ES2311734T3

ES2311734T3 - Proteinas tau truncadas.

Info

Publication number: ES2311734T3
Application number: ES03763763T
Authority: ES
Inventors: Eva Kontsekova
Original assignee: Axon Neuroscience Forschungs- und Entwicklungs GmbH; Axon Neuroscience SE
Current assignee: Axon Neuroscience Forschungs- und Entwicklungs GmbH; Axon Neuroscience SE
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2023-07-09
Also published as: AU2003246664B2; JP2006515270A; US9161520B2; JP2005532802A; DE60320258D1; ATE391781T1; CN1668641A; WO2004007722A3; JP4308760B2; EP1521831A2; US20160106077A1; WO2004007722A2; AU2003253044A1; US20100063250A1; WO2004007547A3; JP4414332B2; EP1995255A1; ES2304146T3; EP1521774A2; ATE406383T1

Abstract

Moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, designadas a continuación moléculas de tau de tipo IIA, que se caracterizan por las siguientes propiedades - las moléculas tienen truncados, como mínimo, los primeros 68 aminoácidos N-terminales y, como mínimo, los últimos 40 aminoácidos C-terminales de las 4 unidades repetidas que contiene la tau43, o los primeros 68 aminoácidos N-terminales y, como mínimo, los últimos 20 aminoácidos C-terminales de las 3 unidades repetidas que contiene la tau44 truncada, - las moléculas son detectables en el tejido cerebral enfermo de Alzheimer, mientras que las moléculas no son detectables en tejido cerebral normal sano, - las moléculas tienen, como mínimo, una actividad promotora del ensamblaje de microtúbulos, como mínimo, un 20% mayor que la tau tipo salvaje en un ensayo de ensamblaje de microtúbulos in vitro. - dicha actividad promotora del ensamblaje de microtúbulos se puede eliminar por inhibición específica, neutralizando los anticuerpos monoclonales contra dichas moléculas en un ensayo de ensamblaje de microtúbulos y - la actividad patológica de dichas moléculas depende de su unión a la red de microtúbulos definida por la actividad promotora del ensamblaje de microtúbulos.

Description

Proteínas tau truncadas.

La presente invención se refiere a formas enfermas de proteínas tau truncadas de forma N- y C-terminal, descubiertas específicamente en la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados.

La presente invención se refiere además a métodos para el cribado y la evaluación potencial de fármacos efectivos en la inhibición, neutralización y eliminación de proteínas tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal o en la prevención de la formación de las mismas, y a procedimientos para el cribado y la evaluación de fármacos potenciales cuyo modo de acción se basa en la neutralización de la modificación del ensamblaje y/o la dinámica de los microtúbulos provocadas por dichas formas enfermas de proteínas tau truncadas doblemente.

La enfermedad de Alzheimer es la causa más común de demencia. En menos del 5% de los casos la enfermedad de Alzheimer está relacionada casi completamente con una o más mutaciones específicas en la proteína precursora amiloide, genes de presenilina-1 o presenilina-2 (1) y en más del 95% de los casos, la causa exacta de la enfermedad no está clara.

Independientemente de su etiología, la enfermedad de Alzheimer se caracteriza histopatológicamente por la presencia de numerosas neuronas con ovillos neurofibrilares de filamentos helicoidales apareados (PHF) y depósitos extracelulares de amiloide \beta como el componente más importante de las placas seniles en el cerebro. Aunque la naturaleza exacta de una relación directa, si la hubiera, entre estas dos lesiones características de la enfermedad de Alzheimer no está determinada actualmente, la presencia de degeneración neurofibrilar parece que es necesaria para la expresión clínica de la enfermedad, es decir, la demencia (2, 3, 4). La degeneración neurofibrilar se representa por ovillos neurofibrilares, neuritas distróficas y hebras de neuropilo. La subunidad de proteína más importante de estas estructuras es la proteína tau asociada a microtúbulos (5, 6).

En el cerebro humano sano la proteína tau aparece en seis isoformas de proteína generadas por empalmes alternativos de ARNm de un transcripto derivado de un lugar de gen único. Las proteínas tau difieren si contienen tres (t3L, t3S, o t3) o cuatro (t4L, t4S, o t4) dominios de unión de tubulina (repetición, R) de 31 ó 32 aminoácidos cerca del extremo C-terminal y dos (t3L, t4L), uno (t3S, t4S), o ningún (t3, t4) insertos de 29 aminoácidos cada uno en la parte N-terminal de la molécula (7, 8). En condiciones fisiológicas, la proteína tau está implicada en el ensamblaje, organización espacial, estabilización y comportamiento de los microtúbulos. En condiciones fisiológicas la proteína aparece en seis isoformas en cerebros humanos sanos. Sin embargo en la EA, es conocido que la proteína tau experimenta una variedad de diferentes modificaciones postranslacionales (hiperfosforilación, ubiquitinación, glicosilación). El descubrimiento reciente de la relación de mutaciones específicas en el gen tau con la enfermedad de demencia frontotemporal y el Parkinsonismo con el cromosoma 17 (FTDP-17) ha confirmado que ciertas anormalidades en la proteína tau pueden ser una causa primaria de neurodegeneración y demencia en individuos afectados (9, 10). Los eventos moleculares que conducen a la modificación de tau y a la formación del filamento helicoidal apareado (PHF) en la enfermedad de Alzheimer no son conocidos. Esto explica la observación de un amplio espectro de eventos patofisiológicos, tales como redistribución patológica de la proteína tau, fallo de transporte axonal o un fallo en el mantenimiento de la función de los microtúbulos axonales (11, 12, 13). Hasta la fecha, se ha cuestionado la significancia de la formación de fibrilas PHF en la enfermedad de Alzheimer, a la luz del reciente descubrimiento de que cualquier proteína puede formar fibrilas in vitro (14).

Muchos autores creen que la formación de fibrilas helicoidales apareadas en la enfermedad de Alzheimer representa un evento primario en la patología neurofibrilar, que está basada en una fosforilación anormal. La proteína tau unida a PHF reacciona con ciertos anticuerpos de una manera dependiente de fosforilación, sugiriendo una situación de fosforilación especial (15, 16). Además, se ha observado que la proteína tau derivada de PHF muestra una movilidad electroforética reducida en geles de SDS, que puede estar relacionada con su patrón de fosforilación (Steiner y otros, EMBO J. 9 (1990), 3539-3544). De forma similar, se ha propuesto que debido a la fosforilación, las tau derivadas de PHF tienen una afinidad menor por los microtúbulos en comparación con la proteína tau normal, dado que se encontró un efecto similar cuando se fosforiló tau normal in vitro por ciertas quinasas (17, 18). Tau es una de las proteínas más solubles conocidas (19, 20, 21) y, por lo tanto, su agregación en la enfermedad de Alzheimer es particularmente enigmática. Por otra parte, el mecanismo por el que la proteína tau se modifica de una manera que conduce a la formación de filamentos en la enfermedad de Alzheimer no es conocido. La fosforilación de tau afecta al potencial de tau para formar agregados, produciendo efectos bien estimulatorios o bien inhibitorios en el ensamblaje de microtúbulos, presumiblemente dependiendo del lugar de la fosforilación (22-27). Muchos estudios in vitro demuestran que en presencia del agente reductor ditiotreitol (DTT), ácidos grasos insaturados libres, ARN o glicosaminoglicanos, la tau normal se puede transformar en filamentos (28-31, 38). Además, el proceso de formación de filamentos se puede acelerar además por la presencia de tau reticulada mediante la oxidación en el Cys322 (32). Los parámetros que varían en los diferentes estudios de ensamblaje de filamentos, que incluyen la concentración de proteína tau, pH y fuerza iónica han sido mucho mayores que los del citoplasma en condiciones fisiológicas. El examen de filamentos tau formados in vitro por microscopía de barrido de transmisión de electrones (STEM) mostró que estos filamentos difieren de los filamentos helicoidales apareados nativos (33). En ausencia de glicanos o ARN, no se detectan filamentos de tipo PHF en muestras que contienen tau tipo salvaje no fosforilada o fosforilada. Por otra parte, se ha sugerido que la fosforilación puede desempeñar un rol protector en la enfermedad de Alzheimer (34). Se han realizado sugerencias similares, como que la modificación de tau conduce a ensamblaje de PHF con resultado de desensamblaje de microtúbulos e interferencia con los procesos neuronales vitales, tales como transporte axonal, para la ubiquitinación y glicosilación (30, 35, 36, 37). Sin embargo ninguna de las modificaciones postranslacionales mencionadas anteriormente de forma única podría proporcionar una explicación molecular para el inicio de los cambios de tau que conducen a su disfunción, que se correlaciona con la expresión clínica en la enfermedad de
Alzheimer.

Por lo tanto, siguen siendo poco claras cuáles de las modificaciones mencionadas anteriormente de tau están implicadas en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.

Hasta la fecha no se disponen de datos fiables del modo o la regulación de los eventos postraslacionales que conducen a la formación de complejos tempranos de proteína tau. Para la prevención de la formación de estos complejos y para la neutralización de cualquier efecto patogénico asociado a los mismos, es necesario clarificar la naturaleza molecular precisa de la tau enferma y del mecanismo regulatorio que transforma la tau normal a su forma truncada doblemente de forma N- y C-terminal. Este conocimiento detallado permitiría construir herramientas para la terapéutica y diagnóstico del Alzheimer.

Zelman y otros (J. P. Neurochem. 72 (2) (1999), 741-750) sugieren que el producto de escisión de la proteína tau unida a microtúbulos se encuentra en el fluido cerebroespinal de personas con una lesión cerebral traumática y refleja el daño de las neuronas. Sin embargo, no se hace en este informe ninguna conexión con la enfermedad de Alzheimer.

Novak (Acta Virologica 38 (1994), 173-189) describe en este artículo de revisión concerniendo a los "Tauones", la unidad mínima de PHFs ("filamentos helicoidales apareados") resistente a proteasa producida artificialmente con la proteasa de amplio espectro "Pronasa".

Kontsekova y otros (J. Inmunol. Meth. 185 (1995), 245-248) describe un método de purificación rápido de proteínas tau humanas truncadas recombinantes para inmunoensayo, en el que se utiliza la resistencia al calor de la proteína tau humana. No se describen propiedades ni estructurales ni biológicas o funciones de la tau recombinante análoga utilizadas en este estudio.

En el trabajo de Novak y otros (EMBO J. 12 (1) (1993), 365-370) se habían preparado filamentos helicoidales apareados (núcleo PHF) in vitro artificialmente, en los que se recuperó una unidad mínima de tau resistente a proteasa, por digestión in vitro con la proteasa pronasa. Se utilizó el anticuerpo monoclonal MN423 para detectar la unidad mínima de tau resistente a proteasa. Sin embargo, los polipéptidos tau descritos en este artículo, no tienen propiedades biológicas, estructurales o patológicas comunes con las proteínas tau del "mundo real", especialmente proteínas tau que están conectadas con la enfermedad de Alzheimer.

Fasulo y otros (Alzheimer's Research 2 (5) (1996), 195-200) informa de que la sobre-expresión de un análogo recombinante de tau de núcleo de PHF no es suficiente para inducir la agregación de tau y el ensamblaje de la misma en filamentos helicoidales apareados. Estos datos contrastan con una publicación de Abraha y otros (J. Cell. Science (113) (21) (2000), 3737-3745) obviamente por el inusual sistema de ensayo no fisiológico descrito en esta publicación (líneas celulares de riñones de monos).

Fasulo y otros (J. Neurochem. 75 (2000), 624-633) describen fragmentos de tau que inducen apoptosis. Sin embargo, ninguna de las proteínas tau relacionadas con la enfermedad de Alzheimer descritas en la presente invención puede inducir apoptosis.

Esposito y otros (J. Peptide Science 6 (2000), 550-559) describe los 19 aminoácidos C-terminales de la proteína tau y la proteína tau sana normal. Los artículos de Novak y otros (Chem. Papers 52 (1998), 429-430) y Ugolini y otros (NeuroReport 8 (1997) 3709-3712), se refieren además a la proteína tau truncada de forma C-terminal con respecto también a la apoptosis. Publicaciones más recientes muestran que la enfermedad de Alzheimer no está relacionada con procesos de apoptosis.

En Abraha y otros (J. Cell Science 113 (21) (2000), 3737-3745) se describen experimentos in vitro a efectos de mostrar la contribución de los dominios únicos de proteína tau para la formación de filamentos. Por lo tanto, se han producido in vitro un conjunto de moléculas de tau recombinantes que se han polimerizado. No se han determinado ni generado actividades biológicas ni patológicas de estas proteínas en bacterias. Además, no se han descrito en este artículo datos con respecto a proteínas tau derivadas de cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer.

En Jicha y otros (J. Neuroscience Research 55 (1999), 713-723) se describe un ensayo molecular del epítopo de los anticuerpos monoclonales Alz50 y MC-1. Ambos anticuerpos dependen de un N-terminal funcional de la molécula de tau, especialmente de los aminoácidos de las posiciones 7-9. No se mencionan en este documento truncaciones de tau.

Brandt y otros (J. Biol. Chem. 268 (1993), 3414-3419) han analizado diferentes dominios de proteínas tau de humanos normales sanos. Para esto, fragmentos recombinantes de tau se han producido en bacterias. Sin embargo, no se describen en este documento fragmentos de tau truncadas relacionados con el Alzheimer.

Philippe y otros (J. Neuroscience Research 46 (1996), 709-719) dan a conocer anticuerpos monoclonales anti proteína precursora amiloide. Los autores describen la generación de un anticuerpo reactivo a tau, aunque este anticuerpo originalmente se desarrolló contra la proteína precursora amiloide. No se dan a conocer en este documento fragmentos de tau relacionados con las patologías del Alzheimer.

El documento WO 94/18560 Al da a conocer un inmuno ensayo para detectar la proteína tau humana en un líquido cerebroespinal para detectar a pacientes con las citopatías de las células nerviosas centrales. Este ensayo no discrimina entre la tau normal y la tau de pacientes con citopatías nerviosas centrales, sino que detecta la cantidad total de proteína tau en una muestra.

El documento WO 96/30766 A describe un inmunoensayo para agentes que modulan o inhiben la asociación tau-tau.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención dar a conocer marcadores fiables de este tipo, correlacionados con la disfunción patológica de las neuronas de la enfermedad de Alzheimer. Por otra parte, herramientas adecuadas para verificar la presencia de estos polipéptidos derivados de tau y ensayar la actividad de los mismos, serían herramientas valiosas para el diagnóstico y la terapéutica de la enfermedad de Alzheimer.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, que se caracterizan por las siguientes características:

- Las moléculas tienen truncados, como mínimo, los primeros 68 aminoácidos N-terminales y, como mínimo, los 40 aminoácidos C-terminales de las 4 unidades repetidas que contiene la tau43, o los primeros 68 aminoácidos N-terminales y, como mínimo, los 20 aminoácidos C-terminales de las 3 unidades repetidas que contiene la tau44.

- las moléculas son detectables en el tejido cerebral enfermo de Alzheimer, mientras que las moléculas no son detectables en tejido cerebral normal sano,

- las moléculas tienen, como mínimo, una actividad promotora del ensamblaje de microtúbulos, como mínimo, un 20% mayor que la tau tipo salvaje en un ensayo de ensamblaje de microtúbulos in vitro.

