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ES2313779T3 - Moleculas que migran a diversos organos o tejidos seleccionados. - Google Patents

Moleculas que migran a diversos organos o tejidos seleccionados. Download PDF

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ES2313779T3
ES2313779T3 ES99912400T ES99912400T ES2313779T3 ES 2313779 T3 ES2313779 T3 ES 2313779T3 ES 99912400 T ES99912400 T ES 99912400T ES 99912400 T ES99912400 T ES 99912400T ES 2313779 T3 ES2313779 T3 ES 2313779T3
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ES
Spain
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molecule
tissue
seq
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ES99912400T
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English (en)
Inventor
Daniel Rajotte
Renata Pasqualini
Erkki I. Ruoslahti
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Original Assignee
Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
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Publication date
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Priority claimed from US09/258,754 external-priority patent/US6174687B1/en
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Abstract

Péptido aislado, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SMSIARL (SEC. ID. nº: 21), VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22) y RGRWLAL (SEC. ID. nº: 279), en el que dicho péptido migra selectivamente al sistema vascular de la próstata.

Description

Moléculas que migran a diversos órganos o tejidos seleccionados.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a los campos de la medicina molecular y a la administración de fármacos y, más específicamente, a moléculas que migran a un órgano o tejido específico.
Información de los antecedentes
Aunque el efecto de una patología determinada se manifiesta con frecuencia en todo el cuerpo de la persona afectada, generalmente, la patología subyacente puede afectar solamente un solo órgano o tejido. Es raro, sin embargo, que un fármaco u otro tratamiento sean direccionados solamente al órgano o tejido enfermo. Más frecuentemente, el tratamiento produce efectos secundarios indeseables debido, por ejemplo, a efectos tóxicos generalizados en todo el cuerpo del paciente. Sería deseable el direccionamiento de manera selectivo a órganos o tejidos, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades asociadas al órgano o tejido diana. En particular, el direccionamiento a un órgano o tejido puede ser útil para migrar la expresión de un gen en un determinado órgano o tejido ya que la incorporación de un gen extraño en las células no direccionadas puede producir efectos secundarios indeseables tal como la transformación maligna.
Se administran las sustancias más terapéuticas al órgano o tejido diana a través de la circulación. El endotelio, que recubre las superficies internas de los vasos sanguíneos, es el primer tipo celular encontrado por una sustancia terapéutica circulante en el órgano o tejido diana. Estas células proporcionan una diana para dirigir selectivamente terapias a un órgano o tejido.
El endotelio puede presentar distintas morfologías y marcadores bioquímicos en diferentes tejidos. Los vasos sanguíneos del sistema linfático, por ejemplo, expresan varias proteínas de adhesión que sirven para guiar la migración de los linfocitos. Por ejemplo, las células endoteliales presentes en los ganglios linfáticos expresan un marcador de la superficie celular que es un ligando para la L-selectina y las células endoteliales en las vénulas del parche de Peyer expresan un ligando para la \alpha_{4}\beta_{7} integrina. Estos ligandos están implicados en la migración del linfocito específico a sus respectivos órganos linfoides. De este modo, la ligadura de un fármaco a la L-selectina o a la \alpha_{4}\beta_{7} integrina puede proporcionar unos medios para direccionar el fármaco a los ganglios linfáticos enfermos o a los parches de Peyer, respectivamente, con la condición de que estas moléculas no se unan a ligandos similares presentes en un número significativo de otros órganos o tejidos.
Aunque las moléculas de migración presentes en los vasos sanguíneos de tejidos no linfoides no se han definido con claridad, determinadas observaciones de la circulación de los linfocitos sugieren que existen marcadores endoteliales específicos para el órgano y el tejido. Asimismo, la migración o la metástasis de determinados tipos de órganos o tejidos específicos sugiere más que pueden existir marcadores específicos de órganos y tejidos. Por ejemplo, Pasqualini R. et al., Nature, vol. 380: 377-380 (28 marzo 1996) da a conocer la identificación de péptidos en bancos de péptidos de expresión en fago que migran selectivamente a los tejidos cerebral y renal. Por lo tanto, existe una necesidad de identificar moléculas que puedan unirse a dichos marcadores específicos del órgano o tejido y, por consiguiente, puedan migrarse al órgano o tejido. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona moléculas que migran selectivamente a la próstata. Específicamente, la invención proporciona péptidos SMSIARL (SEC. ID. nº: 21), VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22) y RGRWLAL (SEC. ID. nº: 279) que migran a la próstata.
La invención proporciona también conjugados, que comprenden dicha molécula unida a un resto que migra al órgano o tejido. Dicho resto puede ser un agente terapéutico tal como una toxina, un agente que inhibe la muerte celular, un agente que altera la producción o actividad de una sustancia perjudicial o beneficiosa para una célula, o un agente que altera la proliferación de una célula expuesta al agente. Un resto puede ser también un agente detectable tal como un radionúclido o una etiqueta tal como un microdispositivo con cámara o un soporte insoluble de cromatografía. Dichos conjugados de la invención son útiles para migrar el resto a un órgano o tejido seleccionado.
La invención proporciona también procedimientos de utilización de una molécula de la invención que migra a un órgano para el diagnóstico o tratamiento de una patología de la próstata, mediante la administración de una molécula que migra a la próstata a un paciente que padece o se sospecha que padece una patología. Se entiende que cualquier referencia a un procedimiento de tratamiento dentro del alcance de la presente invención significa una referencia a la utilización de una sustancia como la especificada para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un estado patológico especificado. Por ejemplo, una patología de próstata puede tratarse administrando a un paciente que presenta la patología un conjugado que comprende una molécula apropiada que migra a la próstata unida a un agente terapéutico. Asimismo, un procedimiento de identificación del órgano o tejido prostático o de diagnóstico de una patología en este órgano mediante la administración a un paciente de un conjugado que comprende una molécula apropiada unida a un agente detectable que migra a la próstata.
La invención proporciona además procedimientos de identificación de una molécula de migración en la próstata detectando la unión selectiva de la molécula de migración a la molécula que migra a la próstata, respectivamente. De este modo, la invención proporciona también una molécula de migración que se une a una molécula que migra a la próstata. Dicha molécula de migración puede ser útil, por ejemplo, para aumentar un anticuerpo específico para la molécula de migración.
Breve descripción de los dibujos
(Los dibujos se proporcionan a título comparativo).
La Figura 1 presenta los resultados de tres rondas del ensayo de adhesión celular sobre plástico (panning) in vivo de un banco de CX_{6}C (SEC. ID. nº: 26) para identificar moléculas que migran a los pulmones. El fago recuperado del pulmón cinco minutos después de la inyección de 10^{10} unidades de transducción en la vena de la cola de ratones se ampliaron y reinyectaron en dos rondas consecutivas. El número de fago recuperado por gramo de pulmón, riñón o cerebro se indica, para cada ronda, con barras que representan la desviación estándar de la media de los cultivos en placas por triplicado.
Las Figuras 2A a 2D presentan la selectividad de un fago que expresa péptidos que migran a los pulmones (figuras 2A y 2B), la piel (Figura 2C) o el páncreas (Figura 2D). El fago seleccionado que expresa los péptidos que migran a los pulmones (Figura 2A, CGFECVRQCPERC, SEC. ID. nº: 1, "GFE-1"; Figura 2B, CGFELETC, SEC. ID. nº: 2, "GFE-2"); en la piel (Figura 2C, CVALCREACGEGC, SEC. ID. nº: 3) o páncreas (Figura 2D, SWCEPGWCR, SEC. ID. nº: 4) se ampliaron independientemente, se inyectaron en ratones y se recuperaron (Ejemplo I). Se determinó la cantidad de fago que presenta un péptido seleccionado que se recuperó por gramo de pulmón, piel, páncreas, riñón de referencia o cerebro. Se determinó también la cantidad de fago no seleccionado (referencia) recuperado del pulmón, piel, páncreas, riñón o cerebro. Las barras indican la desviación estándar de la media de cultivos en placas por triplicado.
Las Figuras 3A y 3B presentan el efecto de la administración conjunta de glutation S-transferasa (GST)-proteínas de fusión sobre el direccionamiento del fago que expresa péptidos que migran al pulmón o la piel.
En la Figura 3A, se inyectaron conjuntamente 100 \mug o 500 \mug de GST-CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1, "GFE-1") o 500 \mug de GST en ratones con 10^{9} unidades de transducción del fago ampliado independientemente que expresa la secuencia CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1) que migra al pulmón. Se determinó la recuperación del fago después de 5 minutos de circulación en el pulmón y riñón, con barras que indican la desviación estándar de la media de cultivos en placas por triplicado.
En la Figura 3B, 10^{9} unidades de transducción del fago ampliado independientemente que expresan los péptidos CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1, "GFE-1") que migran al pulmón o CGFELETC (SEC. ID. nº: 2, "GFE-2") o el péptido CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) que migra a la piel se inyectaron conjuntamente en ratones con 500 \mug de GST-péptido de fusión afín. Se inyectó a ratones de referencia (no representado) el fago seleccionado y 500 \mug de GST. Se muestra el porcentaje de inhibición del fago seleccionado que migra al pulmón o en la piel en presencia de GST-péptido de fusión afín comparado con GST.
La Figura 4 demuestra que una proteína de la superficie celular de 55 kDa de extractos pulmonares se une específicamente a una columna con afinidad al péptido GFE-1. Se fraccionó un extracto pulmonar biotinilado in vivo en una columna del péptido CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) o en una columna del péptido de referencia (GRGESP; SEC. ID. nº: 442), se lavó y se eluyó con el péptido GFE-1. Se resolvieron alícuotas (30 \mul) de la fracción de lavado ("-"), elución con el péptido GFE-1 y elución con urea 8 M por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Los marcadores de peso molecular (en kDa) están indicados en el lado derecho de cada panel.
La Figura 5 presenta un curso temporal de la detección fluorimétrica de la D-fenilalanina (D-Phe) producida por la hidrólisis de Gly-D-Phe. Se analizó la actividad de MDP en muestras de la fracción de lavado (\circ) y el eluido del péptido CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) (\bullet) de la columna con afinidad al péptido GFE-1 con un sustrato de Gly-D-Phe. Se presenta la conversión dependiente del tiempo de D-Phe en un compuesto fluorescente.
La Figura 6 presenta la fijación del fago que lleva el péptido CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) o CGFELETC (SEC. ID. nº: 2; GFE-2) a las células COS-1 que expresan la dipeptidasa de membrana (MDP).
En la Figura 6A, las células COS-1 se transfectaron con el vector de expresión de MDP o el vector solo. Dos días después de la transfección, se prepararon extractos celulares y se analizó su actividad de MDP.
En la Figura 6B, células COS-1 transfectadas con el vector de expresión de MDP o el vector de referencia vacío se sometieron a un ensayo de fijación en presencia de cantidades iguales del fago de referencia (fd-tet) o el fago que lleva el péptido CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3; "shp-1") que migra a la piel, el péptido CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) o el péptido CGFELETC (SEC. ID. nº: 2; GFE-2). En cada caso, se presenta el número total de unidades de transducción del fago recuperadas de estas células. Las barras de error indican la desviación estándar de la media de cultivos en placas por triplicado.
La Figura 7 presenta la inhibición de la actividad de MDP por el péptido CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1) de GFE-1. Se analizó la actividad de MDP en extractos de las células COS-1 que expresan MDP en presencia de concentraciones crecientes de CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) (\bullet) o el péptido de referencia CARAC (SEC. ID. nº: 443), se muestra como (\circ).
La Figura 8 demuestra que GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) inhibe la metástasis pulmonar de las células de melanoma humano. Se muestra el peso del pulmón para ratones de cinco semanas tras la inyección con 10^{5} células C8161 de melanoma humano solas ("vehículo"); 10^{5} células C8161 administradas conjuntamente con 250 \mug de péptido de GFE-1 SEC. ID. nº: 1 ("péptido GFE-1"); o 10^{5} células C8161 administradas conjuntamente con 250 \mug del péptido CARAC SEC. ID. nº: 443 ("péptido de referencia").
La Figura 9 presenta una alineación de las secuencias de aminoácidos previstas de la dipeptidasa de la membrana de cinco especies. Las secuencias de aminoácidos de las MDP humanas ("HUM"; SEC. ID. nº: 448); de cerdo ("PIG"; SEC. ID. nº: 449); de rata ("RAT"; SEC. ID. nº: 450); y de ratón ("MOU"; SEC. ID. nº: 451) están alineadas junto con la secuencia de MDP de conejo ("RAB"; SEC. ID. nº: 452). Los asteriscos indican las secuencias de glucosilación unidas por N en la MDP humana. Los restos Glu^{125} e His^{219} encasillados son esenciales para la actividad (Adachi et al., Biochim. Biophys. Acta 1163:42-48 (1993); Keynan et al., FEBS Letters 349: 50-54 (1994)). Los restos subrayados (-1 a -16) representan el péptido señal. Los restos encasillados en el terminal C indican la señal hidrófoba que se sustituye por un anclaje de glucosil-fosfatidilinositol (GPI) en la proteína madura. La secuencia de adición del anclaje GPI está indicada con una flecha.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona moléculas que migran a la próstata y procedimientos de utilización de estas moléculas para migrar un resto al órgano o tejido prostático. Las moléculas de la invención, que se identificaron esencialmente mediante el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo (patente U.S. nº 5.622.699, concedida el 22 de abril de 1997), incluyen péptidos que migran a la próstata y a la próstata con tumores. Específicamente, la invención proporciona los péptidos SMSIARL (SEC. ID. nº: 21), VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22) y RGRWLAL (SEC. ID. nº: 279) que migran a la próstata (ver la Tabla 7).
Las moléculas de la invención de migración se utilizan para direccionar un resto al órgano o tejido prostático. De este modo, la invención proporciona conjugados, que comprenden una molécula que migra a la próstata unida a un resto. Dichos restos pueden ser un agente terapéutico tal como un virus; un vector vírico de terapia génica; un fármaco; un agente detectable o de detección por la imagen tal como un radionúclido; o una etiqueta tal como la biotina. Tal como se da a conocer en la presente memoria, dichas moléculas de la invención que migran al órgano, conjugadas particularmente de la invención, pueden utilizarse para detectar u observar el órgano o tejido prostático o para diagnosticar o tratar una patología en este órgano o tejido. Una molécula de la invención que migra a la próstata también puede utilizarse para aislar la molécula de migración que se expresa en el órgano o tejido prostático y se une a la molécula que migra a la próstata. Por conveniencia, una molécula de la invención que migra al órgano o tejido prostático se denomina "molécula que migra a la próstata".
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "molécula" se utiliza ampliamente para hacer referencia un compuesto orgánico que tiene por lo menos un grupo reactivo que puede variarse sustituyendo uno o más grupos diferentes. Una molécula orgánica puede ser un fármaco; una molécula de ácido nucleico, incluyendo ARN o ADN; un péptido; un péptido variante o modificado o un péptido mimético; una proteína o fragmento de la misma; un oligosacárido; un lípido; un glucolípido o una lipoproteína.
Una molécula orgánica puede ser una molécula natural, que puede ser un producto de la naturaleza en el que los grupos que comprenden la molécula orgánica y los enlaces que unen los grupos son producidos por procesos biológicos. Por ejemplo, una molécula orgánica natural puede ser una molécula de ARN o un fragmento de la misma, que puede aislarse de una célula o expresarse en una molécula de ácido nucleico recombinante. Asimismo, un péptido es considerado una molécula orgánica natural, incluso si se produce por síntesis química, ya que estos grupos de aminoácidos y los enlaces que unen los grupos pueden producirse por procedimientos biológicos normales y el propio péptido, puede
producirse en una célula debido, por ejemplo, a la degradación proteolítica de una proteína que contiene el péptido.
Una molécula orgánica puede ser también una molécula no natural. Dichas moléculas tienen grupos químicos o enlaces que no son producidos normalmente por procesos biológicos. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que contiene análogos nucleosídicos no naturales o enlaces fosforotioato que conectan los nucleotídicos y los protegen contra la degradación por nucleasas son ejemplos de moléculas artificiales. Un ribonucleótido que contiene un grupo 2-metilo, en lugar del grupo hidroxilo normal, unido al átomo de carbono 2' de los restos de ribosa, es un ejemplo de una molécula de ARN no natural que es resistente a la degradación enzimática y química. Otros ejemplos de moléculas orgánicas artificiales incluyen el ARN que contiene 2'-aminopirimidinas, siendo dicho ARN 1.000 veces más estable en el suero y orina humanos en comparación con el ARN natural (véase Lin et al., Nucl. Acids Res., 22:5229-5234 (1994); y Jellinek et al., Biochemistry, 34:11363-11372 (1995).
En el contexto de la presente invención, el término "péptido" se utiliza en sentido amplio en la presente memoria para hacer referencia péptidos, polipéptidos, proteínas y fragmentos de proteínas. Otras moléculas útiles en la invención incluyen peptoides, peptidomiméticos y similares. Con respecto a los péptidos de la invención que migran al órgano o tejido, peptidomiméticos, que incluyen los péptidos modificados químicamente, las moléculas pseudopeptídicas que contienen aminoácidos no naturales, los peptoides y similares, presentan actividad de fijación de un péptido que migra al órgano del que se deriva el peptidomimético (véase por ejemplo, "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" 5ª ed., vols. 1 a 3 (ed. M.E. Wolff; Wiley Interscience 1995)). Los peptidomiméticos proporcionan varias ventajas sobre un péptido, incluyendo que un peptidomimético puede ser estable cuando se administra a un paciente, por ejemplo, durante el paso a través del aparato digestivo y, por consiguiente, útiles para la administración oral.
Los procedimientos para identificar un peptidomimético son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el cribado de bases de datos que contienen bancos de peptidomiméticos potenciales. Por ejemplo, la Cambridge Structural Database contiene una colección de más de 300.000 compuestos que han reconocido estructuras cristalinas (Allen et al., Acta Crystallogr., sección B, 35:2331 (1979)). Este depósito estructural se actualiza continuamente a medida que se determinan nuevas estructuras cristalinas y puede cribarse para los compuestos que presentan formas adecuadas, por ejemplo, la misma forma que la molécula que migra a un órgano o tejido, así como la geometría potencial y la complementariedad química con una molécula de migración unida por un péptido que migra a un órgano o tejido. Cuando no está disponible ninguna estructura cristalina de un péptido de migración o una molécula de migración, que se une a una molécula que migra a un órgano o tejido, puede generarse una estructura utilizando, por ejemplo, el programa CONCORD (Rusinko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 29: 251 (1989)). Otra base de datos, el Available Chemicals Directory (Molecular Design Limited, Informations Systems; San Leandro CA), contiene aproximadamente 100.000 compuestos que están comercializados y también pueden investigarse para identificar potenciales peptidomiméticos de una molécula que migra al órgano o tejido.
