ES2312166T3 - Acelerador del crecimiento plaquetario. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN POLIPEPTIDO EN EL CUAL AL MENOS UN GRUPO AMINO, CARBOXILO, MERCAPTO O GUANIDINO EN UNA MOLECULA POLIPEPTIDICA QUE TIENE UNA COLONIA DE GRANULOCITOS HUMANOS QUE ESTIMULAN LA ACTIVIDAD FACTORIAL ES QUIMICAMENTE MODIFICADO POR UN AGENTE QUIMICO MODIFICANTE Y UN PROMOTOR PARA LA PRODUCCION DE PLAQUETAS QUE COMPRENDE DICHO POLIPEPTIDO, UN METODO PARA EL TRATAMIENTO DE UN PACIENTE CON RECUENTOS DE TROMBOCITOS DISMINUIDOS COMPRENDE ADMINISTRAR UNA CANTIDAD EFICAZ DE DICHO POLIPEPTIDO AL PACIENTE, EL USO DE DICHO POLIPEPTIDO PARA LA PRODUCCION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS LAS CUALES SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO DEL PACIENTE CON RECUENTOS DE TROMBOCITOS DISMINUIDOS Y LAS COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DEL PACIENTE CON RECUENTOS DE TROMBOCITOS DISMINUIDOS, QUE COMPRENDE UNA DOSIS EFICAZ DE DICHO POLIPEPTIDO EN FORMA DE UNA DOSIFICACION FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE CON UN SOPORTE FARMACEUTICO ACEPTABLE.
Description
Acelerador del crecimiento plaquetario.
La invención se refiere a un polipéptido humano
factor estimulante de colonias de granulocitos modificado
químicamente que se produce mediante modificación química de por lo
menos uno de los grupos amino, carboxilo, mercapto o guanidino en
una molécula de polipéptido que presenta actividad de factor humano
estimulante de colonias de granulocitos (en adelante denominado
hG-CSF) y un agente estimulante de la producción de
plaquetas que comprende dicho polipéptido, a un procedimiento para
tratar un paciente con recuentos plaquetarios reducidos, que
comprende administrar una cantidad efectiva de dicho polipéptido en
el paciente, a la utilización de dicho polipéptido para la
producción de composiciones farmacéuticas que resulten útiles para
el tratamiento de pacientes con recuentos plaquetarios reducidos, y
a composiciones para tratar pacientes con recuentos plaquetarios
reducidos, que comprende una cantidad efectiva de dicho polipéptido
en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable
conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
La interleuquina 6 [F. Takatsuki et al.,
Cancer Research 50:2885-2890, 1990], el factor
inhibidor de la leucemia [D. Metcalf et al., Blood
76:50-56, 1990], factor P de células madre [P. Hunt
et al., Blood 80:904-911, 1992], factor
estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF;
solicitud de patente japonesa publicada examinada nº 11705/94) y la
trombopoyetina [de Sauvage et al., Nature 369:533, 1994] son
conocidos como sustancias que posiblemente estimulan la producción
de plaquetas. Además, la conagenina [Japanese Cancer Association nº
2235, 1992], Y25510 [The 113rd annual meeting of Pharmaceutical
Society of Japan, PB13-22, 1993], derivados
2-piranona [solicitud de patente japonesa publicada
no examinada nº 213758/93] y FK565 (documento WO 93/23066)
son conocidos como sustancias de bajo peso molecular que
posiblemente estimulan la producción de plaquetas.
Es sabido que hG-CSF es uno de
los polipéptidos esenciales para el crecimiento y la diferenciación
de las células madre hematopoyéticas que conduce a la formación de
diversos tipos de hematócitos, y ejerce un efecto estimulante del
crecimiento de la mayoría de granulocitos y en particular de los
neutrófilos.
Como polipéptido modificado que muestra
actividad de hG-CSF en la que los grupos se han
modificado químicamente con un agente modificador químico, es
conocido un hG-CSF químicamente modificado
sustituyendo por lo menos un grupo amino del polipéptido que
muestra actividad de hG-CSF por un derivado de
polietilenglicol (solicitud de patente japonesa publicada no
examinada nº 316400/89, documento WO nº 90/06952, solicitud de
patente japonesa publicada no examinada nº 32559/92). No existe la
constancia de que dichos polipéptidos hG-CSF
químicamente modificados ejerzan un efecto estimulador de la
producción de plaquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere a un polipéptido
químicamente modificado en el que por lo menos uno de los grupos
amino, carboxilo, mercapto o guanidina en la molécula de polipéptido
que presenta actividad de hG-CSF se modifica
químicamente, y a un agente estimulante de la producción de
plaquetas que comprende dicho polipéptido, a un procedimiento para
tratar un paciente con un recuento de plaquetas reducido, que
comprende administrar una cantidad efectiva de dicho polipéptido en
el paciente, a la utilización de dicho polipéptido para la
producción de composiciones farmacéuticas que resultan útiles para
el tratamiento de pacientes con recuentos plaquetarios reducidos, y
a composiciones para tratar un paciente con recuentos plaquetarios
reducidos, que comprende una cantidad efectiva de dicho polipéptido
en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable
conjuntamente con un portador farmacéuticamente
aceptable.
aceptable.
Más específicamente, la invención se refiere a
un polipéptido químicamente modificado en el que por lo menos uno
de los grupos amino, carboxilo, mercapto o guanidino en la molécula
de polipéptido que presenta actividad de hG-CSF se
modifica químicamente con un derivado polialquileno o un copolímero
de estireno-ácido maleico, y un agente estimulante de la producción
de plaquetas que comprende dicho polipéptido, a un procedimiento
para tratar un paciente con recuentos plaquetarios reducidos, que
comprende administrar una cantidad efectiva de dicho polipéptido en
el paciente, a la utilización de dicho polipéptido para la
producción de composiciones farmacéuticas que resultan útiles para
el tratamiento de pacientes con recuentos plaquetarios reducidos, y
a composiciones para tratar un paciente con recuentos plaquetarios
reducidos, que comprende una cantidad efectiva de dicho polipéptido
en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable con un
portador farmacéuticamente aceptable.
Entre los derivados polialquilenglicol se
incluyen, por ejemplo, derivados de polietilenglicol, derivados de
polipropileno y derivados copolímero
polietileno-polipropileno.
\newpage
Haciendo referencia más específica a los agentes
para modificar químicamente por lo menos uno de entre los grupos
amino, carboxilo, mercapto y guanidino, el agente modificador
químico de grupos amino incluye, por ejemplo, derivados de
polialquilenglicol que presenta la fórmula (I):
(I)R^{1}-(M)_{n}-X-R^{2}
en la que R1 representa un grupo
alquilo o alcanoilo; M representa la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- -OCH_{2}CH_{2}-, \ -OCH_{2}CH_{2}CH_{2}-,
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- -(OCH_{2}CH_{2})_{r}-(OCH_{2}CH_{2}CH_{2})_{s}-
\vskip1.000000\baselineskip
en la que r y s presentan cualquier
valor integral positivo variable, que son iguales o diferentes; n
presenta cualquier valor integral positivo variable; X representa
un enlace simple, O, NH o S; y R^{2} representa la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{3} representa OH,
halógeno o la
fórmula:
-X^{a}-(M^{a})_{na}-R^{1a}
en la que X^{a}, M^{a},
R^{1a} y na presentan los mismos significados que X, M, R^{1} y
n anteriormente indicados, respectivamente, e Y representa halógeno
o la
fórmula:
-Z-(CH_{2})P-(O)_{m}-W
en la que Z representa O, S o NH; W
representa un grupo carboxilo, un derivado activo del mismo, o la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{4} representa un
grupo alquilo; y Hal representa halógeno, y p presenta un valor
integral de 1 a 6; y m presenta un valor de 0 ó
1,
-(CO)_{ma}-(CH_{2})_{t}-W^{a}
en la que W_{a} y ma presentan
los mismos significados que W y m anteriormente indicados,
respectivamente; y t presenta un valor integral de 0 a 6,
o
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que Hal^{a}, pa y R^{4a}
presentan los mismos significados que Hal, p y R^{4} mencionados
anteriormente, respectivamente, y copolímeros de estireno-ácido
maleico que presentan la fórmula
(II):
\vskip1.000000\baselineskip
en la que u y v presentan cualquier
valor integral positivo variable, que son iguales o diferentes; y
R^{5} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo. Entre
los agentes modificadores químicos de grupo carboxilo se incluyen,
por ejemplo, derivados polialquilenglicol que presentan la fórmula
(III):
(III)R^{1b}-(M^{b})_{nb}-NH_{2}
en la que M_{b}, R^{1b} y nb
presentan los mismos significados que M, R^{1} y n mencionados
anteriormente, respectivamente. El agente modificador químico de
grupo mercapto son derivados polialquileno que presenta la fórmula
(IV):
en la que M_{c}, R^{1c} y nc
presentan los mismos significados que M, R^{1} y n anteriormente
identificados, respectivamente, y los copolímeros de estireno-ácido
maleico que presentan la fórmula
(V):
en la que R^{5a}, ua y va
presentan los mismos significados que R^{5}, U y V anteriormente
identificados, respectivamente, y uno de entre Q y R representan un
grupo carboxilo y el otro representa la
fórmula:
en la que pb presenta el mismo
significado que p anteriormente identificada. El agente modificador
químico de grupo guanidino incluye, por ejemplo, derivados
polialquilenglicol que presentan la fórmula
(VI):
en la que q presenta un valor de 1
ó 2, y M^{d}, R^{1d} y nd presentan los mismos significados que
M, R^{1} y n anteriormente indicados,
respectivamente.
