ES2313383T3

ES2313383T3 - Composiciones de trombina.

Info

Publication number: ES2313383T3
Application number: ES05766031T
Authority: ES
Inventors: Shan Jiang; Richard I. Senderoff; Jeffrey D. Meyer
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2004-06-22
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2025-06-21
Also published as: IL179852A0; US20060002918A1; CA2570478A1; ES2395466T3; JP2008503240A; US7473543B2; EP1766003A1; US7393674B2; US20070104705A1; AU2009238369B2; ATE405643T1; AU2005265251B2; CA2570478C; WO2006009989A1; DK1766003T3; EP1766003B1; JP4767253B2; DE602005009191D1; AU2005265251A1; AU2009238369A1

Abstract

Una composición que consiste esencialmente en: trombina, sacarosa, manitol, NaCl, CaCl2, un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular, y un tampón fisiológicamente aceptable, en solución acuosa a pH 5,7-7,4, en la que la concentración de trombina es 0,1 mg/ml hasta 5,0 mg/ml; la concentración de sacarosa es 2% hasta 4% (p/v); la concentración de manitol es 3,5% hasta 5% (p/v); la concentración de NaCl es 50 mM hasta 300 mM; la concentración de CaCl2 es 0-5 mM; la concentración de tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular es 0,03% hasta 1% (p/v); en la que la concentración de tampón se selecciona para dar pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un escenario quirúrgico y en la que la relación de manitol:sacarosa es mayor que 1:1 pero no mayor que 2,5:1 (p/p).

Description

Composiciones de trombina.

Antecedentes de la invención

La formulación de proteínas farmacéuticas presenta retos significativos. Las proteínas poseen múltiples grupos funcionales además de estructura tridimensional; la degradación, por lo tanto, procede vía caminos tanto químicos (modificaciones que implican formación o rotura de enlaces) como físicos (desnaturalización, agregación, adsorción, precipitación). Puesto que cada proteína encarna una combinación única de secuencia de aminoácidos, punto isoeléctrico y otros determinantes, su respuesta a cambios en condiciones de solución es impredecible y debe ser determinada en una base de caso a caso. Los intentos para impedir una forma de degradación a menudo aumentan la velocidad de otra.

La degradación de proteínas se puede reducir o evitar en gran medida mediante liofilización. No obstante, la liofilización consume mucho tiempo y es costosa y puede producir la desnaturalización y agregación de la proteína si no se incluyen los ingredientes apropiados. Como con la formulación en solución, la estabilización de proteínas liofilizadas debe ser tratada sobre una base individual.

En el caso de la trombina, se puede usar cloruro sódico para mantener la estabilidad durante la purificación y el almacenamiento reduciendo la agregación y precipitación. No obstante, el cloruro sódico es un excipiente problemático en formulaciones liofilizadas porque reduce la temperatura de transición vítrea, necesitando por ello temperaturas primarias bajas y tiempos de ciclo largos. Además, la combina debe ser protegida de desdoblamiento y agregación dentro de la composición liofilizada.

La formulación ideal combinará estabilidad durante la liofilización, así como almacenamiento a largo plazo y transporte con facilidad de manejo y uso.

El documento US-A-4923815 describe una composición de trombina seca estable que comprende sacáridos. Entre los sacáridos implicados se mencionan sacarosa y manitol.

