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ES2314261T3 - Inhibidores de src quinasa para uso en la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Inhibidores de src quinasa para uso en la enfermedad de alzheimer. Download PDF

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ES2314261T3
ES2314261T3 ES03776874T ES03776874T ES2314261T3 ES 2314261 T3 ES2314261 T3 ES 2314261T3 ES 03776874 T ES03776874 T ES 03776874T ES 03776874 T ES03776874 T ES 03776874T ES 2314261 T3 ES2314261 T3 ES 2314261T3
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ES
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disease
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alzheimer
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Luc Mercken
Nicola Zambrano
Tommaso Russo
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Aventis Pharma SA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract

Método para identificar un compuesto terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas a) proporcionar una proteína Src y b) determinar el efecto inhibidor de un compuesto en la actividad Src quinasa.

Description

Inhibidores de Src quinasa para uso en la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención se refiere a la identificación de inhibidores de Src quinasa, a ensayos y a métodos útiles para dicha identificación y a la utilización del inhibidor de Src PP2 para la preparación de fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo del cerebro, que está acompañado a nivel celular de una pérdida masiva de neuronas en el sistema límbico y en la corteza cerebral. En las áreas del cerebro afectadas pueden detectarse a nivel molecular depósitos de proteínas, denominadas placas, que son una característica esencial de la enfermedad de Alzheimer. La proteína que aparece más frecuentemente en estas placas es un péptido de 40 a 42 aminoácidos de tamaño, que se designa como péptido A\beta. Este péptido es un producto de escisión de una proteína mayor de 695 a 770 aminoácidos, la denominada Proteína Precursora Amiloide (APP).
APP es una proteína transmembrana integral, que en primer lugar atraviesa la bicapa lipídica. Con mucho, la mayor parte de la proteína es extracelular, mientras que el dominio C-terminal más corto está dirigido hacia el citosol (Figura 1). APP es el sustrato de tres proteasas diferentes: \alpha-secretasa, \beta-secretasa y \gamma-secretasa. En APP, aproximadamente dos tercios del péptido A\beta se originan a partir del dominio extracelular y aproximadamente un tercio a partir del dominio transmembrana.
Además de la APP unida a la membrana, puede detectarse una forma secretada de APP que consiste en el ectodominio grande de APP y se designa como APP_{sec} ("APP secretada"). APP_{sec} se forma a partir de APP por escisión proteolítica, que es efectuada por la \alpha-secretasa (Figura 2). Esta escisión proteolítica tiene lugar en la secuencia de aminoácidos del péptido A\beta (después del resto de aminoácido 16 del péptido A\beta). La proteolisis de APP por la \alpha-secretasa evita así la formación del péptido A\beta.
El péptido A\beta sólo puede formarse por lo tanto a partir de APP en una vía de procesamiento alternativa. Se postula que en este procesamiento están implicadas dos proteasas, una proteasa, que se designa como \beta-secretasa, que escinde en el extremo N-terminal del péptido A\beta de APP y la segunda proteasa, que se designa como \gamma-secretasa, que libera el extremo C-terminal del péptido A\beta (Kang, J. et al., (1987) Nature, 325, 733 (Figura 2).
Existen muchas indicaciones de que el péptido A\beta es un factor crucial en la aparición de la enfermedad de Alzheimer. Entre otros, se postula la neurotoxicidad de las fibrillas de A\beta en cultivo celular (Yankner, B.A. et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87, 9020). En pacientes con el síndrome de Down, en los que APP aparece en una copia adicional, también aparece la neuropatología característica de la enfermedad de Alzheimer incluso a una edad de 30 años. Aquí, se asume que la sobreexpresión de APP produce una conversión incrementada en el péptido A\beta (Rumble, B. et al., (1989), N. Engl. J. Med., 320, 1446).
Además, la indicación más fuerte del papel central del péptido A\beta en la enfermedad de Alzheimer son las formas familiares de la enfermedad. Aquí, se encuentran mutaciones en el gen APP alrededor del área de los sitios de escisión de la secretasa o en dos genes más asociados a AD (presenilinas), que en cultivo celular da lugar a un incremento significativo de la producción de A\beta (Scheuner, D. et al., (1996), Nature Medicine, 2, 864).