En el grupo modificador químico tal como se
utiliza en la presente invención, el grupo alquilo representado por
R^{1}, R^{4} y R^{5} incluye, por ejemplo, grupos lineales o
ramificados que presentan entre 1 y 18 átomos de carbono, tales
como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo,
sec-butilo, terc-butilo, pentilo,
isopentilo, hexilo, isohexilo, heptilo, octilo, isooctilo, decilo,
dodecilo, tetradecilo, hexadecilo y octadecilo; los grupos
alcanoilo representados por R^{1} incluyen, por ejemplo, grupos
lineales o ramificados que presentan entre 1 y 18 átomos de
carbono, tales como formilo, acetilo, propionilo, butirilo,
valerilo, pivaroilo, pentanoilo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo y
estearoilo; el halógeno representado por R^{3}, Y y Hal incluye,
por ejemplo, átomos de cloro, bromo, y yodo; los derivados activos
de un grupo carboxilo representados por W incluyen, por ejemplo,
haluros de ácido, tales como cloruro ácido y bromuro ácido, ésteres
activos, tales como éster p-nitrofenilo y
N-oxisuccinimida, y anhídridos mixtos, incluyendo
carbonato de monoetiléster y carbonato de monoisobutilo. Los
símbolos n, r, s, u y v se refieren a valores integrales positivos
de entre 1 y 1.000, y preferentemente n es 7 a 500, y r, s, u y v
son, cada uno, entre 1 y 200. Los pesos moleculares de grupos
modificadores químicos se encuentran comprendidos entre 500 y
100.000, y preferentemente entre 1.000 y 40.000.
Como los polipéptidos que presentan actividad de
hG-CSF de la presente invención, puede utilizarse
cualquier péptido que presente actividad de hG-CSF,
y preferentemente, los polipéptidos que comprenden la secuencia de
aminoácidos de SEC ID nº 1, una parte de dicha secuencia, o la
secuencia de aminoácidos, en la que una parte de los aminoácidos en
dicha secuencia se sustituye por otros aminoácidos [Nature 319:415,
1986; solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº
267292/88, solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº
299/88 y patente WO nº 87/01132]. Una
forma de realización de polipéptidos que comprenden la secuencia de
aminoácidos en la que una parte de la secuencia se sustituye por
otros aminoácidos (derivados de hG-CSF) se ilustra
en la
Tabla 1.
Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\newpage
En la molécula de los péptidos que presentan
actividad de hG-CSF en la que generalmente se
encuentra presente más de un grupo con respecto a cada grupo amino,
carboxilo, mercapto y guanidino, resulta suficiente que uno de
estos grupos se modifique químicamente.
Los péptidos que presentan actividad de
hG-CSF pueden modificarse químicamente mediante la
reacción de los agentes químicos, incluyendo derivados de
polialquilenglicol, tales como derivados de polietilenglicol,
derivados de polipropilenglicol y derivados de copolímero de
polietilenglicol-polipropilenglicol, y derivados de
copolímero de estireno-ácido maleico con el polipéptido (derivados
de hG-CSF) que comprenden grupos amino, carboxilo,
mercapto o guanidino.
Como procedimiento para la reacción del
polipéptido que comprende grupos amino, carboxilo, mercapto o
guanidino con derivados polietilenglicol o grupos
polipropilenglicol, pueden utilizarse los procedimientos
convencionales [por ejemplo la solicitud de patente japonesa
publicada no examinada nº 316400/89, Biotech. Lett.
14:559-564, 1992, BIO/TECHNOLOGY
8:343-346, 1990] o modificaciones de los mismos.
Como procedimiento para la reacción con
derivados de copolímero de
polietilenglicol-polipropilenglicol, pueden
utilizarse los procedimientos convencionales [por ejemplo la
solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 59629/84,
la solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº
176586/85, patente WO nº 89/06546, patente EP nº 0539167A2] o
modificaciones de los mismos.
Como procedimiento para la reacción con
derivados de copolímero de estireno-ácido maleico, pueden utilizarse
los procedimientos convencionales [por ejemplo BIO INDUSTRY
5:499-505, 1988; la solicitud de patente japonesa
publicada no examinada nº 85922/89, la solicitud de
patente japonesa publicada no examinada nº 99573/89] o
modificaciones de los mismos.
A título de ejemplo del péptido químicamente
modificado con actividad de hG-CSF, péptidos
modificados obtenidos mediante unión de por lo menos un grupo amino
de hG-CSF con un grupo descrito por la fórmula (Ia)
siguiente:
(Ia)R^{1}-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-X-R^{2a}
en la que R^{1} representa un
grupo alquilo o alcanoilo; n presenta cualquier valor integral
positivo variable; X representa un enlace sencillo, O, NH o S; y
R^{2a} representa la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{3a} representa OH,
halógeno o la
fórmula:
-X^{a}-(CH_{2}CH_{2}O)_{na}-R^{1a}
en la que X_{a}, R^{1a} y na
son idénticos a dichos X, R^{1} y n, respectivamente, e Ya
representa un enlace sencillo o la
fórmula:
-Z-(CH_{2})_{p}-(O)_{m}-CO-
en la que Z representa O, S o NH; p
presenta un valor integral de entre 1 y 6; y m presenta un valor de
0 ó
1,
-(CO)_{ma}-(CH_{2})_{t}-CO-
en la que ma es idéntico a dicho m;
y t presenta un valor integral de entre 0 y
6.
En cada grupo de la fórmula (Ia), el grupo
alquilo, grupo alcanoilo, halógeno y valor integral positivo se
definen de manera similar a aquellos en dicha fórmula (I).
Además, la presente invención puede proporcionar
un hG-CSF químicamente modificado nuevo o un
derivado de hG-CSF modificado químicamente.
Como nuevo hG-CSF modificado
químicamente, péptidos modificados obtenidos mediante unión de por
lo menos un grupo amino y un grupo descrito por la fórmula (Ib)
siguiente:
en la que R^{1} representa un
grupo alquilo o alcanoilo; M representa la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- -OCH_{2}CH_{2}-, \ -OCH_{2}CH_{2}CH_{2}-
o
- \quad
- -(OCH_{2}CH_{2})_{r}-(OCH_{2}CH_{2}CH_{2})_{s}-
\vskip1.000000\baselineskip
en la que r y s presentan cualquier
valor integral positivo variable, que son iguales o diferentes; n
presenta cualquier valor integral positivo variable; X representa
un enlace sencillo, O, NH o S; R^{3b} es idéntico a R^{3a}; Z
representa O, S o NH; y p presenta un valor integral de entre 1 y
6.
Entre 1 y 5 moléculas de derivados de
polietilenglicol, derivados de polipropilenglicol, derivados de
copolímero de polietilenglicol-polipropilenglicol o
derivados de copolímero de estireno-ácido maleico se unen a
hG-CSF químicamente modificado o derivados de
hg-CSF modificado químicamente. En consecuencia, el
hG-CSF modificado químicamente y los derivados de
hG-CSF químicamente modificados se utilizan en la
forma de una mezcla de entre 1 y 5 combinaciones moleculares, o
cada combinación fraccionada. En el fraccionamiento de
hG-CSF químicamente modificado o derivados de
hG-CSF modificados químicamente, pueden aplicarse
diversas cromatografías, tales como la cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase
reversa y cromatografía hidrofóbica y fraccionamiento con sulfato
amínico, que habitualmente se utilizan en el fraccionamiento de los
polipéptidos de cadena larga.
El grado de modificación química se confirma
mediante la reducción en grupos libres, que se determina mediante
el seguimiento de la morbilidad de hG-CSF modificado
químicamente utilizando electroforesis en gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida.
El ensayo de proteínas en la invención se llevó
a cabo siguiendo los procedimientos experimentales siguientes.
Procedimiento experimental
1
En la presente invención, se determinó la
concentración de proteínas mediante el procedimiento de Lowry et
al. [Lowry, O.H. et al., J. Biol. Chem. 193:265,
1951].
Procedimiento experimental
2
Según el procedimiento de Laemmli [U.K. Laemmli:
Nature 227:680, 1970], se llevó a cabo electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y tras teñir las proteínas
separadas en dicho gel con azul brillante de Coomassie, se
determinó la concentración de proteínas utilizando un escáner
cromatográfico (CS-930, Shimadzu Corporation).
Los ejemplos experimentales siguientes sirven
para ilustrar la actividad farmacológica de hG-CSF
químicamente modificado y derivados de hG-CSF
químicamente modificados.
Ejemplo experimental
1
La actividad de hG-CSF
químicamente modificado y de derivados de hG-CSF
químicamente modificados obtenidos en los ejemplos de referencia 4,
6, 8, 12, 15, 17, 19, 20 siguientes y en el Ejemplo 4 en células de
médula ósea de ratón se determinó siguiendo el procedimiento de
Okabe et al. [M. Okabe et al., Blood 75:1788, 1990].
Además, la actividad estimuladora del crecimiento contra las células
NSF-60 [K. Holmes et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:6687, 1985] según el procedimiento de Asano et
al. [Asano et al., Jpn. Pharmacol. Ther. 19:2767, 1991].
Los resultados se ilustran en la Tabla 2.
Ejemplo experimental
2
En los estudios ilustrados en las Tablas 3 y 4,
se utilizaron 5 ratones BALB/c macho (10 semanas de edad), y en el
estudio ilustrado en la Tabla 5, se utilizaron 4 ratones BALB/c
macho (6 semanas de edad). Tras 3 Gy de irradiación de cuerpo
completo (en adelante denominada Rx) por ratón a partir de una
fuente radioactiva de ^{137}Cs (RI-433, Toshiba
Corporation), dichos ratones se criaron en una jaula limpia en un
entorno ambiental específico libre de patógenos. Se encontraban
disponibles agua y alimento ad libitum. Como controles no
tratados, se criaron de manera similar ratones no irradiados.
\newpage
El factor hG-CSF químicamente
modificado y los derivados de hG-CSF modificados
químicamente ilustrados en las Tablas 3 a 5 se disolvieron en
solución salina fisiológica, respectivamente, y se administraron
subcutáneamente en una sola dosis de 5 \mug/0,2 ml
por ratón, en la que la solución de un derivado de
hG-CSF modificado químicamente (tipo Tri) se
administró una vez el día después de Rx, o dos veces el día después
de Rx, y el quinto día en el estudio lustrado en la Tabla 3, y
hG-CSF modificado químicamente y los derivados de
hG-CSF modificados químicamente se administraron una
vez al día tras Rx en los estudios ilustrados en las Tablas 4 y
5.