- dicha actividad promotora del ensamblaje de microtúbulos se puede eliminar por inhibición específica, neutralizando los anticuerpos monoclonales contra dichas moléculas en un ensayo de ensamblaje de microtúbulos y

- la actividad patológica de dichas moléculas depende de su unión a la red de microtúbulos definida por la actividad promotora del ensamblaje de microtúbulos.

A continuación, la designación "proteínas tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal" se utiliza para describir dos grupos de derivados de tau truncados que aparecen en los cerebros con enfermedad de Alzheimer y que se correlacionan fuertemente con la disfunción patológica de las neuronas de la enfermedad de Alzheimer. Particularmente, estas proteínas representan un grupo de moléculas que ejercen su función patológica modificando funciones biológicas asociadas a microtúbulos, tales como el ensamblaje de los microtúbulos.

A continuación, el término "complejos de proteína" se utiliza para proteínas tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal en forma de complejos homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos que se componen de moléculas que se asocian físicamente con tau y/o con proteínas tau truncadas doblemente.

Según se utiliza en la presente descripción, el término "tau" se refiere al grupo de las isoformas naturales más cortas presentes en el cerebro humano sano que contienen tres repeticiones (tau44) y cuatro repeticiones (tau43) en su dominio de unión a microtúbulos, según se ha descrito anteriormente (39, 40): tau43 (383 aminoácidos, exones perdidos 2 y 3 [posición 45-102]) tau44 (352 aminoácidos, exones perdidos 2, 3 y 10 [posición 45-102 y 275-307, respectivamente]). En la descripción siguiente, el término "tau tipo salvaje" se utiliza de forma sinónima a "proteína tau normal" y se refiere a la proteína tau derivada de cerebros sanos.

Ensayos convenientes de ensamblaje de microtúbulos (a menudo referidos alternativamente también como "ensayos de polimerización de microtúbulos") se describen, por ejemplo, en (19) y (20). El término "que previene" incluye cualquier inhibición significativa del 20% o mayor, preferentemente del 50% o mayor de la actividad promotora de la tau normal.

Preferentemente, la actividad promotora aumentada del ensamblaje de los microtúbulos es, como mínimo, un 20% mayor, especialmente, como mínimo, un 50% mayor que la tau tipo salvaje cuando se mide espectrofotométricamente.

El tipo preferente de moléculas de tau IIA se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo de Id. Sec. Nos. 11 a 18.

Los nuevos polipéptidos de tau según la presente invención (tau IIA) tienen características típicas y de localización única, dado que se localizan exclusivamente en el tejido cerebral enfermo de Alzheimer. Por otra parte, la interacción de estos polipéptidos con la tubulina no polimerizada (dímeros alfa/beta) y la forma polimerizada (como microtúbulos) es también única.

Según otro aspecto, la presente invención da a conocer un método para la preparación de moléculas según la presente invención, que se caracterizada por las etapas siguientes:

a) construcción de plásmidos de expresión procarióticos recombinantes que portan secuencias de codificación para una molécula de tau truncada doblemente con eliminaciones y una actividad promotora de ensamblaje de los microtúbulos tal como se ha definido anteriormente,

b) crecimiento de dichas bacterias en condiciones que permiten la expresión de la molécula de tau truncada doblemente de forma N- y C-terminal,

c) recolección de las bacterias, preferentemente por centrifugación,

d) nueva suspensión de la pastilla bacteriana,

e) sonicación de dichas bacterias,

f) fraccionamiento de dichas bacterias sonicadas por filtración en gel y

g) monitorización de la actividad de las fracciones obtenidas por un ensayo de ensamblaje de microtúbulos para identificar las diferentes actividades de las moléculas de tau de tipo IIA.

Por otra parte, la presente invención da a conocer un método para la preparación de moléculas según la presente invención, caracterizada por las etapas siguientes:

a) homogeneización de tejido cerebral enfermo de Alzheimer en una solución tampón, especialmente en una solución tampón de Tris,

b) precipitación con sulfato amónico de dicho tejido enfermo de cerebral,

c) redisolución en solución tampón de PIPES,

d) fraccionamiento de dicho material redisuelto por filtración de gel y

e) monitorización de la actividad de las fracciones obtenidas por un ensayo de ensamblaje de microtúbulos para identificar las diferentes actividades de las moléculas de tau de tipo IIA con, como mínimo, un 20% más de actividad promotora del ensamblaje de los microtúbulos que la tau tipo salvaje.

La presente invención da a conocer además un método para la conversión in vitro de microtúbulos a un estado patológico caracterizado por la incubación de la proteína tubulina con el tipo IIA en condiciones fisiológicas que permiten la interacción de dicha molécula de tipo IIA con los microtúbulos generando microtúbulos patológicos.

Según otro aspecto, la presente invención da a conocer un método de cribado de sustancias capaz de neutralizar los efectos patológicos de las moléculas de tipo IIA por sus características de eliminación y/o neutralización de las moléculas de tipo IIA y de restauración de los parámetros fisiológicos y las funciones de los microtúbulos causada por las moléculas de tipo II que comprende las etapas siguientes:

a) formación de microtúbulos patológicos en presencia de moléculas de tipo IIA y tubulina,

b) incubación de una mezcla de la sustancia, tipo IIA y tubulina con la sustancia que se va a cribar y

c) evaluación del resultado con respecto a la disminución de la formación de microtúbulos patológicos causados por moléculas de tipo IIA.

Según la presente invención, se da a conocer además un método para evaluar las sustancias efectivas en la inhibición de la actividad in vivo de moléculas de tipo IIA en promover la formación y la función anormal de los microtúbulos en un sistema celular que expresa moléculas de tipo IIA, que comprende las etapas siguientes:

a) introducir un gen funcional que codifica moléculas de tipo IIA bajo control de regiones reguladoras convenientes en una célula que expresa tau tipo salvaje,

b) permitir la formación de complejos entre moléculas de tau de tipo IIA y microtúbulos, de modo que dichos complejos estén implicados en la formación de microtúbulos patológicos,

c) aplicar la sustancia que se va a evaluar a células que contienen dichos complejos y

d) examinar el efecto de dicha sustancia en la actividad biológica de tau de tipo IIA en la actividad promotora del ensamblaje de los microtúbulos.

Según otro aspecto, la presente invención da a conocer animales no humanos transgénicos que expresan una molécula según la presente invención (tau IIA).

La presente invención se refiere además a la utilización de un animal transgénico según la presente invención como modelo animal para la enfermedad de Alzheimer, especialmente para el cribado y evaluación de fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Con la presente invención se da a conocer una vacuna que comprende una molécula según la presente invención (tau IIA), y un portador farmacéutico aceptable, especialmente un coadyuvante.

De este modo, la presente invención da a conocer:

(1) la identificación y caracterización molecular y funcional de formas enfermas de proteínas tau IIA truncadas de forma N- y C-terminal. Estas moléculas ejercen su función patológica en la enfermedad de Alzheimer modificando funciones biológicas asociadas a los microtúbulos, tales como el ensamblaje de los microtúbulos.

(2) métodos para el cribado y evaluación terapéutica de candidatos a fármacos (incluyendo anticuerpos) efectivos en la inhibición, neutralización y la eliminación de proteínas tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal o la prevención de la formación de las mismas

(3) el desarrollo de modelos animales que portan constructos génicos que codifican las respectivas proteínas tau truncadas doblemente como transgénicos o combinaciones transgénicas que se pueden utilizar para el cribado de fármacos.

(4) métodos para cribar moléculas que generan moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal

(5) composiciones diagnósticas y terapéuticas que reconocen y/o que interaccionan con dichas moléculas y el desarrollo de vacunas basadas en la antigenicidad de dichas proteínas doblemente truncadas

Por consiguiente, la presente invención se refiere a la caracterización de las formas patológicas de proteínas tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal y de sus epítopos, que se encuentran específicamente en la enfermedad de Alzheimer.

La degradación de proteínas es un fenómeno general que tiene lugar durante la eliminación fisiológica de las proteínas, que comprende la producción de productos de truncamiento intermedios de varios tamaños, generalmente con tiempos de vida cortos. La proteína at no es una excepción y experimenta este proceso en los cerebros sanos que contienen tau ts (tipo salvaje). En término siguiente "ts" abarca las 6 isoformas naturales de la proteína de tau que se encuentran normalmente en el cerebro de individuos sanos. Las diferentes formas de truncamiento corto de at encontradas en el cerebro enfermo de Alzheimer se producen en bacterias, purificadas hasta varios grados, con el objetivo de evaluar la función fisiológica de las proteínas at, para trazar sus dominios y epítopos de fosforilación o en experimentos que intentan entender los mecanismos del ensamblaje helicoidal apareado en la enfermedad de Alzheimer y otros desórdenes neurodegenerativos, con resultados ambiguos (23-27, 34, 41, 42). El término general "formas de proteínas tau truncadas de forma N- y C-terminal" se refiere a cualquier proteína tau en la enfermedad de Alzheimer con pérdida, como mínimo, de uno de sus aminoácidos en ambos extremos de la molécula. A través del ensayo de tau truncada doblemente en extractos de cerebros enfermos de Alzheimer se encontró, en el curso de la presente invención, que algunas de estas moléculas mostraban características estructural y funcionalmente distintas que permitieron discriminarlas de otros fragmentos de tau que se encuentran en el tejido enfermo cerebral de Alzheimer. En base a esta discriminación, se dio a conocer un nuevo esquema que define dos clases importantes de moléculas patógenas de moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal distintas de tau sanas: moléculas de tau de tipo I y II. Estos grupos pueden ser subdivididos además en dos subclases cada uno, en base a la estructura molecular y se designan como tipo IA y B, y tipo IIA y B, respectivamente.

El tipo IA y el tipo IIA representan tipos estructural y funcionalmente distintos de moléculas enfermas derivadas de la proteína tau asociada a microtúbulos generados por el proceso patológico. Las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, representan moléculas enfermas, derivadas de la proteína tau asociada a microtúbulos y aparecen durante los procesos patológicos específicos característicos de la enfermedad de Alzheimer. Ésta es una característica común de los cuatro grupos de proteínas derivadas de tau. Otras características comunes de todos los grupos son truncamientos N- y C-terminales, su localización intra-y extraneuronal y distinción funcional de la tau normal, sana.

El grupo de moléculas designado como "tipo IA" se describe por los ejemplos de Id. Sec. 1-3. Estas moléculas de tau truncadas se diferencian de tau normal por actuar como unidades clave (central), activas, y como fuerza impulsora para la interacción de tau patológica y tubulina. Las moléculas tanto de tipo IA como de tipo IB no tienen ninguna actividad promotora en el ensamblaje de los microtúbulos. De modo sorprendente, el tipo IA puede evitar que la tau normal promueva el ensamblaje de los microtúbulos (ejemplo comparativo 1). A pesar de las características primarias y de las masas moleculares similares, la secuencia de tipo IB, no muestra esta actividad funcional in vitro (ejemplo comparativo 2). Esto sugiere una actividad de unión fuerte del tipo IA a tubulina y, que de este modo, proporciona un efecto dominante negativo en la fisiología de tau. Por lo tanto, las moléculas de tipo IA son muy probablemente responsables del agotamiento continuo, crónico de neuronas de la red microtubular funcional y de participar en las estructuras neurofibrilares que se correlacionan directamente con la severidad clínica de la enfermedad de Alzheimer. Inesperadamente, el tipo IB (por ejemplo, Nos. Id. Sec.: 4-10), a pesar de tener masa y secuencias moleculares similares al grupo de moléculas de tipo IA, no muestran ninguna de las actividades patológicas de los miembros del grupo IA (véase el ejemplo 2). En contraste con estos grupos, los derivados de tau doblemente truncados de tipo IIA se unen a microtúbulos y promueven su ensamblaje patológico (ejemplo 1). A continuación, los microtúbulos promovidos por el tipo IIA se designan como "microtúbulos patológicos". De modo sorprendente, moléculas con secuencias e intervalos de pesos moleculares similares (tipo IIB) carecen de esta capacidad elevada de ensamblaje de microtúbulos. En ensayos de ensamblaje de microtúbulos, éstos actuaron a niveles observados en la proteína de tau integral (véase el ejemplo 1).

Los derivados truncados de forma N- y C-terminal de ambos grupos (tipo IIA y B) interfieren a nivel celular con el transporte axonal conduciendo a la pérdida sináptica, que da lugar en última instancia a la disfunción neuronal y a la debilitación cognoscitiva en los pacientes de la enfermedad de Alzheimer. Simultáneamente, las neuronas afligidas son vulnerables a varias formas de tensión, tales como tensión oxidativa (ejemplo 2). A pesar de que el tipo IIB tiene tamaños moleculares similares al tipo IIA promueve además el ensamblaje de microtúbulos a niveles considerados para la tau integral sana (tau tipo salvaje) cuando se mide espectrofotométricamente.

Las moléculas de tipo IIA de la presente invención, las versiones recombinantes de dichas moléculas, se pueden obtener realizando las etapas siguientes:

a) construcción de plásmidos de expresión procarióticos recombinantes que portan secuencias de codificación para una molécula de tau truncada doblemente,

b) crecimiento de dichas bacterias en condiciones que permiten la expresión de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal,

c) recolección de las bacterias por centrifugación,

d) resuspensión de nuevo de la pastilla bacteriana en 500 ml de cultivo en solución tampón A: (20 mM PIPES pH 6,9, 50 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO_{4}, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF)

e) sonicación en hielo durante 1 minuto (tres veces) centrifugación a 45000 rpm, 15 minutos a +2ºC (rotor TLA-120,2, Beckman Optima TLX)

f) cromatografía en fosfocelulosa, o MONO S HR 5/5 o columna HP de Sefarosa de 5 ml HiTrap SP en un gradiente lineal 0-1 M de NaCl en solución tampón "A", identificando las proteínas obtenidas por SDS-PAGE y un ensayo tipo transferencia Western.

Como un ejemplo comparativo, los miembros del grupo de tau de tipo IA truncados doblemente de forma N- y C-terminal comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos:

Los derivados de las cuatro repeticiones de tau (tau 43) serán etiquetados como R4

No. Id. Sec.: 1 (239-333, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

\vskip1.000000\baselineskip

No. Id. Sec.: 2 (237-333, R4)

asp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

\vskip1.000000\baselineskip

No. Id. Sec.: 3 (239-318, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu

Como un ejemplo comparativo, los miembros del grupo de tau de tipo IB truncados doblemente de forma N- y C-terminal comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos:

No. Id. Sec.: 4 (239-326, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala

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No. Id. Sec.: 5 (239-328, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr

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No. Id. Sec.: 6 (239-331, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val. asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly

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No. Id. Sec.: 7 (239-334, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile

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No. Id. Sec.: 8 (239-340, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val

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No. Id. Sec.: 9 (239-343, R4)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly

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Los derivados de las tres repeticiones de tau (tau 44) serán etiquetados como R3

No. Id. Sec.: 10 (208-302, R3)

leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

Puede haber uno o más epítopos de la proteína tau que se encuentren específicamente en miembros de tipo IA o de tipo IIA en formas enfermas de proteínas tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal.

Dichos epítopos están situados específicamente dentro de la estructura primaria de los miembros del grupo de tipo IA (Nos. Id. Sec. 1-3) y de tipo IIA (Nos. Id. Sec. 11-18) y su número, heterogeneidad y especificidad depende de la conformación estructural específica de cada miembro individual del grupo y se añade por la misma. Por lo tanto, la singularidad de cada molécula no se basa solamente en su estructura primaria junto con sus efectos sobre el ensamblaje de los microtúbulos, sino también en su estructura secundaria y ternaria, que compone sus epítopos. Algunos de ellos pueden formar "regiones conformacionales" particularmente importantes que contribuyen significativamente a la actividad de dichas moléculas.

