ES2311464T3 - Terapia con variante de lipoproteina lipasa (lpl). - Google Patents

Abstract

Uso de una LPL S447X terapéutica para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición sensible a LPL en un sujeto, donde la LPL S447X terapéutica es seleccionada del grupo que consiste en: a) una proteína LPL S447X que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada, y donde la proteína LPL S447X carece de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 447 y 448 de SEC ID NO:3 cuando están óptimamente alineados; b) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína LPL S447X tal y como se define en a); y, c) un ácido nucleico de LPL S447X que codifica la proteína de LPL S447X tal y como se define en a); y, donde la condición sensible a LPL es seleccionada del grupo que consiste en: deficiencia de LPL completa, quilomicronemia, hiperlipidemia, deficiencia de LPL parcial, pancreatitis, hipertrigliceridemia, hipoalfalipoproteinemia (colesterol HDL bajo), enfermedad cardiovascular, cardiopatía coronaria, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina de pecho, hipertensión, enfermedad cerebrovascular, restenosis coronaria, enfermedad periférica vascular, diabetes, caquexia y obesidad.

Description

Terapia con variante de lipoproteína lipasa (LPL).

Campo de la invención

La invención pertenece al campo de las proteínas y ácidos nucleicos terapéuticos basada en variantes de lipoproteína lipasa (LPL), incluyendo la terapéutica provista por la terapia genética.

Antecedentes de la invención

La lipoproteína lipasa (EC 3.1.1.34) es una enzima importante en el metabolismo de las lipoproteínas ricas en triglicéridos. Es sintetizada en las células parenquimales del tejido adiposo y del músculo esquelético y cardíaco, donde es transferida a sitios de enlace en el lado vascular de células endoteliales en el endotelio vascular. El conocimiento actual es que la LPL juega un papel importante en la regulación del metabolismo lipoproteínico y lipídico, como sigue. Se considera que el homodímero glicosilado enlazado de manera no covalente es transportado al endotelio vascular, donde se enlaza a los proteoglicanos de sulfato de heparano en la superficie luminal. Se entiende que el catabolismo posterior de triglicéridos de los quilomicrones (CM) y de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) permite la absorción y la utilización de los ácidos grasos libres y glicerol para energía y almacenamiento en el músculo y el tejido adiposo respectivamente: quilomicrón y restos de VLDL pueden bien ser usados en la formación de partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL) o lipoproteína de baja densidad (LDL) respectivamente, o absorbidos por el hígado y reenvueltos en nuevas partículas de VLDL. LPL tiene un requisito obligatorio para su activador apolipoproteina (apo) CII, una pequeña proteína de 79 aminoácidos que está presente en partículas de CM y VLDL. Inhibidores de LPL incluyen ácidos grasos libres, apo CIII, y posiblemente apo E. Otro inhibidor es concentraciones altas de sal (1M de NaCl).

Aunque el origen celular de LPL en la circulación no está claro, y puede representar una acumulación de diferentes fuentes tisulares, se considera que su sitio de acción primario está ocupado en la superficie luminal del endotelio vascular. Debido a su interacción no covalente con proteoglicanos de sulfato de heparano, las LPL pueden ser desplazadas en el plasma por una inyección en el bolo intravenoso de heparina. Así, la actividad LPL y los niveles proteínicos pueden ser simplemente evaluados tomando una pequeña muestra de plasma postheparina (PHP). Partes alícuotas de esta PHP pueden después ser usadas sea en un ensayo de triglicérido (TG) radiomarcado sintético para la actividad lipolítica o ser medido por anticuerpos específicos de la LPL para los niveles proteínicos. Las medidas lipídicas pueden ser realizadas en muestras de preheparina puesto que la liberación de LPL puede provocar una rápida lipólisis del triglicérido en la muestra.

Una deficiencia de LPL completa ocurre en aproximadamente 1 en 10^{6} personas, y la frecuencia es mucho más alta en la población canadiense francesa donde puede ocurrir en hasta 1 en 5000 individuos. Las manifestaciones clínicas de una deficiencia de LPL completa en seres humanos proviene de la infancia con un fallo para proliferar, dolor abdominal tipo cólico, hepatosplenomegalia, quilomicronemia caracterizada por plasma lactescente, xantoma eruptivo, lipemia retinalis y pancreatitis que amenaza la vida. Los fármacos que disminuyen los lípidos son inefectivos y las restricciones dietéticas incluso rígidas son frecuentemente mal toleradas. El desarrollo de terapias para la deficiencia de LPL representaría un avance más importante para personas que sufren de este trastorno. Por ejemplo, WO 95 27512 A expone la terapia genética para el tratamiento de enfermedad cardiovascular usando la sobreexpresión de LPL tipo salvaje.