Se recogió secuencialmente sangre de la vena
murina del fondo del ojo, y se determinó el recuento de plaquetas
utilizando un contador celular automático (CC-180A,
TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., Ltd.). Los resultados se muestran en
las Tablas 3 a 5.
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En los ratones que recibieron 3 Gy del grupo de
irradiación de cuerpo completo, el recuento plaquetario se redujo
marcadamente, alcanzó el mínimo entre el octavo y el noveno días
después de Rx, y se incrementó a continuación gradualmente; sin
embargo, durante los estudios, el recuento plaquetario no se
recuperó hasta el nivel previo a la irradiación. Sin embargo, en
los ratones que recibieron hG-CSF químicamente
modificado y derivados de hG-CSF químicamente
modificados, se suprimió la reducción del recuento plaquetario, el
recuento se incrementó marcadamente entre el octavo y el noveno día
tras la irradiación, y el recuento se recuperó por completo hasta
el nivel previo a la irradiación entre el undécimo y el duodécimo
día después de la irradiación. Asimismo, se observó un efecto
similar en el grupo en el que se administraron los agentes el día
después de Rx y el quinto día.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
3
Se administró 5-fluorouracilo
(5-FU, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), un agente
antitumoral, intraperitonealmente a 5 ratones BALB/C macho (9
semanas de edad) a una dosis de 100 mg/kg. El día después de la
administración de 5-FU, se disolvió
hG-CSF modificado químicamente (tipo tri) obtenido
en el Ejemplo de referencia 4 en solución salina fisiológica, y se
administró subcutáneamente en una dosis única de 5 \mug/0,2 ml por
ratón. Se recogió secuencialmente sangre de la vena murina del
fondo del ojo, y se determinaron los recuentos plaquetarios
utilizando un contador celular automático. Se muestran los
resultados en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En el grupo de administración de
5-FU, el recuento plaquetario se redujo a partir del
cuarto día de administración, alcanzó el mínimo el quinto día, y
después se recuperó hasta el nivel previo a la administración el
noveno día. En el grupo de hG-CSF químicamente
modificado, se suprimió la reducción del recuento plaquetario, y se
observó un claro efecto estimulador de la recuperación tras el sexto
día. El día 7 después de la administración, el recuento plaquetario
se había recuperado hasta el nivel previo a la administración.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
4
Tras 10 Gy de Rx a partir de una fuente
radioactiva de ^{137}Cs (RI-433, Toshiba
Corporation), se criaron 4 ratones BALB/c macho (8 semanas de edad)
en una jaula limpia en un entorno ambiental SPF. El día después de
la irradiación, se les trasplantaron 2 x 10^{6} células de médula
ósea (sin lana de nilón adherente) de la misma cepa. Tras 2 horas,
el hG-CSF químicamente modificado (tipo tri)
obtenido en el Ejemplo de referencia 4 se disolvió en solución
salina fisiológica, y se administraron subcutáneamente en una dosis
única de 10 \mug/0,2 ml, 20 \mug/0,2 ml o 40 \mug/0,2 ml por
ratón. Se recogió secuencialmente sangre de la vena murina en el
fondo del ojo y se determinaron los recuentos plaquetarios
utilizando un contador celular automático. Se muestran los
resultados en la Tabla 7.
Todos los ratones que recibieron 10 Gy de
irradiación de cuerpo completo experimentaron recuentos plaquetarios
seriamente reducidos y murieron dentro de las 2 semanas. Los
ratones trasplantados con células de médula ósea no murieron, pero
la reducción de los recuentos plaquetarios continuó durante más de 2
semanas. Los ratones trasplantados con médula ósea que recibieron
hG-CSF modificado químicamente mostraron el efecto
estimulador de la recuperación de los recuentos plaquetarios de una
manera dependiente de la dosis tras el día undécimo, y se
recuperaron a más del nivel previo a la irradiación el día
decimoquinto tras la irradiación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
5
Los 4 ratones BALB/C macho de 5 a 10 semanas de
edad recibieron el hG-CSF (tipo tri) modificado
químicamente obtenido en el Ejemplo de referencia 4 en una dosis
única de 25 \mug por ratón. En otro ensayo, tras la
administración de una dosis de 20 \mug, se administraron 20 \mug
adicionales a cada uno los días 1, 5 y 9 tras la administración. En
ambos ensayos, se siguió la mortalidad, encontrando que los ratones
no experimentaron cambios en la condición sana y que no murió
ningún ratón.
Tal como se describe en los ejemplos
experimentales, el hG-CSF modificado químicamente y
derivados de hG-CSF modificados químicamente
mostraron un claro efecto estimulador hacia la recuperación de los
recuentos plaquetarios desde recuentos plaquetarios seriamente
reducidos causados por irradiación, quimioterapia para el cáncer o
trasplante de médula ósea, indicando de esta manera su utilidad como
estimulador de la producción de plaquetas.
Además de hG-CSF modificado
químicamente y derivados de hG-CSF modificados
químicamente, pueden utilizarse otras citoquinas o estimuladores de
bajo peso molecular de la producción plaquetaria. Como otras
citoquinas, pueden utilizarse interleuquina 3, interleuquina 6,
factor inhibidor de leucemia, factor de células madre, factor
estimulador de colonias de macrófagos, trombopoyetina. Como
estimulador de bajo peso molecular de la producción plaquetaria,
existen la conagenina, Y25510, derivados de
2-piranona y FK565.
El hG-CSF modificado
químicamente y los derivados de hG-CSF modificados
químicamente pueden utilizarse por sí mismos o en diversas formas
de dosificación. Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden producirse mediante la mezcla uniforme de una
dosis efectiva como componente activo del hG-CSF
modificado químicamente y de derivados de hG-CSF
modificados químicamente y un portador farmacológicamente aceptable.
Preferentemente, estas composiciones farmacéuticas se utilizan en
una forma de dosificación adecuada para la administración mediante
inyección.
Pueden prepararse preparaciones inyectables
utilizando hG-CSF modificado químicamente o
derivados de hG-CSF modificados químicamente, y
portadores, tales como agua destilada, una solución salina, una
solución de glucosa, o una mezcla de una solución salina y una
solución de glucosa. En esta preparación, según un procedimiento
convencional, las preparaciones pueden prepararse en la forma de una
solución, de una suspensión o de una dispersión, utilizando un
agente auxiliar adecuado. Además, pueden prepararse preparaciones
liofilizadas mediante la liofilización de dichas preparaciones.
Aunque la condición de liofilización no se encuentra específicamente
limitada, habitualmente dichas preparaciones se congelan a menos de
-50ºC durante 1 a 5 horas, se secan a una temperatura de
almacenamiento de entre -20ºC y 0ºC, y en un vacío de entre 50 y 150
mTorr durante 24 a 48 horas, y posteriormente a una temperatura de
almacenamiento de entre 10ºC y 30ºC, y en un vacío de entre 50 y
100 mTorr durante 16 a 24 horas, obteniendo la preparación
liofilizada.
El estimulador de la producción plaquetaria de
la invención puede incluir diversos portadores farmacéuticos
comunes, constituyentes de remedio, diluyentes, estabilizadores o
inhibidores de la adsorción.
Aunque la dosis y la frecuencia de
administración se deciden dependiendo de la forma de dosificación,
edad del paciente, peso corporal, enfermedad y condiciones
subjetivas, habitualmente, en un adulto, 15 \mug a 1,5 mg,
preferentemente 25 a 500 \mug del hG-CSF
modificado químicamente o derivados de hG-CSF
modificados químicamente, se administran 1 a 7 veces por semana.
Como vía de administración se utiliza la inyección intravenosa o
subcutánea. El estimulador de producción plaquetaria de la presente
invención, además, se utiliza como supositorio o gotas nasales.
La invención se ilustra además mediante los
ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó la inyección compuesta de las
composiciones siguientes mediante el procedimiento descrito a
continuación.
Se disolvieron 10 mg del derivado de
hG-CSF modificado químicamente obtenido en el
Ejemplo de referencia 4, en 80 ml de solución de PBS y se añadieron
2 mg de polisorbato 80 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 100
mg de albúmina de suero humana (Sigma, Ltd.) y 1,5 g de
D-manitol, y se ajustó a un volumen de 100 ml con
PBS. Tras la filtración aséptica a través de un filtro de membrana
desechable con un tamaño de poro de 0,22 \mum, se añadió
asépticamente cada 2 ml de la solución resultante a un vial de
vidrio para obtener la inyección (que contenía 0,2 mg de
ingredientes activos por vial).
Prescripción
Se preparó la inyección compuesta de las
composiciones siguientes mediante el procedimiento descrito a
continuación.
Se disolvieron 50 mg del derivado de
hG-CSF modificado químicamente obtenido en el
Ejemplo de referencia 4, en 80 ml de solución de PBS y se añadieron
2 mg de polisorbato 80 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y 1,5
g de D-manitol, y se ajustó a un volumen de 100 ml
con PBS. Tras la filtración aséptica a través de un filtro de
membrana desechable con un tamaño de poro de 0,22 \mum, se añadió
asépticamente cada 2 ml de la solución resultante a un vial de
vidrio para obtener la inyección (que contenía 1,0 mg de
ingredientes activos por vial).
Prescripción
Se preparó la inyección compuesta de las
composiciones siguientes mediante el procedimiento descrito a
continuación.
Se disolvieron 10 mg del derivado de
hG-CSF modificado químicamente obtenido en el
Ejemplo de referencia 4, en 80 ml de solución de PBS, y se
añadieron 2 mg de polisorbato 80 (Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.), 100 mg de albúmina de suero humano (Sigma Ltd.) y 1,5 g de
D-manitol y se ajustó a aproximadamente pH 5 con
ácido fosfórico y a un volumen de 100 ml con agua destilada para
inyección. Tras la filtración aséptica a través de un filtro de
membrana desechable con un tamaño de poro de
0,22 \mum, se añadió asépticamente cada 2 ml de la solución
resultante a un vial de vidrio, obteniendo la inyección (que
contenía 0,2 mg de ingredientes activos por vial).