Descripción de la invención

Dentro de un aspecto de la invención se crea una composición que consiste esencialmente en 0,1 mg/ml hasta 5,0 mg/ml de trombina, 2% hasta 4% (p/v) de sacarosa, 3,5% hasta 5% (p/v) de manitol, NaCl 50 mM hasta 300 mM, CaCl_{2} 0-5 mM, 0,03% hasta 1% (p/v) de un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular y un tampón fisiológicamente aceptable, en solución acuosa a pH 5,7-7,4, en la que la concentración del tampón se selecciona para dar aproximadamente pH fisiológico tras la aplicación de la composición en un escenario quirúrgico y en la que la relación de manitol:sacarosa es mayor que 1:1 pero no mayor que 2,5:1 (p/p). Dentro de una relación de la invención, la relación de manitol a sacarosa es 1,33:1 (p/p). Dentro de otras realizaciones de la invención, la relación molar de sacarosa:trombina es al menos 700:1 o al menos 2000:1. Dentro de otras realizaciones de la invención, la trombina es trombina humana, incluyendo, por ejemplo, trombina humana recombinante. Dentro de aún otras realizaciones de la invención, la concentración de trombina es 0,5-3,0 mg/ml o la concentración de trombina es 1 mg/ml. Dentro de otras realizaciones de la invención, la concentración de sacarosa es 3% (p/v) y/o la concentración de manitol es 4% (p/v). Dentro de otra realización, el tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular es PEG 3350. Dentro de una realización relacionada, el tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular es PEG 3350 a una concentración de 0,1% (p/v). Dentro de realizaciones adicionales, el pH de la composición es 6,0. Dentro de otras realizaciones, el tampón se selecciona del grupo que consiste en tampones de histidina, citrato, fosfato, Tris, y succinato. Dentro de realizaciones relacionadas, el tampón es tampón de histidina, tal como tampón de histidina 2,0-10 mM o tampón de histidina 5 mM. Una composición tal de la presente invención consiste esencialmente en 0,1 mg/ml hasta 5,0 mg/ml de trombina, 2% hasta 4% (p/v) de sacarosa, 3,5% hasta 5% (p/v) de manitol, NaCl 100 mM hasta 200 mM, CaCl_{2} 1 mM hasta 5 mM, 0,03% hasta 1% (p/v) de PEG 3350, e histidina 2 mM hasta 10 mM en solución acuosa a pH 5,5-6,5, en la que la relación de manitol:sacarosa es mayor que 1:1 pero no mayor que 2,5:1 (p/p). Una segunda composición tal de la invención consiste esencialmente en 1 mg/ml de trombina, 3% (p/v) de sacarosa, 4% (p/v) de manitol, CaCl_{2} 4 mM, 0,1% (p/v) de PEG 3350, NaCl 150 mM e histidina 5 mM en solución acuosa a pH 6,0.

Dentro de un segundo aspecto de la invención, se crea un método para preparar una composición de trombina liofilizada que comprende (a) crear una composición acuosa que contiene trombina como la descrita anteriormente, y (b) liofilizar la composición acuosa para formar una composición de trombina liofilizada.

Dentro de un tercer aspecto de la invención, se crea una composición de trombina liofilizada preparada por el método descrito anteriormente. Dentro de una realización de la invención, la composición liofilizada está contenida en un recipiente sellado que tiene una etiqueta fijada en una superficie exterior del mismo. Dentro de una realización adicional de la invención, la composición en el recipiente sellado contiene desde 2.500 hasta 20.000 unidades NIH de trombina. Dentro de una realización relacionada de la invención, la composición se crea en forma de un kit que comprende un recipiente sellado como el descrito anteriormente y un segundo recipiente sellado que contiene un diluyente tal como, por ejemplo, solución salina normal.

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Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y los dibujos adjuntos. En los dibujos:

La Fig. 1 ilustra el análisis de muestras pre- y post-liofilización de ciertas formulaciones de trombina mediante dispersión de luz en ángulo recto (RALS, por sus siglas en inglés).

La Fig. 2 ilustra el análisis de ciertas formulaciones de trombina mediante RALS después de almacenamiento durante trece semanas.

La Fig. 3 ilustra el análisis de ciertas formulaciones de trombina mediante RALS después de almacenamiento durante seis semanas.

La Fig. 4 ilustra el análisis de la estructura secundaria de trombina por espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier usando cuatro formulaciones de trombina humana recombinante (etiquetadas A, B, C y D).

La Fig. 5 ilustra el análisis de la estructura secundaria de trombina por espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier usando cinco formulaciones de trombina humana recombinante (etiquetadas T, A, B, C y D).

Los intervalos numéricos (p. ej., "desde X hasta Y") incluyen los puntos extremos, a menos que se indique de otra forma.