La expresión "molécula de ácido nucleico" se utiliza ampliamente también para hacer referencia a cualquier polímero de dos o más nucleótidos, que están unidos por un enlace covalente tal como un enlace fosfodiéster, un enlace tioéster o cualquiera de otros varios enlaces conocidos en la materia útiles y eficaces para enlazar nucleótidos. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser lineales, circulares o superenrolladas y pueden ser el ADN monocatenario o bicatenario o el ARN o puede ser un híbrido ADN/ARN.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "banco" significa una colección de moléculas. Un banco puede contener unas pocas o un gran número de moléculas diferentes, oscilando entre aproximadamente dos y aproximadamente 10^{15} moléculas o más. La estructura química de las moléculas de un banco puede estar relacionada entre sí o ser diferente. Si se desea, las moléculas que constituyen el banco pueden estar unidas a una etiqueta corriente o única, que puede facilitar la recuperación y/o identificación de la molécula.
Los procedimientos para preparar bancos que contienen diversas poblaciones de varios tipos de moléculas tales como péptidos, peptoides y peptidomiméticos son bien conocidos en la materia y varios bancos están disponibles en el mercado (véanse, por ejemplo, Ecker y Crooke, Biotechnology 13: 351-360 (1995), y Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14: 83-92 (1995) y las referencias citadas en la presente memoria; véanse, también, Goodman y Ro, Peptidomimetics for Drug Design, en "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" vol. 1 (ed. M.E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), páginas 803-861, y Gordon et al., J. Med. Chem. 37: 1385-1401 (1994)). Cuando una molécula es un péptido, proteína o fragmento de los mismos, la molécula puede ser producida in vitro directamente o puede expresarse en un ácido nucleico, que puede producirse in vitro. Los procedimientos de péptidos sintéticos y la química de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica.
Un banco de moléculas peptídicas también puede producirse, por ejemplo, construyendo un banco de expresión de ADNc a partir del ARNm recogido de una célula, tejido, órgano u organismo de interés. Los procedimientos para producir dichos bancos son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)). Preferentemente, un péptido codificado por un ADNc se expresa sobre la superficie de una célula o un virus que contiene el ADNc. Por ejemplo, el ADNc puede clonarse en un vector de fago tal como fuse 5 (Ejemplo I), en el que, durante la expresión, el péptido codificado se expresa como una proteína de fusión sobre la superficie del fago.
Además, un banco de moléculas puede ser un banco de moléculas de ácido nucleico, que pueden ser ADN, ARN o análogos de los mismos. Por ejemplo, un banco de ADNc puede construirse a partir del ARNm recogido de una célula, tejido, órgano u organismo de interés o recogiendo ADN genómico, que puede tratarse para producir de manera apropiada fragmentos dimensionados utilizando endonucleasas de restricción o procedimientos que fragmentan de manera aleatoria el ADN genómico. Un banco que comprende moléculas de ARN también puede construirse recogiendo ARN de las células o sintetizando químicamente las moléculas de ARN. Pueden prepararse diversos bancos de moléculas de ácido nucleico utilizando síntesis en fase sólida, que facilita la producción de las zonas al azar en las moléculas. Si se desea, la aleatorización puede sesgarse para producir un banco de moléculas de ácido nucleico que contienen determinados porcentajes de uno o más nucleótidos en una posición en la molécula (patente US nº 5.270.163, concedida el 14 de diciembre de 1993).
Si se desea, las moléculas de ácido nucleico pueden ser análogos del ácido nucleico que son menos sensibles a la degradación por las nucleasas. Por ejemplo las moléculas de ARN que contienen sustituciones de 2'-O-metilpurina en los restos de ribosa y casquetes de fosforotioato cortos en los extremos 3' y 5' presentan aumento de resistencia a las nucleasas (Green et al., Chem. Biol., 2:683-695 (1995)). Asimismo, el ARN que contiene 2'-amino-2'-desoxipirimidinas o 2'-fluoro-2'-desoxipirimidinas es menos sensible a la actividad de la nucleasa (Pagratis et al., Nature Biotechnol., 15:68-73 (1997)). Además, el L-ARN, que es un esteroisómero del D-ARN natural, es resistente a la actividad de la nucleasa (Nolte et al., Nature Biotechnol., 14:1116-1119 (1996); Klobmann et al., Nature Biotechnol., 14: 1112-1115 (1996)). Dichas moléculas de ARN y los procedimientos para producirlas son bien conocidos y rutinarios (véase Eaton y Piekern, Ann. Rev. Biochem., 64:837-863 (1995)). Las moléculas de ADN que contienen fosforotioato unidas a oligodesoxinucleótidos son resistentes a la nucleasa (Reed et al., Cancer Res. 50:6565-6570 (1990)). La modificación por la fosforotioato-3' hidroxipropilamina del enlace fosfodiéster reduce también la sensibilidad de una molécula de ADN a la degradación por la nucleasa (véase Tam et al., Nucl. Acids. Res., 22:977-986 (1994)). Si se desea, la diversidad del banco de ADN puede aumentarse sustituyendo la timidina por la 5-(1-pentinil)-2'-desoxiridina (Latham et al., Nucl. Acids. Res. 22:2817-2822 (1994)). Dichas moléculas de ácido nucleico modificadas pueden ser útiles para la preparación de un banco o con el fin de que sean una etiqueta, lo que se describe a continuación.
Como se da a conocer en la presente memoria, el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo con el fin de identificar una molécula que migra a un órgano o tejido comprende la administración de un banco a un paciente, recogiendo una muestra de órgano o tejido e identificando una molécula que migra a un órgano o tejido utilizando varios procedimientos muy conocidos en la materia. Generalmente, se identifica la presencia de una molécula que migra a un órgano o tejido recogido basándose en una o más características comunes a las moléculas presentes en el banco, a continuación puede determinarse la estructura de una determinada molécula que migra a un órgano o tejido.
Un procedimiento de detección muy sensible tal como la espectrometría de masas (MS), sola o en combinación con un procedimiento tal como la cromatografía de gases (GC), puede utilizarse para identificar moléculas de direccionamiento que están íntimamente relacionadas aun cuando estén presentes en pequeñas cantidades en un órgano o tejido seleccionado. Por ejemplo, se utilizó la GC en combinación con la MS para identificar dos metabolitos mayores y cuatro menores de lidocaína después de la inyección de lidocaína a ratas y el análisis de orina (Coutts et al., J. Chromotogr. 421:267-280 (1987)). Asimismo, cuando un banco comprende diversas moléculas basadas generalmente en la estructura de una molécula orgánica tal como un fármaco, pueden identificarse una molécula que migra a un órgano o tejido determinando la presencia de un pico precursor para la molécula específica.
Si se desea, puede procesarse el órgano o tejido seleccionado utilizando un procedimiento tal como la HPLC, que puede utilizarse para obtener una fracción enriquecida de moléculas con un intervalo definido de pesos moleculares o de polaridad o similares a partir de una mezcla compleja. La fracción enriquecida de moléculas puede analizarse más a continuación con el fin de identificar las moléculas que migran al órgano o tejido. Por ejemplo, la HPLC acoplada con la GC y la MS se utilizaron para identificar siete metabolitos de un análogo de la vitamina D después de la inyección de dihidrotaquisterol 3 en una rata y el fraccionamiento de un riñón aislado perfundido (Porteous et al., Biomed. Environ. Mass Spectrum 16:87-92 (1988)). Las condiciones para la HPLC dependerán de la estructura de la molécula específica y pueden ser optimizadas por los expertos en la materia basándose en el conocimiento de la molécula.
Las moléculas que migran a un órgano presentes en una muestra recogida de un órgano o tejido pueden ser recuperadas de la muestra por incubación en una solución que tiene una concentración salina y una temperatura definidas. La extracción selectiva también puede utilizarse para obtener diferentes fracciones de moléculas orgánicas incubando sucesivamente una muestra recogida en una o más soluciones. Dichas soluciones pueden tener una concentración salina diferente o pueden efectuar la extracción de una molécula orgánica de direccionamiento a una temperatura específica. Los eluidos resultantes de la muestra recogida pueden recogerse independientemente o pueden agruparse en una o más fracciones y pueden detectarse e identificarse las moléculas que migran al órgano. Asimismo, los procedimientos para la mayor parte de la eliminación de los materiales celulares que interfieren potencialmente, tales como ADN, ARN, proteínas, lípidos o hidratos de carbono son bien conocidos en la materia. Dichos procedimientos pueden utilizarse para enriquecer la molécula que migra a un órgano específico con materiales potencialmente contaminantes en la muestra recogida y para aumentar la sensibilidad de la detección de la molécula.
La facilidad de identificación de una molécula que migra a un órgano o tejido, particularmente una molécula no etiquetada, depende de varios factores, incluyendo la presencia de material celular de fondo potencialmente contaminante. Por ejemplo, cuando la molécula de direccionamiento es un péptido no etiquetado, un número mayor debe migrarse órgano o tejido con objeto de identificar los péptidos específicos sobre el fondo de la proteína celular. En cambio, una cantidad mucho más pequeña de una molécula de direccionamiento no etiquetada tal como un fármaco es identificable porque dichas moléculas normalmente están generalmente ausentes o presentes en cifras muy pequeñas en el cuerpo. En esta situación, puede utilizarse un procedimiento muy sensible tal como la MS para identificar una molécula que migra al órgano. El especialista experto reconocerá que el procedimiento de identificación de una molécula dependerá, en parte, de la estructura de la molécula específica.
Como se da a conocer en la parte experimental de la solicitud, un número de moléculas migran selectivamente a un órgano o tejido seleccionado durante el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, de modo que las moléculas pueden identificarse fácilmente. Como puede apreciarse en los ejemplos, los péptidos se identificaron dos o más veces en un órgano recogido determinado (véase la Tabla 1). Por ejemplo, de cuarenta clones secuenciados de varios órganos seleccionados, el péptido YSGKWGK (SEC. ID. nº: 9) que migra al intestino estaba presente en el 22% de los clones; los péptidos EVRSRLS (SEC. ID. nº: 10) y RVGLVAR (SEC. ID. nº: 11) que migran a los ovarios, cada uno estaba presente en el 22% de los clones; y el péptido VKSVCRT (SEC. ID. nº: 12) que migra al hígado estaba presente en el 11% de los clones (véase la Tabla 1). Asimismo, los péptidos CLAKENVVC (SEC. ID. nº: 13) y CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1) que migran a los pulmones; el péptido CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) que migra a la piel; y el péptido CGEFKVGC (SEC. ID. nº: 14) que migra a la retina se identificaron cada uno aislados independientemente varias veces durante el ensayo de adhesión celular sobre plástico de los órganos respectivos, como que eran otros péptidos que migran al órgano (véase las Tablas 2 a 11; péptidos marcados con asterisco). Estos resultados demuestran que una fracción sustancial de moléculas que migran al órgano identificado tienen la misma estructura o, en muchos casos, comparten motivos conservados.
Después de varias identificaciones por el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, cientos de miles a millones de péptidos de fagos que expresan péptidos de migración se recubrieron del órgano o tejido respectivo. Generalmente, los fagos recogidos de una ronda de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo se colocaron en placas sobre agar-agar, se seleccionaron aproximadamente 250 a 300 clones, se cultivaron en cultivos de 5 ml, a continuación se agruparon y se volvieron a administrar para una ronda posterior de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo ("procedimiento regular"). Sin embargo, en algunos experimentos, se seleccionaron 1.000 clones, se cultivaron en cultivos de 2 ml, a continuación se agruparon y se administraron para una ronda posterior de identificación; o la placa de agar-agar completa se raspó y todos los fagos se cultivaron juntos y se administraron a una ronda posterior de cribado. Las inserciones de péptido de varios fagos aislados se determinaron de modo que, de los millones de fagos que se dirigieron, solamente un pequeño número de secuencias se identificaron. Estos resultados indican que los tipos específicos de moléculas de direccionamiento pueden estar presentes en proporciones relativamente grandes en un órgano o tejido después del direccionamiento in vivo, aumentando de este modo la facilidad con la que las moléculas pueden identificarse.
Cuando una molécula que migra a un órgano o tejido es una molécula de ácido nucleico, pueden utilizarse varios procedimientos de ensayo para aislar o identificar sustancialmente la molécula. Por ejemplo, la PCR puede ser particularmente útil para identificar la presencia de la molécula de direccionamiento porque, en principio, la PCR puede detectar la presencia de una sola molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Erlich, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Stockton Press (1989)). La PCR se ha utilizado también para ampliar las moléculas de ácido nucleico que se unen a una diana predeterminada in vitro y, cuando los ácidos nucleicos se volvían resistentes a las nucleasas y se administraban a un paciente, modulaban los procesos biológicos tales como el tráfico de linfocitos in vivo (véase, por ejemplo, Hicke et al., J. Clin. Invest. 98:2688-2692 (1996)). Estos descubrimientos indican que las moléculas de ácido nucleico son suficientemente estables cuando se administran a la circulación de un paciente de modo que puede utilizarse el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para identificar las moléculas de ácido nucleico que migran selectivamente a un órgano o tejido in vivo.
Las moléculas de un banco pueden etiquetarse, lo que puede facilitar la recuperación o identificación de las moléculas que migran a un órgano. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "etiqueta" significa un resto físico, químico o biológico tal como microbolas de plástico o metálicas, un oligonucleótido o un bacteriófago, respectivamente, que está ligado a una molécula del banco. Los procedimientos para etiquetar una molécula son bien conocidos en la técnica (Hermanson, Bioconjugate Techniques, (Academia Press 1996)). El enlace entre una molécula y una etiqueta puede ser un enlace covalente o no covalente y, si se desea, el enlace puede escindirse selectivamente de la molécula.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "etiqueta compartida" significa un resto físico, químico o biológico que es común a cada molécula en un banco. Una etiqueta compartida puede utilizarse para identificar la presencia de una molécula del banco en una muestra o para aislar sustancialmente las moléculas de una muestra después del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. Por ejemplo, un banco que comprende una población de diversas moléculas tales como ácidos nucleicos puede unirse a una etiqueta compartida. Si la etiqueta compartida es la biotina, por ejemplo, una molécula que migra al ácido nucleico puede aislarse sustancialmente de un órgano o tejido seleccionado por fijación, por ejemplo, en una columna de afinidad a la estreptavidina. La presencia de la molécula de ácido nucleico que migra al órgano o tejido puede también detectarse por fijación con una estreptavidina marcada. Un péptido, tal como el antígeno de hemaglutinina, puede también ser una etiqueta compartida que, cuando se une a cada molécula en un banco, permite la utilización de un anticuerpo específico para el antígeno de hemaglutinina aislar sustancialmente las moléculas que migran a un órgano o tejido seleccionado. Además, una molécula o un soporte que contiene una molécula puede estar unido a un hapteno tal como 4-etoxi-metilen-2-fenil-2-oxazolina-5-ona (phOx), que puede estar unido por un anticuerpo anti-phOx a un lecho magnético como medio para recuperar la molécula de direccionamiento. Los procedimientos para purificar los conjugados marcados con phOx son conocidos en la técnica y los materiales para llevar a cabo estos procedimientos están disponibles en el mercado (Invitrogen, La Jolla CA; Promega Corp., Madison WI).
Una etiqueta compartida también puede ser una secuencia de ácido nucleico que puede utilizarse para identificar la presencia de moléculas del banco en una muestra o para aislar sustancialmente las moléculas de un banco de una muestra. Por ejemplo, cada una de las moléculas de un banco puede estar unida a la misma secuencia nucleotídica seleccionada, que constituye la etiqueta compartida. Una columna de afinidad que contiene una secuencia nucleotídica que es complementaria a la etiqueta compartida puede utilizarse después para aislar las moléculas que migran a una muestra de órgano o tejido hibridando la etiqueta compartida unida a las moléculas. Una secuencia nucleotídica complementaria con una parte de la etiqueta compartida puede utilizarse también como cebador de PCR de modo que la presencia de las moléculas que contienen la etiqueta compartida pueda identificarse en una muestra por PCR.
Una etiqueta también puede ser una etiqueta específica o exclusiva. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "etiqueta específica" significa una etiqueta física, química o biológica que está unida a una molécula en un banco que es exclusivo para la molécula específica. Una etiqueta específica es particularmente útil si es fácilmente identificable. Una secuencia nucleotídica que es exclusiva para una determinada molécula de un banco es un ejemplo de etiqueta específica, por ejemplo, una etiqueta olinucleotídica exclusiva unida a cada péptido de un banco o péptidos (véase, por ejemplo, Brenner y Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:5381-5383 (1992)). Cuando migra a un órgano o tejido, el péptido de migración puede identificarse determinando la secuencia del único oligonucleótido que utiliza la etiqueta, por ejemplo, por PCR (véase, por ejemplo, Erlich, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Stockton Press 1989)). Asimismo, la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido expresado en un fago es otro ejemplo de una etiqueta específica de ácido nucleico, ya que el secuenciado del ácido nucleico identifica la secuencia de aminoácidos del péptido expresado (véase el Ejemplo I). Dichas etiquetas exclusivas de la secuencia oligonucleotídica, cuando se unen a otros bancos de moléculas, pueden utilizarse para identificar la secuencia de la molécula de direccionamiento unida a éstas.
Una etiqueta compartida y una etiqueta específica, en combinación, pueden ser particularmente útiles para aislar e identificar una molécula que migra a un órgano o tejido cuando la molécula que de direccionamiento está presente en cantidades diminutas. Por ejemplo, cada molécula de un banco puede estar unida a una etiqueta oligonucleotídica que contiene dos partes; una etiqueta con la secuencia nucleotídica exclusiva interna y etiquetas compartidas nucleotídicas en 5' y 3' adyacentes que sirven como puntos de fijación al cebador para su utilización en la PCR. Cada molécula, por consiguiente, contiene una etiqueta oligonucleotídica que tiene una parte exclusiva para identificar la molécula de direccionamiento y una parte compartida para identificar la molécula de direccionamiento y una parte compartida para proporcionar puntos de fijación al cebador de PCR. Dicha molécula activada, en el direccionamiento a un órgano o tejido seleccionado, puede identificarse realizando la PCR que utiliza cebadores que hibridan a las etiquetas compartidas nucleotídicas en 5' y 3' adyacentes, realizando a continuación el secuenciado del ADN para determinar la secuencia nucleotídica de la etiqueta interna de la secuencia única. El producto de PCR puede secuenciarse directamente utilizando uno de los cebadores de PCR o el producto de PCR puede clonarse en un vector y la secuencia de ADN determinarse por procedimientos de rutina bien conocidos en la materia.
