ES2311963T3

ES2311963T3 - Dispositivo y procedimiento para la deteccion de analitos mediante visualizacion y separacion de la aglutinacion.

Info

Publication number: ES2311963T3
Application number: ES05701310T
Authority: ES
Inventors: Peter Schwind; Philippe Monod
Original assignee: Medion Diagnostics AG
Current assignee: Medion Grifols Diagnostics AG
Priority date: 2004-02-02
Filing date: 2005-02-02
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2025-02-02
Also published as: JP4741517B2; AU2005224973A1; US20090170062A1; ATE402414T1; EP1711820B1; WO2005090970B1; US7754472B2; DE102004005193B4; WO2005090970A1; DE502005004800D1; AU2005224973B2; EP1711820A1; JP2007519938A; DE102004005193A1

Abstract

Dispositivo para la detección de uno o varios analitos en una muestra, que comprende una o varias cámaras de reacción (1) apropiadas para el alojamiento de una muestra, así como opcionalmente uno o varios canales de aplicación de reactivos (2), con uno o varios sistemas capilares (3) conectados con las cámaras de reacción (1) o con los canales de aplicación de reactivos (2), en el que se conectan uno o varios recipientes negativos (4) con el o los sistemas capilares (3), en el que un sistema capilar (3) comprende al menos un capilar (3b) de un plano capilar (3a), o comprende uno o varios capilares (3b) que se estrechan en uno o varios planos capilares (3a).

Description

Dispositivo y procedimiento para la detección de analitos mediante visualización y separación de la aglutinación.

La presente invención se refiere a un dispositivo y a un procedimiento para la detección de uno o varios analitos en un líquido de muestra mediante la visualización de reacciones de aglutinación, en particular reacciones de hemaglutinación o de aglutinación de partículas.

Se conocen procedimientos para la detección de analitos mediante ensayos de hemaglutinación, así como de aglutinación de partículas. Para los ensayos de hemaglutinación, se conocen procedimientos en los que hemaglutinantes se separan mediante una etapa de centrifugación a través de una matriz inerte de eritrocitos individuales no aglutinados (por ejemplo, los documentos EP-A-0194212, EP-A-0305337, EP-A-0485228, EP-A-0725276). Según estos procedimientos se retienen eritrocitos aglutinados sobre o en la matriz inerte, y por consiguiente pueden separarse de eritrocitos individuales no reaccionantes que pueden atravesar la matriz y sedimentarse en el fondo del recipiente de reacción.

La patente de Estados Unidos US 2003/0129671 describe un dispositivo para la detección de la presencia de un analito en una muestra líquida. El dispositivo comprende una abertura de entrada de muestra y un sistema de flujo de tamaño mediano.

Las matrices separadoras son habitualmente matrices porosas (por ejemplo de vidrio); matrices de esferas de gel (por ejemplo, de Sephadex, Sephacryl, agarosa: EP-A-0194212, EP-A-0305337) o matrices de esferas de vidrio (EP-A-0725276).

En todos estos sistemas es común que la matriz separadora y el sistema de elemento portador comprenda dos componentes separados. Lo mismo es válido para procedimientos igualmente publicados, en los que en lugar de pequeñas esferas se emplean matrices de filtrado o porosas. El sistema de elemento portador se fabrica respectivamente con métodos convencionales de (macro-) moldeo por inyección.

Las matrices nombradas se emplean en el diagnóstico serológico de grupos sanguíneos, en particular, para la visualización de reacciones de hemaglutinación. En general detectan parámetros que tienen especial importancia en relación con transfusiones o con la enfermedad hemolítica del recién nacido. En este caso, se trata entre otros de la detección de antígenos sobre la superficie de los eritrocitos que son característicos de los grupos sanguíneos. Otros sistemas antigénicos importantes se encuentran también en los trombocitos, granulocitos, linfocitos, que tienen igualmente un papel en las transfusiones y/o transplantes. Además, de igual manera pueden detectarse virus hemaglutinantes.

Las matrices nombradas, en particular, matrices de esferas de gel, se utilizan igualmente para ensayos de aglutinación de partículas. No obstante, hasta ahora sólo se trabaja con partículas sintéticas que cumplen rigurosas especificaciones, en particular, presentan una alta densidad específica y un menor diámetro que los eritrocitos (por ejemplo, densidad específica \geq1,1; diámetro < 5 \mum; compárese EP-0849595).