La presente invención crea composiciones de trombina estabilizadas, incluyendo composiciones liofilizadas. Como se usa en esta memoria descriptiva, "trombina" indica la enzima activada, también conocida como \alpha-trombina, que resulta de la rotura proteolítica de la protrombina (factor II). Como se describe más adelante, la trombina se puede preparar mediante varios métodos conocidos en la técnica, y el término "trombina" no está destinado a implicar un método particular de producción. La trombina humana es una proteína de aminoácido 295 compuesta de dos cadenas de polipéptido unidas por un enlace disulfuro. Tanto las trombinas humanas como las no humanas se pueden usar dentro de la presente invención. La trombina se usa médicamente como un agente hemostático y como un componente de adhesivos de tejidos.

Las trombinas humanas y no humanas (p. ej. bovina) se preparan según métodos conocidos en la técnica. La purificación de trombina a partir de plasma está descrita por, por ejemplo, Bui-Khac et al., patente de Estados Unidos nº 5.981.254. La purificación de trombina a partir de fracciones de plasma, tal como la fracción III de Cohn, está descrita por Fenton et al., J. Biol. Chem. 252:3587-3598, 1977. La trombina recombinante se puede preparar a partir de un precursor de pretrombina por activación con un activador de veneno de serpiente como se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.476.777. Los activadores de veneno apropiados incluyen ecarina y activador de protrombina de Oxyuranus scutellatus.

Dentro de la presente invención, la trombina se formula en una solución acuosa débilmente tamponada que contiene sacarosa, manitol, cloruro sódico, un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular (PEG-APM) y, opcionalmente, cloruro cálcico. Los intervalos de concentración de estos componentes se muestran en la tabla 1. Las concentraciones expresadas como porcentaje son en base de peso a volumen.

TABLA 1

1

La concentración de trombina dentro de la formulación de la presente invención se puede variar dependiendo del uso pretendido, incluyendo la concentración deseada del producto reconstituido. La trombina se incluye en la formulación a una concentración de 0,01-5,0 mg/ml, más comúnmente 0,1-5,0 mg/ml, y típicamente 0,5-3,0 mg/ml. Dentro de ciertas realizaciones de la invención, la concentración de trombina es 1,0 mg/ml.

Los inventores han encontrado que la relación de manitol a sacarosa afecta significativamente al desdoblamiento de la proteína durante la liofilización. El manitol se incluye como un agente de volumen, para mejorar la eficiencia del ciclo de liofilización y el aspecto del producto liofilizado. La sacarosa se incluye como estabilizador (lioprotector), reduciendo el desdoblamiento de la trombina durante la liofilización y tras el almacenamiento. Las formulaciones que tenían una relación de manitol:sacarosa de 5:1 (p/p) o mayor eran inaceptables; aquellas que tenían una relación de 2,5:1 o menor parecían estables al analizarse por espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en inglés). Las relaciones de 1:1 o menor mostraron agregación/precipitación en solución (tras la reconstitución) medida por dispersión de la luz en ángulo recto (RALS) y no formaron una torta aceptable tras la liofilización. Por lo tanto, dentro de la presente

\hbox{invención, la relación de
manitol:sacarosa  será mayor que 1:1 pero no mayor que
2,5:1.}

El NaCl se incluye en la formulación para reducir la agregación y/o precipitación. Como se indica anteriormente, el NaCl puede ser problemático en el proceso de liofilización. Dentro de la formulación de la presente invención, el NaCl se incluye a una concentración de 50 mM hasta 300 mM. Dentro de ciertas realizaciones de la invención, la concentración de NaCl es 75 mM hasta 250 mM, 100 mM hasta 200 mM o 150 mM.

