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ES2316481T3 - Sistema de muerte de la celulas vegetales. - Google Patents

Sistema de muerte de la celulas vegetales. Download PDF

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ES2316481T3
ES2316481T3 ES01974526T ES01974526T ES2316481T3 ES 2316481 T3 ES2316481 T3 ES 2316481T3 ES 01974526 T ES01974526 T ES 01974526T ES 01974526 T ES01974526 T ES 01974526T ES 2316481 T3 ES2316481 T3 ES 2316481T3
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ES
Spain
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rip
plant
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ES01974526T
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English (en)
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C.J.R. Advanced Tech. THOMAS (Cambridge) Ltd
Michael John Mcpherson
Howard John Atkinson
Anil Neelam
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Advanced Technologies Cambridge Ltd
Original Assignee
Advanced Technologies Cambridge Ltd
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Abstract

Un método de producción de una planta transgénica que alberga en el genoma de la planta un gen quimérico, gen cuya expresión causa citotoxicidad a la planta en un sitio diana, en donde una planta se transforma con un gen quimérico que comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura de desactivación de los ribosomas del maíz o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura que comprende un dominio alfa y un dominio a dispuestos contiguamente, en donde dicha secuencia codificante comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2 o una secuencia codificante que es al menos 70% homóloga a la misma.

Description

Sistema de muerte de las células vegetales.
La presente invención se refiere a un sistema de muerte de las células vegetales, y en particular a plantas transgénicas que albergan en su genoma un gen quimérica que, al expresarse, produce una proteína citotóxica.
Uno de los medios disponibles para los mejoradores de plantas que tratan de producir nuevas variedades cultivadas es la producción de híbridos entre variedades cultivadas existentes que contienen rasgos deseables. Los híbridos son generalmente superiores en una diversidad de características a sus parentales, fenómeno conocido como vigor del híbrido. Tales cruzamientos híbridos pueden realizarse por polinización cruzada manual, procedimiento tedioso y que consume mucho tiempo.
Durante la producción de tales cruzamientos híbridos, es vital la prevención de la autopolinización. Para conseguir esto, el parental femenino puede emascularse manualmente, v.g. en la producción de maíz híbrido por desborlado. Sin embargo, la emasculación en gran escala de especies con flores hermafroditas es económicamente irrealizable. Las líneas parentales femeninas (con esterilidad masculina) pueden generarse también por esterilidad masculina genética, un rasgo conocido en muchas plantas, que usualmente es recesivo y monogénico. El problema con este enfoque es que resulta difícil obtener líneas puras de parentales con esterilidad masculina para cualquier cruzamiento. El sistema de producción de esterilidad masculina empleado más ampliamente para uso en la producción de híbridos es la esterilidad masculina citoplásmica (cms). En este caso, factores citoplásmicos son responsables del aborto del polen. En las cosechas en que se ha identificado cms en el germoplasma, se ha utilizado el mismo extensamente, v.g., maíz, girasol. Existen varias desventajas en este sistema: el citoplasma masculino estéril puede asociarse con otras características indeseables, v.g. el citoplasma T en el maíz y la susceptibilidad a Helminthosporium maydis; su aplicación requiere líneas masculinas fértiles mantenedoras de la isogenicidad para propagar el parental masculino; y se limita a especies en las cuales está disponible una fuente de esterilidad citoplásmica.
Otra ventaja de un sistema de esterilidad masculina sería la producción de plantas exentas de polen. Esto podría ser deseable en cierto número de variedades de flores ornamentales, y podría tener también aplicación en la contención de los rasgos genéticos por la prevención del cruzamiento exogámico.
Una propiedad deseable adicional de un sistema de esterilidad es que pudieran producirse plantas con esterilidad femenina tales que pudiera tener lugar el desarrollo del fruto en ausencia de producción de semillas. Las variedades de frutos sin semillas podrían ser ventajosas para procesamiento, v.g. los tomates, y ser deseables también para el consumidor, v.g. el melón. Variedades sin semillas están disponibles y están establecidos programas de mejora genética, pero el desarrollo de frutos sin semillas se ha visto limitado por la disponibilidad del germoplasma apropiado en muchas especies.
En los casos en que no está disponible una fuente genética de esterilidad o es infactible por cualquier otra razón, un enfoque de modificación genética podría proporcionar esterilidad proporcionando un sistema de muerte celular por el cual se produce necrosis en células específicas en los tejidos reproductores.
WO 89/10396 describe un sistema de muerte de células vegetales en el cual se introduce un gen quimérico en una planta, comprendiendo dicho gen quimérico un promotor específico de las anteras fijado a una proteína o polipéptido RNAsa que, al expresarse, causa la disrupción del metabolismo celular. Así, la expresión del gen quimérico da como resultado necrosis de las células de las anteras y redunda en la esterilidad masculina de las plantas.
El presente sistema de muerte celular podría utilizarse para proporcionar esterilidad femenina en las plantas, en cuyo caso el sitio de direccionamiento puede ser el óvulo de la planta.
WO 93/18170 y WO 92/04453 describen sistemas de muerte de células vegetales que son específicos para controlar la infección por nematodos. En WO 93/18170 y WO 92/04453, se introduce un gen que comprende una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica un producto que es disruptivo del ataque de los nematodos en una especie vegetal hospedadora. El gen comprende adicionalmente una región promotora, región promotora que controla la expresión de la secuencia codificante de tal manera que la expresión ocurre después del ataque de los nematodos y de modo sustancialmente específico dentro de o adyacente a las células del sitio de alimentación de los nematodos. Con objeto de anular el ataque de los nematodos, el producto puede ser hostil para las células de la planta que se diferencian en células de sitio de alimentación de los nematodos o zonas adyacentes a las mismas, u hostil a los nematodos directamente.
Nematodos parásitos de plantas económicamente importantes incluyen nematodos de los quistes, tales como los nematodos de los quistes de la patata (Globodera rostochiensis y G. pallida), el nematodo de los quistes de la soja (Heterodera glycines), el nematodo de los quistes de la remolacha (Heterodera schachtii) y el nematodo de los quistes de los cereales (Heterodera avenae), y los nematodos de los nudos de las raíces, tales como Meloidogyne spp. Tales nematodos parásitos de plantas son patógenos importantes de muchas cosechas en todo el mundo, por ejemplo hortalizas, leguminosas comestibles, tomate, sandía, uva, cacahuete, tabaco y algodón.
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La represión con productos químicos, las prácticas de cultivo y el uso de variedades resistentes de plantas son los métodos principales para la represión de los nematodos que están disponibles actualmente y se utilizan a menudo de manera integrada contra los nematodos parásitos de las plantas. Se requiere una mejora en la represión de los nematodos dado que estos enfoques actuales ofrecen una protección inadecuada de las cosechas. Los nematocidas adolecen de un estatus ambiental cuestionable, y no siempre son eficaces. El control de los cultivos impone pérdidas ocultas a los cultivadores en varios sentidos. La muy extensa gama de nematodos de los nudos de las raíces limita la disponibilidad de cosechas no hospedadoras económicamente satisfactorias. En muchos casos no están disponibles variedades cultivadas eficazmente resistentes, y aquéllas que puede utilizar el cultivador se ven a veces sobrepasadas por variedades cultivadas sensibles para densidades de nematodos bajas. Asimismo, puede perderse la resistencia a las temperaturas elevadas del suelo que se presentan en los ambientes tropicales y sub-tropicales.
Pueden contemplarse otras aplicaciones de sistemas de muerte de las células vegetales. Por ejemplo, el sitio diana puede estar constituido por partes específicas de la flor, alterando con ello la morfología de la flor. Alternativamente, el sitio diana puede estar constituido por raíces secundarias, espinas o pelos urticantes. La abscisión de la hoja o el fruto podría conseguirse por el direccionamiento de la zona de abscisión de la hoja o el fruto. Podría lograrse facilitar la liberación de semillas de las plantas, por direccionamiento al funículo. Por direccionamiento a otros órganos tales como tricomas, tricomas que son típicamente glandulares, puede interrumpirse o impedirse la producción de sustancias químicas por los tricomas. Otra aplicación podría ser la abscisión inducible de raíces, hojas, flores, o frutos al final de la estación de crecimiento.
Las proteínas desactivadoras de ribosomas (RIPs) son un grupo de proteínas tóxicas de las plantas que desactivan catalíticamente los ribosomas eucariotas (Stirpe y Barbieri (1986)). Las RIPs funcionan como N-glicosidasas para eliminar una adenina específica en un bucle conservado del rRNA grande, e impiden con ello la fijación del Factor de Elongación 2, bloqueando así la síntesis de las proteínas celulares.
Se han descrito tres formas de RIPs. Las RIPs Tipo 1 tales como la proteína antiviral de la fitolaca y el inhibidor de la traducción de la cebada están constituidas cada una por una sola cadena polipeptídica, que tiene en cada caso un valor M_{r} aproximado de 30.000. Las RIPs Tipo 2 tales como ricina, abrina y modecina comprenden cada una dos cadenas polipeptídicas; un polipéptido con una actividad RIP (cadena A) está enlazado por un puente disulfuro a una lectina de fijación de galactosa (cadena B; Stirpe et al. 1978). El valor M_{r} de cada RIP Tipo 2 es aproximadamente 60.000.