Existen varias indicaciones de que APP es escindida en primer lugar por la \beta-secretasa, para servir posteriormente como sustrato para la \gamma-secretasa (Maruyama, K. Y. et al., (1994) Biochem. Biophys Res Commun, 202, 1517; Estus, S. et al., (1992), Science, 255, 726). La \gamma-secretasa tiene por lo tanto un papel crucial en la formación del péptido A\beta. Una demostración de la actividad de la \gamma-secretasa que se utiliza habitualmente es la detección del péptido A\beta, que, sin embargo, es habitualmente difícil.
Una razón importante para esto es que sólo una pequeña parte de APP se convierte en el péptido A\beta (Simons M, et al., Neurosci (1996) 1;16(3):899-908). Además, el péptido A\beta es un fragmento pequeño de degradación de aproximadamente 4 kDa y, debido a su carácter hidrofóbico, tiene una gran tendencia a agregarse consigo mismo de manera que precipita fácilmente en condiciones fisiológicas (Hilbich, C. et al., (1991) J. Mol. Biol., 218, 149).
La cola C-terminal corta con una longitud de 47 aminoácidos de APP está expuesta al citosol y es el sitio de interacción de adaptadores moleculares que contienen dominios PTB, denominados Fe65, X11, m-dab y Jip1. Como la unión de estas proteínas es dependiente de la secuencia YENPTY de APP, se espera que sus interacciones no sean simultáneas (T. Russo et al. (1998) FEBS Lett. 434, 1-7; N. Zambrano et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6399-6405). En efecto, se ha mostrado, en células en cultivo, que las proteínas Fe65 y X11 tienen efectos opuestos en el procesamiento proteolítico de APP (Sabo S. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 7952-7957; Borg J.P. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 14761-14766). Una posible explicación para estos descubrimientos puede residir en el reclutamiento, bien por Fe65 o X11, de APP en diferentes complejos macromoleculares, dependiendo de la interacción de diferentes conjuntos de proteínas con los demás dominios de interacción proteína-proteína de los dos adaptadores.
El citodominio de APP contiene varios restos de serina y treonina, que se fosforilan in vitro por diferentes actividades quinasa. Thr668 es un sitio principal de fosforilación in vivo, fosforilándose por quinasas neuronales dependientes de ciclina, Cdk5 en neuronas (lijima, K. et al. (2000) J. Neurochem. 75, 1085-1091), cdc2 quinasa en células en división (Suzuki, T. et al. (1994) EMBO J. 13, 1114-1122; Oishi, M. et al. (1997) Mol. Med. 3, 111-123) y glucógeno sintasa quinasa 3b (GSK3b) y proteína quinasa activada por estrés 1b (SAP quinasa 1b) in vitro (Aplin, E. E. et al. (1996) J. Neurochem. 67, 699-707; Standen, C. L. et al. (2001) J. Neurochem. 76, 316-320). Se ha mostrado que la fosforilación de APP regula la extensión de las neuritas en células PC12 que se diferencian (Ando, K. et al. (1999) J. Neurosci. 19, 4421-4427), mientras que, a nivel molecular, la fosforilación de APP puede regular la unión a los adaptadores que contienen el dominio PTB y su procesamiento (Ando K. et al. (2001) J Biol. Chem., 276, 40353-40361).
Previamente, se demostró que APP se fosforila en la tirosina 682 en células que expresan una forma activa de la tirosina quinasa no asociada a receptor Abl (Zambrano N. et al. (2001) J Biol. Chem. 276, 19787-92); Abl activa se recluta cerca de APP por Fe65, que puede unirse simultáneamente a estas dos proteínas mediante su dominio WW (Abl) y dominio PTB2 (APP). La fosforilación de Tyr682 de APP genera un sitio de acoplamiento para el dominio SH2 de Abl y, de hecho, se forman complejos estables entre APP y Abl.
Con el fin de ensayar la hipótesis de que la fosforilación en tirosina regula la actividad biológica de pp60c-src, Kmiecik y Shalloway (1987) Cell 49, 65-73 describieron la construcción y estudio de mutantes de pp60c-src en los que Tyr 527 y Tyr 416 se alteraron independientemente o coordinadamente a fenilalanina. La mutación
Tyr- - - -Phe 527 activó fuertemente las actividades de transformación y quinasa de pp60c-src, mientras que la introducción adicional de una mutación Tyr- - - -Phe 416 suprimió estas actividades. La mutación Tyr- - -Phe 416 de pp60c-src normal eliminó su actividad de transformación parcial, lo que sugiere que la fosforilación transitoria o restringida de otra forma de Tyr 416 es importante para la función de pp60c-src incluso si no se observa in vivo una fosforilación estable. Normalmente, pp60c-src se fosforila in vivo en la tirosina 527, un resto que no está presente en pp60v-src (su homólogo transformante) y no en la tirosina 416, su sitio de autofosforilación in vitro.