La formulación de trombina de la presente invención está tamponada para proporcionar estabilidad durante la formulación y para optimizar la actividad tras la reconstitución. Aunque no se desea estar ligado por la teoría, se cree que la degradación autolítica de la trombina aumenta a medida que aumenta el pH por encima de 6,0, y la velocidad de precipitación aumenta a medida que disminuye el pH por debajo de 6,0. Es, por lo tanto, deseable preparar trombina a pH ligeramente ácido hasta aproximadamente neutro para limitar la pérdida de actividad debida a autolisis (formación de productos de degradación autolítica inactivos incluyendo \beta- y \gamma-trombina). No obstante, para proporcionar actividad biológica óptima tras el uso, se desea pH aproximadamente fisiológico. La presente invención aborda estas necesidades conflictivas mediante el uso de un tampón débil que es eficaz a pH ligeramente ácido hasta aproximadamente neutro (es decir, pH 5,7-7,4), pero permitirá que el pH alcance el pH aproximadamente fisiológico (es decir, pH 6,8-7,5, preferentemente pH 7,0-7,5, más preferentemente pH 7,35-7,45) cuando la trombina se aplique a tejido sangrante en un escenario quirúrgico. Dentro de la presente invención, la solución de trombina está tamponada a pH 5,7-7,4, comúnmente 6,0-6,5 y, dentro de ciertas realizaciones, 6,0. Los tampones apropiados incluyen, además de histidina, otros tampones fisiológicamente aceptables que son eficaces dentro del intervalo de pH indicado y permitirán que la solución alcance el pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un escenario quirúrgico. Ejemplos de tales tampones incluyen fosfato, citrato, Tris (2-amino-2-hidroximetil)-1,3-propanodiol) y succinato. Dentro de ciertas realizaciones de la invención, el tampón de histidina se incluye a 1-20 mM, 2-10 mM o 5 mM.

Concentraciones apropiadas de otros tampones dentro de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica. Los tampones de la formulación se pueden ensayar añadiendo sangre y midiendo el pH de la solución resultante. En un ensayo ejemplar, se añaden partes alícuotas de sangre de conejo gradualmente a varios tampones y se mide el pH después de cada adición. Cuando se prueban tampones de histidina en tal ensayo, se neutraliza histidina 3,2 mM, 5 mM, 12,8 mM y 20 mM por la adición de no más de 1,0 volumen de sangre. En contraste, tampón de succinato 160 mM y tampón de fosfato 90 mM/histidina 12,8 mM no produjeron una mezcla con un pH por encima de 7,0, incluso después de la adición de 2-3 volúmenes de sangre.

Dentro de la presente invención, se incluye un tensioactivo o polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular para impedir las pérdidas adsortivas y la agregación/precipitación de la trombina inducida por cizallamiento en solución antes de la liofilización o después de la reconstitución del producto liofilizado. Tensioactivos apropiados útiles a este respecto incluyen poli(óxidos de etileno), ésteres de sorbitán, éteres de alquilo y polioxietileno, glicéricos de ácidos grasos (p. ej., monooleato de glicerilo y monoestearato de glicerilo), ésteres de ácido graso de sorbitán y polioxietileno (p. ej., polisorbato 20 (monolaurato de sorbitán y polioxietileno) y polisorbato 80 (monooleato de sorbitán y polioxietileno)), y los similares. Los polietilenglicoles de alto peso molecular incluyen aquellos que tienen pesos moleculares desde 400 hasta 8000, tales como PEG 400, PEG 1000, PEG 3350, PEG 5000 y PEG 8000. Un polietilenglicol de alto peso molecular ejemplar es PEG 3350. La concentración preferida de PEG 3350 es 0,1-1%. Aunque el PEG 3350 al 0,03% inhibe eficazmente pérdidas adsortivas y agregación/precipitación inducida por cizallamiento, se usarán comúnmente concentraciones algo mayores en la formulación inicial para responder de la dilución después de la reconstitución. Por ejemplo, una dosis unitaria típica de trombina se puede preparar llenando un vial con 1,6 ml de una solución de 1,0 mg/ml (3200 U/mg) (alrededor de 5000 U NIH/vial) y liofilizando. El producto liofilizado, cuando se reconstituye con 5 ml de solución salina normal, proporciona una concentración de trombina de alrededor de 1000 U NIH/ml (0,32 mg/ml). Si la concentración de PEG 3350 en la formulación inicial es 0,1%, la concentración en el producto reconstituido será 0,03%.

