ES2311638T5 - Métodos de uso de polimerasas mejoradas. - Google Patents
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Abstract
Un método para incrementar el rendimiento de una reacción de polimerasa sobre un ácido nucleico diana presente en una solución que contiene un inhibidor de la polimerasa, comprendiendo el método: (a) la puesta en contacto del ácido nucleico diana con una polimerasa, donde la polimerasa está unida covalentemente a un dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia que: (i) se une a ácido nucleico bicatenario y (ii) incrementa la procesividad de la polimerasa en comparación con una polimerasa idéntica que no tenga fusionado a la misma el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia, y donde la solución tiene una composición que permite al dominio de unión unirse al ácido nucleico diana y al dominio polimerasa extender un cebador que esté hibridado a la secuencia de ácido nucleico diana; (b) la incubación de la solución en condiciones bajo las cuales el cebador sea extendido por la polimerasa, con la condición de que la sal no sea un inhibidor.
Description
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60//333.966, registrada el 28 de Noviembre de 2001.
Esta invención proporciona métodos más eficaces para llevar a cabo reacciones de polimerasa. Los métodos emplean una generación mejorada de polimerasas de ácido nucleico. La mejora es la unión covalente al enzima de un dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia, de tal manera que incrementa la capacidad del enzima para unirse y modificar catalíticamente al ácido nucleico.
La procesividad de una polimerasa, esto es la cantidad de producto generada por el enzima por acontecimiento de unión, puede ser incrementada aumentando la estabilidad del complejo enzima modificador/ácido nucleico. La presente invención proporciona ahora ensayos mejorados de polimerasa que emplean nuevos enzimas modificadores en los cuales la conformación bicatenaria del ácido nucleico está estabilizada y la procesividad del enzima incrementada por la unión al enzima de un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario no específico de ninguna secuencia, o su dominio catalítico, que se describen en, por ejemplo, la Solicitud de EE.UU. Copendiente Nº 09/870.353 y WO01/92501. Las proteínas modificadoras que son procesivas por naturaleza presentan una procesividad incrementada cuando están unidas a un dominio de unión en comparación con el enzima solo. WO01/11051 describe un método para incrementar el rendimiento de una reacción de polimerasa utilizando una polimerasa unida no covalentemente a un dominio de unión de ácido nucleico no específico de ninguna secuencia.
Existe la necesidad de mejorar las reacciones de polimerasa en muchas aplicaciones. Por ejemplo, SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, OR; Patentes de EE.UU. 5.436.134 y 5.658.751), un colorante fluorescente que es específico para la detección de ADN bicatenario, es muy utilizado en las reacciones de PCR en tiempo real para monitorizar la generación de ADN bicatenario por cada ciclo de amplificación. Sin embargo, la adición de SYBR Green I inhibe la actividad de las ADN polimerasas utilizadas en PCR. De manera similar, es a menudo deseable utilizar PCR para el análisis de muestras de ácido nucleico brutas o "sucias". Por ejemplo, la PCR de colonias es una técnica útil en la cual muestras pequeñas de colonias bacterianas individuales son lisadas y añadidas directamente a reacciones de PCR con el fin de seleccionar colonias por secuencias particulares de ADN. Sin embargo, la PCR de colonias tiene una elevada tasa de fallos, debido a los contaminantes residuales procedentes de la colonia. Por tanto, se necesitan polimerasas que sean resistentes a tales inhibidores, por ejemplo, a los colorantes fluorescentes y a las impurezas presentes en los extractos celulares, con el fin de obtener reacciones de polimerasa más eficaces, por ejemplo, la PCR.
Existe también la necesidad de mejorar las reacciones de secuenciación. Las polimerasas empleadas actualmente en las reacciones de secuenciación, por ejemplo, la secuenciación por ciclos, son a menudo ineficaces. Por ejemplo, la secuenciación por ciclos se realiza a menudo con enzimas de procesividad baja. A menudo, los enzimas utilizados son derivados ΔTaq, en los cuales se ha eliminado el dominio nucleasa 5'-3' de la polimerasa Taq, y tienen una procesividad de 2 bases aproximadamente. Además, en el caso de la secuenciación por terminador colorante, se utiliza dITP en lugar de dGTP, que hace que la polimerasa se detenga y se disocie en los nucleótidos G. Estos enzimas producen por tanto un gran número de productos de secuencia que están terminados incorrectamente. Estas paradas compiten con, y afectan negativamente a, la producción de productos de secuencia terminados apropiadamente. Además, si una polimerasa se disocia durante la extensión de los cebadores de un molde que contiene una unidad de repetición (por ejemplo, la repetición de un triplete) o estructura secundaria (por ejemplo, un tronco y un bucle), el extremo 3' puede desnaturalizarse y rehibridarse para cebar en una posición diferente del molde — por ejemplo, en el caso de una repetición, la rehibridación podría tener lugar en una repetición diferente; o en el caso de la estructura secundaria, una rehibridación incorrecta podría eliminar una sección del molde. Por tanto, la disociación de la polimerasa durante la secuenciación puede producir un problema en la obtención eficaz de información fiable sobre la secuenciación.
La presente invención está dirigida a ambas necesidades, esto es, a la necesidad de mejorar las reacciones de polimerasa llevadas a cabo en presencia de inhibidores y la necesidad de mejorar la procesividad en las aplicaciones de secuenciación de ADN. La presente invención proporciona tales reacciones de polimerasa incrementadas o mejoradas. La mejora es la utilización de una polimerasa que tenga una procesividad incrementada debido a la presencia de un dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia que está unido covalentemente a la polimerasa.
La presente invención proporciona métodos para llevar a cabo reacciones de polimerasa más eficaces utilizando una proteína polimerasa que contiene un dominio polimerasa unido covalentemente a un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario no específico de secuencia que contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d. La presencia del dominio de unión a ácido nucleico bicatenario no específico de ninguna secuencia mejora la procesividad de la polimerasa en comparación con una proteína idéntica que no tenga unido covalentemente a ella un dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia.
El dominio polimerasa puede ser térmicamente estable, por ejemplo, un dominio polimerasa de Thermus tal como un dominio de la polimerasa ΔTaq, o un dominio polimerasa de Pyrococcus.
En una realización, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d. Típicamente, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia es Sso7d o se une específicamente a anticuerpos policlonales producidos contra Sso7d.
La reacción de polimerasa puede ser llevada a cabo sobre un ácido nucleico diana que esté presente en la preparación bruta de una muestra. En otra realización, la reacción de polimerasa se lleva a cabo en presencia de una molécula que inhibe típicamente las polimerasas, particularmente, colorantes fluorescentes tales como SYBR Green I. Además, la polimerasa puede ser utilizada en reacciones de secuenciación por ciclos para obtener secuencias más largas, por ejemplo a través de regiones de la estructura secundaria que impiden la secuenciación utilizando polimerasas no modificadas.
Las Figuras 1A y 1B muestran los resultados de una reacción de PCR llevada a cabo en presencia de contaminantes, utilizando una polimerasa mejorada.
Descripción detallada de la invención
"Proteína de unión a ADN básica pequeña de Arqueobacterias" se refiere a una proteína de entre 50-75 aminoácidos que tiene un 50% de homología con una proteína de unión a ADN básica, pequeña, natural de Arqueobacterias tal como Sso7d de Sulfolobus sulfataricus, o bien que se une a anticuerpos generados contra una proteína de unión a ADN básica, pequeña, nativa de Arqueobacterias.
"Dominio" se refiere a una unidad de una proteína o de un complejo proteico, que comprende una subsecuencia polipeptídica, una secuencia polipeptídica completa o una pluralidad de secuencias polipeptídicas en las que esa unidad tiene una función definida. Se comprende que la función está claramente definida y puede ser la unión a ligandos, una actividad catalítica, o puede tener un efecto estabilizante sobre la estructura de la proteína.
"Eficacia", en el contexto de un enzima modificador de ácidos nucleicos de esta invención, se refiere a la capacidad del enzima para llevar a cabo su función catalítica bajo condiciones de reacción específicas. Típicamente, la "eficacia", según se define en la presente, está indicada por la cantidad de producto generado bajo condiciones de reacción dadas.
"Incrementar" en el contexto de un enzima, se refiere a mejorar la actividad del enzima, esto es, a incrementar la cantidad de producto por unidad de enzima, por unidad de tiempo.
"Fusionado" se refiere a la unión mediante un enlace covalente.
"Heterólogas", cuando se utiliza con referencia a porciones de una proteína, indica que la proteína contiene dos o más dominios que no se encuentran en la naturaleza en la misma relación entre sí. Tal proteína, por ejemplo una proteína de fusión, contiene dos o más dominios procedentes de proteínas no relacionadas dispuestos para producir una nueva proteína funcional.
"Unir" se refiere a una unión covalente, incluyendo sin limitación la fusión recombinante con o sin dominios intermedios; a una fusión mediada por inteína y a enlaces disulfuro.
"Enzima modificador de ácidos nucleicos" se refiere a un enzima que altera covalentemente a un ácido nucleico.
"Polimerasa" se refiere a un enzima que lleva a cabo la síntesis de polinucleótidos dirigida por un molde. El término, según se utiliza en la presente, se refiere también a un dominio de la polimerasa que tiene actividad catalítica.