La RIP del maíz, que se encuentra en el endospermo de las semillas del maíz (Zea mays), es una RIP Tipo 3. Esta RIP se sintetiza como una cadena polipeptídica simple, pero subsiguientemente sufre escisión proteolítica para liberar dos dominios peptídicos activos. La RIP del maíz comprende dos dominios, el dominio \alpha y el dominio \beta, dominios que están separados en la forma inactiva de la RIP del maíz (es decir, Pro-RIP del maíz) por un espaciador peptídico central y están flanqueados por péptidos N- y C-terminales. El dominio \alpha está localizado hacia el término N de la pro-RIP; el dominio \beta está localizado hacia el término C. Durante la germinación de las semillas, la pro-RIP del maíz se activa por escisión proteolítica de los péptidos N- y C-terminales junto con el espaciador peptídico central, de tal manera que los dos dominios forman la RIP madura (activa) del maíz (US 5.248.606). La escisión es efectuada por proteasas endógenas.
La presente invención proporciona un método de producción de una planta transgénica que alberga en el genoma de la planta un gen quimérico, gen cuya expresión causa citotoxicidad para la planta en un sitio diana, en donde una planta está transformada con un gen quimérico que comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha secuencia codificante comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma.
La presente invención proporciona adicionalmente una planta transformada con un gen quimérico, en donde dicho gen quimérico comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína desactivadora de los ribosomas de maíz madura o parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha codificación (sic) comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma.
La presente invención proporciona adicionalmente una célula vegetal transformada con un gen quimérico, en donde dicho gen quimérico comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha codificación (sic)
comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2 como una secuencia codificante que es homóloga a la misma.
La presente invención proporciona también un aislado de DNA de un gen quimérico que comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz, o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha codificación (sic) comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma.
La presente invención proporciona adicionalmente un vehículo de expresión biológicamente funcional que contiene un gen quimérico que comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz, o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha codificación (sic) comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma.
La secuencia codificante de la proteína desactivadora de los ribosomas del maíz puede comprender una RIP "madura", descrita en esta memoria como "RIP-P", que comprende el dominio \alpha y el dominio \beta dispuestos contiguamente, es decir las extensiones N- y C-terminales y el péptido espaciador central están eliminados. La presente invención demuestra que la provisión de una molécula RIP funcionalmente activa no depende de limitación alguna de la conformación impuesta por la molécula pro-RIP intacta o por la reacción de escisión. La actividad funcional en los sistemas de traducción exentos de células de moléculas RIP recombinantes que carecen del espaciador central y los péptidos terminales se ha descrito en las Patentes U.S. núms. 5.248.606 y 5.646.026.
Sin pretender quedar ligados por la teoría, se cree que el dominio \alpha comprende regiones de reconocimiento de ribosoma y de fijación, en tanto que se cree que el dominio \beta comprende el sitio catalítico necesario para la despurinación/escisión del ribosoma.
La secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante pro-RIP es la identificada en SEQ ID No.: 1 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma; la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante RIP-P es la identificada en SEQ ID No.: 2 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma; la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante del dominio \alpha es la identificada en SEQ ID No.: 3 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma; la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante del dominio \beta es la identificada en SEQ ID No.: 4 o una secuencia codificante que es homóloga a la misma.
Dependiendo de la homología de las secuencias de nucleótidos requeridas, pueden utilizarse condiciones de severidad diferentes en el procedimiento de hibridación utilizado para el cribado respecto a secuencias similares. A modo de ejemplo y no de limitación, procedimientos de hibridación que utilizan condiciones de alta severidad son como sigue: hibridación para DNA fijado en filtro en NaHPO_{4} 0,5M, dodecilsulfato de sodio al 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65ºC, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68ºC (Ausubel F.M. et al., compiladores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley and Sons, Inc., Nueva York en p. 2.10.3). Otras condiciones de severidad alta que pueden utilizarse son bien conocidas en la técnica. Procedimientos de hibridación que utilizan condiciones de severidad moderada que pueden utilizarse son como sigue: hibridación a DNA fijado en filtro en NaHPO_{4} 0,5M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65ºC, y lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42ºC (Ausubel et al., 1989, supra). Otras condiciones de severidad moderada que pueden utilizarse son bien conocidas en la técnica. Otras soluciones tales como Citrato Salino Estándar (SSC) o Solución Salina de Fosfato de Sodio (EDTA) (SSPE) pueden utilizarse en los procedimientos de hibridación.
Secuencias homólogas adecuadas son secuencias que son homólogas al menos en un 70%, preferiblemente 80% y más preferiblemente 85%, y aún más preferiblemente 90% o 95% con cada una de las secuencias enumeradas en esta memoria, reteniendo dichas secuencias homólogas la actividad enzimática requerida.
Las secuencias adecuadas pueden ser también variantes de las mismas. Variante, en relación con la presente invención, puede significar cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazamiento de, o deleción de, o la adición de uno o más ácidos nucleicos/aminoácidos de o a la secuencia, con tal que la secuencia resultante exprese o exhiba la actividad enzimática requerida. Un derivado o una mutación puede ser también adecuado en la invención. Un derivado tiene algunas modificaciones, usualmente químicas, comparado con el polipéptido existente naturalmente expresado por el ácido nucleico.
Convenientemente, el gen quimérico comprende además una secuencia 3' terminadora no traducida. La secuencia terminadora puede obtenerse de genes de plantas, bacterianos o virales. Secuencias terminadoras adecuadas son la secuencia terminadora rbcS E9 del guisante, la secuencia terminadora nos del gen de nopalina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la secuencia terminadora 35S del virus del mosaico de la coliflor, por ejemplo. Una persona experta en la técnica será fácilmente conocedora de otras secuencias terminadoras adecuadas. Adicionalmente, el gen quimérico puede comprender opcionalmente secuencias intensificadoras de la transcripción o la traducción, tales como las descritas en la Solicitud de Patente Internacional, No. de publicación WO 97/20056, secuencias de direccionamiento intracelulares e intrones, por ejemplo, así como secuencias de nucleótidos operables que facilitan el proceso de transformación y la expresión estable del gen quimérico, tales como regiones de borde de T-DNA, regiones de fijación de matriz y secuencias de excisión/recombinantes.
Preferiblemente, el promotor se induce de modo específico o de modo sustancialmente específico en y/o adyacente al sitio diana. Si el promotor se induce en lugar distinto del sitio diana y/o de las células adyacentes al sitio diana, el promotor se expresa preferiblemente de modo predominante en el sitio diana y/o adyacente al sitio diana.
El sitio diana puede ser un sitio de alimentación de los nematodos. Cuando sucede que el sitio diana es un sitio de alimentación de los nematodos, el promotor seleccionado es uno que se induce en y/o adyacente al sitio de alimentación de los nematodos. Un promotor de este tipo se induce preferiblemente después de la infección de la planta por los nematodos. Un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor KNT1. El aislamiento del promotor KNT1 se describe en la Patente NZ No. 260.511, y el método se cita adicionalmente más adelante. Otros promotores adecuados incluyen el promotor TobRB7 y los promotores Lemmi. El aislamiento del promotor TobRB7 se expone en la Solicitud de Patente Internacional WO 94/17194, y el aislamiento de los promotores Lemmi se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/21757.
El sitio de alimentación de los nematodos puede estar constituido, por ejemplo, por células de plantas en el sitio local de la infección que más tarde se rediferencian para formar un sincitio (en el caso de los nematodos de los quistes) o las células gigantes y/o las células hipertróficas acompañantes (en el caso de los nematodos de los nudos de las raíces), y/o una o más de las células de sincitios, las células gigantes y las células hipertróficas acompañantes.
Por direccionamiento del sitio de alimentación de los nematodos puede obtenerse una planta resistente a los nematodos. Por la expresión "planta resistente a los nematodos" se entiende una planta que, después de la infección por nematodos parásitos de las plantas es capaz de prevenir, ralentizar o afectar desfavorablemente de algún otro modo al crecimiento y el desarrollo de los nematodos que atacan la planta, evitando con ello que se acumulen densidades económicamente importantes de nematodos parásitos de las plantas durante un solo periodo de crecimiento de la cosecha. Es decir, que los nematodos pueden, por ejemplo, morir o el ciclo de vida de los nematodos puede ralentizarse dando como resultado un retardo en el tiempo necesario para alcanzar la madurez y por tanto la puesta de huevos, o los nematodos hembra maduras pueden ser de un tamaño reducido y tener por tanto una capacidad reducida de puesta de huevos dado que la puesta de huevos comienza solamente después que los nematodos hembra han alcanzado un tamaño crítico mínimo.
La presente invención es aplicable, pero sin carácter limitante, al uso con las especies de nematodos siguientes: Globodera spp., Heterodera spp. y Meloidogyne spp.
En lugar de resistencia a los nematodos, los métodos, aislados de DNA y vehículos de expresión de la presente invención pueden estar dirigidos a causar esterilidad masculina en las plantas. Por ejemplo, el sitio diana puede ser uno o más de un polen de planta, antera o tapete. Cuando sucede que el sitio diana es tapete, por ejemplo, el promotor seleccionado es uno que se induce en y/o adyacente al tapete. Un ejemplo de un promotor de tapete adecuado, es el promotor TA29 del tabaco, como se describe en Mariani et al. (1990). Promotores específicos de las anteras se describen en Twell et al. (1991).