Dentro de ciertas realizaciones de la invención se incluye CaCl_{2} en la formulación para fomentar la hemostasia, ya que se requiere para activar varios factores de coagulación de la sangre (p. ej., Factor IX, Factor X). Cuando se incluye, la concentración de CaCl_{2} en la formulación es hasta 5 mM, generalmente 1-5 mM, comúnmente 4 mM. La inclusión de cloruro cálcico también puede mejorar la estabilidad física de la trombina.

Para almacenamiento a largo plazo, la solución acuosa se divide en partes alícuotas en viales estériles, ampollas, u otros recipientes y se liofiliza según los procedimientos conocidos en la técnica. El producto liofilizado aparece como un polvo o torta, siendo una torta la forma preferida. Después, se sellan los recipientes. Se prefiere usar un sello que permita la posterior inyección de diluyente a través del sello y dentro del recipiente. El recipiente se etiqueta según la práctica estándar en el ámbito farmacéutico.

En una realización de la invención, el recipiente se suministra en un kit con un segundo recipiente que contiene un diluyente. Diluyentes apropiados incluyen solución salina normal para inyección y agua para inyección. El kit puede incluir además un dispositivo de aplicación, tal como un pulverizador, jeringa o similar.

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Para el uso, la composición de trombina liofilizada se reconstituye con un diluyente apropiado hasta la concentración deseada, generalmente desde alrededor de 100 U NIH/ml hasta alrededor de 5.000 U NIH/ml, típicamente alrededor de 1.000 U NIH/ml, aunque la concentración real será determinada por el médico según las necesidades del paciente individual. La trombina se puede aplicar a tejido sangrante para conseguir la hemostasia, a menudo en combinación con una esponja de gelatina absorbible. La trombina también se puede usar como un componente de un adhesivo de tejido o cola de fibrina. Estos y otros usos de la trombina son conocidos en la técnica.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Se formuló trombina humana recombinante (trombina hr, rhThrombin, por sus siglas en inglés) a 1 mg/ml en histidina 5 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 4 mM, PEG 33550 al 0,1%, pH 6,0, con concentraciones variables de manitol y sacarosa como se muestra en la tabla 2.

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TABLA 2

2

Se colocaron partes alícuotas de 1,6 ml de las soluciones en viales y se liofilizaron bajo las condiciones mostradas en la tabla 3. Para el análisis subsiguiente, las muestras liofilizadas se reconstituyeron con agua cuando fue necesario. Las observaciones visuales de las muestras liofilizadas y reconstituidas se muestran en la tabla 4.

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TABLA 3

3

TABLA 4

4

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Ejemplo 2

Las formulaciones A, B, C, D, E y F de trombina hr se analizaron para determinar la presencia de agregados/precipitantes en la solución. Se analizaron muestras pre- y post-liofilización por dispersión de la luz en ángulo recto (RALS) usando un espectrofluorometro (QUANTAMASTER QM4, Photon Technology International, Inc., Lawrenceville, NJ). Las longitudes de onda de excitación y emisión se fijaron ambas a 320 nm. Se cargaron las muestras en un vial de cuarzo de 1 cm de longitud de paso. Se ajustaron las anchuras de la ranura a 2 nm y se recogieron las señales a 1 punto/s durante 60 segundos. La corriente aplicada fue de 75 vatios. Los valores presentados (véase la Fig. 1) fueron los recuentos promedio registrados en 60 segundos. En la formulación A se encontró dispersión de luz significativa consistente con agregación/precipitación tras la reconstitución. Las formulaciones E y F no produjeron una torta aceptable tras la liofilización.

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Ejemplo 3

La recuperación de trombina hr después de la liofilización se midió usando cromatografía de fase inversa (RP-HPLC). Se usó cromatografía de exclusión molecular (SE-HPLC) para determinar el porcentaje de agregado soluble en las muestras de ensayo. Las formulaciones A, B, C, D, E y F se analizaron antes de la liofilización y después de la liofilización y reconstitución.