"Actividad correctora de errores" de una polimerasa o de un dominio de polimerasa, se refiere a la actividad correctora exonucleasa 3' a 5' de una polimerasa de ácido nucleico específica de un molde, mediante la cual los nucleótidos que no forman pares de bases de Watson-Crick con el molde son eliminados del extremo 3' de un oligonucleótido, esto es, de una hebra que está siendo sintetizada a partir de un molde, de manera secuencial. Ejemplos de polimerasas que tienen actividad correctora de errores incluyen las polimerasas de Pyrococcus furiosus, Thermococcus litoralis y Thermotoga maritima.
Procesividad se refiere a la capacidad de un enzima modificador de ácidos nucleicos para permanecer unido al molde o sustrato y llevar a cabo múltiples reacciones de modificación. La procesividad es medida por el número de acontecimientos catalíticos que tienen lugar por cada acontecimiento de unión.
"Dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia", se refiere al dominio de una proteína que se une con una afinidad significativa a un ácido nucleico, para el que no se conoce un ácido nucleico que se una al dominio proteico con una afinidad mayor de 100 veces que otro ácido nucleico con la misma composición de nucleótidos pero con una secuencia de nucleótidos diferente.
"Polimerasa térmicamente estable", según se utiliza en la presente, se refiere a cualquier enzima que cataliza la síntesis de polinucleótidos por la adición de unidades de nucleótidos a una cadena de nucleótidos utilizando ADN o ARN como molde y que tiene una actividad óptima a una temperatura por encima de 45ºC.
"Polimerasa de Thermus" se refiere a una ADN polimerasa de la familia A aislada de cualquier especie de Thermus, incluyendo sin limitación Thermus aquaticus, Thermus brockianus y Thermus thermophilus; a cualquier enzima recombinante derivado de las especies de Thermus y a cualquier derivado funcional de los mismos, ya sea derivado mediante modificación genética o modificación química o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.
El término "reacción de amplificación" se refiere a cualquier medio in vitro para multiplicar las copias de una secuencia de ácido nucleico diana. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción de la ADN ligasa (ver las Patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis y col., eds., 1990)), (LCR), la reacción de la ARN replicasa QBeta y las reacciones de amplificación basadas en la transcripción de ARN (tales como TAS y 3SR), así como otras conocidas por los expertos en la técnica.
"Amplificación" se refiere a la etapa de someter a una solución a condiciones suficientes para permitir la amplificación de un polinucleótido si todos los componentes de la reacción están intactos. Los componentes de una reacción de amplificación incluyen, por ejemplo, cebadores, un molde polinucleotídico, polimerasa, nucleótidos, etcétera. El término "amplificación" se refiere típicamente a un incremento "exponencial" del ácido nucleico diana. Sin embargo, "amplificación", según se utiliza en la presente, puede referirse también a incrementos lineales del número de una secuencia de ácido nucleico diana seleccionada.
El término "mezcla de la reacción de amplificación" se refiere a una solución acuosa que contiene los diferentes reactivos utilizados para amplificar un ácido nucleico diana. Éstos incluyen enzimas, tampones acuosos, sales, cebadores de la amplificación, ácido nucleico diana y nucleósidos trifosfato. Dependiendo del contexto, la mezcla puede ser una mezcla de la reacción de amplificación completa o incompleta.
"Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", se refiere a un método mediante el cual un segmento específico o una subsecuencia específica de un ADN bicatenario diana son amplificados en progresión geométrica. La PCR es bien conocida por los expertos en la técnica; ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y col., eds., 1990. Las condiciones de una reacción de PCR ejemplar comprenden típicamente dos o tres ciclos progresivos. Dos ciclos progresivos tienen una etapa de desnaturalización seguida por una etapa de hibridación/elongación. Tres ciclos progresivos comprenden una etapa de desnaturalización seguida por una etapa de hibridación seguida por una etapa de elongación separada.
"PCR larga" se refiere a la amplificación de un fragmento de ADN de 5 kb de longitud o mayor. La PCR larga se lleva a cabo típicamente utilizando polimerasas o mezclas de polimerasas especialmente adaptadas (ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos 5.436.149 y 5.512.462) que son distintas de las polimerasas utilizadas convencionalmente para amplificar productos más cortos.
Un "cebador" se refiere a una secuencia polinucleotídica que hibrida con una secuencia de un ácido nucleico diana y sirve como punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico. Los cebadores pueden tener una variedad de longitudes y tienen a menudo menos de 50 nucleótidos de longitud, por ejemplo 12-30 nucleótidos de longitud. La longitud y las secuencias de los cebadores para ser utilizados en PCR pueden ser diseñadas sobre la base de principios conocidos por los expertos en la técnica; ver, por ejemplo, Innis y col., supra.
Un perfil de temperatura se refiere a la temperatura y a la duración del tiempo de las etapas de desnaturalización, hibridación y/o extensión de una reacción de PCR o de una reacción de secuenciación por ciclos. Un perfil de temperatura para una PCR o para una reacción de secuenciación por ciclos consta típicamente de 10 a 60 repeticiones de perfiles de temperatura más cortos similares o idénticos; cada uno de estos perfiles más cortos puede definir típicamente un ciclo de dos etapas o de tres etapas. La selección de un perfil de temperatura está basada en varias consideraciones conocidas por los expertos en la técnica, ver, por ejemplo, Innis y col., supra. En una reacción de PCR larga, según se describe en la presente, el tiempo de extensión requerido para obtener un producto de amplificación de 5 kb de longitud o mayor está reducido en comparación con las mezclas de polimerasa convencionales.
La "sensibilidad" de la PCR se refiere a la capacidad para amplificar un ácido nucleico diana que está presente con un bajo número de copias. Un "bajo número de copias" se refiere a 105, a menudo a 104, 103, 102 o menos copias de la secuencia diana en la muestra de ácido nucleico que va a ser amplificada.
Un "molde" se refiere a una secuencia polinucleotídica bicatenaria que contiene el polinucleótido que va a ser amplificado, flanqueado por sitios de hibridación de los cebadores. Así, un "molde diana" contiene la secuencia polinucleotídica diana flanqueada por sitios de hibridación para un cebador 5' y para un cebador 3'.
Una "polimerasa mejorada" incluye un dominio de unión a ADN bicatenario no específico de ninguna secuencia unido a la polimerasa o a un dominio polimerasa. Una "polimerasa no mejorada" es una polimerasa que no tiene un dominio de unión a ADN bicatenario no específico de ninguna secuencia.
La presente invención proporciona métodos para llevar a cabo reacciones de polimerasa utilizando polimerasas mejoradas. Estas reacciones de polimerasa son típicamente más eficaces y producen más producto que las polimerasas tradicionales. Estas polimerasas mejoradas contienen un dominio polimerasa, con un dominio de unión que contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene un 50% de similitud con Sso7D, unido covalente al mismo. Aunque la técnica anterior describió que las proteínas de unión a ácidos nucleicos pueden incrementar la afinidad de unión de enzimas a ácidos nucleicos, el grupo de proteínas de unión que tienen la capacidad de mejorar la naturaleza procesiva del enzima tiene un valor particular. Sin querer estar ligado a ninguna teoría, los dominios de unión de la invención, como se expone anteriormente, se disocian típicamente del ácido nucleico bicatenario a una velocidad muy lenta. De este modo, incrementan la procesividad y/o la eficacia del enzima modificador al que están unidos covalentemente mediante la estabilización del complejo enzima-ácido nucleico. Por consiguiente, esta invención es el resultado del descubrimiento de que los dominios de unión a ADN de la invención pueden estabilizar la conformación bicatenaria de un ácido nucleico e incrementar la eficacia de un dominio catalítico que requiera un sustrato bicatenario. En la presente se describen ejemplos y ensayos sencillos para determinar fácilmente la mejora de la naturaleza catalítica y/o procesiva de enzimas catalíticos modificadores de ácidos nucleicos, por ejemplo, polimerasas.
Las ADN polimerasas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Éstas incluyen polimerasas dependientes de ADN y polimerasas dependientes de ARN tales como la transcriptasa inversa. Se conocen al menos cinco familias de ADN polimerasas dependientes de ADN, aunque la mayoría están dentro de las familias A, B y C. Existe poca o ninguna similitud estructural o de secuencias entre las diferentes familias. La mayoría de las polimerasas de la familia A son proteínas de una sola cadena que pueden contener múltiples funciones enzimáticas incluyendo actividad polimerasa, actividad exonucleasa 3' a 5' y actividad exonucleasa 5' a 3'. Las polimerasas de la familia B tienen típicamente un único dominio catalítico con actividad polimerasa y exonucleasa 3' a 5', además de factores accesorios. Las polimerasas de la familia C son típicamente proteínas de múltiples subunidades con actividad polimerizante y exonucleasa 3' a 5'. En E. coli, se han encontrado tres tipos de ADN polimerasas, las ADN polimerasas I (familia A), II (familia B) y III (familia C). En las células eucarióticas, tres polimerasas diferentes de la familia B, las ADN polimerasas α, δ y ε, están implicadas en la replicación nuclear, y una polimerasa de la familia A, la polimerasa γ, es utilizada para la replicación del ADN mitocondrial. Otros tipos de ADN polimerasas incluyen las polimerasas de los fagos.
De manera similar, las ARN polimerasas incluyen típicamente las ARN polimerasas procarióticas I, II y III, y las ARN polimerasas bacterianas así como las polimerasas de fagos y virus. Las ARN polimerasas pueden ser dependientes de ADN y dependientes de ARN.