Prescripción
Se ajustaron 35 ml de tampón fosfato 50 mM (pH
7,3) que contenía 31,5 mg del derivado de hG-CSF
obtenido en el Ejemplo de referencia 3 a pH 8,7 con hidróxido
sódico al 5%, y se le añadieron 5,0 g de 2,4-bis
(o-metoxipolietilenglicol)-6-(1-aminopropiloxicarboniloxi-4'-nitrofenil)-s-triazina,
y la reacción se llevó a cabo a 4ºC durante 7 días. A dicha
solución de reacción, se añadió sulfato amónico a una concentración
final de 0,7 M y se cargó en una columna (2,5 cm x 6,1 cm = 30 ml)
de butil-Toyopearl 650M (Tosoh Corporation)
equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que
contenía sulfato amónico 0,7 M a un caudal de 30 ml/hora. Tras
lavar la columna con 90 ml de tampón Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5) que contenía sulfato amónico 0,7 M a un caudal de 30
ml/hora, se llevó a cabo la elución con un gradiente lineal
decreciente de concentración de sulfato amónico de 0,7 a 0 M en
tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en un volumen total
de 180 ml a un caudal de 30 ml/hora. Se eluyó la sustancia deseada
a concentraciones de sulfato amónico de entre 0,47 M y 0,16 M.
Se añadió sulfato amónico a una concentración
final de 0,7 M a la fracción eluida, y se cargó en una columna (2,5
cm x 12 cm = 60 ml) de butil-Toyopearl 650 M (Tosoh
Corporation) equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5) que contenía sulfato amónico 0,7 M a un caudal de 60
ml/hora. Tras lavar la columna con 180 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía sulfato amónico
0,7 M a un caudal de 60 ml/hora, se llevó a cabo la elución con un
gradiente lineal decreciente de concentración de sulfato amónico de
0,7 a 0 M en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en un
volumen total de 600 ml a un caudal de 60 ml/hora. La sustancia
deseada se eluyó a concentraciones de sulfato amónico de entre 0,38
M y 0,11 M. 200 ml de la fracción eluida se ultrafiltraron [Mr de
corte de peso molecular nominal límite 10.000:YM10 (Amicon Co.,
Ltd.) y se concentró a 6,5 ml. Dicha solución concentrada se cargó
en una columna (2,5 cm x 45 cm = 220 ml) de Sephacryl
S-300 (Pharmacia Co., Ltd.) equilibrada con PBS a
un caudal de 44 ml/hora, y se pasó a continuación PBS al mismo
caudal.
Tras el inicio de PBS, se eluyó el
hG-CSF modificado químicamente (tipo tri) en el que
3 moléculas de ácido carboxílico del polietilenglicol unidas a una
molécula de hG-CSF se eluyeron entre 92 ml y 100 ml,
el derivado de hG-CSF modificado químicamente (tipo
di) en el que 2 moléculas de ácido carboxílico del polietilenglicol
se eluyeron entre 100 ml y 104 ml, el derivado de
hG-CSF modificado químicamente (tipo mono) en el que
una molécula de ácido carboxílico del polietilenglicol se eluyó
entre 116 ml y 120 ml, con 1,0 mg (rendimiento:
3,0%), 1,4 mg (rendimiento: 4,4%) y 1,1 mg (rendimiento: 3,6%).
El número de moléculas de derivados de
polietilenglicol unidas a una molécula del derivado de
hG-CSF de tipo mono, di y tri se confirmó mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Además, en los ejemplos de referencia
siguientes, se confirmó el número de moléculas ligantes de derivados
de polietilenglicol y la pureza del derivado de
hG-CSF modificado químicamente mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Ejemplo de referencia
1
Se disolvieron 20 g de metoxipolietilenglicol
con un peso molecular medio de 4.000 (Nippon Oil & Fats Co.,
Ltd.) en 100 ml de tolueno anhidro que contenía 10 g de carbonato
sódico anhidro y se calentaron a 110ºC durante 30 minutos y después
se añadieron 500 mg de cloruro cianúrico, y se calentó a 110ºC
durante 24 horas. Se eliminaron las sustancias residuales, y se
añadieron 300 ml de éter de petróleo para la precipitación, y dichos
precipitados se lavaron varias veces con éter de petróleo,
obteniendo 10 g del cloruro objetivo (rendimiento: 50%).
Ejemplo de referencia
2
Se disolvieron 500 mg de los cloruros obtenidos
en el Ejemplo de referencia 1 en 9 ml de tetrahidrofurano
anhidro. Por otra parte, la solución anteriormente indicada se
añadió a una solución en la que se disolvieron 10 mg de ácido
gamma-aminobutírico y 28 \mul de
trietilamina en 1 ml de N,N-dimetilformamida
anhidra, y después se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas.
Tras el secado bajo presión reducida, se añadieron 30 ml de cloruro
de metileno y 15 ml de tampón fosfato 10 mM (pH 10) para la
distribución. La fase superior se ajustó a pH 1 con ácido
hidroclórico 2 N, después se añadieron 30 ml de cloruro de metileno
y se llevó a cabo nuevamente la distribución. La fase inferior se
fraccionó, se secó con sulfato sódico anhidro, después se filtró y
se concentró bajo presión reducida, obteniendo 150 mg del ácido
carboxílico objetivo (rendimiento: 30%).
Se disolvieron 150 mg de dicho ácido carbónico y
3 mg de N-hidroxisuccinimida en 1 ml de cloruro de
metileno anhidro, y tras la adición de 6 mg de
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) sobre hielo, se
agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. Se filtró la
diciclohexilurea (DCU) generada, se secó bajo presión reducida,
obteniendo 100 mg del éster objetivo (rendimiento: 67%).
Ejemplo de referencia
3
Los derivados de hG-CSF (Tabla
1, compuesto k), que comprenden la secuencia de aminoácidos definida
en la SEC ID nº 1 en la que el primer aminoácido, la treonina, se
sustituyó por alanina, el tercer aminoácido, leucina, se sustituyó
por treonina, el cuarto aminoácido, glicina, se sustituyó por
tirosina, el quinto aminoácido, prolina, se sustituyó por arginina,
y el decimoséptimo aminoácido, cisteína, se sustituyó por serina,
respectivamente, se obtuvo de la manera siguiente:
Se cultivó E. coli W3110 str A
(Escherichia coli EcfBD28 FERM BP-1479) que
presentaba el plásmido pCfBD28 que comprendía ADN codificante de
dicho derivado de hG-CSF, en medio LG [10 g de
Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de
cloruro sódico y 1 g de glucosa disueltos en 1.000 ml de agua, y se
ajustó a pH 7,0 con NaOH] a 37ºC durante 18 horas y se inocularon 5
ml del cultivo en 100 ml de medio MCG (Na2HPO4 al 0,6%, KH2PO4 al
0,3%, cloruro sódico al 0,5%, ácidos casamino al 0,5%, MgSO4 1 mM,
vitamina B1 4 \mug/ml, pH 7,2) que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina a 30ºC durante 4 a 8 horas, y después 10 \mug/ml de
ácido 3\beta-indolacrílico (en adelante
denominado IAA), se añadió un derivado de triptófano y se continuó
el cultivo durante 2 a 12 horas. Se centrifugó el cultivo a 8.000
rpm durante 10 minutos, se recogieron las células y se lavaron con
cloruro sódico 30 mM y tampón Tris-HCl 30 mM (pH
7,5). Las células lavadas se suspendieron en 30 ml de dicho tampón
y se ultrasonicaron (aparato BRANSON SONIC POWER COMPANY SONIFIER
CELL DISRUPTOR 200, CONTROL DE SALIDA 2) a 0ºC durante 10 minutos.
Dichos residuos ultrasonicados se centrifugaron a 9.000 rpm durante
30 minutos, obteniendo pellets de las células. A partir del pellet,
según el procedimiento de Marston et al. [F.A.O. Marston
et al.: BIO/TECHNOLOGY 2:800, 1984], el derivado de
hG-CSF se extrajo, se purificó, se solubilizó y se
replegó.
Ejemplo de referencia
4
A 100 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,2) que
contenía 300 mg del derivado de hG-CSF obtenido en
el Ejemplo de referencia 3, se le añadieron 800 mg del éster
activado obtenido en el Ejemplo de referencia 2, y la reacción se
llevó a cabo a 4ºC durante 24 horas. Tras la adición de 100 ml de
tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) que contenía sulfato
amónico 0,7 M, la mezcla reaccionada se cargó en una columna (2,2 cm
x 26 cm) de butil-Toyopearl 650M (Tosoh
Corporation) equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM
(pH 8,0) que contenía sulfato amónico 0,35 M a un caudal de 100
ml/hora. Tras lavar la columna con 100 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) que contenía sulfato
amónico 0,35 M a un caudal de 100 ml/hora, se llevó a cabo la
elución con un gradiente lineal decreciente de concentración de
sulfato amónico de 0,35 a 0 M en tampón Tris-HCl 10
mM (pH 8,0) en un volumen total de 400 ml a un caudal de 100
ml/hora. La sustancia deseada se eluyó a concentraciones de sulfato
amónico de entre 0 mM y 250 mM. Se ultrafiltraron 250 ml de la
fracción eluida [Mr de corte o peso molecular nominal límite de
10.000: YM10 (Amicon Co., Ltd.)] y se concentró hasta 10 ml. Dicha
solución concentrada se cargó en una columna (5,6 cm x 40 cm) de
Sephacryl S-200 (Pharmacia Co., Ltd.) a un caudal de
160 ml/hora y después se pasó PBS al mismo caudal.
Tras pasar el PBS, el derivado de
hG-CSF modificado químicamente (tipo tri) en el que
3 moléculas de ácido carboxílico del polietilenglicol se unen a una
molécula de hG-CSF se eluyó entre aproximadamente
360 ml y aproximadamente 400 ml, el derivado de
hG-CSF (tipo di) modificado químicamente en el que 2
moléculas de ácido carboxílico del polietilenglicol unidas se
eluyeron entre aproximadamente 420 ml y aproximadamente 450 ml, el
derivado de hG-CSF modificado químicamente (tipo
mono) en el que una molécula de ácido carboxílico del
polietilenglicol unido se eluyó entre aproximadamente 500 ml y
aproximadamente 530 ml, con 2,1 mg (rendimiento: 7%), 1,5 mg
(rendimiento: 5%) y 1,5 mg (rendimiento: 5%). Los niveles de pureza
de los tipos mono, di y tri son todos superiores a 90%.