Para RP-HPLC, las muestras de ensayo y el patrón de referencia (trombina hr, 1 mg/ml en tampón de dilución (fosfato sódico 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,0)) se filtraron usando unidades de filtro centrífugo (0,22 \mum) (SPIN-X; Corning Life Sciences, Action, Mass.) a 14.000 rpm (20.800 FCR). Se empleó un intervalo de curva estándar desde 5 hasta 40 \mug con muestras inyectadas a aproximadamente 90% del límite superior de cuantificación. Se determinaron los valores de pureza basados en el área del pico principal con relación al área de picos integrada total. El análisis se llevó a cabo usando un sistema de HPLC (1100 Series; Agilent Technologies, Palo Alto, California) configurado
con:

\bullet: Bomba binaria con kit de lavado de cierre (G1312A).

\bullet: Desgasificador de disolvente de cuatro canales (G1322A).

\bullet: Automuestreador termostatado (G1329A/G1330A).

\bullet: Kit de concentración de volumen extendido utilizando una jeringa de 900 \mul (G1363A).

\bullet: Compartimiento de columna termostatado con dos intercambiadores de calor (G1316A).

\bullet: Kit de mejora del cambio de columna (G1353A).

\bullet: Detector de haz de diodos (G1315B) con celda de 10 mm/13 \mul de flujo.

\bullet: Software Agilent CHEMSTATION (Revisión A.08.03).

Para SE-HPLC, se filtraron las muestras de ensayo y el patrón de referencia usando unidades de filtro centrífugo (0,22 \mum) a 14.000 rpm (20.800 FCR). Se utilizó un intervalo de curva estándar desde 5,1 hasta 102 \mug, con muestras inyectadas a aproximadamente 90% del límite superior de cuantificación. Se determinó el porcentaje de agregados basado en el área de los picos detectados que preceden al pico de trombina hr principal con relación al área de picos integrada total. El análisis se llevó a cabo usando un sistema de HPLC como el descrito anterior-
mente.

Estos análisis mostraron un incremento en la recuperación de trombina hr después de la liofilización con contenido creciente de sacarosa (\geq 3%) como se muestra en las tablas 5 y 6. Los datos se presentan como concentración de trombina hr (mg/ml). La observación de que incrementos en el agregado soluble no se correlacionaban necesariamente con menor recuperación es consistente con la formación de agregado de trombina hr insoluble durante la
liofilización.

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TABLA 5 RP-HPLC

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5

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TABLA 6 % de agregado soluble por SE-HPLC

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6

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Ejemplo 4

Se estudió la estabilidad al almacenamiento de formulaciones de trombina hr en un periodo de 6 meses. Muestras liofilizadas de las formulaciones A, B, C, D, E y F se almacenaron a 40ºC y a 25ºC y se analizaron para determinar el contenido (concentración de trombina) por RP-HPLC a 0, 1, 2, 3 y 6 meses como se describe anteriormente. A ambas temperaturas, la formulación A, tras la reconstitución, se volvió turbia después de dos meses (tabla 7). Las formulaciones E y F produjeron tortas inaceptables y no se analizaron después del punto de tiempo del mes 0. La estabilidad, expresada como % de recuperación, se muestra en las tablas 8 y 9.

TABLA 7

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7

TABLA 8 % de recuperación de trombina durante el almacenamiento a 40ºC

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8

\quad: n.e. = no ensayado

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TABLA 9 % de recuperación de trombina durante el almacenamiento a 25ºC

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9

: n.e. = no ensayado

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Ejemplo 5

Muestras liofilizadas de las formulaciones A, B, C, D, E y F se almacenaron a 40ºC y a 25ºC y se analizaron a 0, 1, 2, 3 y 6 meses para determinar la presencia de impurezas de alto peso molecular (agregado soluble) por SE-HPLC como se describe anteriormente. Los resultados, mostrados en la tabla 10, indicaron que en la formulación T (que contiene la menor cantidad de sacarosa) se detectaron aumentos en agregado soluble después de una semana. No obstante, en las formulaciones que contenían 1% o más de sacarosa no se encontraron aumentos significativos después de seis meses. Las formulaciones E y F produjeron tortas inaceptables y no se analizaron después del punto de tiempo del mes 0.