En una realización, los dominios polimerasa que tienen actividad correctora de errores son utilizados como el dominio catalítico de las polimerasas mejoradas descritas en la presente. Estas polimerasas pueden ser utilizadas para obtener productos de PCR largos, esto es, de 5 kb, a menudo de 10 kb, de longitud, o mayores. Puede realizarse una "PCR larga" utilizando estas polimerasas mejoradas empleando tiempos de extensión que están reducidos en comparación con la polimerasa y/o las mezclas de polimerasas para la "PCR larga" de la técnica anterior. Pueden utilizarse tiempos de extensión menores de 30 segundos por kb, a menudo de 15 segundos por kb, para amplificar productos largos en reacciones de PCR utilizando las polimerasas mejoradas. Además, estas polimerasas mejoradas presentan también una sensibilidad incrementada.
Las polimerasas no correctoras de errores de la técnica anterior tales como la polimerasa Taq, son capaces de amplificar ADN a partir de concentraciones muy pequeñas de las copias iniciales, tales como, como mínimo, 10 copias por ml. Sin embargo, debido a la baja fidelidad de tales polimerasas, es probable que los productos clonados a partir de tales amplificaciones contengan mutaciones introducidas.
Las polimerasas correctoras de errores de la técnica anterior tales como la Pfu, copian ADN con mayor fidelidad que la Taq, pero no son capaces de amplificar ADN a partir de pequeñas concentraciones de copias iniciales. Las polimerasas correctoras de errores híbridas de la invención presentan una procesividad mucho más elevada a la vez que conservan la actividad correctora de errores y proporcionan de este modo sensibilidad y fidelidad a las reacciones de amplificación.
La actividad de una polimerasa puede ser medida utilizando ensayos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una actividad enzimática procesiva, tal como una actividad polimerasa, puede ser medida determinando la cantidad de ácido nucleico sintetizada en una reacción, tal como una reacción en cadena de la polimerasa. Para determinar la eficacia relativa del enzima, la cantidad de producto obtenido con una polimerasa que contiene un dominio de unión a ADN bicatenario no específico de ninguna secuencia, puede ser comparada posteriormente con la cantidad de producto obtenida con el enzima polimerasa normal, lo cual será descrito con más detalle posteriormente y en los Ejemplos.
Un dominio polimerasa adecuado para ser utilizado en esta invención puede ser el propio enzima o el dominio catalítico, por ejemplo, la polimerasa Taq o un dominio de Taq con actividad polimerasa. El dominio catalítico puede incluir aminoácidos adicionales y/o puede ser una variante que contenga sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos pero que conserve todavía la actividad enzimática.
Dominio de Unión a Ácido Nucleico No Específico de Ninguna Secuencia
Un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario no específico de la secuencia es una proteína o una región definida de una proteína, que se une a un ácido nucleico bicatenario de manera independiente de la secuencia, esto es, la unión no presenta una preferencia grande por una secuencia particular y que contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d. Típicamente, las proteínas de unión a ácido nucleico bicatenario presentan una afinidad de 10 veces o mayor por los ácidos nucleicos bicatenarios frente a los ácidos nucleicos monocatenarios. Las proteínas de unión a ácidos nucleicos bicatenarios de las realizaciones particulares de la invención son preferiblemente termoestables. Ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, las proteínas de unión a ADN básicas, pequeñas, de Arqueobacterias Sac7d y Sso7d (ver, por ejemplo, Choli y col., Biochimica et Biophysica Acta 950:193-203, 1988; Baumann y col., Structural Biol. 1:808-819, 1994; y Gao y col., Nature Struc. Biol. 5:782-786, 1998)
Sso7d y Sca7d
Sso7d y Sca7d son proteínas cromosómicas básicas pequeñas (7.000 kd aproximadamente de peso molecular), de las arqueobacterias hipertermofílicas Sulfolobus solfataricus y S. acidocaldarius, respectivamente. Estas proteínas son ricas en lisina y tienen una elevada estabilidad térmica, ácida y química. Se unen al ADN de manera independiente de la secuencia y cuando están unidas incrementan la TM del ADN hasta 40ºC bajo ciertas condiciones (McAfee y col., Biochemistry 34:10063-10077, 1995). Se cree que estas proteínas y sus homólogos están típicamente implicadas en el empaquetamiento del ADN genómico y en la estabilización del ADN genómico a temperaturas elevadas.
Omitido deliberadamente
Los dominios de unión a ácido nucleico adicionales adecuados para ser utilizados en la invención pueden ser identificados por homología Sso7D y/o mediante reactividad cruzada con anticuerpos. Estos métodos están descritos en, por ejemplo, WO01/92501. Además, se describen también métodos para unir la polimerasa a la proteína de unión a ADN bicatenario no específica de ninguna secuencia y métodos para expresar polimerasas recombinantes y proteínas de fusión de polimerasas (ver, por ejemplo, WO01/92501).
La actividad del dominio polimerasa puede ser medida utilizando una variedad de ensayos que pueden ser empleados para comparar la procesividad o la actividad modificadora de un dominio proteico modificador unido a un dominio de unión en comparación con la proteína por sí misma. La mejora de la actividad incluye una procesividad incrementada y una eficacia incrementada.
La procesividad de la polimerasa puede ser medida en una variedad de métodos conocidos por las personas con experiencia habitual en la técnica. La procesividad de la polimerasa es definida de manera general como el número de nucleótidos incorporados durante un único acontecimiento de unión de un enzima modificador a un molde cebado.
Por ejemplo, un cebador marcado con FAM 5' es hibridado a ADN de M13mp18 monocatenario circular o linealizado para formar un molde cebado. En la medida de la procesividad, el molde hibridado está presente normalmente en un exceso molar significativo respecto al enzima o respecto al dominio catalítico que va a ser analizado, de tal manera que la probabilidad de que cualquier molde cebado sea extendido más de una vez por la polimerasa esté minimizada. El molde cebado es por tanto mezclado con el dominio catalítico de la polimerasa que va a ser analizado en una proporción tal como 4000:1 aproximadamente (ADN cebado:ADN polimerasa) en presencia de tampón y dNTPs. Se añade MgCl2 para iniciar la síntesis de ADN. Las muestras son amortiguadas a varios tiempos después del inicio y analizadas en un gel de secuenciación. A una concentración de polimerasa en la que la mediana de la longitud de los productos no cambie con el tiempo o con la concentración de polimerasa, la longitud corresponde a la procesividad del enzima. La procesividad de una proteína de la invención, esto es, de una proteína que contenga un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario no específico de ninguna secuencia fusionado al dominio catalítico de un enzima modificador de ácido nucleico procesivo tal como una polimerasa, es posteriormente comparada con la procesividad del enzima sin el dominio de unión.
La eficacia mejorada puede ser también demostrada midiendo la capacidad incrementada de un enzima para producir producto. Tal análisis mide la estabilidad del dúplice de ácido nucleico bicatenario indirectamente mediante la determinación de la cantidad de producto obtenida en una reacción. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de PCR para medir la cantidad de producto de la PCR obtenida con un cebador corto, por ejemplo de 12 nucleótidos de longitud, hibridado a una temperatura elevada, por ejemplo 50ºC. En este análisis, la eficacia mejorada es mostrada por la capacidad de una polimerasa, tal como una polimerasa Taq, para producir más producto en una reacción de PCR utilizando el cebador de 12 nucleótidos hibridado a 50ºC cuando está unido a un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario no específico de ninguna secuencia de la invención, por ejemplo, Sso7d, que la polimerasa Taq sola. En contraste, un tracto de unión que sea una serie de residuos cargados, por ejemplo lisinas, no mejora la procesividad cuando está unido a una polimerasa.
Pueden utilizarse también ensayos tales como la sensibilidad a la sal para demostrar la mejora de la eficacia de un enzima procesivo modificador de ácidos nucleicos de la invención. Un enzima modificador, o el dominio catalítico, cuando está fusionado a un dominio de unión a un ácido nucleico bicatenario no específico de ninguna secuencia de la invención, presenta una tolerancia incrementada a concentraciones elevadas de sal, esto es, un enzima procesivo con procesividad incrementada puede producir más producto en concentraciones de sal más elevadas. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un análisis mediante PCR para determinar la cantidad de producto obtenida en una reacción utilizando una polimerasa Taq de fusión (por ejemplo, Sso7d fusionada a polimerasa Taq) en comparación con la polimerasa Taq en condiciones de reacción con una elevada concentración de sal, por ejemplo, 80 mM.
Otros métodos para determinar la eficacia incrementada de las polimerasas mejoradas de la invención pueden ser determinados por las personas con experiencia habitual en la técnica utilizando ensayos estándar de la actividad enzimática de un enzima modificador dado.
La invención proporciona métodos mejorados para llevar a cabo reacciones de polimerasa. En una realización, la invención proporciona un método para llevar a cabo una reacción de polimerasa en presencia de un colorante fluorescente. Varios colorantes fluorescentes que son utilizados comúnmente en reacciones tales como la PCR en tiempo real, que tienen una actividad inhibidora sobre las polimerasas, han sido utilizados típicamente en PCR, por ejemplo la polimerasa Taq. Por ejemplo, el SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, OR; Patentes de EE.UU.