Los métodos, aislados de DNA, y vehículos de expresión de la presente invención pueden estar dirigidos también para producir esterilidad masculina en las plantas. Por ejemplo, el sitio diana puede ser el óvulo de la planta. Es decir, el promotor seleccionado es uno que se induce en y/o adyacente al óvulo. Un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor AGL15 como se describe en Perry et al., 1996.
Los métodos, aislados de DNA y vehículos de expresión de la presente invención, pueden utilizarse para manipular la morfología de la flor de una planta. Por ejemplo, el sitio diana puede ser partes específicas de la flor, siendo la finalidad que cuando estas partes específicas de la flor no se desarrollan, se cambia la morfología de la flor. En tal caso, el promotor seleccionado es uno que se induce en y/o adyacente al sépalo, carpelo, pétalo y/o estambre. Ejemplos de promotores adecuados son los encontrados en los genes agamous, apetala3, globosa, pistillata y deficiens (Sieburth y Meyerowitz, 1997; Samach et al., 1997 y las referencias dadas en dicho lugar).
Los métodos, aislados de DNA y vehículos de expresión de la presente invención pueden utilizarse para asistir en o promover la abscisión de las hojas y/o los frutos en las plantas. Por ejemplo, el sitio diana puede ser la zona de abscisión de la hoja y/o el fruto. Así, el promotor seleccionado es uno que se induce en y/o adyacente a dicha zona de abscisión.
Los métodos, aislados de DNA y vectores de expresión de la presente invención pueden utilizarse en el direccionamiento de tricomas, tricomas que son típicamente glandulares. El promotor seleccionado es un que se induce en y/o adyacente a los tricomas. Por causar necrosis de los tricomas de la planta, la producción de sustancias químicas por el tricoma puede interrumpirse o evitarse. Un séptimo aspecto de la presente invención es el direccionamiento de raíces laterales, espinas o pelos urticantes.
Los métodos, aislados de DNA y vehículos de expresión de la presente invención pueden estar dirigidos al control de infecciones virales. Durante las infecciones virales, existen cierto número de genes que se inducen específicamente, o de modo sustancialmente específico, dentro de las células infectadas realmente por el virus. El promotor seleccionado es uno que se induce en y/o adyacente a las células infectadas por el virus.
Los métodos, aislados de DNA y vehículos de expresión de la presente invención pueden estar dirigidos para facilitar la liberación de semillas de las plantas, por direccionamiento de las semillas. Durante el desarrollo de las semillas se digieren cierto número de genes que se inducen específicamente, o de modo sustancialmente específico, dentro de ciertas células/partes de la semilla.
Puede seleccionarse un promotor de la presente invención que es externamente inducible y que se induce en, por ejemplo, las raíces de la planta. Un promotor de este tipo podría utilizarse para efectuar la abscisión de la raíz al final de una estación de crecimiento. Promotores comparables inducidos, por ejemplo, en los peciolos, pedicelos o pedúnculos de las hojas, podrían utilizarse para efectuar la abscisión de hojas, flores o fruto al final de la estación de crecimiento.
Los métodos para transformación de plantas son bien conocidos en la técnica e incluyen transformación mediada por Agrobacterium, por ejemplo. Típicamente en la transformación mediada por Agrobacterium, un vector binario que lleva un DNA extraño de interés, es decir un gen quimérico, se transfiere desde una cepa de Agrobacterium apropiada a una planta diana por el co-cultivo del Agrobacterium con explantes de la planta diana. El tejido vegetal transformado se regenera luego en un medio de selección, comprendiendo dicho medio de selección un marcador seleccionable y hormonas de crecimiento de las plantas.
Métodos de transformación adecuados adicionales incluyen transferencia directa de genes a protoplastos utilizando polietilenglicol o técnicas de electroporación, bombardeo con partículas, microinyección y el uso de fibras de carburo de silicio, por ejemplo.
Especies de plantas adecuadas que pueden transformarse de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, arroz, trigo, maíz, patata, tabaco, remolacha azucarera, soja, canola, tomate, cacahuete, algodón, vid, sandía, papaya, hortalizas y leguminosas alimentarias.
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A fin de que la invención pueda ser comprendida fácilmente y llevada fácilmente a la práctica, se hará referencia a continuación a modo de ejemplo, a los dibujos diagramáticos que se acompañan, en los cuales:
La Figura 1 muestra el efecto de la actividad de la proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz (RIP-P) sobre los ribosomas del tabaco como se mide por la síntesis de la proteína GUS;
la Figura 2 muestra el efecto de la dosificación de cantidades diferentes de DNA de RIP-P de maíz (20 \mug a 0,02 mg) sobre ribosomas del tabaco como se mide por la síntesis de la proteína GUS;
la Figura 3 muestra el efecto de las proteínas RIP-P del maíz sobre los ribosomas del tabaco tal como se mide por la síntesis de \alpha-amilasa y proteína GUS;
la Figura 4 muestra el efecto de dominios separados del maíz RIP \alpha y \beta y dominios \alpha y \beta combinados sobre los ribosomas del tabaco como se mide por la síntesis de la proteína GUS.
La Figura 5 muestra en forma esquemática las construcciones de los promotores pDVM35S y pATC KNT1 y las construcciones pATC KNT2/RIP \alpha:KNT1/RIP \beta utilizadas en la transformación de plantas;
la Figura 6 muestra tamaños de nematodos adultos en líneas RIP de maíz de control y transgénicas representadas como un gráfico de frecuencias acumuladas;
la Figura 7 muestra tamaños de hembras ponedoras de huevos en las mismas líneas RIP de maíz de control y transgénicas de la Figura 6, representadas como un gráfico de frecuencias acumulados;
la Figura 8 muestra una comparación entre los tamaños de los nematodos de los nudos de la raíz adultos y ponedores de huevos en líneas de control y transgénicas representados como un gráfico de frecuencias acumulado;
la Figura 9 muestra el número de agallas y tres categorías de nematodos para cada línea de nematodos transgénica. Las líneas A a G son progenie de transformantes de maíz RIP-P, las líneas I a Q son progenie de transformantes de maíz RIP\alpha/RIP\beta de dos componentes, y las líneas P y H son líneas de control no transformadas;
la Figura 10 muestra el vector de transformación pATC en el cual se insertaron las construcciones de RIP de la Figura 5 para transformación de plantas;
la Figura 11 muestra el vector de clonación pDE4;
la Figura 12 es un diagrama esquemático de la producción de variantes de la proteína de desactivación de los ribosomas del maíz por PCR;
la Figura 13 muestra la construcción utilizada para producir esterilidad masculina;
la Figura 14 muestra la formación del tubo polínico para polen de tipo salvaje (a la izquierda) con tubos de germinación señalados por flechas y la RIP-P transgénica (a la derecha) con granos de polen deformados que carecen de tubos de germinación; y
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la Figura 15 muestra polen de tipo salvaje de la variedad cultivada Desiree (a la izquierda) que muestra la captura de FDA por granos de polen viables y un número similar de granos de polen de la línea transgénica RIP-P (a la derecha) que muestra uno solo con captura de FDA. Los granos de polen tienen un diámetro de 50 \mum.
Ejemplos Clonación y secuenciación de la proteína de desactivación de los ribosomas del maíz
Se extrajo DNA genómico de plantas de semillero de 14 días de la variedad de maíz Early King.
Se diseñaron iniciadores a partir de la secuencia de nucleótidos del DNA genómico RIP de maíz para generar variantes de secuencias RIP, por eliminación de las regiones N- y C-terminales y el espaciador central. Los iniciadores se diseñaron también para eliminar un sitio de restricción SacI en la secuencia RIP y facilitar así la clonación (Figura 12). Las secuencias RIP se amplificaron con Pfu-polimerasa.
La secuencia ProRIP (SEQ ID No.: 1) se obtuvo por PCR del DNA genómico como sigue:
Para eliminar el sitio de restricción SacI en el gen, se llevaron a cabo dos reacciones PCR utilizando iniciadores PRORIPBF (SEQ ID No.: 5) más RIPSDR (SEQ ID No.: 14), y RIPSDF (SEQ ID No.: 13) más PRORIPSR (SEQ ID No.: 6), respectivamente. Los productos PCR se purificaron en gel y se combinaron. La extensión de solapamiento seguida por amplificación PCR utilizando los iniciadores PRORIPBF (SEQ ID No.: 5) y PRORIPSR (SEQ ID No.: 6) dio como resultado la secuencia ProRIP de longitud total (SEQ ID No.: 1).
La PCR de ProRIP con los iniciadores RIP1BF (SEQ ID No.: 7) y RIP2SR (SEQ ID No.: 8) dio como resultado un producto PCR de aproximadamente 800 pares de bases, correspondiente a los dominios RIP\alpha, espaciador central y RIP\beta. Este producto ("RIP-CD") se digirió con las endonucleasas de restricción XbaI y SalI, se purificó en gel, se ligó al vector pBluescript, se transformó en células XL1-Blue de E. coli, y se secuenció. La secuencia era idéntica a la de la región equivalente del DNA RIP de maíz.