Recientemente, pacientes con mutaciones en el gen de LPL que resultan en defectos parciales en la función catalítica de LPL han sido identificados y, de hecho, son muy comunes en la población general. Colectivamente, las mutaciones conocidas que dan como resultado defectos catalíticos parciales en LPL se estima ahora que ocurren con una frecuencia de entre 5-7% en la población general. La presentación clínica, puede ser inactiva, evidente sólo por los niveles de triglicéridos marginales elevados en el estado no estresado, con hipertrigliceridemia profunda desencadenada por factores tales como embarazo normal, obesidad o diabetes. Estudios metabólicos posprandiales han sido realizados en individuos heterocigotos para mutaciones en el gen de la LPL, demostrando un desenmascarado del defecto lipolítico después de un desafío de grasa, dando como resultado la lipemia posprandial prolongada y trastornos significantes en los niveles lipoproteínicos y la composición. Hay también evidencia de que las mutaciones específicas que alteran, pero no abolen, la actividad LPL, tales como Asn291 Ser, Asp9Asn, existen comúnmente en la población general (Reymer et Al,. Nat.Genet. 1995, 10:28-33; Gagné et Al,. Arterioscl. Thromb. 1994: 14(8):1250-1257). Su importancia no está todavía completamente entendida aunque están implicadas en la susceptibilidad a la ateriosclerosis. Una mutación que introduce un codón de terminación en la posición 447 en lugar de un codón de serina (Ser447Ter o S447X) ha sido asociada a niveles de TG disminuidos y de colesterol HDL aumentados (Hokanson, 1997, International Journal of Clinical and Laboratory Research 27, 24-34; Gagné et al, Arterioscl. Thromb. 1994, 14(8):1250-1257: Mattu et al., 1994, Arteriosclerosis and Thrombosis 14, 1090-1097; Kuivenhoven et al., 1997, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17, 595-599; Groenemeijer et al., 1997, Circulation 95, 2628-2635; Fisher et al., 1997, Atherosclerosis 135, 145-159; U.S. Patent No. 5,658,729; Groenemeijer et al., Circulation 1997, 95:2628-2635; Gagne et al., Clin. Genet. 1999: 55(6):450-454). Correspondientemente, en la mayoría de estudios esta mutación parece conferir protección contra CAD. El(los) mecanismo(s) detrás de estos efectos no es(son) conocido(s). Henderson et al, Journal of Lipid Research, vol. 40, 1999, págs 735-43, expone que el mutante de LPL S447X presenta actividad LPL mejorada. Fisher et al, Atherosclerosis, vol. 135, 1997, págs 145-59, indica que la mutación de S447X en LPL está asociada con un perfil lipídico beneficioso con concentración de TG inferior y protección contra CAD, y muestra estudios in vitro que sugieren que el aumento en la actividad LPL postheparina se debe a una producción más alta de LPL-S447X.

Resumen de la invención

Un aspecto de la invención implica el reconocimiento de las importantes ventajas que pueden ser obtenidas a través de tratamientos terapéuticos que comprenden la administración de un tratamiento terapéutico derivado de la proteína LPL S447X y secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína LPL S447X. Tales LPL S447X terapéuticas pueden incluir péptidos de LPL S447X, secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los mismos, células que expresan tales péptidos o ácidos nucleicos, y derivados de tales péptidos, donde la LPL S447X terapéutica mejora o trata la enfermedad cuando se administra en dosificaciones profilácticamente o terapéuticamente eficaces. La LPL S447X terapéutica de la invención incluye modificaciones, derivados y análogos de péptidos de LPL S447X, y ácidos nucleicos que codifican tales péptidos. En algunas formas de realización, la LPL S447X terapéutica de la invención puede ser un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 1-446 de un péptido de LPL tipo salvaje de origen natural, como se establece en la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1). Una variedad de péptidos de LPL de origen natural son conocidos (Murthy V., Julien P., y Gagné C. 1996. Molecular pathobiology of the human lipoprotein lipase gene. Pharmacol. Ther. 70[2], 101-135). Péptidos de LPL de origen natural alternativos pueden ser identificados mediante la selección de genomas individuales, incluyendo genomas no humanos, para secuencias homólogas a los genes de la LPL conocidos.