Pueden utilizarse otras varias combinaciones de etiquetas compartidas y exclusivas. Por ejemplo, cada una de las moléculas en un banco puede estar unida a una etiqueta específica con secuencia nucleotídica (véase, por ejemplo, Brenner y Lerner, supra, 1992), que contiene también una secuencia nucleotídica compartida en 3' que puede ser un punto de fijación del cebador para su utilización en la PCR y puede unirse además a una etiqueta compartida tal como la biotina. Durante el direccionamiento a un órgano o tejido, la molécula de direccionamiento específica puede aislarse sustancialmente de una muestra de órgano o tejido basándose en la etiqueta de biotina. Las moléculas aisladas pueden identificarse a continuación, por ejemplo, por secuenciado de ADN basado en la PCR de la etiqueta específica utilizando la secuencia nucleotídica compartida en 3' de la etiqueta nucleotídica como punto de fijación al cebador.
Puede servir también como soporte una etiqueta. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "soporte" significa una etiqueta que tiene una superficie definida a la que puede unirse una molécula. En general, una etiqueta útil como soporte es una etiqueta compartida. Por ejemplo, un soporte puede ser una etiqueta biológica tal como un virus o una partícula pseudovírica tal como un bacteriófago ("fago"); una bacteria tal como E. coli; o una célula eucariótica tal como una célula de levadura, insecto o mamífero; o puede ser una etiqueta física tal como un liposoma o una microesfera, que puede estar compuesta de un material plástico, agarosa, gelatina u otro material biológico o artificial. Si se desea, una etiqueta compartida útil como soporte puede tener unida a ésta una etiqueta específica.
Tal como se ejemplifica en la presente memoria, un péptido que se supone que es capaz de migrarse a un órgano o tejido normal seleccionado tal como el pulmón, la piel, el páncreas, la retina, la próstata, los ovarios, los ganglios linfáticos, las glándulas suprarrenales, el hígado o el intestino, o a un órgano o tejido que contiene un tumor, por ejemplo, un pulmón que tiene tumores pulmonares o un páncreas que tiene un tumor pancreático, se expresó como terminal N de una proteína de fusión, en la que el terminal C estaba constituido por una proteína de la envoltura del fago (véase el Ejemplo I). En la expresión de la proteína de fusión, la proteína de la capa C-terminal unió la proteína de fusión a la superficie de un fago de modo que el péptido N-terminal estaba en una posición para interactuar con una molécula de migración en el órgano o tejido. De este modo, se formó una molécula que tiene una etiqueta compartida mediante el enlace de un péptido a un fago, en la que el fago proporcionó un soporte biológico, la molécula de péptido estaba unida como proteína de fusión, la parte codificada del fago de la proteína de fusión actuó como molécula espaciadora y el ácido nucleico que codifica el péptido proporcionó una etiqueta específica que permite la identificación de los péptidos que migran al órgano y al tejido.
Cuando una molécula está unida a un soporte, la molécula activada comprende la molécula unida a la superficie del soporte, de modo que la parte de la molécula que se supone que es capaz de interactuar con una molécula de migración en una célula en el paciente se coloca de modo que sea capaz de participar en la interacción. Por ejemplo, cuando la molécula migra se supone que es un ligando para el receptor del factor de crecimiento, la parte de la fijación de la molécula acoplada a un soporte se coloca de modo que pueda interactuar con el receptor del factor de crecimiento en una célula, en un órgano o un tejido. Si se desea, un espaciador apropiado puede colocarse entre la molécula y el soporte de modo que no esté impedida la capacidad de la molécula que migra al órgano o tejido potencial para interactuar con la molécula de migración. Una molécula espaciadora puede contener también un grupo reactivo, que proporcione un medio conveniente y eficaz de unir una molécula a un soporte y, si se desea, puede contener una etiqueta, que puede facilitar la recuperación o identificación de la molécula (véase Hermanson, supra, 1996).
En general, un soporte debería tener un diámetro inferior a aproximadamente 10 \mum a aproximadamente 50 \mum en su dimensión más corta, de modo que el soporte pueda pasar sin dificultad relativamente a través de los lechos capilares presentes en el paciente a fin de que no ocluyan la circulación. Además, un soporte puede ser biológicamente inerte, de modo que no perturbe la expresión normal de las moléculas de la superficie celular o la fisiología normal del paciente. Además, un soporte puede ser excretable o biodegradable, particularmente cuando el paciente utilizado para el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo no se sacrifica para recoger una muestra de un órgano o tejido seleccionado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo", cuando se utiliza en referencia a la identificación de una molécula que migra a un órgano o tejido, significa un procedimiento de cribado de un banco mediante la administración del banco a un paciente y la identificación de la molécula que migra selectivamente a un órgano o tejido en el paciente (patente US nº 5.622.699, supra, 1997). La expresión "administrar a un paciente" cuando se utiliza refiriéndose a un banco de moléculas o a una parte de dicho banco, se utiliza en su sentido más amplio para dar a entender que se administra el banco a un órgano o tejido seleccionado en el paciente, que, generalmente, es un vertebrado, particularmente un mamífero tal como un ser humano. Los bancos de moléculas pueden administrarse por cualquier vía o medio de administración, tal como por vía intravenosa, intramuscular, oral, óptica, ocular, intraperitoneal, nasal, vaginal, rectal, dentro del útero, dentro de la cámara del ojo, dentro del sistema nervioso central o periférico, por inhalación, por administración tópica o por inyección dentro de cualquier órgano o tejido normal o dentro de una zona patológica tal como un tumor o un órgano o tejido implicado en una patología, particularmente en el sistema circulatorio del órgano o tejido.
Puede administrarse un banco a un paciente, por ejemplo, inyectando el banco en la circulación del paciente de tal modo que las moléculas pasen a través del órgano o tejido seleccionado; después de un periodo apropiado, se termina la circulación, por ejemplo, mediante perfusión a través del corazón o extrayendo una muestra del órgano o tejido (Ejemplo I; patente U.S. nº 5.622.699, supra, 1997; véase, también, Pasqualini y Ruoslahti, Nature, 380:364-366 (1996)). Alternativamente, puede insertarse una cánula en un vaso sanguíneo del paciente, de tal modo que el banco se administra por perfusión durante un periodo apropiado, tras el cual el banco puede extraerse de la circulación a través de la cánula o puede sacrificarse o anestesiar al paciente para recoger una muestra de órgano o tejido. Un banco puede ser también puenteado a través de uno o unos pocos órganos o tejidos que incluyen un órgano o tejido seleccionado, por canulación de los vasos sanguíneos apropiados en el paciente. Se reconoce que un banco también puede administrarse a un órgano o tejido aislado perfundido. Dicho ensayo de adhesión celular sobre plástico en un órgano o tejido perfundido aislado puede ser útil para identificar moléculas que se unen al órgano o tejido.
La utilización del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para identificar moléculas que migran al órgano o tejido está ejemplificada en la presente memoria cribando un péptido del fago que expresa el banco en ratones e identificando los péptidos que migran selectivamente al pulmón, páncreas, piel y otros, y en ratas, para los péptidos que migran a la retina (Ejemplos I y II). Sin embargo, los bancos de fago que expresan otras moléculas proteicas, incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo que se une al antígeno, tal como un fragmento Fv, Fd o Fab; un receptor de hormonas tal como un receptor del factor de crecimiento; o un receptor de adhesión de células tal como una integrina o una selectina también pueden utilizarse para poner en práctica la invención. Pueden construirse variantes de dichas moléculas utilizando procedimientos bien conocidos tales como la mutagénesis aleatoria dirigida al sitio o basada en el codón (véase Huse, patente U.S. nº 5.264.563, concedida el 23 de noviembre de 1993) y, si se desea, pueden modificarse químicamente los péptidos, por ejemplo, introduciendo un puente disulfuro, después de la expresión del fago pero antes de la administración al paciente. De este modo, muchos tipos diferentes de fago que expresan bancos pueden identificarse mediante el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo.
La tecnología de expresión en el fago proporciona un medio para expresar una población diversa de péptidos aleatorios o selectivamente aleatorizados. Varios procedimientos de expresión en el fago y procedimientos para producir diversas poblaciones de péptidos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, Ladner et al. (patente USnº 5.223.409, concedida el 29 de junio de 1993) describen procedimientos para preparar diversas poblaciones de dominios de fijación en la superficie de un fago. En particular, Ladner et al. describe vectores de fago útiles para producir un banco de expresión en el fago, así como procedimientos para seleccionar dominios de fijación potenciales y producir dominios de fijación mutados al azar o selectivamente.
Asimismo, Smith y Scott (Meth. Enzymol. 217:228-257 (1993); véase también, Scott y Smith, Science 249: 386-390 (1990)) describen procedimientos de producción de bancos de expresión de péptido en fago, incluyendo vectores y procedimientos de diversificación de la población de péptidos que se expresan (véase, también, Huse, documentos WO 91/07141 y WO 91/07149; véase, también, el Ejemplo I). La tecnología de expresión en el fago puede ser particularmente potente cuando se utiliza, por ejemplo, con un procedimiento de mutagénesis basado en el codón, que puede utilizarse para producir péptidos aleatorios o péptidos sesgados al azar o como se desee (Huse, patente US nº 5.264.563, supra, 1993). Estos u otros procedimientos bien conocidos pueden utilizarse para producir un banco de expresión en el fago, que puede someterse al ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de la invención con objeto de identificar un péptido que migra a un órgano o tejido seleccionado.
Además de cribar un banco de presentación en el fago, puede utilizarse el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para cribar otros varios tipos de bancos. Por ejemplo, se han descrito moléculas de ácido nucleico que se unen a un receptor de la superficie celular (véanse O'Connell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:5883-5887 (1996); Tuerk y Gold, Science 249:505-510 (1990); Gold et al., supra (1995)). Estos resultados in vitro indican que un banco de moléculas de ácido nucleico también puede examinarse por el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para identificar las moléculas de ácido nucleico que migran a un órgano o tejido seleccionado. Los bancos adicionales adecuados para cribado incluyen, por ejemplo, bancos de oligosacáridos (York et al., Carb. Res. 285:99-128, (1996); Liang et al., Science 274:1520-1522, (1996); y Ding et al., Adv. Expt. Med. Biol. 376:261-269, (1995), cada una de los cuales está incorporada como referencia); bancos de lipoproteínas (de Kruif et al., FEBS Lett. 399:232-236, (1990)); bancos de glucoproteínas o glucolípidos (Karaoglu et al., J. Cell Biol. 130:567-577 (1995), que están incorporadas a la presente memoria como referencia); o bancos químicos que contienen, por ejemplo, fármacos u otros agentes farmacéuticos (Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994); Ecker y Crook, Bio/Technology 13:351-360 (1995). Dichos bancos, si se desea, pueden activarse, lo que puede facilitar la recuperación de la molécula procedente de un órgano o tejido o su identificación como se describió anteriormente.
El ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo proporciona un procedimiento para identificar directamente las moléculas que pueden migrarse selectivamente a un órgano o tejido. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "migrar" o "migrar selectivamente" significa que una molécula determinada se une de manera relativamente específica a una molécula de migración presente en el órgano o tejido, particularmente en el sistema vascular presente en el órgano o tejido, después de la administración a un paciente. En general, el direccionamiento selectivo se caracteriza, en parte, detectando por lo menos una fijación selectiva dos veces (2\times) mayor de la molécula a un órgano o tejido en comparación con un órgano o tejido de referencia.
El direccionamiento selectivo de una molécula a un órgano o tejido seleccionado puede ser debido al reconocimiento selectivo por la molécula de una determinada molécula de migración de la célula tal como una proteína de la superficie celular presente en una célula en el órgano o tejido. La selectividad de acceso depende de la molécula de migración específica que se expresa solamente en uno o unos pocos tipos de células diferentes, de modo que la molécula migra solamente a uno o a unos pocos órganos o tejidos. A este respecto, los tipos de células más diferentes, particularmente los tipos de células que son únicos para un órgano o tejido, pueden expresar moléculas de migración únicas. De este modo, en órganos tales como el hígado, el bazo o los ganglios linfáticos, donde la sangre circula a través de sinusoides formados por las células específicas para el órgano, el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo puede ser útil para identificar moléculas que migran al órgano o tejido específico.
Debe apreciarse que, en algunos casos, una molécula puede localizar de manera no específica a un órgano o tejido. Por ejemplo, el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de un banco que expresa en el fago puede producir un fondo elevado en órganos tales como el hígado y el bazo, que contienen un componente marcado del sistema reticuloendotelial (RES). De este modo, la fijación inespecífica de las moléculas debida a la absorción por el RES de dicho órgano o tejido puede hacer más difícil la identificación de una molécula que migran al órgano o tejido. Sin embargo, como se da a conocer en la presente memoria, la fijación no específica potencial puede ser soslayada, por ejemplo, por perfusión a través del corazón antes de recoger el órgano o tejido seleccionado (Ejemplo I).
Además, el direccionamiento selectivo puede distinguirse fácilmente de la fijación no específica detectando diferencias en las capacidades de cada uno de los diferentes fagos para migrarse a un órgano o tejido. Por ejemplo, el direccionamiento selectivo puede identificarse combinando una supuesta molécula de direccionamiento tal como un péptido expresado en un fago con un exceso de fago no infeccioso o con aproximadamente un exceso de cinco veces de fago que expresa péptidos no seleccionados, inyectando la mezcla en un paciente y recogiendo una muestra del órgano o tejido. En este último caso, por ejemplo, con tal que la fracción de fago inyectado en el que un péptido que migra al órgano o tejido sea suficientemente baja para que no se sature por la molécula de migración, una determinación mayor que aproximadamente el 20% del fago en el órgano o tejido contiene la supuesta molécula de direccionamiento es una prueba demostrativa de que el péptido expresado por el fago es una molécula selectiva que migra al órgano o tejido. Además, la localización no específica puede distinguirse del acceso selectivo realizando experimentos competitivos que utilizan, por ejemplo, un fago que expresa un supuesto péptido que migra al órgano o tejido en combinación con una cantidad en exceso del péptido "libre" (véase el Ejemplo II).
Pueden utilizarse varios procedimientos para impedir la localización inespecífica de una molécula a órganos o tejidos, tales como los que contienen un componente del RES. Por ejemplo, como se da a conocer en la presente memoria, la perfusión de una solución a través del corazón brevemente después de iniciar la circulación del fago disminuyó la fijación de fondo y permitió la identificación de péptidos que migran selectivamente al pulmón y al hígado, los cuales contienen un componente del RES (véase Ejemplo II). Además, la administración conjunta del fago de referencia no replicador con un banco de presentación en el fago redujo la captura del fago no específico en órganos tales como el hígado y el bazo, que también contienen un componente del RES. Esta estrategia permitió la identificación de moléculas que migran selectivamente al hígado (Ejemplo II). De este modo, un banco de moléculas acoplado a un soporte puede administrarse conjuntamente con un exceso del soporte a un paciente para inhibir la fijación inespecífica en un órgano o tejido.
La absorción inespecífica por un componente del RES puede evitarse también administrando un agente de bloqueo que inhibe la absorción por el RES. Por ejemplo, partículas de poliestireno látex o de sulfato de dextrano pueden administrarse a un paciente antes de la administración del banco (véase Kalin et al., Nucl. Med. Biol. 20:171-174 (1993); Illum et al., J. Pharm. Sci. 5:16-22 (1986); Takeya et al., J. Gen. Microbiol. 100:373-379 (1977)). Dicha administración previa de sulfato de dextrano 500 o de microesferas de poliestireno ha sido utilizada para bloquear la absorción inespecífica de una sustancia de la prueba por las células de Kupffer, que son el componente de RES del hígado (Illum et al., supra, 1986). Asimismo, la absorción no específica de agentes por el RES se ha bloqueado utilizando partículas de carbono o de sílice (Takeya et al., supra, 1977) o un coloide de gelatina (Kalin et al., supra, 1993). Por lo tanto, muchos procedimientos útiles para inhibir la absorción inespecífica por el RES son conocidos en la técnica y utilizados de manera rutinaria.
Los procedimientos de disminución de la captura inespecífica del fago incluyen la utilización del fago que presenta una fijación de fondo baja en un órgano o tejido determinado. Por ejemplo, Merrill et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3188-3192 (1996)) seleccionaron el fago de tipo lambda que no son absorbidos por el RES y, como resultado, permanecen en la circulación durante un periodo prolongado. Una variante comparable del fago filamentoso, por ejemplo, puede seleccionarse utilizando procedimientos similares.
El direccionamiento selectivo puede demostrarse determinando si una molécula de direccionamiento para un órgano o tejido selectivo es relativamente específica. Por ejemplo, la cantidad de molécula de direccionamiento en un órgano o tejido seleccionado puede compararse con un órgano o tejido de referencia o diferente. El direccionamiento selectivo puede demostrarse también demostrando que las moléculas que migran a un órgano o tejido, identificadas mediante una ronda del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, son enriquecidas en una ronda posterior del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. Por ejemplo, el fago que expresa los péptidos CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1) y CGFELETC (SEC. ID. nº: 2) se enriquecieron durante la segunda y tercera rondas del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo en el pulmón y presentaron un enriquecimiento de 35 veces y de 9 veces, respectivamente, en comparación con un fago no seleccionado (véase el Ejemplo II.B). Además, se detectó el direccionamiento no selectivo al riñón o al cerebro.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "órgano o tejido seleccionado" se utiliza en su sentido más amplio para dar a entender un órgano o tejido normal o un órgano o tejido con una patología, por ejemplo, pulmón que tiene tumores pulmonares, al que puede migrarse una molécula de manera selectiva. De este modo, la expresión "órgano o tejido" se utiliza ampliamente para hacer referencia a cualquier tejido u órgano incluyendo un tipo de célula normal o patológica tal como una célula cancerosa, en cuyo caso el órgano o tejido seleccionado puede ser un tumor primario o una lesión metastásica.