Williamson et al. (2002) J. Neurochem. 22, 10-20) han descrito la fosforilación rápida de proteínas neuronales incluyendo Tau y la quinasa de adhesión Focal en respuesta a la exposición al péptido amiloide-\beta y una implicación de la familia Src de proteínas quinasas.
Slack, B. E. y Berse; B. (1998) han descrito en Society for Neuroscience Abstracts, Vol. 24, No. 1-2, p. 208 (Conference/Meeting Information: 28th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Parte 1, Los Angeles, California, EEUU, Nov. 7-12, 1998 Society for Neuroscience, ISSN: 0190-5295) un papel para las tirosina quinasas en la estimulación de la liberación de APP por acción de los receptores muscarínicos m3 de la acetilcolina. Han descrito un papel para la tirosina quinasa Src en la regulación de la liberación de APP_{sec} por los receptores muscarínicos. Han demostrado que un incremento de la forma activa de Src da lugar a una disminución de secAPP.
La presente invención proporciona métodos para identificar agentes terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Una realización de la invención proporciona métodos para identificar inhibidores de la actividad Src, comprendiendo los métodos las etapas
a)
proporcionar una proteína Src (es decir, un ADN que codifica Src bajo el control de un elemento de expresión) y
b)
determinar si un compuesto inhibe la actividad de Src.
La proteína Src podría ser cualquier proteína Src de mamífero, preferiblemente Src humana (SEQ ID NO. 1 (isoforma 1) y SEQ ID NO. 2 (isoforma 2)) o Src de roedor (SEQ ID NO. 3). La proteína podría obtenerse expresando ADNc de Src humano o ADNc de Src de roedor, utilizando, por ejemplo, las secuencias SEQ ID NO. 4 o SEQ ID NO. 5. Además, puede utilizarse una de las secuencias depositadas bajo el No. de Registro de Genbank M17031 o BC011566.
Para el método, se utiliza preferiblemente una célula o línea celular de mamífero en la que se expresa Src, bien de forma natural o porque la célula/línea celular se ha modificado por ingeniería genética. En una realización particular se utilizan cultivos primarios de neuronas.
Otra realización de la invención se refiere a un método para identificar compuestos, que inhiben la expresión de Src. El método comprende las etapas
a)
proporcionar una secuencia que regula la expresión de Src (es decir, una secuencia promotora de Src) y
b)
determinar si un compuesto inhibe la expresión de la proteína Src.
La secuencia que regula la expresión de Src está unida preferiblemente a un gen informador o una construcción de gen informador. Dicho gen informador puede utilizarse fácilmente para determinar si un compuesto inhibe la expresión de Src. Otra posibilidad es utilizar el gen Src. La región del cromosoma 20 que incluye el gen Src está depositada bajo el no. de Registro de Genbank AL133293.
Se ha descrito un promotor constitutivo, que puede utilizarse como una secuencia que regula la expresión de Src, así como un promotor alternativo regulado por el Factor-1a Nuclear Hepático (Bonham et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 37604) (número de registro de Genbank AF272982).
Otra realización de la invención se refiere a la utilización de PP2 (4-amino-5-(4-clorofenil)-7-(t-butil)pirazolo[3,4-d]pirimidina) para la preparación de un fármaco para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Los nuevos resultados demuestran que APP se fosforila no sólo por Abl. De hecho, la quinasa Src también es responsable de la fosforilación en tirosina de APP. Se espera que la fosforilación en tirosina de APP altere las propiedades de unión de su citodominio y entonces el procesamiento de APP podría modificarse consecuentemente. Si esto es así, se demostrará la utilidad de los inhibidores de tirosina quinasa disponibles actualmente y servirá para diseñar unos nuevos para la modulación farmacológica de la liberación de los productos de procesamiento de APP en modelos celulares y animales de la enfermedad de Alzheimer.
Tomados en conjunto, los resultados de los ejemplos siguientes sugieren que la actividad exógena Src es responsable de la activación de una ruta que resulta en una secreción incrementada de A\beta. Esto también sugiere que PP2 podría utilizarse como un agente farmacológico capaz de reducir la secreción de A\beta en sistemas celulares y animales asemejando el estado AD.