El término "región conformacional" según se utiliza en la presente descripción, se refiere a epítopos agrupados a una región de la molécula contribuyendo a su actividad.

La región conformacional en moléculas de tipo I y tipo II puede comprender los aminoácidos "ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu" que corresponden a los residuos 239-267 (Nos. Id. Sec.: 1-9 y 11-14, 19 R4) y se designó como secuencia A a las que comprenden los aminoácidos "val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu" que corresponden a los residuos 217-236 (Nos. Id. Sec.: 10, 15-18, 20 R3).

Dichos epítopos en dicha región conformacional se identificaron y su contribución relativa fue determinada por mutagénesis de eliminación. La significancia de todos estos epítopos y su relación con la función en microtúbulos se demuestra por formas mutantes que mostraron que estaban contribuyendo en distintos grados a la actividad de las moléculas de tipo IA (ejemplo comparativo 3). Estos epítopos individuales comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos:

A: ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu (que corresponden a los residuos 239-267 en los Nos. Id. Sec.: 1-9 y 11-14, 19). El mutante de eliminación de epítopo tiene el No. Id. Sec.: 21 (268-333, R4; elim. 239-267)

gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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A1: ile lys his val pro gly gly gly ser (que corresponde a los residuos 239-247 en los Nos. Id. Sec.: 1-9 y 11-14, 19). El mutante de eliminación tiene el No. Id. Sec.: 22 (248-333, R4; elim. 239-247)

val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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A2: ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu (que corresponde a los residuos 239-257 en Nos. Id. Sec.: 1-9 y 11-14, 19). El mutante de eliminación tiene el No. Id. Sec.: 23 (258-333, R4; elim. 239-257)

ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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A3: ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser (que corresponde a los residuos 239-262 en los Nos. Id. Sec.: 1-9 y 11-14, 19). El mutante de eliminación tiene el No. Id. Sec.: 24 (263-333, R4; elim. 239-262)

lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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A4: ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser (que corresponde a los residuos 246-262 en los Nos. Id. Sec. 1-9 y 11-14,19). El mutante de eliminación de epítopo tiene el No. Id. Sec.: 25 (239-333, R4; elim. 248-262)

ile lys his val pro gly gly gly lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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A5: asp leu ser lys val thr ser, que corresponde a los residuos 256-262 en los Nos. Id. Sec.: 1-9 y 11-14,19, y a los residuos 225-231, R3 Nos. Id. Sec.: 10, 15-18, 20. El mutante de eliminación de epítopo tiene el No. Id. Sec.: 26 (239-333, R4; elim. 256-262)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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A6: lys cys gly ser leu que corresponde a los residuos 263-267 en Nos. Id. Sec.: 1-9 y 11-14, 19 y a los residuos 232-236, R3 en los Nos. Id. Sec.: 10, 15-18, 20. El mutante de eliminación de epítopo tiene el No. Id. Sec.: 27 (239-333, R4; elim. 263-267)

ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

De nuevo, debe entenderse que no todos los aminoácidos del péptido contribuyen necesariamente al sitio específico reconocido realmente por anticuerpos específicos.

Otra realización de la presente invención es la combinación del presente método que comprende varios métodos de extracción, muchos de ellos conocidos por sí mismos en la técnica, combinados con ensayos funcionales con las mencionadas formas de tau truncadas doblemente, que conducen a la identificación de moléculas adicionales que afectan a las funciones de tau y de los microtúbulos. La producción de proteína tau a partir de un extracto cerebral puede variar en la funcionalidad de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal extraídas, dependiendo del desprendimiento de la muestra particular del tejido cerebral (ejemplo 3). El técnico en la materia sabe utilizar el método de la presente invención para una variedad de propósitos diferentes que quedan todos abarcados por el alcance de protección de la presente invención.

El grupo de moléculas designado como "tipo II" comprende las moléculas de proteína tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal (por ejemplo, las secuencias descritas en los Nos. Id. Sec. 11-20). Los representantes de este grupo se localizan intra- y extraneuronalmente y son funcionalmente diferentes de la tau normal, sana.

El descubrimiento y el aislamiento de este grupo de proteínas, en los que subyace la presente invención, da a conocer (1) una descripción y una caracterización molecular de las modificaciones de tau que conducen a la unión específica a los microtúbulos y a la promoción anormal del ensamblaje de los microtúbulos (ejemplo 1) con consecuencias patológicas a su portador (ejemplo 2), (2) anticuerpos específicos para los epítopos de la proteína y (3) anticuerpos que neutralizan las actividades patológicas de dichas moléculas de tipo II (ejemplo 6), (4) métodos para el cribado y la evaluación de candidatos a fármacos terapéuticos efectivos en la inhibición, neutralización y eliminación de dichas proteínas de tipo II o (5) métodos para el cribado y la evaluación de candidatos a fármacos terapéuticos efectivos en la inhibición de la formación de proteínas derivadas de tau, tales como moléculas de tipo II, (6) el desarrollo de modelos animales que portan constructos genéticos que codifican a las respectivas proteínas tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal como transgénicos o combinaciones transgénicas que se pueden utilizar para el cribado de fármacos, (7) composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de dichas proteínas tau truncadas doblemente y sus proteasas, (8) composiciones diagnósticas y terapéuticas que reconocen/interaccionan con dichas moléculas, (9) desarrollo de vacunas basadas en dichas proteínas truncadas doblemente, (10) métodos que implican dichas proteínas y sus epítopos y/o anticuerpos u otras pruebas específicas para la diagnóstico in vitro e in vivo de la enfermedad de Alzheimer y otros desórdenes relacionados con los cambios patológicos de tau.

En comparación con los grupos de tipo IA y B, las moléculas de tipo IIA promueven el ensamblaje patológico de los microtúbulos significativamente más que el ensamblaje de los microtúbulos promovido por las isoformas de tau sanas normales, cuando se mide espectrofotométricamente (véase el ejemplo comparativo 1 y el ejemplo 1, respectivamente). De modo sorprendente, un subgrupo de moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal con secuencias e intervalos de pesos moleculares similares (tipo IIB) carece de esta capacidad "elevada" de ensamblaje de microtúbulos. En ensayos de ensamblaje de microtúbulos, este subgrupo de moléculas actúa a los niveles observados con la proteína tau integral (ejemplo 1).

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un nuevo tipo de proteína tau modificada encontrada en la enfermedad de Alzheimer, llamada grupo de tipo IIA de proteínas tau. El grupo comprende moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal (Nos. Id. Sec. 11-18).

El término "moléculas de tipo II" se refiere a miembros del grupo significativamente diferente en estructura y función, no sólo de tau sana normal, sino además de tau del grupo de tipo IA y -B. Las moléculas de este subgrupo se unen a microtúbulos y promueven su ensamblaje patológico que es considerablemente más pronunciado que el ensamblaje de microtúbulos normal por las isoformas sanas de tau (ejemplo 1). Las moléculas de tau de tipo IIA truncadas doblemente de forma N- y C-terminal interfieren a nivel celular con el transporte axonal de los constituyentes conduciendo a la pérdida sináptica y al malfuncionamiento neuronal, que conducen en última instancia al deterioro cognoscitivo de todo el organismo, en las neuronas de la enfermedad de Alzheimer y en condiciones experimentales (Ejemplos 9 y 10, respectivamente). Simultáneamente, las neuronas afligidas son vulnerables a varias formas de tensión, como por ejemplo la tensión oxidativa (ejemplo 2).

En una realización preferente de la presente invención, dicho grupo de miembros doblemente truncados de forma N- y C-terminal de tipo IIA comprende las secuencias de aminoácidos:

Los derivados de las cuatro repeticiones de tau (tau 43) se etiquetan como R4

No. Id. Sec.: 11 (69-333, R4)

met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asn val gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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No. Id. Sec.: 12 (93-333, R4)

ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asn val gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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No. Id. Sec.: 13 (69-363, R4)

met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asn val gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val asp

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No. Id. Sec.: 14 (93-363, R4)

ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asn val gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val asp

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Los derivados de las tres repeticiones de tau (tau 44) se etiquetan como R3

No. Id. Sec.: 15 (93-302, R3)

ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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No. Id. Sec.: 16 (69-302, R3)

met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu

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No. Id. Sec.: 17 (93-332, R3)

ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val asp

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No. Id. Sec.: 18 (69-332, R3)

met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val asp

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Para comparación, dichos miembros doblemente truncados de forma N- y C-terminal del grupo de tipo IIB comprenden las secuencias de aminoácidos:

No. Id. Sec.: 19 (6-378, R4)

gln glu fe glu val met glu asp his ala gly thr tyr gly leu gly asp arg lys asp gln gly gly tyr thr met his gln asp gln glu gly asp thr asp ala gly leu lys ala glu glu ala gly ile gly asp thr pro ser leu glu asp glu ala ala gly his val thr gln ala arg met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asn val gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val asp ser pro gln leu ala thr leu ala asp glu val ser ala ser leu

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No. Id. Sec.: 20 (6-347, R3)

gln glu fe glu val met glu asp his ala gly thr tyr gly leu gly asp arg lys asp gln gly gly tyr thr met his gln asp gln glu gly asp thr asp ala gly leu lys ala glu glu ala gly ile gly asp thr pro ser leu glu asp glu ala ala gly his val thr gln ala arg met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp fe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr fe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val asp ser pro gln leu ala thr leu ala asp glu val ser ala ser leu

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En una realización preferente, dicho tipo IIA de proteínas tau enfermas tiene las características siguientes:

a) las proteínas están truncadas de forma N- y C-terminal (ejemplo 3)

b) son promotores patológicos eficientes del ensamblaje de microtúbulos (ejemplo 1; figura 28C)

c) su actividad promotora de ensamblaje de microtúbulos patológicos se puede eliminar mediante compuestos específicos, tales como, por ejemplo anticuerpos monoclonales inhibitorios o derivados de los mismos (ejemplo 6)

d) las proteínas no están presentes en el cerebro sano normal (ejemplo 3)

e) deterioran significativamente las funciones de transporte intracelular (ejemplo 10)

f) su actividad patológica depende de una afinidad de unión elevada a la red microtubular y de su debilitación funcional (ejemplo 1)

g) parecen ser conformacionalmente diferentes de la tau normal (ejemplo 3).

Las moléculas de tipo IIB tienen las características siguientes:

a) las proteínas están truncadas de forma N- y C-terminal.

b) son menos efectivas en promover el ensamblaje de los microtúbulos que el tipo IIA

c) las proteínas no están presente en el cerebro sano normal

d) es probable que deterioren la función de los microtúbulos por su unión a éstos, sin embargo en un grado inferior que el observado para el tipo IIA

e) parecen ser conformacionalmente diferentes de la tau normal.

Los epítopos de las moléculas de tipo IIA y B se pueden identificar de una manera similar según se ha descrito para moléculas de tipo I. La importancia de las moléculas de tipo II, de todos estos epítopos y sus relaciones con la función en los microtúbulos se demuestra por formas mutantes, que mostraron que están contribuyendo en varios grados a la actividad de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, tales como se muestra en el ejemplo de tipo IA.

Por lo tanto, un inhibidor útil en la composición de la presente invención es cualquier inhibidor capaz de modular la interacción patológica de las moléculas de tipo IIA con microtúbulos que da como resultado "microtúbulos patológicos". El término "microtúbulos patológicos", según se utiliza en la presente descripción, se refiere a los microtúbulos modificados por las moléculas de tipo II. El modo de acción de una molécula inhibitoria de este tipo comprende una interacción bien con microtúbulos, bien con moléculas asociadas a microtúbulos que incluyen tau y derivados patológicos de los mismos. Como fuente de inhibidores se puede utilizar bibliotecas de moléculas pequeñas de estructura y composición química definidas, bibliotecas de péptidos, bibliotecas de anticuerpos libres en solución o que se expresan en superficies sintéticas, o en fagos o en bacterias o ribosomas (expresión ribosómica) y las tecnologías similares conocidas en la técnica.

Estos "inhibidores" pueden ser específicos para el epítopo o los epítopos comprendidos en las moléculas de tipo IIA, mediante, por ejemplo, el bloqueo del epítopo o se pueden dirigir a varios dominios de moléculas de tipo IIA, siempre que prevengan o alteren su actividad patológica o biológica in vitro o in vivo. El efecto inhibitorio puede ser definido cuantitativamente, por ejemplo, midiendo la actividad promotora residual de ensamblaje de microtúbulos por la tau normal o midiendo parámetros de los microtúbulos intracelulares, tales como la extensión, estabilidad o transporte intracelular.

En otra realización las moléculas de tipo IIA pueden ser inhibidas o neutralizas por derivados de las mismas, por ejemplo, como proteínas negativas dominantes expresadas en la célula respectiva. Según se describe en la presente invención para el cribado de moléculas inhibitorias, los péptidos de tipo IIA y los derivados de los mismos, por ejemplo los péptidos que contienen eliminaciones o mutaciones, se pueden evaluar o explorar para sus efectos sobre la inhibición los efectos patológicos de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal.

El efecto terapéutico se alcanza mediante la inhibición del debilitamiento de la estructura y de las funciones de los microtúbulos.

Por consiguiente, otro objetivo de la presente invención es dar a conocer composiciones farmacéuticas que contienen un inhibidor específico para moléculas de tau de tipo IIA de la presente invención, opcionalmente conjuntamente con un portador farmacéutico aceptable y/o diluyente.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere especialmente al No. Id. Sec.: 11 como prototipo del grupo de moléculas de tipo IIA.

Aún otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un método para la conversión in vitro de microtúbulos normales a un estado patológico, en los que la proteína tau normal se incuba con el tipo IIA de la presente invención en condiciones fisiológicas que permitan la interacción de dicho tipo IIA con microtúbulos generando microtúbulos patológicos.

La presente invención se refiere además a un ensayo de cribado que permite el cribado de cualquier biblioteca de moléculas para compuestos capaces de neutralizar los efectos patológicos de moléculas de tipo IIA. En la presente evaluación, las moléculas se criban por sus características de eliminación y/o neutralización de moléculas de tipo IIA y restauración de los parámetros y las funciones fisiológicas de los microtúbulos causados por moléculas de tipo II. El ensayo de cribado de fármacos comprende las etapas siguientes:

(1) formación de microtúbulos patológicos en presencia de moléculas de tipo IIA y tubulina en condiciones apropiadas (ejemplos 1 y 2, respectivamente).

(2) incubación de estos microtúbulos patológicos con el candidato a fármaco que va a examinarse

(3) examen del resultado con respecto a la neutralización del efecto de moléculas de tipo IIA en microtúbulos. (Ejemplos 4 y 6, respectivamente).

Se puede establecer un sistema de cribado in vitro para inhibidores que alivian los efectos sobre los microtúbulos causados por tau patológica de tipo IIA truncada doblemente de forma N- y C-terminal. Estos "inhibidores" pueden ser específicos para el epítopo o los epítopos comprendidos en las moléculas de tipo IIA, mediante, por ejemplo, el bloqueo del epítopo o se pueden dirigir a varios dominios de moléculas de tipo IIA, siempre que prevengan o alteren su actividad. El efecto inhibitorio puede ser cuantificado midiendo la dinámica del ensamblaje de los microtúbulos. Como una fuente de inhibidores se puede utilizar bibliotecas de moléculas pequeñas de estructura y composición química definidas, bibliotecas de péptidos, bibliotecas de anticuerpos libres en solución o que se expresan en superficies sintéticas,
o en fagos o en bacterias o ribosomas (expresión ribosómica) y tecnologías similares conocidas en la técnica.