Los procedimientos conocidos presentan una serie de desventajas. Mediante la centrifugación se consigue una separación espacial de los eritrocitos individuales y hemaglutinados, la matriz de reacción para reacciones positivas y negativas comprende, sin embargo, un único compartimento, de forma que es fluida la transición de reacciones negativas (no aglutinadas) a positivas (aglutinadas) y la valoración del resultado está sujeta por consiguiente a una cierta subjetividad. Especialmente en el caso de reacciones débilmente positivas, la borrosa delimitación de resultados negativos puede conducir a dificultades de interpretación. Además, la reproducibilidad de los procedimientos conocidos, que funcionan en particular con matriz de esferas de gel, depende en gran medida de la calidad de la matriz, habitualmente esferas de gel de poliacrilamida. Estos geles presentan diferencias de un lote a otro, que para la misma muestra pueden conducir a reacciones de detección de diferente potencia. Esto dificulta la estandarización y reproducibilidad de los resultados. La sensibilidad de las partículas de gel respecto a cualquier tipo de fuerzas de cortante, con la consecuencia de, en particular, partículas de gel quebradas, es otro problema que puede conducir a reacciones falseadas. Además, es común para todas las matrices aquí mencionadas, que son tridimensionales y que una gran parte del espacio de la matriz está compuesto por polímeros matriciales, lo que conduce a que una parte de las partículas coloreadas, que están incluidas en la matriz, permanezcan ocultas a simple vista, es decir, no pueden contribuir a la detección. Además, estos procedimientos son poco apropiados para la detección de propiedades de trombocitos en trombocitos intactos, ya que los trombocitos sólo pueden pasar el gel con grandes dificultades.

Por ello, el objetivo de la presente invención es superar las desventajas esgrimidas con respecto al estado de la técnica, en particular, la borrosa separación de la detección de reacciones débilmente positivas frente a reacciones negativas en las matrices conocidas y las oscilaciones de lote a lote en matrices de gel, sin que en este caso deba prescindirse de las ventajas de los procedimientos según el estado de la técnica, como por ejemplo, la estabilidad mecánica de los aglutinantes retenidos en la matriz (punto final estable). En particular, debe preparase una matriz separadora en ausencia de partículas de gel, es decir, debe prepararse un espacio sin matriz en el sentido estricto conocido, en el que se separan espacialmente las zonas para reacciones positivas y negativas sin transición fluida.

Este objetivo se consigue según la invención, por un lado, mediante un dispositivo para la detección de uno o varios analitos en una muestra, que comprende una o varias cámaras de reacción (1) apropiadas para el alojamiento de una muestra, así como, opcionalmente uno o varios canales de aplicación de reactivos (2), con uno o varios sistemas capilares (3) conectados con las cámaras de reacción (1) o con los canales de aplicación de reactivos (2), conectándose uno o varios recipientes negativos (4) con el o los sistemas capilares (3), comprendiendo un sistema capilar (3) al menos un capilar (3b) de un plano capilar (3a), o comprendiendo uno o varios capilares (3b) que se estrechan en uno o varios planos capilares (3a).

El sistema capilar del dispositivo según la invención, que se conecta preferiblemente con una cámara de reacción o con un canal de aplicación de reactivo, es parte integral de un elemento portador que está compuesto preferiblemente por materiales sintéticos, por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliestireno, topacio o polimetacrilato de metilo, y el mismo esta exento de matriz.

Un sistema capilar comprende, al menos, un capilar de un plano capilar o uno o varios capilares que se ramifican o estrechan en uno o varios planos capilares. En una forma de realización preferida del dispositivo, comprende uno o varios capilares que se estrechan escalonadamente en ulteriores planos capilares, que están dispuestos respectivamente uno bajo el otro, y se acumulan al final en un recipiente negativo. El sistema capilar comprende al menos un capilar de un plano que desemboca en un recipiente negativo. En una forma de realización de la invención, están dispuestos varios capilares unos junto a otros o agrupados por plano capilar. Los capilares de un plano capilar, dispuestos unos junto a otros o agrupados, poseen preferiblemente la misma superficie de paso para el líquido a ensayar. La superficie de paso del capilar o de los capilares de uno plano capilar se vuelve menor cuanto más alejados distalmente de la cámara de reacción están dispuestos.

Una forma de realización del dispositivo según la invención comprende un sistema capilar con solo un capilar de un plano capilar. A modo de ejemplo, la superficie de paso de un capilar presenta en este caso menos de
250.000 \mum^{2}.

En una forma de realización preferida, están unidos los planos capilares del sistema capilar a través de cámaras, cuya superficie de paso es preferiblemente del mismo tamaño que aquella del capilar con el mayor diámetro, sirviendo las cámaras preferiblemente para la ventilación o la compensación de presión. En otra forma de realización del dispositivo según la invención, los capilares de un plano capilar, dispuestos unos junto a otros, presentan enlaces de unión a través de las que están unidos unos con otros.

En una forma de realización preferida, los capilares (si se trata de más de un capilar) del dispositivo según la invención están dispuestos de forma paralela unos junto a otros y no agrupados en cada plano, por lo que el color de la partícula puede usarse de forma óptima para la detección.