En general, un órgano o tejido seleccionado contiene una célula, que puede ser una célula del sistema vascular, que expresa una molécula de migración determinada tal como una proteína de la superficie celular a la que puede unirse una molécula de direccionamiento. Al realizar por lo menos dos rondas del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, puede determinarse la selectividad de direccionamiento de la molécula a un órgano o tejido seleccionado. Como se expone más adelante, sin embargo, en algunos casos una molécula de direccionamiento puede migrarse a más de un órgano o tejido seleccionado, en cuyo caso la molécula se considera que es capaz de migrarse selectivamente a una familia de órganos o tejidos seleccionados. Generalmente, sin embargo, las moléculas que migran a más de un o unos pocos órganos o tejidos diferentes no son particularmente útiles ya que una ventaja de las moléculas de direccionamiento de la invención es que permiten el direccionamiento de un órgano o tejido determinado.
La expresión "órgano o tejido de referencia" se utiliza en el sentido de un órgano o tejido distinto del órgano o tejido seleccionado. Un órgano o tejido de referencia se caracteriza por la incapacidad de la molécula que migra al órgano o tejido para migrarse al órgano o tejido de referencia y, por consiguiente, sirve para identificar la fijación selectiva de una molécula a un órgano o tejido seleccionado (Ejemplo II). Cuando se identifica una molécula que migra a un órgano o tejido basándose en su capacidad para migrarse a una lesión patológica en un órgano o tejido, el órgano o tejido de referencia puede ser una parte correspondiente del órgano o tejido seleccionado que no presente la lesión patológica.
Un órgano o tejido de referencia puede recogerse, por ejemplo, para identificar la fijación no específica de la molécula o para determinar la selectividad de direccionamiento de la molécula. Además, la fijación no específica puede identificarse administrando, por ejemplo, una molécula de referencia, que no se conoce para migrarse a un órgano o tejido salvo que sea químicamente similar a una supuesta molécula de direccionamiento. Alternativamente, cuando las moléculas administradas están unidas a un soporte, la administración del soporte, solo, puede utilizarse para identificar la fijación no específica. Por ejemplo, un fago que no contiene una proteína de fusión del péptido puede administrarse a un paciente y el órgano o tejido seleccionado puede examinarse para determinar el nivel de fijación no específica del soporte del fago.
Las etapas de administración del banco al paciente, recogiendo un órgano o tejido seleccionado e identificando las moléculas que migran al órgano o tejido, comprenden una sola ronda del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. Aunque no se requiera, generalmente se llevan a cabo una o más rondas adicionales del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. Cuando se realiza una ronda adicional del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, las moléculas recuperadas del órgano o tejido seleccionado en la ronda previa se administran a un paciente, que puede ser el mismo paciente utilizado en la ronda anterior, en el que se recogió solamente una parte del órgano o tejido.
Al realizar una segunda ronda del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo la selectividad relativa de fijación de las moléculas recuperadas en la primera ronda puede determinarse administrando las moléculas identificadas a un paciente, recogiendo el órgano o tejido seleccionado, y determinando si se recuperan más fagos que expresan una molécula determinada del órgano o tejido después de la segunda ronda de cribado en comparación con los recuperados después de la primera ronda. Aunque no se requiere, puede recogerse también un órgano o tejido de referencia y las moléculas recuperadas del órgano o tejido seleccionado pueden compararse con las recuperadas del órgano o tejido de referencia. Teóricamente, pocas moléculas, si es que hay alguna, se recuperan de un órgano o tejido de referencia después de una segunda o ulterior ronda de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. Generalmente, sin embargo, una proporción de las moléculas también estará presente en un órgano o tejido de referencia. En este caso, puede determinarse la relación de moléculas en el órgano o tejido seleccionado en comparación con el órgano o tejido de referencia (seleccionado:referencia). Pueden utilizarse rondas adicionales de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para determinar si una molécula determinada accede solamente al órgano o tejido seleccionado o pueden reconocer una diana expresada en uno u otros más órganos o tejidos que es idéntica o es suficientemente similar a la diana en el órgano o tejido seleccionado originalmente.
En general, se prepara un banco de moléculas, que contiene una población diversa de moléculas de interés al azar o aleatorizadas de manera selectiva, después se administra a un paciente. Algún tiempo después de la administración, se recoge el órgano o tejido seleccionado y se identifican las moléculas presentes en el órgano o tejido seleccionado (véase el Ejemplo I). Si se desea, se muestrean también uno o más órganos o tejidos de referencia o una parte del órgano o tejido de referencia. Por ejemplo, ratones inyectados con un banco que expresa el péptido en el fago, después de aproximadamente 1 a 5 minutos, se anestesiaron, a continuación se congelaron instantáneamente o se perfundieron a través del corazón para terminar la circulación del fago. Se recogieron pulmones, páncreas u otros órganos o tejidos y uno o más órganos de referencia y se recogieron el fago presente en los órganos seleccionados y el de referencia. Se identificaron los péptidos que migran selectivamente a los órganos o tejidos respectivos (Ejemplo II y Tablas 1 a 11).
Como se ejemplifica en la presente memoria, se sacrificaron animales experimentales para recoger el órgano o tejido seleccionado o de referencia. Debe reconocerse, sin embargo, que solamente necesita recogerse una parte de un órgano o tejido para recuperar una molécula que migra a este órgano o tejido. Asimismo, solamente necesita recogerse parte de un órgano o tejido como referencia. De este modo, por ejemplo, después de la administración de un banco de moléculas a un paciente, una parte del órgano o tejido seleccionado puede recogerse mediante biopsia, pueden recogerse las moléculas de direccionamiento y, si se desea, ampliarse y volverse a administrarse al mismo paciente para una segunda ronda de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. Cuando la molécula que debe administrarse una segunda vez al mismo paciente se activa o se une, por ejemplo, a un soporte, la etiqueta o soporte debería ser biológicamente inerte y biodegradable o excretable, para que no interfiera con las rondas posteriores de cribado.
El cribado in vitro de los bancos de fago se utilizó previamente para identificar péptidos que se unen a anticuerpos o a receptores de la superficie celular (Smith y Scott, supra, 1993). Por ejemplo, en el cribado in vitro de los bancos que expresan el péptido en el fago se identificaron nuevos péptidos que se unen específicamente a receptores de la adhesión a la integrina (Koivunen et al., J. Cell Biol. 124:33-380 (1994a)) y al receptor de uroquinasa humano (Goodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7129-7133 (1994)). Asimismo, el cribado in vitro de las moléculas de ácido nucleico identificó moléculas que se unen específicamente a anticuerpos, receptores de la superficie celular o moléculas orgánicas (Gold et al., supra, 1993, 1995, 1997). Por ejemplo, se identificaron las moléculas de ARN que se unen específicamente a la transcriptasa inversa del VIH-1 utilizando la transcriptasa inversa de VIH-1 purificada como molécula de migración (Green et al., J. Mol. Biol., 247:60-68 (1995)). Estos procedimientos in vitro se realizaron utilizando moléculas de migración definidas y bien caracterizadas en un sistema artificial. Sin embargo, dichos estudios in vitro no proporcionan ninguna comprensión de si una molécula que se une in vitro puede también unirse a la diana in vitro. Por ejemplo, las células endoteliales desarrolladas en cultivo tienden a perder sus diferencias específicas para el tejido (Pauli y Lee, Lab. Invest. 58:379-387 (1988)). De este modo, una molécula que se une a una diana en una célula in vitro puede que no se una in vivo porque la diana puede no estar presente en la célula. Además, dichos procedimientos in vitro están limitados porque requieren conocimiento anterior de la molécula de migración y proporcionan poca información, si es que alguna, con respecto a la utilidad in vivo. Por ejemplo, Goodson et al. (supra, 1994) utilizaron células cultivadas para expresar un receptor recombinante de uroquinasa para obtener péptidos de fijación. Sin embargo, el receptor de uroquinasa se expresa en células de órganos y tejidos muy diferentes y, por consiguiente, una molécula que se une a él puede interactuar con muchos órganos o tejidos y sería considerada una molécula que migra al órgano o tejido dentro de la presente invención.
En contraste con los procedimientos de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vitro, el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo no requiere conocimiento anterior o disponibilidad de una molécula de migración conocida para identificar una molécula que se une a una molécula de migración que se expresa in vivo. Asimismo, como los órganos o tejidos "sin acceso" están presentes durante el cribado, la probabilidad de aislar moléculas que migran al órgano o tejido que carecen de selectividad de direccionamiento es muy reducida. Además, al obtener moléculas que migran al órgano o tejido mediante ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, algunas moléculas que pueden ser particularmente sensibles a la degradación en la circulación in vivo debido, por ejemplo, a la actividad metabólica, se seleccionarán en contra y no se recuperarán. De este modo, el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo proporciona ventajas significativas sobre los procedimientos anteriores al identificar moléculas que acceden selectivamente in vivo y, si se desea, la molécula de migración se presenta en un órgano o tejido seleccionado.
La identificación de las moléculas que migran al órgano que migran selectivamente a varios tejidos normales y a lesiones patológicas en un órgano o tejido específico, como se ejemplifica en la presente memoria, indica que determinadas moléculas de migración de la célula endotelial expresaron los reflejos del órgano o tejido seleccionado refleja el estado fisiológico o patológico del órgano o tejido. Dichas moléculas de direccionamiento al órgano que migran selectivamente a un órgano o tejido basadas en un determinado estado fisiológico o patológico que se producen en el órgano o tejido pueden identificarse utilizando el procedimiento ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo y la selectividad de las moléculas de direccionamiento para el estado patológico o fisiológico del órgano o tejido puede confirmarse por análisis inmunohistológico (Ejemplo III). Por ejemplo, las moléculas que migran al páncreas aquejado de pancreatitis pueden identificarse por ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de un paciente que padece pancreatitis y selectivamente de la molécula de direccionamiento puede confirmarse utilizando inmunohistoquímica para comparar el direccionamiento de la molécula en el páncreas normal con direccionamiento en un páncreas aquejado de pancreatitis.
Las moléculas de direccionamiento selectivo para un órgano normal o un órgano o tejido que presentan un estado patológico pueden ser útiles para detectar la presencia o ausencia de la patología. Por ejemplo, después de la administración de una molécula que migra a la próstata conjugada con un grupo de diagnóstico por la imagen para un paciente, puede observarse la próstata. Si la imagen es anormal, por ejemplo, si el tamaño de la próstata es distinto del que es de esperar para unas medidas y edad iguales del paciente, el resultado del pronóstico por la imagen puede indicar un estado fisiológico anormal o un estado patológico que afecta a la próstata. Por ejemplo, puede administrarse a un paciente un conjugado que comprende un agente de diagnóstico por la imagen y una molécula que de direccionamiento a la próstata que migra a la próstata normal, pero no a la anormal. La identificación, por ejemplo, de una zona de la próstata que no se une a la molécula de direccionamiento puede indicar la aparición de circulación sanguínea anormal en la próstata y puede ser el diagnóstico de un estado patológico tal como la presencia de un tumor de próstata. Un conjugado que comprende una molécula que migra al tejido del tumor de próstata, pero no a la próstata normal, puede utilizarse para diagnosticar por la imagen directamente un tumor de próstata.
Una molécula de direccionamiento selectivo para un órgano o tejido puede utilizarse para administrar un agente terapéutico al órgano o tejido. Dicho direccionamiento selectivo del agente puede aumentar la cantidad eficaz del agente administrado al órgano o tejido diana, a la vez que reduce la probabilidad de que el agente tenga un efecto desfavorable sobre otros órganos o tejidos. Por ejemplo, una molécula que migra al pulmón puede utilizarse para administrar, al pulmón de un paciente con fibrosis quística, un gen que codifica el receptor de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que es defectuoso en la fibrosis quística. De este modo, las moléculas que migra al órgano de la invención son particularmente útiles para la terapia génica in vivo, ya que proporcionan un medio para dirigirse a un gen a un órgano diana deseado, aumentando de este modo la probabilidad de que las células diana reciban el gen y disminuyendo la probabilidad de que las células que no son dianas sean afectadas desfavorablemente. Una molécula que migra al pulmón también puede utilizarse para dirigir un agente terapéutico al pulmón, compartiendo de este modo los órganos o tejidos que no son dianas de los efectos tóxicos del agente. Por ejemplo, en la neumonía alveolar bacteriana, una molécula que migra al pulmón puede ser útil para dirigir un antibiótico a la zona del pulmón afectada, aumentando de este modo la cantidad eficaz de fármaco en el punto deseado.
Debido a la naturaleza conservada de los receptores celulares y de los ligandos que se unen a un determinado receptor, el experto en la materia reconocería que una molécula que migra a un órgano o tejido identificada utilizando el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo en un ratón o rata puede unirse también a la molécula de migración correspondiente en el órgano o tejido seleccionado de una especie humana o de otro mamífero. En dicha molécula de direccionamiento identificada utilizando un animal experimental puede examinarse fácilmente su capacidad para unirse al correspondiente órgano o tejido en un paciente humano demostrando, por ejemplo, que la molécula también puede unirse selectivamente in vitro a una muestra del órgano o tejido seleccionado extraída de un paciente humano. Alternativamente, pueden utilizarse las células primarias o las estirpes celulares creadas derivadas de un órgano o tejido humano para probar la fijación in vitro de la molécula de direccionamiento. Asimismo, las células primarias o las estirpes celulares creadas que reflejan una patología determinada del órgano o tejido humano pueden utilizarse para probar la fijación de moléculas de direccionamiento selectivas para la patología. Se conocen modelos animales tales como los modelos de primate de patologías humanas y también pueden utilizarse para probar el direccionamiento de las moléculas utilizando ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. De este modo, pueden utilizarse procedimientos de rutina para confirmar que una molécula que migra a un órgano o tejido identificada utilizando ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo en un animal experimental también pueden unirse a una molécula de migración específica para el órgano o tejido en un paciente humano. Además, la puesta en contacto in vitro de una molécula de direccionamiento con una muestra susceptible de contener un órgano tejido o patología seleccionados pueden identificar la presencia del órgano, tejido o patología seleccionados en la muestra. Habiendo identificado la molécula de migración mediante ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, el especialista conocería que es la auténtica diana para una molécula que migra al órgano y, por consiguiente, conocería que la molécula de migración puede utilizarse in vitro para identificar moléculas adicionales que migran al órgano que probablemente serían específicas para la molécula de migración in vivo. Dichas moléculas potenciales que migran al órgano podrían examinarse a continuación mediante el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para confirmar la capacidad de direccionamiento al órgano.
Como se da a conocer en los ejemplos se utilizó el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para identificar los péptidos expresados por el fago que migran selectivamente al pulmón, piel, páncreas, retina, próstata, ovario, ganglio linfático, glándulas suprarrenales, hígado o intestino, y al pulmón que tiene tumores pulmonares o al páncreas que tiene un tumor pancreático (Ejemplos II y IV; véanse también, las Tablas 2 a 11). Debido al gran tamaño del fago (300 nm) y al breve tiempo que se dejó circular el fago, es improbable que un número sustancial de fagos haya salido del sistema circulatorio. De hecho, los estudios inmunohistoquímicos de varias moléculas que migran al órgano y tejido demostraron que las moléculas migran principalmente y se unen a los marcadores de la superficie celular endotelial del sistema vascular. Por lo tanto, la invención proporciona moléculas tales como péptidos que migran selectivamente al sistema vascular de un órgano o tejido seleccionado.
Se construyeron bancos de expresión del péptido en el fago esencialmente tal como los descritos por Smith y Scott (supra, 1993; véase, también, Koivunen et al., Biotechnology 13:265-270 (1995); Koivunen et al., Meth. Enzymol. 245:346-369 (1994b)). En algunos bancos también se incluyó por lo menos un codón que codifica la cisteína en cada oligonucleótido de modo que pudieran formarse péptidos cíclicos mediante enlaces disulfuro (Ejemplo I). Durante la realización del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo, se obtuvieron péptidos que migran selectivamente al pulmón, páncreas, piel, retina, próstata, ovario, ganglio linfático, cápsulas suprarrenales, hígado o intestino o a un pulmón que tienen tumores pulmonares o al páncreas que tiene un tumor pancreático.
De manera destacable, algunos péptidos que migran al órgano independientemente se recuperaron hasta cuatro o más veces, durante una ronda del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo (véase, por ejemplo, la Tabla 1).
TABLA 1
1
TABLA 1 (continuación)
2
Además, varios péptidos que migran a órganos o tejidos específicos compartían motivos de la secuencia de aminoácidos conservada. Por ejemplo, algunos péptidos que migran al pulmón compartían un motivo GFE; algunos péptidos que migran a la retina compartían un motivo RDV; y algunos péptidos que migran a las glándulas suprarrenales compartían un motivo LPR (véase las Tablas 2, 6 y 11, respectivamente). Como es conocido, por ejemplo, que el motivo RGD del tripéptido es suficiente para unirse a la integrina (Ruoslahti, Ann. Rev. Cell Devel. Biol. 12:697 (1996); Koivunen et al., supra, 1995; documento WO 95/14714), los resultados dados a conocer en la presente memoria indican que muchas interacciones ligando/receptor pueden derivar su especificidad de motivos de reconocimiento tan pequeños como los tripéptidos.
Ninguna de las secuencias de los péptidos de migración al órgano dadas a conocer en los ejemplos presentaban similitud significativa con los ligandos conocidos por los receptores de la célula endotelial. Aunque muchos de los péptidos de migración al órgano pueden estar contenidos dentro de grandes péptidos o proteínas, no se conoce si son capaces de proporcionar una función de direccionamiento a la molécula mayor. Basándose en el descubrimiento anterior de que RGD media en la fijación a la integrina cuando está presente en péptidos y proteínas mayores, un experto en la materia reconocería, sin embargo, que dichos péptidos y motivos de direccionamiento podrían comunicar una función de direccionamiento cuando están situados dentro de un péptido o proteína mayor. Sin embargo, dichos péptidos y proteínas
endógenos naturales no se considera que sean moléculas que migran al órgano o tejido dentro de la invención.
Las moléculas del péptido que migran al órgano o tejido ejemplificadas en la presente memoria oscilan en tamaño desde aproximadamente 7 hasta 13 aminoácidos de longitud. Sin embargo, basándose, por ejemplo, en la capacidad del motivo RGD de fijación a la integrina para mediar la fijación a la integrina por sí mismo o cuando está presente en una proteína grande, se debe reconocer que puede esperarse que las moléculas de direccionamiento al órgano de la invención mantengan también su potencial de direccionamiento en el contexto de una secuencia polipeptídica significativamente mayor. De este modo, un péptido que migra al órgano de la invención puede ser por lo menos de tres aminoácidos, generalmente por lo menos de seis aminoácidos o siete aminoácidos o más, y puede ser significativamente mayor, por ejemplo, aproximadamente de 20 a 50 aminoácidos o 100 aminoácidos o más.