La región espaciadora central se eliminó como sigue:
se amplificó el DNA de RIP-CD en dos reacciones PCR utilizando los iniciadores RIP1BF (SEQ ID No.: 7) más RIPCDR (SEQ ID No.: 12) y RIPCDF (SEQ ID No.: 11) más RIP2SR (SEQ ID No.: 8). Los productos PCR se purificaron en gel y se combinaron. La extensión de solapamiento seguida por PCR con los iniciadores RIP1BF (SEQ ID No.: 7) y RIP2SR (SEQ ID No.: 8) dio como resultado la RIP totalmente procesada (RIP-P). Se digirió RIP-P con las endonucleasas de restricción XbaI y SalI, se purificó en gel, se ligó en el vector pBluescript, se transformó en células XL1-Blue de E. coli, y se secuenció. La secuencia RIP-P se identifica en esta memoria como SEQ ID No.: 2.
Se llevaron a cabo reacciones PCR ulteriores sobre RIP-CD utilizando los iniciadores RIP1BF (SEQ ID No.: 7) más RIP1SR (SEQ ID No.: 9) o iniciadores RIP2BF (SEQ ID No.: 10) más RIP2SR (SEQ ID No.: 8), para amplificar los dominios RIP\alpha o RIP\beta respectivamente. Se digirió RIP\alpha o RIP\beta con las endonucleasas de restricción XbaI y SalI, se purificó en gel, se ligó al vector pBluescript, se transformó en células XL1-Blue de E. coli y se secuenció. Las secuencias de RIP\alpha y RIP\beta se identifican como SEQ ID No.: 3 y SEQ ID No.: 4, respectivamente.
Producción de construcciones que comprenden la proteína de desactivación de los ribosomas del maíz para evaluación en ensayos transitorios en protoplastos
Construcciones que contenían el promotor constitutivo del virus 35S del mosaico de la coliflor unido a una secuencia codificante derivada de la proteína de desactivación de ribosoma del maíz y una secuencia terminadora Nos se produjeron en un vector derivado de pDE4 (Denecke et al., 1990) (véase la Figura 11) adecuado para uso en un sistema de expresión transitoria en protoplastos. Se realizaron las construcciones siguientes y se muestran esquemáticamente en la Figura 5:
1.
pDEA 35S/Pro RIP
3.
pDE4 35S/RIP P (RIP "madura")
4.
pDE4 35S/RIP \alpha
5.
pDE4 35S/RIP \beta
Ensayo transitorio de construcciones RIP en protoplastos de tabaco
En este ensayo, se detectó la desactivación de los ribosomas mediada por la proteína desactivadora de los ribosomas, por evaluación de la síntesis de la proteína GUS. Se prepararon protoplastos a partir de hojas de plantas de tabaco mantenidas in vitro y se sometieron a electroporación con las construcciones RIP. La eficiencia de traducción de la proteína de los ribosomas en los protoplastos de tabaco se evaluó con un gen informador GUS en una construcción pDE4 bajo el control de un promotor CaMV 35S. Se sometió a electroporación una construcción GUS pDE4 junto con cada construcción de RIP. A fin de obtener valores para los niveles óptimos de la síntesis de proteína GUS en protoplastos en competición con una segunda proteína, se utilizó un control GUS-positivo, en donde se sometió a electroporación una construcción de proteína BiP no tóxica, pDE800 (Leborgna-Castel et al., 1999) en protoplastos de tabaco junto con la construcción GUS pDE4. Se utilizó también un control GUS-negativo, en donde un vector pDE4 vacío se sometió a electroporación en protoplastos de tabaco junto con la construcción de la proteína chaperona BiP no tóxica.
(i) RIP-P madura de maíz
Construcciones RIP-P de maíz se sometieron juntamente a electroporación con la construcción de GUS en protoplastos de tabaco. El efecto de actividad de RIP en el maíz sobre los ribosomas se ensayó por medida de los niveles de actividad de GUS después de 24 horas de expresión (Figura 1). El efecto de la dosificación de la construcción se ensayó por electroporación de cantidades diferentes (0,02 \mug a 20 \mug) de la construcción de RIP-P de maíz (Figura 2).
Los resultados demuestran que la proteína RIP-P de maíz madura desactiva eficientemente los ribosomas del tabaco. Por consiguiente, únicamente se observan niveles basales de actividad de GUS en comparación con el control GUS-positivo.
La eficiencia de la desactivación de los ribosomas dependía de la cantidad de DNA de entrada sometido a electroporación en los protoplastos. Cantidades mayores de DNA de RIP (20 \mug) inducían rápidamente la desactivación de los ribosomas y únicamente se observaban niveles basales de actividad de GUS. Cantidades menores de DNA de entrada (0,02 \mug) daban como resultado una actividad residual de GUS mucho mayor, debido posiblemente al mayor tiempo requerido para que RIP alcanzara las concentraciones críticas de proteínas y desactivara completamente los ribosomas.
(ii) Actividad de RIP-P del maíz sobre los diferentes ribosomas de la célula
Se llevó a cabo un experimento para testar si la RIP-P del maíz despurina a la vez los ribosomas en el Retículo Endoplasmático (ER) y los del citosol. Como ejemplo de una proteína sintetizada en el ER, la proteína \alpha-amilasa posee una secuencia señal N-terminal y la proteína es secretada por el ER. Se sometió a electroporación una construcción de \alpha-amilasa en protoplastos junto con la construcción de RIP-P, y se utilizó también para comparación una construcción de GUS. Después de 24 horas de expresión, se realizó un ensayo de amilasa (Figura 3).
Los resultados indicaban la ausencia de diferencia significativa entre el efecto de RIP-P sobre las actividades de \alpha-amilasa y de GUS. La RIP-P madura de maíz desactivaba todos los ribosomas con indiferencia de su localización celular. Los resultados de estos ensayos con RIP-P de maíz indican que la enzima es muy eficaz para inducir la desactivación completa de los ribosomas y la atenuación celular o muerte celular subsiguiente.
(iii) Los dominios RIP de maíz separados
Se expresaron también regiones polipeptídicas RIP\alpha y RIP\beta de maíz individualmente o en combinación en protoplastos de tabaco (Figura 4).
La expresión de la proteína RIP\alpha sola daba sorprendentemente como resultado una reducción significativa en la actividad de GUS. En contraste, se encontró que la expresión de la proteína RIP\beta sola era inactiva. Sobre la base de predicciones estructurales, RIP\alpha contiene el motivo de reconocimiento de RNA y regiones de dominio de fijación de ribosomas, pero no el sitio del residuo catalítico crítico. La proteína RIP\alpha puede ser preventiva de la traducción de proteínas por fijación a los ribosomas y prevención de la traducción de proteínas. Esto implicaría que RIP\alpha está adoptando una conformación correctamente plegada y es capaz de reconocimiento molecular específico. RIP\beta contiene el residuo del sitio activo necesario para la despurinación de los ribosomas y no podría esperarse que fuera capaz de interaccionar con el ribosoma.
La expresión simultánea de RIP\alpha y RIP\beta en protoplastos daba como resultado una reducción ulterior de las actividades de GUS en comparación con las proteínas RIP\alpha y RIP\beta solas. Esto implica que los dos péptidos son capaces de interaccionar y facilitar la despurinación de los ribosomas.
Aislamiento de un promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana
Se expone por la presente un método para el aislamiento de un promotor, método que se da a modo de ejemplo. Métodos alternativos para el aislamiento de un promotor adecuado para uso en la presente invención estarán fácilmente a disposición de las personas expertas, algunos de cuyos métodos se han citado anteriormente.
Un método para el aislamiento del promotor KNT1 es como sigue: Crecimiento e infección de las plantas de tabaco
Se germinaron semillas de tabaco C319 sobre compost Fisons F1 en las condiciones siguientes: intensidad luminosa de 4500 a 5000 lux; 16 horas día/8 horas noche; temperatura 20-25ºC. Después de aprox. 3 semanas, las plantas de semillero se lavaron suavemente en agua del grifo para eliminar la tierra, se transfirieron a bolsas (Northrup-King) 2 plantas por bolsa, y se dejaron crecer durante una semana más en un Conviron a 25ºC con iluminación como anteriormente. Se levantaron las raíces de la parte posterior de la bolsa y se soportaron con papel Whatman GF/A de fibra de vidrio en sus ápices. Se depositaron luego nematodos de tres días (M. javanica) en los ápices de estas raíces en partes alícuotas de 10 \mul (50 nematodos) y se puso una segunda pieza de papel GF/A enzima para encapsular por completo el ápice de la raíz. Después de 24 horas de la infección, se retiró el papel GF/A para asegurar una infección sincrónica. Después de 3 días de la infección, se disecaron los nodos de las raíces (desechando la raíz sana y el tejido del ápice de la raíz atrás) y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se recogieron aproximadamente 0,5-1,0 g de tejido infectado de la raíz de 80 plantas inoculadas.
