ES2312812T3

ES2312812T3 - Procedimientos para la modulacion de procesos relacionados con citoquininas en una planta mediante el uso de proteinas con dominio b3.

Info

Publication number: ES2312812T3
Application number: ES03761222T
Authority: ES
Inventors: John Harada; Sandra Stone; Julie Pelletier
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2023-06-20
Also published as: EP1558742A4; EP1558742B1; US20070050867A1; DE60323120D1; WO2004000007A3; AU2003247599A1; WO2004000007A2; US7138566B2; CA2490063A1; AU2003247599A8; EP1558742A2; US20040006796A1; ATE405659T1; US7612253B2

Abstract

Procedimiento para la modulación de la senescencia de una planta, en donde el procedimiento comprende: (i) introducción en una planta de una construcción que comprenda un promotor de planta unido de forma operativa a un polinucleótido heterólogo, en donde el polinucleótido codifique una proteína de dominio B3 que comprenda el SEQ ID Nº 16, y (ii) selección de una planta que presente, con respecto a una planta que no incluya la construcción, un fenotipo de senescencia retrasada en una estructura de planta.

Description

Procedimientos para la modulación de procesos relacionados con citoquininas en una planta mediante el uso de proteínas con dominio B3.

Campo de la invención

La presente invención va dirigida a la ingeniería genética de plantas. En particular, se refiere a procedimientos para la modulación de procesos relacionados con citoquininas en una planta y para la selección de una planta que posea un fenotipo asociado a un proceso relacionado con citoquininas que haya sido modificado.

Antecedentes de la invención

Las citoquininas son una clase de hormonas de crecimiento de las plantas que son bien conocidas por promover la división celular, el crecimiento celular y la diferenciación, además de estar activas en otros procesos fisiológicos. En particular, las citoquininas se activan en procesos que regulan la resistencia a las enfermedades, la tolerancia al estrés, la tolerancia a la sequía, la resistencia al encamado, el retraso de la senescencia, la dominancia apical y la distribución de los asimilados de una planta, Werner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 98(18)10487-10492 (2001), Haberer et al., Plant Physiol., 128, pp. 354-362 (2002).

La senescencia, que constituye la fase final del desarrollo de las plantas, es una etapa crítica del ciclo vital de una planta. Forma parte del proceso de envejecimiento que ocurre normalmente antes de la muerte celular y se caracteriza por los cambios en la estructura celular, el metabolismo y la expresión génica que producen una disminución de las actividades de las plantas. La inhibición de la senescencia de una planta ha sido identificada como una manera de prolongar la vida útil activa de la misma. Así, se ha demostrado que ciertas hormonas asociadas a la senescencia, por ejemplo, la citoquinina, cuando están presentes en las plantas en niveles elevados, retrasan la senescencia y prolongan la actividad de la planta.

Con anterioridad, ya se había demostrado que las plantas con patrones de senescencia modificados presentan hojas que retienen elevados niveles de clorofila durante el desarrollo de las semillas y de las flores. Por ejemplo, las plantas de tabaco con patrones de senescencia foliar modificados presentan un mayor rendimiento de biomasa y flores (ver la Patente estadounidense nº 5.689.042).

Debido a la importancia de las plantas para la producción de alimentos, existe un continuado y sustancial esfuerzo por mejorar las plantas, por ejemplo, creando plantas con fenotipos de mayor resistencia a las enfermedades, fenotipos de mayor tolerancia al estrés y a la sequía, fenotipos de mayor resistencia al encamado, fenotipos de senescencia retrasada, fenotipos de dominancia apical y fenotipos de mejor distribución de asimilados. Las plantas con mejorados fenotipos poseen mayor capacidad para satisfacer las demandas de la producción de alimentos. Por consiguiente, existe una necesidad de crear plantas con mejorados fenotipos. La invención aborda esta y otras necesidades.

Breve resumen de la invención

Se ha descubierto que la modulación, por ejemplo, sobreexpresión o pérdida de expresión, en una planta de una proteína de dominio B3 afectará a los procesos relacionados con citoquininas como la senescencia de la planta. Por consiguiente, la presente invención provee procedimientos para la modulación de la senescencia de una planta. Los procedimientos para la modulación de la senescencia de una planta comprenden los siguientes pasos: (1) introducción en una planta de una construcción que comprenda un promotor de planta unido de forma operativa a un polinucleótido heterólogo, en donde el polinucleótido codifica una proteína de dominio B3 que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID Nº 16, y (2) selección de una planta que presente un fenotipo asociado a un fenotipo de senescencia retrasada en una estructura de planta. En una realización de la presente invención, la proteína de dominio B3 comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID Nº 18. En una segunda realización, la proteína de dominio B3 es SEQ ID Nº 2. En una tercera realización, la proteína de dominio B3 es SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12 ó SEQ ID Nº 14.

En los procedimientos de la presente invención se utiliza un promotor de planta. En un aspecto de la presente invención, el promotor de planta es un promotor inducible por senescencia. En otro aspecto, el promotor de planta es un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido o un promotor específico del desarrollo floral. El promotor puede dirigir ventajosamente la expresión en óvulos, pistilos, anteras, frutos, cubiertas de semillas, tejidos vasculares, tejidos provasculares o meristemos apicales.

En la presente invención, el fenotipo seleccionado es la senescencia retrasada de una estructura de planta, y el paso de selección comprende la selección de una planta con senescencia retrasada de una estructura vegetativa de la planta o de una estructura reproductiva de la planta. En una realización de la presente invención, la estructura vegetativa es una hoja, tallo o raíz. En una segunda realización, la estructura reproductiva es un óvulo, flor, pistilo, antera o fruto. En una tercera realización, el paso de selección comprende la selección de una planta con partes de la misma de mayor tamaño, en comparación con una planta de tipo natural, como la selección de una planta con semillas más grandes, óvulos más grandes o embriones más grandes en comparación con una planta de tipo natural. En una cuarta realización, el paso de selección comprende la selección de una planta con un mayor número de partes de planta, en comparación con una planta de tipo natural, como la selección de una planta con un mayor número de semillas, un mayor número de flores, un mayor número de frutos o un mayor número de tallos en comparación con una planta de tipo natural. En una quinta realización, el paso de selección comprende la selección de una planta con desarrollo de óvulos en ausencia de fertilización.

En otro aspecto de la presente invención, el paso de selección comprende la selección de una planta con menor elongación internodal, hojas más pequeñas, frutos más pequeños o un menor tamaño en comparación con una planta de tipo natural.

En otro aspecto de la presente invención, el promotor de planta está unido de forma operativa al polinucleótido en una orientación antisentido. En otro aspecto adicional de la presente invención, la construcción se introduce en la planta mediante un entrecruzamiento sexual.

Definiciones

La frase "ácido nucleico" o "secuencia de polinucleótido" se refiere a un polímero de cadena sencilla o doble de bases de desoxirribonucleótido o de ribonucleótido leídas desde el extremo 5' al extremo 3'. Los ácidos nucleicos también pueden incluir nucleótidos modificados que puedan ser leídos de forma correcta por una polimerasa y que no modifiquen la expresión de un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico.

La frase "secuencia de ácido nucleico codificante" se refiere a un ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína o péptido específico. Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen tanto la secuencia de cadena de ADN que es trascrita en ARN como la secuencia de ARN que es traducida en proteína. Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen tanto las secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa como las secuencias de longitud incompleta derivadas de las secuencias de longitud completa. Debe entenderse además que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia nativa o de secuencias que puedan introducirse para proporcionar una preferencia de codones en una célula huésped específica.

El término "promotor" se refiere a una región o determinantes de secuencia ubicados corriente arriba o corriente abajo desde el principio de la transcripción y que están involucrados en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y de otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en las células de las plantas. Dichos promotores no necesitan ser de origen vegetal, por ejemplo, promotores derivados de virus de plantas, como el promotor CaMV 35S, que puede utilizarse en la presente
invención.

El término "planta" incluye plantas completas, órganos/estructuras vegetativas de brotes (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endospermo y cubierta de semilla) y frutos (el ovario maduro), tejido de planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental y similares) y células (por ejemplo, células oclusivas, células de cigoto, tricomas y similares) y la progenie de ellas. La clase de plantas que pueden utilizarse en el procedimiento de la invención es, en general, tan amplia como la clase de las plantas superiores e inferiores susceptible de someterse a técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, helechos, briófitos y algas multicelulares Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidía, incluyendo aneuploide, poliploide, diploide, haploide y hemicigótico.

La frase "célula huésped" se refiere a una célula procedente de cualquier organismo. Las células huésped preferidas proceden de plantas, bacterias, levaduras, hongos, insectos y otros animales. Los procedimientos para la introducción de secuencias de polinucleótido en diversos tipos de células huésped son bien conocidos en la técnica.

Una secuencia de polinucleótido es "heteróloga a" una segunda secuencia de polinucleótido si se origina a partir de especies foráneas o, en caso de que proceda de la misma especie, si ha sido modificada por la acción del hombre a partir de su forma original. Por ejemplo, un promotor unido de forma operativa a una secuencia codificante heteróloga se refiere a una secuencia codificante de una especie diferente a aquella de la que procede el promotor, o, en caso de que proceda de la misma especie, una secuencia codificante que sea diferente a cualquier variante alélica que se produzca de forma natural.

Un polinucleótido "exógeno a" una planta individual es un polinucleótido que se introduce en la planta, o una generación predecesora de la planta, por cualquier medio diferente a un entrecruzamiento sexual. Más adelante se muestran ejemplos de medios que permiten conseguir esto, e incluyen la transformación mediada por Agrobacterium, los procedimientos biolísticos, la electroporación, las técnicas en la planta, y similares.

Un ácido nucleico o polinucleótido que codifica una proteína de dominio B3 es una secuencia de ácido nucleico que comprende (o consta de) una región codificante de aproximadamente 50 a aproximadamente 6800 nucleótidos, en ocasiones de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 nucleótidos y en ocasiones de aproximadamente 300 a aproximadamente 1300 nucleótidos, que codifica un dominio B3 de aproximadamente 115 residuos de aminoácido, en ocasiones de aproximadamente 105 a 125 residuos de aminoácido y, en ocasiones, de aproximadamente 90 a aproximadamente 140 residuos de aminoácido.

Una "proteína de dominio B3" o "polipéptido de dominio B3" es una proteína que comprende un dominio B3. Las proteínas de dominio B3 puede ser, por ejemplo, secuencias de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000, en ocasiones de 200 a 450 residuos de aminoácido. Un dominio B3 es una secuencia de aproximadamente 90 a aproximadamente 140, en ocasiones de aproximadamente 105 a 125 y, ventajosamente, de 115 residuos de aminoácido. El dominio B3 es una región de unión a ADN bien conocida y caracterizada en la técnica; ver Stone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 98:20 11806-11811 (2001); Giraudat et al., Plant Cell, 4, 1251-1261 (1992); Luerssen et al., Plant J., 15, 755-764 (1998); Kagaya et al., Nucleic Acids Res. 27, 470-478 (1999); McCarty et al., Cell, 66, 895-906; Ulmasov et al., Science, 276, 1865-1868. Ejemplos de proteínas con dominios B3 incluyen los números de acceso al GenBank: AAD20695, ARF10, CAB43843, AAF08561, ARF6, ARF8, ARF7, BIPOSTO, AAF82232, ACO25813, MP/IAA24/ARF5, ARF3/ETTIN, ARF4, ARF1, BAB10162, AAG12520, AAD20164, CAB71113, ARF9,
AAF79263, AAG27097, AAD39615, AAF79371, AAF79686, AAB63625, AAD26965, AAC34233, CAB71904, AAF26476, AAC62776, BAB08947, AAF00671, RAV1, BAA95760, RAV2, ABI3, FUS3, LEC2, AAB63089,
CAA16588, CAA18719, AAD20409, BAB03184, AAC69145, AAD30572, BAB02078, BAB09917, AAF29400. Ejemplos de realizaciones de dominios B3 incluyen un dominio B3 idéntico o sustancialmente idéntico al dominio B3 mostrado en SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 16, SEQ ID Nº 17 y SEQ ID Nº 18.