La invención también proporciona péptidos que migran a la próstata tales como SMSIARL (SEC. ID. nº: 21) y VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22), que fueron identificados por inyección de un banco X_{7} (SEC. ID. nº: 29) en ratones (Tabla 7). Los péptidos se aislaron por el procedimiento habitual. Los péptidos SMSIARL (SEC. ID. nº: 21) y VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22) que migran a la próstata presentaban un enriquecimiento de 34 y 17 veces, respectivamente, en el direccionamiento a la próstata en comparación con el cerebro (Tabla 1).
Las moléculas de la invención que migran a la próstata son particularmente útiles como conjugados, las cuales comprenden la molécula que migra a la próstata unida a un resto, siendo útiles dichos conjugados para dirigir el resto a la próstata.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "resto" se utiliza en sentido amplio para dar a entender un material físico, químico o biológico que está unido a una molécula que migra a un órgano o tejido. Generalmente, un resto unido a una molécula que migra a un órgano proporciona una función biológicamente útil a la molécula de direccionamiento. Un resto puede estar constituido por cualquier material natural o artificial por ejemplo, secuencias peptídicas o polipeptídicas, moléculas o composiciones orgánicas o inorgánicas, moléculas de ácido nucleico, hidratos de carbono, lípidos o combinaciones de los mismos.
Un resto puede ser un material físico, químico o biológico tal como un virus, un vector vírico para terapia génica, una célula, un liposoma, una microcápsula, una microbomba u otro microdispositivo compartimentado, que puede utilizarse, por ejemplo, como sistema de administración de fármacos. Generalmente, dichos microdispositivos deberían ser biológicamente inertes y, si se desea, biodegradables o excretables. Varios restos, incluyendo microcápsulas, que pueden contener un agente, y procedimientos para la ligadura de un grupo o microdispositivo compartimentado a una molécula orgánica de la invención son bien conocidos en la técnica y están disponibles en el comercio (véanse, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 18ª ed. (Mack Publishing Co. 1990), capítulos 89-91; Harlox y Lane, Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988); véase, también, Hermanson, supra, 1996). Ejemplos adicionales de restos son conocidos por los expertos en la materia y se pretende que estén incluidos dentro del significado del término siempre que posean una función biológicamente útil cuando se fijan a las moléculas de direccionamiento de la invención.
La ligadura de un resto a una molécula de direccionamiento a un órgano en aras de dirigir el resto al órgano o tejido seleccionado se demostró mediante la ligadura a un glóbulo rojo (RBC) de un péptido que migra al cerebro, en la que el péptido dirigió el direccionamiento del RBC al cerebro (patente U.S. nº 5.622.699, supra, 1997). Estos resultados indican que una molécula que migra al órgano o tejido de la invención puede unirse a otro resto con el fin de dirigir el grupo a un órgano o tejido seleccionado.
Una molécula de la invención que migra a la próstata puede servir para dirigir al órgano o tejido prostático, un agente terapéutico, un agente de diagnóstico o un agente de diagnóstico por la imagen, una etiqueta o soporte insoluble, un liposoma o una microcápsula que comprende, por ejemplo, una membrana permeable o semipermeable, en la que un agente tal como un fármaco que debe administrarse a un órgano o tejido seleccionado está contenido dentro del liposoma o microcápsula. Estos y otros restos conocidos en la materia pueden utilizarse en un conjugado de la invención, y en un procedimiento de la invención, como se da a conocer en la presente memoria.
En una forma de realización, un resto puede ser un agente detectable tal como un radionúclido o un agente de diagnóstico por la imagen, que permite la detección u observación del órgano o tejido seleccionado. Por lo tanto, la invención proporciona un conjugado que comprende una molécula que migra a la próstata, unida a un agente detectable. El tipo de agente detectable seleccionado dependerá de la aplicación.
Las moléculas que acceden selectivamente a una lesión patológica en un órgano o tejido asimismo pueden estar unidas a un agente detectable apropiado de tal modo que pueda observarse el tamaño y la distribución de la lesión. Por ejemplo, cuando una molécula que migra a un órgano o tejido migra a un órgano o tejido normal, pero no a una lesión patológica en el órgano o tejido, puede detectarse la presencia de la lesión patológica identificando una imagen anormal o atípica del órgano o tejido, por ejemplo, la ausencia del agente detectable en la zona de la lesión.
Un agente detectable también puede ser un agente que facilite la detección in vitro. Por ejemplo, un conjugado que comprende una molécula de direccionamiento ligada a una enzima, que produce una señal visible cuando está presente un sustrato apropiado, puede detectar la presencia de un órgano o tejido al que se dirige la molécula de direccionamiento. Dicho conjugado, que puede comprender, por ejemplo, fosfatasa alcalina, luciferasa o similares, puede ser útil en un procedimiento tal como la inmunohistoquímica. Dicho conjugado puede también utilizarse para detectar la presencia de una molécula de migración, a la que se une la molécula de direccionamiento al órgano, en una muestra, por ejemplo, durante la purificación de la molécula de migración.
En otra forma de realización, un resto puede ser un agente terapéutico. Por lo tanto, la invención proporciona un conjugado que comprende una molécula que migra a la próstata unida a un agente terapéutico.
Un agente terapéutico puede ser cualquier agente biológicamente útil, cuando se une a una molécula de la invención de direccionamiento al órgano, ejerce su función en el punto del órgano o tejido seleccionado. Por ejemplo, un agente terapéutico puede ser una pequeña molécula orgánica que, durante la fijación a una célula diana debido a la molécula que migra al órgano unido, es interiorizada por la célula donde puede efectuar su función. Un agente terapéutico puede ser una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína implicada en estimular o inhibir la supervivencia celular, la proliferación celular o la muerte celular, según se desee, en el órgano o tejido seleccionado. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína tal como Bcl-2, que inhibe la apoptosis, puede utilizarse para activar la supervivencia celular, mientras que una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína tal como Bax, que estimula la apoptosis, puede utilizarse para activar la muerte celular de una célula
diana.
Un agente terapéutico particularmente útil que estimula la muerte celular es el ricino, que, cuando está ligado a una molécula de la invención de direccionamiento a un órgano, puede ser útil para tratar un trastorno hiperproliferante, por ejemplo, el cáncer. Un conjugado que comprende una molécula de la invención de direccionamiento a un órgano y un antibiótico, tal como ampicilina o un agente antivírico tal como ribavirina, por ejemplo, puede ser útil para tratar una infección bacteriana o vírica en un órgano o tejido seleccionado.
Un agente terapéutico puede inhibir o activar también la producción o actividad de una molécula biológica, cuya expresión o insuficiencia está asociada a la patología. De este modo, un inhibidor de proteasa puede ser un agente terapéutico que, cuando se une a una molécula de direccionamiento al órgano, puede inhibir la actividad de la proteasa en el órgano o tejido seleccionado, por ejemplo, el páncreas. Un gen o su equivalente funcional tal como un ADNc, que puede recargar o restablecer la producción de una proteína en un órgano o tejido seleccionado, puede ser también un agente terapéutico útil para mejorar la gravedad de una patología. Un agente terapéutico puede ser también una molécula de ácido nucleico complementaria, cuya expresión inhibe la producción de una proteína perjudicial o puede ser una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína negativa dominante o un fragmento de la misma, que puede inhibir la actividad de una proteína perjudicial.
En otra forma de realización, la invención proporciona un conjugado que comprende una molécula que migra a la próstata unida a una etiqueta. Una etiqueta puede ser, por ejemplo, un soporte insoluble tal como una matriz cromatográfica, o una molécula tal como biotina, el antígeno hemaglutinina, polihistidina, T7 u otras moléculas conocidas en la técnica. Dicho conjugado que comprende una etiqueta puede ser útil para aislar una molécula de migración, a la que se une la molécula que migra al órgano.
Cuando se administra a un paciente, un conjugado que comprende una molécula que migra al órgano y un resto se administra como composición que contiene, por ejemplo, el conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas tales como agua o solución salina fisiológicamente tamponada u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, gliceroles, aceites tal como el aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o aumentar la absorción del complejo. Dichos compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. Un experto en la materia debería conocer que la elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración de la composición. La composición farmacéutica puede contener también un agente tal como un agente terapéutico para el cáncer u otro agente terapéutico según se desee.
Un experto en la materia debería conocer que una composición farmacéutica que contiene una molécula que migra al órgano puede administrarse a un paciente por varias vías incluyendo, por ejemplo, por vía oral o parenteral, tal como por vía intravenosa. La composición puede administrarse por inyección o por intubación. La composición farmacéutica puede ser también una molécula que migra al órgano unida a un grupo tal como un liposoma u otra matriz polimérica, que puede haber incorporado en ella, por ejemplo, un fármaco que activa o inhibe la muerte celular (Gregoriadis, Liposome Technology, vol. 1 (CRC Press, Boca Ratón, FL 1984)). Los liposomas, por ejemplo, que están constituidos por fosfolípidos u otros lípidos, son inocuos, fisiológicamente aceptables y metabolizan vehículos que son relativamente sencillos de preparar y administrar.
Al realizar un diagnóstico o procedimiento terapéutico como se da a conocer en la presente memoria, debe administrarse al paciente una cantidad eficaz de un conjugado que comprende una molécula que migra a un órgano. Una "cantidad eficaz" es la cantidad de conjugado que produce un efecto deseado. Una cantidad eficaz dependerá, por ejemplo, del resto ligado a la molécula que migra al órgano y del uso pretendido. Por ejemplo, una cantidad inferior de una molécula de direccionamiento radiomarcada puede requerirse para el diagnóstico por la imagen en comparación con la cantidad de la molécula radiomarcada administrada con fines terapéuticos, cuando se desea la muerte celular. Una cantidad eficaz de un conjugado determinado para un fin específico puede determinarse utilizando los procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.
La vía de administración de una molécula orgánica dependerá, en parte, de la estructura química de la molécula que migra al órgano. Los péptidos, por ejemplo, no son particularmente útiles cuando se administran por vía oral porque pueden degradarse en el aparato digestivo. Sin embargo, son bien conocidos los procedimientos para modificar químicamente los péptidos para hacerles menos sensibles a la degradación por las proteasas endógenas o más absorbibles por el sistema alimentario (véase, por ejemplo, Blondelle et al., supra, 1995; Ecker y Crooke, supra, 1995; Goodman y Ro, supra, 1995). Dichos procedimientos pueden realizarse en péptidos que migran a un órgano o tejido seleccionado. Además, los procedimientos para preparar bancos de análogos peptídicos tales como los péptidos que contienen D-aminoácidos; los peptidomiméticos que están constituidos por moléculas orgánicas que simulan la estructura de un péptido; o los peptoides tales como los peptoides vinílogos se han descrito anteriormente y pueden utilizarse para identificar moléculas de direccionamiento adecuadas para la administración oral a un paciente.
La invención proporciona procedimientos de identificación de un órgano o tejido seleccionado administrando a un paciente un conjugado que comprende una molécula que migra a la próstata y un agente detectable. Un conjugado que comprende una molécula de la invención que migra a la próstata unido a un resto detectable puede administrarse a un paciente y utilizarse para identificar u observar el órgano o tejido prostático. La capacidad para observar la próstata proporciona un medio para el diagnóstico de una patología del órgano o tejido prostático. Por ejemplo, una molécula que migra a la próstata unida a indio-113 puede administrarse a un paciente con objeto de diagnosticar por la imagen la próstata. Dicho procedimiento puede ser especialmente valioso porque los procedimientos para diagnosticar por la imagen la próstata son limitados. La presencia de una patología de la próstata puede ponerse de manifiesto detectando que una zona de la próstata no contiene el conjugado, indicando de este modo una anomalía en la circulación a la zona, o detectando que la próstata está anormalmente alargada o que carece de sus límites normales.
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En principio, una molécula de la invención que migra a la próstata puede tener una propiedad biológica intrínseca, de modo que la administración de la molécula proporciona un efecto biológico directo. Por ejemplo, una molécula que migra a la próstata puede ser suficientemente similar a un ligando natural para la molécula de migración, de modo que la molécula que migra a la próstata simula la actividad del ligando natural. Dicha molécula que migra a la próstata puede ser útil como agente terapéutico con actividad del ligando natural. Por ejemplo, cuando la molécula que migra al órgano simula la actividad de un factor de crecimiento que se une a un receptor expresado por el órgano o tejido seleccionado, tal como una molécula que migra a la piel que simula la actividad del factor de crecimiento epidérmico, la administración de la molécula que migra al órgano puede dar como resultado la proliferación celular en el órgano o tejido. Dicha actividad biológica intrínseca de una molécula que migra al órgano puede identificarse poniendo en contacto las células del órgano o tejido seleccionado con la molécula de direccionamiento y examinando las células para las pruebas de un efecto biológico, por ejemplo, la proliferación celular o, cuando la actividad intrínseca es un efecto tóxico, la muerte celular.
Además, una molécula que migra a la próstata de la invención puede tener una actividad intrínseca de fijación a una molécula de migración determinada de modo que un ligando correspondiente no puede unirse al receptor. Es sabido, por ejemplo, que varios tipos de células cancerosas metastatizan órganos o tejidos específicos, lo que indica que las células cancerosas expresan un ligando que se une a una molécula en el órgano al que metastatiza. En general, sin embargo, las moléculas de la invención que migran a la próstata son particularmente útiles para migrar un resto al órgano o tejido prostático. De este modo, la invención proporciona procedimientos de tratamiento de una patología en un órgano o tejido prostático administrando a un paciente que padece la patología un conjugado que comprende una molécula que direcciona a la próstata de la invención unida a un agente terapéutico.
Una molécula que migra a la próstata es útil, por ejemplo, para direccionar un agente terapéutico o detectable al órgano o tejido prostático. Además, una molécula que migra a la próstata puede utilizarse para identificar la presencia de una molécula de migración en una muestra. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "muestra" se utiliza en su sentido más amplio para dar a entender una célula, tejido, órgano o parte de los mismos que se aísla del cuerpo. Una muestra puede ser, por ejemplo, una sección histológica, una muestra obtenida por biopsia o las células que se colocan en cultivo tisular o se adaptan al mismo. Si se desea, puede procesarse una muestra, por ejemplo, por homogeneización, que puede ser una etapa inicial para el aislamiento de la molécula de migración a la que se une la molécula que migra al órgano o tejido.
Una molécula que migra al órgano obtenida como se da a conocer en la presente memoria puede ser útil para identificar la presencia de una molécula de migración, particularmente una proteína de la superficie celular, que es reconocida por la molécula de direccionamiento, o para aislar sustancialmente la molécula de migración. De este modo, la invención proporciona procedimientos de identificación de moléculas de migración que se unen selectivamente a una molécula que migra a la próstata. Dicho procedimiento comprende poner en contacto una muestra de próstata, con una molécula que migra a la próstata y detectar la fijación selectiva de un componente de una muestra, en la que dicha fijación identifica la presencia de una molécula de migración.
Un péptido que migra a la próstata puede estar unido a una etiqueta, por ejemplo, un soporte sólido tal como una matriz cromatográfica. La molécula inmovilizada que migra al órgano puede utilizarse entonces para cromatografía por afinidad pasando una muestra procesada de manera apropiada de tejido prostático sobre una columna que contiene la matriz en condiciones que permiten la fijación específica de la molécula que migra a la próstata a la molécula de migración específica (véase, por ejemplo, Deutscher, Meth. Enzymol., Guide to Protein Purification (Academic Press, Inc., ed. M.P. Deutscher, 1990), vol. 182; véase, por ejemplo, páginas 357-379). Puede eliminarse el material no ligado y el ligado de manera no específica y puede eluirse de la columna la molécula de migración, que forma un complejo con la molécula que migra a la próstata, y recogerse en una forma sustancialmente aislada. La molécula de migración de la próstata sustancialmente aislada a continuación puede caracterizarse utilizando procedimientos bien conocidos. Una molécula que migra a la próstata también puede estar unida a un agente detectable tal como un radionúclido, una molécula fluorescente, una enzima o una etiqueta de biotina marcada y puede utilizarse, por ejemplo, para identificar una muestra con objeto de detectar la presencia de la molécula de migración o para seguir la molécula de migración durante su aislamiento.
Alternativamente a la utilización de una muestra de órgano o tejido para identificar una molécula de migración del órgano o tejido seleccionado, pueden utilizarse como material de partida los extractos de células cultivadas procedentes del órgano o tejido seleccionado, o los extractos de las células endoteliales cultivadas. La selección de las células que contienen la molécula de migración pueden determinarse utilizando ensayos de fijación y de acoplamiento celular (véase Barry et al., Nature Med. 2:299-305 1996), que está incorporada en la presente memoria como referencia). Aquellas células que contienen la molécula de migración pueden utilizarse para preparar extractos para el aislamiento y la identificación de una molécula de migración, tal como se ha descrito anteriormente.
Durante la identificación de una estirpe celular apropiada que expresa la molécula de migración, la molécula de migración puede marcarse cultivando las células en un medio que contiene aminoácidos radiomarcados. Los aminoácidos radiomarcados se incorporan en la molécula de migración, facilitando de este modo su utilización durante la purificación. Las células marcadas pueden extraerse a continuación con octilglucósido y el extracto puede fraccionarse por cromatografía por afinidad utilizando, por ejemplo, una molécula que migra al páncreas acoplada a una matriz tal como Sepharose. Pueden utilizarse como referencia los extractos preparados, por ejemplo, a partir de células endoteliales de la vena umbilical humana. La molécula de migración purificada a continuación puede microsecuenciarse y pueden prepararse los anticuerpos. Si se desea, pueden prepararse sondas de oligonucleótido y utilizarse para aislar los clones de ADNc que codifican el receptor diana. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo anti-receptor para aislar el clon de ADNc procedente de un banco de expresión (véase Argraves et al., J. Cell Biol. 105:1183-1190 (1987)).
Además de aislar una molécula de migración, puede aislarse un ácido nucleico que codifica la molécula de migración utilizando como sonda química una molécula que migra a la próstata para cribar un banco de expresión de ADNc prostático para los clones que expresan la molécula de migración.
De entre los ejemplos siguientes los que no se refieren al tema del asunto reivindicado se proporcionan a título comparativo.
Ejemplo I Ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo
Este ejemplo demuestra los procedimientos para la preparación de un banco de expresión en un fago y la identificación del banco utilizando el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo para identificar los péptidos que expresan el fago que migran a un órgano o tejido seleccionado.