Por lo tanto, se utilizó una línea de células CHO que sobreexpresa de manera estable la forma APP751 que secreta niveles discretos de A\beta. Si la secreción implica la actividad endógena Src, PP2 debería ser capaz de inhibir la producción de A\beta también en este sistema celular. En efecto este es el caso, ya que, como se muestra en la Figura 6, PP2 reduce de una manera dependiente de la dosis la cantidad de A\beta en los tres tiempos ensayados (1, 3 y 12 horas), mientras que PP3, utilizada a la concentración más alta, no tiene efecto.
Estos experimentos resaltan claramente la relevancia de la activación de Src en la secreción de A\beta y constituyen la base para intentar aplicaciones farmacológicas de los inhibidores de tirosina quinasa en el tratamiento de AD. El cribado de dichos inhibidores y su optimización dará lugar al desarrollo de agentes terapéuticos potenciales e innovadores para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Ejemplos
Ejemplo 1
Cultivo celular, transfecciones y tratamientos
Se cultivaron células de riñón embrionarias humanas (HEK293) en medio mínimo modificado por Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal de ternera a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Para la transfección, las células se crecieron durante 16 horas en medio sin antibióticos y se transfectaron con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La cantidad total de ADN se mantuvo constante mediante la adición de vector de ADN vacío. 48 horas después de la transfección, se recuperó el medio de cultivo, mientras que las células se recogieron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y se lisaron suavemente en tampón de lisis (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Tritón X-100, 10% glicerol, 50 mM NaF, 1 mM vanadato de Na), en presencia de una mezcla de inhibidores de proteasas (Completo, sin EDTA, Roche). Los extractos se clarificaron mediante centrifugación a 16.000 x g a 4ºC y la concentración de proteínas se determinó por el ensayo de proteínas Bio-Rad según las instrucciones del fabricante. Para el marcaje metabólico, 36 horas después de la transfección, las células se incubaron durante 30 minutos en medio sin metionina ni cisteína, el medio se reemplazó por medio fresco que contiene 80 \muCi/ml de mezcla ^{35}S-metionina/cisteína (Promix, 1000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech). El pulso fue de 30 minutos y el medio radiactivo se reemplazó por medio completo durante 90 minutos. Las células CHO que expresan APP751 de tipo salvaje han sido descritas (N. Zambrano et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6399-6405).
Se realizaron inmuno-precipitaciones bien en el medio de cultivo o en los lisados celulares con 1 \mug/muestra del anticuerpo monoclonal 6E10 (Signet).
Las muestras radiactivas se resolvieron en 10% SDS-PAGE y se cuantificaron con un fosforimager Storm 840 (Amersham Pharmacia Biotech).
PP2 y PP3 (Hanke, J.H. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 695-701) se obtuvieron de Calbiochem y se disolvieron en DMSO; los tratamientos se realizaron en células transfectadas durante 48 horas con vehículo solo o con 1, 5 y 20 \muM de PP2 o PP3. La concentración de DMSO fue la misma en todas las muestras. Los tratamientos en células CHO/APP751 se hicieron con DMSO o PP2 (5 y 20 \muM) o PP3 (20 \muM).
Ejemplo 2
Las células HEK293 se transfectaron con vectores de expresión APP695. Este sistema celular se utilizó porque estas células se transfectan con una eficacia alta y porque expresan el conjunto completo de actividades de procesamiento requeridas para la maduración de APP. De hecho, después de la transfección de vectores de expresión APP695 humana, tanto el producto de la \alpha-secretasa (APP_{sec}) como los productos de la \beta- \gamma-secretasa (A\beta) se acumulan en el medio de cultivo. Las células HEK293 se co-transfectaron con APP y vector vacío o quinasa Abl activa (Abl-PP) o quinasa Src activa (SrcYF) y se evaluó la secreción de APP_{sec} y de A\beta. Las células transfectadas se habían sometido a un pulso de marcaje con la mezclaS-Met/Cys durante 30' y se siguieron con aminoácidos fríos durante 90'. En los experimentos de inmunoprecipitación se utilizaron tanto extractos de medio como de proteínas para la dosificación cuantitativa de APP_{sec} y holo-APP radiactivas, respectivamente. Mientras que la estabilidad de holo-APP no se afectó por la co-transfección con las quinasas activas Abl-PP o SrcYF (Figura 3A), se observó en ambos casos una reducción en las cantidades relativas de APP_{sec}, normalizada respecto a la holo-APP correspondiente sintetizada durante el periodo del pulso (Figura 3B). Esto puede interpretarse como una disminución de la actividad de la ruta de la \alpha-secretasa después de la co-transfección de APP con las quinasas activas.