TABLA 10 % de agregados; almacenamiento a 40ºC

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10

\quad: n.e. = no ensayado

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TABLA 11 % de agregados; almacenamiento a 25ºC

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Ejemplo 6

Muestras liofilizadas de las formulaciones A, B, C y D se almacenaron durante trece semanas y seis meses a
-20ºC, 5ºC, 25ºC y 40ºC, después se analizaron por RALS como se describe en el ejemplo 2 anterior. Los aumentos en la dispersión de la luz medidos por RALS se asociaron con la presencia de agregados insolubles y/o solubles. Los resultados, mostrados en las tablas 12 y 13 (como recuentos por segundo), y presentados gráficamente en las Figs. 2 y 3, indicaron que las formulaciones B, C y D eran más estables que la formulación A con respecto a la agregación durante el almacenamiento bajo todas las condiciones de ensayo. Debido a variaciones instrumentales menores entre los puntos de tiempo de 13 semanas y 6 meses, los números absolutos de los dos puntos de tiempo no deberían comparase; los datos de RALS deberían compararse sólo entre las formulaciones ensayadas al mismo
tiempo.

TABLA 12 13 semanas

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12

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TABLA 13 6 meses

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13

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Ejemplo 7

Muestras liofilizadas de las formulaciones A, B, C y D se analizaron por espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) para comparar la estructura secundaria de la trombina hr en estado liofilizado. Los espectros de infrarrojos se obtuvieron con un espectrómetro de FTIR (FTLA2000-104, ABB Inc., Norwalk, Conn.). Las muestras liofilizadas se mezclaron con bromuro potásico (KBr) (relación aproximada 1:100 de trombina hr:KBr) y se prensaron para formar pelets. Los espectros se recogieron en modo de transmisión de haz único. Para reducir las interferencias de los excipientes y el vapor de agua, se restaron los espectros del placebo y del vapor de agua de los espectros de la proteína usando el software analítico (BOMEN-GRAMS/32 AI (Versión 6.01); ABB Inc.). Los espectros de segunda derivada se crearon usando la función de Savitzky-Golay de segundo grado. Las formulaciones de trombina hr se compararon en la región I de amida (1700-1600 cm^{-1}). Como se muestra en la Fig. 4, se obtuvieron espectros similares para las formulaciones B, C y D, dando la formulación A un espectro diferente.

Después, se ensayaron por FTIR tres duplicados de la formulación A como se describe anteriormente. Los espectros resultantes fueron esencialmente idénticos.

Después se compararon las formulaciones A, B, C y D con una formulación que contenía 5% de manitol y 0,5% de sacarosa (formulación T). El FTIR se llevó a cabo como se describe anteriormente. Como se muestra en la Fig. 5, las formulaciones B, C y D dieron espectros similares, mientras que los espectros de las formulaciones que contenían 5% de manitol y o 1% de sacarosa o 0,5% de sacarosa indicaron espectros diferentes. Los aumentos en RALS observados después de la liofilización cuando las formulaciones que contienen \leq 1% de sacarosa se comparan con las que contienen \geq 2% de sacarosa son consistentes con estos hallazgos (ejemplo 6). Estos datos sugieren que la trombina está parcialmente desdoblada en formulaciones que contienen \leq 1% de sacarosa (que conducen a insolubles aumentados tras la reconstitución), mientras que la estructura secundaria de la trombina está estabilizada en presencia de \geq 2% de sacarosa durante la liofilización.