5.436.134 y 5.658.751), es un colorante fluorescente que es específico para la detección de ADN bicatenario, y es ampliamente utilizado en las reacciones de PCR en tiempo real para monitorizar la producción de ADN bicatenario a través de cada ciclo de amplificación. La utilización de colorantes para monitorizar la amplificación está descrita en las Patentes de EE.UU. 5.994.056 y 6.171.785, y la utilización de SYBR Green I para este fin está descrita en Morrison y col., Biotechniques 24:954-962 (1998).
Se ha observado que la adición de SYBR Green I inhibe la actividad de las ADN polimerasas utilizadas en PCR, posiblemente interfiriendo con la unión de la polimerasa al cebador-molde. Se requieren por tanto a menudo aditivos tales como DMSO para reducir el efecto inhibidor del colorante. Sin embargo, el DMSO puede reducir la estabilidad durante el almacenamiento del enzima y puede inhibir las polimerasas. La presente invención proporciona un método para llevar a cabo reacciones de polimerasa en presencia de un colorante fluorescente que utiliza las polimerasas mejoradas descritas en la presente, que no son tan sensibles al colorante fluorescente, esto es, que no son inhibidas en el mismo grado que la polimerasa no mejorada.
La capacidad de una polimerasa para funcionar en presencia de un colorante que presenta emisiones de fluorescencia alteradas cuando está unido a ADN bicatenario, puede ser medida utilizando ensayos de polimerasa bien conocidos, tales como los descritos en la presente. Típicamente, un colorante fluorescente reduce la actividad de una polimerasa no mejorada en un 25%, a menudo en un 50%, en un 75% o más. La actividad polimerasa puede ser analizada utilizando los métodos descritos en la presente.
La capacidad de una polimerasa mejorada para llevar a cabo una reacción de PCR en presencia de un colorante fluorescente, por ejemplo SYBR Green I, puede ser también comparada con la capacidad de la polimerasa no mejorada para funcionar en una reacción de PCR por lo demás idéntica. La comparación puede ser realizada utilizando valores tales como el valor umbral de ciclos (Ct), que representa el número de ciclos requeridos para generar una cantidad detectable de ADN. Una polimerasa eficaz puede ser capaz de producir una cantidad detectable de ADN en un número menor de ciclos, aproximándose más estrechamente a la eficacia de amplificación máxima teórica de la PCR. Por consiguiente, un valor más bajo de Cf refleja una mayor eficacia de amplificación para el enzima. Los enzimas mejorados presentan una actividad 2x, a menudo 5x o mayor, en presencia de un colorante fluorescente, cuando se comparan con el enzima no mejorado.
En las realizaciones típicas, la reacción de la polimerasa se lleva a cabo en presencia de un colorante fluorescente tal como SYBR Green I o Pico Green (Molecular Probes, Eugene, OR). Estos colorantes son colorantes de cianina asimétrica que contienen un sustituyente definido en el sistema de anillos de piridinio o quinolinio o un sustituyente inmediatamente adyacente al átomo de nitrógeno del anillo de piridinio o quinolinio. Estos y otros miembros de la misma clase de colorantes están descritos en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos 5.436.134 y 5.658.751. El SYBR Green I, por ejemplo, se une específicamente a ADN bicatenario con una constante de disociación en el rango submicromolar. Después de la unión, tiene un gran incremento de su rendimiento cuántico y por tanto un gran incremento de la fluorescencia.
En otras realizaciones, las reacciones de polimerasa de la invención pueden ser llevadas a cabo en presencia de otros compuestos fluorescentes que inhiben típicamente las polimerasas, tales como otros colorantes fluorescentes, por ejemplo, yoduro de propidio, bromuro de etidio, acridinas, proflavina, naranja de acridina, acriflavina, fluorocumarina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D, cromomicina, mitramicina, polipiridilos de rutenio y antramicina, que presentan también emisiones alteradas de fluorescencia cuando se unen a ADN bicatenario. Las polimerasas mejoradas pueden ser analizadas para determinar la resistencia a otros colorantes utilizando una metodología bien conocida en la técnica y descrita en la presente (ver, por ejemplo, el Ejemplo 6).
En otra realización, la invención proporciona un método para llevar a cabo una reacción de polimerasa, por ejemplo una reacción de PCR, en presencia de contaminantes tales como los presentes cuando se utiliza una muestra de ácido nucleico bruta. En las preparaciones de muestras de ácido nucleico brutas están a menudo presentes inhibidores de la actividad polimerasa, presentando así dificultades para utilizar tales preparaciones en reacciones de polimerasa tales como PCR o secuenciación de ácidos nucleicos. Los enzimas mejorados son más tolerantes a tales contaminantes. Por consiguiente, los enzimas mejorados ofrecen ventajas sobre los enzimas estándar cuando se realizan reacciones de polimerasa, por ejemplo PCR, utilizando preparaciones de ácido nucleico brutas. Estas preparaciones pueden proceder de una variedad de fuentes, incluyendo células tales como células bacterianas, células vegetales y otros tipos celulares diferentes.
Una muestra de ácido nucleico bruta incluye típicamente contaminantes que proceden de la fuente del ácido nucleico o de una manipulación previa química o de biología molecular.
Las polimerasas mejoradas son menos sensibles a la presencia de tales contaminantes. Según se indicó anteriormente, los ensayos de la actividad polimerasa pueden ser realizados utilizando los métodos descritos en la presente. Una polimerasa mejorada presenta típicamente una actividad 2x, 5x, 10x o mayor, con relación a la polimerasa no mejorada, cuando se analiza en presencia de contaminantes en un ensayo de actividad de la polimerasa o en una PCR por lo demás idénticos. Una análisis ejemplar de la actividad polimerasa en preparaciones brutas está proporcionado en el Ejemplo 7. Las preparaciones brutas típicamente no son procesadas mediante ciclos repetidos de purificación y son típicamente menos de un 98% puras, a menudo menos de un 95% puras.
Los enzimas polimerasa mejorados son también más resistentes a aditivos comunes para reacciones de PCR difíciles tales como Betaína, DMSO, así como más resistentes a las sales, por ejemplo, KCl, etc. La polimerasa mejorada presenta típicamente una actividad 2x, 5x, 10x o mayor, con relación a la polimerasa no mejorada, en presencia de tales agentes.
Las polimerasas mejoradas pueden ser también utilizadas en reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos. Estas reacciones son bien conocidas por las personas con experiencia habitual en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Las polimerasas mejoradas son particularmente ventajosas cuando se utilizan en reacciones de secuenciación, en particular en reacciones de secuenciación que utilizan polimerasas termoestables, tales como las reacciones de secuenciación por ciclos. La secuenciación por ciclos se refiere a una técnica de secuenciación de ADN mediante amplificación lineal, en la cual se utiliza un único cebador para generar fragmentos terminados en una marca mediante el método de terminación de la cadena en didesoxi de Sanger. En tales reacciones se emplean enzimas polimerasa termoestables.
Polimerasas termoestables tales como Taq o Pfu catalizan la incorporación de ddNTPs a una velocidad que es al menos dos órdenes de magnitud más lenta que la velocidad de incorporación de los dNTPs. Además, la eficacia de la incorporación de un ddNTP en un sitio particular es afectada por la secuencia local del ADN molde. Se ha desarrollado una versión modificada de polimerasas que carecen de actividad exonucleasa 5' a 3' y que catalizan la incorporación de ddNTPs con una alta eficacia. Sin embargo, su procesividad es a menudo mala. Por ejemplo, enzimas termoestables tales como los derivados ΔTaq, en los que se ha eliminado el dominio nucleasa 5'-3' de la polimerasa Taq, tienen una procesividad de 2 bases aproximadamente. Además, en el caso de la secuenciación por terminador colorante, se utiliza dITP en lugar de dGTP, lo que hace que la polimerasa se detenga y se disocie en los nucleótidos G. Estos enzimas producen por tanto un gran número de productos de secuencia que están terminados incorrectamente. Además, si una polimerasa se disocia durante la extensión del cebador de un molde que contiene una unidad repetida (por ejemplo, la repetición de un triplete) o una estructura secundaria (por ejemplo, un tronco y un bucle) de tal manera que la hebra no se complete durante un ciclo de PCR particular, el extremo 3' puede desnaturalizarse y rehibridarse durante un ciclo posterior de PCR para cebar en una posición diferente sobre el molde — por ejemplo, en el caso de una repetición, la rehibridación podría ocurrir en una repetición diferente; o en el caso de la estructura secundaria, una rehibridación incorrecta podría eliminar una sección del molde. Por tanto, la disociación de la polimerasa es también un problema.
La utilización de polimerasas mejoradas como las descritas en la presente puede proporcionar reacciones de secuenciación mejoradas, por ejemplo reacciones de secuenciación por ciclos, en las cuales hay menos terminaciones incorrectas y menos acontecimientos de disociación. Esto proporciona lecturas de secuencia más largas, esto es, el número de nucleótidos para los cuales puede ser determinada la secuencia, que contienen menos ambigüedades en comparación con la reacción llevada a cabo con enzimas no mejorados.
Las polimerasas son típicamente modificadas para sustituir un residuo F por un residuo Y (Patente de EE.UU. Nº 5.614.365).
Omitido deliberadamente
Los ejemplos siguientes se proporcionan a manera de ilustración únicamente y no a manera de limitación. Los expertos reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que pueden ser cambiados o modificados para producir resultados esencialmente similares.
Ejemplo 1. Construcción de proteínas de fusión.
Construcción de la fusión Sso7d-ΔTaq.