El dispositivo según la invención presenta preferiblemente un canal de aplicación del reactivo. En una forma de realización especialmente preferida del dispositivo según la invención, el canal de aplicación de reactivos se llena previamente con un reactivo, a modo de ejemplo un tampón, soluciones reforzadoras, anticuerpos. El canal de aplicación de reactivos presenta, a modo de ejemplo, 1,2 veces el volumen comparado con el sistema capilar más recipiente negativo.

En una forma de realización preferida del dispositivo según la invención, el recipiente negativo presenta una forma que se angosta hacia abajo y que se vuelve estrecha, a modo de ejemplo, se afila en forma de flecha o en forma de U. En su lado superior es preferiblemente al menos tan ancha como la anchura de la suma de los capilares del plano capilar más inferior. El lado superior del recipiente negativo discurre en ángulo recto o en cualquier otro ángulo, en particular un ángulo menor, respecto al sistema capilar. En una forma de realización, el recipiente negativo presenta preferiblemente un volumen mayor que el volumen del sedimento compactado de las células o partículas empleadas. En una forma de realización preferida, el volumen del recipiente negativo es al menos 0,8 veces el volumen de todo el sistema capilar.

En otra forma de realización preferida, en el recipiente negativo se encuentra al menos un canal de ventilación, preferiblemente en el punto más ancho de un recipiente negativo, cuya unión con el plano inferior del sistema capilar es preferiblemente más ancha que la anchura de la suma de los capilares del plano capilar más inferior y que discurre preferiblemente hacia arriba fuera del sistema capilar.

En una forma de realización especialmente preferida, se juntan varios dispositivos según la invención (reactores) de forma paralela unos junto a otros en un elemento portador sintético, comprendiendo al menos respectivamente una cámara de reacción y/o un canal de aplicación de reactivos y un sistema capilar y un recipiente negativo. Por ejemplo, los canales de ventilación existentes conducen hacia arriba a través del elemento portador. En otra forma de realización preferida, zonas parciales de la pared exterior de un reactor, preferiblemente en la zona del sistema capilar, pueden estar configuradas como una lente óptica que confiere la función de lupa a la pared de un reactor individual o de todo el dispositivo según la invención para así facilitar la lectura de las reacciones débiles.

Otro objeto de la invención es el uso del dispositivo según la invención, en particular, en el diagnóstico serológico de grupos sanguíneos, preferiblemente para la determinación de los grupos sanguíneos humanos y animales, anticuerpos contra los grupos sanguíneos, para la determinación de las características de los trombocitos y de los anticuerpos dirigidos contra los trombocitos, para la determinación de las características de los leucocitos y de los anticuerpos dirigidos contra los leucocitos, para la detección de virus hemaglutinantes, para la detección de anticuerpos contra péptidos, proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, virus, bacterias, parásitos, para la detección de antígenos víricos o bacterianos o parásitos u otros y/o para la detección de autoanticuerpos y anticuerpos dirigidos contra alergenos.

Es otro objeto de la invención un procedimiento para la detección de uno o varios analitos en un líquido de prueba mediante visualización de la aglutinación, caracterizado porque a) el líquido de muestra se pone en contacto con un reactivo, b) la mezcla de reacción se expone al efecto de la gravedad, en particular por centrifugación, o del magnetismo, pasando la mezcla de reacción por el sistema capilar del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 12, con el que se conecta un recipiente negativo del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 12 y c) se determina la reacción entre el analito y el reactivo.

En una forma de realización especial, se pone en contacto la mezcla reactiva con otro reactivo durante la etapa de procedimiento b).

En otra forma de realización, se invierte el orden de las etapas individuales del procedimiento a) y b), en particular poner en contacto el líquido de muestra con un reactivo se realiza sólo durante la acción de la gravedad o el magnetismo. El líquido de muestra y/o el reactivo comprenden preferiblemente uno o varios tipos de partículas.

En el procedimiento según la invención, se emplean como partículas, en particular, eritrocitos, trombocitos y/o leucocitos o partes de ellos, o por ejemplo, un amplio espectro de partículas sintéticas de materiales y densidades diferentes, preferiblemente partículas de poliestireno, partículas de polibromoestireno, partículas magnéticas o paramagnéticas, partículas de melamina, de gelatina, agarosa polimerizada, partículas de polimetracrilato de metilo u otras partículas sintéticas.

Una reacción positiva se caracteriza porque partes del sistema capilar se colorean de forma visible después de la centrifugación. Cuanto más hacia arriba permanecen colgadas las células, más positiva es entonces la reacción. La reacción se determina preferiblemente a simple vista, con procedimientos ópticos o electrónicos.

En formas de realización especiales, las partículas presentan una coloración natural o están coloreadas o marcadas con color o marcadas por un marcador radioactivo, fluorescente y/o enzimático. En una forma de realización especial, las partículas se tratan previamente con enzimas proteolíticas para amplificar la reacción.