Claims

1. Una composición que consiste esencialmente en:

trombina, sacarosa, manitol, NaCl, CaCl_{2}, un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular, y un tampón fisiológicamente aceptable, en solución acuosa a pH 5,7-7,4,

en la que la concentración de trombina es 0,1 mg/ml hasta 5,0 mg/ml;

la concentración de sacarosa es 2% hasta 4% (p/v);

la concentración de manitol es 3,5% hasta 5% (p/v);

la concentración de NaCl es 50 mM hasta 300 mM;

la concentración de CaCl_{2} es 0-5 mM;

la concentración de tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular es 0,03% hasta 1% (p/v);

en la que la concentración de tampón se selecciona para dar pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un escenario quirúrgico y en la que la relación de manitol:sacarosa es mayor que 1:1 pero no mayor que 2,5:1 (p/p).

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la relación de manitol a sacarosa es 1,33:1 (p/p).

3. La composición de la reivindicación 1, en la que la relación molar de sacarosa:trombina es al menos 700:1.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que la relación molar de sacarosa:trombina es al menos 2000:1.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que la trombina es trombina humana.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que la trombina es trombina humana recombinante.

7. La composición de la reivindicación 1, en la que la concentración de trombina es 0,5-3,0 mg/ml.

8. La composición de la reivindicación 1, en la que la concentración de trombina es 1 mg/ml.

9. La composición de la reivindicación 1, en la que la concentración de sacarosa es 3% (p/v).

10. La composición de la reivindicación 1, en la que la concentración de manitol es 4% (p/v).

11. La composición de la reivindicación 1, en la que la concentración de sacarosa es 3% (p/v) y la concentración de manitol es 4% (p/v).

12. La composición de la reivindicación 1, en la que el tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular es PEG 3350.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que la concentración de PEG 3350 es 0,1% (p/v).

14. La composición de la reivindicación 1, en la que el pH es 6,0.

15. La composición de la reivindicación 1, en la que el tampón se selecciona del grupo que consiste en tampones de histidina, citrato, fosfato, Tris y succinato.

16. La composición de la reivindicación 1, en la que el tampón es tampón de histidina.

17. La composición de la reivindicación 16, en la que la concentración de tampón de histidina es 2,0-10 mM.

18. La composición de la reivindicación 1, en la que el tampón es histidina 5 mM de pH 6,0.

19. Una composición que consiste esencialmente en:

trombina, sacarosa, manitol, NaCl, CaCl_{2}, PEG 3350, e histidina, en solución acuosa a pH 5,5-6,5,

en la que la concentración de trombina es 0,1 mg/ml hasta 5,0 mg/ml;

la concentración de sacarosa es 2% hasta 4% (p/v);

la concentración de manitol es 3,5% hasta 5% (p/v);

la concentración de NaCl es 100 mM hasta 200 mM;

la concentración de CaCl_{2} es 1 mM hasta 5 mM;

la concentración de PEG 3350 es 0,03% hasta 1% (p/v);

la concentración de histidina es 2 mM hasta 10 mM;

en la que la concentración del tampón se selecciona para dar pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un escenario quirúrgico y en la que la relación de manitol:sacarosa es mayor que 1:1 pero no mayor que 2,5:1 (p/p).

20. La composición de trombina de la reivindicación 19, en la que:

la concentración de trombina es 1 mg/ml;

la concentración de sacarosa es 3% (p/v);

la concentración de manitol es 4% (p/v);

la concentración de CaCl_{2} es 4 mM;

la concentración de PEG 3350 es 0,1% (p/v);

la concentración de NaCl es 150 mM; y

la concentración de histidina es 5 mM;

en solución acuosa a pH 6,0.

21. Un método para preparar una composición de trombina liofilizada que comprende: crear una composición según la reivindicación 1 ó 19; y liofilizar la solución acuosa para formar una composición de trombina liofilizada.

22. Una composición de trombina liofilizada preparada por el método de la reivindicación 21.

23. La composición de la reivindicación 22 contenida en un recipiente sellado que tiene una etiqueta fijada a una superficie exterior del mismo.

24. La composición de la reivindicación 23, que contiene desde 2.500 hasta 20.000 unidades NIH de trombina.

25. Un kit que comprende la composición de la reivindicación 23 y un segundo recipiente sellado que contiene un diluyente.

26. El kit de la reivindicación 25, en el que el diluyente es solución salina normal.