Ejemplo de referencia
5
Se disolvieron 4 g de
carboxil-metil-monometoxipolietilenglicol
suficientemente deshidratado (Nippon Oil y Fats Co., Ltd.) (0,8
mmoles) con un peso molecular medio de 5.000 y se disolvieron 184 mg
de N-hidroxisuccinimida (HONSu) en 40 ml de cloruro
de metileno anhidro, y se añadieron 300 mg de DCC sobre hielo en un
flujo de argón, y se agitó durante 30 minutos. Posteriormente, de
nuevo a temperatura ambiente, tras agitar durante 1,5 horas, se
separó por filtración un material insoluble (DCU) y el filtrado se
concentró hasta 16 ml bajo presión reducida. La solución resultante
se añadió gota a gota a 240 ml de éter dietílico anhidro, generando
un precipitado, y tras lavar el precipitado con éter dietílico
anhidro, se eliminó el solvente bajo presión reducida, obteniendo
2,8 g del compuesto objetivo (0,56 mmoles) (rendimiento: 70%).
Ejemplo de referencia
6
Se ajustaron 225 ml de tampón fosfato 50 mM (pH
7,3) que contenía 202,5 mg del derivado de hG-CSF
obtenido en el Ejemplo de referencia 3 a pH 8,1 con hidróxido
sódico al 5% y se le añadieron 1,1 g de
N-hidroxusuccinimida éster de
carboxil-metil-monometoxipolietilenglicol
obtenidos en el Ejemplo de referencia 5 a dicha solución que
contenía hG-CSF y la reacción se llevó a cabo a 4ºC
durante 6 horas. Posteriormente, se obtuvo la solución de reacción
mediante la adición de 0,5 ml de una solución acuosa que contenía
26,7 mg de tris(hidroximetil)-amino metano.
La solución de reacción se centrifugó a 8.000 rpm, 4ºC, durante 40
minutos y se añadió sulfato amónico a 370 ml del sobrenadante a una
concentración final de 0,68 M, y la solución se cargó en una columna
(5 cm x 6,6 cm = 130 ml) de butil-Toyopearl 650M
(Tosoh Corporation) a un caudal de 130 ml/hora.
Tras lavar la columna con 390 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía sulfato amónico
0,68 M a un caudal de 130 ml/hora, se llevó a cabo la elución con
390 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) a un caudal
de 130 ml/hora. Se eluyó la sustancia deseada entre 35 ml y 80 ml.
Se ultrafiltraron 45 ml de la fracción eluida [Mr de corte o peso
molecular nominal límite de 10.000: YM10] y se concentró hasta 30
ml. Dicha solución concentrada se cargó en una columna (5 cm x 51
cm = 1.000 ml) de Sephacryl S-200 (Pharmacia Co.,
Ltd.) equilibrada con PBS a un caudal de 200 ml/hora, y después se
pasó PBS al mismo caudal. El polipéptido hG-CSF
modificado químicamente se eluyó entre aproximadamente 200 ml y
aproximadamente 380 ml tras pasar PBS, que era una mezcla de las
combinaciones de 1 a 4 moléculas de polietilenglicol (tipo mono a
tipo tetra) (peso total: 158 mg; rendimiento: 78%).
\newpage
Ejemplo de referencia
7
Se disolvieron 12 g de
carboxil-metil-monometoxipolietilenglicol
suficientemente deshidratado (Nippon Oil y Fats Co., Ltd.) (1,2
mmoles) con un peso molecular medio de 10.000 y se disolvieron 276
mg de HONSu en 120 ml de cloruro de metileno anhidro, y se le
añadieron 495 mg de DCC sobre hielo en un flujo de argón, y se
agitó durante 30 minutos. Posteriormente, de nuevo a la temperatura
ambiente, tras agitar durante 1,5 horas, se separó mediante
filtración un material insoluble (DCU) y el filtrado se concentró
hasta 48 ml bajo presión reducida. La solución resultante se añadió
gota a gota a 720 ml de éter dietílico anhidro para generar un
precipitado, y tras lavar el precipitado con éter dietílico anhidro,
el solvente se eliminó bajo presión reducida y se obtuvieron 10,0 g
del compuesto objetivo (1,0 mmol) (rendimiento: 83%).
Ejemplo de referencia
8
30 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) que
contenía 40,8 mg de hG-CSF que comprendía la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 1 se ajustaron a pH 8,3
con hidróxido sódico al 5%, y se añadieron a 326 mg de
N-hidroxisuccinimida éster de
carboxil-metil-monometoxipolietilenglicol
obtenido en el Ejemplo de referencia 7 sobre hielo, y la reacción
se llevó a cabo a 4ºC durante 6 horas. Posteriormente, la solución
de reacción se obtuvo mediante adición de 0,1 ml de una solución
acuosa de 3,9 mg de
tris-(hidroximetil)amino-metano. Se añadió
sulfato amónico a la solución de reacción a una concentración final
de 0,7 M y se cargó en una columna (2,5 cm x 8,1 cm = 40 ml) de
butil-Toyopearl 650M (Tosoh Corporation) a un caudal
de 40 ml/hora.
Tras lavar la columna con 120 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía sulfato amónico
0,7 M a un caudal de 40 ml/hora, se llevó a cabo la elución con un
gradiente lineal decreciente de concentración de sulfato amónico de
0,7 a 0 M en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en un
volumen total de 240 ml a un caudal de 40 ml/hora. La sustancia
deseada se eluyó a una concentración de sulfato amónico de entre
0,33 M y 0,05 M. Se ultrafiltraron 90 ml de la fracción eluida [Mr
de corte o peso molecular nominal límite 10.000: YM10 (Amicon Co.,
Ltd.)] y se concentró hasta 6 ml. Se cargó dicha solución
concentrada en una columna (2,5 cm x 45 cm = 220 ml) de Sephacryl
S-300 (Pharmacia Co., Ltd.) equilibrada con PBS a un
caudal de 44 ml/h y después se pasó PBS al mismo caudal. El
polipéptido hG-CSF modificado químicamente se eluyó
entre aproximadamente 60 ml y aproximadamente 102 ml tras iniciar
el PBS, que era una mezcla de las combinaciones de 1 a 4 moléculas
de polietilenglicol (tipo mono a tipo tetra) (peso total: 9,5 mg;
rendimiento: 23%).
Ejemplo de referencia
9
Se ajustaron a pH 8,1 con hidróxido sódico al 5%
338 ml de tampón fosfato 50 M (pH 7,3) que contenían 304,2 mg del
derivado de hG-CSF obtenido en el Ejemplo de
referencia 3, y se le añadieron 4,8 g de
N-hidroxisuccinimida éster de
carboxil-metil-monometoxipolietilenglicol
obtenidos en el Ejemplo de referencia 7 a dicha solución que
contenía hG-CSF sobre hielo, y la reacción se llevó
a cabo a 4ºC durante 6 horas. A continuación, se obtuvo la solución
de reacción mediante la adición de 0,5 ml de una solución acuosa que
contenía 58,1 mg de tris(hidroximetil)amino metano.
La solución de reacción se centrifugó a 8.000 rpm, 4ºC, durante 40
minutos, y se añadió sulfato amónico al sobrenadante a una
concentración final de 0,68 M, y la solución se cargó en una columna
(5 cm x 7,1 cm = 140 ml) de butil-Toyopearl 650M
(Tosoh Corporation) equilibrada con tampón Tris-HCl
10 mM (pH 8,0) que contenía sulfato amónico 0,68 M a un caudal de
140 ml/hora.
Tras lavar la columna con 420 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) que contenía sulfato amónico
0,68 M a un caudal de 140 ml/hora, se llevó a cabo la elución con
420 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) a un caudal
de 140 ml/hora. La sustancia deseada eluyó entre 82 ml y 184 ml. La
fracción eluida, 102 ml, se cargó en una columna (10 cm x 50 cm =
3.900 ml) de Sephacryl S-300 (Pharmacia Co., Ltd.)
equilibrada con PBS a un caudal de 780 ml/hora, y después se pasó
PBS al mismo caudal. El polipéptido hG-CSF
modificado químicamente se eluyó entre aproximadamente 1.600 ml y
aproximadamente 2.070 ml tras iniciar el PBS, que era una mezcla de
las combinaciones de 1 a 4 moléculas de polietilenglicol (tipo mono
a tipo tetra) (peso total: 216 mg; rendimiento: 71%).
Ejemplo de referencia
10
Se disolvieron 412 mg (4,0 mmoles) de ácido
gamma-aminobutírico en 300 ml de tampón borato 0,1 M
(pH 10) y se le añadieron 20 g (2 mmoles) de
6-cloro-2,4-bis(o-metoxipolietilenglicol)-s-triazina
(SEIKAGAKU CORPORATON) sobre hielo y se agitaron a 4ºC durante la
noche. Tras agitar adicionalmente la mezcla a temperatura ambiente
durante 6 horas, la solución se ajustó a pH 1 con ácido hidroclórico
1 N, y se extrajo utilizando cloroformo. La fase cloroformo se secó
con sulfato sódico anhidro, y se separó mediante filtración tras el
secado. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y el sólido
generado se añadió a acetona seca y se disolvió. Dicha solución de
acetona se concentró bajo presión reducida y el ácido carboxílico
objetivo se recristalizó dejándolo reposar a temperatura ambiente,
obteniendo 15,8 g (1,6 mmoles) de dicho sólido cristalino.
\newpage
Se disolvieron 10 g (1,0 mmol) de dicho ácido
carboxílico y 230 mg de N-hidroxisuccinimida en
cloruro de metileno anhidro, y se añadieron a 413 mg de DCC sobre
hielo en un flujo de argón, y se agitaron durante 30 minutos.
Posteriormente, tras mantener nuevamente a temperatura ambiente y
agitar durante 1,5 horas, se separó por filtración un material
insoluble (DCU) y el filtrado se concentró hasta 40 ml bajo presión
reducida. La solución resultante se añadió gota a gota en 600 ml de
éter dietílico anhidro, generando un precipitado, y tras lavar el
precipitado con éter dietílico anhidro, se eliminó el solvente bajo
presión reducida, obteniendo 7,7 g (0,77 mmoles) del compuesto
objetivo (rendimiento: 77%).