El ejemplo siguiente ilustra la construcción de una proteína polimerasa que posee una procesividad incrementada, en la cual la proteína de unión a ácido nucleico bicatenario no específica de ninguna secuencia Sso7d es fusionada a la ADN polimerasa PolI de Thermus aquaticus (una polimerasa de la familia A conocida como ADN polimerasa Taq) de la que se han eliminado en el extremo N 289 aminoácidos (ΔTaq).
Sobre la base de la secuencia de aminoácidos publicada de Sso7d, se utilizaron siete oligonucleótidos para construir un gen sintético que codificara Sso7d. Los oligonucleótidos fueron hibridados y ligados utilizando ADN ligasa de T4. El producto ligado final fue utilizado como molde en una reacción de PCR utilizando como cebadores dos oligonucleótidos terminales para amplificar el gen de longitud completa. Por el diseño, el fragmento de PCR resultante contiene un único sitio de EcoRI en el extremo 5', y un único sitio de BstXI en el extremo 3'. Además de codificar la proteína Sso7d, el fragmento de PCR anterior codifica también un adaptador peptídico con la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Val-Thr (SEC ID Nº:34) situado en el extremo C de la proteína Sso7d. El gen sintético de Sso7d tiene la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº:1, y codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº:2.
El gen sintético que codifica Sso7d fue utilizado posteriormente para generar una proteína de fusión en la cual Sso7d sustituye a los primeros 289 aminoácidos de Taq. El fragmento que codificaba Sso7d fue subclonado en un plásmido que codificaba polimerasa Taq para generar la proteína de fusión, según sigue. Brevemente, el fragmento de ADN que contenía el gen de Sso7d sintético fue digerido con las endonucleasas de restricción EcoRI y BstXI, y ligado en los sitios correspondientes de un plásmido que codificaba Taq. Como resultado, la región que codifica los 289 primeros aminoácidos de Taq es sustituida por el gen sintético de Sso7d. Este plásmido (pYW1) permite la expresión de un único polipéptido que contiene Sso7d fusionado al extremo N de ΔTaq a través de un adaptador sintético compuesto por Gly-Gly-Val-Thr (SEC ID Nº:34). La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión (Sso7d-ΔTaq) y la secuencia de aminoácidos de la proteína están mostradas en las SEC ID Nos:3 y 4, respectivamente.
Construcción de la fusión Sso7d-Taq.
Se construyó también una proteína de fusión Sso7d/Taq de longitud completa. Brevemente, un fragmento de PCR de 1 kb que codificaba los primeros 336 aminoácidos de la polimerasa Taq fue generado utilizando dos cebadores. El cebador 5' introduce un sitio de SpeI en el extremo 5' del fragmento de PCR, y el cebador 3' hibrida con los nucleótidos 1008-1026 del gen de Taq. El fragmento fue digerido con SpeI y BstXI, liberando un fragmento de 0,9 kb que codificaba los primeros 289 aminoácidos de la polimerasa Taq. El fragmento de 0,9 kb fue ligado en el plásmido pYW1 en los sitios de SpeI (situado en la región que codifica el adaptador) y BstXI. El plásmido resultante (pYW2) permite la expresión de un único polipéptido que contiene la proteína Sso7d fusionada al extremo N de la ADN polimerasa Taq de longitud completa a través de un adaptador compuesto por Gly-Gly-Val-Thr (SEC ID Nº:34), el mismo que en Sso7d-ΔTaq. La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión Sso7d-Taq y la secuencia de aminoácidos de la proteína están mostradas en las SEC ID Nos:5 y 6, respectivamente.
Construcción de la fusión Pfu-Sso7d.
Se creó una tercera proteína de fusión uniendo Sso7d al extremo C de la ADN polI de Pyrococcus furiosus (una ADN polimerasa de la familia B conocida como Pfu). Un plásmido basado en pEt portador del gen de la ADN polimerasa Pfu fue modificado de tal manera que se introdujeron un único sitio de KpnI y un único sitio de SpeI en el extremo 3' del gen de Pfu antes del codón de parada. El plásmido resultante (pPFKS), expresa una polimerasa Pfu con tres aminoácidos adicionales (Gly-Thr-His) en su extremo C.
Se utilizaron dos cebadores para amplificar mediante PCR el gen sintético de Sso7d descrito anteriormente para introducir un sitio de KpnI y un sitio de NheI flanqueando el gen de Sso7d. El cebador 5' introducía también seis aminoácidos adicionales (Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly; SEC ID Nº:35), que servían como adaptador, en el extremo N de la proteína Sso7d. Después de la digestión con KpnI y NheI, el fragmento de la PCR fue ligado a pPFKS en los sitios correspondientes. El plásmido resultante (pPFS) permite la expresión de un único polipéptido que contiene la proteína Sso7d fusionada al extremo C de la polimerasa Pfu a través de un adaptador peptídico (Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly; SEC ID Nº:35). La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión (Pfu-Sso7d) y la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión están mostradas en las SEC ID Nos:7 y 8, respectivamente.
Construcción de la fusión Sac7d-ΔTaq.
Se construyó una cuarta proteína de fusión que unía una proteína de unión a ADN no específica de ninguna secuencia procedente de una especie diferente a ΔTaq. Se utilizaron dos cebadores para amplificar mediante PCR el gen de Sac7d a partir de ADN genómico de Sulfolobus acidocaldarius. Los cebadores introducían un sitio único de EcoRI y un sitio único de SpeI en el fragmento de PCR en los extremos 5' y 3', respectivamente. Después de la digestión de restricción con EcoRI y SpeI, el fragmento de PCR fue ligado en pYW1 (descrito anteriormente) en los sitios correspondientes. El plásmido resultante expresa un único polipéptido que contiene la proteína Sac7d fusionada al extremo N de ΔTaq a través del mismo adaptador que el utilizado en Sso7d-ΔTaq. La secuencia de ADN de la proteína de fusión (Sac7d-ΔTaq) y la secuencia de aminoácidos de la proteína están mostradas en las SEC ID Nos:9 y 10, respectivamente.
Construcción de la fusión PL-ΔTaq.
Una quinta proteína de fusión une un péptido compuesto por 14 lisinas y 2 argininas al extremo N de ΔTaq. Para generar la proteína de fusión polilisina (PL)-ΔTaq, dos oligonucleótidos de 67 nt fueron hibridados para formar un fragmento de ADN bicatenario con un extremo 5' saliente compatible con un sitio de EcoRI y un extremo 3' saliente compatible con un sitio de SpeI. El fragmento de ADN codifica un péptido rico en lisina con la composición siguiente: NSKKKKKKKRKKRKKKGGGVT (SEC ID Nº:36). El número de lisinas y argininas de este péptido es idéntico al de Sso7d. Este fragmento de ADN fue ligado en pYW1, predigerido con EcoRI y SpeI, para sustituir la región que codificaba Sso7d. El plásmido resultante (pLST) expresa un único polipéptido que contiene el péptido rico en lisina fusionado al extremo N de ΔTaq. La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión (PL-ΔTaq) y la secuencia de aminoácidos de la proteína están mostradas en las SEC ID Nos:11 y 12, respectivamente.
Ejemplo 2. Determinación de la procesividad de las polimerasas de fusión.
Este ejemplo ilustra el incremento de la procesividad de las proteínas de fusión de la invención generadas en el Ejemplo
1.
Ensayo para la definición de una unidad de polimerasa.
Se utilizó el ensayo siguiente para definir una unidad de polimerasa. Un oligonucleótido fue prehibridado a ADN monocatenario de M13mp18 en presencia de un tampón de reacción sin Mg++ y dNTPs. La ADN polimerasa de interés fue añadida a la mezcla de ADN cebado. Se añadió MgCl2 para iniciar la síntesis de ADN a 72ºC. Se recogieron muestras a varios puntos de tiempo y se añadieron a tampón TE que contenía PicoGreen (Molecular Probes, Eugene, Oregon). Se cuantificó la cantidad de ADN sintetizada utilizando un lector de placas de fluorescencia. La actividad unidad de la ADN polimerasa de interés fue determinada comparando su tasa inicial con la de una ADN polimerasa control (por ejemplo, una polimerasa comercial de concentración unidad conocida).
Ensayo de la procesividad.
La procesividad fue medida determinando el número de nucleótidos incorporados durante un único acontecimiento de unión de la polimerasa a un molde cebado.
Brevemente, se hibridaron 40 nM de un cebador 5' marcado con FAM (34 nucleótidos de longitud) con 80 nM de ADN monocatenario de M13mp18 circular o linealizado para formar el molde cebado. El molde cebado fue mezclado con la ADN polimerasa de interés en una relación molar de 4000:1 (ADN cebado:ADN polimerasa) aproximadamente en presencia de tampón estándar para PCR (libre de Mg++) y 200 µM de cada dNTPs. Se añadió MgCl2 a una concentración final de 2 mM para iniciar la síntesis de ADN. A varios tiempos después del inicio, se amortiguaron muestras con un colorante de carga para secuenciación que contenía un 99% de formamida y se analizaron en un gel de secuenciación. La mediana de la longitud de los productos, que se define como la longitud de un producto por encima o por debajo de la cual hay cantidades iguales de productos, fue determinada sobre la base de la integración de todos los picos de producto detectables. A una concentración de polimerasa para la cual cambia la mediana de la longitud de los productos con el tiempo o con la concentración de polimerasa, la longitud corresponde a la procesividad del enzima. Los rangos presentados en la Tabla 1 representan el rango de valores obtenidos en varias repeticiones del ensayo.