Un "polinucleótido LEC2" es una secuencia de ácido nucleico que comprende (o consta de) una región codificante de aproximadamente 50 a aproximadamente 6800 nucleótidos, en ocasiones de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 nucleótidos y, en ocasiones, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1300 nucleótidos, que se hibrida con SEQ ID Nº 1 bajo condiciones de astringencia (según se define más adelante), o que codifica un polipéptido LEC2 o un fragmento del mismo de al menos 15 aminoácidos (ver la Patente estadounidense nº 6.492.577). Los polinucleótidos LEC2 también se pueden identificar por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de baja astringencia (por ejemplo, Tm \sim40ºC) con sondas de ácidos nucleicos que presenten la secuencia de SEQ ID Nº 1. Ejemplos de polinucleótidos LEC2 son SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 5 (el ADNc de LEC2) y SEQ ID Nº 6.

Un "polipéptido LEC2" o "proteína LEC2" es una proteína de dominio B3. Un polipéptido LEC2 presenta una secuencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, en ocasiones de 100 a 150 y, ventajosamente, de 363 residuos de aminoácido codificados por un polinucleótido LEC2. Los polipéptidos LEC2 son factores de transcripción de plantas caracterizados por la presencia de un dominio B3. Por ejemplo, los residuos de aminoácido 158 a 272 representan el dominio B3 del polipéptido mostrado en SEQ ID Nº 2. El dominio B3 es conocido en la técnica y es compartido por otros factores de transcripción, incluyendo VIVTPAROUS1 (VP1) (McCarty, et al. (1989) Plant Cell 1:523-532), FACTOR DE RESPUESTA A AUXINAS 1 (ARF1) (Ulmasov, T. et al. (1997) Science 276:1865-1868), FUSCA3 (Luerssen, H., et al. (1998) Plant J. 15:755-764) y ABI3 (Giraudat, J., et al. (1992) Plant Cell 4, 1251-1261). Se ha demostrado que los dominios B3 de FUS3 (Reidt, W. et al: (2000) Plant J. 21:401-408), VP1 (Suzuki, M. et al. (1997) Plant Cell 9:799-807) y ARF1 (Ulmasov, T., et al., supra) son dominios de unión a ADN. LEC2 y FUS3 activan ambos el promotor de un gen de proteína de reserva en ensayos de expresión transitoria, indicando que el dominio B3 de LEC2 es un dominio de unión a ADN y se muestra en SEQ ID Nº 7.

Un "polinucleótido FUSCA3" o "polinucleótido FUS3" es una secuencia de ácido nucleico que comprende (o consta de) una región codificante de aproximadamente 50 a aproximadamente 6800 nucleótidos, en ocasiones de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 nucleótidos y, en ocasiones, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1300 nucleótidos, que se hibrida con SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 ó SEQ ID Nº 13 bajo condiciones de astringencia (según se define más adelante), o que codifica un polipéptido FUS3 o un fragmento del mismo de al menos 15 aminoácidos. Los polinucleótidos FUS3 también se pueden identificar por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de baja astringencia (por ejemplo, Tm \sim40ºC) con sondas de ácidos nucleicos que presenten la secuencia de SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 ó SEQ ID Nº 13. Ejemplos de polinucleótidos FUS3 son SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 y SEQ ID Nº 13.

Un "polipéptido FUSCA3" o "polipéptido FUS3" o "proteína FUS3" es una proteína de dominio B3. Un polipéptido FUS3 presenta una secuencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, en ocasiones de 100 a 300 y, ventajosamente, de 255 residuos de aminoácido codificados por un polinucleótido FUS3. Los polipéptidos FUS3 son factores de transcripción de plantas caracterizados por la presencia de un dominio B3. Por ejemplo, los residuos de aminoácido 78 a 192 representan el dominio B3 del polipéptido mostrado en SEQ ID Nº 9. El dominio B3 de FUS3 es un dominio de unión a ADN y se muestra en SEQ ID Nº 15.

"Aumentada o mejorada expresión o actividad de una proteína de dominio B3", por ejemplo, las proteínas LEC2 o FUS3, o "aumentada o mejorada expresión o actividad de un ácido nucleico que codifica una proteína de dominio B3", por ejemplo, los genes LEC2 o FUS3, se refiere a un incremento en la actividad de la proteína de dominio B3. Ejemplos de dicha aumento en la actividad o expresión incluyen los siguientes: La actividad de la proteína de dominio B3 o la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3 aumenta por encima del nivel encontrado en plantas de control no transgénicas de tipo natural (por ejemplo, aumenta la cantidad de actividad o expresión de LEC2 o FUS3 del gen LEC2 o FUS3). La actividad de la proteína de dominio B3 o la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3 aumenta en un órgano, tejido o célula en los que normalmente no se detecta en plantas de control no transgénicas de tipo natural (por ejemplo, se modifica la distribución espacial de la proteína de dominio B3 o la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3). La actividad de la proteína de dominio B3 o la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3 aumenta cuando la actividad de la proteína de dominio B3 o la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3 está presente en un órgano, tejido o célula durante un periodo de tiempo superior al encontrado en los controles no transgénicos de tipo natural (por ejemplo, aumento de la duración de la actividad de la proteína de dominio B3 o de la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3).

"Reducida expresión o actividad de una proteína de dominio B3", por ejemplo, las proteínas LEC2 o FUS3, o "reducida expresión o actividad de un ácido nucleico que codifica una proteína de dominio B3", por ejemplo, los genes LEC2 o FUS3, se refiere a una reducción de la actividad de la proteína de dominio B3. Ejemplos de dicha actividad o expresión reducida incluyen los siguientes: La actividad de la proteína de dominio B3 o la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3 se reduce por debajo del nivel encontrado en plantas de control no transgénicas de tipo natural (por ejemplo, se reduce la cantidad de actividad o expresión de LEC2 o FUS3 del gen LEC2 o FUS3).

El término "estructuras reproductivas" o "tejidos reproductivos", tal como se utiliza aquí, incluye los frutos, óvulos, semillas, polen, flores o partes de flores como son los pistilos, estambres, sépalos, pétalos, carpelos o cualquier tejido embrionario.

El término "estructuras vegetativas" o "tejidos vegetativos", tal como se utiliza aquí, incluye hojas, tallos, tubérculos, raíces, tejido vascular o meristemo de raíz o brote.

Un "casete de expresión" se refiere a una construcción de ácido nucleico que, cuando se introduce en una célula huésped, provoca la transcripción y/o traducción de un ARN o polipéptido, respectivamente. Las construcciones sentido o antisentido que no se traducen o que no se pueden traducir quedan expresamente incluidas en esta definición.

En el caso de la expresión de transgenes y de la inhibición de genes endógenos (por ejemplo, mediante supresión antisentido o sentido), un experto en la técnica admitirá que la secuencia de polinucleótido insertada no necesita ser idéntica, sino que puede ser "sustancialmente idéntica" a una secuencia del gen del que procede. Según se explica más adelante, estas variantes quedan específicamente incluidas en este término.

En el caso de que la secuencia de polinucleótido insertada se transcriba o traduzca para producir un polipéptido funcional, un experto en la técnica admitirá que, debido a la degeneración de codones, existirá un cierto número de secuencias de polinucleótido que codificarán el mismo polipéptido. Dichas variantes quedan específicamente incluidas en el término "secuencia de polinucleótido derivada de" un determinado gen, como el LEC2. Además, el término incluye específicamente secuencias (por ejemplo, secuencias de longitud completa) que sean sustancialmente idénticas (determinado según se describe más adelante) a una secuencia de gen que codifica una proteína de dominio B3, por ejemplo, LEC2 o FUS3, y que codifica proteínas que conservan la función de una proteína de dominio B3, por ejemplo, un polipéptido de LEC2 o FUS3.

En el caso de los polinucleótidos utilizados para inhibir la expresión de un gen endógeno, la secuencia introducida no necesita ser totalmente idéntica a una secuencia del gen endógeno objetivo. Normalmente, la secuencia de polinucleótido introducida será al menos sustancialmente idéntica (según se determina más adelante) a la secuencia endógena objetivo.

Dos secuencias de ácidos nucleicos o dos polipéptidos se consideran "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o de residuos de aminoácido, respectivamente, de ambas secuencias es la misma cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia, según de describe más adelante. El término "complementario a" se usa aquí para especificar que la secuencia es complementaria a toda o a una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia.

El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse a partir del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), a partir del algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), mediante el procedimiento de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)), mediante implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA del Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, EE.UU.) o mediante inspección.

El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina mediante comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la parte de la secuencia de polinucleótido que se encuentra en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (por ejemplo, huecos), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones), para que el alineamiento de las dos secuencias sea óptimo. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que ambas secuencias presentan la misma base de ácido nucleico o residuo de aminoácido para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones que se muestran en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que presenta al menos un 25% de identidad de secuencia. Alternativamente, el porcentaje de identidad puede ser cualquier número comprendido entre el 25% y el 100%. Realizaciones más ventajosas incluyen al menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99%, mediante comparación con una secuencia de referencia utilizando los programas aquí descritos; ventajosamente BLAST usando parámetros estándares, según se describe más adelante. Por consiguiente, las secuencias que codifican una proteína de dominio B3 utilizadas en los procedimientos de la presente invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que presentan una identidad sustancial con SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 ó SEQ ID Nº 13. Por ejemplo, las secuencias LEC2 de la invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que presenten una identidad sustancial con SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4. Las secuencias LEC2 de la invención también incluyen secuencias de polipéptidos que presenten una identidad sustancial con SEQ ID Nº 2. Las secuencias FUS3 de la invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que presenten una identidad sustancial con SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 ó SEQ ID Nº 13. Las secuencias FUS3 de la invención también incluyen secuencias de polipéptidos que presenten una identidad sustancial con SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12 ó SEQ ID Nº 14. Un experto en la técnica admitirá que dichos valores están ajustados de forma aproximada para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en consideración la degeneración de codones, la similaridad de aminoácidos, la ubicación del marco de lectura y similares. Para tales, fines, identidad sustancial de secuencias de aminoácidos significa, normalmente, una identidad de secuencia de al menos el 40%. Ventajosamente, el porcentaje de identidad de los polipéptidos puede ser cualquier número comprendido entre el 40% y el 100%. Realizaciones más ventajosas incluyen al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99%. En las realizaciones más ventajosas posibles, se incluyen un 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% y 75%. Los polipéptidos que son "sustancialmente similares" comparten las secuencias, tal como se ha indicado anteriormente, excepto por el hecho de que pueden presentar sustituciones conservativas de aminoácidos en las posiciones de residuos que no son idénticas. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren al intercambio de residuos que presentan cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales alifáticas es el formado por glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales hidroxil-alifáticas es el formado por serina y treonina; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales que contienen un grupo amida es el formado por asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales aromáticas es el formado por fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales básicas es el formado por lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales que contienen un grupo sulfuro es el formado por cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos que resultan ventajosos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutámico y asparagina-glutamina.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es el hecho de que dos moléculas de hibriden entre sí, o con un tercer ácido nucleico, bajo condiciones de astringencia. Las condiciones de astringencia son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. En general, las condiciones de astringencia son aquellas que corresponden a una temperatura aproximadamente 5ºC inferior al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica, a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia objetivo se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Normalmente, las condiciones de astringencia serán aquellas en las que la concentración de sales sea aproximadamente 0,02 molar a pH = 7 y a una temperatura de, al menos, aproximadamente 60ºC ó 65ºC.