Son reactivos preferidos, por ejemplo, para el llenado del canal de aplicación de reactivos, en particular soluciones formuladas de anticuerpos monoclonales, policlonales o recombinantes o fragmentos de ellos, que están dirigidos contra las características de grupos sanguíneos, anticuerpos anti-globulina humana o fragmentos de ellos, solos o en combinación con anticuerpos complementarios anti-humanos o fragmentos de ellos y/o soluciones tampón o soluciones reforzadoras que no contienen anticuerpos.

Otro reactivo preferido comprende anticuerpos anti-globulina humana o fragmentos de ellos, solos o en combinación con anticuerpos complementarios anti-humanos o fragmentos de ellos, aumentándose la densidad de la solución, por ejemplo, mediante la adición de glicerina, un dextrano, un polietilenglicol u otros polímeros naturales o sintéticos. El aumento de la densidad sirve para crear una barrera que sigue permitiendo pasar a los eritrocitos bajo las condiciones de la centrifugación, mientras que se retienen el suero o plasma libres de células. De esta manera, se posibilita la separación de moléculas de IgG unidas con partículas de moléculas de IgG no unidas con partículas. La detección de partículas de IgG unidas con partículas tiene lugar, por ejemplo, mediante reacción con reactivos globulina anti-humana que se encuentran preferiblemente en la solución densificada, y que puede hacerse visible por aglutinación. Para que esto sea posible, el reactivo globulina anti-humana no debe neutralizarse antes por moléculas de IgG no específicas encontradas en el suero/plasma y presentes allí en exceso. Con este procedimiento, se posibilita realizar un ensayo indirecto globulina anti-humana sin etapa de lavado.

Es otro objeto de la invención la aplicación del procedimiento según la invención, en particular para la determinación de los grupos sanguíneos, anticuerpos contra los grupos sanguíneos, de compatibilidad entre sangre almacenada y receptor, para la determinación de las características de los trombocitos y de los anticuerpos dirigidos contra los trombocitos, para la determinación de las características de los leucocitos y de los anticuerpos dirigidos contra los leucocitos, para la detección de virus hemaglutinantes, para la detección de anticuerpos contra virus, bacterias, parásitos, para la detección de antígenos víricos u otros o para la detección de autoanticuerpos y anticuerpos dirigidos contra alergenos.

A continuación, se explica detalladamente la invención mediante figuras y ejemplos, sin que la limiten. Muestran:

Fig. 1 una representación de un dispositivo según la invención con varios capilares dispuestos unos junto a otros en varios planos capilares, siendo los diámetros de los capilares individuales de los planos situados más arriba mayores que aquellos de los planos situados más abajo.

Fig. 2 una representación de una vista lateral de un dispositivo según la invención con varios planos capilares.

Fig. 3a una representación de un dispositivo según la invención con un capilar de un plano capilar.

Fig. 3b una representación de un dispositivo según la invención con un capilar de un plano capilar que se estrecha.

Fig. 3c una representación de un dispositivo según la invención con tres planos capilares respectivamente con un capilar.

Fig. 3d una representación de un dispositivo según la invención con tres planos capilares respectivamente con un capilar, estando interconectadas dos cámaras.

Fig. 3e una representación de un dispositivo según la invención con 3 capilares de un plano capilar.

Fig. 3f una representación de un dispositivo según la invención con 4 capilares de un plano capilar con enlaces de unión.

Fig. 3g una representación de un dispositivo según la invención con un capilar de un plano capilar con 2 canales de ventilación del recipiente negativo.

Fig. 4 una representación de varios (seis) dispositivos (reactores) según la invención en una tarjeta respectivamente con respectivamente un canal de ventilación y diferentes resultados positivos y negativos graduados.

En la fig. 1 se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con la disposición de una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2) un sistema capilar (3) compuesto por varios planos capilares (3a) que se estrechan, siendo mayor el diámetro de los capilares individuales de los planos situados más arriba que aquellos de los planos situados más abajo, con varios capilares (3b) y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 2 se muestra en vista lateral, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con un canal de aplicación de reactivos (2) un sistema capilar (3) compuesto por varios planos capilares (3a), siendo mayor el diámetro de los capilares individuales de los planos situados más arriba que aquellos de los planos situados más abajo, con varios capilares (3b) y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador.