Para el objetivo de la presente invención, es suficiente que el fármaco que se evalúa sea efectivo en la reducción de la cantidad de moléculas de tipo IIA y/o su actividad, cumpliendo de este modo un efecto terapéutico suplementario, aunque es preferente una eliminación total de la actividad de tipo IIA.

El técnico en la materia sabe cómo utilizar el método de la presente invención para una variedad de diferentes propósitos, que quedan todos dentro del alcance de protección de la presente invención.

Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un método para la validación de fármacos en células vivas, es decir, neuronas o células de tipo neurona que expresan moléculas de tipo II (ensayo celular de tipo II). Alternativamente, pueden ser utilizados cultivos neuronales primarios derivados de animales transgénicos u otras células neuronales primarias derivadas de varias fuentes que expresan moléculas de tipo IIA.

El término "neuronas que expresan moléculas de tipo II" tal como se ha utilizado anteriormente, se refiere a células que expresan establemente las moléculas de tipo IIA o que tienen la capacidad de expresar moléculas de este tipo y dentro de las que se ha introducido un gen funcional de tipo IIA, bien por técnicas de cultivo celular o mediante transgénesis según se ejemplifica a continuación.

En una realización preferente, dicha célula que expresa moléculas de tipo IIA es un neuroblastoma, o célula de feocromocitoma o un cultivo primario de células nerviosas derivadas de animales transgénicos que expresan moléculas de tipo IIA.

El técnico en la materia conoce el hecho de que la secuencia de la introducción de los genes que codifican moléculas de tipo IIA no es relevante a los propósitos del método de la presente invención.

La presente invención se refiere a un método para evaluar fármacos efectivos en la inhibición del tipo IIA que promueve la formación y la función anormal de los microtúbulos en un sistema celular que expresa moléculas de tipo IIA que comprenden las etapas siguientes:

a) introducir un gen funcional que codifica moléculas de tipo II bajo el control de regiones reguladoras adecuadas en una célula que expresa la proteína de tau normal

b) permitir la formación de complejos entre tau de tipo IIA y los microtúbulos (microtúbulos patológicos)

c) aplicar el fármaco a evaluar a las células que contienen los complejos resultantes

d) examinar el efecto de dicho fármaco en la actividad biológica del tipo IIA, tal como modificaciones de la red de microtúbulos y de sus funciones asociadas.

En otra realización adicional más preferente de la presente invención es el fenotipo de las neuronas el que expresa moléculas de tipo IIA. Las neuronas que expresan estas moléculas en condiciones apropiadas causan la alteración de los procesos de transporte intracelulares. Además, las neuronas que expresan moléculas de tipo IIA experimentan muerte celular en condiciones apropiadas de tensión (ejemplo 2).

Dicho método es particularmente ventajoso, dado que se genera el sistema implicado, que se basa en la utilización de líneas celulares que crecen continuamente que proporcionan una imagen cercana de la situación in vivo, proporciona una fuente amplia de moléculas de tipo IIA localizadas intracelularmente, permitiendo el cribado de fármacos para compuestos efectivos en el alivio de los efectos intracelulares de tipo IIA.

En una realización preferente la lectura de este ensayo celular se adapta para sistemas de cuantificación de baja o alta capacidad de procesamiento. El término "condiciones apropiadas" en conexión con los fenotipos mencionados que conducen a la interrupción o al deterioro del transporte microtubular y/o a la muerte neuronal, se refiere a cualquier enfermedad que permita la aparición de dichos fenotipos según las indicaciones del ejemplo.

Para el objetivo de la presente invención, es suficiente que el fármaco potencial bien cribado por este sistema, o bien validado en el sistema o fármaco de un tercer origen, sea efectivo en la reducción de la escala de los fenotipos, satisfaciendo de este modo una función suplementaria en terapia, aunque se prefiere por el fármaco una eliminación total o la reducción de los fenotipos enfermos.

Además de líneas celulares que crecen establemente o celulares primarias, la invención respectiva se puede ampliar además a un sistema análogo de lectura utilizando células derivadas de animales completos que expresan moléculas de tipo IIA en sus neuronas (el modelo de animal transgénico se ejemplificará a continuación).

El técnico en la materia sabe utilizar el método de la presente invención para una variedad de propósitos diferentes que todos quedan bajo el alcance de la protección de la presente invención.

En una realización preferente dichas células y animales transgénicos que expresan establemente formas de tau de tipo IIA truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, permiten trazar las rutas de la enfermedad, proporcionando información valiosa que conduce a nuevas moléculas relevantes en la patogénesis de la enfermedad, diagnóstico y tratamiento de Alzheimer. Estos procedimientos de cribado e identificación incluyen tecnologías de cribado basadas en expresión de ARNm, así como tecnologías basadas en proteínas.

En una realización preferente, dichas moléculas de tipo IIA o los derivados de las mismas proporcionan además un constructo de ADN recombinante que se puede introducir en el genoma de animales no humanos, con el fin de proporcionar un modelo animal transgénico que porta y que expresa las formas patógenas de tipo IIA truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, descritas anteriormente. Los animales transgénicos según la presente invención incluyen animales en los cuales la construcción se ha introducido directamente, así como progenie de estos animales que conservan la capacidad de expresar la construcción. La secuencia transgénica es una secuencia de polinucleótidos unida funcionalmente a un promotor expresado ubicuamente o a uno específico de tejido. Preferentemente, el ADN transgénico que codifica moléculas de tipo IIA es ADNc y/o ADN genómico derivado de fuentes animales o
humanas.

Se espera que los animales transgénicos que expresan moléculas de tipo IIA desarrollen cambios funcionales a nivel celular y/o de órgano que se relacionan de forma fenotípica con la enfermedad de Alzheimer. Entre estos se incluyen cambios histológicos, cambios de expresión de ARN, cambios de parámetros fisiológicos celulares y, preferentemente, cambios del comportamiento característicos de la EA. En neuronas maduras de animales transgénicos la expresión de moléculas de tipo IIA no se había evaluado anteriormente.

Se espera que el nivel al que los transgenes de tipo IIA se expresan en el animal transgénico (es decir, el nivel de ARNm transgénico), sea un parámetro importante para obtener defectos patofisiológicos constantes en el animal transgénico. Mediante la cría y el cruzamiento de animales que llevan los transgenes, se pueden aumentar atenuar o modular de otra manera las características patológicas tales como, por ejemplo, introduciendo el transgén en las cadenas animales que sirven actualmente como modelos de la enfermedad, animales que expresan otros transgenes o animales que carecen de expresión funcional de genes (véase el ejemplo 8).

Más particularmente, la presente invención proporciona una célula animal no humana transgénica, en la que el ADN que codifica la molécula de tipo IIA se expresa bajo control transcripcional de promotores ubicuos o específicos de tejido adecuados incluyendo modificaciones regulables de los mismos.

Las células manipuladas según la presente invención se pueden preparar por cualquier técnica de transfección conocida. La secuencia de ADN se puede introducir por manipulación genética directa o en una generación anterior de la célula. Así, las células se pueden obtener de animales transgénicos y cultivar in vitro. Además, los animales transgénicos pueden ser generados según métodos bien establecidos, tales como manipulación de embriones, por ejemplo, por transferencia del gen en las células madre embrionarias, infección retroviral de embriones jóvenes o microinyección pronuclear. Es preferente la técnica de microinyección pronuclear. Las unidades de trascripción obtenidas de una construcción de ADN recombinante de la presente invención se inyectan en los pronúcleos de los embriones animales y se crían los fundadores transgénicos obtenidos.

Los resultados obtenidos en la descendencia se pueden analizar utilizando varias técnicas bien conocidas en la técnica. Los modelos basados en las células y los animales de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, para identificar y para determinar la eficiencia de agentes terapéuticos potenciales en las enfermedades neurodegenerativas, en los que se pueden analizar tau y moléculas derivadas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal y además de otras moléculas relacionadas con la enfermedad de Alzheimer, tales como APP y derivados de los mismas. Particularmente, estos modelos se pueden utilizar en el ensayo de cribado o caracterización para detectar agentes que probablemente prevengan los efectos patógenos de las moléculas derivadas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, descritas en la presente invención.

Por consiguiente, en un aspecto adicional la presente invención comprende un método para evaluar un agente terapéutico potencial para una enfermedad especificada, particularmente una enfermedad neurodegenerativa, preferentemente EA, en el que se utiliza una célula derivada de un animal transgénico que expresa dichas formas de tau truncadas doblemente como célula diana. Más particularmente, comprende un método en el que el agente terapéutico tal como, por ejemplo, anticuerpos o sus derivados, se administran a un animal transgénico de la presente invención o se introducen por cruzamiento o manipulación genética y se evalúa posteriormente por los sistemas de ensayo descritos anteriormente. Por otra parte, la presente invención comprende un ensayo de cribado o de caracterización que comprende o que incluye este método, así como un equipo de ensayo de cribado que comprende las células de la presente invención. Los métodos para explorar agentes terapéuticos potenciales que utilizan las líneas celulares que expresan moléculas de tipo IIA de la presente invención se dan en la presente invención (véase el ejemplo 9). Las células y los animales de la presente invención se pueden utilizar de manera análoga.

Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer composiciones farmacéuticas que contienen un inhibidor específico para las formas truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de proteínas de tau, opcionalmente en conjunto con un portador y/o diluyente aceptables farmacéuticamente.

El término "inhibidor específico para tau truncada doblemente de forma N- y C-terminal" se refiere a las sustancias que inhiben específicamente las acciones de dichas proteínas tau truncadas doblemente. La naturaleza de un inhibidor puede ser un anticuerpo, una molécula sintetizada, derivada del mismo, cualquier péptido o composición química definida que exhibe la actividad inhibitoria deseada en los sistemas de evaluación de la presente invención.

Otro objetivo de la presente invención es un anticuerpo o un derivado del mismo que reconoce específicamente un epítopo de la presente invención y puede inhibir parcial o totalmente las actividades patológicas de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal.

El término "oligo- o polipéptido que comprende un epítopo, o epítopos de la presente invención" se refiere a péptidos que en su estructura bi o tridimensional reconstituyen el epítopo de la presente invención que se reconoce específicamente por un anticuerpo dirigido a los mismos. Por otra parte, dichos oligo o polipéptidos pueden comprender solamente los aminoácidos que representan dicho o dichos epítopos o pueden comprender aminoácidos adicionales. La construcción de estos oligo- o polipéptidos es bien conocida en la técnica.

Además se dan a conocer anticuerpos monoclonales y derivados de los mismos nativos o recombinantes, inmovilizados, libres en solución o que se expresan en la superficie de diferentes moléculas o bacterias, virus, u otras superficies. Los anticuerpos y sus derivados pueden inhibir parcial o totalmente las actividades biológicas de moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal. Se ha mostrado una actividad de anticuerpo específico de este tipo utilizando el anticuerpo monoclonal DC44 cultivado contra dichas moléculas de tau truncadas doblemente aisladas de tejido cerebral enfermo de Alzheimer (ejemplo 5 y ejemplo comparativo 6, respectiva-
mente).

Dicho o dichos anticuerpos tienen muchas otras variantes (DC82, DC136, etc.) y pueden ser un anticuerpo derivado de un suero o monoclonal, o cualquier derivado de los mismos. La producción tanto de anticuerpos monoclonales como policlonales a un epítopo deseado es bien conocida en la técnica (43). Además, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo natural o derivado por ingeniería genética, tal como un anticuerpo quimérico derivado por técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por otra parte, dicho anticuerpo también se refiere a un fragmento de un anticuerpo que ha conservado su capacidad de unirse al epítopo específico, tal como un fragmento de Fab o un minicuerpo de Fv de cadena única, o a los anticuerpos de cadena única expresados intracelularmente llamados intracuerpos.

En una realización preferente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su utilización en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Asimismo, dicha composición farmacéutica se puede administrar a un paciente que necesite la misma, por la ruta y con la dosificación que se juzgue apropiada por el médico que se encarga del caso.

En otra realización preferente de la presente invención, dicha composición farmacéutica contiene como inhibidor específico, como mínimo, un anticuerpo monoclonal o molécula pequeña o un derivado de los mismos que se une a cualquier parte del grupo de epítopos enumerados anteriormente conduciendo a la alteración y/o neutralización, parcial o completa de los mismos (véanse los ejemplos 5, 6 y el ejemplo comparativo 6, respectivamente).

Se dan a conocer composiciones de diagnóstico para la detección y/o la monitorización de la enfermedad de Alzheimer que comprenden a) un epítopo o epítopos de la presente invención; b) un anticuerpo de la presente invención o una molécula derivada del mismo.

La composición de diagnóstico de la presente invención puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que reconoce específicamente a un miembro del grupo de moléculas de tipo IA o de tipo II o su epítopo o epítopos o un nivel aumentado de moléculas de tipo IA o de tipo IIA en una muestra a evaluar. En otra realización, dicha composición de diagnóstico puede comprender un anticuerpo de la presente invención dirigido a uno de los epítopos de la presente invención. De este modo, una muestra que se correlaciona con el estado de la enfermedad de Alzheimer puede ser detectada tratando dicha muestra con un anticuerpo que reconoce el epítopo de la presente invención. El complejo de anticuerpo-epítopo (hapteno) se puede visualizar utilizando un segundo anticuerpo dirigido al anticuerpo de la presente invención y que se marca según métodos conocidos en la técnica (43).

Dicha composición de diagnóstico puede comprender un epítopo de la presente invención y un anticuerpo descritos en la presente descripción. El tratamiento de una muestra con dicho anticuerpo puede dar lugar a conclusiones con respecto al estado de la enfermedad de la patente correspondiente, si se ha llevado a cabo la unión de dicho anticuerpo a dicha muestra en referencia a la unión de dicho anticuerpo a dicho epítopo utilizado como muestra de
referencia.

La composición de diagnóstico puede comprender moléculas de tipo IA o tipo IIA y un anticuerpo, tal como se ha mencionado anteriormente. La actividad de ambos tipos de moléculas se puede monitorizar con respecto a la capacidad de tau normal de neutralizar la muestra, comparada con la molécula de tipo IA recombinante (por ejemplo, No. Id. Sec.: 1) y moléculas IIA (No. Id. Sec.: 11-18) de la presente invención. De la actividad aberrante cuantificada de la molécula de tipo I, se puede deducir el nivel de las moléculas contenidas en dicha muestra y, por lo tanto, el estado de la enfermedad del paciente. El tipo de actividad de IA se puede deducir, por ejemplo, midiendo la actividad residual de tau normal que queda no reactiva con moléculas de tipo I. La actividad de tipo II se puede deducir midiendo la actividad adicional de moléculas de tipo II en un ensayo de ensamblaje de microtúbulos.

El técnico en la materia está en posición de diseñar otros sistemas de pruebas que combinen cualquiera de los objetivos de la presente invención. Debe entenderse que todas las combinaciones concebibles quedan dentro del alcance de la protección de la presente invención.

Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un método para la diagnóstico y/o monitorización in vitro de la enfermedad de Alzheimer que comprende ensayar aislados de fluidos cerebroespinales de un paciente, llevar a cabo una biopsia del tejido nervioso para la presencia de moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo molécula de IIA o su epítopo o epítopos y para el nivel de su actividad inhibitoria de tau normal.

El "aislado de fluido cerebroespinal de un paciente" se obtiene por procedimientos médicos estándares.

En una realización adicional la presente invención se refiere a moléculas de tipo II que son idénticas u homólogas a dicha secuencia de aminoácidos de tipo IIA, respectivamente moléculas y fragmentos inmunogenéticos derivados de los mismos capaces de inducir una respuesta inmune en animales. De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que las moléculas de tipo II pueden ser utilizadas como (a) inmunogenes para la producción de anticuerpos inhibitorios y como parte central de vacunas usadas para la inmunización contra la enfermedad.

Después de aplicación parenteral, todas las secuencias y epítopos enumerados anteriormente y aislados de tipo I y II de tejido cerebral enfermo son inmunogénicos y conducen a la producción de anticuerpos dirigidos específicamente contra dichas proteínas de tipo I y II y los derivados de las mismas (ejemplos 5 y 7, respectivamente).

En una realización más preferente, las moléculas de tipo II o los derivados de las mismas son capaces de inducir una respuesta inmune dirigida contra la estructura primaria, secundaria y/o ternaria de dichas moléculas. En el anfitrión, la respuesta inmune resultante es, por lo tanto, capaz de distinguir entre las formas sanas y enfermas de tau y sus derivados. Esta característica de la presente invención se puede utilizar como vacuna, resaltando la característica exclusiva de estas formas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal en inducir una respuesta inmune específica de la enfermedad.

Se entiende que, para los polipéptidos patogénicos doblemente truncados de forma N- y C-terminal abarcados por la presente invención, existen variaciones naturales entre los casos individuales de las enfermedades de Alzheimer. Estas variaciones pueden existir en una o varias diferencias de aminoácidos en la secuencia total o por eliminaciones, substituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o varios aminoácidos en dicha secuencia. Tales substituciones de aminoácidos de las realizaciones de ejemplo de la presente invención están dentro del alcance de la presente invención. De este modo, las variaciones naturales que no influencian esencialmente la inmunogeneticidad del polipéptido, se consideran variantes inmunológicas equivalentes de dichas formas truncadas doblemente de polipéptidos de tau según la presente invención.

Sin embargo, cuando se utiliza un polipéptido de tau de tipo IIA doblemente truncado de forma N- y C-terminal para, por ejemplo, propósitos de vacunación o para generar anticuerpos, no es necesario utilizar el polipéptido entero descrito en la presente invención. Es posible también utilizar un fragmento de estos polipéptidos que sea capaz de inducir una respuesta inmune contra ese polipéptido entero, un denominado fragmento inmunogénico.

Por lo tanto, esta realización de la presente invención no sólo se refiere a los polipéptidos según la presente invención, sino también a los fragmentos derivados de aquellos polipéptidos que siguen siendo capaces de inducir una respuesta inmune contra los polipéptidos (denominados fragmentos inmunogénicos).

Con el propósito de proporcionar un ejemplo, se da la inmunogenicidad en animales de bien un péptido de tipo IIA recombinante o una fracción de tau enferma de tipo IIA truncada doblemente de forma N- y C-terminal derivada de un cerebro humano enfermo de Alzheimer (ejemplo 1).

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La presente invención se describe adicionalmente por los ejemplos siguientes y las figuras ilustradas, aún sin que constituyan limitación.

Figura 1: Ensamblaje de microtúbulos con moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IA y de tipo IB.

Figura 2: Inhibición del ensamblaje de microtúbulos por moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IA y de tipo IB.

Figura 3: Actividad de moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IIA y de tipo IIB en el ensamblaje de microtúbulos.

Figura 4: Tau truncada doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IIA expresada en células neuronales aumenta significativamente su sensibilidad a la tensión oxidativa.

Figura 5: Afinidad de anticuerpo monoclonal a proteína de tau enferma de tipo IA y a sus mutantes de eliminación. Afinidad aparente del anticuerpo monoclonal a la proteína de tau enferma de tipo IA y sus mutantes de eliminación. En la primera columna se enumeran: proteína tau de tipo IA "prototipo" (No. Id. Sec. 1) y los respectivos mutantes de eliminación. En la columna central están los epítopos indicados de la presente invención. Las afinidades aparentes indicadas en la columna final se midieron por ELISA competitivo, y se muestran como las concentraciones del antígeno correspondiente necesarias para el 50% de competencia con la proteína tau de tipo IA "prototipo".

Figura 6: Fraccionamiento de proteínas de tau de cerebro con EA en la columna de Superdex 200.

Figura 7 de: Actividad inhibitoria de tipo IA en la fracción No. 19 de tres aislados diferentes de cerebros con EA.

Figura 8: Demostración de moléculas de tau truncadas doblemente de forma N y C-terminal de tipo I en cerebro con EA.

Figura 9: Presencia de tau tipo I en cerebro con EA pero no en cerebro sano.

Figura 10: Inmunoreactividad de moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo II.

Figura 11: Construcción de tau de tipo I-II recombinante (Id. Sec. 1-24).

Figura 12: Efecto inhibitorio de tau derivada de cerebro con EA y de tipo IA recombinante en tau sana normal.

Figura 13: Primera tanda de cribado para candidatos a fármacos que neutralizan moléculas de tau de tipo IA (etapa 1).

Figura 14: Segunda tanda de cribado para candidatos a fármacos que neutralizan moléculas de tau de tipo IA con selectividad frente a tau normal (etapa 2).

Figura 15: Primera tanda de cribado para candidatos a fármaco que neutralizan moléculas de tau de tipo IIA.

Figura 16: Segunda tanda de cribado para candidatos a fármaco capaces de neutralizar moléculas de tau de tipo IIA y discriminarlas de tau normal (etapa 2).

Figura 17: Niveles específicos de anticuerpos en sueros perfundidos de ratones determinados por ELISA.

Figura 18: Reactividad de ELISA de anticuerpos monoclonales con tau derivada de cerebro con EA (fracción #19) y control de tau derivada de cerebro sano (DC 20: anticuerpo monoclonal con especificidad irrelevante. Los datos mostrados representan valores medios a partir de tres experimentos paralelos).

Figura 19: Reactividad de ELISA de anticuerpos monoclonales con moléculas de tau recombinante (DC 20: anticuerpo monoclonal con especificidad irrelevante. Los datos mostrados representan valores medios a partir de tres paralelos).

Figura 20: Cribado para los anticuerpos de neutralización dirigidos contra tau derivada de cerebro con EA de tipo IA (fracción #19).

Figura 21: Cribado para anticuerpos de neutralización dirigidos contra tau de tipo IA recombinante (No. Id. Sec.: 1).

Figura 22: Cribado para candidatos a fármaco capaces de neutralizar moléculas de tau de tipo IA y discriminarlas de tau sana.

Figura 23: Neutralización de la actividad patológica de tau de tipo IIA recombinante (No. Id. Sec.: 12) por anticuerpos monoclonales.

Figura 24: Niveles de anticuerpos contra tau recombinante de tipo IIA (No. Id. Sec.: 12) detectados por ELISA.

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Figura 25: Genotipo de animales transgénicos. La tabla A muestra el genotipo de la generación parental de animales transgénicos. La amplificación específica de la secuencia de ADN truncada doblemente del ADN genómico en las líneas 1, 2, 3 y 4 indica la presencia de un ADN genómico transgénico específico extraído de las colas de la descendencia de madres adoptivas. Estos animales representan la generación parental de los animales transgénicos que portan moléculas de tau truncadas doblemente de tipo IIA. En este ejemplo se muestran un positivo (+C) un negativo (-C) y dos muestras negativas adicionales (5, 6) (M=marcador de tamaño). La flecha indica el tamaño del producto de PCR previsto esperado en animales transgénicos positivos.

Tabla B. Genotipo de animales de la generación F1. El ADN genómico se extrajo de extremos de cola y se identificó la secuencia específica de ADN de tau truncada doblemente y se muestra en la línea 1. Las líneas 2 y 3 muestran controles negativos. La identificación de un fragmento específico de ADN de tau en la generación F1 confirma la heredabilidad de estos transgenes.

Figura 26: Expresión genética de transcripciones de tau humanas truncadas doblemente en la generación F1 de animales transgénicos. El ARN fue extraído de tejido de animales transgénicos congelado súbitamente y se sometió a la transcripción inversa seguida de amplificación específica del ADNc. Un ejemplo muestra animales que expresan transgénicos en las líneas número 1 y 2. Las líneas 3-5 representan controles que no expresan mientras que la línea 5 muestra una señal no específica que aparece típicamente en un animal no transgénico al utilizar este método. Este ejemplo indica la presencia de ARNm específico de tau truncada doblemente que se expresa de transgenes en animales experimentales.

Figura 27: Muerte celular causada por la sobreexpresión de la molécula de tipo IIA después de diferenciación in vitro de 6 días. Comparación de la viabilidad celular de las células SY5Y transfectadas con tau truncada doblemente de tipo IIA (tipo IIA) y células de control de tipo neuronal (prueba) no transfectadas, respectivamente.

Figura 28: A: Se muestra la afinidad de unión aumentada de moléculas de tipo IIA utilizando el fraccionamiento celular de células transfectadas que expresan establemente moléculas de tau truncadas doblemente de tipo IIA y tau integral. El aislamiento de tau libre (TL), de tau unida a microtúbulos (TM) y de tau asociada a núcleo (TAN) se realizó según se describe. B: Inhibición de tau de tipo IA e IIA, ensayo de ensamblaje de microtúbulos, respectivamente, por el compuesto orgánico F123; C: Comparación directa entre la medida de la absorción y el ensamblaje de microtúbulos mostrada por análisis electromicroscópico.

Figura 29: Crecimiento logarítmico de células SH-SY5Y tincionadas con MitoFluor. Distribución regular de mitocondrias en los cuerpos y procesos celulares.

Figura 30: Crecimiento logarítmico de células SH-SY5Y que expresan molécula de tau de tipo IIA MitoFluor. Agrupamiento perinuclear de mitocondrias marcadas de verde alrededor del área del centrosoma celular.

Ejemplos

Ejemplo comparativo 1

Ensamblaje de microtúbulos con moléculas de tau de tipo IA y de tipo IB truncadas doblemente de forma N- y C-terminal

La función fisiológica de tau sana consiste en la estabilización de microtúbulos (MTs). Esta función se puede medir por un ensayo de ensamblaje de microtúbulos (EEM). En estos ejemplos, las reacciones de EEM se realizaron utilizando tres tipos de moléculas de tau: tau humana sana normal, las formas recombinantes de tau de tipo IA (No. Id. Sec.: 1) y de tau tipo IB (No. Id. Sec.: 4). La tau humana normal, tau de tipo IA y tipo IB se ensayaron individualmente en reacciones separadas. Se mezclaron preparaciones individuales de tau a 0,1 mg/ml con tubulina cerebral porcina purificada a una concentración final de 1 mg/ml y 1 mM de GTP, todos los materiales en solución tampón de ensamblaje (100 mM PIPES, pH 6,9, 1 mM MgSO_{4}, 2 mM EGTA). Se añadió la tau por último para iniciar la promoción del ensamblaje de los MT. Después de mezcla rápida y suave, se pipetearon las muestras en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente (Beckman Coulter DU640). La turbidez se monitorizó continuamente a 340 nm en intervalos de 10 s durante un período de 20 min. La curva superior 1 (figura 1) muestra la capacidad de promoción de ensamblaje de los microtúbulos de la tau sana normal. En cambio, ni el tipo IA (curva 2) ni el tipo IB (curva 3) mostraron esta actividad de la tau normal y carecieron de cualquier promoción de ensamblaje de MT en EEM.

Ejemplo comparativo 2

Inhibición del ensamblaje de microtúbulos por moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IA y tipo IB

Tanto las moléculas de tau de tipo IA como IB carecen de actividad funcional cuando se aplicaron en el ensayo de ensamblaje de MT (EEM). De modo sorprendente, las moléculas de tau de tipo IA muestran un efecto inhibitorio sobre tubulina en el ensamblaje de microtúbulos. En cambio, las proteínas de tipo IB (a pesar de su estructura primaria similar) no inhiben la actividad funcional de la tubulina en EEM. Para la inhibición del ensamblaje de los microtúbulos, se utilizaron formas recombinantes de tau de tipo IA (No. Id. Sec.: 1) y tipo IB (No. Id. Sec.: 4). Las reacciones de inhibición de ensamblaje se realizaron utilizando por separado proteínas de tipo IA y tipo IB. Se mezcló tubulina humana (2 mg/ml) con moléculas de tipo IA (0,2 mg/ml) o moléculas de tipo IB (0,2 mg/ml). Las mezclas se incubaron 1 h a 37ºC con agitación suave. Se añadió solución tampón de ensamblaje (100 mM PIPES, pH 6,9, 1 mM MgSO_{4}, 2 mM EGTA) a las mezclas de tau humano normal conservadas en hielo (0,1 mg/ml) y GTP (la concentración final de tubulina en la mezcla es de 1 mg/ml y 1 mM de GTP)). Después de mezcla rápida y suave, las muestras se pipetearon en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente (Beckman Coulter DU640). Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm en intervalos de 10 s durante 5 min. La curva superior 1 (Figura 2) muestra que la tau humana normal sola era capaz de inducir completamente el ensamblaje de la tubulina. La preincubación de la tubulina con el tipo IA suprimió el ensamblaje de los microtúbulos (Figura 2, curva inferior 2). Por contra, la incubación de la tubulina con el tipo IB no inhibe la capacidad de ensamblaje de los microtúbulos de la tau normal (Figura 2, curva 3), a pesar de tener una masa molecular en el mismo intervalo que el tipo IA.

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TABLA

1

Ejemplo 1 Actividad de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IIA y IIB en el ensamblaje de los microtúbulos

En comparación con las moléculas del grupo IA, se descubrió de modo sorprendente, que los derivados de tau doblemente truncados de tipo IIA promovían de modo sorprendente el ensamblaje patológico de los microtúbulos (véase la figura 3 y la figura 28C). Las reacciones de ensamblaje de microtúbulos se realizaron utilizando tres tipos de moléculas: isoformas naturales de tau de humanos sanos, tau de tipo IIA de Alzheimer (No. Id. Sec.: 12) y tipo IIB (No. Id. Sec.: 19). Se realizaron tres reacciones por separado, cada una con una preparación única de tau respectiva (tau sana, tau recombinante de tipo IIA o de tipo IIB). Se mezclaron las preparaciones de tau individuales a 0,1 mg/ml con tubulina y GTP (la concentración final de tubulina es 1 mg/ml y 1 mM de GTP), todos los reactivos en solución tampón de ensamblaje (100 mM PIPES, pH 6,9, 1 mM MgSO_{4}, 2 mM EGTA). Después de mezcla rápida y suave, las muestras se pipetearon en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente (Beckman Coulter DU640). Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm en intervalos de 10 s durante 5 min. En este experimento, la tau recombinante de tipo IIA exhibió una promoción extremadamente elevada (el triple) del ensamblaje patológico de microtúbulos (Figura 3, curva superior 1) con respecto al ensamblaje fisiológico de microtúbulos por la tau sana (Figura 3, curva 2). En cambio, las moléculas de tipo IIB, a pesar de estar truncadas doblemente de forma N- y C-terminal no son capaces de actuar en EEM como el tipo IIA y promueven el ensamblaje de los microtúbulos solamente al nivel observado con la tau sana (Figura 3, curva 3).