Para los fines de esta revelación, condiciones de astringencia para hibridaciones son aquellas que incluyen al menos un lavado en 0,2 x SSC a 63ºC durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Las condiciones de astringencia moderada incluyen al menos un lavado (normalmente 2) en 0,2 x SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50ºC, normalmente a aproximadamente 55ºC, durante 20 minutos, o condiciones equivalentes.

El término "procesos relacionados con citoquininas" se refiere a los procesos ocurridos en una planta que son modulados por citoquininas. Ejemplos de citoquininas incluyen, pero sin limitarse a, cinetina, zeatina, benciladenina. Ejemplos de procesos relacionados con citoquininas incluyen procesos ocurridos en una célula que resultan afectados por citoquinina, por ejemplo, división celular, tolerancia al estrés, tolerancia a la sequía, resistencia a las enfermedades, resistencia al encamado, senescencia, dominancia apical y distribución de asimilados. La modulación de procesos relacionados con citoquininas puede resultar, por ejemplo, de la sobreproducción de citoquinina, la deficiente producción de citoquinina, el aumento de la sensibilidad a citoquinina en una célula o la disminución de la sensibilidad a citoquinina en una célula.

Descripción detallada de la invención A. Resumen general

La presente invención provee nuevos procedimientos para la modulación de la senescencia de una planta usando proteínas de dominio B3 y para la selección de plantas que presenten fenotipos asociados a una senescencia retrasada en una estructura de planta. Los procesos relacionados con citoquininas se pueden modular mediante la sobreproducción de citoquinina en una planta, la deficiente producción de citoquinina en una planta, el aumento de la sensibilidad a citoquinina en una planta o la disminución de la sensibilidad a citoquinina en una planta. La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que un aumento en la expresión de un gen que codifica una proteína de dominio B3, por ejemplo, un gen LEC2 o FUS3, de una planta induce el retraso de la senescencia de la planta. Los procesos relacionados con citoquininas incluyen cualquier proceso que resulte afectado por los niveles de citoquininas o por su actividad en una planta. Ejemplos de procesos relacionados con citoquininas incluyen la resistencia a las enfermedades, la tolerancia al estrés, la tolerancia a la sequía, la resistencia al encamado, el retraso de la senescencia, la dominancia apical y la distribución de asimilados.

Por consiguiente, la presente invención provee nuevos procedimientos para retrasar la senescencia de una planta mediante la sobreexpresión de una proteína de dominio B3, por ejemplo, una proteína LEC2 o FUS3, en la planta. La presente invención también provee procedimientos para la selección de una planta con patrones o características de senescencia retrasada. Los patrones de senescencia retrasada se producen en plantas con fenotipos modificados en una estructura de planta, en comparación con las plantas de tipo natural. Dichos fenotipos modificados incluyen, pero sin limitarse a, la modulación (por ejemplo, mejora) del tamaño de ciertas partes de la planta y un mayor número de partes de planta. Por consiguiente, mediante la sobreexpresión de una proteína de dominio B3 en una planta se pueden identificar plantas con una mayor biomasa y rendimiento.

También se describen procedimientos para aumentar la resistencia a las enfermedades de una planta mediante la sobreexpresión de una proteína de dominio B3, por ejemplo, una proteína LEC2 o FUS3, en la planta y para la selección de una planta con un fenotipo de mayor resistencia a las enfermedades. En algunas realizaciones, una planta con mayor resistencia a las enfermedades estará mas sana y vivirá más tiempo que una planta de tipo natural cuando se exponga a condiciones de enfermedad. La mayor resistencia a las enfermedades puede medirse conforme a cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los síntomas de enfermedad observados en una planta de prueba se pueden comparar con los síntomas de enfermedad observados en una planta control tras el contacto con un patógeno.

También se describen procedimientos para aumentar la tolerancia al estrés de una planta mediante la sobreexpresión de una proteína de dominio B3, por ejemplo, una proteína LEC2 o FUS3, en la planta y para la selección de una planta con un fenotipo de mayor tolerancia al estrés. Ejemplos de ello incluyen, por ejemplo, una mayor tolerancia a la sequía o a condiciones con elevada concentración de sales. En algunas realizaciones, una planta con mayor tolerancia al estrés será capaz de adaptarse mejor a las condiciones ambientales que una planta de tipo natural. Por ejemplo, una planta con mayor tolerancia a la sequía tendrá hojas que conserven su turgencia en condiciones de sequía.

También se describen procedimientos para aumentar la resistencia al encamado de una planta mediante la sobreexpresión de una proteína de dominio B3, por ejemplo, una proteína LEC2 o FUS3, en la planta y para la selección de una planta con un fenotipo de mayor resistencia al encamado. En algunas realizaciones, una planta con mayor resistencia al encamado tendrá tallos más gruesos que una planta de tipo natural.

B. Aislamiento de los ácidos nucleicos utilizados en los procedimientos de la presente invención

El aislamiento de secuencias a partir de los genes utilizados en los procedimientos de la presente invención puede conseguirse mediante un cierto número de técnicas. Por ejemplo, las sondas oligonucleótidas basadas en las secuencias aquí reveladas se pueden usar para identificar el gen deseado en una librería de ADNc o ADN genómico de una especie de planta deseada. Para construir las librerías genómicas, se generan grandes segmentos de ADN genómico mediante fragmentación aleatoria, por ejemplo, usando endonucleasas de restricción, que se ligan a un ADN vector para formar concatémeros que puedan empaquetarse en el vector apropiado. Para preparar una librería de ADNc específico de embrión, se aísla el ARNm de los embriones y a partir de dicho ARNm se prepara una librería de ADNc que contenga los transcritos del gen.

La librería genómica o de ADNc se puede cribar entonces usando una sonda basada en la secuencia de un gen específico de embrión clonado como son los polinucleótidos aquí revelados. Las sondas se pueden utilizar para hibridarse con secuencias de ADN genómico o ADNc con el fin de aislar los genes homólogos en plantas de la misma especie o de una especie diferente.

Alternativamente, los ácidos nucleicos de interés se pueden amplificar a partir de muestras de ácidos nucleicos usando las técnicas de amplificación. Por ejemplo, se puede usar la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de los genes directamente a partir de ARNm, de ADNc, de librerías genómicas o de librerías de ADNc. La PCR y otros procedimientos de amplificación in vitro también pueden ser de utilidad, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifiquen las proteínas a expresar, para obtener ácidos nucleicos que se usen como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en las muestras, para secuenciación de ácidos nucleicos o para otros fines.

Los cebadores y sondas apropiados para la identificación de genes que codifiquen una proteína de dominio B3 a partir de tejidos de plantas se generan mediante comparaciones de las secuencias aquí reveladas. Para obtener una resumen general de PCR, ver PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. y White, T., eds.), Academic Press, San Diego (EE.UU.) (1990). Por ejemplo, cebadores apropiados para la amplificación de la región genómica de LEC2 incluyen los tres pares de cebadores siguientes: D2F - 5'TTTCAGAATACGCAAAAACGAC3' (SEQ ID Nº 19) y D2R - 5'AACTATCCTCCCGAGTGACC3' (SEQ ID Nº 20); Ef -5'AGATGGCAAGGATCAACAGG3' (SEQ ID Nº 21) y BlastR - 5'CTTGCTTTCGTCCTCGTATATTG3' (SEQ ID Nº 22); y F2F - 5'TTTGTGAAGCAAAATGGAGC3' (SEQ ID Nº 23) y Stop - 5'CGGATGAACCCACGTACG3' (SEQ ID Nº 24). Cebadores apropiados para la amplificación de ADNc de LEC2 incluyen el siguiente par: 5'AAATGGATAACTTCTTACCCTTTCC3' (SEQ ID Nº 25) y 5'CGGATGAACCCACGTACG3' (SEQ ID Nº 26). Normalmente, las condiciones de amplificación serán las siguientes. Componentes de reacción: Tris-HCl 10 mM, pH=8,3, cloruro potásico 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, gelatina al 0,001%, dATP 200 ìM, dCTP 200 ìM, dGTP 200 ìM, dTTP 200 ìM, cebadores 0,4 ìM y 100 unidades por ml de polimerasa Taq. Programa: 96ºC durante 3 min., 30 ciclos de 96ºC durante 45 seg., 50ºC durante 60 seg., 72ºC durante 60 seg., seguido de 72ºC durante 5 min.

Los polinucleótidos también se pueden sintetizar siguiendo técnicas bien conocidas, como las descritas en la literatura técnica. Ver, por ejemplo, Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982) y Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105:661 (1983). Los fragmentos de ADN de cadena doble se pueden obtener entonces mediante síntesis de la cadena complementaria y apareamiento de las cadenas entre sí bajo las condiciones apropiadas, o mediante adición de la cadena complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

El género de las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de dominio B3 utilizadas en los procedimientos de la presente invención incluye genes y productos de genes que han sido identificados y caracterizados mediante análisis utilizando las secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 y SEQ ID Nº 13 y secuencias de proteínas, incluyendo SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12 y SEQ ID Nº 14. Las secuencias que codifican proteínas de dominio B3 utilizadas en la presente invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que presentan una identidad sustancial con SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11 y SEQ ID Nº 13. Las secuencias que codifican proteínas de dominio B3 utilizadas en la presente invención incluyen secuencias de polipéptidos que presentan una identidad sustancial con SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12 y SEQ ID Nº 14. Los dominios B3 utilizados en la presente invención incluyen secuencias que presentan una identidad sustancial con SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 16, SEQ ID Nº 17 y SEQ ID Nº 18.

Los ácidos nucleicos de la presente invención codifican proteínas de dominio B3. Las proteínas de dominio B3 forman parte de diferentes clases o familias, dependiendo de la relación existente entre sus dominios B3 codificados. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente invención, los ácidos nucleicos utilizados en los procedimientos de la presente invención codificarán un dominio B3 idéntico o sustancialmente idéntico a una clase o familia específica de proteínas de dominio B3, por ejemplo, factores de transcripción que contienen el dominio B3. En algunas realizaciones, los factores de transcripción que contienen el dominio B3 se unen a un motivo RY, por ejemplo, el motivo RY de tipo natural CATGCATG; ver, por ejemplo, Reidt et al., Plant J., 21(5), 401-408 (2000). Los expertos en la técnica admitirán que las proteínas de dominio B3 se pueden cribar por su capacidad para unirse a motivos RY utilizando para ello ensayos estándares, como los ensayos de retardo en gel o de huellas de ADN; ver, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982).

Los SEQ ID Nº 11-13 ilustran motivos de dominio B3 conservados. Los Ejemplos 5 y 6 proporcionan alineamientos de proteínas B3 e ilustran posibles aminoácidos adicionales en posiciones no conservadas. Así, en algunas realizaciones, los dominios B3 comprenden los aminoácidos que se conservan o son similares a los definidos en los algoritmos BLAST entre cualquiera de las proteínas LEC2, FUS3, VP1 o a los ilustrados mediante recuadros grises en los Ejemplos 5-6.