A. Preparación de bancos de fago
Se construyeron bancos de expresión en el fago utilizando el vector fuse 5 tal como ha descrito Koivunen et al., supra, 1995; véase, también, Koivunen et al., supra, antes de 1994). Se prepararon bancos que codifican péptidos denominados CX_{6}C (SEC. ID. nº: 26), CX_{7}C (SEC. ID. nº: 24), CX_{10}C (SEC. ID. nº: 30), CX_{3}CX_{3}CX_{3}C (SEC. ID. nº: 25), X_{2}CX_{4}CX (SEC. ID. nº: 23) y X_{7} (SEC. ID. nº: 29), en las que "C" indica cisteína y "X_{N}" indica el número dado de cada uno de los aminoácidos seleccionados. Estos bancos pueden expresar péptidos cíclicos cuando por lo menos dos restos de cisteína están presentes en el péptido.
Los bancos que contienen los restos de cisteína definidos se generaron utilizando oligonucleótidos construidos de modo que "C" estaba codificado por el codón TGT y "X_{N}" estaba codificado por NNK, en el que "N" es igual a las mezclas molares de A, C, G y T, y en el que "K" es igual a las mezclas molares de G y T. De este modo, el péptido representado por CX_{6}C (SEC. ID. nº: 26) puede estar representado por un oligonucleótido que tiene la secuencia TGT(NNK)_{6}TGT (SEC. ID. nº: 31). Se prepararon oligonucleótidos bicatenarios mediante 3 ciclos de amplificación por PCR, se purificaron y se ligaron al ácido nucleico que codifica la proteína génica III en el vector fuse 5 de modo que, durante la expresión, el péptido está presente como proteína de fusión en el terminal N de la proteína génica III.
Se transfectaron los vectores por electroporación en células MC1061. Se cultivaron las bacterias durante 24 h en presencia de 20 \mug/ml de tetraciclina, a continuación se recogieron los fagos del sobrenadante por precipitación doble utilizando polietilenglicol. Cada banco contenía aproximadamente 10^{12} unidades de transducción/ml (TU; fago recombinantes).
B. Ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo del fago
Para el pulmón y el páncreas, se diluyó una mezcla de bancos de fago que contenía 10^{10} TU en 200 \mul de DMEM y se inyectó en la vena de la cola de ratas BALB/c anestesiadas (2 meses de vida; Harlan Sprague Dawley; San Diego CA); se utilizó AVERTIN (0,017 ml/g) como anestésico (Pasqualini y Ruoslahti, supra, 1996). Después de 1 a 4 minutos, los ratones se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido o, después de aproximadamente 5 minutos de circulación del fago, se perfundió a los ratones a través del corazón con 5 a 10 ml de DMEM (SIGMA; St. Louis MO). Para recuperar el fago, se recogieron y se pesaron los órganos de los ratones perfundidos o se congelaron parcialmente los órganos de los ratones congelados instantáneamente, a continuación se homogeneizaron en 1 ml de DMEM-PI (DMEM que contiene inhibidores de proteasa (PI); fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF; 1 mM), aprotinina (20 \mug/ml), leupeptina (1 \mug/ml)).
Se lavaron 3 veces las muestras orgánicas con DMEM-PI enfriadas en hielo que contenían albúmina de suero bovino (BSA) al 1%, a continuación se incubaron directamente con 1 ml de bacterias K91-kan durante 1 h. Se añadieron diez ml de medio NZY que contenía 0,2 \mug/ml de tetraciclina (NZY/tet) al cultivo bacteriano, se incubó la mezcla en un agitador a 37ºC durante 1 h, a continuación se colocaron alícuotas de 200 \mul en placas de agar-agar que contenían 40 \mug/ml de tetraciclina (tet/agar-agar).
Para el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de la piel, se utilizaron ratones lampiños BALB/c de dos meses de vida para evitar la contaminación por el pelo. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa con fago como se ha descrito anteriormente y, después de la perfusión a través del corazón, se retiró la piel en secciones grandes y se colocó en una placa enfriada con hielo con las hipodermis enfrentadas. Se rascó la piel con un bisturí para eliminar la mayor parte de la hipodermis que se procesó a continuación para la recuperación del fago como se describe a continuación.
Para el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de la retina, se utilizaron ratas Simonson Albino hembras de dos meses de vida para proporcionar muestras de tejido mayores de los ratones. Se anestesiaron las ratas con fenobarbital (50 mg/kg de peso corporal), y mientras estaban bajo el efecto de la anestesia, se abrió la cavidad abdominal de las ratas y se inyectaron 10^{10} UT de un banco de fagos en el ventrículo izquierdo del corazón a través del diafragma. Después de 2 a 5 minutos de circulación del fago, se extirparon los ojos, a continuación se lavaron una vez en EtOH al 70% y una vez en PBS. Se extirpó la cámara anterior, con la córnea y el cristalino, y se desprendió la retina de la cámara posterior restante. Se pesó el tejido se homogeneizó con una jeringuilla con bulbo en 1 ml de DMEM enfriado en hielo que contenía los inhibidores de proteasa (PMSF 1 mM, 20 \mug/ml de aprotinina y 1 \mug/ml de leupeptina; todos de SIGMA; St. Louis MO). Se lavó el tejido 3 veces con 1 ml de DMEM y se recuperó el fago como se describe a continuación.
Se cultivaron durante 16 h en 5 ml de NZY/tet, aproximadamente 250 a 300 colonias bacterianas independientes que contenían el fago recuperado de varios órganos o tejidos. En algunos experimentos, se seleccionaron aproximadamente 1.000 bacterias independientes que contenían el fago y los fagos se ampliaron en 2 ml de NZY/tet o la placa completa que contenía el fago se raspó, se agruparon y se cultivaron en su mayor parte y se procesaron para inyectables. Donde se cultivaron los fagos por separado, los cultivos se agruparon y los fagos se inyectaron en ratones o ratas como se ha descrito anteriormente para una segunda ronda del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo. En algunos experimentos, se llevó a cabo una tercera o cuarta ronda del ensayo de adhesión celular sobre plástico. Se purificó el ADN del fago en las colonias bacterianas independientes obtenidas y las secuencias de ADN que codifican los péptidos expresados por el fago seleccionado se determinaron (véase Koivunen et al., supra, antes de 1994).
Ejemplo II Caracterización de péptidos que migran a un órgano seleccionado
Este ejemplo demuestra que un péptido de la invención que migra al órgano o tejido migra selectivamente a un órgano o tejido seleccionado, incluyendo un órgano que contiene un componente del RES.
A. El pulmón es el órgano seleccionado
Después de dos o tres rondas de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de ratones inyectados con un banco de expresión en el fago CX_{3}CX_{3}CX_{3}C cíclico (SEC. ID. nº: 25) o CX_{6}C cíclico (SEC. ID. nº: 26), se identificaron cuatro péptidos que hicieron diana en el pulmón. Las secuencias peptídicas CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) y CGFELETC (SEC. ID. nº: 2; GFE-2) aparecieron repetidamente en el pulmón y se descubrió también que dos secuencias peptídicas del banco CX_{6}C (SEC. ID. nº: 26), CTLRDRNC (SEC. ID. nº: 15) y CIGEVEVC (SEC. ID. nº: 16) migran al pulmón (véase la Tabla 2, más adelante).
Para determinar la especificidad de direccionamiento al pulmón de cada uno de los péptidos identificados, se ampliaron cada uno de los fagos que expresan los péptidos, se diluyeron al mismo valor de entrada y se administraron a ratones. Después de la administración, se extirparon el riñón de referencia y el órgano cerebral y se determinó el número de UT del fago en el pulmón, riñón y cerebro. En la Figura 2 los resultados presentados ponen de manifiesto que el fago que tiene la secuencia peptídica CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) se unió 10 y 35 veces más al pulmón que al riñón y al cerebro, respectivamente. La Figura 2 pone de manifiesto también que CGFELETC (SEC. ID. nº: 2; GFE-2) se encontraba en el pulmón a una concentración mayor de 12 y 20 veces que en el riñón y el cerebro, respectivamente. Los péptidos CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1), CGFELETC (SEC. ID. nº: 2; GFE-2), CTLRDRNC (SEC. ID. nº: 15) y CIGEVEVC (SEC. ID. nº: 16) que migran al pulmón se enriquecen en el pulmón 35, 9, 6 y 5 veces, respectivamente, sobre el fago no seleccionado (véase la Figura 2). De este modo, se observó enriquecimiento sustancial del fago que se une al pulmón en comparación con el cerebro de referencia y el riñón y en comparación con el fago no seleccionado.
Se determinó también la especificidad para los péptidos que migran al pulmón mediante experimentos competitivos con GST-péptidos de fusión. Un péptido de fusión GST-GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) administrado conjuntamente con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) inhibió a GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) que migra al pulmón, mientras que GST no tenía ningún efecto sobre el direccionamiento (Figura 3A). Además, el efecto inhibidor del GST-GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) sobre el direccionamiento dependía de la dosis; el 70% de inhibición del direccionamiento se produjo al inyectar 50 \mug de la proteína de fusión GST-GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) (Figura 3B). La inyección conjunta de GST-GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) con GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) inhibió el direccionamiento en menor medida; el 30% de inhibición del direccionamiento se produjo al inyectar 500 \mug de la proteína de fusión GST-GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) (Figura 3B).
Resulta interesante que la fusión GST-GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) fue más eficaz inhibiendo GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) que migra al pulmón; el 60% de la inhibición del direccionamiento a GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) se produjo al inyectar 500 \mug de la proteína de fusión GST-GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) (Figura 3B). Sin embargo, no se observó ningún efecto inhibidor del direccionamiento a GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) al inyectar conjuntamente GST-GFE-2 (SEC. ID. nº: 2). Esto puede explicarse por GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) que presenta una afinidad mayor para una molécula de migración compartida que GFE-2 (SEC. ID. nº: 2).
Se obtuvieron péptidos adicionales que migran al pulmón y se determinaron las secuencias de aminoácidos para las inserciones (véase la Tabla 2). Predominaban los péptidos que contenían el motivo GFE (véase la Tabla 1; SEC. ID. nº: 1 y nº: 2). Otros péptidos que estaban presentes más de una vez en el pulmón están indicados con un asterisco en la Tabla 2 (más adelante) y los péptidos restantes fueron identificados una vez cada uno.
Estos resultados indican que la selección de los péptidos que contienen el motivo GFE representa la unión selectiva de varios péptidos que se expresan en cada fago que presenta la secuencia GFE y no es debida a un producto artificial, por ejemplo, a la ampliación del fago. Además, en algunos casos, los fagos que expresaban los péptidos que presentan la misma secuencia de aminoácidos eran codificados por oligonucleótidos con diferentes secuencias, confirmando por consiguiente que el direccionamiento de un fago determinado a un pulmón es debido al péptido específico expresado en el fago.
Estos resultados demuestran que el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo puede utilizarse para cribar bancos de expresión en el fago con objeto de identificar los péptidos que se expresan en el fago que migran al pulmón, que contienen un componente del RES.
B. La piel es el tejido seleccionado
Después de dos o tres rondas de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de los ratones inyectados con un banco de expresión en el fago CX_{3}CX_{3}CX_{3}C cíclico (SEC. ID. nº: 25), se identificó la secuencia peptídica CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3), que aparecía repetidamente en la piel (Tabla 1). Para determinar la especificidad de la secuencia CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) sobre el direccionamiento a la piel, se amplió independientemente el péptido que se expresa en el fago, se diluyó hasta el mismo valor de entrada y se administró a ratones. Después de la administración, se extrajeron el riñón de referencia y el órgano del cerebro y se determinó el número de UT de fagos en la piel, riñón y cerebro.
Los resultados pusieron de manifiesto que la secuencia peptídica que se presenta en el fago CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) se unió 7 veces más a la piel que al riñón o al cerebro (véase Figura 2; Tabla 1). El péptido CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) se enriqueció en la piel 7 veces más que el fago no seleccionado (Figura 2). De este modo, se observó enriquecimiento sustancial de fago que se une a la piel en comparación con el cerebro de referencia y el riñón y en comparación con el fago no seleccionado.
Se obtuvieron péptidos adicionales que migran a la piel cribando los bancos de expresión en el fago CX_{3}CX_{3}CX_{3}C cíclico (SEC. ID. nº: 25) o CX_{10}C (SEC. ID. nº: 30); se determinaron las secuencias de aminoácidos para las inserciones, como se muestra en la Tabla 5, más adelante. Los péptidos que fueron identificados más de una vez durante el cribado están indicados con un asterisco. Por ejemplo, el 14% del fago CX_{3}CX_{3}CX_{3}C cíclico (SEC. ID. nº: 25) recuperado que se dirigió a la piel de la cabeza presentaba la secuencia CVDVCCDGCPVCC (SEC. ID. nº: 437). Cada uno de los fagos que presenta las secuencias RVPLSGDVEH (SEC. ID. nº: 438), LRVMSFTSGQ (SEC. ID. nº: 439) o RFSVGSLFGS (SEC. ID. nº: 440) constituía el 14% del fago CX_{10}C (SEC. ID. nº: 30) recuperado que se dirigió a la piel de la cabeza. El cribado frente al direccionamiento a la piel de la cola puso de manifiesto que el 12% del fago CX_{3}CX_{3}CX_{3}C cíclico (SEC. ID. nº: 25) recuperado presentaba la secuencia CGATCEMQCPSGC (SEC. ID. nº: 441).
La especificidad para los péptidos que migran a la piel se determinó también mediante experimentos competitivos con GST-péptidos de fusión. La Figura 3B demuestra que un péptido de fusión GST-CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) administrado conjuntamente con CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) inhibía el direccionamiento en la piel, mientras que GST no tenía ningún efecto sobre el direccionamiento. El efecto inhibidor del GST-GFE-1 sobre el direccionamiento fue aproximadamente del 55% cuando se inyectan 500 \mug de la proteína de fusión GST-CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) (Figura 3B).
Estos resultados demuestran que el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo puede utilizarse para cribar bancos de expresión en el fago con objeto de identificar los péptidos de expresión en el fago que migran a la piel y que dicho direccionamiento es específico.
C. El páncreas es el órgano seleccionado
Después de dos o tres rondas de ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo de los ratones inyectados con un banco de expresión en el fago CX_{7}C cíclico (SEC. ID. nº: 24), se identificaron varios péptidos que migran al páncreas (Tabla 3). En particular, la secuencia peptídica SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4) aparecía repetidamente en el páncreas. Para determinar la especificidad de SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4), un fago que expresa la secuencia se amplió independientemente, se diluyó hasta el mismo valor de entrada y se administró a ratones. Después de la administración, se extrajo el órgano del cerebro de referencia y se determinó el número de UT de fagos en cada páncreas. Los resultados mostrados en la Figura 2, ponen de manifiesto que el fago que expresa la secuencia peptídica SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4) que se presenta en el fago CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) se unió 10 veces más al páncreas que al cerebro y experimentos adicionales pusieron de manifiesto un enriquecimiento de hasta 20 veces en el páncreas en comparación con el cerebro (Tabla 1). Además, SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4) presentaba 22 veces más enriquecimiento de fago en el páncreas en comparación con el fago no seleccionado (véase la Figura 2). De este modo, se observó enriquecimiento sustancial de fago que se une al páncreas en comparación con el tejido de referencia (cerebro) y el fago no seleccionado.
Estos resultados demuestran que el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo puede utilizarse para identificar moléculas que migran selectivamente al páncreas. Además, los resultados indican que el ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo identifica cada fago que codifica el mismo péptido.
D. La retina es el tejido seleccionado
Ratas inyectadas con un banco de expresión en el fago CX_{7}C cíclico (SEC. ID. nº: 24) se sometieron al ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo y, después de tres rondas, se identificaron en la retina las secuencias peptídicas CSCFRDVCC (SEC. ID. nº: 5) y CRDVVSVIC (SEC. ID. nº: 6). Debido al pequeño tamaño de la muestra de tejido, no pudo cuantificarse exactamente el fago aislado. De este modo, la selectividad de los péptidos que se expresan en el fago se determinó ampliando independientemente la secuencia que expresa el fago y administrando el fago a ratas con un fago fdAMPLAY88 de referencia. Este fago fd-ampicilina es similar al fd-tetraciclina (basado en fuse 5) porque presenta la misma capacidad de infección.
Se inyectaron ratas con una cantidad igual de la CSCFRDVCC (SEC. ID. nº: 5) o CRDVVSVIC (SEC. ID. nº: 6) y el fago fdAMPLAY88. Después de la administración, se evaluó el direccionamiento a la retina comparando el número de UT del fago seleccionado en placas de tetraciclina y fdAMPLAY88 en placas de ampicilina recubiertas procedente de la retina.
Los resultados pusieron de manifiesto que CSCFRDVCC (SEC. ID. nº: 5) presentaba un enriquecimiento triple y CRDVVSVIC (SEC. ID. nº: 6) demostró un enriquecimiento doble en la retina en comparación con el fago fdAMPLAY88 de referencia. De este modo, se observó un enriquecimiento sustancial del fago que se une a la retina en comparación con el fago de referencia.
Se obtuvieron péptidos adicionales que migran a la retina y se determinaron las secuencias de aminoácidos para las inserciones (Tabla 6, más adelante). Están indicados los péptidos que aparecían más de una vez. En particular, el motivo RDV del tripéptido estaba presente en varios contextos de secuencia diferentes, lo que indica que los ácidos nucleicos que codifican los péptidos procedían de numerosos fagos independientes.
Estos resultados indican que la selección de los péptidos que contienen el motivo RDV representa la unión selectiva de varios péptidos independientes que se expresan en el fago que presentan la secuencia RDV y no es debido a un producto artificial, por ejemplo, a la ampliación del fago. Además, en algunos casos, los fagos que expresan péptidos que presentan la misma secuencia de aminoácidos estaban codificados por oligonucleótidos con diferentes secuencias, confirmando por consiguiente que el direccionamiento de un fago determinado a la retina es debido al péptido específico expresado en el fago.
Estos resultados demuestran además que el procedimiento del ensayo de adhesión celular sobre plástico in vivo es un procedimiento generalmente aplicable para cribar un banco para identificar, por ejemplo, los péptidos que se expresan en el fago que migran a un órgano o tejido seleccionado, incluyendo los órganos y tejidos que contienen un componente del RES. Las búsquedas en la base de datos no ponen de manifiesto ninguna homología significativa de los péptidos que migran al páncreas, pulmón, piel o retina con ligandos conocidos para los receptores de las células endoteliales.
Ejemplo III Análisis inmunohistológico de los péptidos que migran al pulmón, páncreas y piel
Este ejemplo demuestra la localización de las moléculas que migran al pulmón, páncreas y piel utilizando un examen inmunohistológico.