En la fig. 3a se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2), un sistema capilar (3) compuesto por un capilar de un plano capilar y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 3b se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2), un sistema capilar (3) compuesto por un capilar de un plano capilar que se estrecha, y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 3c se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2), un sistema capilar (3) compuesto por tres planos capilares respectivamente con un capilar y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 3d se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2), un sistema capilar (3) compuesto por uno tres planos capilares respectivamente con un capilar, que están separados por cámaras (7), y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 3e se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2), un sistema capilar (3) compuesto por tres capilares (3b) en un plano capilar (3a) y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 3f se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2), un sistema capilar (3) compuesto por cuatro capilares en un plano capilar, que están unidos entre sí con enlaces de unión (8) y un recipiente negativo (4) insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 3g se muestra, a modo de ejemplo, un dispositivo según la invención con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2), un sistema capilar (3) compuesto por un capilar en un plano capilar y un recipiente negativo (4), desde el del borde superior que conducen hacia arriba dos canales de ventilación (6), insertado en el elemento portador (5).

En la fig. 4 se muestra, a modo de ejemplo, una tarjeta con seis dispositivos (reactores) según la invención respectivamente con una cámara de reacción (1), un canal de aplicación de reactivos (2) un sistema capilar (3) compuesto por varios planos capilares con varios capilares, siendo mayor el diámetro de los capilares individuales de los planos situados más arriba que aquellos de los planos situados más abajo, y un recipiente negativo (4), desde el del borde superior que conduce hacia arriba un canal de ventilación (6), insertado en el elemento portador (5). Los reactores individuales de la tarjeta muestran diferentes resultados positivos graduados en el sistema capilar (3), a saber, una reacción fuertemente positiva (9), una reacción positiva (10), una reacción más débilmente positiva (11) y una reacción débilmente positiva (12), y una reacción negativa (13) en el recipiente negativo (4).

Ejemplos 1. Determinación del grupo sanguíneo

a): Los dos reactivos se pipetean en el recipiente de reacción.

: En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de un tampón fosfato. Se centrifuga en una centrifugadora ID (DiaMed) (10 min, 85 g). Se pipetean 25 \mul de una suspensión diluida al 0,8% de células del grupo sanguíneo A (Reverse-Cyte A1, Medion Diagnostics) en la cámara de reacción, seguidos de 5 \mul de anti-A (BIRMA-1, Serologicals). La tarjeta se centrifuga de nuevo en la centrifugadora ID. Resultado: los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. El recipiente negativo permanece libre de células. Si en lugar de células ReverseCyte A 1 se emplean células ReverseCyte B, las células se acumulan después de la centrifugación de forma visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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b): Reactivo de aglutinación pipeteado previamente.

: En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portante, se pipetean 5 \mul de anti-A (BIRMA-1, Serologicals). Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se pipetean 25 \mul de una suspensión diluida al 0,8% de células del grupo sanguíneo A (Reverse-Cyte A1, Medion Diagnostics) en la cámara de reacción. Se centrifuga de nuevo la tarjeta en la centrifugadora ID. Resultado: los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. El recipiente negativo permanece libre de células. Si en lugar de células ReverseCyte A1 se emplean células ReverseCyte B, las células se acumulan después de la centrifugación de forma visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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c): Reactivo de aglutinación pipeteado previamente, sangre completa diluida en reactivo de bromelina.

: En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de anti-A (BIRMA-1, Serologicals). Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se mezclan 50 \mul de una suspensión de sangre completa anticoagulada de una persona con el grupo sanguíneo A con 500 \mul de un reactivo de bromelina (Diluent 1, DiaMed) y se deja 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se pipetean 10 \mul de esta suspensión en la cámara de reacción. Se centrifuga la tarjeta inmediatamente en la centrifugadora ID. Resultado: los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. El recipiente negativo permanece libre de células. Si en lugar de células del grupo sanguíneo A se emplean células del grupo sanguíneo B, las células se acumulan después de la centrifugación de forma visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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d): Reactivo de aglutinación pipeteado previamente, pero no centrifugado previamente, sangre completa diluida en reactivo de bromelina.

: En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de anti-A (BIRMA-1, Serologicals). Se mezclan 50 \mul de una suspensión de sangre completa anticoagulada de una persona con el grupo sanguíneo A con 500 \mul de un reactivo de bromelina (Diluent 1, DiaMed) y se deja 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se pipetean 10 \mul de esta suspensión en la cámara de reacción. Se centrifuga la tarjeta inmediatamente en la centrifugadora ID. Resultado: los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. El recipiente negativo permanece libre de células. Si en lugar de células del grupo sanguíneo A se emplean células del grupo sanguíneo B, las células se acumulan después de la centrifugación de forma visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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e): Determinación de características débiles del grupo sanguíneo en el ensayo globulina anti-humana: Dweak.