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Ejemplo 2 Los mecanismos de protección de tensión alterados debido a la proteína tau enferma de tipo II se pudieron demostrar in vitro en células del neuroblastoma que expresan dichas moléculas expuestas a varias clases de tensión oxidativa

En el presente ejemplo, se utilizó la descomposición oxidativa de la 3-morfolinosidnonimina (SIN-1) que genera los aniones superóxido y el óxido nítrico, que reaccionan y forman de este modo peroxinitrito. Este radical muy reactivo puede posteriormente oxidar principalmente sistemas celulares de membrana. Los técnicos en la materia podrán aplicar también otras fuentes de tensión oxidativa a las células de neuroblastoma en cultivo y podrán obtener el mismo efecto descrito en la presente por la utilización de SIN-1.

El efecto de la vulnerabilidad se evaluó como sigue:

1. Se aplicó SIN-1 a varias concentraciones (0-3,32 mM) a las líneas celulares neuronales humanas que expresan las proteínas de tau de tipo IIA No. Id. Sec. 15 y No. Id. Sec. 11, respectivamente.

2. La viabilidad celular se midió por ensayo de reducción con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ílo)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) para determinar la concentración efectiva de peróxido de hidrógeno para una viabilidad celular del 50% (EC50). Los técnicos en la materia conocen las diferentes maneras de evaluar la viabilidad celular para medir el efecto que se describe en la presente invención.

3. Los valores de EC50 se compararon para las líneas celulares de neuroblastoma en presencia o ausencia de expresión de la proteína tau enferma de tipo IIA y el significado estadístico de diferencias de valor de EC50 se determinó por el examen de t.

Se hicieron crecer células en MEM/F12 con un 10% de FCS, 2 mM de L-Glutamina, 1% de NEAA, 50 U/L de gentamicina. Se diluyó 3-morfolinosidnonimina (SIN-1) a partir de la solución de reserva 1 M en un medio sin suero (por ejemplo, 47,5 mg en 230 ml). La solución de reserva de MTT (2,6 mg/ml) se preparó en MEM/F12 sin suero y se esterilizó por filtración.

Las células se cultivaron por métodos que son bien conocidos en la técnica. Se sembraron placas de 96 pocillos con 2x10^{4} células/pocillo. La mitad de la placa se sembró con células que expresan moléculas de tau de tipo II y la otra mitad de la placa se sembró con las células que no la expresan. El medio se cambió cada 36-48 horas. Después del día cinco, se añadió SIN-1 a concentraciones que iban de 0 a 3,3 mM y las placas se incubaron durante 24 horas. Se evaluó cada concentración por hexaplicado. Después de incubación con SIN-1, se añadió solución de reserva de MTT hasta una concentración final de 200 mg/ml y las placas se incubaron durante otra hora. El medio se desechó; la superficie de la placa se secó con lana de papel. Se añadieron 50 ml de DMSO por pocillo y las placas se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia a 540 nm con la corrección de fondo a 690 nm en un lector de ELISA y los valores restados del fondo se utilizaron para el cálculo de la EC50, como es bien conocido en la técnica.

El significado de las diferencias registradas en la concentración EC50 entre las células de neuroblastoma que expresan la proteína de tipo IIA y dichas proteínas que no la expresan se evaluó utilizando el examen de t, el valor P fue para ambas proteínas de tau enfermas de tipo IIA P< 0,001. La expresión de la proteína de tau con No. Id. Sec.: 12 y No. Id. Sec.: 18 disminuyó la resistencia de las células de neuroblastoma a la tensión oxidativa en un 50%.

Los resultados del ejemplo indicado (figura 4) contribuyen a una explicación del efecto patógeno de la forma enferma de la proteína de tau.

El técnico en la materia está en posición de diseñar otros sistemas de pruebas que combinen alguno de los objetivos anteriores de la presente invención. Debe ser entendido que todas las combinaciones concebibles quedan dentro del alcance de la protección de la presente invención.

El gráfico de la figura 4 representa la disminución en la resistencia relativa a la tensión oxidativa de células neuronales en presencia de tau de tipo IIA. La resistencia de las células que no contienen dicha proteína (control) se expresa como 100% (barra izquierda) y la resistencia de las células neuronales que expresan la proteína de tau enferma se muestra como el % del valor de control (barras central y derecha). La resistencia se define como la concentración de radicales libres generados por SIN-1 en el medio de cultivo, en la que el 50% de las células mueren. Los resultados representan una medida de las proteínas de tau truncadas doblemente de tipo IIA No. Id. Sec.: 12 (93-333, R4) y No. Id. Sec.: 18 (69-332, R3), respectivamente.

Ejemplo Comparativo 3

Contribución de epítopos individuales a la conformación de tau truncada doblemente de tipo IA

El significado de la "región conformacional" en tau de tipo IA (segmento A) o sus partes se determinó por eliminación secuencial bien de toda región de conformación (segmento A) o de sus partes individuales llamadas epítopos y designadas A1-A6. Dado que la conformación de las moléculas de tipo IA se correlaciona fuertemente con su función, se midió la contribución de cada epítopo (A1-A6) a la conformación total del "segmento A" en base a su reactividad al utilizar un anticuerpo monoclonal de tau (figura 5).

El prototipo de tau de tipo IA (No. Id. Sec.: 1) tiene una afinidad de 10 nM. Los mutantes individuales de eliminación de Nos. Id. Sec.: 22, 23, 26, con eliminación de los epítopos Al, A2 y A5, respectivamente, mostraron que la contribución de estas regiones se refleja en una disminución de la afinidad de 2-4 veces (20-40 nM) mientras que la eliminación de los epítopos A3, A4, A6 en los Nos. Id. Sec. 24, 25 y 27, respectivamente, contribuyeron a una mayor pérdida de la afinidad, de 10-30 veces (100-300 nM). Solamente después de la eliminación del segmento A completo (No. Id. Sec. del mutante: 21), la afinidad disminuye dramáticamente en tres órdenes de magnitud de la afinidad del prototipo de tau de tipo IA.

Ejemplo 3 Aislamiento de tau truncada doblemente de forma N- y C-terminal de tipo I y tipo II

Preparación de moléculas de tau derivadas de cerebro con Alzheimer de tipo I y de tipo II: Se utilizó tejido cerebral humano enfermo de casos confirmados neuropatológicamente de enfermedad de Alzheimer como fuente para el aislamiento de proteínas de tau truncadas doblemente IA, -B y IIA. La preparación de tau de cerebro con Alzheimer se basa en la combinación de la homogeneización del tejido en solución tampón de TRIS y el fraccionamiento de lisatos por precipitación con sulfato amónico saturado. El tejido se homogeneizó en TRIS frío 20 mM pH 8, sacarosa 0,32 mM, b-mercaptoetanol 10 mM, EGTA 5 mM, EDTA 10 mM, MgSO_{4} 5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, fluoruro sódico 50 mM, benzamidina 5 mM, leupeptina 5 \mug/ml, pepstatina 1,5 \mug/ml, aprotinina 2 \mug/ml con el homogeneizador Heidolph DIAX 900 durante 10 minutos a 4ºC. El homogeneizado se centrifugó a 27000 g durante 30 minutos a 4ºC para eliminar restos celulares. Las proteínas tau se precipitaron del sobrenadante de tejido cerebral añadiendo sulfato amónico saturado al 44,12% (v/v). Después de incubación durante 20 minutos a 25ºC y agitación suave, la muestra se centrifugó a 20000 g durante 10 minutos a 25ºC. La pastilla se suspendió de nuevo en 500 \mul de 100 mM PIPAS 100 mM pH 6,9, 2 mM de EGTA, 1 mM de MgSO_{4} y se dializó contra la misma solución tampón. Esta preparación se fraccionó por filtración de gel en una columna Superdex 200 (Amer-sham-Pharmacia-Biotech) y las fracciones se resolvieron por SDS-PAGE (gradiente 5-20% poliacrilamida) y las proteínas de tau se detectaron por inmunotransferencia según el procedimiento estándar utilizando los anticuerpos DC25 anti tau (figura 6). Se evaluó el efecto de las fracciones individuales en el ensamblaje de microtúbulos.

Aislamiento de tau de tipo IA y IB: La fracción #19 (Figura 7) contiene las moléculas de tau que corresponden a la masa molecular (12 KDa) representativa de moléculas truncadas doblemente de tipo IA y IB - esta fracción mostró la capacidad inhibitoria más elevada. Esta fracción se caracterizó por ensayo de transferencia Western utilizando tres anticuerpos anti tau: DC25 reconoce ambas proteínas, truncadas e integrales, DC39 (específico para el extremo C-terminal intacto) y Alz50 (específico para el extremo N-terminal intacto) (figura 8). La inmunoreactividad de estos anticuerpos demostró la carencia de proteínas truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo I solamente en fracciones de cerebro con EA. Fracciones correspondientes preparadas por el mismo método a partir de cerebro normal sano no mostraron ni la actividad inhibitoria ni la inmunoreactividad específico (figura 9). La concentración de las proteínas de tau se determinó por RIE de tipo sándwich. La concentración total de proteína se determinó utilizando el ensayo de Bradford. La preparación de tau se almacenó a -20ºC hasta su utilización.

Aislamiento de tau de tipo IIA: La fracción #15 (Figura 6) que contiene las moléculas de tau que corresponden a la masa molecular de 30 KDa es representativa de las moléculas truncadas doblemente de tipo IIA. La fracción #15 mostró una actividad anormalmente elevada de promoción del ensamblaje de microtúbulos. Esta fracción se caracterizó por ensayo de transferencia Western utilizando tres anticuerpos anti tau: DC25 reconoce ambas proteínas, truncadas e integrales, DC39 (específico para el extremo C-terminal intacto) y Alz50 (específico para el extremo N-terminal intacto) (figura 10). La inmunoreactividad de estos anticuerpos demostró la presencia de proteínas truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo II solamente en fracciones derivadas de cerebro con EA. La concentración de las proteínas de tau se determinó por RIE de tipo sándwich. La concentración de la proteína total se determinó utilizando el ensayo de Bradford.

Clonación, expresión y purificación de proteínas tau recombinantes de tipo I y tipo II: Se derivaron genes para proteínas tau truncadas recombinantes a partir de ADNc humano para las isoformas tau43 y tau44. Los insertos de ADNc se clonaron en el vector pET17b (Novagen) utilizando lugares de restricción de NdeI-EcoRI. (Figura 11) (Studier y otros, Meth. Enzym. 185 (1990), 60-89).

Las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal recombinantes (Id. Sec. 1-24) se prepararon por la amplificación de PCR de las regiones relevantes del ADNc. Se utilizaron cebadores específicos que introducen los codones de comienzo de iniciación de la traducción (ATG), y de terminación (TGA), y sitios de restricción de EcoRI y NdeI.

Se generaron plásmidos que portan la eliminación de los epítopos A4-A6 (Id. Sec. 25-27) en el ADNc de tau por PCR inversa según las indicaciones de la Figura 11 (esquema inferior).

Ejemplo comparativo 4

Efecto inhibitorio de tau derivada de cerebro con EA y recombinante de tipo IA en tau sana normal en ensayos de ensamblaje de microtúbulos

Los extractos de cerebro con EA, así como las moléculas de tau recombinante de tipo IA son capaces de inhibir la promoción del ensamblaje de los microtúbulos al utilizar isoformas de tau naturales sanas. Para estos experimentos, se aisló tau humana sana de cerebros de controles de edad comparable y se aisló tau de tipo IA de cerebros de pacientes con EA (véase el ejemplo 6, figura 6, fracción #19). Se produjeron y purificaron taus recombinantes de tipo IA (No. Id. Sec.: 1) y tipo IB (No. Id. Sec.: 4, control negativo) según las indicaciones del ejemplo 6. En estos experimentos, se mezclaron con tubulina isoformas de tau derivadas de cerebro sanos (0,1 mg/ml), tau derivada de cerebro con EA o recombinante de tipo IA o tipo IB (0,2 mg/ml). Cada combinación se ensayó por separado. Las mezclas de ensayo se incubaron durante 1 hora a 37ºC en un baño de agua con agitación suave. A la mezcla conservada en hielo se añadió GTP y/o tau normal (la concentración final de tubulina es 1 mg/ml y GTP 1 mM) todos los reactivos en solución tampón de ensamblaje (100 mM PIPES, pH 6,9, 1 mM MgSO_{4}, 2 mM EGTA). Después de mezcla suave y rápida, las muestras se pipetearon en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente (Beckman Coulter DU640). Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm en intervalos de 10 s durante 5 min. Los datos muestran que tanto las moléculas derivadas de cerebro con EA como las recombinantes truncadas doblemente de tipo IA inhiben la capacidad de tau normal de promover el ensamblaje de microtúbulos (Figura 12, curva 2, 3). En cambio, la recombinante de tipo IB no puede inhibir la capacidad de promoción de ensamblaje de tubulina inducido por la tau humana normal (Figura 12, curva 4). La curva 1 (figura 12) representa el ensamblaje de los microtúbulos promovida por tau normal.

Ejemplo comparativo 5

Ensayo de cribado para candidatos a fármaco que neutralizan la actividad patológica de tau de tipo IA

Utilizando la capacidad de las moléculas de tau truncadas doblemente de tipo IA para inhibir la actividad de la tau normal sana de promoción del ensamblaje de tubulina, se diseñó un ensayo de cribado para la selección de compuestos capaces de neutralizar la actividad inhibitoria de moléculas de tipo IA. La tau enferma de tipo IA se puede derivar de cerebros con EA o de fuentes recombinantes, no obstante es práctico utilizar el material recombinante. El efecto de neutralización del candidato a fármaco se puede definir cuantitativamente midiendo la capacidad residual de tau sana normal en promover el ensamblaje de los microtúbulos. El ensayo se realiza en dos etapas:

1. Cribado de los candidatos a fármaco que neutralizan tau de tipo IA. Se preincubaron moléculas prototipo recombinantes de tipo de IA (No. Id. Sec.: 1) (concentración final 100 mg/ml) mezcladas por separado con los candidatos a fármaco individuales (concentración final 50 mg/ml) durante 1 h a 37ºC. Después de la incubación, se añadieron la tubulina, GTP y tau sana a la mezcla (la concentración final: tubulina- 1 mg/ml, GTP- 1 mM, tau sana- 100 mg/ml) a +4ºC. Después de mezcla rápida, las muestras se cargaron en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente. Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm. Se seleccionaron los candidatos a fármaco con capacidad de neutralizar la actividad de tipo IA midiendo el potencial de ensamblaje residual de microtúbulos promovido por la tau sana normal (figura 13; se preincubó un candidato a fármaco con la molécula de tipo IA y la eficiencia de neutralización del tipo IA se evaluó en ensamblaje de microtúbulos. La curva inferior 1 y la curva superior 2 representan actividad de neutralización negativa (ninguna neutralización) y positiva (100%) del candidato a fármaco evaluado contra las moléculas enfermas de tipo IA. Las curvas intermedias indican varias eficiencias de neutralización del tipo IA de tres candidatos a fármaco diferentes). Es obvio que el umbral de selección de fármacos positivos es arbitrario y puede variar de la neutralización total del tipo IA a la neutralización parcial del mismo.