Tabla 1. Comparación de la procesividad
- ADN polimerasa
- Mediana de la longitud de los productos (nt)
- ΔTaq
- 2-6
- Sso7d-ΔTaq
- 39-58
- PL-ΔTaq
- 2-6
- Taq
- 15-20
- Sso7d-Taq
- 130-160
- Pfu
- 2-3
- Pfu-Sso7d
- 35-39
Al comparar la procesividad del enzima modificado con la del enzima no modificado, la ΔTaq tenía una procesividad de
5 2-6 nucleótidos, mientras que la fusión Sso7d-ΔTaq presentaba una procesividad de 39-58 nucleótidos (Tabla 1). La Taq de longitud completa tenía una procesividad de 15-20 nucleótidos, que era significativamente menor que la de la fusión Sso7d-Taq con una procesividad de 130-160 nucleótidos. Estos resultados demuestran que la Sso7d unida a la polimerasa Taq incrementaba la procesividad de la polimerasa.
10 La Pfu pertenece a la familia B de polimerasas. A diferencia de la polimerasa Taq, Pfu posee una actividad exonucleasa 3' a 5' que le permite mantener una elevada fidelidad durante la síntesis de ADN. Una polimerasa Pfu modificada, en la cual Sso7d está fusionada al extremo C de la polimerasa Pfu de longitud completa, y una Pfu sin modificar fueron analizadas en el ensayo de procesividad anteriormente descrito. Según se muestra en la Tabla 1, la polimerasa Pfu presentaba una procesividad de 2-3 nt, mientras que la proteína de fusión Pfu-Sso7d tenía una procesividad de 35-39
15 nt. Por tanto, la fusión de Sso7d al extremo C de Pfu tuvo como resultado un incremento de >10 veces de la procesividad sobre el enzima sin modificar.
Ejemplo 3. Efecto de las proteínas de fusión sobre la temperatura de hibridación de los oligonucleótidos.
20 Este experimento demuestra la eficacia incrementada de la proteína de fusión Sso7d-ΔTaq, en comparación con Taq, para producir un producto a temperaturas de hibridación más elevadas mediante la estabilización del ADN bicatenario.
Se utilizaron dos cebadores, el cebador 1008 (19mero; TM=56,4ºC) y 2180R (20mero; TM=56,9ºC), para amplificar un fragmento de 1 kb (1008-2180) del gen de la polimerasa Taq. Se utilizó un ciclador térmico de gradiente (MJ Research, 25 Waltham, MA) para variar la temperatura de hibridación desde 50ºC hasta 72ºC en un programa de ciclos de PCR. Se cuantificaron y compararon las cantidades de los productos de PCR generados utilizando un número idéntico de unidades de Sso7d-ΔTaq y Taq. Los resultados están mostrados en la Tabla 2. la proteína de fusión Sso7d-ΔTaq presentaba una eficacia significativamente más elevada que la de la Taq de longitud completa a temperaturas de hibridación superiores. Por tanto, la presencia de Sso7d en cis incrementa la temperatura de fusión del cebador sobre el
30 molde.
El ensayo de temperaturas de hibridación anterior fue utilizado para investigar si PL-ΔTaq tenía algún efecto sobre la temperatura de hibridación del cebador durante la amplificación por PCR. Según se muestra en la Tabla 2, se observó poco o ningún producto amplificado cuando la temperatura de hibridación era de 63ºC o superior.
35 Tabla 2. Comparación de actividades a diferentes temperaturas de hibridación
- Polimerasa
- Actividad a 63ºC Actividad a 66ºC Actividad a 69ºC
- Taq
- 85% 30% <10%
- Sso7d-ΔTaq
- >95% 70% 40%
- PL-ΔTaq
- <5% nd nd
- nd: no detectable.
Ejemplo 4: Efecto de las proteínas de fusión sobre la longitud requerida para los cebadores.
40 Un incremento de la TM de los cebadores (según se mostró anteriormente) predice que Sso7d-ΔTaq, pero no Taq, podría utilizar cebadores más cortos para conseguir una amplificación eficaz mediante PCR. Este análisis muestra que Sso7d-ΔTaq es más eficaz en un ensayo que utiliza cebadores más cortos, en comparación con Taq.
45 Se utilizaron cebadores de diferente longitud para comparar las eficacias de la amplificación por PCR con Sso7d-ΔTaq y Taq. Los resultados están mostrados en la Tabla 3. Cuando se utilizaron dos cebadores largos, 57F (22mero; TM=58ºC) y 732R (24mero; TM=57ºC), no se observó diferencia significativa entre Sso7d-ΔTaq y Taq a temperaturas de hibridación bajas o altas. Cuando se utilizaron cebadores de longitud media, 57F15 (15mero; TM=35ºC) y 732R16 (16mero; TM=35ºC), Sso7d-ΔTaq fue más eficaz que Taq, especialmente cuando la temperatura de hibridación era
50 elevada.
La diferencia más sorprendente entre los dos enzimas fue observada con cebadores cortos, 57F12 (12mero) y 732R16 (16mero), con los que Sso7d-ΔTaq generó 10 veces más productos que Taq tanto a temperaturas de hibridación bajas como altas.
5 Se llevó a cabo una PCR utilizando los cebadores 57F12 (12 nt) y 732R16 (16 nt) para comparar la eficacia de Sac7dΔTaq con la de Taq de longitud completa no modificada en la reacción de PCR. De manera similar a Sso7d-ΔTaq, Sac7d-ΔTaq es significativamente más eficaz que Taq en la amplificación que utiliza cebadores cortos.
10 Se utilizó un ensayo de longitud de los cebadores con el fin de determinar la capacidad de PL-ΔTaq para utilizar cebadores cortos en la amplificación por PCR. Cuando se utilizaron cebadores largos (57F y 732R), el producto amplificado generado por PL-ΔTaq es ~50% del generado por Sso7d-ΔTaq. Cuando se utilizaron cebadores cortos (57F12 y 732R16), el producto amplificado generado por PL-ΔTaq es <20% del generado por Sso7d-ΔTaq.
15 Tabla 3. Comparación del efecto de la longitud de los cebadores sobre la amplificación mediante PCR por Sso7d-ΔTaq y por la ADN polimerasa Taq
- polimerasa
- Cebador de 22 nt Cebador de 15 nt Cebador de 12 nt
- Hibridación a 55ºC
- Hibridación a 63ºC Hibridación a 49ºC Hibridación a 54ºC Hibridación a 49ºC Hibridación a 54ºC
- Taq
- 14000 9000 5500 <500 1000 indetectable
- Sso7d-ΔTaq
- 17000 13000 15000 5000 10000 3000
- Sso7dΔTaq:Taq
- 1,2:1 1,4:1 2,7:1 >10:1 10:1 >10:1
Funcionamiento incrementado de las polimerasas de fusión en reacciones de PCR.
20 La estabilidad y/o la procesividad incrementada de las proteínas de fusión de la invención proporcionan una eficacia incrementada al funcionamiento de diferentes reacciones de modificación. Por ejemplo, las proteínas de fusión de polimerasas pueden proporcionar una amplificación más eficaz en reacciones de PCR. Muchos factores influyen sobre el resultado de una reacción de PCR, incluyendo la especificidad de los cebadores, la eficacia de la polimerasa, la
25 calidad, la cantidad y el contenido en GC del molde, la longitud del amplicón, etc. Los Ejemplos 5-8 demuestran que proteínas de fusión que incluyen un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario no específico de ninguna secuencia, por ejemplo Sso7d, unido a una polimerasa o a un dominio polimerasa termoestable tienen varias características ventajosas sobre el enzima no modificado en aplicaciones de PCR.
30 Ejemplo 5. Las proteínas de fusión con Sso7d presentan una mayor y más amplia tolerancia a la sal en PCR.
La unión de la polimerasa a un molde cebado es sensible a la fuerza iónica del tampón de reacción debido a interacciones electrostáticas, la cual es más potente a una baja concentración de sal y más débil a una elevada concentración de sal. La presencia de Sso7d en una proteína polimerasa de fusión estabiliza la interacción de unión de
35 la polimerasa al molde de ADN. Este ejemplo demuestra que proteínas de fusión con Sso7d presentan un funcionamiento mejorado en reacciones de PCR que contienen concentraciones elevadas de KCl.
Se utilizó ADN de lambda (2 pM) como molde en reacciones de PCR con los cebadores 57F y 732R. La concentración de KCl variaba desde 10 mM a 150 M, mientras que todos los demás componentes del tampón de reacción no 40 cambiaron. La reacción de PCR se llevó a cabo utilizando un programa de ciclos de 94ºC durante 3 minutos, 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, seguido por 72ºC durante 10 minutos. Después de la finalización de la reacción, se recogieron 5 µl de la reacción de PCR y se mezclaron con 195 µl de una dilución 1:400 de PicoGreen en TE con el fin de cuantificar las cantidades de amplicón generadas. Los productos de la reacción de PCR fueron también analizados en paralelo en un gel de agarosa para verificar que se generaban los 45 amplicones de la longitud esperada (datos no mostrados). Los efectos de la concentración de KCl sobre la eficacia en la PCR de Sso7d-ΔTaq frente a la de ΔTaq, y de Pfu-Sso7d frente a la de Pfu están mostrados en la Tabla 4. Los enzimas sin modificar, ΔTaq y Pfu, mostraron preferencia por concentraciones de KCl inferiores a 25 mM y 40 mM, respectivamente, para mantener un 80% de la actividad máxima. En contraste, las proteínas de fusión Sso7d-ΔTaq y Pfu-Sso7d mantienen un 80% de la actividad máxima en concentraciones de KCl de 30-100 mM y 60-100 mM, respec
50 tivamente. Por tanto, las proteínas de fusión de Sso7d eran más tolerantes a concentraciones elevadas de KCl en comparación con sus equivalentes no modificadas. Esta característica de la polimerasa híbrida permitirá potencialmente una amplificación por PCR a partir de un molde de ADN de baja calidad, por ejemplo de muestras de ADN preparadas a partir de, pero sin limitarse a, sangre, alimentos y fuentes vegetales.