Ejemplo de referencia
11
Se ajustaron a pH 7,2 con hidróxido sódico al
5%, 30 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) que contenía 40,8 mg de
hG-CSF que comprendía la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID nº 1, y se le añadieron sobre hielo 326 mg de
N-hidroxisuccinimida éster de
6-(3-carboxipropilamino)-2,4-bis-(o-metoxipolietilenglicol)-s-triazina
obtenidos en el Ejemplo de referencia 10, y la reacción se llevó a
cabo a 4ºC durante 48 horas. A continuación, se obtuvo la solución
de reacción mediante adición de 0,1 ml de una solución acuosa de 3,9
mg de tris(hidroximetil)aminometano. Se añadió
sulfato amónico a la solución de reacción a una concentración final
de 0,7 M y se cargó en una columna (2,5 cm x 8,1 cm = 40 ml) de
butil-Toyopearl 650M (Tosoh Corporation) a un caudal
de 40 ml/hora.
Tras lavar la columna con 120 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía sulfato amónico
0,7 M a un caudal de 40 ml/hora, la elución se llevó a cabo con un
gradiente lineal decreciente de concentración de sulfato amónico de
0,7 a 0 M en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en un
volumen total de 240 ml a un caudal de 40 ml/hora. La sustancia
deseada se eluyó a una concentración de sulfato amónico de entre
0,35 M y 0,07 M. Se ultrafiltraron 90 ml de la fracción eluida [Mr
de corte o peso molecular nominal límite 10.000: YM10 (Amicon Co.,
Ltd.)] y se concentraron hasta 6 ml. Dicha solución concentrada se
cargó en una columna (2,5 cm x 47 cm = 230 ml) de Sephacryl
S-300 (Pharmacia Co., Ltd.) equilibrada con PBS a un
caudal de 46 ml/h y después se pasó PBS al mismo caudal. El
polipéptido hG-CSF modificado químicamente se eluyó
entre aproximadamente 110 ml y aproximadamente 145 ml tras iniciar
el PBS, que era una mezcla de las combinaciones de 1 a 3 moléculas
de polietilenglicol (tipo mono a tipo tri) (peso total: 7,8 mg;
rendimiento: 19%).
Ejemplo de referencia
12
Se ajustaron a pH 7,2 con hidróxido sódico al 5%
600 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) que contenía 540 mg de
derivado de hG-CSF obtenido en el Ejemplo de
referencia 3, y se añadieron sobre hielo 8,7 g de
N-hidroxisuccinimida éster de
6-(3-carboxipropilamino)-2,4-bis(o-metoxipolietilenglicol)-s-triazina
obtenidos en el Ejemplo de referencia 10, y se llevó a cabo la
reacción a 4ºC durante 48 horas.
A continuación, se obtuvo la solución de
reacción mediante la adición de 0,5 ml de una solución acuosa de
105 mg de tris-(hidroximetil)aminometano. La solución de
reacción se centrifugó a 8.000 rpm, 4ºC, durante 40 minutos y se
añadió sulfato amónico a 600 ml del sobrenadante a una concentración
final de 0,68 M, y la solución se cargó en una columna (5 cm x 18
cm = 350 ml) de butil-Toyopearl 650 M (Tosoh
Corporation) equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5) que contenía sulfato amónico 0,68 M a un caudal de 350
ml/h.
Tras lavar la columna con 700 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenían sulfato
amónico 0,68 M a un caudal de 350 ml/hora, se llevó a cabo la
elución con un gradiente lineal decreciente de concentración de
sulfato amónico de 0,68 a 0 M en tampón Tris-HCl 10
mM (pH 7,5) en un volumen total de 2.800 ml a un caudal de
350 ml/hora. La sustancia deseada se eluyó a una
concentración de sulfato amónico de entre 0,39 M y 0,20 M. Se
ultrafiltraron 800 ml de la fracción eluida [Mr de corte 10.000:
YM10 (Amicon Co., Ltd.)] y se concentraron hasta 100 ml. Dicha
solución concentrada se cargó en una columna (10 cm x 50 cm = 3.900
ml) de Sephacryl S-300 (Pharmacia Co., Ltd.)
equilibrada con PBS a un caudal de 780 ml/hora y después se pasó
PBS al mismo caudal. El polipéptido hG-CSF
modificado químicamente se eluyó entre aproximadamente 1.750 ml y
aproximadamente 2.250 ml tras iniciar el PBS, que era una mezcla de
las combinaciones de 1 a 3 moléculas de polietilenglicol (tipo mono
a tipo tri) (peso total: 303 mg; rendimiento: 56%).
Ejemplo de referencia
13
Se disolvieron 100 g (8,33 mmoles) de
monometoxipolietilenglicol suficientemente deshidratado (Nippon Oil
and Fats Co., Ltd.) con un peso molecular medio de 12.000, 9,3 g de
óxido de zinc (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 83,5 g de
tamiz molecular (tipo 4A) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en
benceno seco, y se dejaron en un flujo de argón durante la noche a
temperatura ambiente. Después, se eliminaron los tamices
moleculares, y se añadieron nuevamente 42 g de tamiz molecular, y
la solución se dejó reposar durante la noche de manera similar. A
continuación, se eliminó el tamiz molecular, y la solución se
destiló a 80ºC en un flujo de argón utilizando un destilador, y el
primer destilado, 50 ml, se eliminó. Además, utilizando un extractor
Soxhlet (para tierra) cargado con 100 g de tamiz molecular (tipo
4A), se deshidrató la solución bajo reflujo a 80ºC en un flujo de
argón durante la noche. Tras enfriar, se añadieron 36 mg (4,0
mmoles) de cloruro cianúrico a la solución de reacción y se
deshidrató de manera similar bajo reflujo durante 5 días. El cloruro
cianúrico recristalizado por el éter dietílico seco se utilizó en
este caso. A continuación, la solución se enfrió hasta la
temperatura ambiente, se añadieron 300 ml de benceno seco a la
solución, la solución se centrifugó a 3.600 rpm durante 10 minutos
y se eliminaron los materiales insolubles. El sobrenadante se
concentró bajo presión reducida hasta 300 ml, y se añadió gota a
gota a 3.000 ml de éter dietílico seco, generando un precipitado.
Dicho precipitado se recogió y se lavó con éter dietílico seco, y el
solvente se eliminó a continuación bajo presión reducida y se
obtuvo el precipitado seco.
Se añadieron 100 g de dicho precipitado seco a
1.000 ml de solución tampón de borato 0,1 M (pH 10) en la que se
disolvieron 24 g (12,0 mmoles) de ácido
gama-aminobutírico en 1.000 ml del tampón sobre
hielo, y se agitó a 4ºC durante la noche. Tras agitar
adicionalmente a temperatura ambiente durante 6 horas, la solución
se ajustó a pH 1,0 con ácido hidroclórico 1 N y se extrajo con
cloroformo. La fase cloroformo se secó con sulfato sódico anhidro,
y se separó mediante filtración y el solvente se eliminó bajo
presión reducida. Se añadió acetona seca al sólido blanco que se
generaba y se disolvió el sólido. Dicha solución de acetona se
concentró bajo presión reducida y se hizo recristalizar dejándola a
temperatura ambiente, obteniendo 90 g del producto curdo que
contenía aproximadamente 70% a 80% del compuesto diana. Este
producto se disolvió en 6.000 ml de agua destilada, y se cargó en
una columna de resina de intercambio aniónico HPA-75
(Mitsubishi Chemical Corporation) que se equilibró con agua
destilada tras pasar previamente 12.000 ml de hidruro sódico 2 N, y
las fracciones que contenían el compuesto de la invención como
ingrediente principal se recogieron mediante elución con agua
destilada. La solución resultante se ajustó a pH 1,0 con ácido
hidroclórico 1 N y se extrajo con cloroformo. La fase cloroformo se
secó con sulfato sódico anhidro y se separó mediante filtración, y
el solvente se eliminó bajo presión reducida, y se obtuvieron 43,6
g del compuesto objetivo altamente purificado (rendimiento:
43%).
Ejemplo de referencia
14
Se sintetizaron 25 g de
6-(3-carboxipropilamino)-2,4-bis(o-metoxipolietilenglicol)-s-triazina
y se secaron suficientemente según el procedimiento del Ejemplo de
referencia 13 y se disolvieron 240 mg de
N-hidroxisuccinimida en 400 ml de cloruro de
metileno anhidro, y se añadieron a 431 mg de DCC sobre hielo en un
flujo de argón y se agitaron durante 30 minutos. Posteriormente,
tras volver a la temperatura ambiente y agitar durante 1,5 horas,
se separó por filtración un material insoluble (DCU), y el filtrado
se concentró bajo presión reducida hasta 160 ml. La solución
resultante se añadió gota a gota a 2.400 ml de éter dietílico
anhidro para generar un precipitado, y tras lavar dicho precipitado
con éter dietílico anhidro, se eliminó el solvente bajo presión
reducida, obteniendo 21,4 g (0,89 mmoles) del compuesto diana
(rendimiento: 89%).