2. Selección de los candidatos a fármaco que neutralizan moléculas de tipo IA y que los discriminan de tau sana normal. Se cribaron a los candidatos seleccionados con actividad de neutralización de moléculas de tau de tipo IA por su reactividad con tau sana normal para seleccionar específicamente moléculas solamente para el tipo IA. Se preincubaron por separado mezclas de tau sana normal (concentración final 100 mg/ml) con los candidatos individuales a fármaco (concentración final 50 mg/ml) 1 h/37ºC. Después de la incubación, se añadió tubulina y GTP a las mezclas (concentración final: tubulina- 1 mg/ml, GTP- 1 mM) a +4ºC. Después de mezcla rápida, las muestras se cargaron en microcubetas de cuarzo. Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm. Se seleccionaron aquellos candidatos a fármaco
que no mostraron ninguna interferencia con la actividad promotora del ensamblaje de MT de tau sana (Figura 14).

Ejemplo 4 Ensayo de cribado para candidatos a fármaco que neutralizan la actividad patológica de tau de tipo IIA

La presente invención muestra que las moléculas de tau de tipo IIA tienen inesperadamente una elevada potencia para promover formas del ensamblaje de tubulina, que es una base para un ensayo de cribado para la selección de compuestos que neutralizan dicha actividad de proteínas de tipo IIA. La neutralización del tipo IIA se puede cuantificar midiendo la actividad residual de ensamblaje de los microtúbulos de las moléculas de tipo IIA. El ensayo se realiza en dos etapas:

1. El cribado de los candidatos a fármaco que neutralizan tau de tipo IIA

Se preincubaron mezclas de tipo IIA separadas (No. Id. Sec.: 12) (concentración final 100 mg/ml) con candidatos a fármaco individuales (concentración final 50 mg/ml) durante 1 h/37ºC. Después de la incubación, se añadió tubulina y GTP a las mezclas (concentración final: tubulina 1 mg/ml, GTP- 1 mM) a +4ºC. Después de mezcla rápida, las muestras se pipetearon en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente. Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm. Se seleccionaron para la segunda etapa del ensayo a los candidatos a fármaco que disminuyeron significativamente la proporción de ensamblaje de microtúbulos (Figura 15; se preincubó al candidato a fármaco con la molécula de tipo IIA y se evaluó la eficiencia de neutralización del tipo IIA en ensamblaje de microtúbulos. La curva inferior 1 representa una actividad de neutralización positiva (100%) de candidato a fármaco respectivo y la curva superior 2 indica ninguna neutralización de moléculas enfermas de tipo IIA. Las curvas intermedias indican eficiencias de neutralización del tipo IIA de varios candidatos).

2. Selección de candidatos a fármaco que neutralizan moléculas de tipo IIA y que las discriminan de tau sana normal

Se preincubaron por separado mezclas de los candidatos a fármaco (concentración final 50 mg/ml) con tau sana normal (concentración final 100 mg/ml) durante 1 h/37ºC. A continuación, se añadió tubulina y GTP a las mezclas (concentración final: tubulina 1 mg/ml, GTP 1 mM) a +4ºC. Después de mezcla rápida, las muestras se cargaron en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente. Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm. Se seleccionaron aquellos candidatos a fármaco sin ninguna interferencia con la tau sana (Figura 16; Se preincubaron los candidatos a fármaco seleccionados en la etapa 1 con tau sana y se evaluó el efecto en el ensamblaje de los microtúbulos. La curva inferior (1) muestra la máxima inhibición de tau sana y la curva superior (2) representa no inhibición de tau sana. Las curvas intermedias muestran varios candidatos a fármacos con diferentes actividades inhibitorias contra tau sana).

Ejemplo 5 Preparación de anticuerpos monoclonales que neutralizan moléculas truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IA y de tipo IIA

Protocolo de inmunización y procedimiento de fusión: Se utilizaron proteínas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo I aisladas de cerebros humanos con Alzheimer (fracción #19, Ejemplo 6) como inmunogen. Se cebaron subcutáneamente ratones de Balb/c con dichas proteínas (50 mg/ratón) en coadyuvante completo de Freund y se incrementó después intraperitonealmente 3 veces en intervalos de 4 semanas con 50 mg/ratón de las mismas proteínas. Los sueros de profusión se recogieron y el nivel de anticuerpos específicos contra tau se evaluó por ELISA (Figura 17; los niveles de anticuerpos específicos en sueros de los ratones inmunizados con tau derivada de EA se evaluaron en ELISA con el mismo antígeno. Los cinco sueros mostraron actividad de unión anti-tau elevada a dicha proteína tau. La figura 17 representa los niveles de anticuerpos específicos en uno de los ratones inmunizados. Como un control se utilizó suero del ratón inmunizado con la proteína irrelevante). Se fundieron células del bazo del ratón con las células de mieloma NS/0, utilizando un procedimiento de pocillos modificado conocido en la técnica (M. Kohler y C. Milstein, 1975).

Según los resultados mostrados en la Figura 18, los anticuerpos monoclonales DC44, DC82 y DC136 reconocen las moléculas truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IA y tipo IIA de cerebro con Alzheimer. Para estos anticuerpos no se observó ninguna reactividad con los aislados de tau de cerebro humano normal preparado por el mismo método (figura 18) Por el contrario, el anticuerpo monoclonal DC25 reacciona en ELISA con dichas proteínas patológicas así como con las de cerebro sano normal (Figura 18). Este anticuerpo no discrimina entre la forma patológica de tau (tau-EA) y la tau humana normal. Después de este cribado primario, se subclonaron los hibridomas en agarosa suave, una técnica de pocillos conocida por los técnicos en la materia, dando como resultado finalmente poblaciones homogéneas de hibridoma que secretaban anticuerpos con un idiotipo idéntico.

Estos hibridomas clonados se examinaron posteriormente por su reactividad a las isoformas de tau integrales y a las moléculas de tau truncadas doblemente recombinantes de tipo IA (No. Id. Sec.: 1) y tipo IIA (No. Id. Sec.: 12), en ELISA idéntico al ensayo de cribado.

Ejemplo comparativo 6

Neutralización de la actividad patológica de moléculas truncadas doblemente de forma N- y C-terminal derivadas de cerebro con EA y recombinantes utilizando los anticuerpos monoclonales

Se caracterizaron posteriormente los anticuerpos monoclonales DC44, DC82, DC136 y DC25 seleccionados por su capacidad de neutralizar la actividad de tau de tipo IA nativa aislada de cerebro con Alzheimer (véase el ejemplo 6). Se preincubaron dicho aislado de tau (concentración final 100 mg/ml) y los anticuerpos evaluados (concentración final 50 mg/ml) durante l h a 37ºC. Después de la incubación, se añadió a la mezcla tubulina, tau humana normal y GTP (concentración final: tubulina 1 mg/ml, tau humana sana 100 mg/ml, GTP 1 mM) a +4ºC. Después de mezcla rápida, las muestras se pipetearon en microcubetas de cuarzo. Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm. Los anticuerpos monoclonales DC136, DC44 y DC82 fueron capaces de inhibir la actividad patológica de dicha proteína (figura 20; los anticuerpos se preincubaron con la tau nativa de tipo IA (fracción #19) y se mezclaron posteriormente con tau humana sana, tubulina y GTP. La formación de microtúbulos se determinó espectrofotométricamente después de 5 minutos a 37ºC. Las barras representan un valor medio de tres experimentos independientes. Ensayo de EEM-ensamblaje de microtúbulos con tau humana sana. Ensayo de EIPM-inhibición de ensamblaje microtúbulos con tau humana sana preincubada con tau tipo IA (sin anticuerpo)). En un experimento análogo, se evaluaron los anticuerpos con el prototipo de tau recombinante de tipo IA (No. Id. Sec.: 1), mostrando un patrón similar de actividad de neutralización (Figura 21). El anticuerpo DC25 de control reconoce todas las formas de tau truncadas y normales evaluadas por ELISA y por transferencia werstern, sin embargo no interfiere con la actividad del tipo IA derivado cerebro con EA en ensayos de ensamblaje de los microtúbulos. Estos resultados sugieren que el anticuerpo DC25 reacciona con una región diferente de tau en comparación con los anticuerpos DC136, DC44 y DC82. En cambio, los anticuerpos DC136, DC44 y DC82 se unen al epítopo o epítopos implicados en el comportamiento patológico de las moléculas de tipo IA.

La etapa siguiente de selección se dirigió a anticuerpos capaces de discriminar entre moléculas sanas y de tipo IA. Se preincubaron mezclas de tau sana normal (concentración final 100 mg/ml) y anticuerpos evaluados (concentración final 50 mg/ml) 1 h/37ºC. Después de la incubación se añadió a las mezclas tubulina y GTP (concentración final: tubulina 1 mg/ml, GTP 1 mM) a +4ºC. Después de mezcla rápida, las muestras se pipetearon en microcubetas de cuarzo y se equilibraron a 37ºC en un espectrofotómetro controlado termostáticamente. Los cambios de turbidez se midieron a 340 nm. Ninguno de los anticuerpos DC136, DC44, DC82 y DC25 fue capaz de inhibir tau sana normal en el ensamblaje de los microtúbulos (figura 22; se preincubaron anticuerpos que neutralizan tau de tipo IA con tau sana y se mezclaron posteriormente con tubulina y GTP. La formación de microtúbulos se determinó espectrofotométricamente después de 5 minutos a 37ºC. Las barras muestran el valor medio de tres experimentos independientes. Ensayo de EEM-ensamblaje de microtúbulos con tau sana. Como control negativo se utilizó un anticuerpo de neutralización de tau sana). Los presentes datos demostraron que los anticuerpos DC136, DC44, DC82 reconocen el epítopo o epítopos específicos implicados en la interacción de formas enfermas de tau truncadas con proteínas sanas de tau.

Ejemplo 6 Neutralización de la actividad de tipo IIA por anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos aislados anteriormente por su actividad de neutralización de tau de tipo IA se evaluaron por su actividad de neutralización contra tau recombinante de tipo IIA (No. Id. Sec.: 12) utilizando el método descrito en el ejemplo 8B. Los tres anticuerpos monoclonales neutralizadores DC44, DC82 y DC136 fueron capaces de reducir la actividad patológica de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IIA (Figura 23; los anticuerpos se preincubaron con la tau recombinante de tipo IIA y después se mezclaron con tubulina y GTP. La formación de microtúbulos se determinó espectrofotométricamente después de 5 minutos a 37ºC. Las barras representan el valor medio de tres experimentos independientes. Ensayo de EEM-ensamblaje de microtúbulos con tau de tipo IIA (sin anticuerpo)). Esto sugiere que el epítopo o epítopos de dichos anticuerpos está compartido, como mínimo, por el tipo I A de No. Id. Sec.: 1 y el tipo II A de No. Id. Sec.: 12. Para el anticuerpo DC25 no se observó actividad inhibitoria del tipo IIA.

Ejemplo 7 Inmunogeneticidad de moléculas de tau recombinantes truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo IA y IIA

Protocolo de inmunización: En una realización preferente de la presente invención, dichas proteínas de tau recombinantes de tipo IA y IIA se utilizan para propósitos de vacunación o para generar anticuerpos que neutralizan específicamente la actividad patógena de las moléculas de tau enfermas de tipo IA y IIA. En el ejemplo dado, se utilizó como inmunogen tau recombinante truncada doblemente de forma N- y C- terminal de tipo IIA (No. Id. Sec.: 12). Se cebaron subcutáneamente ratones de Balb/c con dichas proteínas (50 mg/ratón) en coadyuvante completo de Freund y se incrementó después intraperitonealmente 3 veces en intervalos de 4 semanas con 50 mg/ratón de las mismas proteínas en coadyuvante incompleto de Freund. Los sueros inmunes se recogieron y el nivel de anticuerpos específicos contra tau antígena recombinante se evaluó por ELISA (figura 24).

Ejemplo 8 Animales transgénicos

ADN extraído de puntas de la cola: El ADN genómico se extrajo mediante el kit de tejido DNeasy, Qiagen.

Genotipo (Figura 25): La amplificación específica de los transgenes que codifican formas de tau truncadas doblemente se realizó en ADN genómico derivado de la generación parental de animales transgénicos y se muestra en la figura 25A. Ensayos posteriores de ADN genómico de la generación F1 revelaron que los transgenes son hereditarios puesto que también se identificaron en la descendencia de la generación parental. Por lo tanto, los transgenes que codifican tau truncada doblemente están fijado en el ADN cromosómico de los animales (figura 25B-Genotipo de la generación F1). Los animales utilizados en este ejemplo tienen antecedentes genéticos específicos caracterizados por la hipertensión espontánea y otros factores de riesgo asociados a la enfermedad de Alzheimer, tales como dislipidemia o diabetes. Por lo tanto, esta tensión animal representa un modelo experimental único de Alzheimer, por la combinación de los factores de riesgo que tienen lugar más frecuentemente en la enfermedad de Alzheimer, tales como hipertensión y diabetes.

Para la generación del transgénico, se utilizaron técnicas estándar de biología molecular según se describen en Sambrook y otros, "Clonación molecular. Un manual de laboratorio", CSH Laboratory, Nueva York (2001). Se introdujo ADNc que codifica tau truncada doblemente en un vector de expresión ligado a un promotor que dirige una expresión de manera ubicua o específica de tejido. Se introdujo el fragmento del gen en embriones de un día mediante inyección pronuclear (no limitada). La descendencia resultante se genotipó utilizando el ADN genómico de la punta de la cola.

Análisis de la expresión transgénica (Figura 26): La expresión del ARNm derivado de los transgenes se determinó por ensayo de RT-PCR, aplicando métodos conocidos generalmente, tales como RT-PCR y electroforesis de gel de agarosa.

La Tabla A de la figura 25 muestra el genotipo de la generación parental de animales transgénicos. La amplificación específica de la secuencia de ADN truncada doblemente a partir de ADN genómicos en las líneas 1, 2, 3 y 4 indica la presencia de un transgén específico en el ADN genómico extraído de las colas de la descendencia de madres de acogida. Estos animales representan la generación parental de animales transgénicos que portan moléculas de tau truncadas doblemente de tipo IIA. En este ejemplo, se muestran un positivo (+C) y un negativo (- C) y dos muestras negativas adicionales (5, 6) (M=tamaño de marcador). La flecha indica el tamaño previsto del producto de PCR esperado en animales transgénicos positivos.

Tabla B de la figura 25: Genotipo de los animales de la generación F1. El ADN genómico se extrajo de puntas de la cola y la secuencia específica de ADN de tau truncada doblemente se identificó y se muestra en las líneas 1. La línea 2 y 3 muestra controles negativos. La identificación de un fragmento específico de ADN de tau en la generación F1 confirma la heredabilidad de estos transgenes.

Figura 26: El ARN se extrajo de tejido de congelación instantánea de animales transgénicos y se sometió a transcripción inversa seguida de amplificación específica de ADNc. Un ejemplo muestra animales que expresan transgenes en las líneas número 1 y 2. Las líneas 3-5 representan controles que no expresan mientras que la línea 5 muestra una señal no específica que aparece típicamente en animales no transgénicos al utilizar este método. Este ejemplo indica la presencia de ARNm de tau truncada doblemente específico expresado a partir del transgén en animales experimentales.