Se detectaron péptidos de migración que se expresan en el fago en el pulmón, páncreas y piel mediante inmunotinción de secciones histológicas obtenidas 5 min. después de la administración a un ratón del péptido que migra al pulmón, páncreas o piel que se expresa en un fago ("péptido-fago"). Después de la administración del péptido-fago, se manipularon los ratones como se ha descrito anteriormente y se extirparon varios órganos, incluyendo el pulmón, páncreas y piel, y se fijaron en solución de Bouin (SIGMA). Se prepararon secciones histológicas y se hicieron reaccionar con anticuerpos anti-M13 (fago) (Pharmacia Biotech; véase la patente U.S. nº 5.622.699, supra, 1997; Pasqualini y Ruoslahti, supra, 1996). La observación del anticuerpo anti-M13 ligado se llevó a cabo utilizando un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa (SIGMA) según las instrucciones del fabricante.
Se administraron por vía intravenosa a ratones péptidos que migran al pulmón fagos que se expresan en fagos, GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) y, después de 5 minutos de circulación, se aisló el pulmón y se procesó como se ha descrito anteriormente. Se observó la tinción inmunohistoquímica de los capilares alveolares y no se detectó ninguna preferencia para ninguna parte anatómica. Sin embargo, no hubo tinción de las paredes bronquiales y algunos vasos sanguíneos mayores. Los ratones inyectados con fago no seleccionado no presentaban tinción en el pulmón, y no se observó tinción en el páncreas ni en la piel tras la inyección de GFE-1 (SEC. ID. nº: 1).
Se llevaron a cabo experimentos similares en el páncreas utilizando el péptido que migra al páncreas, SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4) que se expresa en el fago. En estos experimentos, se prepararon muestras histológicas del páncreas así como de los órganos y tejidos de referencia incluyendo el pulmón y la piel y se examinaron por inmunotinción como se ha descrito anteriormente. Los resultados pusieron de manifiesto que la tinción en los capilares y en los vasos sanguíneos del páncreas exocrino era mayor mientras que era pequeña si se detectaba alguna tinción del páncreas exocrino. De nuevo, el fago no seleccionado no tiñó el páncreas, ni se observó ninguna tinción en el pulmón ni en la piel de los ratones inyectados con SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4) que se expresa en el fago. Curiosamente, se observó alguna tinción de los vasos sanguíneos en el interior del útero para el péptido SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4). Además, después de la inyección intravenosa de SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4) que se expresa en el fago, se recuperó el fago del útero a un nivel 6 veces mayor en comparación con el fago no seleccionado. De este modo, SWCEPGWCR (SEC. ID. nº: 4) migra tanto al páncreas como al útero.
Se llevaron a cabo experimentos en la piel utilizando el fago que expresa el péptido CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3) que migra a la piel. En estos experimentos, se prepararon muestras histológicas de la piel así como de los órganos y tejidos de referencia incluyendo el pulmón y el páncreas y se examinaron por inmunotinción como se ha descrito anteriormente. Los resultados pusieron de manifiesto la tinción de los vasos sanguíneos de la hipodermis aunque pequeña si se detectaba alguna tinción de la epidermis. De nuevo, el fago no seleccionado no tiñó estos vasos sanguíneos, y no se observó tinción en la referencia, el pulmón y el páncreas de los ratones inyectados con el fago que expresa CVALCREACGEGC (SEC. ID. nº: 3).
Todos los fagos, incluyendo el fago no seleccionado, produjeron tinción del hígado y del bazo. Este resultado es coherente con la captura del fago por un componente del RES que se ha descrito anteriormente.
Estos resultados demuestran que los péptidos que migran al pulmón, páncreas y piel migran selectivamente al pulmón, páncreas y piel, específicamente en el sistema vascular. Además, estos resultados ponen de manifiesto que los órganos y tejidos pueden presentar diferencias de los modelos de tinción en zonas determinadas, reflejando supuestamente la expresión diferenciada de una molécula de migración en el interior del órgano o tejido. El análisis inmunohistoquímico proporciona un ensayo conveniente para identificar la localización y distribución del fago que expresa los péptidos que migran al pulmón, páncreas y piel.
Ejemplo IV El receptor para el péptido gfe-1 que migra al pulmón es la dipeptidasa de la membrana
Este ejemplo demuestra que el receptor para "GFE" que contiene los péptidos tales como GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) es la dipeptidasa de la membrana. Este ejemplo demuestra además que GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) se une e inhibe la actividad de la dipeptidasa de la membrana.
A. El fago GFE-1 se une selectivamente a las células primarias del pulmón
Como se ha descrito anteriormente, el fago con CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) se une al sistema vascular de los pulmones del ratón cuando se inyecta in vivo. Se realizó un ensayo de fijación del fago en las células primarias del pulmón para determinar si la especificidad del fago con CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) que se une al tejido pulmonar in vivo podría reconstruirse in vitro.
La fijación del fago a las células primarias se llevó a cabo de la manera siguiente. En resumen, se anestesiaron ratones Balb/c (Harlan Sprague Dawley) con 0,017 ml/g de Avertin tal como describió Gardner et al., Lab. Animal Sci. 45:199-204 (1995), que está incorporada en la presente memoria como referencia. Después de anestesia profunda, los ratones se perfundieron a través del corazón con 10 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Irvine Scientific; Santa Ana, CA). Se recogieron a continuación los pulmones, los riñones y el cerebro, se picaron, se colocaron en 2 ml de DMEM que contenía BSA al 0,5% (Intergen; Purchase, NY) y 0,5 \mug/ml de colagenasa V (SIGMA) y se incubaron a 37ºC durante 25 minutos. Después del tratamiento con colagenasa, el tejido se hizo pasar a través de un filtro de células de 70 \muM de poro (Becton Dickinson; Franklin Lake, NJ). Las células filtradas se lavaron una vez con 10 ml de DMEM enriquecido con suero al 10%. Las partículas de fago utilizadas en el ensayo de fijación se ampliaron y purificaron, y las inserciones expresadas en el fago se secuenciaron tal como se describe en Smith y Scott, supra, 1993. Para asegurar una entrada igual del fago diferente a la que se ha de ensayar, el fago se valoró varias veces utilizando bacterias K91Kan (Smith y Scott, supra, 1993).
Para la reacción de fijación, se incubaron 10^{9} unidades de transducción (UT) del fago con 5 \times 10^{6} células en 1 ml de DMEM enriquecido con suero al 10%. La fijación se llevó a cabo a 4ºC durante 2 horas con agitación suave. Después de la reacción de fijación, se lavaron las células cuatro veces con 1 ml de DMEM enriquecido con 10% de suero a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos cada vez. Se centrifugaron las células y se volvió a poner en suspensión el sedimento celular en 100 \mul de DMEM y se transfirió a un tubo nuevo. El fago unido a las células se recuperó añadiendo 1 ml de cultivo bacteriano K91Kan (Smith y Scott, supra, 1993) seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las bacterias se diluyeron a continuación en 10 ml de medio de cultivo LB enriquecido con 0,2 \mug/ml de tetraciclina y se incubaron durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. Diluciones en serie del cultivo bacteriano se colocaron en placas LB que contenían 40 \mug/ml de tetraciclina. Se incubaron las placas a 37ºC durante la noche antes del recuento de colonias (unidades de transducción, UT).
Los resultados del ensayo de fijación al fago en las células primarias de pulmón in vitro demostraron que las células primarias de pulmón ligaron aproximadamente 60 veces más fago con CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) que el fago fd-tet sin inserción. La fijación del fago con CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1; GFE-1) a células de riñón fue también superior a la fijación de fd-tet (prueba de la t, p<0,02) aunque esta fijación fue mucho menor que la fijación de GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) en las células pulmonares. En los estudios in vivo, no se detectó ningún fago específico que migra al riñón cuando el fago con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) se inyectó por vía intravenosa. El fago con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) no presentaba fijación específica a las células primarias del cerebro in vitro.
La fijación del fago con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) a las células del pulmón se inhibió en casi el 70% en presencia de 150 \muM de péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1), mientras que la misma concentración de un péptido de referencia, GRGESP (SEC. ID. nº: 442) no tuvo efecto. La fijación no específica del fago fd-tet sin inserción no fue afectada por la presencia de los péptidos GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) o de referencia. Estos resultados demuestran que la fijación selectiva in vivo de la secuencia del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) al endotelio pulmonar puede reconstruirse en un ensayo in vitro en las células primarias completas del pulmón y que los extractos celulares completos del pulmón contienen suficientes cantidades de receptor de GFE-1 para aislamiento.
B. El péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) se une a una proteína de superficie de 55 kDa
Para detectar únicamente las moléculas de la superficie celular que se unen a GFE-1 (SEC. ID. nº: 1), se biotinilaron in vivo proteínas de la superficie endotelial del pulmón de ratón y se preparó un extracto pulmonar completo. El extracto marcado se fraccionó en primer lugar en una columna por afinidad con péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1); posteriormente, se lavó la columna y se eluyeron las proteínas ligadas con una solución del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1).
La biotinilación in vivo de las proteínas de la superficie de las células endoteliales se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente en De La Fuente et al., Am. J. Physiol. 272: L461-L470 (1997), que está incorporada en la presente memoria como referencia, con varias modificaciones. En resumen, se anestesiaron ratones Balb/c con Avertin y se perfundieron lentamente a través del corazón durante 10 a 15 minutos con aproximadamente 15 ml de PBS que contenía 0,5 mg/ml de sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce; Rockford, IL). Los pulmones bien perfundidos o los tejidos de referencia tal como el cerebro se recogieron a continuación y se incubaron en hielo durante 20 minutos. Se homogeneizaron a continuación los tejidos para la preparación de extractos como se describe con más detalle a continuación.
Para la preparación de los extractos, se picaron en primer lugar pulmones de ratón o rata y a continuación se homogeneizaron en un homogeneizador Brinkman (Brinkman; Wesbury, NY) en un volumen mínimo (2,5 ml/g de tejido) de PBS en frío que contenía N-octil-\beta-D-glucopiranósido 100 mM (Calbiochem; La Jolla, CA) con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), 20 \mug/ml de aprotinina y 1 \mug/ml de leupeptina (PBS/octilglucósido). El tejido homogeneizado se incubó en hielo durante 2 horas y a continuación se centrifugó a 12.000 \times g durante 30 minutos para eliminar el residuo celular. Los sobrenadantes reunidos se clarificaron de algunos residuos antes de la cromatografía por afinidad.
Se llevó a cabo la cromatografía por afinidad de GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) según los principios generales establecidos por Pytela et al. para el aislamiento de integrinas por cromatografía del péptido RGD (Pytela et al., Cell 40:191-198 (1985); Pytela et al. Methods Enzym. 144:475-489 (1987), cada una de las cuales está incorporada en la presente memoria como referencia. Todas las etapas se realizaron a 4ºC. En resumen, los péptidos GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) o de referencia (AnaSpec; San José, CA) se acoplaron a Sepharose 4B activada por CNBr según las instrucciones del fabricante (Pharmacia Biotech; Uppsala, Suecia). La matriz contenía aproximadamente 2 mg/ml de péptido. El extracto marcado con biotina de 2 pulmones de ratón se aplicó a 500 \mul de la matriz de afinidad equilibrada en el tampón de la columna (PBS que contenía octilglucósido 50 mM y PMSF 1 mM). El extracto se aplicó a la columna y se volvió a aplicar en flujo a través de durante un periodo de 90 minutos. Se lavó a continuación la columna con 20 volúmenes de tampón de la columna. La elución con el péptido sintético GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) se realizó lavando lentamente la columna durante un periodo de 1 hora con 2 volúmenes de tampón de la columna enriquecido con 1 mg/ml del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1). Las proteínas restantes unidas a la columna se eluyeron con urea 8 M.
Se concentraron los eluidos 5 veces utilizando una columna Centricon 10.000 MWCO (Amicon; Beverly, MA). Se separaron a continuación alícuotas de cada elución por SDS-PAGE utilizando geles del 4 al 12% de poliacrilamida fundida previamente (Novex; San Diego, CA). Para los experimentos realizados con extractos marcados con biotina, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore; Bedford, MA), se electrotransfirieron con estreptavidina-HRP (Pierce; Rockford, IL) y se revelaron con el sistema ECL de quimioluminiscencia (NEN; Boston, MA).
Como se muestra en la Figura 4 (panel izquierdo), se eluyó selectivamente una proteína biotinilada de 55 kDa con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1). Antes de la elución, los lavados de la columna no presentaban proteínas biotiniladas detectables; la adición ulterior de urea 8 M eluyó muchas proteínas biotiniladas que fueron retenidas de manera no específica en la columna. No se detectó ninguna proteína en el intervalo de 55 kDa después de llevar a cabo el mismo procedimiento en una columna con el péptido de referencia (GRGESP; SEC. ID. nº: 442) (Figura 4; panel derecho). Como referencia adicional, se fraccionó un extracto celular de cerebro biotinilado in vivo a través de una columna con el péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) en las mismas condiciones; ninguna de las proteínas biotiniladas del extracto de cerebro se unió específicamente a la columna con péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) (datos no mostrados).
Estos resultados indican que el péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) se une específicamente a una proteína de la superficie vascular del pulmón de 55 kDa. En condiciones no reductoras, la proteína de 55 kDa migró como una banda de 110 kDa (datos no mostrados). De este modo, estos resultados indican además que el receptor de GFE es un homodímero ligado a disulfuro.
C. El receptor de GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) de 55 kDa es la dipeptidasa de la membrana
El fago con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) puede migrarse selectivamente a los vasos sanguíneos del pulmón de rata cuando se inyecta en la circulación. Para purificar una cantidad mayor de la proteína de 55 kDa que podría obtenerse de los tejidos del ratón, se preparó un extracto no biotinilado de 100 pulmones de rata congelados (Pel-Freez Biologicals; Rogers, AR). El extracto a gran escala se preparó esencialmente como se ha descrito anteriormente en la adición de una segunda extracción del sedimento con un volumen mínimo de PBS/octilglucósido.
El extracto a gran escala se fraccionó en una columna de afinidad con el péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) como se ha descrito anteriormente utilizando 3 ml de matriz de afinidad. Una proteína de 55 kDa que era detectable por tinción con azul de Coomassie fue eluida de la columna por el péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) (datos no mostrados). Esta proteína que emigró conjuntamente con la proteína de la superficie de 55 kDa aislada del pulmón de ratón, se sometió a digestión tríptica y se secuenció por espectrometría de masas en el Harvard University Microchemistry Facility (Boston, MA) por espectrometría de masas en tandem de HPLC microcapilar en fase inversa (\muLC/MS/MS) en el espectrómetro de masas con trampa iónica de cuadrupolo LCQ de Finnigan.
Dos péptidos trípticos procedentes de la proteína de 55 kDa, YPDLIAELLR (SEC. ID. nº: 444) y TTPVIDGHNDL
PWQMLTLFNNQLR (SEC. ID. nº: 445), presentaron identidad completa con la dipeptidasa de la membrana de rata (EC 3.4.13.19), conocida también como dipeptidasa microsómica, deshidropeptidasa-1 o MDP. Otras varias secuencias peptídicas indicaron la presencia de IgG de rata en la muestra. En este intervalo de peso molecular es de esperar contaminación de la muestra con IgG, dada la abundancia de IgG en el extracto de tampones no perfundidos.
Para confirmar que la dipeptidasa de la membrana (MDP) es la proteína que se une al péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1), se ensayó la actividad de la dipeptidasa de la membrana en la proteína de 55 kDa. Las muestras de la fracción de lavado de la cromatografía por afinidad y el eluido del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) (Figura 4) se incubaron en presencia del sustrato Gly-D-Phe del MDP específico, y D-Phe se detectó exactamente por fluorimetría tal como se describe en Heywood y Hooper, supra, 1995 (véase, también, Keynan et al., supra, 1996). En resumen, se incubaron en primer lugar las muestras a 37ºC durante 3 horas con el sustrato Gly-D-Phe de MDP (1 mM; SIGMA). El D-Phe liberado se convirtió a continuación en el ácido 6,6'-dihidroxi-(1,1'-bifenil)-3,3'-diacético en presencia de ácido D-amino oxidasa (tipo I; SIGMA) y peroxidasa (tipo VI; SIGMA; Heywood y Hooper, supra, 1995). Se midió la fluorescencia utilizando un lector de microplacas por fluorescencia fmax de Molecular Devices
(Sunnyvale, CA).
La Figura 5 presenta el curso temporal de la conversión de D-Phe en un compuesto fluorescente en muestras de la fracción del lavado de la cromatografía por afinidad y del eluido del péptido GFE-1 descrito anteriormente (Figura 4). Aunque la fracción del lavado presentaba solamente un nivel de referencia de fluorescencia, el eluido del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) contenía gran actividad de dipeptidasa de la membrana como se ilustra por la conversión de D-Phe dependiente del tiempo (véase la Figura 5). Además, el eluido del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) aislado del extracto de pulmón de rata presentaba también fuerte actividad de MDP (datos no mostrados). La actividad de MDP se detectó también en el extracto completo de pulmón, aunque la actividad específica fue aproximadamente 600 veces mayor para el eluido del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) (200 nmoles de D-Phe/min/mg) que para el extracto de pulmón de rata completo (0,34 nmoles de D-Phe/min/mg).
D. Los fagos con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) y GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) se unen a células transfectadas con MDP
La estirpe celular de COS-1, que es conocida porque tiene un nivel bajo o no detectable de actividad de MDP, se ha utilizado extensamente para estudiar la estructura y función de MDP (Keynan et al., supra, 1996; Keynan et al., Biochem. J. 326:47-51 (1997)). Se transfectaron células COS-1 con MDP murina y se utilizaron para ensayar la fijación a las SEC. ID. nº: 1 y nº: 2 como se describe más adelante.
Para la transfección en las células COS-1, se preparó el vector de expresión de MDP murino de la forma siguiente. Se aisló ARN completo de pulmón de ratón utilizando las columnas de purificación de RNA de Qiagen (Qiagen; Santa Clarita, CA) y se utilizó como plantilla para la síntesis de la primera cadena del ADNc con transcriptasa inversa y una mezcla de hexámeros y poli-dT oligonucleótidos al azar (GIBCO/BRL; Grand Island, NY). El ADNc de MDP de ratón (Pasqualini et al., J. Cell Biol. 130:1189-1196 (1995)) se amplió a partir del grupo ADNc por PCR utilizando el par de oligonucleótidos: CCGCTGGTACCGCAGATCCCTGGGGACCTTG (SEC. ID. nº: 446) que contiene un adaptador Kpn I y TCTTTCTAGAGCTCAGAGAGCACTGGAGGAG (SEC. ID. nº: 447), que contiene un adaptador Xba I, utilizando la Taq polimerasa de GIBCO/BRL. Se digirió el ADNc de la MDP murina de 1,3 kb ampliado con Kpn I y Xba I y se insertó en los mismos puntos del vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen; Carlsbad, CA) utilizando enzimas de restricción de ADN y T4 ADN ligasa de New England Biolabs (Beverly, MA). La clonación con éxito del ADNc de MDP murino se confirmó por secuenciado de ADN. La transfección de las células COS-1 se llevó a cabo con el Superfect Reagent de Qiagen tal como recomienda el fabricante.