Tinción para visualización de los nematodos en las raíces infectadas
Se estableció el grado de infección por determinación del número de nematodos infectantes por cada ápice de raíz. Se recogieron raíces de las plantas tres días después de la infección y se sumergieron durante 90 segundos en lactofenol que contenía 0,1% de Azul de Algodón a 95ºC. Después de un enjuagado de 5 segundos en agua, se pusieron las raíces en lactofenol a la temperatura ambiente (TA) durante 3-4 días para aclarado. Los nematodos teñidos se visualizaron utilizando microscopía óptica.
Aislamiento de RNA del tejido de raíz sano e infectado
Se trituró a un polvo fino el tejido de la raíz en un mortero con mano enfriado en nitrógeno líquido. Se transfirieron luego partes alícuotas de aproximadamente 100 mg a tubos de microcentrífuga enfriados análogamente y se añadieron 300 \mul de tampón de extracción con fenol caliente (50% fenol, 50% tampón de extracción: cloruro de litio 0,1 M, Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 (TA), EDTA 10 mM, 1% SDS), y se incubó a 80ºC durante 5 minutos. Se añadió luego un volumen igual de cloroformo y el homogeneizado se sometió a microcentrifugación durante 15 minutos a 4ºC. La fase acuosa se extrajo luego con 1600 \mul de fenol/cloroformo y se sometió a microcentrifugación como anteriormente. La fase acuosa se retiró de nuevo y se precipitó el RNA con un volumen igual de cloruro de litio a 4ºC durante una noche. El precipitado se redujo a un sedimento por microcentrifugación durante 15 minutos a TA y se lavó en etanol de 70%. Se liofilizó el sedimento, se suspendió de nuevo en agua tratada con DEPC y se ensayó utilizando un espectrofotómetro. Se evaluó la calidad del RNA por electroforesis en gel desnaturalizante. (Adaptado de Shirzadegan et al., 1991).
Clonación sustractiva de los cDNAs específicos de la invención
Se aisló RNA poli(A)^{+} (mRNA) de muestras de 200 \mug de RNA total procedentes de tejido de raíces C319 sano e infectado utilizando Dynabeads magnéticas oligo-dT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó in situ la síntesis del cDNA de la primera cadena sobre la fracción de poli(A)^{+} fijada a Dynabeads procedente del tejido sano para proporcionar DNA Conductor. Se realizó in situ la síntesis de la primera y la segunda cadena sobre la fracción de poli(A)^{+} fijada en Dynabeads del tejido infectado para proporcionar el DNA Diana. Todas las reacciones de cDNA se realizaron utilizando un kit de síntesis de cDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). Tres oligonucleótidos, SUB 21 (5' CTCTTGCTTGAATTCGGACTA 3') (SEQ ID No.: 15), SUB 25 (5' TAGTCC
GAATTCAAGCAAGAGCACA 3') (SEQ ID No.: 16) (secuencias de Duguid & Dinauer, 1990) y LDT15 (5' GACA
GAAGCGGATCCd(T)_{15} 3') (SEQ ID No.: 17) (O'Reilly, 1990) se quinasaron con polinucleótido-quinasa T4 de acuerdo con Maniatis et al. (1982). Se reasociaron luego SUB21 y SUB25 para formar un enlazador que se ligó después al DNA Diana con DNA-ligasa T4 de acuerdo con King & Blakesley (1986). Subsiguientemente, las bolitas que llevaban
el DNA Diana se lavaron concienzudamente con TE y la segunda cadena del cDNA se eluyó a 95ºC en 5xSSC.
El RNA fijado al DNA Conductor fijado a Dynabeads se separó por calentamiento y el DNA Diana eluido se hibridó al DNA Conductor a 55ºC en 5xSSC durante 5 horas. El DNA Diana que no se hibridaba se separó del DNA Conductor fijado a las bolitas a la temperatura ambiente (TA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, después de lo cual, el DNA Diana hibridante se separó análogamente del DNA Conductor fijado a las bolitas a 95ºC. El DNA Diana eluido a la temperatura ambiente se añadió de nuevo al DNA Conductor y se repitió la hibridación. Se repitió este proceso hasta que la cantidad de Diana que se hibridaba al Conductor no excedía ya de la cantidad que no se hibridaba. Se establecieron las concentraciones de DNA utilizando DNA Dipstick (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Partes alícuotas de la fracción final eluida a la temperatura ambiente se utilizaron en amplificación PCR (Eckert y Kunkel, 1990) para generar cDNA bicatenario para clonación en un vector plasmídico. La amplificación del DNA Diana se realizó utilizando iniciadores SUB21 (SEQ ID No.: 15) y LDT15 (SEQ ID No.: 17) de acuerdo con las condiciones descritas por Frohman et al., 1988. Los productos PCR se ligaron luego al vector pBluescript digerido con SmaI de acuerdo con King y Blackesley (1986).
Cribado de la genoteca substractiva por análisis Northern inverso
Se identificaron recombinantes por PCR de colonias (Gussow y Clackson, 1989). Los insertos amplificados se sometieron a transferencia Southern por triplicado en membranas Pall Biodyne de acuerdo con las prescripciones del fabricante. La pre-hibridación y la hibridación se llevaron a cabo ambas a 42ºC en 5xSSPE, 0,05% BLOTTO, 50% formamida. Las membranas se hibridaron por separado a sondas de cDNA (véase más adelante) de tejido sano e infectado y a una sonda que comprendía DNA Diana amplificado de la sustracción final. Los clones que exhibían una señal de hibridación a la sonda de cDNA infectado únicamente, o que exhibían una señal de hibridación a la sonda sustraída únicamente se seleccionaron para análisis ulterior.
Generación de sondas de cDNA
Muestras de 10 \mug de RNA total de tejido sano e infectado se trataron con 2,5 unidades de DNasa1 a 37ºC durante 15 minutos. La DNasa1 se desnaturalizó luego a 95ºC durante 10 minutos antes de realizar la síntesis del cDNA utilizando el protocolo del fabricante (Pharmacia). Se separó luego el RNA en presencia de hidróxido de sodio 0,4 M durante 10 minutos a TA y el cDNA se purificó en una columna giratoria de Sephacryl 400 HR. El rendimiento y la concentración se determinaron utilizando DNA Dipsticks (Invitrogen). Se marcó el cDNA utilizando aprox. 35 ng/sonda con empleo del protocolo estándar de oligomarcación de Pharmacia.
Transferencia Northern
Para determinar el perfil de expresión de los clones seleccionados de Northerns Inversas, se utilizaron los mismos como sondas en análisis Northern de RNA total o RNA poli(A)^{+} de raíces, tallos, hojas, y flores, sanos e infectados. Las transferencias de RNA total comprendían 25 \mug de RNA por pista, mientras que las transferencias de RNA poli(A)^{+} comprendían 0,5-1,0 \mug de RNA por pista. El RNA se sometió a electroforesis en geles de formaldehído y se transfirió a membrana Pall Biodyne B como ha sido descrito por Fourney et al. (1988). Las sondas se marcaron y se hibridaron como anteriormente.
Transferencia Southern
Para determinar si los cDNAs seleccionados procedían de la planta o del nematodo, se prepararon DNA de tabaco C319 y DNA de M. javanica como ha sido descrito por Gawel y Jarret (1991). Se prepararon transferencias Northern que comprendían 10 \mug de DNA digerido con EcoRI y HindIII por pista. Las transferencias se hibridaron a sondas oligomarcadas como se ha descrito arriba.
Hibridación in situ
Para determinar la localización de la expresión de los cDNAs de interés en el sitio de alimentación, se realizaron hibridaciones in situ. Tejidos procedentes de raíces infectadas y sanas se empotraron en parafina, se seccionaron, y se hibridaron a las sondas como ha sido descrito por Jackson (1991).
Aislamiento de los términos 5' de los mRNAs
Los términos 5' de los RNAs de interés se determinaron por utilización de 5'RACE como ha sido descrito por Frohman et al. (1988).
Aislamiento de las regiones promotoras
Las regiones promotoras de los genes de interés se aislaron por PCR ligada a vector. Se ligaron muestras de 100 ng de DNA genómico C319 digerido con endonucleasas de restricción durante 4 horas a TA (King y Blackesley, 1986) con muestras de 100 ng de pBluescript (digerido con una endonucleasa de restricción que producía términos compatibles). Las enzimas utilizadas típicamente fueron EcoRI, BamHI, HindIII, BglII, XhoI, ClaI, SalI, KpnI, PstI, y SstI. Se realizó luego la PCR sobre las ligaciones utilizando un iniciador vector tal como el iniciador -40 Sequencing y un iniciador complementario al término 5' del mRNA. Los productos de la PCR se clonaron y secuenciaron luego. En caso necesario, se repitió el proceso con un nuevo iniciador complementario al término 5' del fragmento promotor para asegurar que las secuencias de control de los promotores se habían aislado.
Utilizando los procedimientos arriba descritos, se identificó un gen, KNT1, y se aisló de las plantas de tabaco. Un fragmento promotor de KNT1 de longitud aproximada 0,8 Kpb desde el sitio de comienzo de la transcripción, se aisló y se insertó en el vector informador GUS, pBI101 (Jefferson et al., 1987). La construcción resultante, pBIN5101, se utilizó para transformar plantas de tabaco. Después de infección con M. javanica, se observó una expresión fuerte de GUS en el sitio de alimentación de los nematodos.