Ejemplo 9 A: La sobreexpresión de moléculas de tipo IIA causan la muerte celular en células diferenciadas de tipo neurona

En la línea celular SH-SY5Y del neuroblastoma, se demostró la muerte celular causada por la molécula de tipo IIA utilizando condiciones de diferenciación in vitro estandardizadas conocidas por el técnico en la materia. El efecto se evaluó en células transfectadas estables que expresaban tau truncada doblemente de tipo IIA y se comparó con células no transfectadas. La viabilidad celular se cuantificó manualmente utilizando un ensayo de exclusión de azul de tripano en triplicados y la evaluación estadística se realizó utilizando la prueba de ANOVA unidireccional. Se encontraron diferencias significativas en viabilidad celular entre las células que sobre expresan tau truncada doblemente de tipo IIA y células de tipo salvaje después del día 6 de la diferenciación in vitro (P<0,001). La sobre producción de tau truncada doblemente de tipo IIA (0,5% de la cantidad de proteína total) provocó una proporción de viabilidad disminuida 3x de las células (Figura 27; comparación de la viabilidad celular de células SY5Y transfectadas con tau truncada doblemente de tipo IIA (tipo IIA) y células de control no transfectadas de tipo neurona (prueba), respectiva-
mente).

En analogía a las construcciones mostradas anteriormente se ha establecido un sistema similar utilizando las construcciones que codificaban moléculas truncadas doblemente de tipo I.

Las moléculas de tau truncadas doblemente tipo de II muestran afinidad de unión creciente al sistema microtubular.

Se realizó el aislamiento de las fracciones de tau libre (TL), fracciones asociadas a microtúbulos (MT) las fracciones nucleares (FN) de células de SH-SY5Y transfectadas estables que expresaban tau truncada doblemente de tipo IIA y tau integral. La cuantificación de la asociación de tau con los microtúbulos mostró una afinidad aumentada de tau truncada doblemente de tipo IIA a microtúbulos (más del 50%) en comparación con la forma integral (figura 28A; la afinidad de unión aumentada de moléculas de tipo IIA a microtúbulos se muestra utilizando el fraccionamiento celular de las células transfectadas establemente que expresan moléculas de tau truncadas doblemente de tipo IIA y tau integral. El aislamiento de las fracciones de tau libre (TL), fracciones asociadas a microtúbulos (MT) las fracciones nucleares (FN) se realizó según se describe). La cantidad de tau se cuantificó según los métodos de fraccionamiento biológico celular estándar utilizados en la técnica, seguidos de ensayo de transferencia Western. Las curvas de calibración se calcularon utilizando la proteína de tau recombinante con cantidades definidas.

B: La sustancia orgánica F123 [C_{34-59}O_{14-23}H_{32-44}N_{6-8}]_{n} se analizó con respecto a su efecto inhibitorio en un ensayo de ensamblaje de microtúbulos:

(1) Incubación de F123 con tau (tau normal y tau de tipo IA'; concentración = 100 \mug/ml; concentración de tau de tipo IIA = 60 \mug/ml) durante 1 h a 37ºC

(2) adición de tubulina (concentración = 1 mg/ml)

(3) medidas a 340 nm/5 min (observación: todas las diluciones con solución tampón de PIPES)

C: La tau sana normal y la tau de tipo II de Alzheimer se analizaron con respecto a su capacidad de promoción del ensamblaje de los microtúbulos. En este ejemplo, la tau normal representada por tau 43 forma los microtúbulos típicos mostrados en microscopia electrónica (véase la figura 28C). Sin embargo, la tau de tipo II de Alzheimer produce microtúbulos patológicos con el patrón típico (véase la figura 28C).

Ejemplo 10 Consecuencias funcionales de la sobre expresión de tau truncada doblemente de forma N- y C-terminal de tipo II en células eucarióticas

Se llevó a cabo el fenotipo patológico que muestra el transporte alterado de las mitocondrial causados por la sobre expresión de moléculas de tipo IIA en las líneas celulares SH-SY5Y del neuroblastoma. La influencia de las moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal de tipo II se examinó comparando la redistribución mitocondrial en células vivientes de tipo salvaje de SH-SY5Y con células transfectadas. Se utilizaron ensayos biológicos de transporte celular conocidos por el técnico en la materia. En resumen, las células se cultivaron en compartimientos de LabTekII (Nunc) con igual densidad (confluyentes 70%) según técnicas de laboratorio estándar y la transfección se realizó utilizando Fugene 6 (Roche) según las instrucciones del fabricante. La tinción de las mitocondrias (MitoFluor Red 594, Molecular Probes) se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células vivas se examinaron con un microscopio de fluorescencia de Axiovert 200M (ZEISS) equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 63x y de filtros de fluorescencia. Las fotografías se tomaron con una cámara fotográfica CCD (Photometrics, Cool Snap HQ; Hamamatsu) conjuntamente con el programa de software MetaMorph (Universal Imaging).

Utilizando la tinción específica de mitocondria MitoFluor (Molecular Probes), la localización mitocondrial se comparó en células de SH-SY5Y inducidas y no inducidas. La tinción confirmó el efecto negativo de las moléculas de tau truncadas doblemente de tipo IIA en el transporte mitocondrial en células de SH-SY5Y que da por resultado el agrupamiento mitocondrial perinuclear cerca del centrosoma, indicativo de una dominancia funcional de las fuerzas intracelulares dirigidas del extremo menos (Figura 30).

Como control, células de crecimiento logarítmico (Figura 29) revelan una distribución regular de mitocondrias en el cuerpo celular así como en la periferia celular. En conclusión, proteínas de tipo IIA truncadas doblemente de forma N- y C-terminal pueden por lo tanto influenciar el mecanismo intracelular del transporte que afecta la redistribución mitocondrial. El presente ajuste experimental muestra un método conveniente para evaluar las actividades inhibitorias dirigidas contra las moléculas de tipo IIA.

Referencias

1. Finch C, Tanzi RE, (1997) Science 278,407-411

2. Blessed G, Tomlinson BE, Roth M (1968) Br J Psychiatry 114: 797-811

3. Tomlinson BE, Blessed G, Roth M J, (1970) Neurol Sci 11, 205242

4. Arigada PA, Growdon JH, Hedley-White ET, Hyman BT (1992) Neurology 42,631-639

5. Wischik CM, Novak M, Edwards PC, Klug A, Tichelaar W, Crowther RA (1988a) Proc Natl Acad Sci USA 85: 4884-4888

6. Wischik CM, Novak M, Trogersen HC, Edwards PC, Runswick MJ, Jake R, Walker JE, Milstein C, Roth M, Klug A (1988b) Proc Natl Acad USA 85: 4506-4510

7. Himmler A, Drechsel D, Kirschner MW, Martin DWjr, (1989) Mol Cell Biol 9,1381-1388

8. Goedert M, Spillantini MG, Jakes R, Rutherford D., Crowther RA (1989) Neuron #, 519-526

9. Hutton M, Lendon CL, Rizzu P, Baker M, Froelich S., Houlden H, Pickering-Brown S, Chackraverdad S, Isaacs A, Grover A (1998) Nature 393,702-705

10. Spillantini NG, Murrell JR, Goedert M, Farlow MR, Klug A, Ghetti B (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95,7737-7741.

11. Selkoe DJ, (1999) Nature 399, A23-31

12. Isacson O, Seo H, Lin L, Albeck D, Granholm A CH, (2002) Trends Neurosci 25,79-84

13. Mudher A, Lovestone S, (2002) Trends Neurosci 25, 22-26

14. Couzin J, (2002) Science 296, 28-29

15. Grundke-Iqbal I, Iqbal K, Tung Y-C, Quinlan M, Wisniewski HM, Binder LI, (1986) Proc Natl Acad Sci USA, 83,4913-4917

16. Gustke N, Steiner B, Mandelkow EM, Biernat J, Meyer HE, Goedert M, Mandelkow E (1992) FEBS Lett 307,199-205

17. Lindwall G, Cole RD (1984) J Biol Chem 259, 12241-12245

18. Kopke E, Tung Y-Ch, Shaikh S, Alonso AC, Iqbal K, GrundkeIqbal I (1993) J Biol Chem 268,24374-24384

19. Cleveland DW, Hwo SY, Kirschner MW (1977a) J Mol Biol 116: 227-247

20. Cleveland DW, Hwo SY, Kirschner MW (1977b) J Mol Biol 116: 207-225

21. Lee MY, Balin BJ, Otvos L, Trojanowski JQ (1991) Science 251,675-678

22. Alonso AC, Zaidi T, Grundke-Iqbal I, Iqbal K (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 5562-5566

23. Wille H, Mandelkow EM, Mandelkow E (1992) J Biol Chem 267: 10737-10742

24. Alonso AC, Grundke-Iqbal I, Iqbal K (1996) Nat Med 2: 783-787

25. von Bergen M, Barghorn S, Li L, Marx A, Biernat J, Mandelkow EM, Mandelkow E (2001) J Biol Chem 276: 48165-48174

26. Friedhoff P, von Bergen M, Mandelkow EM, Mandelkow E (2000) Biochim Biophys Acta 1502: 122-132 Review

27. Illenberger S, Zheng-Fischhofer Q, Preuss U, Stamer K, Baumann K, Trinczek B, Biernat J, Godemann R, Mandelkow EM, Mandelkow E (1998) Mol Biol célula 9: 1495-1512

28. Kampers T, Friedhoff P, Biernat J, Mandelkow EM, Mandelkow E (1996) FEBS Lett 399: 344-349

29. Perez M, Valpuesta JM, Medina M, Montejo de Garcini E, Avila J (1996) J Neurochem 67: 1183-1190

30. Wang J-Z; Grundke-Iqbal I; Iqbal K (1996) Naturaleza Med 2: 871875

31. Wilson DM, Binder LI (1997) Am J Pathol 150: 2181-2195

32. Schweers O, Mandelkow EM, Biernat J, Mandelkow E (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 8463-8467

33. Rsiezak-Reding H, Yang G, Simon M, Wall JS (1998) Brain Res. 814: 86-98

34. Schneider A, Biernat J, Von Bergen M, Mandelkow E, Mandelkow EM (1999) Biochemistry 38: 3549-3558

35. Yan S-D, Chen X, Schmid A-M, Brett J, Godman G, Zou Y-S, Scott CW, Caputo C, Frappier T, Smith MA, Perry G, Yen SH, Stern D (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7787-7791

36. Smith MA, Taneda S, Richey PL, Miyata S, Yan SD, Stern D, Sayre LM, Monnier VM, Perry G (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 5710-5714

37. Mori H, Kondo J, Ihara Y (1987) Science 235: 1641-1644

38. Paudel H, Li W (1999). J Biol Chem 274: 8029-8038

39. Goedert M, Spillantini MG, Potier MC, Ulrich J, Crowther RA, (1989) EMBO J. 8,393

40. Goedert M, Spillantini MG, Jakes R, Rutherford D, Crowther RA (1989) Neurona 4,519

41. Crowther RA, Olesen OF, Jakes R, Goedert M (1992) FEBS Lett 309: 199-202

42. Crowther RA, Olesen OF, Smith MJ, Jakes R, Goedert M (1994) FEBS Letter 337: 135-138

43. (véase, por ejemplo M. Kohler y C. Milstein, en "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Pre-Defined Specificity", Nature, 256, págs. 495-497, 1975; y Harlow y Lane, en "Anticuerpos, un Manual de Laboratorio", Cold Sring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)

Claims

1. Moléculas de tau truncadas doblemente de forma N- y C-terminal, designadas a continuación moléculas de tau de tipo IIA, que se caracterizan por las siguientes propiedades

- las moléculas tienen truncados, como mínimo, los primeros 68 aminoácidos N-terminales y, como mínimo, los últimos 40 aminoácidos C-terminales de las 4 unidades repetidas que contiene la tau43, o los primeros 68 aminoácidos N-terminales y, como mínimo, los últimos 20 aminoácidos C-terminales de las 3 unidades repetidas que contiene la tau44 truncada,

2. Moléculas de tau de tipo IIA, según la reivindicación 1, caracterizadas porque comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de los Nos. Id. Sec. 11 a 18.

3. Método para la preparación de las moléculas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por las etapas siguientes:

a) construcción de plásmidos de expresión procarióticos recombinantes que portan secuencias de codificación para una molécula de tau truncada doblemente con las eliminaciones y la actividad de promoción del ensamblaje de microtúbulos, según se define en la reivindicación 1 ó 2,

c) recolección de las bacterias, preferentemente por centrifugación,

d) resuspensión de nuevo de la pastilla bacteriana,

e) sonicación de dichas bacterias,

f) fraccionamiento de dichas bacterias sonicadas por filtración en gel y

4. Método de preparación de las moléculas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por las etapas siguientes:

b) precipitación con sulfato amónico de dicho tejido cerebral homogeneizado,

c) redisolución en solución tampón de PIPES,

d) fraccionamiento de dicho material redisuelto por filtración de gel y

f) monitorización de la actividad de las fracciones obtenidas por un ensayo de ensamblaje de microtúbulos para identificar las diferentes actividades de las moléculas de tau de tipo IIA con una actividad de promoción del ensamblaje, como mínimo, un 20% mayor que la tau de tipo salvaje en un ensayo de ensamblaje de microtúbulos in vitro.

5. Método para la conversión in vitro de microtúbulos a un estado patológico, que se caracteriza por la incubación de proteína tau de tipo salvaje con el tipo IIA, según la reivindicación 1 ó 2 en condiciones fisiológicas, que permite la interacción de dichas moléculas de tipo IIA con los microtúbulos generando microtúbulos patológicos.

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6. Método para explorar sustancias capaces de neutralizar los efectos patológicos de moléculas de tipo IIA, según las reivindicaciones 1 ó 2 por sus propiedades de eliminación y/o neutralización de moléculas de tipo IIA y restauración de los parámetros y funciones fisiológicos de los microtúbulos provocados por moléculas de tipo II, que comprende las etapas siguientes:

a) formación de microtúbulos patológicos en presencia de moléculas de tipo IIA y tubulina, según la reivindicación 5,

c) evaluación del resultado con respecto a la disminución de la formación de microtúbulos patológicos provocada por las moléculas de tipo IIA.

7. Método para evaluar sustancias efectivas en la inhibición de la actividad in vivo de moléculas de tipo IIA, según la reivindicación 1 ó 2, de promoción de la formación de microtúbulos y la función anormal de éstos, en un sistema celular que expresa moléculas de tipo IIA que comprenden las etapas siguientes:

a) introducción de un gen funcional que codifica moléculas de tipo IIA bajo control de las regiones reguladoras adecuadas en una célula que expresa tau de tipo salvaje,

b) permitir la formación de complejos entre las moléculas de tau de tipo IIA y los microtúbulos, de modo que dichos complejos estén implicados en la formación de microtúbulos patológicos,

c) aplicar la sustancia que se evaluará a las células que alojan dichos complejos y

d) examinar el efecto de dicha sustancia en la actividad biológica de tipo IIA, especialmente en las modificaciones del conjunto de microtúbulos tau y de sus funciones asociadas.

8. Animal transgénico que expresa una molécula, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

9. Utilización de un animal transgénico, según la reivindicación 8, como modelo animal para la enfermedad de Alzheimer, especialmente para el cribado y la evaluación de fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

10. Vacuna que comprende una molécula, según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, especialmente según la reivindicación 2, y un portador aceptable farmacéuticamente, especialmente un coadyuvante.