: En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de anti IgG en PBS, pH 7,4, 10% de glicerina. Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se mezclan 50 \mul de una suspensión de sangre completa anticoagulada de una persona con grupo sanguíneo D con forma débil (Dweak) con 500 \mul de una solución diluida (Diluent 2, DiaMed). De esta suspensión, se pipetean 25 \mul en la cámara de reacción, seguido de 25 \mul de un producto comercial IgGanti-D (ESD-1, DiaMed). Se incuba 15 min. a 37ºC y se centrifuga en la centrifugadora ID. Resultado: los eritrocitos se hemaglutinan y los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. El recipiente negativo permanece libre de células. Si en lugar de células positivas del grupo sanguíneo D se emplean células negativas del grupo sanguíneo D, las células se acumulan después de la centrifugación de forma visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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2. Contraprueba de suero

En los canales de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de un tampón de baja ionización (DiaMed, Diluent 2). Después se pipetean 10 \mul cada vez de una suspensión de células de ensayo A1, A2, B o 0 (DiaMed; ID-DiaCell AB0) en 4 cámaras de reacción diferentes del elemento portador, luego se pipetean aquí 10 \mul del plasma de una persona a ensayar con el grupo sanguíneo A en la cámara de reacción y se incuba la mezcla 10 minutos a temperatura ambiente (18 a 25ºC). Se centrifuga la tarjeta en la centrifugadora ID. Resultado: las células B reaccionan positivamente, los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. El recipiente negativo de este reactor permanece libre de células. Las otras tres células (A1, A2, 0), que no reaccionan con las isoaglutininas en el plasma empleado, se acumulan después de la centrifugación de forma visible en la zona inferior del recipiente negativo.

3. Ensayo de búsqueda de anticuerpos

a): Ensayo globulina anti-humana indirecto (ensayo de Coombs indirecto)

: En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de una mezcla de anti-IgG y anti-C3d (Medion Diagnostics) que ha sido espesada con glicerina al 10% (p/v). Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se pipetean 25 \mul de una célula de ensayo del grupo sanguíneo 0 para el ensayo de búsqueda de anticuerpos (ScreenCyte al 0,8% I, II, III, Medion Diagnostics) en la cámara de reacción, seguido de 25 \mul de suero de paciente. Se incuba 15 min. a 37ºC y se centrifuga en la centrifugadora ID. Resultado: si el suero de paciente contiene un anticuerpo irregular que esté dirigido contra un antígeno presente sobre una de las células, entonces se hemaglutinan los eritrocitos de las correspondientes células de ensayo y los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. Si el suero de paciente no contiene un anticuerpo irregular que esté dirigido contra un antígeno presente sobre una de las células, entonces no se hemaglutinan los eritrocitos. Se acumulan después de la centrifugación como un "botón" rojo visible en la zona inferior del recipiente negativo.

b): Ensayo enzimático

\; i): Ensayo de una fase

: En los canales de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de un tampón fosfato, pH 7,4. Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se pipetean 25 \mul de una célula de ensayo del grupo sanguíneo 0 para el ensayo de búsqueda de anticuerpos (Screencyte I, II, III) en la cámara de reacción, seguido de 25 \mul de un reactivo enzimático (Diluent 1, DiaMed) y 25 \mul de suero de paciente. Se incuba 15 min. a 37ºC y se centrifuga en la centrifugadora ID. Resultado: si el suero de paciente contiene un anticuerpo irregular que esté dirigido contra un antígeno presente sobre una de las células, entonces se hemaglutinan los eritrocitos de las correspondientes células de ensayo y los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. Si el suero de paciente no contiene un anticuerpo irregular que esté dirigido contra un antígeno presente sobre una de las células, entonces no se hemaglutinan los eritrocitos. Se acumulan después de la centrifugación como un "botón" rojo visible en la zona inferior del recipiente negativo.

\; ii): Ensayo de dos fases

: En los canales de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de un tampón fosfato, pH 7,4. Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se pipetean 25 \mul de una célula papainizada de ensayo del grupo sanguíneo 0 para el test de búsqueda de anticuerpos (ID-DiaCell IP, IIP, IIIP, DiaMed) en la cámara de reacción, seguido de 25 \mul de suero de paciente. Se incuba 15 min. a 37ºC y se centrifuga en la centrifugadora ID. Resultado: si el suero para paciente contiene un anticuerpo irregular que esté dirigido contra un antígeno presente sobre una de las células, entonces se hemaglutinan los eritrocitos de las correspondientes células de ensayo y los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. Si el suero de paciente no contiene un anticuerpo irregular que esté dirigido contra un antígeno presente sobre una de las células, entonces no se hemaglutinan los eritrocitos. Se acumulan después de la centrifugación como un "botón" rojo visible en la zona inferior del recipiente negativo.

c): Ensayo de compatibilidad (prueba cruzada)

: En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de una mezcla de anti-IgG y anti-C3d (Medion Diagnostics) que se ha espesado con glicerina al 10% (p/v). Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se diluye la sangre almacenada, mientras que se mezclan 10 \mul de sedimento celular con 1 ml de una solución diluida (Diluent 2, DiaMed). Luego se pipetean 25 \mul de la sangre almacenada diluida en la cámara de reacción, seguido de 25 \mul de suero de paciente. Se incuba 15 min. a 37ºC y se centrifuga en la centrifugadora ID. Resultado: si el suero de paciente contiene un anticuerpo que esté dirigido contra un antígeno de eritrocitos de la sangre almacenada, entonces se hemaglutinan estos y los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar (donante y receptor incompatibles). Si el suero de paciente no contiene un anticuerpo incompatible, los eritrocitos se acumulan después de la centrifugación como un "botón" rojo visible en la zona inferior del recipiente negativo.