En aspectos alternativos, la invención proporciona el uso de una LPL S447X terapéutica, tal como una proteína LPL S447X o ácido nucleico, para modular la actividad LPL o la masa de LPL, para reducir los triglicéridos en el plasma y/o aumentar el colesterol HDL, alterar niveles de lípidos en el plasma, o para tratar una condición sensible a la LPL en un paciente. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas para este tipo de usos. Ejemplos de condiciones sensibles a la LPL que pueden ser susceptibles al tratamiento en formas de realización alternativas incluyen: una deficiencia de LPL completa (incluso crónica (p. ej. para toda la vida, quilomicronemia, hipoalfalipoproteinemia) y aguda (p. ej. pancreatitis, hiperlipidemia severa) sea genética o adquirida); deficiencia de LPL parcial (incluso crónica y aguda (p. ej. pancreatitis, hiperlipidemia, en embarazo, diabetes, alcoholismo); hiperlipidemia que no es debida a la deficiencia de LPL (p. ej. FH, FCH, lipoproteinemia tipo II); hipertrigliceridemia (con una variedad de causas); hipoalfalipoproteinemia (HDL bajo), niveles de colesterol HDL bajos; enfermedad cardiovascular; cardiopatía coronaria; arteriopatía coronaria; aterosclerosis; angina de pecho; hipertensión (presión elevada de la sangre); enfermedad cerebrovascular; restenosis coronaria; enfermedad vascular periférica; diabetes (hipertrigliceridemia y otros síntomas relacionados en la diabetes y en estados insulino-resistentes); caquexia (por ejemplo en cáncer o cuando hay un perfil de expresión de LPL alterado); y obesidad.

En un aspecto la invención se refiere al uso de una LPL S447X terapéutica seleccionada del grupo que consiste en:

a) una proteína LPL S447X donde la secuencia de aminoácidos de la proteína LPL S447X comprende un segmento contiguo que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada, y donde la proteína LPL S447X carece de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 447 y 448 de la SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada; y,

b) un ácido nucleico de LPL S447X que codifica la proteína LPL S447X.

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En algunas formas de realización, la proteína LPL S447X puede tener una actividad LPL u otra propiedad terapéutica igual o mayor que una LPL tipo salvaje, tal como la LPL de la SEC ID NO:3.

En un aspecto preferido la invención se refiere al uso de una LPL S447X terapéutica, donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que codifica un ARN que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

En otro aspecto preferido la invención se refiere al uso de una LPL S447X terapéutica donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que se hibrida bajo condiciones astringentes a los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

En un aspecto, la invención se refiere al uso en terapia genética de un ácido nucleico de LPL S447X que codifica la proteína LPL S447X. El ácido nucleico de LPL S447X puede ser entregado por un vector de la terapia genética terapéuticamente aceptable para tratar condiciones sensibles a la LPL, tales como las condiciones establecidas arriba. El vector de la terapia genética puede por ejemplo ser un vector adenoasociado (AAV). Tal vector puede comprender por ejemplo: una repetición terminal invertida (ITR) en 5'; un promotor, tal como un promotor intensificador de CMV con un intensificador específico muscular; un intrón; una región no traducida 3' (3'-UTR); una señal de poliadenilación, tal como una señal de poliadenilación de SV40; y una 3'-ITR.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es un listado de la secuencia de aminoácidos de LPL S447X, que muestra los aminoácidos designados 1 a 446 en la presente (SEC ID NO:1). La figura reproduce la información disponible del número de acceso de GenBank NP 000228 para un precursor de la lipoproteína lipasa de homosapiens, versión NP 000228.1. Gl:4557727, (Wion, et Al., Science 235 (4796), 1638-1641 (1987); Sparkes et Al., Genomics 1 (2), 138-144 (1987); Mattei et Al., Cytogenet. Cell Genet. 63 (1), 45-46 (1993); Zechner, Curr. Opin. Lipidol. 8 (2), 77-88 (1997); Fisher et al., Atherosclerosis 135 (2), 145-159 (1997); y Beisiegel, Eur. Corazón J. 19. A20-A23 (1998); Groenemeijer et Al., Circulation 1997, 95:2628-2635; Gagne et al., Clin. Genet. 1999: 55(6):450-454).