Se demostró que el gen KNT1 tiene homólogos en especies de plantas distintas del tabaco. Éstas incluyen, pero sin carácter limitante, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum y Beta vulgaris. El gen KNT1 es inducido también tanto por los nudos de las raíces como por especies de nematodos de los quistes.
La construcción pBIN05101 fue depositada por Advanced Technologies (Cambridge) Limited de 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0WA, Inglaterra, de acuerdo con el Tratado de Budapest acerca del Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para propósitos de Procedimientos de Patente en las Nacional Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Escocia, el 20 de marzo de 1997 bajo el número de acceso NCIMB 40870. El vector contiene los bordes izquierdo y derecho del T-DNA de la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens. Entre los bordes se encuentran un sitio de clonación múltiple y un gen de resistencia a la kanamicina bajo el control de un promotor de plantas (Nos). Externamente a los bordes, el vector contiene un gen bacteriano de resistencia a la kanamicina. El inserto en el vector está constituido por el promotor KNT1-secuencia codificante de glucuronidasa-promotor KLT1.
Producción de construcciones para estudios de transformación de plantas, construcciones que comprenden la proteína desactivadora de los ribosomas del maíz y promotores que se inducen en y/o adyacentes a un sitio de alimentación de los nematodos
Se utilizaron construcciones que comprendían el promotor sensible a los nematodos KNT1 enlazado a una secuencia codificante de la proteína desactivadora de los ribosomas del maíz y un terminador Nos en un vector de transformación de plantas derivado de pATC (Figura 10) en los estudios de transformación. Éstos fueron diseñados para estudiar la eficacia de las construcciones de RIP para inducir la muerte celular en los sitios de alimentación establecidos por los nematodos. Las construcciones se ensamblaron en el vector pDVM y a continuación las casetes transgénicas se cortaron con la endonucleasa de restricción NotI y se clonaron al vector binario pATC. Las construcciones se introdujeron en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por electroporación.
Las construcciones producidas fueron como sigue:
1.
pATCKNT1/Pro RIP
2.
pATCKNT1/RIP-P
3.
pATCKNT1/RIP \alpha
4.
pATCKNT1/RIP \beta
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Se preparó una construcción final que comprendía ambas regiones codificantes RIP\alpha y RIP\beta bajo dos promotores separados sensibles a los nematodos (Figura 5). El segundo promotor utilizado se llamó KNT2 (véase SEQ ID No.: 18). Esta construcción se llamó:
pATC KNT2/RIP \alpha KNT1/RIP \beta
El promotor KNT1 se expresa en las células del sitio de alimentación, los ápices de las raíces y, en mucho menor grado, en otros meristemos. El promotor KNT2 se expresa en el cuerpo de la raíz y las células del sitio de alimentación (pero no en los ápices de la raíz). Existe por tanto expresión solapante en las células del sitio de alimentación que causa citotoxicidad incrementada específica en las plantas donde se expresan juntamente los dominios \alpha y \beta.
Las construcciones para uso en las otras realizaciones de esta invención se preparan análogamente con promotores de direccionamiento adecuados para la realización alternativa apropiada.
Producción de plantas transgénicas que contienen construcciones RIP de maíz bajo el control de promotores inducibles por nematodos
Todas las construcciones anteriores (véase la Figura 5) se introdujeron en la variedad cultivada Hermes de patata y la variedad cultivada K326 de tabaco, por cocultivo de discos de hojas utilizando Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Horsch et al., 1985).
Se generaron plantas transgénicas de patata y tabaco, y se llevaron a cabo pruebas de resistencia a los nematodos en invernadero.
Cribados de resistencia utilizando plantas de tabaco infectadas con Meloidogyne javanica
Se plantaron plántulas de tabaco transgénicas y de control en un diseño ciego experimental aleatorizado en Rootrainers de compost para tiestos fino sin fertilizante y se cortaron por la mitad las hojas más grandes. Las plantas se cubrieron con politeno para mantener una humedad elevada durante el aislamiento. Se practicaron gradualmente orificios en el politeno para reducir la humedad antes de completar el tiempo de aislamiento. Una semana después del aislamiento, las pequeñas plantas se infectaron con 200 nematodos rayados J2 de Meloidogyne javanica. Se efectuó solamente riego con alimentación líquida posteriormente una vez que el suelo se hubo secado suficientemente para hacer que las hojas comenzaran a marchitarse. Los Rootrainers se pusieron en bandejas sobre esterilla caliente para mantener la temperatura del suelo entre 25 y 30ºC. Se recortaron luego las hojas una vez a la semana a fin de nivelar el crecimiento y prevenir que los puntos de crecimiento llegaran a quedar cubiertos con hojas mayores debido a la densidad de plantación.
Se recogieron las plantas para su registro aproximadamente 8 semanas después de la infección. Típicamente, las raíces se lavaron y se registraron respecto a crecimiento de la raíz, nivel de la formación de agallas y tamaño de las agallas.
Cribados de resistencia utilizando plantas de patata infectadas con Globodera pallida, patovariedad 2/3
Se condujeron pruebas primarias de resistencia de las plantas transgénicas en pruebas ciegas aleatorizadas sobre lotes de 20 a 25 líneas transgénicas con al menos 10 réplicas de dos o más líneas de control. Se llenaron los Rootrainers o recipientes con una mezcla de limo y arena 50:50. Se humedecen 12 litros de limo y arena con 1250 ml de agua para dar un contenido de agua de 40%. Se depositaron tres quistes en las raíces de cada plántula, que se insertó luego en un orificio en el compost y el compost se apretó suavemente alrededor de las raíces. Se aislaron las plantas y, después de ello, se regaron con alimento líquido solamente una vez a la semana o cuando el suelo se había secado suficientemente. Una vez que las plantas alcanzaron aprox. 10 cm de altura, se recortaron los ápices para igualar el crecimiento.
Se cultivaron las plantas durante aproximadamente 3 meses para permitir la maduración de los quistes. Se dejaron secar luego las plantas durante un mes más. Se recuperaron los quistes de las plantas por lavado de la tierra y las raíces enérgicamente en un vaso de precipitados con 250 ml de agua. Se dejó que la tierra se sedimentara durante unos cuantos minutos, y se vertió el sobrenadante en un embudo de filtración grande con un disco de papel de filtro Whatman No. 1 de 32 cm de diámetro. El sobrenadante se dejó reposar en el embudo durante 1 minuto y a continuación se tocó el centro de la superficie de la solución con una gota de detergente Hederol para desplazar el material que se encontraba en el menisco de la superficie de la solución al costado del filtro. La base del filtro se perforó luego para eliminar el resto de la solución. Se retiró el disco de filtración y se contó el número de quistes adheridos
al mismo.
Se consideró que las plantas exhibían signos de resistencia si las mismas estaban infectadas con menos quistes que las líneas de control sensibles.
Registro de infección del tabaco y la patata con nematodos por tinción
Se plantaron plantas de tabaco de cultivo de tejido o plántulas y se dejaron crecer como se ha descrito arriba con la modificación siguiente. Se infectaron las plantas con 1000 nematodos rayados J2 de Meloidogyne javanica. Las plantas de patata se infectaron con Globodera pallida como se ha descrito arriba.
Un mes después de la infección, se tomaron esquejes de las plantas. Las plantas se lavaron para limpiarlas de tierra y se blanquearon durante 4 minutos en hipoclorito de sodio al 1%. Se retiró el blanqueante por enjuagado con agua y se empapó luego en un gran volumen de agua durante 15 minutos con agitación ocasional. Las raíces se pusieron luego en 10 a 15 ml de una dilución 1:500 de solución stock de fuchsina ácida en ácido acético al 5%. (El stock de fuchsina ácida se preparó de acuerdo con "Introduction to Plant Nematology" por V.H. Dropkin, ISBN 0-471-85268-6. Se disuelven 0,35 g de fuchsina ácida en 100 ml de ácido acético glacial 1:3 respecto a agua destilada). Las muestras teñidas se pusieron en un baño de agua hirviente durante 4 minutos y se transfirieron a 37ºC durante 4 horas. Se decantó el tinte y las muestras se aclararon por adición de glicerol acidificado e incubación a 37ºC durante una noche.
Las raíces aclaradas con los nematodos teñidos se montaron luego en cápsulas Petri (la muestra se puso en el interior de la tapa de una cápsula Petri y la base de la cápsula Petri se utiliza para extender y comprimir la muestra para observación más fácil en el microscopio).
Se observaron las muestras con 20 hasta 100 aumentos y se registraron los nematodos de varias maneras. Los nematodos de los nudos de las raíces se clasificaron en tres grupos: a) nematodos vermiformes, b) nematodos saculiformes que no producen huevos y c) nematodos saculiformes que producen huevos. Se midieron los diámetros de los nematodos esencialmente saculiformes utilizando un retículo ocular. Se clasificaron también los nematodos de los quistes en tres grupos: a) nematodos vermiformes, b) nematodos vermiformes obesos que no producen huevos y c) nematodos globosos que producen huevos. Se midieron los diámetros de los nematodos esencialmente globosos utilizando un retículo ocular.
Se midieron los efectos de resistencia en términos de números absolutos de nematodos en los sistemas radiculares, en términos de la proporción de nematodos que alcanzaban la madurez y producían huevos, y en términos del tamaño de los nematodos.