55
Tabla 4. La modificación con Sso7d aumenta la tolerancia a la sal de la polimerasa en reacciones de PCR
- Enzima
- Concentración del enzima [KCl] para una actividad del 80%
- ΔTaq
- 20 U/ml <25 mM
- Sso7d-ΔTaq
- 20 U/ml 30-100 mM
- Pfu
- 3 U/ml <40 mM
- Pfu-Sso7d
- 12 U/ml* (igual molaridad) 60-100 mM
- *Pfu-Sso7d tiene una actividad específica 4 veces mayor que Pfu. La actividad específica se define como unidades/mol de enzima.
Ejemplo 6. Las polimerasas de fusión con Sso7d son más tolerantes al SYBR Green I en PCR a tiempo real.
5 Se compararon tres pares de enzimas modificados y sin modificar: ΔTaq comercial (ABI, Foster City, CA) frente a Sso7d-ΔTaq, Taq frente a Sso7d-Taq y Pfu comercial (Stratagene, La Jolla, CA) frente a Pfu-Sso7d. Además de la concentración de 20 U/ml utilizada para todos los enzimas, se utilizó también una concentración 5 veces mayor (100 U/ml) de ΔTaq y Pfu. Los valores de Ct representan el número de ciclos requeridos para generar una cantidad
10 detectable de ADN, y por tanto un valor más bajo de Ct refleja una mayor eficacia de amplificación para el enzima. Son también preferibles valores consistentes de Ct, que indican que la reacción es robusta respecto a diferencias en la concentración de colorante. Se utilizaron dos tiempos de extensión (10 s y 30 s). La concentración de SYBR Green I está indicada como 0,5x, etc. Se define SYBR Green I 1x como una solución de SYBR Green I en TE (Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) que tiene una absorbancia a 495 nm de 0,40±0,02. El SYBR Green I fue adquirido a Molecular Probes
15 (Eugene, Oregon) como una solución madre 10.000x en DMSO. En los tres pares, la polimerasa modificada mostró una tolerancia de colorante significativamente mayor. Las diferencias son más sorprendentes en el caso de ΔTaq frente a Sso7d-ΔTaq.
Tabla 5. Las proteínas de fusión de Sso7d son más tolerantes a SYBR Green I. (El símbolo "--" indica que no se 20 observó amplificación en 40 ciclos)
- 10 segundos a 72ºC
- MgCl2
- 2 mM 3 mM
- SYBR Green I
- SYBR Green I
- ENZIMAS
- Unidades/ml 0,5x 1x 1,5x 2x 2,5x 0,5x 1x 1,5x 2x 2,5x
- ΔTaq
- 20 - - - - - - - - - -
- ΔTaq
- 100 - - - - - - - - - -
- Sso7d-ΔTaq
- 20 23,3 22,5 22,5 22,3 22,4 22,9 22,2 22 22,2 21,8
- Taq
- 20 23 23,6 - - - 22,5 22,3 22,6 - -
- Sso7d-Taq
- 20 23,3 23,3 23,2 23,5 - 24 24 23,1 23,4 23,6
- Pfu
- 20 31,2 - - - - 31,5 - - - --
- Pfu
- 100 21,8 25 - - - 22,6 23,3 30 - -
- Pfu-Sso7d
- 20 21,5 22,3 35 - - 21,8 22 22,6 27,2 -
- 30 segundos a 72ºC
- ΔTaq
- 20 - - - - - - - - - -
- ΔTaq
- 100 - - - - - 26,8 - - - -
- Sso7d-ΔTaq
- 20 23,8 22,3 22,6 21,8 21,7 22,3 21 21,3 21,8 21,8
- Taq
- 20 24,2 24,6 29,4 ∞ - 22,8 22,1 22,6 25 -
- Sso7d-Taq
- 20 24,2 23,5 23 22,7 24,2 24,7 23,1 23,6 23,1 22,9
- Pfu
- 20 33,2 - - - - 29,4 - - - --
- Pfu
- 100 27,6 30,6 - - - 24,8 29,8 - - -
- Pfu-Sso7d
- 20 25 24,8 25,4 24,4 - 23,1 25,3 23,6 26,1 -
Ejemplo 7. Las polimerasas de fusión con Sso7d son más tolerantes a preparaciones de molde brutas.
25 A. Resistencia a la contaminación bacteriana en PCR
La PCR de colonias es una técnica útil en la cual muestras pequeñas de colonias bacterianas individuales son lisadas y añadidas directamente a reacciones de PCR con el fin de someter a selección las colonias por secuencias particulares de ADN. La PCR de colonias tiene una elevada tasa de fallos, debido presumiblemente a los contaminantes
30 transportados desde la colonia. Son deseables polimerasas resistentes a los extractos celulares debido a que presumiblemente tendrán más éxito en la PCR de colonias.
Materiales Para Una PCR "Sucia"
35 Molde de lambda (10 ng/ml): el amplicón es un fragmento de 891 pb Cebadores 56F/55R (TM 56º y 55º), 400 nM
Enzimas: Sst (Sso7d-ΔTaq) frente a PE Stf (ΔTaq), Stq (Sso7d-Taq) frente a Taq-HIS o AmpliTaq o Taq de Amersham y Pfu de Stratagene frente a PfS (Pfu-Sso7d). Todos los enzimas están a 20 U/ml excepto donde se indique
200 µM de cada dNTP
MgCl2 2 mM, excepto 1,5 mM para la Taq de Amersham y para AmpliTaq
Las reacciones eran de 20 µl
Métodos
Se cultivó E. coli hasta saturación, se sedimentó mediante centrifugación, se suspendió en agua hasta una DO de 100 y se congeló y descongeló para romper las células. Diluciones de las bacterias rotas fueron añadidas a varias concentraciones a reacciones de PCR que contenían como molde ADN de lambda y dos cebadores para amplificar un amplicón de 890 pb. 1x Equivale a una DO de 10 (10 unidades de DO/ml). Las condiciones de los ciclos fueron según sigue:
1) 95ºC -20"
2) 94ºC -5"
3) 60ºC -15"
4) 72ºC -45"
5) repetir las etapas 2-4 19 veces
6) 72ºC -5'
7) 4ºC constantemente
8) FIN
El experimentó mostró que Sso7d-ΔTaq funcionaba significativamente mejor que el fragmento de Stoffel (Applied Biosystems, Foster City, CA). Stoffel (Stf) es una marca registrada de una preparación de ΔTaq. Utilizando 20 U/ml del enzima en la reacción final, Sso7d-ΔTaq permitía una amplificación mediante PCR en presencia de una dilución celular de 0,25x. Cuando se utilizó la misma concentración de unidades de Stoffel, no se generó ningún producto detectable, incluso en la solución celular más diluida. Cuando se utilizaron 220 U/ml de Stoffel, se generó una cantidad detectable de producto a 0,06x o a una concentración menor de la dilución celular. Por tanto, la resistencia de Sso7d-ΔTaq a la contaminación bacteriana en la reacción de PCR es más de 10 veces mayor que la del enzima Stoffel sin modificar.
De manera similar, Pfu-Sso7d mostró más resistencia a la contaminación bacteriana que Pfu, aunque ambos enzimas parecían ser más sensibles a la contaminación que los enzimas basados en Taq. Con 20 U/ml de enzima en la reacción final, Pfu permitía la amplificación únicamente en presencia de concentraciones de la dilución celular de 0,00006x o menores. En contraste, Pfu-Sso7d permitía una amplificación por PCR eficaz en una dilución celular de 0,002x. Por tanto, Pfu-Sso7d tiene una tolerancia a la contaminación bacteriana en PCR 30 veces mayor que el enzima Pfu sin modificar.
B. Resistencia a la contaminación vegetal y sanguínea en PCR
Existen los mismos problemas con otras preparaciones brutas de molde. La PCR falla debido a los contaminantes transportados a la preparación del molde. Este ejemplo muestra resultados con preparaciones brutas de plantas y de sangre. Se llevaron a cabo diluciones seriadas de homogenado de hojas de la planta Fritallaria agrestis, una especie de lirio, y de sangre humana completa. Las diluciones se realizaron con TE 1x, pH 8,0, a 1/10, 1/100, 1/1000. Un microlitro de cada dilución fue añadido a la mezcla de reacción apropiada. El protocolo de ciclos de la PCR fue según sigue:
94ºC -2 minutos
94ºC -10 segundos
59ºC -20 segundos para Taq y Sso7d-Taq (54ºC para Pfu y Pfu-Sso7d)
72ºC -30 segundos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
repetir el ciclo 34 veces
72ºC -10 minutos
Los productos de reacción fueron analizados en geles de agarosa (Figura 1A y Figura 1B). La Figura 1A muestra una comparación de la resistencia a la contaminación de Pfu frente a PfS. Las Calles 1-4 y 14-17 muestran diluciones progresivas de 10 veces del homogenado de hojas de la planta. Pfu muestra inhibición significativa a una dilución de
1:10 (Calle 2), mientras que PfS es completamente resistente a esta dilución (Calle 7). De manera similar, las Calles 6-9 y 19-22 muestran diluciones progresivas de 10 veces de sangre. Pfu es inhibida significativamente por 1 microlitro de sangre, mientras que PfS es resistente. Las Calles 10 y 23 son controles positivos (sin planta ni sangre), mientras que las Calles 11 y 24 son controles negativos (sin planta ni sangre ni molde).