4. Ensayo globulina anti-humana directo (ensayo de Coombs directo)

En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de una mezcla de anti-IgG y anti-C3d (Medion Diagnostics) que ha sido espesada con glicerina al 10% (p/v). Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se pipetean 10 \mul de una célula de control de Coombs cargada con IgG (Coombs Control, Medion Diagnostics) en la cámara de reacción. Se centrifuga inmediatamente en la centrifugadora ID. Resultado: ya que la célula de control de Coombs está cargada con anticuerpos IgG, se hemaglutinan los eritrocitos y los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. Las células no cargadas con IgG se acumulan después de la centrifugación como un "botón" rojo visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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5. Aglutinación de partículas con centrifugación: detección de anticuerpos contra T. pallidum

En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de IgG anti-humano (Medion Diagnostics) que ha sido espesada con glicerina al 10% (p/v). Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se agita con vórtex un reactivo de partículas (DiaMed, Syphilis polymer particles) recubierto con antígenos recombinantes de T. pallidum (TpN15, TpN17, TpN47) durante 5 s a la potencia mayor. Luego, se pipetean 5 \mul de un suero de paciente, así como 25 \mul del reactivo de partículas, en la cámara de reacción. Después de 5 min. de incubación a temperatura ambiente, se centrifuga en la centrifugadora ID. Resultado: en sueros de pacientes que contienen anticuerpos contra uno o varios de los antígenos de la sífilis sobre las partículas, aglutinan las partículas de tal manera que, de forma similar a los eritrocitos, se retienen en el sistema capilar. Los sueros de personas no infectadas no aglutinan las partículas. Por ello, las partículas libres se sedimentan durante la centrifugación como un "botón" marrón visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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6. Aglutinación de partículas con separación magnética: detección de anticuerpos contra T. pallidum

En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de IgG anti-humano (Medion Diagnostics) que ha sido espesada con glicerina al 10% (p/v). Se centrifuga la tarjeta en una centrifugadora ID (10 min, 85 g). Se agita con vórtex una partícula paramagnética (estapor microspheres, Francia) recubierta con antígenos recombinantes de T. pallidum (TpN15, TpN17, TpN47) durante 5 s a la potencia mayor. Luego, se pipetean 5 \mul de un suero de paciente, así como 25 \mul de reactivo de partículas, en la cámara de reacción. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente, se pone un imán (LifeSep 1.5 S Magnetic Separation Unit, Dexter Magnetic Technologies, USA) a la base del recipiente negativo. Resultado: en sueros de pacientes que contienen anticuerpos contra uno o varios de los antígenos de la sífilis sobre las partículas, aglutinan las partículas de tal manera que, de forma similar a los eritrocitos, se retienen en el sistema capilar. Los sueros de personas no infectadas no aglutinan las partículas. Por ello las partículas libres se sedimentan como un "botón" marrón visible en la zona inferior del recipiente negativo.

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7. Determinación del antígeno de parvovirus humano B19

En un canal de aplicación de reactivos de un elemento portador, se pipetean 5 \mul de un tampón PBS que se ha titulado a pH 5,8. Luego, se pipetean 10 \mul de una suspensión de células de ensayo papainizadas, que portan el antígeno del grupo sanguíneo P, en la cámara de reacción, después se pipetean aquí 10 \mul de una solución de partículas VP2 recombinantes en la cámara de reacción y se centrifuga la mezcla inmediatamente en la centrifugadora ID. Resultado: las células se hemaglutinan, los hemaglutinantes se retienen en el sistema capilar. El recipiente negativo de este reactor permanece libre de células. Si en lugar de la partícula VP2 se emplea el suero de una persona sin virus, los eritrocitos se almacenan después de la centrifugación de forma visible en la zona inferior del recipiente negativo.

Claims

1. Dispositivo para la detección de uno o varios analitos en una muestra, que comprende una o varias cámaras de reacción (1) apropiadas para el alojamiento de una muestra, así como opcionalmente uno o varios canales de aplicación de reactivos (2), con uno o varios sistemas capilares (3) conectados con las cámaras de reacción (1) o con los canales de aplicación de reactivos (2), en el que se conectan uno o varios recipientes negativos (4) con el o los sistemas capilares (3), en el que un sistema capilar (3) comprende al menos un capilar (3b) de un plano capilar (3a), o comprende uno o varios capilares (3b) que se estrechan en uno o varios planos capilares (3a).