Alternativamente, en algunas realizaciones, los factores de transcripción que contienen el dominio B3 regulan la embriogénesis en las plantas. Las proteínas de dominio B3 se pueden expresar, ventajosamente, en una célula de planta en ciertas etapas del desarrollo, por ejemplo, durante la embriogénesis. En algunas realizaciones de la presente invención, los ácidos nucleicos utilizados en los procedimientos de la presente invención codificarán un dominio B3 característico de las proteínas de tipo LEC2/FUS3. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína de dominio B3 comprenderá un dominio B3 idéntico o sustancialmente idéntico al dominio B3 encontrado en LEC2 o FUS3. En otras realizaciones, la proteína de dominio B3 será idéntica o sustancialmente idéntica a los polipéptidos LEC2 o FUS3, tal como se muestran en los SED ID Nº 2 y 9. Alternativamente, en algunas realizaciones, una proteína de dominio B3 utilizada en la presente invención presentará un dominio B3 característico de las proteínas de tipo VP1/ABI3, pero no presentará otras regiones de la proteína, por ejemplo, motivos de enmascaramiento, que previenen la unión a ADN. Ejemplos de estos motivos de enmascaramiento incluyen los residuos de aminoácido 1 a 491 y 632 a 659 presentes en la proteína VP1; ver, Suzuki et al., Plant Cell, 9:799-807 (1997).

Una vez aislado un ácido nucleico utilizando el procedimiento descrito anteriormente, se pueden utilizar procedimientos estándares para determinar si dicho ácido nucleico codifica una proteína de dominio B3. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas de dominio B3 se pueden utilizar para crear plantas transgénicas que presenten una senescencia retrasada. En algunas realizaciones de la presente invención, el dominio B3 será idéntico o sustancialmente idéntico a SEQ ID Nº 7 ó SEQ ID Nº 15. En otras realizaciones, el dominio B3 será idéntico o sustancialmente idéntico a las regiones conservadas de SEQ ID Nº 16, SEQ ID Nº 17 ó SEQ ID Nº 18. Una planta transgénica que presente una expresión mejorada o aumentada de una proteína de dominio B3 idéntica o sustancialmente idéntica a SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12 ó SEQ ID Nº 14 mostrará un fenotipo asociado a un proceso de citoquinina modificado de la planta, por ejemplo, la senescencia retrasada.

Alternativamente, el dominio B3 puede ser idéntico o sustancialmente idéntico al dominio B3 de LEC2, según se describe en SEQ ID Nº 7, o al dominio B3 de FUS3, según se describe en SEQ ID Nº 15. El experto en la técnica comprenderá que un ácido nucleico que codifica un dominio B3 idéntico o sustancialmente idéntico a SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 16, SEQ ID Nº 17 ó SEQ ID Nº 18 se puede utilizar en los procedimientos de la presente invención para crear una planta con un fenotipo asociado a un proceso de citoquinina modificado de la planta, por ejemplo, un fenotipo asociado a la senescencia retrasada.

En otras realizaciones, el ácido nucleico codificará un polipéptido LEC2 idéntico o sustancialmente idéntico a SEQ ID Nº 2. Alternativamente, en otras realizaciones diferentes, el ácido nucleico codificará un polipéptido FUS3 idéntico o sustancialmente idéntico a SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12, ó SEQ ID Nº 14.

Utilizando procedimientos estándares, el experto en la técnica podrá comparar la secuencia de un supuesto ácido nucleico destinado a codificar una proteína de dominio B3 con respecto a una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de dominio B3 para determinar si el supuesto ácido nucleico codifica un dominio B3. Los ácidos nucleicos que codifiquen una proteína de dominio B3, por ejemplo, los ácidos nucleicos que comprendan secuencias idénticas o sustancialmente idénticas a los dominios B3, según se muestran en los SEQ ID Nº 7, 15, 16, 17 y 18 pueden ser utilizados en los procedimientos de la presente invención.

C. Mejora de la expresión de proteínas de dominio B3

La presente invención provee procedimientos para la modulación de la senescencia de una planta. En una realización de la invención, la senescencia se modula aumentando o mejorando la expresión de un gen que codifica una proteína de dominio B3 en una planta, por ejemplo, los genes LEC2 o FUS3. Así, la presente invención, provee procedimientos para retrasar la senescencia de una planta mediante el aumento o mejora de la expresión de un gen que codifica una proteína de dominio B3 en una planta, por ejemplo, los genes LEC2 o FUS3. Una planta con senescencia retrasada poseerá características fenotípicas que resultan fácilmente reconocibles para el experto en la técnica, por ejemplo, por patrones de desarrollo anómalos como son la aparición de partes de la planta de mayor tamaño y/o el aumento en el número de partes de la planta. La parte de la planta afectada puede ser una parte reproductiva de la planta o una parte vegetativa de la planta. Por ejemplo, la parte de la planta puede incluir, pero sin limitarse a, frutos, óvulos, polen, flores, partes de flores como son los pistilos, estambres, sépalos, pétalos, carpelos, hojas, tallos, tubérculos, raíces, tejido vascular, tejido provascular o meristemo de raíz o tallo.

En esta invención también se describen procedimientos para aumentar la resistencia a las enfermedades de una planta y para la selección de una planta con un fenotipo de mayor resistencia a las enfermedades. Una planta con mayor resistencia a las enfermedades poseerá características fenotípicas que resultarán fácilmente reconocibles para el experto en la técnica, por ejemplo, la reducción de síntomas tras la exposición a un patógeno.

Los ácidos nucleicos aquí descritos también se pueden utilizar para aumentar la tolerancia al estrés de una planta. Por consiguiente, en esta invención también se describen procedimientos para aumentar la tolerancia al estrés de una planta y para la selección de una planta con un fenotipo de mayor tolerancia al estrés. Una planta con mayor tolerancia al estrés poseerá características fenotípicas que resultarán fácilmente reconocibles para el experto en la técnica, por ejemplo, la mayor tolerancia a la sequía.

También se describen procedimientos para aumentar la resistencia al escamado de una planta o para reducir la dominancia apical.

Utilizando promotores específicos, el experto en la técnica puede dirigir la expresión de una proteína de dominio B3, por ejemplo, LEC2, y crear plantas con las características fenotípicas deseadas. Por ejemplo, un promotor específico de tejido, como es un promotor específico de semilla, se puede utilizar para crear una planta transgénica con características de semilla modificadas en comparación con una planta de tipo natural. Una planta con características de semilla modificadas puede presentar, por ejemplo, un mayor rendimiento de semilla o unas semillas de mayor tamaño en comparación con una planta de tipo natural. Alternativamente, la característica deseada en una planta puede ser la existencia de un mayor número de flores en comparación con una planta de tipo natural. Para ello, el experto en la técnica puede usar un promotor específico de flores para crear una planta transgénica con la característica deseada. De forma similar, el experto en la técnica puede elegir entre una variedad de conocidos promotores, ya sean constitutivos, inducibles, específicos de tejido y similares, para dirigir la expresión del gen que codifica la proteína de dominio B3, por ejemplo, el gen LEC2 o FUS3, retrasando así la senescencia de una planta. Otras características fenotípicas deseables pueden incluir la existencia de hojas que permanezcan verdes durante un periodo de tiempo mayor o una planta con un mayor rendimiento de frutos o un mayor número de tallos.

En la presente invención se puede seleccionar cualquier característica fenotípica de una estructura de planta causada por una senescencia retrasada. Por ejemplo, tras la introducción de un polinucleótido que codifique una proteína de dominio B3, unida de forma operativa a un promotor deseable, por ejemplo, un promotor constitutivo, específico de tejido o inducible, en una planta, y tras la regeneración de la planta mediante procedimientos estándares, un experto en la técnica podrá utilizar los procedimientos estándares para determinar si la planta transgénica es una planta transgénica de la presente invención, por ejemplo, comparando la planta transgénica con una planta de tipo natural y buscando fenotipos asociados a la senescencia retrasada. En algunas realizaciones de la presente invención, la planta se caracterizará por la retrasada senescencia de los óvulos. La retrasada senescencia de los óvulos puede hacerse evidente por un aumento en el tamaño del óvulo en comparación con un óvulo de tipo natural o por el desarrollo del óvulo en ausencia de fertilización.

La mejora o aumento de la expresión de un gen que codifique una proteína de dominio B3 en una planta puede modular los procesos relacionados con citoquininas mediante una variedad de rutas. La ruta utilizada específicamente para modular la senescencia no es crítica para la presente invención. Por ejemplo, la sobreexpresión de una proteína de dominio B3 en una planta puede afectar a los procesos relacionados con citoquininas mediante el aumento de los niveles de citoquinina de una planta, el aumento de la sensibilidad a citoquinina de una planta, la disminución de los niveles de citoquinina de una planta o la disminución de la sensibilidad a citoquinina de una planta.

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Para aumentar la actividad de una proteína de dominio B3, por ejemplo, un polipéptido LEC2, en una planta se puede utilizar cualquiera de los medios que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias, según se describen aquí, se pueden utilizar para preparar casetes de expresión que mejoren o aumenten la expresión génica endógena. Allí donde se desee la sobreexpresión de un gen, se podrá utilizar el gen deseado de una especie diferente para disminuir los potenciales efectos de la supresión sentido. La mejorada expresión de polinucleótidos que codifican dominios B3 resulta de utilidad, por ejemplo, para aumentar el número de semillas producidas por una planta. Dichas técnicas pueden ser especialmente útiles para aumentar el rendimiento de importantes cultivos de plantas.

La sobreexpresión de una proteína de dominio B3, por ejemplo, LEC2 o FUS3, puede ir dirigida a cualquier órgano, como son los órganos/estructuras vegetativas de brotes (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales o reproductivas (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embrión, endospermo y cubierta de semilla) y frutos. También puede dirigirse a tejidos vasculares o provasculares. Alternativamente, uno o varios genes descritos en la presente invención se pueden expresar de forma constitutiva (por ejemplo, utilizando el promotor CaMV 35S).

Un experto en la técnica admitirá que los polipéptidos codificados por los genes de la invención, al igual que otras proteínas, presentan diferentes dominios que llevan a cabo diferentes funciones. Así, las secuencias de genes no necesitan ser de longitud completa, siempre que se exprese el deseado dominio funcional de la proteína.

D. Inhibición de la expresión de proteínas de dominio B3

En algunas realizaciones de la presente invención, la senescencia se modula inhibiendo la expresión génica en una planta. Por ejemplo, los casetes de expresión de la invención se pueden utilizar para suprimir la expresión endógena de genes que codifican una proteína de dominio B3, por ejemplo, FUS3 o LEC2. La modulación de la senescencia puede aumentar la dominancia apical, provocando una menor ramificación, o puede promover el crecimiento de las
raíces.

Para inhibir la expresión génica en las plantas se pueden utilizar un cierto número de procedimientos. Por ejemplo, la tecnología antisentido puede utilizarse de forma conveniente. Para ello, un segmento de ácido nucleico del gen deseado es clonado y unido de forma operativa a un promotor de manera tal que se transcriba la cadena antisentido de ARN. El casete de expresión se transformará entonces en las plantas y se producirá la cadena antisentido de ARN. En las células de las plantas se ha sugerido que el ARN antisentido inhibe la expresión génica al evitar la acumulación de ARNm que codifica la proteína de interés; ver, por ejemplo, Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8805-8809 (1988) y Hiatt et al., Patente estadounidense nº 4.801.540.

La secuencia de ácido nucleico antisentido transformada en las plantas será sustancialmente idéntica a, al menos, una porción del gen o genes endógenos específicos de embrión a reprimir. No obstante, la secuencia no necesita ser totalmente idéntica para inhibir la expresión. Los vectores de la presente invención se pueden diseñar de forma tal que el efecto inhibidor se aplique a otras proteínas de una familia de genes que exhiban homología u homología sustancial con el gen objetivo.

Para la supresión antisentido, tampoco es necesario que la secuencia introducida sea de longitud completa con respecto al producto de transcripción primaria o al ARNm totalmente procesado. En general, se puede utilizar una homología más elevada para compensar el uso de una secuencia más corta. Más aún, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrones o exones, y la homología de los segmentos no codificantes puede ser igualmente efectiva. Normalmente, deberá utilizarse una secuencia de entre aproximadamente 30 a 40 nucleótidos y con nucleótidos de aproximadamente longitud completa, aunque resulta ventajoso utilizar una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos, resulta más ventajoso utilizar una secuencia de al menos aproximadamente 200 nucleótidos y resulta especialmente ventajoso utilizar una secuencia de al menos aproximadamente 500
nucleótidos.