Se identificaron cierto número de líneas de resistencia de tabaco y patata que expresaban RIP de maíz como un componente efector simple y como un sistema de dos componentes.
Prueba en tiestos de líneas de patata RIP del maíz seleccionadas
Tubérculos despojados de brotes de líneas seleccionadas de patata de la variedad cultivada Hermes se replicaron y se utilizaron en una prueba estándar de resistencia a los nematodos de los quistes de la patata con G. pallida de la variedad 2/3 para la cual está disponible solamente una resistencia parcial. Las patatas comprendían cuatro líneas transformadas con la RIP-P procesada del maíz y cuatro líneas transformadas con la construcción de dos componentes RIP\alpha/RIP\beta. La prueba incluía Hermes y Prairie sin transformar no sólo como tubérculos stock (control) sino también como material que ha pasado por el mismo procedimiento de cultivo de tejidos que las plantas transgénicas (controles ncc). Adicionalmente, la prueba incluía las variedades de control sin transformar Desiree y Maris Piper (ambas sensibles a PCN), y Sante (resistencia parcial a PCN de la variedad 2/3, la mejor línea disponible comercial-
mente.
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La Tabla 1 proporciona un sumario de los resultados expresados como sensibilidad porcentual de las líneas transgénicas con relación a los controles carentes de resistencia.
TABLA 1
1
Había un grado importante de variación en los recuentos de quistes PCN tanto entre los controles como entre las réplicas individuales, lo que puede atribuirse a factores ambientales. Sin embargo, una línea RIP de maíz procesada (RIP-P) y una línea RIP de maíz de dos componentes exhibían una reducción significativa en la sensibilidad con relación a las líneas de control. Éstas están marcadas con ** en la Tabla 1. En el sistema de dos componentes es sorprendente observar que algunas plantas se mantienen viables, a pesar de la expresión de RIP \alpha o \beta en los sitios no solapantes.
Análisis de nematodos en líneas de tabaco transgénicas que expresaban RIP de maíz
Progenie de líneas de tabaco transgénicas transformadas con la RIP-P de maíz procesada o la construcción RIP de maíz de dos componentes, Se infectó con nematodos de los nudos de las raíces. Un mes después de la infección, las raíces de las plantas infectadas se trataron con fuchsina ácida para teñir los nematodos in situ. Se contaron las agallas y los nematodos teñidos y se asignaron a las cuatro categorías siguientes: agallas vacías, juveniles vermiformes, adultos esféricos, y adultos ponedores de huevos (Figura 9).
Si bien no había diferencia significativa alguna en el número total de nematodos y agallas por línea entre las líneas transgénicas y los controles, tres líneas transgénicas, D, G y K, exhibían menos adultos ponedores de huevos.
A fin de determinar si las líneas RIP de maíz reducen el crecimiento de los nematodos en las plantas, se midió el tamaño de los nematodos adultos como se ha descrito arriba.
Los nematodos adultos no ponedores de huevos eran significativamente más pequeños para las líneas D, G y K comparados con los que se encontraron en las plantas de control (Figura 6). Sin embargo, los tamaños de los nematodos ponedores de huevos exhibían diferencias mucho menores (Figura 7), lo que indicaba que la puesta de huevos parece ocurrir únicamente cuando los nematodos han alcanzado un tamaño mínimo (de 32 a 36 unidades del retículo). La expresión de la RIP parece ralentizar el crecimiento de los nematodos, dando como resultado el retardo en alcanzar el tamaño apto para la puesta de huevos (Figura 8).
En contraste, aquellas líneas que no exhibían reducción alguna en el número de nematodos infectantes o en el número de hembras ponedoras de huevos no exhibían la disminución en el tamaño de las hembras adultas que se observa con las líneas D, G y K.
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Estos resultados indican por tanto que las construcciones RIP de maíz y RIP de maíz de dos componentes afectan al desarrollo de los nematodos de los nudos de las raíces.
Para uso en otros aspectos de la invención, se utiliza el promotor apropiado con una proteína desactivadora de los ribosomas del maíz o parte de la misma en enlace operativo de acuerdo con los procesos descritos en este aspecto ilustrado como ejemplo.
Esterilidad masculina inducida en el polen por expresión de una proteína desactivadora de los ribosomas (RIP) Construcciones
La secuencia de barnasa de Bacilus amyloliquefaciens (Hartley R.W. 1998) y una proteína desactivadora de los ribosomas (RIP-P; SEQ ID No.: 2) de granos de maíz (Bass et al. 1995) se insertaron cada una en construcciones separadas detrás de un promotor específico del tapete (TA29, Mariani, C., 1989) de Nicotiana tabacum. Las construcciones se produjeron (Figura 13) y se transformaron utilizando el vector de plantas pBI131 (menos el promotor 35S de CaMV). Las construcciones se transformaron en la variedad cultivada Desiree de Solanum tuberosum spp. tuberosum para permitir la comparación directa con el fenotipo normal Desiree.
Transformación y regeneración de plantas transgénicas
Esta casete anterior se clonó en el vector binario pBI121 como un fragmento NotI. La construcción final se introdujo en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 competente por electroporación como ha sido descrito por Shen W. et al., 1989.
Subsiguientemente, discos de hojas de Solanum tuberosum tuberosum cv. Désirée se transformaron como ha sido descrito por un protocolo estándar (Dietze J. et al. 1995). Las plantas transgénicas se enraizaron en MS líquido (Murashige, T. y Skoog, F., 1962 suplementado con 0,1 mg l^{-1} de NAA antes de la transferencia al suelo.
Las plantas regeneradas se transplantaron en tiestos de mezcla arena:limo 50:50. Las plantas de cada variedad cultivada se dejaron crecer en un invernadero de aislamiento a 18 \pm 2ºC en condiciones de 14 horas de luz diurna con riego en caso requerido. Las líneas no transgénicas se establecieron en cultivo de tejidos procedentes de tallos de plantas cultivadas en un invernadero. Las plantas generadas por esta fuente se transplantaron a los invernaderos al mismo tiempo que las líneas transgénicas.
Las líneas transgénicas y de control se cribaron respecto a polen viable utilizando un bioensayo de germinación del tubo polínico y su capacidad para absorber diacetato de fluoresceína. Las líneas seleccionadas que exhibían pérdida de polen viable más las plantas de control se utilizaron posteriormente en experimentos de cruzamiento manual para confirmar la posibilidad o imposibilidad de que su polen fertilizara cruzadamente los estigmas de otra planta de patata.
Formación del tubo polínico
Se estudió la germinación del polen utilizando el protocolo de Krishnakumar y Oppenheimer (1999).
Se recubrieron portaobjetos de vidrio con medio fundido de germinación de polen. Ésta es una solución a pH 6 de CaCl_{2} 1 mM, Ca(NO_{3})_{2} 1 mM, MgSO_{4} 1 mM, ácido bórico al 0,01%, sacarosa al 18% y agarosa al 0,5%. Se retiró una antera de la planta de test y se dejó caer su polen sobre el portaobjetos. Se dejó luego el último durante 18 horas en una cámara con aproximadamente 100% de humedad relativa en una incubadora a 22-25ºC en la oscuridad. Se monta un cubreobjetos sobre el portaobjetos y se cuenta la proporción de granos con tubos de germinación por examen de los granos de polen bajo iluminación en campo brillante. La Figura 14 muestra la formación del tubo polínico para polen de tipo salvaje pero su ausencia del polen anormal de una de las líneas RIP-P que se seleccionaron como poseedoras de esterilidad masculina.
Tinción del polen viable con diacetato de fluoresceína (FDA)
El procedimiento utiliza una solución stock de diacetato de fluoresceína llevada hasta 2 mg/ml en acetona. Antes del uso, la misma se diluyó 1000 veces en sacarosa al 20% en agua destilada que se había esterilizado previamente por filtración. Se retiraron individualmente con fórceps las anteras de una flor de patata y se golpearon ligeramente sobre un portaobjetos de vidrio para recoger los granos de polen. Se añadió la solución diluida de FDA y se montó un cubreobjetos sobre el portaobjetos. La preparación se examinó inmediatamente bajo un microscopio (Leica DMR) con epi-iluminación y filtros apropiados para examen de las emisiones fluorescentes por fluoresceína. Las imágenes se registraron utilizando una cámara adjunta (Olympus OM4) y película de inversión (Kodak Elite 100 ASA). La Figura 15 muestra un ejemplo de polen de tipo salvaje en iluminación de campo brillante. En comparación, las líneas transgénicas que expresaban SEQ ID No.: 2 o barnasa proporcionaban polen que estaba marchito y no producía tubos polínicos. Esto indicaba una falta de viabilidad para el polen de las líneas transgénicas.
Como resultado tanto de los ensayos de germinación del tubo polínico como de la absorción de FDA, un total de ocho de las 37 líneas RIP-P que se ensayaron se seleccionaron por tener una viabilidad del polen muy baja. Se demostró también que un total de 2 de 21 líneas de barnasa carecían de polen viable. Los datos para cada una de estas líneas, más un ejemplo para cada una de las construcciones de una línea rechazada como poseedora de esterilidad masculina inadecuada se proporcionan en la Tabla 2. Se incluyen también algunas líneas de control.