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el sistema capilar (3) comprende planos capilares (3a) que se estrechan y que están dispuestos los unos bajo los otros.

3. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 2, en el que en cada plano capilar (3b) varios capilares (3b) están dispuestos los unos junto a los otros o agrupados.

4. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los capilares (3b) de un plano capilar (3a), que están dispuestos los unos junto o los otros o agrupados, presentan enlace de unión.

5. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los capilares (3b) de un plano capilar (3a), que están dispuestos unos junto a los otros o agrupados, poseen la misma superficie de paso.

6. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la superficie de paso de los planos capilares (3a) se vuelve menor cuanto más alejados distalmente de la cámara de reacción (1) están dispuestos.

7. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los planos capilares (3a) del sistema capilar (3) están unidos a través de cámaras cuya superficie de paso es preferiblemente la misma que la del capilar más grande (3b).

8. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el canal de aplicación de reactivos (2) comprende 1,2 veces el volumen comparado con el capilar (3b) o el sistema capilar (3) más recipiente negativo (4).

9. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el recipiente negativo (4) presenta un mayor volumen que el volumen del sedimento compactado de las células o partículas empleadas.

10. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el recipiente negativo (4) presenta una forma que se estrecha hacia abajo, a modo de ejemplo se afila en forma de flecha o en forma de U.

11. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 10, a partir del que se ramifican uno o varios canales de ventilación (6), preferiblemente desde la parte superior más ancha del recipiente negativo.

12. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el sistema capilar (3) es parte integral del elemento portador (5).

13. Procedimiento para la detección de uno o varios analitos en un líquido de muestra mediante visualización de la aglutinación, caracterizado porque

a): se pone en contacto el líquido de muestra con un reactivo,

b): la mezcla de reacción se expone al efecto de la gravedad o del magnetismo causando el pasaje de la mezcla de reacción por el sistema capilar del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 12, con el que se conecta un recipiente negativo del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 12 y

c): se determina la reacción entre el analito y el reactivo.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que durante la etapa del procedimiento b) la mezcla de reacción se pone en contacto con un reactivo adicional.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que se invierte el orden de las etapas individuales del procedimiento a) y b), en particular, poner en contacto el líquido de muestra con un reactivo se realiza sólo durante la acción de la gravedad o el magnetismo.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el líquido de muestra y/o el reactivo comprende una o varias partículas.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la reacción se determina ópticamente.

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18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 17, en el que las partículas presentan una coloración natural o están coloreadas.

19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 18, en el que las partículas están marcadas con un marcador coloreado, radioactivo, fluorescente o enzimático.

20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 19, en el que las partículas comprenden eritrocitos y/o trombocitos y/o leucocitos o partes de ellos.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 20, en el que las partículas están pretratadas con enzimas proteolíticas para amplificar la reacción.

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 21, en el que están unidos a las partículas anticuerpos, en particular contra péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos, virus, bacterias, parásitos, células humanas, células animales o células vegetales o partes de ellos.

23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 22, en el que están unidos a las partículas antígenos u otros ligandos, como por ejemplo, péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos, virus, bacterias, parásitos, células humanas, células animales o células vegetales o partes de ellos.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 23, en el que las partículas comprenden, en particular, poliestireno, polibromoestireno, gelatina, melamina, agarosa polimerizada o polimetacrilato de metilo.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 24, en el que las partículas son magnéticas o paramagnéticas.

26. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 25, en el que la mezcla de muestra se expone a la gravedad sometiéndose a una centrifugación.

27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 26, en el que la mezcla de muestra se expone al magnetismo.

28. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 27, en el que el líquido de muestra comprende material humano, animal o vegetal, en particular sangre o componentes de la sangre.

29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 28, en el que el reactivo comprende, en particular, anticuerpos, células de ensayo, partículas sintéticas, tampones o soluciones reforzadoras.

30. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 29, en el que al reactivo se le añaden glicerina u otras moléculas para el aumento de la densidad específica de la solución.

31. Uso del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 12, en particular, en el diagnóstico serológico de grupos sanguíneos, preferiblemente para la determinación de los grupos sanguíneos, anticuerpos contra las características de grupos sanguíneos, de la compatibilidad entre sangre almacenada y receptor, para la determinación de las características de los trombocitos y de anticuerpos dirigidos contra los trombocitos, para la determinación de las características de los leucocitos y de los anticuerpos dirigidos contra los leucocitos, para la detección de virus hemaglutinantes, para la detección de anticuerpos contra proteínas, virus, bacterias, parásitos, para la detección de antígenos víricos o bacterianos o parásitos u otros y/o para la detección de autoanticuerpos y anticuerpos dirigidos contra alergenos.