La Figura 1B muestra una comparación entre Taq y Sso7d-Taq. El panel superior muestras reacciones llevadas a cabo con 20 U/ml de Taq, y el panel inferior muestra reacciones llevadas a cabo con 20 U/ml de Sso7d-Taq. Las Calles 1-4 de cada panel muestran diluciones progresivas de 10 veces del homogenado de hojas de la planta y las Calles 7-10 muestran diluciones progresivas de 10 veces de sangre. Sso7d-Taq puede amplificar un producto incluso en presencia de 1 µl de sangre completa, mientras que Taq es inhibida por 100 veces menos de sangre. Las Calles 5 son controles positivos (sin planta ni sangre), mientras que las Calles 11 son controles negativos (sin planta ni sangre ni molde).
Ejemplo 8. Las polimerasas de fusión con Sso7d tienen ventajas en la secuenciación por ciclos.
Se han construido clones plasmídicos que codifican polimerasas mejoradas adecuadas para la secuenciación de ADN, y se han purificado los productos proteicos. El primer enzima es Sso7d-ΔTaq(Y), (SEC ID Nos:30 y 31 con las mutaciones indicadas en negrita) que es el mismo que el enzima Sso7d-ΔTaq, excepto en que está modificado según el método de Tabor y Richardson (Patente de EE.UU. Nº 5.614.365) para que tenga un residuo "F" sustituido por "Y" en la posición indicada de la SEC ID Nº:31. El segundo enzima es Sso7d-ΔTaq(E5;Y) (SEC ID Nos:32 y 33 con las mutaciones indicadas en negrita) que es el mismo que Sso7d-Taq, excepto en que está modificado según el método de Tabor y Richardson y contiene también mutaciones puntuales que inactivan el dominio nucleasa 5'-3'.
La procesividad de cada una de las polimerasas de fusión con Sso7d fue comparada con la de su equivalente no modificado, esto es, con la de la polimerasa sin el dominio Sso7d. Los resultados de la Tabla 6 muestran que las polimerasas de fusión con Sso7d son más procesivas.
Tabla 6.
Mediana de la Procesividad: Mediana de la longitud de los productos a KCl 10 mM
ΔTaq(Y) 3 a 4 nucleótidos
Sso7d-ΔTaq(Y) 11 a 13 nucleótidos
ΔTaq(E5)(Y) 5 a 6 nucleótidos
Sso7d-ΔTaq(E5)(Y) 34 a 47 nucleótidos
Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación utilizando las polimerasas de fusión y sus equivalentes sin modificar, separando los componentes de un kit comercial de secuenciación (BigDye Terminator Kit v.3, ABI, Foster City, CA). Los componentes de bajo peso molecular fueron separados de los enzimas mediante ultrafiltración. Las reacciones de secuenciación llevadas a cabo combinando la fracción de bajo peso molecular con los enzimas mejorados mostraron buenas curvas de potencia de la señal frente al número de bases. Además, las polimerasas mejoradas, por ejemplo Sso7d-ΔTaq(E5;Y), eran capaces de continuar a través de una parada firme mejor que los demás enzimas. Tal polimerasa mejorada es también capaz de continuar a través de repeticiones de dinucleótidos, trinucleótidos y de repeticiones largas de bases individuales, más eficazmente que la polimerasa correspondiente.
La optimización de las reacciones de secuenciación demostrará mejoras en la uniformidad de la altura de los picos, de la resistencia a la contaminación, y hará que se requiera una menor concentración de molde y/o enzima.
Tabla de Secuencias
GCAACCGTAAAGTTCAAGTACAAAGGCGAAGAAAAAGAGGTAGACATCTCCAAGATCAAGAAAGTATGGCGTGTG GGCAAGATGATCTCCTTCACCTACGACGAGGGCGGTGGCAAGACCGGCCGTGGTGCGGTAAGCGAAAAGGACGC GCCGAAGGAGCTGCTGCAGATGCTGGAGAAGCAGAAAAAG
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5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'
5'-GCACAGCGGCTGGCTGAGGA-3'
SEC ID Nº:15 CEBADOR L18015F
5'-TGACGGAGGATAACGCCAGCAG-3'
SEC ID Nº:16 CEBADOR L23474R
5'-GAAAGACGA TGGGTCGCTAATACGC-3'
SEC ID Nº:17 CEBADOR L1801F
5'-TGACGGAGGATAAC GCCAGCAG-3'
SEC ID Nº:18 CEBADOR L29930R
5'-GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC-3'
SEC ID Nº:19 CEBADOR L30350F
5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'
SEC ID Nº:20 CEBADOR L35121R
5'-CACATGGTACAGCAAGCCTGGC-3'
SEC ID Nº:21 CEBADOR L2089F
5'-CCCGTATCTGCTGGGA TACTGGC-3'
SEC ID Nº:22 CEBADOR L7112R
5'-CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG-3'
SEC ID Nº:23 CEBADOR L30350F
5'-CCTGCCTGCCGCTTCACGC-3'
SEC ID Nº:24 CEBADOR L40547R
5'-CCAATACCCGTTTCA TCGCGGC-3'
5'-CCACCTCATCCTGG GCACC-3'
5'-GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC-3'
5'-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3'
5'-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3'
5'-GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG-3'
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Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Un método para incrementar el rendimiento de una reacción de polimerasa sobre un ácido nucleico diana presente en una solución que contiene un inhibidor de la polimerasa, comprendiendo el método:
- (a)
- la puesta en contacto del ácido nucleico diana con una polimerasa, donde la polimerasa está unida covalentemente a un dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia que: (i) se une a ácido nucleico bicatenario, (ii) incrementa la procesividad de la polimerasa en comparación con una polimerasa idéntica que no tenga fusionado a la misma el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia y (iii) contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d y donde la solución tiene una composición que permite al dominio de unión unirse al ácido nucleico diana y al dominio polimerasa extender un cebador que esté hibridado a la secuencia de ácido nucleico diana;
- (b)
- la incubación de la solución en condiciones bajo las cuales el cebador sea extendido por la polimerasa, en el que el inhibidor de polimerasa es un colorante fluorescente.
-
- 2.
- Un método de la reivindicación 1, en el que el colorante es SYRR Green I.
-
- 3.
- Un método para secuenciar un ácido nucleico en una solución acuosa utilizando una polimerasa mejorada, comprendiendo el método:
- (a)
- la puesta en contacto del ácido nucleico diana con una polimerasa, donde la polimerasa está unida covalentemente a un dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia que: (i) se une a ácido nucleico bicatenario, (ii) incrementa la procesividad de la polimerasa en comparación con una polimerasa idéntica que no tenga fusionado a la misma el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia, y (iii) contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d y donde la solución tiene una composición que permite al dominio de unión unirse al ácido nucleico diana y al dominio polimerasa extender un cebador que esté hibridado a la secuencia de ácido nucleico diana;
- (b)
- la incubación de la solución en condiciones bajo las cuales el cebador sea extendido por la polimerasa.
-
- 4.
- Un método para llevar a cabo una reacción de polimerasa cuantitativa en un ácido nucleico diana presente en una solución que contiene un colorante fluorescente que se une al ADN, comprendiendo el método:
- (a)
- la puesta en contacto del ácido nucleico diana con una polimerasa, donde la polimerasa está unida covalentemente a un dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia que: (i) se une a ácido nucleico bicatenario, (ii) aumenta la procesividad de la polimerasa en comparación con una polimerasa idéntica que no tenga fusionado a la misma el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia, y (iii) contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d y donde la solución tiene una composición que permite al dominio de unión unirse al ácido nucleico diana y al dominio polimerasa extender un cebador que esté hibridado a la secuencia de ácido nucleico diana;
- (b)
- la incubación de la solución en condiciones bajo las cuales el cebador sea extendido por la polimerasa, y
- (c)
- la exposición de la solución a una luz de excitación adecuada y la medida de la emisión de fluorescencia procedente del colorante fluorescente.
-
- 5.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio polimerasa tiene actividad polimerasa térmicamente estable.
-
- 6.
- El método de la reivindicación 5, en el que el dominio polimerasa térmicamente estable es un dominio de la polimerasa ΔTaq.
-
- 7.
- El método de la reivindicación 5, en el que el dominio polimerasa comprende un dominio de la polimerasa de Pyrococcus.
-
- 8.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sso7d.
-
- 9.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia es una proteína de unión a ADN básica, pequeña, de Arqueobacterias.
-
- 10.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia es Sso7d.
-
- 11.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dominio de unión a ácido nucleico no específico de ninguna secuencia es Sac7d.
-
- 12.
- El método de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico diana es una muestra bruta.
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