Las inserciones de transposones o inserciones de ADNt se pueden utilizar para inhibir la expresión de genes que codifiquen proteínas de dominio B3. Los procedimientos estándares son conocidos en la técnica. Las moléculas de ARN catalítico o ribozimas también se pueden utilizar para inhibir la expresión de genes específicos de tejido. Resulta posible diseñar ribozimas que se emparejen específicamente con virtualmente cualquier ARN objetivo y que liberen el esqueleto de fosfodiéster en una ubicación específica, inactivando así funcionalmente el ARN objetivo. Durante dicha liberación, el ribozima no se modifica por sí solo, sino que es capaz de reciclar y liberar otras moléculas, convirtiéndose en una verdadera enzima. La inclusión de secuencias de ribozima en los ARN antisentido les confiere una actividad de liberación de ARN, aumentando así la actividad de las construcciones.

Se han identificado un cierto número de clases de ribozimas. Una clase de ribozimas deriva de un número de pequeños ARN circulares que son capaces de autoliberarse y de replicarse en las plantas. Los ARN se replican solos (ARN viroides) o con un virus de ayuda (ARN satélites). Ejemplos de ello incluyen los ARN del viroide del manchado solar del aguacate y los ARN satélites del virus de la mancha anular del tabaco, el virus de rayado transitorio de la alfalfa, el virus del moteado aterciopelado del tabaco, el virus del moteado del Solanum nodiflorum y el virus del moteado del trébol subterráneo. El diseño y uso de los ribozimas específicos de ARN objetivo se describen en Haseloff et al. Nature, 334:585-591 (1988).

Otro método de supresión es la supresión sentido. La introducción de casetes de expresión en los que un ácido nucleico se configura en la orientación sentido con respecto al promotor ha demostrado ser un medio eficaz para bloquear la transcripción de los genes objetivo. Ver un ejemplo del uso de este procedimiento para modular la expresión de genes endógenos en Napoli et al., The Plant Cell 2:279-289 (1990) y en las Patentes estadounidenses nº 5.034.323, 5.231.020 y 5.283.184.

En general, allí donde se desee la inhibición de la expresión, se producirá cierta transcripción de la secuencia introducida. Este efecto puede producirse allí donde la secuencia introducida no contenga ninguna secuencia codificante per se, sino que sólo contenga secuencias de intrones o secuencias no traducidas homólogas de las secuencias presentes en el transcrito primario de la secuencia endógena. En general, la secuencia introducida será sustancialmente idéntica a la secuencia endógena que se espera reprimir. Normalmente, esta identidad mínima será superior a aproximadamente el 65%, aunque una identidad superior puede ejercer una represión más eficaz de la expresión de las secuencias engódenas. Resulta ventajosa una identidad sustancialmente superior de más de aproximadamente el 80%, aunque la situación más ventajosa posible se obtendría entre aproximadamente un 95% de identidad y la identidad absoluta. Como sucedía con la regulación antisentido, el efecto se aplicará a cualquier otra proteína de una familia similar de genes que exhiban homología u homología sustancial.

Para la supresión sentido, tampoco es necesario que la secuencia introducida en el casete de expresión, que debe tener una identidad inferior a la identidad absoluta, sea de longitud completa con respecto al producto de transcripción primaria o al ARNm totalmente procesado. Esto puede resultar ventajoso para evitar la producción concurrente de algunas plantas que son sobreexpresores. Una identidad mayor en una secuencia con longitud inferior a la longitud completa compensa una secuencia de mayor longitud con una identidad menor. Más aún, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrones o exones, y la identidad de los segmentos no codificantes será igualmente efectiva. Normalmente, para la regulación antisentido se utiliza una secuencia del rango de tamaños anteriormente mencionado.

Un experto en la técnica admitirá que el uso de tecnología basada en secuencias de nucleótidos específicas (por ejemplo, tecnología de supresión antisentido o sentido) permite suprimir familias de genes homólogos con un único transcrito sentido o antisentido. Por ejemplo, si un transcrito sentido o antisentido se diseña para poseer una secuencia que se conserve en toda una familia de genes, se podrán suprimir múltiples miembros de una familia de genes. Contrariamente, si el objetivo es suprimir únicamente un miembro de una familia de genes homólogos, entonces el transcrito sentido o antisentido deberá ir dirigido a secuencias con la mayor variación posible entre los diferentes miembros de la familia.

Otra forma de inhibir la función génica de una planta consiste en la creación de mutaciones negativas dominantes. En esta aproximación, se introducen en una planta polipéptidos no funcionales de dominio B3 mutante que conservan la capacidad de interaccionar con subunidades de tipo natural.

D. Preparación de vectores recombinantes

Para usar las secuencias aisladas en las técnicas anteriores, se prepararon vectores de ADN recombinante adecuados para la transformación de las células de plantas. Las técnicas empleadas para la transformación de una gran variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la literatura técnica y científica, por ejemplo, Weising et al. Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Una secuencia de ADN que codifica el polipéptido deseado, por ejemplo, una secuencia de ADNc que codifica una proteína de longitud completa, se combinará ventajosamente con secuencias reguladoras de iniciación de la transcripción y la traducción que dirigirán la transcripción de la secuencia a partir del gen en los tejidos previstos de la planta transformada.

Por ejemplo, en el caso de la sobreexpresión, se puede emplear un fragmento de un promotor de planta que dirigirá la expresión del gen en todos los tejidos de una planta regenerada. Dichos promotores se denominan aquí promotores "constitutivos" y se activan bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de iniciación de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1' ó 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens y otras regiones de iniciación de la transcripción de diversos genes de plantas conocidos por los expertos en la técnica.

Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión del polinucleótido de la invención en un tejido de planta (promotores específicos de tejido), órgano (promotores específicos de órgano) o puede realizarlo, en caso contrario, bajo un control ambiental más preciso (promotores inducibles). Ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción únicamente en determinados tejidos, como frutos, semillas, flores, pistilos o anteras. Entre los promotores adecuados se incluyen los derivados de genes que codifican proteínas de reserva o la proteína de membrana del cuerpo lipídico, oleosina. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por parte de promotores inducibles incluyen las condiciones anaeróbicas, la elevada temperatura o la presencia de luz.

Si se desea obtener una adecuada expresión del polipéptido, debe incluirse una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante. La región de poliadenilación puede proceder del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas o de ADN-T.

El vector que comprenda las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones codificantes) de genes de la invención, comprenderá normalmente un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable a las células de las plantas. Por ejemplo, el marcador puede codificar la resistencia a biocidas, especialmente la resistencia a antibióticos, como la resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o la resistencia a herbicidas, como la resistencia a clorosulfuron o Basta.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas de dominio B3, se expresan de forma recombinante en las células de las plantas para mejorar y aumentar los niveles de factores de transcripción endógenos de plantas. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos LEC2 o FUS3 de la invención se expresan de forma recombinante en las células de las plantas para mejorar y aumentar los niveles de los polipéptidos LEC2 o FUS3 endógenos. Así, se pueden preparar una variedad de construcciones de expresión diferentes, como los vectores y casetes de expresión adecuados para la transformación de las células de plantas. Las técnicas para la transformación de una gran variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la literatura técnica y científica, por ejemplo, Weising et al. Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido descrito en la presente invención, por ejemplo, una secuencia de ADNc que codifica una proteína LEC2 de longitud completa, se puede combinar con secuencias reguladoras de la transcripción (promotor o intensificador) que actúan en cis para dirigir el momento en que se realiza la transcripción, el tipo de tejido en que se lleva a cabo y los niveles de transcripción en los tejidos previstos de la planta transformada. También se pueden usar elementos de control de la traducción.

La invención provee un ácido nucleico que codifica una proteína de dominio B3 unida de forma operativa a un promotor que, en algunas realizaciones, es capaz de dirigir la transcripción de la secuencia codificante en las plantas. El promotor puede ser, por ejemplo, un derivado de planta o fuentes virales. El promotor puede ser, por ejemplo, constitutivamente activo, inducible o específico de tejido. En la construcción de casetes de expresión recombinantes, vectores, transgénicos de la invención, se pueden elegir y emplear diferentes promotores para dirigir de forma diferencial la expresión génica, por ejemplo, en algunos o todos los tejidos de una planta o animal. Normalmente, según se ha discutido anteriormente, los promotores deseados se identifican analizando las secuencias 5' de un clon genómico correspondiente a los genes específicos de embrión aquí descritos.

Promotores constitutivos

Se puede emplear un fragmento de promotor que dirigirá la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de dominio B3, por ejemplo, LEC2 o FUS3, en todas las células o tejidos transformados, por ejemplo, como los de una planta regenerada. Dichos promotores se denominan aquí promotores "constitutivos" y se activan bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen a los derivados de virus que infectan a las plantas, como la región de iniciación de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (ver, por ejemplo, Dagless (1997) Arch. Virol. 142:183-191); el promotor 1' ó 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens (ver, por ejemplo, Mengiste (1997) supra; O'Grady (1995) Plant Mol. Biol. 29:99-108); el promotor del virus del mosaico del tabaco; el promotor del virus del mosaico de la escrofularia (ver, por ejemplo, Maiti (1997) Transgenic Res. 6:143-156); promotores de actina, como el promotor del gen de actina de Arabidopsis (ver, por ejemplo, Huang (1997) Plant Mol. Biol. 33:125-139); promotores del gen de la alcohol deshidrogenasa (Adh) (ver, por ejemplo, Millar (1996) Plant Mol. Biol. 31:897-904); ACT11 de Arabidopsis (Huang et al. Plant Mol. Biol. 33:125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (GenBank Nº U43147, Zhong et al., Mol. Gen. Genet. 251:196-203 (1996)), el gen que codifica la estearoil-ACP desaturasa de Brassica napus (GenBank Nº X74782, Solocombe et al. Plant Physiol. 104:1167-1176 (1994)), GPc1 de maíz (GenBank Nº X15596, Martínez et al. J. Mol. Biol 208:551-565 (1989)), GPc2 de maíz (GenBank Nº U4S8SS, Manjunath et al., Plant Mol. Biol. 33:97-112 (1997)), otras regiones de iniciación de la transcripción de diversos genes de plantas conocidos por los expertos en la técnica. Ver también Holtorf (1995) "Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana," Plant Mol. Biol. 29: 637-646.

Promotores inducibles

Alternativamente, un promotor de planta puede dirigir la expresión de los ácidos nucleicos descritos en la presente invención, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican una proteína de dominio B3, bajo la influencia de cambiantes condiciones ambientales o condiciones de desarrollo. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por parte de promotores inducibles incluyen las condiciones anaeróbicas, la elevada temperatura, la sequía o la presencia de luz. Ejemplos de condiciones de desarrollo que pueden afectar a la transcripción por parte de promotores inducibles incluyen la senescencia y la embriogénesis. Dichos promotores se denominan aquí promotores "incucibles". Por ejemplo, la invención incorpora el promotor inducible por sequía del maíz (Busk (1997) supra); el promotor inducible por frío, sequía y elevada concentración de sales de la patata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897-909). Ejemplos de condiciones de desarrollo incluyen el envejecimiento de las células y la embriogénesis. Por ejemplo, la invención incorpora el promotor inducible por senescencia de Arabidopsis, SAG 12, (Gan y Amasino, Science, 270:1986-1988 (1995)) y los promotores relacionados con la embriogénesis de LEC1 (Lotan et al., Cell, 93:1195-1205 (1998)), LEC2 (Stone et al., Proc. Natl. Acad. of Sci., 98:11806-11811 (2001)), FUS3 (Luerssen, Plant J. 15:755-764 (1998)), AtSERK1 (Hecht et al. Plant Physiol 127:803-816 (2001)), AGL15 (Heck et al. Plant Cell 7:1271-1282 (1995)) y BBM (BABYBOOM).