Ejemplo 3
A continuación, se investigó la acumulación de A\beta en células transfectadas como se ha indicado anteriormente. La dosificación se realizó por ensayos de ELISA tipo sandwich en medio de cultivo a las 48 horas después de la transfección (Figura 4). El ensayo muestra claramente que en las células que expresan Src la cantidad de A\beta secretado es más elevada que en presencia del vector control o Abl-PP.
El mecanismo por el que Src activa induce este gran incremento en la secreción de A\beta no está claro. Sin embargo, puede depender de la fosforilación de otras proteínas, diferentes de APP, ya que la fosforilación en tirosina de APP por Abl-PP no resulta en niveles incrementados de A\beta. De acuerdo con esto, se obtiene un comportamiento similar con varios mutantes de APP que tienen sustituciones de tirosina bien a glicina o fenilalanina (datos no mostrados).
En cualquier caso, la elevación de los niveles de A\beta depende de la actividad tirosina quinasa de Src, ya que la acumulación de A\beta es sensible al tratamiento con el inhibidor específico de la familia Src, PP2. De hecho, como se muestra en la Figura 5, la exposición de células transfectadas durante 48 horas a concentraciones crecientes de PP2 resulta en una disminución dependiente de la dosis de A\beta secretada. Ni PP3, una análogo inactivo de PP2, ni el vehículo solo, afectan la elevación de A\beta por la transfección con SrcYF.
Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que la actividad Src exógena es responsable de la activación de una ruta hasta ahora no identificada que resulta en una secreción incrementada de A\beta.
Referencias
1) T. Russo et al. (1998) FEBS Lett. 434, 1-7.
2) N. Zambrano et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6399-6405.
3) Sabo S. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 7952-7957.
4) Borg J.P. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 14761-14766.
5) lijima, K. et al. (2000) J. Neurochem. 75, 1085-1091.
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8) Aplin, E. E. et al. (1996) J. Neurochem. 67, 699-707.
9) Standen, C. L. et al. (2001) J. Neurochem. 76, 316-320.
10) Ando, K. et al. (1999) J. Neurosci. 19, 4421-4427.
11) Ando K. et al. (2001) J Biol Chem.; 276, 40353-40361.
12) Zambrano N. et al. (2001) J Biol Chem 276, 19787-19792.
13) Hanke, J. H. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 695-701.
TABLA 1 Secuencia proteica de la isoforma 1 de la proteína Src humana (SEQ ID NO. 1)
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TABLA 2 Secuencia proteica de la isoforma 2 de Src humana (SEQ ID NO. 2)
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TABLA 3 Secuencia de la proteína Src de ratón (SEQ ID NO. 3)
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TABLA 4 Secuencia del ADNc que codifica la proteína Src humana (SEQ ID NO. 4)
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TABLA 5 Secuencia del ADNc de Src de ratón (SEQ ID NO. 5)
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<110> AVENTIS PHARMA S.A.
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<120> Inhibidores de SRC quinasa para utilizarse en la enfermedad de Alzheimer
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<130> FRAV2002/0030
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<160> 5
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<170> Versión PatentIn 3.1
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<210> 1
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<211> 542
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<212> PRT
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<213> Murinae gen. sp.
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3.711
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
22 
\hskip1cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.626
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
24

Claims (7)

1. Método para identificar un compuesto terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas
a)
proporcionar una proteína Src y
b)
determinar el efecto inhibidor de un compuesto en la actividad Src quinasa.
2. Método para identificar un compuesto terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas
a)
proporcionar una secuencia que regula la expresión de Src y
b)
determinar si un compuesto inhibe la expresión de la proteína Src.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que Src es Src humana o Src de ratón.
4. Método según una de las reivindicaciones anteriores, en el que Src tiene la secuencia SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3.
5. Método según la reivindicación 1, en el que Src se expresa en una célula de mamífero.
6. Método según la reivindicación 2; en el que la secuencia reguladora es el promotor de Src.
7. Utilización de PP2 (4-amino-5-(4-clorofenil)-7-(t-butil)pirazolo[3,4-d]pirimidina) para la preparación de un fármaco para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
ES03776874T 2002-10-22 2003-10-06 Inhibidores de src quinasa para uso en la enfermedad de alzheimer. Expired - Lifetime ES2314261T3 (es)

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