TABLA 2
2
Ocho líneas transgénicas RIP y dos líneas transgénicas que expresaban barnasa se seleccionaron como masculinamente estériles a partir de los bioensayos de germinación del tubo polínico y por una incidencia baja de absorción de FDA por los granos de polen. Para comparación, se muestran las líneas transgénicas que no exhibían un nivel alto de polen no viable y variedades cultivadas de patata de control de tipo salvaje no transformadas (na = no ensayado).
La diferencia en frecuencia de la germinación de los tubos polínicos o la absorción de FDA para las líneas RIP y líneas de barnasa positivas era estadísticamente diferente de la de los controles (test \chi^{2}, P<0,001 en ambos casos).
Polinización manual de la patata
Se utilizó este procedimiento para comprobar que tanto una línea RIP particular (SEQ ID No.: 2) como una línea de barnasa evaluadas como masculinamente estériles la germinación del tubo polínico y la absorción de FDA no consiguieron fertilizar un estigma de una flor de patata que recibía el polen. Para este trabajo se seleccionó también una gama de variedades cultivadas de control. Las variedades cultivadas Revolution y Waycha son formas de Solanum tuberosum spp andigena. Se seleccionaron ambas dado que la variedad cultivada Waycha produce bayas abundantemente, mientras que Revolution es masculinamente estéril, por lo que no se forma baya alguna a no ser que se done polen a la misma. Los experimentos de control establecen que la polinización manual es a menudo eficaz con una fuente de polen viable.
Se utilizó también en el trabajo la variedad cultivada de Solanum tuberosum spp tuberosum Desiree. Esta variedad produce bayas abundantemente y es una variedad cultivada para la cual la patata auténtica forma semillas comúnmente. Dada su capacidad normal para producir abundantemente bayas, la misma representa una variedad cultivada adecuada para determinar la pérdida de esta capacidad utilizando uno de los genes RIP que es objeto de esta invención. La eficacia de este transgén en la prevención de la fertilización se comparó con la obtenida utilizando una barnasa.
Cuando se produjo una flor, se preparó la misma para un cruzamiento manual forzado. Si la misma iba a ser receptora de polen, sus pétalos y posteriormente sus anteras se cortaron de tal modo que sobresaliera el estigma. Si la flor iba a ser donante de polen, se cortaron los pétalos y el estigma. En este caso se tomó con fórceps y se golpeó suavemente contra la superficie de una baldosa negra a fin de que la deposición del polen pudiera comprobarse a simple vista. La fuente de polen se frotó a través del estigma de los receptores o donantes de polen. Todas las flores no utilizadas se quitaron de la planta. Cuando se hubo fertilizado satisfactoriamente un estigma, la flor no caía y comenzaba a hincharse para formar una baya. Si la fertilización fallaba, el estigma caía de la planta al cabo de una semana y no formaba baya alguna. La presencia de bayas era un indicador fiable preliminar de que se había producido la fertilización. Experimentos preliminares establecieron que las bayas contenían semillas, pero su número por baya no se contó rutinariamente.
Los resultados que se muestran en la Tabla 3 confirman que el polen de la línea 33 de la línea RIP y la línea 12 de barnasa seleccionadas como masculinamente estériles por los bioensayos de terminación (sic) del tubo polínico y carencia de absorción de FDA por granos de polen fallaban de hecho en lo referente a la fertilización del estigma de la patata.
TABLA 3
3
La Tabla 3 muestra un resumen de cruzamientos manuales para estigmas individuales para diferentes variedades cultivadas como receptores o donantes de polen, y el número de bayas que resultaron subsiguientemente. Los cruzamientos con Desiree transgénica se realizaron para confirmar la conclusión de un alto nivel de esterilidad masculina para dos líneas identificadas como masculinamente estériles en los bioensayos de germinación del tubo polínico y por la ausencia de absorción de FDA por los granos de polen.
Referencias
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<130> RD-ATC-28
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<140>
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<141>
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<160> 18
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 909
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<212> ADN
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<213> Zea mays 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> (1)..(48)
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<223> Dominio N-terminal
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> (865)..(903)
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<223> Dominio c-terminal
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> (484)..(558)
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<223> Dominio Central
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> mutación
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<222> (226)..(231)
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<223> Sitio SacI eliminado de secuencia de reemplazo
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> (1)..(3)
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<223> Codón de iniciación añadido vía cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> (904)..(909)
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<223> Codones de parada añadido vía cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> (1)..(24)
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<223> Sitio de unión para el cebador ProRIPBF
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> (205)..(249)
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<223> Sitio de unión para el cebador RIPSDF
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> Complemento ((205)..(249))
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<223> Sitio de unión para el cebador RIPSDR
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
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<222> Complemento ((880)..(909))
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<223> Sitio de unión para el cebador ProRIPSR
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> (49)..(73)
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<223> Sitio de unión para el cebador RIP1BF
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> Complemento ((837)..(864))
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<223> Sitio de unión para el cebador RIP2SR
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> (463)..(579)
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<223> Sitio de unión para el cebador RIPCDF que complementa un dominio central
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> Complemento ((463)..(579))
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<223> Sitio de unión para el cebador RIPCDR que complementa un dominio central
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<400> 1
\hskip1cm
4 
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<210> 2
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<211> 750
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<212> ADN
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<213> Zea mays 
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> (1)..(3)
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<223> Codón de iniciación añadido vía cebador PCR
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<220>
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<221> mutación
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<222> (181)..(186)
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<223> Sitio SacI eliminado de secuencia de reemplazo
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> (745)..(750)
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<223> Codón de parada añadido vía cebador de PCR
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<400> 2
\hskip1cm
5 
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<210> 3
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<211> 444
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<212> ADN
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<213> Zea mays 
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<220>
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<221> Característica variada
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<222> (1)..(3)
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<223> Codón de iniciación añadido vía cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> mutación
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<222> (181)..(186)
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<223> Sitio SacI eliminado de secuencia de reemplazo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica variada
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<222> (439)..(444)
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<223> Codón de parada añadido vía cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
6 
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de iniciación añadido vía cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (349)..(354)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de parada añadido vía cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador ProRIPBF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitios de restricción introducidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador ProRIPSR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitios de restricción introducidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIP1BF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitios de restricción introducidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIP2SR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitios de restricción introducidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIP1SR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitios de restricción introducidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIP2BF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitios de restricción introducidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIPCDF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIPCDR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIPSDF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nucleótidos modificados para separar el sitio SacI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador RIPSDR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nucleótidos modificados para separar el sitio SacI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador SUB21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador SUB25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador LDT15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
21

Claims (12)

1. Un método de producción de una planta transgénica que alberga en el genoma de la planta un gen quimérico, gen cuya expresión causa citotoxicidad a la planta en un sitio diana, en donde una planta se transforma con un gen quimérico que comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura de desactivación de los ribosomas del maíz o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha secuencia codificante comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2 o una secuencia codificante que es al menos 70% homóloga a la misma.
2. Un método de producción de una planta transformada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia codificante tiene al menos 80% de homología con SEQ ID No.: 2.
3. Un método de producción de una planta transformada de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha secuencia codificante tiene al menos 85% de homología con SEQ ID No.: 2.
4. Un método de producción de una planta transformada de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha secuencia codificante tiene al menos 90% de homología con SEQ ID No.: 2.
5. Un método de producción de una planta transformada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho gen quimérico comprende adicionalmente una secuencia terminadora 3' no traducida.
6. Un método de producción de una planta transformada de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha secuencia terminadora 3' no traducida procede de genes vegetales, bacterianos, o virales.
7. Un método de producción de una planta transformada de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, en donde dicha secuencia terminadora 3' no traducida se selecciona del grupo que comprende la secuencia terminadora rbcS E9 del guisante, la secuencia terminadora nos derivada del gen nopalina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la secuencia terminadora 35S del virus del mosaico de la coliflor.
8. Un método de producción de una planta transformada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho gen quimérico comprende una secuencia intensificadora de la transcripción o la traducción y/o secuencias de direccionamiento intracelular e intrones, y/o secuencias de nucleótidos capaces de operar para facilitar el proceso de transformación y la expresión estable de dicho gen quimérico.
9. Una planta transformada con un gen quimérico de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho gen quimérico comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz o parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha secuencia codificante comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2, o una secuencia codificante que es al menos 70% homóloga a ella.
10. Una célula vegetal transformada con un gen quimérico de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho gen quimérico comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha secuencia codificante comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2, o una secuencia codificante que es al menos 70% homóloga a ella.
11. Un aislado de DNA de un gen quimérico que comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha secuencia codificante comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2, o una secuencia codificante que es al menos 70% homóloga a ella.
12. Un vehículo de expresión biológicamente funcional que contiene un gen quimérico que comprende un promotor, promotor que se induce en y/o adyacente a un sitio diana, enlazado operativamente a una secuencia codificante, secuencia codificante que codifica una proteína madura desactivadora de los ribosomas del maíz, o una parte de la misma, estando constituida dicha secuencia codificante por una RIP madura recombinante que comprende un dominio \alpha y un dominio \beta dispuestos contiguamente, en donde dicha secuencia codificante comprende la secuencia identificada en SEQ ID No.: 2, o una secuencia codificante que es al menos 70% homóloga a ella.
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