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Alternativamente, los promotores de plantas que son inducibles por la exposición a hormonas de plantas, como las auxinas o las citoquininas, se usan para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, la invención puede utilizar el fragmento del promotor E1 de los elementos de respuesta a auxinas (AuxREs) de la soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407); el promotor GST6 de Arabidopsis que responde a auxinas (también responde a ácido salicílico y a peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); el promotor parC inducible por auxinas del tabaco (Sakai (1996) 37:906-913); un elemento de respuesta a biotina de las plantas (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); y el promotor que responde al ácido abscísico u hormona del estrés (Sheen (1996) Science 274:1900-1902). La invención también puede utilizar los promotores inducibles por citoquininas de ARR5 (Brandstatter y Kieber, Plant Cell, 10:1009-1019 (1998)), ARR6 (Brandstatter y Kieber, Plant Cell, 10: 1009-1019 (1998)), ARR2 (Hwang y Sheen, Nature, 413:383-389 (2001)), el promotor que responde al etileno de ERF1 (Solano et al., Genes Dev. 12:3703-3714 (1998)) y el promotor inducible por \hat{a}-estradiol de XVE (Zuo et al., Plant J, 24: 265-273 (2000)).

Los promotores de plantas inducibles por la exposición a reactivos químicos que se pueden aplicar a la planta, como los herbicidas o los antibióticos, también se usan para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar el promotor In2-2 del maíz, activado por fitoprotectores de herbicidas de benzenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577), así como el promotor de la fusión de proteínas de receptores de glucocorticoides inducible por aplicación de dexametasona (Aoyama, Plant J., 11:605-612 (1997)); la aplicación de diferentes fitoprotectores de herbicidas induce patrones de expresión génica diferenciados, incluyendo la expresión en la raíz, los hidatodos y el meristemo apical de los brotes. La secuencia codificante de los ácidos nucleicos descritos también puede estar controlada, por ejemplo, por un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como el descrito en plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de la arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 10 11:465-473); o un elemento de respuesta al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324).

Promotores específicos de tejido

Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión del polinucleótido de la invención en un tejido específico (promotores específicos de tejido). Los promotores específicos de tejido son elementos de control transcripcional que sólo se activan en determinadas células o tejidos en momentos específicos del desarrollo de la planta, como en los tejidos vegetativos o en los tejidos reproductivos.

Ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción únicamente (o principalmente) en determinados tejidos, como los tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces, hojas o tallos, o los tejidos reproductivos, por ejemplo, frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores o cualquier tejido embrionario. Los promotores específicos de tejido reproductivo pueden ser, por ejemplo, específicos del óvulo, específicos de embrión, específicos de endospermo, específicos de tegumento, específicos de semilla y de cubierta de semilla, específicos de polen, específicos de pétalos, específicos de sépalos o algunas combinaciones de
ellos.

Los promotores específicos de semillas adecuados derivan de los siguientes genes: MAC1 de maíz (Sheridan (1996) Genetics 142:1009-1020); Cat3 de maíz (GenBank Nº L05934, Abler (1993) Plant Mol. Biol. 22:10131-1038); vivpa-rous-1 de Arabidopsis (GenBank Nº U93215); atmyc1 de Arabidopsis (Urao (1996) Plant Mol. Biol. 32:571-57; Conceicao (1994) Plant 5:493-505); napA y BnCysP1 de Brassica napus (GenBank Nº J02798, Josefsson (1987) JBL 26:12196-1301, Wan et al., Plant J 30:1-10 (2002)) y la familia de genes de napin de Brassica napus (Sjodahl (1995) Planta 197:264-271). Los promotores específicos de frutos incluyen el promotor del gen CYP78A9 (Ito y Meyerowitz, Plant Cell, 12:1541-1550 (2000)).

El gen BEL1 específico de óvulo descrito en Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank Nº U39944, también se puede utilizar. Ver también Ray (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5761-5765. El promotor FIE1 específico de células centrales y de cigoto también es un promotor específico de tejido reproductivo que resulta de utilidad.

Los promotores específicos de sépalos y pétalos también se utilizan para expresar ácidos nucleicos que codifican una proteína de dominio B3 de manera específica para tejido reproductivo. Por ejemplo, el gen homeótico floral de Arabidopsis APETALAl (AP1) codifica un supuesto factor de transcripción que se expresa en los primordios de flores jóvenes, para posteriormente localizarse en los sépalos y pétalos (ver, por ejemplo, Gustafson-Brown (1994) Cell 76:131-143; Mandel (1992) Nature 360:273-277). También resulta de utilidad un promotor relacionado, para AP2, un gen homeótico floral que es necesario para el normal desarrollo de los sépalos y pétalos en los verticilos florales (ver, por ejemplo, Drews (1991) Cell 65:991-1002; Bowman (1991) Plant Cell 3:749-758). Otro promotor de utilidad es aquel que controla la expresión del gen de órganos florales inusuales (UFO) de Arabidopsis,cuya expresión está restringida a la unión entre los primordios de sépalos y pétalos (Bossinger (1996) Development
122:1093-1102).

En el maíz se ha identificado un promotor específico del polen de maíz (Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161-168). Otros genes que se expresan de forma específica en el polen se describen, por ejemplo, en Wakeley (1998) Plant Mol. Biol. 37:187-192; Ficker (1998) Mol. Gen. Genet. 257:132-142; Kulikauskas (1997) Plant Mol. Biol. 34:809-814; Treacy (1997) Plant Mol. Biol. 34:603-611.

Promotores específicos de pistilos y valvas de silicua, meristemos de inflorescencia, hojas caulinares y la vasculatura de tallos y pedicelos florales incluyen promotores del gen FUL (Mandel y Yanofsky, Plant Cell, 7:1763-1771 (1995)). Los promotores específicos para el desarrollo de carpelos, placenta, tabiques y óvulos también se utilizan para expresar ácidos nucleicos LEC2 de manera específica para tejido. Entre ellos se incluyen los promotores de los genes SHP1 y SHP2 (Flanagan et al. Plant J 10:343-353 (1996), Savidge et al., Plant Cell 721-733). Los promotores específicos del tapete de la antera pueden proceder del gen TA29 (Goldbeg et al., Philos Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350:5-17).

Otros promotores adecuados incluyen los derivados de genes que codifican proteínas de reserva embrionarias. Por ejemplo, se pueden usar el gen que codifica la proteína de reserva 2S para Brassica napus (Dasgupta (1993) Gene 133:301-302); la familia de genes de la proteína de reserva de las semillas 2S de Arabidopsis; el gen que codifica la oleosina de 20 kD de Brassica napus (GenBank Nº M63985); los genes que codifican la oleosina A (GenBank Nº U09118) y la oleosina B (GenBank Nº U09119) de la soja; el gen que codifica la oleosina de Arabidopsis (GenBank Nº Z17657); el gen que codifica la oleosina de 18 kD del maíz (GenBank Nº J05212, Lee (1994) Plant Mol. BioL 26:1981-1987); y el gen que codifica la proteína rica en azufre de bajo peso molecular de la soja (Choi (1995) Mol Gen, Genet. 246:266-268). El promotor específico de tejido E8 del tomate es de especial utilidad para dirigir la expresión génica, ya que un producto de gen deseado se encuentra en los frutos. Promotores adecuados también pueden incluir los derivados de genes expresados en tejido vascular, como los genes ATHB-8, AtPIN1, AtP5K1 o TED3 (Baima et al., Plant Physiol. 126:643-655 (2001), Galaweiler et al., Science, 282:2226-2230 (1998), Elge et al., Plant J., 26:561-571 (2001), Igarashi et al., Plant Mol. Biol., 36:917-927 (1998)).

Se puede usar un promotor de tomate activo durante la maduración del fruto, la senescencia y la abscisión de las hojas y, en un menor grado, de las flores (Blume (1997) Plant J. 12:731-746). Otros ejemplos de promotores incluyen el promotor específico de pistilos en el gen SK2 de la patata (Solanum tuberosum L.), que codifica una endoquitinasa básica específica de pistilos (Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425-431); el gen Blec4 del guisante (Pisum sativum cv. Alaska), activo en el tejido epidérmico de los ápices de brotes florales y vegetativos de la alfalfa transgénica. Esto lo convierte en una herramienta de utilidad para dirigir la expresión de genes extraños en la capa epidérmica de brotes que se encuentren en una fase de crecimiento activo.

Una variedad de promotores específicamente activos en tejidos vegetativos, como las hojas, tallos, raíces y tubérculos, también puede utilizarse para expresar los ácidos nucleicos utilizados en los procedimientos de la invención. Por ejemplo, se pueden usar promotores que controlen la patatina, la principal proteína de reserva del tubérculo de la patata (ver, por ejemplo, Kim (1994) Plant Mol. Biol. 26:603-615; Martin (1997) Plant J. 11:53-62). También se puede utilizar el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes, que exhibe una elevada actividad en las raíces (Hansen (1997) Mol. Gen. Genet. 254:337-343). Otros promotores específicos de tejido vegetativo de utilidad incluyen: el promotor tarina del gen que codifica una globulina de una importante familia de proteínas del cormo de taro (Colocasia esculenta L. Schott), el promotor tarina de tejido (Bezerra (1995) Plant Mol. Biol. 28:137-144); el promotor curculina activo durante el desarrollo del cormo de taro (de Castro (1992) Plant Cell 4:1549-1559) y el promotor para el gen TobRB7 específico de la raíz del tabaco, cuya expresión se localiza en el meristemo de la raíz y en las regiones inmaduras del cilindro central (Yamamoto (1991) Plant Cell 3:371-382).

Se pueden utilizar promotores específicos de las hojas, como los promotores de la ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS). Por ejemplo, los genes RBCS 1, RBCS2 y RBCS3A del tomate se expresan en las hojas y en las plantas de semillero crecidas con luz, aunque sólo los genes RBCS1 y RBCS2 se expresan en los frutos del tomate en desarrollo (Meier (1997) FEBS Lett. 415:91-95). Se puede utilizar el promotor de la ribulosa bifosfato carboxilasa expresado casi exclusivamente en las células del mesofilo en láminas foliares y vainas foliares a elevados niveles, según se describe en Matsuoka (1994) Plant J. 6:311-319. Otro promotor específico de hojas es el promotor del gen de la proteína de unión a la clorofila a/b captadora de luz (ver, por ejemplo, Shiina (1997) Plant Physiol. 115:477-483; Casal (1998) Plant Physiol. 116:1533-1538). El promotor del gen de myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5) descrito por Li (1996) FEBS Lett. 379:117-121, es específico de las hojas. El promotor Atmyb5 se expresa en los tricomas de las hojas en desarrollo, estípulas y células epidérmicas en los márgenes de las hojas jóvenes de rosetas y caulinas, y en las semillas inmaduras. El ARNm de Atmyb5 aparece entre la fertilización y la etapa de desarrollo embrionario de 16 células y persiste más allá de la etapa del corazón. También se puede utilizar un promotor específico de las hojas identificado en el maíz por Busk (1997) Plant J. 11:1285-1295.