Ejemplo de referencia
15
Se ajustaron a pH 7,3 con hidróxido sódico al 5%
560 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) que contenía 504 mg del
derivado hG-CSF obtenido en el Ejemplo de referencia
3, y se añadieron sobre hielo 22,4 g de
N-hidroxisuccinimida éster de
6-(3-carboxipropilamino)-2,4-bis(o-metoxipolietilenglicol)-s-triazina
obtenida en el Ejemplo de referencia 14, y la reacción se llevó a
cabo a 4ºC durante 48 horas. Posteriormente, se obtuvo la solución
de reacción mediante adición de 0,5 ml de una solución acuosa de
113 mg de tris(hidroximetil)-aminometano. Se
añadió sulfato amónico a una concentración final de 0,7 M a la
solución de reacción, y la solución se cargó en una columna (5 cm x
25 cm = 500 ml) de butil-Toyopearl 650M (Tosoh
Corporation) equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5) que contenía sulfato amónico 0,7 M a un caudal de 500
ml/hora. Tras lavar la columna con 1.500 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía sulfato amónico
0,7 M a un caudal de 500 ml/hora, se llevó a cabo la elución con un
gradiente lineal decreciente de concentración de sulfato amónico de
0,7 a 0 M en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en un
volumen total de 3.000 ml a un caudal de 500 ml/hora. La sustancia
deseada se eluyó a una concentración de sulfato amónico de entre
0,55 y 0,08 M. Se añadió sulfato amónico a la fracción eluida a una
concentración final de 0,7 M y se cargó en una columna (5 cm x 15 cm
= 300 ml) de butil-Toyopearl 650M (Tosoh
Corporation) equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5) que contenía sulfato amónico 0,7 M a un caudal de 450
ml/hora. Tras lavar la columna con tampón Tris-HCl
10 mM (pH 7,5) que contiene sulfato amónico 0,7 M a un caudal de
450 ml/hr, la elución se realizó con 900 ml de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) a un caudal de 450 ml/hr.
La sustancia deseada se eluyó entre 67 ml y 132 ml. La fracción
eluida, 100 ml, se cargó en una columna (5 cm x 50 cm = 1.000 ml)
de Sephadex G-25 (Pharmacia Co., Ltd.) equilibrada
con PBS a un caudal de 300 ml/hora. Después, se pasó PBS al mismo
caudal. El polipéptido hG-CSF modificado
químicamente eluyó entre aproximadamente 350 ml y aproximadamente
500 ml tras iniciar el PBS, que era una mezcla de las combinaciones
de 1 a 4 moléculas del polietilenglicol (tipo mono a tipo tetra)
(peso total: 282 mg; rendimiento: 56%).
Ejemplo de referencia
16
Se disolvieron 5,5 g de metoxipolietilenglicol
suficientemente deshidratados (Nippon Oil and Fats Co., Ltd.) (0,55
mmoles) con un peso molecular medio de 10.000, en 27,5 ml de cloruro
de metileno seco, y se añadieron 0,153 ml de trietilamina y 222 mg
de cloroformato de 4-nitrofenilo, y se agitó en un
flujo de argón a temperatura ambiente durante 4 horas. Durante la
agitación, se mantuvo el pH entre 7,5 y 8,5 mediante la adición de
trietilamina. Se concentró la solución de reacción hasta 20 ml bajo
presión reducida, y se añadió gota agota a 300 ml de éter dietílico
seco, generando un precipitado. Dicho precipitado se recristalizó
con acetato de etilo, y se obtuvieron 4,8 g del compuesto diana
mediante secado bajo presión reducida (0,48 mmoles) (rendimiento:
87%).
Ejemplo de referencia
17
Se ajustaron a pH 8,7 con hidróxido sódico al 5%
45 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) que contenía 40,5 mg del
derivado de hG-CSF obtenido en el Ejemplo de
referencia 3, y se añadieron sobre hielo 4,3 g de
4-nitrofeniloxicarbonil(o-metoxipolietilenglicol)
obtenidos en el Ejemplo de referencia 16, y se obtuvo la solución
de reacción mediante la reacción de lo anterior a 4ºC durante 3
días. Se añadió sulfato amónico a la solución de reacción a una
concentración final de 0,7 M y se cargó en una columna (2,5 cm x 12
cm = 60 ml) de butil-Toyopearl 650M (Tosoh
Corporation) equilibrada con tampón Tris-HCl (pH
7,5) que contenía sulfato amónico 0,7 a un caudal de 60 ml/hora.
Tras lavar la columna con 180 ml de tampón Tris-HCl
10 mM (pH 7,5) que contenía sulfato amónico 0,7 M a un caudal de 60
ml/hora, se llevó a cabo una elución con un gradiente lineal
decreciente de concentración de sulfato amónico de 0,7 a 0 M en
tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en un volumen total
de 360 ml a un caudal de 60 ml/hora.
Posteriormente, la parte no eluida restante se
eluyó pasando 180 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH
7,5). La sustancia deseada se eluyó a concentraciones de sulfato
amónico de entre 0,4 M y 0 M. La fracción eluida, 210 ml, se
ultrafiltró [Mr de corte 10.000: YM10 (Amicon Co., Ltd.)] y se
concentró hasta 30 ml. Dicha solución concentrada se cargó en una
columna (5 cm x 51 cm = 1.000 ml) de Sephacryl S-300
(Pharmacia Co., Ltd.) equilibrada con PBS a un caudal de 200
ml/hora y después se pasó PBS al mismo caudal.
Tras iniciar el PBS, el derivado de
hG-CSF modificado químicamente (tipo tri) en el que
3 moléculas de ácido carboxílico del polietilenglicol se unía a una
molécula de hG-CSF se eluyó entre aproximadamente
285 ml y aproximadamente 305 ml, el derivado de
hG-CSF modificado químicamente (tipo di) en el que 2
moléculas de ácido carboxílico del polietilenglicol unidas se
eluyeron entre aproximadamente 325 ml y aproximadamente 345 ml, el
derivado de hG-CSF modificado químicamente (tipo
mono) en el que una molécula de ácido carboxílico del
polietilenglicol se eluyó entre aproximadamente 365 ml y
aproximadamente 385 ml, con 6,2 mg (rendimiento: 10,9%), 6,8 mg
(rendimiento: 11,9%) y 5,0 mg (rendimiento: 8,8%).
Ejemplo de referencia
18
Se disolvieron 120 mg (1,6 mmoles) de
3-amino-1-propanol
en 200 ml de tampón borato 0,1 M (pH 10) y se añadieron sobre hielo
8 g (0,8 mmoles) de
6-cloro-2,4-bis(o-metoxipolietilenglicol)-s-triazina
(SEIKAGAKU CORPORATION), y se agitó a 4ºC durante la noche. La
solución de reacción se ajustó a pH 1,0 con ácido hidroclórico 2 N y
se extrajo con cloroformo. Tras lavar dos veces con ácido
hidroclórico 2 N, la fase cloroformo se secó con sulfato sódico
anhidro y se filtró. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y
la acetona seca se añadió al sólido que se generaba, y el sólido se
disolvió. Dicha solución de acetona se concentró bajo presión
reducida, y el derivado polietilenglicol se recristalizó dejándolo
a temperatura ambiente, obteniendo 5,5 g de dicha sustancia
cristalina (rendimiento: 69%).
Posteriormente, se disolvieron 5,3 g (0,53
mmoles) de dicho derivado polietilengliicol en 26,5 ml de cloruro
de metileno seco, se añadieron 0,147 ml de trietilamina y se
añadieron además 214 mg (1,06 mmoles) de
4-nitrofenil-cloroformato, y se
agitó a 4ºC durante 4 horas. Posteriormente, la solución de reacción
se concentró hasta 20 ml bajo presión reducida, y se añadió gota a
gota a 300 ml de éter dietílico seco, generando un precipitado. El
precipitado se lavó con éter dietílico seco y tras eliminar el
solvente bajo presión reducida, se recristalizó con acetato de
etilo seco y se obtuvieron 4,6 g (0,46 mmoles) del compuesto
objetivo mediante secado del mismo bajo presión reducida
(rendimiento: 87%).
Ejemplo de referencia
19
Se añadieron 287 mg de polietilenglicol activado
M-SCM-20.000 (Shearwater Polymer,
Inc.) a 6,5 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,5) que contenía 29,25
mg del derivado de hG-CSF obtenido en el Ejemplo de
referencia 3, y la reacción se llevó a cabo a 4ºC durante 6 horas,
y después la solución de reacción se obtuvo mediante la adición de
35 \mul de tris-(hidroximetil)aminometano 50 mg/ml. Dicha
solución de reacción se cargó en una columna (2,5 cm x 45 cm = 220
ml) de Sephacryl S-300 (Pharmacia Co., Ltd.)
equilibrada con PBS a un caudal de 44 ml/hora, y se pasó a
continuación PBS al mismo caudal.
Tras iniciar el PBS, el polipéptido
hG-CSF modificado químicamente (tipo di), en el que
se encontraban unidas dos moléculas de ácido carboxílico del
polietilenglicol, se eluyó entre aproximadamente 96 ml y
aproximadamente 104 ml, y se obtuvieron 3,8 mg de dicho tipo d
(rendimiento: 13,0%).
Ejemplo de referencia
20
Se añadieron 98 mg de polietilenglicol activado
M-SSPA-20.000 (Shearwater Polymer
Inc.) a 6,7 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,5) que contenía 28,8
mg del derivado de hG-CSF obtenido en el Ejemplo de
referencia 3, y se llevó a cabo la reacción a 4ºC durante 24 horas,
y después la solución de reacción se obtuvo mediante la adición de
30 \mul de tris-(hidroximetil)aminometano 40 mg/ml. Dicha
solución de reacción se cargó en una columna (2,5 cm x 45 cm = 220
ml) de Sephacryl S-300 (Pharmacia Co., Ltd.) se
equilibró con PBS a un caudal de 44 ml/hora y después se pasó PBS
al mismo caudal.
Tras iniciar el PBS, el polipéptido
hG-CSF modificado químicamente (tipo tri), en el que
se encuentran unidas 3 moléculas de ácido carboxílico del
polietilenglicol, eluyó entre aproximadamente 78 ml y
aproximadamente 98 ml, y se obtuvieron 2,0 mg de dicho tipo tri
(rendimiento: 6,6%).
La presente invención puede proporcionar un
polipéptido modificado químicamente, en el que por lo menos un
grupo de grupos amino, carboxilo, mercapto y guanidino en una
molécula de polipéptido que presenta hG-CSF se
encuentra modificado químicamente, y es un excelente agente
estimulador de la producción de plaquetas, que comprende dicho
polipéptido modificado.