La fijación del fago a las células COS-1 transfectadas con MDP se determinó de la manera siguiente. En resumen, se transfectaron 10^{7} células COS-1 con 10 \mug del vector de expresión MDP o del vector solo. Después de 48 horas, las células se rasparon suavemente en la placa, se lavaron una vez y se sometieron al ensayo de fijación del fago o al ensayo de actividad de la dipeptidasa de la membrana descrito anteriormente. Para el ensayo de fijación del fago, se utilizaron de entrada 5 \times 10^{6} y 10^{10} unidades de transducción (UT) del fago. Para la medición de la actividad de la peptidasa de la membrana, se lisaron 10^{6} células en 100 \mul de PBS/octilglucósido sin inhibidores de proteasa. Se utilizó una alícuota de 10 \mul del extracto para medir la actividad de MDP.
Como se muestra en la Figura 6A, las células COS-1 transfectadas con MDP murino presentaban por lo menos 15 veces mayor actividad de MDP que las células pseudotransfectadas. Además, el fago con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) se unió a las células COS-1 transfectadas con MDP. Como se muestra en la Figura 6B, el fago con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) se unió 4 veces más a las células transfectadas con MDP que a las células pseudotransfectadas. El fago de referencia negativa, el fago fd-tet y el fago que migra a la piel (CVALCREACGEGC; SEC. ID. nº: 3) que expresa un péptido con propiedades estructurales similares a las del péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1), no presentó ninguna fijación específica para las células que expresan MDP en comparación con las células pseudotransfectadas. Además, la Figura 6B demuestra que el fago con GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) también se unió a las células transfectadas con MDP; la fijación fue más débil que la fijación de GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) de acuerdo con los datos de direccionamiento en el pulmón in vivo descritos anteriormente. La fijación del fago tanto con GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) como con GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) a las células transfectadas con MDP fue inhibida completamente por el péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1; datos no mostrados). Estos resultados indican que los péptidos GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) y GFE-2 (SEC. ID. nº: 2) se unen al mismo receptor.
E. GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) puede inhibir la actividad de MDP
El metabolismo del tripéptido glutatión conlleva la escisión del tripéptido por la \gamma-glutamil transpeptidasa para formar el glutamato y la cisteinilglicina (Cys-Gly). El dipéptido Cys-Gly es reconocido posteriormente y escindido por la MDP, que escinde solamente dipéptidos. La secuencia de aminoácidos del glutatión es similar a la de la fracción N-terminal del péptido GFE-1, CGFECVRQCPERC (SEC. ID. nº: 1), siendo Cys-Gly el primer y segundo aminoácidos de GFE-1.
Se ensayó la capacidad de GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) para inhibir la hidrólisis de Gly-D-Phe por la MDP. Se llevó a cabo la detección fluorimétrica de D-Phe como se ha descrito anteriormente. La Figura 7 demuestra que GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) inhibía la hidrólisis del sustrato Gly-D-Phe (0,5 mM) en función de la dosis. Un péptido cíclico de referencia (CARAC; SEC. ID. nº: 443) no inhibió la enzima.
Estos resultados indican que GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) puede actuar como inhibidor competitivo de la actividad de MDP.
Ejemplo V GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) Inhibe la metástasis pulmonar
Este ejemplo demuestra que la SEC. ID. nº: 1 del péptido GFE-1 puede inhibir la metástasis pulmonar experimental en ratones.
Se provocó metástasis pulmonar experimental en ratones utilizando células C8161 de melanoma humano como se ha descrito en Arap et al., Science 279:377-380 (1998) y Pasqualini et al., Nature Med. 11:1197-1203, cada una de las cuales está incorporada en la presente memoria como referencia. En resumen, se cultivaron células C8161 a confluencia del 75% y a continuación se recogieron con EDTA/PBS 2,5 mM. Se inyectaron las células cancerosas C8161 en la vena de la cola de ratones BALB/c lampiños hembra (dos meses de vida) a una concentración de 10^{5} células por animal. Se inyectaron las células solas a dos series de cinco ratones; las células con 250 \mug de péptido CARAC de referencia (SEC. ID. nº: 443) o las células con 250 \mug de péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1). Cada inyección estaba en un volumen total de 200 \mul.
Se cultivaron alícuotas de las células de melanoma durante la noche para confirmar que los péptidos no afectan la viabilidad de las células tumorales. Ni el péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) ni el péptido CARAC (SEC. ID. nº: 443) presentaban toxicidad a las células de melanoma (datos no mostrados).
Se sacrificaron los ratones cinco semanas después de la inyección, se recogieron los pulmones y se pesaron. Como se muestra en la Figura 8, el peso del pulmón de los ratones a los que se administró el péptido GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) fue significativamente inferior al peso del pulmón observado en los ratones a los que se administraron células de melanoma solas ("vehículo") o células de melanoma con la SEC. ID. nº: 443 del péptido de referencia CARAC ("péptido de referencia"). Estos resultados indican que GFE-1 puede inhibir la metástasis pulmonar de las células cancerosas humanas.
Se llevó a cabo un experimento similar de metástasis pulmonar utilizando la proteína de fusión glutatión S-transferasa GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) preparada como se describe en Rajotte et al., J. Clinical Invest. 102:430-437 (1998), que está incorporada en la presente memoria como referencia. La proteína de fusión glutatión S-transferasa GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) inhibió el aumento en el peso del pulmón resultante de la inyección de células de melanoma humano C8161 de manera similar a los resultados observados con la SEC. ID. nº: 1 del péptido como se muestra en la Figura 8.
Estos resultados indican que GFE-1 (SEC. ID. nº: 1) puede inhibir la metástasis pulmonar y que la MDP actúa como receptor para metastatizar células tumorales en el sistema vascular del pulmón.
Ejemplo VI Preparación de moléculas de migración a la fijación de MDP a propenoato Z-2-acilamino-3-monosustituido
Este ejemplo demuestra varios procedimientos para la preparación de las moléculas que se fijan en MDP con la Estructura 1.
A. Procedimiento para la preparación de una molécula de migración a la fijación de MDP que presenta la Estructura 1
Una molécula de direccionamiento que migra a la fijación de MDP que presenta la Estructura 1 se prepara condensando directamente el ácido 2-ceto y la amida apropiados de la manera siguiente:
3
en las que R^{2} y R^{3} son como se han definido. Las condiciones generales de la reacción implican mezclar aproximadamente 14:1 partes de ácido a amida en un disolvente inerte tal como tolueno o isovalerato de metilo y calentar a reflujo con eliminación azeotrópica de agua durante 3 a 48 horas, preferentemente de 5 a 24 horas. Cuando se ha enfriado, la solución normalmente proporciona el producto en forma cristalina. Si se desea, se aísla el producto utilizando un procedimiento de extracción de la base. Se recristaliza el producto utilizando técnicas generalmente conocidas.
Una modificación opcional de este procedimiento requiere una pequeña cantidad adicional de ácido p-toluensulfónico como catalizador durante la reacción.
B. Procedimiento para la preparación de una molécula de migración a la fijación de MDP que presenta la Estructura 1
Se prepara una molécula que migra a la fijación de MDP que presenta la Estructura 1 utilizando un éster t-butílico de \alpha-aminoácido, en la reacción con un cloruro ácido de la manera siguiente:
4
La reacción tiene lugar en presencia de una base, tal como la trietilenamina, en un disolvente tal como el cloruro de metileno. El producto N-acilado resultante se oxida a continuación por tratamiento con hipoclorito de t-butilo seguido de la adición de metóxido sódico. Esto proporciona el derivado de 2-metoxi o su producto de eliminación, el éster \alpha,\beta-insaturado. El tratamiento adicional con ácido clorhídrico anhidro convierte el derivado 2-metoxi o el éster insaturado (o la mezcla de ambos) en el ácido libre \alpha,\beta-insaturado.
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Algunos compuestos en los que R^{3} tiene un sustituyente terminal que es un derivado de amino, nitrógeno cuaternario, tiol o carboxilo pueden prepararse de la manera más conveniente a partir de un compuesto intermedio que tiene un bromo terminal. En este caso el compuesto intermedio presenta la estructura
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en la que n es el número de carbonos en la cadena hidrocarbonada deseada (p. ej., de 3 a 7).
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Con objeto de preparar R^{3} que tiene un sustituyente de trimetilamonio terminal, el compuesto intermedio de bromo se hace reaccionar con trimetilamina; para proporcionar el amino, el compuesto intermedio de bromo se hace reaccionar con amoniaco; la reacción de guanidino es con guanidina; para preparar los derivados tio, incluyendo el 2-amino-2-carboxietiltio, el compuesto de bromo se hace reaccionar con cisteína HCl o el mercaptano apropiado. El amino derivado, tal como formamidino, ureido y acilamida (acetamido) se preparan a partir de los compuestos que tienen un grupo amino haciéndolos reaccionar con formimidato de o-bencilo HCl, cianato potásico y el anhídrido de acilo apropiado (anhídrido acético) respectivamente.
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C. Procedimiento para la preparación de una molécula de migración a la fijación de MDP que presenta la Estructura 1
Otra vía para preparar compuestos cuando R^{3} es un derivado tio sustituido en el terminal utiliza un compuesto intermedio de éster cloroceto de la forma siguiente:
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en la reacción con la amida deseada,
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en tolueno a reflujo en presencia de una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico. El compuesto intermedio resultante se hidroliza al ácido; el grupo cloro es desplazado a continuación en la reacción con el mercaptano apropiado. Esta reacción es valiosa ya que permite la utilización de una amida quiral, preparando de este modo una cadena lateral funcionalizada. Alternativamente, la mezcla de los isómeros Z+E preparada después de la condensación del mercaptano se isomeriza directamente en la forma Z añadiendo ácido a un pH de aproximadamente 3 y calentando a aproximadamente 90ºC durante 30 minutos. Solamente la forma Z permanece y la recuperación es sencilla y directa.
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D. Preparación de la sal sódica del ácido Z-7-(L-amino-2-carboxietiltio)-2-(2,2-dimetilciclopropano carboxamido)-2-heptanoico 1. Preparación de Grignard del etil-7-cloro-2-oxoheptanoato
Se hacen reaccionar cantidades equimolares (de 8 moles cada una) de I-bromo-5-cloropentano y magnesio en tetrahidrofurano (THF) (960 ml) a 25ºC. El matraz se carga con magnesio en THF y se añade bromocloropentano durante 1 hora, a continuación se envejece 2 horas. Una vez se interpreta que la reacción se ha terminado, se añade la solución de reacción (enfriada a -15ºC) a 16 moles de dietiloxalato en 1856 ml de THF, mientras se mantiene la temperatura a 10 grados C. Se añade HCl 3 N para enfriar, manteniendo la temperatura inferior a 25ºC. Después del arrastre de los disolventes, el rendimiento calculado es del 48,8% de etil-1-cloro-6-oxoheptanoato.
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2. Condensación e hidrólisis
Se cargan en un matraz de 22 l carboxamida de S-2,2-dimetilciopropilo (1017 g), 2143,6 g de etil-7-cloro-2-cetoheptanoato, 9 litros de tolueno y 12 g de ácido p-toluensulfónico y se calientan a reflujo en agitación. Después de 23 horas, la cromatografía líquida presenta la relación esperada del producto, y se eliminan 4 l de tolueno a presión ligeramente reducida. El recipiente se carga con agua, se neutraliza a pH 7 con NaOH 2 N y se destila al vacío dejando un volumen final en el recipiente de aproximadamente 5 litros. Esto se hidroliza añadiendo 1.760 g de NaOH acuoso al 50% (4 litros de agua) y se agita durante la noche. Se carga el matraz con 4 l de cloruro de metileno y se ajusta el pH a 8,8 utilizando HCl. La amida sin reaccionar cristaliza. Se separan las capas orgánicas del agua y a continuación se evaporan. El residuo gomoso se disuelve en 8 l de agua que contiene 720 g de NaOH al 50% y a esta solución se cargan 1818 g de L-cisteína HCl, H_{2}O, 2 kg de hielo, 2484 g de NaOH al 50% y 1 l de agua. El pH de esta solución, después de envejecer durante la noche a temperatura ambiente, se ajusta a 3,0 con HCl concentrado y la suspensión gomosa resultante se calienta a 95ºC para proporcionar una solución transparente. Después de 30 minutos, el isómero E no es detectado por 1c. Después de la absorción y purificación, el rendimiento global es de 2.060 g, rendimiento del 87%. Este material se recristaliza en acetonitrilo. Se disuelven 1.500 g del material recristalizado en 6 l de agua y 910 ml de NaOH 3,88 N, a continuación se neutraliza a pH 7 y se liofiliza para proporcionar 1.569 g (98,6%) del compuesto del título. Análisis: Calc.: C, 50,52; H, 6,62; N, 7,36; S, 8,43; Na, 6,04. Obtenido: C, 50,71; H, 6,78; N, 7,49; S, 8,52; Na, 5,92.
Todos los artículos de revistas, referencias y citas de patentes proporcionadas anteriormente, entre paréntesis o de otro modo, sean o no mencionados anteriormente, están incorporados a la presente memoria como referencia.
Aunque la invención se ha descrito haciendo referencia a los ejemplos proporcionados anteriormente, debería apreciarse que pueden introducirse varias modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Por consiguiente, la invención está únicamente limitada por las reivindicaciones.
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TABLA 2 (continuación)
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<110> The Burnham Institute
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<120> Moléculas que migran a diversos órganos o tejidos seleccionados
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<130> FP-LJ 3406
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<140> PCT/US99/05284
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<141> 1999-03-10
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<150> 09/042,107
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<151> 1998-03-13
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<150> 09/258,754
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<151> 1999-02-26
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<160> 452
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<400> 2
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23 
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<210> 3
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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24 
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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26 
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<400> 6
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<210> 8
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dudosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dudosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dudosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dudosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dudosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dudosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N es igual a las mezclas molares de A, C, G y T; K es igual a las mezclas molares de G y T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtnnknnkn nknnknnknn ktgt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\hskip1cm
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\hskip1cm
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<220>
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<223> Dudosa
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<211> 9
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<211> 9
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\hskip1cm
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\hskip1cm
352 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<220>
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<221> SITIO
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<222> (2)
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<223> Tirosina o fenialanina
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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419 
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<211> 7
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 430
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\hskip1cm
445 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 431
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 431
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 432
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1 a 10 aminoácidos independientemente seleccionados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 0 a 10 aminoácidos independientemente seleccionados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 432
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
446 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1 a 10 aminoácidos independientemente seleccionados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 433
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
447 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 434
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 434
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 435
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\hskip1cm
448 
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<210> 436
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<400> 436
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000 
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<210> 437
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<400> 437
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449 
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<210> 438
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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450 
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<400> 439
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451 
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<400> 440
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452 
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<210> 441
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<400> 441
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453 
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<210> 442
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<400> 442
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454 
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<210> 443
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<400> 443
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455 
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<210> 444
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Rattus sp.
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<400> 444
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456 
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<210> 445
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Rattus sp.
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<400> 445
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457 
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<210> 446
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Nucleótido sintético
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<400> 446
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccgctggtac cgcagatccc tggggacctt g 
\hfill
31 
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<210> 447
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Nucleótido sintético
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<400> 447
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tctttctaga gctcagagag cactggagga g 
\hfill
31 
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<210> 448
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<211> 411
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 448
458
459
460 
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<210> 449
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<211> 409
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<212> PRT
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<213> Sus scrofa 
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<400> 449
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461
462
463 
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<210> 450
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<211> 410
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<212> PRT
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<213> Rattus sp.
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465
466 
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<210> 451
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<211> 410
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 451
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467
468 
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<210> 452
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<211> 410
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<212> PRT
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<213> Oryctolagus cuniculus 
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469
470

Claims (15)

1. Péptido aislado, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SMSIARL (SEC. ID. nº: 21), VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22) y RGRWLAL (SEC. ID. nº: 279),
en el que dicho péptido migra selectivamente al sistema vascular de la próstata.
2. Péptido aislado según la reivindicación 1, que presenta como máximo 100 restos.
3. Péptido aislado según la reivindicación 2, que presenta como máximo 50 restos.
4. Péptido aislado según la reivindicación 3, que presenta de 20 a 50 restos.
5. Péptido aislado según la reivindicación 3, que presenta de 7 a 13 restos.
6. Péptido aislado según la reivindicación 1, que es cíclico.
7. Péptido aislado según la reivindicación 1, constituido por la secuencia SMSIARL (SEC. ID. nº: 21), VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22) o RGRWLAL (SEC. ID. nº: 279).
8. Peptidomimético aislado, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SMSIARL (SEC. ID. nº: 21), VSFLEYR (SEC. ID. nº: 22) y RGRWLAL (SEC. ID. nº: 279),
en el que dicho peptidomimético migra selectivamente al sistema vascular de la próstata.
9. Conjugado, que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
en el que dicho péptido está ligado a un resto.
10. Conjugado, que comprende un peptidomimético según la reivindicación 8,
en el que dicho peptidomimético está ligado a un resto.
11. Conjugado según la reivindicación 9 ó 10, en el que dicho resto es un agente terapéutico.
12. Conjugado según la reivindicación 9 ó 10, en el que dicho resto es un agente detectable.
13. Procedimiento in vitro de identificación del tejido de la próstata, que comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto un tejido u órgano aislado con un péptido aislado según la reivindicación 1; y
b) detectar la unión de dicho péptido a dicho órgano o tejido, identificando así el órgano o tejido como tejido de la próstata.
14. Procedimiento de identificación de una molécula de migración expresada por la próstata, que comprende el procedimiento según la reivindicación 13, que comprende además las etapas siguientes:
c) proporcionar una muestra de dicha próstata; y
d) identificar la molécula de migración, que está unida por dicho péptido.
15. Utilización del conjugado según la reivindicación 9 ó 10, para la preparación de un medicamento destinado a tratar una patología de la próstata en un sujeto.
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