Otra clase de promotores específicos de tejido vegetativo son los promotores meristemáticos (ápice de la raíz y brote apical). Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores "SHOOT MERISTEMLESS" y "SCARECROW", que se activan en los meristemos apicales de la raíz o de los brotes en desarrollo, descritos por Di Laurenzio (1996) Cell 86:423-433; y Long (1996) Nature 379:66-69. Otro promotor de utilidad es aquel que controla la expresión del gen HMG2 de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa, cuya expresión está restringida a los tejidos meristemáticos y florales (zona secretora del estigma, granos de polen maduros, tejido vascular del gineceo y óvulos fertilizados) (ver, por ejemplo, Enjuto (1995) Plant Cell. 7:517-527). También son de utilidad los genes relacionados con kn1 del maíz y de otras especies, que muestran expresión específica del meristemo; ver, por ejemplo, Granger (1996) Plant Mol. Biol. 31:373-378; Kerstetter (1994) Plant Cell 6:1877-1887; Hake (1995) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350:45-51. Por ejemplo, los promotores KNAT1 o KNAT2 de Arabidopsis thaliana. En los brotes apicales, el transcrito KNAT1 se localiza principalmente en el meristemo de los brotes apicales; la expresión de KNAT1 en el meristemo de los brotes disminuye durante la transición floral y está restringida al córtex del tallo en inflorescencia (ver, por ejemplo, Lincoln (1994) Plant Cell 6:40 1859-1876).

Un experto en la técnica admitirá que un promotor específico de tejido puede dirigir la expresión de secuencias unidas de forma operativa en tejidos diferentes al tejido objetivo. Así, según se utiliza aquí, un promotor específico de tejido es un promotor que dirige la expresión de forma ventajosa en el tejido objetivo, pero que también puede llevar a cierta expresión en otros tejidos.

En otra realización, un ácido nucleico descrito en la presente invención se expresa a través de un elemento transponible. Esto permite la expresión constitutiva, aunque periódica e infrecuente, del polipéptido constitutivamente activo. La invención también provee el uso de promotores específicos de tejido derivados de virus, que pueden incluir, por ejemplo, el promotor subgenómico del tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683); el virus baciliforme del tungro del arroz (RTBV), que se replica únicamente en células del floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor que dirige una potente expresión de un gen testigo específica del floema; el promotor del virus del mosaico de las nervaduras de la yuca (CVMV), con máxima actividad en elementos vasculares, en células del mesofilo de las hojas y en los ápices de la raíz (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139).

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D. Producción de plantas transgénicas

Las construcciones de ADN de la invención se pueden introducir en el genoma de la planta huésped deseada mediante una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, la construcción de ADN se puede introducir directamente en el ADN genómico de la célula de planta usando técnicas como la electroporación y la microinyección de protoplastos de células de planta, o las construcciones de ADN se pueden introducir directamente en el tejido de la planta utilizando procedimientos biolísticos, como el bombardeo de partículas de ADN. Alternativamente, las construcciones de ADN se pueden combinar con las adecuadas regiones flanqueantes del ADN-T y se pueden introducir en un vector huésped convencional de Agrobacterium tumefaciens. Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción y del marcador adyacente en el ADN celular de la planta cuando la célula resulte infectada por la bacteria.

Las técnicas de microinyección son conocidas en la técnica y se describen adecuadamente en la literatura científica y técnica. La introducción de construcciones de ADN usando la precipitación en polietilenglicol se describe en Paszkowski et al. Embo J. 3: 2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación se describen en Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). Las técnicas de transformación biolística se describen en Klein et al. Nature 327:70-73 (1987).

Las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarme y uso de vectores binarios, se describen adecuadamente en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Horsch et al. Science 233:496-498 (1984) y Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983).

Las células de plantas transformadas que deriven de cualquiera de las técnicas de transformación anteriores se pueden cultivar para regenerar una planta completa que posea el genotipo transformado y, por tanto, el fenotipo deseado como la apirenia. Dichas técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de cultivo de crecimiento tisular, basándose normalmente en un marcador de biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York (EE.UU.), 1983; y en Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton (EE.UU.), 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callos de plantas, explantes, órganos y partes de ellos. Dichas técnicas de regeneración se describen de forma general en Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987).

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para conferir los rasgos deseados a, esencialmente, cualquier planta. Así, la invención ha utilizado una amplia gama de plantas, incluyendo especies de los géneros Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna y Zea. Los genes LEC2 de la invención resultan de especial utilidad en la producción de plantas transgénicas del género Brassica. Entre los ejemplos se incluyen el brócoli, la coliflor, las coles de Bruselas, la canola y similares.

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E. Detección de las plantas transgénicas de la presente invención

Utilizando procedimientos conocidos, un experto en la técnica puede cribar las plantas de la invención mediante la detección del aumento o disminución de los niveles de proteínas de dominio B3 en una planta y mediante la detección del fenotipo deseado. Los medios para detectar y cuantificar el ARNm o las proteínas son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, Northern blots, Western blots o ensayos de actividad. Por ejemplo, tras la introducción del casete de expresión en una planta, las plantas se pueden cribar para la presencia del transgén y se pueden cruzar con una línea endogámica o híbrida. Las plantas de la progenie se pueden cribar entonces para la presencia del transgén y auto-polinizarse. La progenie de las plantas auto-polinizadas se hace crecer. Las plantas transgénicas resultantes se pueden examinar para cualquiera de las características fenotípicas asociadas a los procesos relacionados con citoquininas modificados, por ejemplo, las características asociadas a la senescencia retrasada. Por ejemplo, mediante el uso de los procedimientos de la presente invención, la sobreexpresión de los ácidos nucleicos o proteínas descritos en la presente invención, por ejemplo, proteínas de dominio B3 como LEC2 o FUS3, pueden retrasar la senescencia de las células de una estructura de planta vegetativa o reproductiva. El experto en la técnica puede usar los procedimientos estándares para determinar si una planta posee las características asociadas a la senescencia retrasada. Por ejemplo, se puede examinar el color de las hojas para determinar si la vida fotosintética de la planta ha llegado a su fin. Las plantas con ampliados ciclos de vida fotosintética se caracterizan por presentar hojas que permanecen verdes durante un periodo de tiempo más prolongado en comparación con las plantas de tipo natural. El tamaño de las estructuras vegetativas y reproductivas se puede examinar para determinar si son mayores o menores que las de una planta de tipo natural. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden poseer mayores frutos, óvulos, semillas, polen, tejido embrionario, flores, partes de flores como son los pistilos, estambres, sépalos, pétalos, carpelos, hojas, tallos, tubérculos, raíces, tejido vascular, tejido provascular o meristemos de raíz o tallo. En otras realizaciones, las plantas transgénicas de la presente invención pueden presentar una menor elongación internodal, hojas más pequeñas, frutos más pequeños o un menor tamaño en comparación con una planta de tipo natural.

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Ejemplos Ejemplo 1 Sobreexpresión de LEC2

El ADNc de LEC2 fusionado con el promotor 35S CaMV fue transfectado a mutantes lec2-1 y lec2-5 y a plantas Ws-0 de tipo natural usando el procedimiento de inmersión floral de Agrobacterium. Fenotipos de sobreexpresión similares se observaron en fondos mutantes y de tipo natural. Plantas de semillero T1 de tipo embrión carnoso con cotiledones no expandidos y con radículas y hipocótilos no extendidos se obtuvieron con frecuencia en medios libres de hormonas. Éstas, así como otras plantas de semillero con aspecto más natural, produjeron callos. De los callos emergieron con frecuencia embriones somáticos, órganos de tipo cotiledón, hojas y brotes. Las raíces se indujeron con menor frecuencia, en ocasiones presentaban un grosor, anatomía y color anormales y en ocasiones fueron inducidas ectópicamente en las hojas y órganos florales. Los embriones somáticos germinaron fácilmente e indujeron la producción adicional de callos, embriones somáticos y órganos vegetativos, que llevaron a la formación de grandes masas de plántulas. En contraste con las hojas de tipo natural escindidas que senescieron cuando se cultivaron en un medio libre de hormonas, las hojas de 3SS::LEC2 no senescieron, sino que indujeron la formación de callos, hojas, brotes, órganos de tipo cotiledón, embriones somáticos y, ocasionalmente, raíces. Estos fenotipos indican que LEC2 es capaz de establecer una competencia embriogénica en las células. Además, la expresión ectópica de LEC2 crea un entorno organogénico proliferante. Las plantas de semillero T1 que contenían el transgén 35S::LEC2 con buen crecimiento de raíces fueron transferidas al suelo y posteriormente desarrolladas para obtener plantas de pequeña estatura, hojas pequeñas, tallos más gruesos, limitada elongación internodal, reducida dominancia apical y anomalías florales, incluyendo la esterilidad masculina. Estas plantas 35S::LEC2 se mantuvieron verdes y continuaron creciendo durante mucho tiempo después de que las plantas de tipo natural de la misma edad murieran, indicando la existencia de un retraso en la senescencia de las hojas y los tallos.

Uno de los fenotipos más sobresalientes de las plantas T1 35S::LEC2 crecidas en el suelo es el continuado crecimiento de los óvulos en ausencia de fertilización. Los sacos embrionarios del óvulo y las células tegumentosas de tipo natural se colapsaron 10 días después de la antesis en ausencia de fertilización. Contrariamente, los óvulos 35S::LEC2 no fertilizados no senescieron, y habitualmente crecieron hasta obtener un tamaño superior al de las semillas de tipo natural. El crecimiento de los óvulos se debió estrictamente al agrandamiento y la división de las células tegumentosas; el saco embrionario no persistió. Ésta es la primera observación de óvulos no fertilizados no senescentes en Arabidopsis.

Los pistilos 35S::LEC2 polinizados se desarrollaron en silicuas, que eran más pequeñas y anchas que las de tipo natural. Veinte días después de la polinización, las silicuas de 35S::LEC2 permanecían verdes y no dehiscentes, mientras que las silicuas de tipo natural habían amarilleado y comenzaban a dehiscir. Así, 35S::LEC2 retrasó la senescencia de las silicuas. Los pistilos 35S::LEC2 no polinizados que encerraban los óvulos en crecimiento se elongaron y desarrollaron en estructuras con características similares a las silicuas 35S::LEC2. En ausencia de polinización, los pistilos de tipo natural se elongaron sólo ligeramente antes de sufrir senescencia aproximadamente 10 días después de la antesis. Estos resultados indican que la presencia de LEC2 evita la muerte normal de los pistilos que se produce en ausencia de polinización y retrasa la senescencia de las estructuras de frutos resultantes.

Las plantas T1 35S::LEC2 que fueron polinizadas con polen de tipo natural formaron silicuas en las que la mayoría de las semillas eran de mayor tamaño que en la planta de tipo natural, y todas presentaban cubiertas de semillas carnosas. Los embriones incluidos en estas semillas presentaron, habitualmente, una forma variada, aunque la mayoría eran de mayor tamaño que las de tipo natural. El tamaño y la forma de los embriones no se dividieron en categorías discretas, y no se asociaron a la presencia del transgén en el embrión. Las cubiertas de semillas carnosas fueron el resultado de las continuadas divisiones celulares y del retraso en la muerte celular que normalmente se produce durante la maduración de las cubiertas de semillas de tipo natural. Los experimentos de entrecruzamiento recíproco en los que las plantas de tipo natural se polinizaron con polen 35S::LEC2 generaron semillas y embriones con un aspecto 100% de tipo natural. Estos resultados indican que LEC2 afecta tanto al tamaño de las semillas como a su forma mediante su expresión en tejidos maternales. La senescencia retrasada de la silicua 35S::LEC2 permite que todas sus semillas, con independencia de si contienen o no el transgén 35S::LEC2, continúen creciendo durante más tiempo que las de tipo natural y, por tanto, alcancen un tamaño superior.

En conjunto, la mayor vida útil de las plantas completas, silicuas, óvulos y semillas 35S::LEC2 y la ausencia de senescencia en los óvulos de los pistilos no polinizados y en las hojas escindidas indican que LEC2 es suficiente para retrasar la senescencia.