<110> Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Acelerador del crecimiento
plaquetario
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M/37274
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 95 909 967.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1995-02-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP H06-25735
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1995-02-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Acelerador del crecimiento
plaquetario
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M/37274
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 95 909 967.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1995-02-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP H06-25735
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1994-02-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Utilización de un polipéptido modificado
químicamente, en la que por lo menos un grupo de entre el grupo
amino, carboxilo, mercapto o guanidino en la molécula de un
polipéptido que presenta actividad estimuladora de colonias de
granulocitos humanos se modifica químicamente con un derivado
polialquilenglicol o copolímero estireno-ácido maleico para la
producción de composiciones farmacéuticas destinadas a promover la
producción de plaquetas de los pacientes que presentan recuentos
plaquetarios reducidos.
2. Utilización del polipéptido modificado
químicamente según la reivindicación 1, en la que el polipéptido
que presenta actividad estimuladora de colonias de granulocitos
humanos comprende una secuencia de aminoácidos de secuencia SEC ID
nº 1 o una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo
de (a) a (I):
- (a)
- una secuencia de aminoácidos en la que el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por ácido glutámico, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por lisina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente, en la secuencia SEC ID nº 1;
- (b)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por valina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por isoleucina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente, en la secuencia SEC ID nº 1;
- (c)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por cisteína, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por isoleucina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina respectivamente, en la secuencia SEC ID nº 1;
- (d)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por tirosina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por isoleucina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente, en la secuencia SEC ID nº 1;
- (e)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por arginina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente, en la secuencia SEC ID nº 1;
- (f)
- una secuencia de aminoácidos en la que el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (g)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por asparagina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por ácido glutámico, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente, en la secuencia SEC ID nº 1;
- (h)
- una seucnecia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por isoleucina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (i)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por serina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimooctavo aminoácido, cisteína se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (j)
- una secuencia de aminoácidos en la que el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina y el de- cimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (k)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por alanina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por tirosina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por arginina y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1; y
- (l)
- una secuencia de aminoácidos en la que el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina en la secuencia SEC ID nº 1.
3. Utilización del polipéptido modificado
químicamente según la reivindicación 1 ó 2, en la que un derivado
polialquilenglicol es un derivado polietilenglicol, un derivado
polipropilenglicol, o un derivado de copolímero
polietilenglicol-polipropilenglicol.
4. Utilización del polipéptido modificado
químicamente según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente
modificador químico del grupo amino es un derivado
polialquilenglicol que presenta la fórmula (I):
(I)R^{1}-(M)_{n}-X-R^{2}
en la que R^{1} representa un
grupo alquilo o alcanoilo; M presenta la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- -OCH_{2}CH_{2}-, \ -OCH_{2}CH_{2}CH_{2}-,
o
- \quad
- -(OCH_{2}CH_{2})_{r}-(OCH_{2}CH_{2}CH_{2})_{s}-
\vskip1.000000\baselineskip
en la que r y s presentan cualquier
valor integral positivo variable, que son iguales o diferentes; n
presenta cualquier valor integral positivo variable; X representa
un enlace sencillo, O, NH o S; y R^{2} representa la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{3} representa OH,
halógeno o la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X^{n}-(M^{a})_{na}-R^{1a}
en la que X^{a}, M^{a},
R^{1a} y na presentan las mismas definiciones que X, M, R^{1} y
n definidos anteriormente, respectivamente; e Y representa halógeno
o la
fórmula:
-Z-(CH_{2})_{p}-(O)_{m}-W
en la que Z representa O, S o NH; W
representa un grupo carboxilo, un derivado activo del mismo, o la
fórmula:
en la que R^{4} representa un
grupo alquilo, y Hal representa halógeno; p presenta un valor
integral de 1 a 6; y m presenta un valor de 0 ó
1,
-(CO)_{ma}-(CH_{2})_{t}-W_{a}
en la que W_{a} y ma presentan la
misma definición que W y m anteriormente definidos, respectivamente,
y t presenta un valor integral de 0 a 6,
o
en la que Hal^{a}, pa y R^{4a}
presentan la misma definición que Hal, p y R^{4} definidos
anteriormente, respectivamente, o un derivado del copolímero
estireno-ácido maleico que presenta la fórmula
(II):
en la que u y v presentan cualquier
valor integral positivo variable, que son iguales o diferentes, y
R^{5} representa un átomo de hidrógeno o un grupo
alquilo.
5. Utilización del polipéptido modificado
químicamente según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente
modificador químico del grupo carboxilo es un derivado
polialquilenglicol que presenta la fórmula (III):
(III)R^{1b}-(M^{b})_{nb}-NH_{2}
en la que M^{b}, R^{1b} y nb
presentan las mismas definiciones que M, R^{1} y n anteriormente
definidos,
respectivamente.
6. Utilización del polipéptido modificado
químicamente según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente
modificador químico del grupo mercapto es un derivado
polialquilenglicol que presenta la fórmula (IV):
en la que Mc, R^{1c} y nc
presentan la misma definición que M, R^{1} y n anteriormente
definidos, respectivamente, o un copolímero estireno-ácido maleico
que presenta la fórmula
(V):
en la que R^{5a}, ua y va
presentan la misma definición que R^{5}, u y v anteriormente
definidos, respectivamente, y uno de entre Q y R representa un
grupo carboxilo, y el otro de entre Q y R representa la
fórmula:
en la que pb presenta la misma
definición que p anteriormente
definido.
7. Utilización del polipéptido modificado
químicamente según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente
modificador químico del grupo guanidino es un derivado
polialquilenglicol que presenta la fórmula (VI):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que q presenta un valor de 1
ó 2, y M^{d}, R^{1d} y nd presentan la misma definición que M,
R^{1} y n anteriormente definidos,
respectivamente.
8. Utilización de un polipéptido modificado
químicamente para la producción de composiciones farmacéuticas
destinadas a promover la producción de plaquetas de los pacientes
con recuentos plaquetarios reducidos, en la que por lo menos uno de
los grupos amino en la molécula del polipéptido que presenta
actividad estimuladora de colonias de granulocitos humanos se
encuentra unido a un grupo representado por la fórmula (Ia)
siguiente:
(Ia)R^{1}-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-X-R^{2a}
en la que R^{1} representa un
grupo alquilo o alcanoilo; n presenta cualquier valor integral
positivo variable; X representa un enlace sencillo, O, NH o S;
R^{2a} representa la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{3a} representa OH,
halógeno o la
fórmula:
-X_{a}-(M_{a})_{nn}-R^{1a}
en la que Xa, R^{1a} y na
presentan la misma definición que X, R^{1} y n definidos
anteriormente, respectivamente; M_{a} representa la
fórmula:
- \quad
- -OCH_{2}CH_{2}-, \ -OCH_{2}CH_{2}CH_{2}-
o
- \quad
- -(OCH_{2}CH_{2})_{r}-(OCH_{2}CH_{2}CH_{2})_{s}-
en la que r y s presentan cualquier
valor integral positivo variable, que son iguales o diferentes, e
Y^{a} representa un enlace sencillo, la
fórmula:
-Z-(CH_{2})_{p}-(O)_{m}-CO-
en la que Z representa O, S o NH; p
presenta un valor integral de 1 a 6; y m presenta un valor de 0 ó 1,
o la
fórmula:
-(CO)_{ma}-(CH_{2})_{1}-CO-
en la que ma presenta la misma
definición que m definido anteriormente; y t presenta un valor
integral de 0 a
6.
9. Polipéptido modificado químicamente que
comprende un polipéptido que presenta actividad estimuladora de
colonias de granulocitos humanos, en el que por lo menos un grupo
amino en la molécula se encuentra unido a un grupo de fórmula
(Ib):
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} representa un
grupo alquilo o alcanoilo; M representa la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- -OCH_{2}CH_{2}-, \ -OCH_{2}CH_{2}HC_{2}-
o
- \quad
- -(OCH_{2}CH_{2})_{r}-(OCH_{2}CH_{2}CH_{2})_{s}-
\vskip1.000000\baselineskip
en la que r y s presentan cualquier
valor integral positivo variable, que son iguales o diferentes; n
presenta cualquier valor integral positivo variable; X representa
un enlace sencillo, O, NH o S; R^{3b} representa OH, halógeno o
la
fórmula:
-X^{a}-(M^{a})_{ma}-R^{1a}
en la que X^{a}, M^{a},
R^{1a} y na presentan la misma definición que X, M, R^{1} y n
anteriormente definidos, respectivamente; Z representa O, S o NH; y
p presenta un valor integral de 1 a
6.
10. Polipéptido modificado químicamente según la
reivindicación 9, en el que el polipéptido que presenta actividad
estimuladora de colonias de granulocitos humanos comprende una
secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o una secuencia de
aminoácidos seleccionada de entre el grupo de (a) a (l):
- (a)
- una secuencia de aminoácidos en la que el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por ácido glutámico, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por lisina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (b)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por valina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por isoleucina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (c)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por cisteína, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por isoleucina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina se ha sustituido por serina, y el decimooctavo aminoácido, cisteína se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (d)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por tirosina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por isoleucina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (e)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por arginina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (f)
- una secuencia de aminoácidos en la que el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1,
- (g)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por asparagina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por ácido glutámico, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina, y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (h)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por isoleucina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (i)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por serina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por serina y el decimooctavo aminoácido, cisteína se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (j)
- una secuencia de aminoácidos en la que el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por arginina y el decimoctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1;
- (k)
- una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido, treonina, se ha sustituido por alanina, el cuarto aminoácido, leucina, se ha sustituido por treonina, el quinto aminoácido, glicina, se ha sustituido por tirosina, el sexto aminoácido, prolina, se ha sustituido por arginina y el decimooctavo aminoácido, cisteína, se ha sustituido por serina, respectivamente en la secuencia SEC ID nº 1; y
- (l)
- una secuencia de aminoácidos en la que el decimoctavo aminoácido se ha sustituido por serina en la secuencia SEC ID nº 1.
11. Composición para tratar pacientes que
presentan recuentos plaquetarios reducidos, que comprende el
polipéptido modificado químicamente según la reivindicación 9 ó 10
en la forma de dosificación farmacéuticamente aceptable con un
portador farmacéuticamente aceptable.
12. Utilización del polipéptido modificado
químicamente según la reivindicación 9 ó 10 para la producción de
composiciones farmacéuticas para promover la producción de plaquetas
de los pacientes que presentan recuentos plaquetarios
reducidos.
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