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Ejemplo 2 Retraso de la senescencia asociado a citoquininas

Un aumento en el nivel de citoquininas, ya sea por aplicación exógena o por aumento de los niveles endógenos, se asocia con frecuencia a un retraso de la senescencia. Nosotros usamos un gen testigo GUS bajo el control de un promotor de un gen inducible por citoquininas, ARR5 (Agostino et al. (2000) Plant Physiol 124: 1706), para identificar de forma indirecta los cambios en el nivel de o la sensibilidad a citoquininas. En la antesis, los pistilos de tipo natural y los pistilos 35S::LEC2 presentaron niveles similares de actividad GUS regulada por ARR5 en tabiques y funículos y se mostraron asociados a los tejidos vasculares. Cinco días después de la antesis, los pistilos 35S::LEC2 no polinizados mantuvieron un nivel de actividad promotora de ARR5 en tabiques y funículos similar al de las silicuas polinizadas de tipo natural, mientras que los pistilos de tipo natural de la misma edad mostraron menores niveles de actividad promotora de ARR5 en estos tejidos. En las silicuas polinizadas en etapas tardías de desarrollo de semillas, las silicuas 35S::LEC2 mostraron niveles de actividad promotora de ARR5 superiores a los de las silicuas de tipo natural Estos resultados sugieren que el crecimiento prolongado de las semillas y óvulos no polinizados 35S::LEC2 produce una senescencia retrasada de los óvulos y las semillas, quizás debido a un aumento en la expresión de los genes inducibles por citoquininas.

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Ejemplo 3 Sobreexpresión de FUS3

El ADNc de FUS3 fusionado con el promotor 35S CaMV fue transfectado a plantas de Arabidopsis de tipo natural con ecotipo Ws-0, usando el procedimiento de inmersión floral de Agrobacterium. Se obtuvieron dos tipos de plantas de semillero transformadas en medio libre de hormonas. Aproximadamente el 50% de los transformantes tenía el mismo aspecto que las plantas de semillero de tipo natural, excepto por el hecho de que presentaban hojas ligeramente más gruesas y reducido número de tricomas. El 50% restante presentaron un retraso comparativo en la germinación y resultaron anómalas en diversas formas. Una anomalía destacada era el retraso en el crecimiento de las raíces. Por consiguiente, estas plantas de semillero se mantuvieron en medios libres de hormonas. Las estructuras de tipo cotiledón y las hojas carnosas crecieron frecuentemente a partir de los cotiledones, del meristemo apical de los brotes y de los peciolos de estas plantas de semillero. En ocasiones, se obtuvieron algunos callos que posteriormente se diferenciaron en tallos, hojas e inflorescencias y, en ocasiones más raras, en embriones somáticos. Los embriones somáticos se formaron con mayor frecuencia en el margen de las hojas, así como en los tallos y órganos florales que estaban en contacto con el medio. Los embriones somáticos germinaron y dieron origen a órganos vegetativos, callos, estructuras de tipo cotiledón y, más raramente, embriones somáticos, provocando así la formación de masas de plántulas. En contraste con los órganos de tipo natural que senescieron cuando se cultivaron en un medio libre de hormonas, los órganos de 3SS::FUS3 no senescieron, sino que indujeron la formación de hojas, brotes, callos, órganos de tipo cotiledón y embriones somáticos. Estos fenotipos indican que FUS3 es suficiente para establecer una competencia embriogénica en las células, conferir características embrionarias a las plantas de semillero e inducir la formación de embriones somáticos. FUS3 también retrasó la senescencia de los órganos de las plantas. Además, la expresión ectópica de FUS3 crea un entorno organogénico proliferante.

Las plantas de semillero T1 que contenían el transgén 35S::FUS3 con buen crecimiento de raíces fueron transferidas al suelo. La mayoría de las plantas de semillero se desarrollaron en plantas de reducida estatura, limitada elongación internodal, ausencia de dominancia apical y anomalías florales, incluyendo la esterilidad masculina. La mayoría de los transformantes se mantuvieron verdes y continuaron creciendo durante mucho tiempo después de que las plantas de tipo natural de la misma edad murieran, indicando la existencia de un retraso en la senescencia de las hojas y los tallos.

Los transformantes con la ausencia de dominancia apical y el retraso en la senescencia más severos mostraron un interesente fenotipo floral: Las papilas estigmáticas estuvieron ausentes o empezaron a crearse vagamente varios días después de la antesis. Una interpretación de este fenotipo podría ser un retraso en la maduración del gineceo. En ningún caso se obtuvieron semillas a partir de estas flores, ya que las partes reproductivas masculinas y femeninas se desarrollaron de forma asíncrona. No obstante, en contraste con la planta de tipo natural, los óvulos contenidos en estos carpelos 35S::FUS3 no senescieron ni degeneraron. Por el contrario, los óvulos 35S::FUS3 presentaron un mayor tamaño, indicando la existencia de un retraso en la senescencia de los óvulos y la inducción del crecimiento y la proliferación de las células de los óvulos. Los pistilos 35S::FUS3 no polinizados que encerraban los óvulos de mayor tamaño se elongaron y desarrollaron paredes más gruesas y carnosas que los pistilos no polinizados o las paredes de silicuas en desarrollo de tipo natural. Con el tiempo, las estructuras de frutos senescieron y las valvas amarillearon, pero el replo y los tabiques permanecieron habitualmente verdes y carnosos durante un mayor periodo de tiempo. Estos resultados indican que la presencia de FUS3 evita la muerte normal de los pistilos que se produce en ausencia de polinización y retrasa la senescencia de las estructuras de frutos resultantes.

En ocasiones, las flores revirtieron hacia un desarrollo adicional de tipo natural, que permitió la fertilización y el desarrollo de las semillas. En la mayoría de las plantas T1 fértiles, el desarrollo de las semillas se produjo de forma normal, aunque la elongación de las silicuas se redujo con frecuencia. Las plantas 35S::FUS3 fértiles produjeron semillas que eran indistinguibles de las semillas de tipo natural en cuanto a su morfología y viabilidad.

En conjunto, la mayor vida de las plantas completas 35S::FUS3 y la ausencia de senescencia en los óvulos de los pistilos no polinizados y en los órganos escindidos indican que la expresión ectópica de FUS3 retrasa la senescencia.

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Ejemplo 4 Comparación de los dominios B3 de LEC2 y FUS3

ISEQ GAP se ejecutó utilizando las secuencias de los dominios B3 de LEC2 y FUS3. Los dominios B3 de LEC2 y FUS3 comparten un 50% de identidad y un 61,7% de similaridad.

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Las secuencias de nucleótidos FUS3 difieren en los tres ecotipos de Arabidopsis. Sin embargo, el polimorfismo no causa diferencias de aminoácidos dentro del dominio B3.

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Ejemplo 5 Secuencia consenso para los dominios B3 de LEC2/FUS3/ABI3/VP1

Se creó el siguiente alineamiento de aminoácidos de los residuos de los dominios B3 de LEC2 (SEQ ID Nº 7), FUS3 (SEQ ID Nº 15), ABI3 (SEQ ID Nº 27) y VP 1 (SEQ ID Nº 28). Los residuos de los recuadros negros son idénticos en al menos dos de las cuatro proteínas, mientras que los de los recuadros sombreados comparten similaridad con los residuos conservados. El número de la columna de la derecha indica el número de residuos de los polipéptidos previstos.

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Ejemplo 6 Secuencia consenso para la familia de dominio B3 de LEC2

Se creó el siguiente alineamiento de aminoácidos de los residuos de los dominios B3 de AT2G30470 (SEQ ID Nº 29) (nº de acceso al GenBank AAB63089), AT4G32010 (SEQ ID Nº 30) (nº de acceso al GenBank CAA16588), AT4G21550 (SEQ ID Nº 31) (nº de acceso al GenBank CAA18719), FUS3 (SEQ ID Nº 32), ABI3 (SEQ ID Nº 33) y LEC2 (SEQ ID Nº 7). Los residuos de los recuadros oscurecidos son idénticos en las seis proteínas. Los residuos de los recuadros negros son idénticos en al menos tres de las seis proteínas, mientras que los de los recuadros ligeramente sombreados comparten similaridad con los residuos conservados. El número de la columna de la derecha indica el número de residuos de los polipéptidos previstos. Consenso = SEQ ID Nº 34.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

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\bulletAGOSTINO et al. Plant Physiol, 2000, vol. 124, 1706 [0114]

SEQ ID Nº 1: Secuencia genómica de LEC2

4

5

6

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SEQ ID Nº 2: Polipéptido LEC2

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7

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SEQ ID Nº 3: Promotor 5' de LEC2

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8

9

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SEQ ID Nº 4: Promotor 3' de LEC2

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10

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SEQ ID Nº 5: ADNc de LEC2

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11

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SEQ ID Nº 6: Gen LEC2 desde el sitio de iniciación de la traducción hasta el sitio de poliadenilación

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12

13

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SEQ ID Nº 7: Dominio B3 de LEC2

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14

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SEQ ID Nº 8: ADNc de FUS3 de ecotipo Col de Arabidopsis

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15

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SEQ ID Nº 9: Polipéptido FUS3 de ecotipo Col de Arabidopsis

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16

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SEQ ID Nº 10: ADNc de FUS3 de ecotipo Ler de Arabidopsis

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17

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SEQ ID Nº 11: Gen v de ecotipo Ler de Arabidopsis

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18

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SEQ ID Nº 12: Polipéptido FUSS de ecotipo Ler de Arabidopsis

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19

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SEQ ID Nº 13: Gen FUS3 de ecotipo Ws-0 de Arabidopsis

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20

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SEQ ID Nº 14: Polipéptido FUS3 de ecotipo Ws-0 de Arabidopsis

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SEQ ID Nº 15: Dominio B3 de FUS3

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SEQ ID Nº 16: Secuencia consenso para los dominios B3 de la familia LEC2/FUS3

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SEQ ID Nº 17: Secuencia consenso para los dominios B3 de LEC2, FUS3, ABI3 y VP1

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SEQ ID Nº 18: Secuencia consenso para los dominios B3 de LEC2 y FUS3

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25

Claims

1. Procedimiento para la modulación de la senescencia de una planta, en donde el procedimiento comprende:

(i) introducción en una planta de una construcción que comprenda un promotor de planta unido de forma operativa a un polinucleótido heterólogo, en donde el polinucleótido codifique una proteína de dominio B3 que comprenda el SEQ ID Nº 16, y

(ii) selección de una planta que presente, con respecto a una planta que no incluya la construcción, un fenotipo de senescencia retrasada en una estructura de planta.

2.Procedimiento de la reivindicación 1, en donde la proteína de dominio B3 es SEQ ID Nº 18.

3. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde la proteína de dominio B3 es SEQ ID Nº 2.

4. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde la proteína de dominio B3 es SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12 ó SEQ ID Nº 14.

5. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el promotor de planta es un promotor constitutivo.

6. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el promotor de planta es un promotor especifico de tejido.

7. Procedimiento de la reivindicación 6, en donde el promotor de planta es un promotor específico de flores.

8. Procedimiento de la reivindicación 6, en donde el promotor de planta dirige ventajosamente la expresión en óvulos, pistilos, anteras, frutos, cubierta de semillas, tejidos vasculares, tejidos provasculares o meristemos apicales.

9. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el promotor de planta es un promotor inducible por senescencia.

10. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el paso de selección comprende la selección de una planta que exhiba una senescencia retrasada en una estructura de planta vegetativa.

11. Procedimiento de la reivindicación 10, en donde la estructura vegetativa es una hoja, tallo o raíz.

12. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el paso de selección comprende la selección de una planta con senescencia retrasada en un óvulo, flor, pistilo, antera o fruto.

13. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde la construcción se introduce por un entrecruzamiento sexual.