Figura 2 es un listado de la secuencia de aminoácidos de un péptido de LPL tipo salvaje maduro, que muestra los aminoácidos designados 1 a 448 en la presente (SEC ID NO:3). La figura reproduce la información disponible del número de acceso de GenBank NP 000228.

Figura 3 es un listado de la secuencia de aminoácidos de un péptido pre-LPL, que muestra una proteína que tiene un péptido señal en los aminoácidos 1 a 27, antes de la secuencia del péptido de LPL maduro (SEC ID NO:2). La figura reproduce la información disponible del número de acceso de GenBank NP 000228.

Figura 4 es un listado de la secuencia de un ARNm de LPL, donde un péptido señal es codificado por los nucleótidos 175 a 255, y el péptido maduro es codificado por los nucleótidos 256 a 1599 (SEC ID NO:4). La figura reproduce la información disponible del número de acceso de GenBank NM 000237 para un ARNm lipoproteína lipasa (LPL) de Homo sapiens, versión NM 000237.1. Gl:4557726, (Wion, et, Al., Science 235 (4796), 1638-1641 (1987); Sparkes et Al., Genomics 1 (2),138-144 (1987); Mattei et Al., Cytogenet. Cell Genet. 63 (1), 45-46 (1993); Zechner, Curr. Opin. Lipidol. 8 (2), 77-88 (1997); Fisher et Al., aterosclerosis 135 (2), 145-159 (1997); y Beisiegel, Eur. Heart J. 19. A20-A23 (1998)).

Descripción detallada de la invención

En algunas formas de realización, la LPL S447X terapéutica de la invención puede incluir sustancialmente compuestos purificados tales como fragmentos peptídicos, fragmentos peptídicos modificados, análogos o sales farmacológicamente aceptables de LPL que tienen los aminoácidos 447-448 truncados del terminal carboxi de una LPL tipo salvaje, tales compuestos son colectivamente denominados en este caso como péptidos de LPL S447X. Los péptidos de LPL S447X pueden incluir homólogos de la secuencia de LPL madura tipo salvaje de los aminoácidos 1 a 446, incluyendo homólogos de especies distintas de los homo sapiens (que pueden tener aplicaciones veterinarias). Los péptidos de LPL S447X pueden incluir isoformas de origen natural o variantes genéticas de LPL tipo salvaje. Los polipéptidos de la LPL pueden incluir también polipéptidos con similitud de secuencias sustancial a los aminoácidos 1 a 446 de la LPL tipo salvaje, tal como el 90%, el 95% o el 99% de identidad de secuencia a una parte correspondiente de la secuencia 1-446 de la LPL tipo salvaje, la parte correspondiente de la LPL tipo salvaje siendo cualquier secuencia contigua de cualquier longitud, tal como 10, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos. En algunas formas de realización, tales proteínas pueden tener actividad LPL, u otra propiedad tipo LPL, igual o mayor que la LPL tipo salvaje. En algunas formas de realización, los aminoácidos químicamente similares puede ser sustituidos por aminoácidos en la secuencia de LPL tipo salvaje (para proporcionar sustituciones de aminoácidos conservadoras). Las sustituciones de aminoácidos que reducen la actividad LPL, de las cuales se han descrito más de 50, tales como la sustitución de un residuo Ser por Asn en la posición 291 (Asn291 Ser), la sustitución de Asn por Asp en la posición 9 (Asp9Asn), la sustitución de Glu por Gly en la posición 188 (Gly188Glu, véase Monsalve et al,. J. Clin. Invest. 1990, 86(3):728-734) o Asp25OAsn (Ma et al., Genomics. 1992, 13:649-653) puede ser evitada en las formas de realización preferidas.

Dos secuencias de ácidos nucleicos o proteínicas son consideradas sustancialmente idénticas si, cuando están óptimamente alineadas, comparten al menos aproximadamente el 70% de identidad de secuencia. En formas de realización alternativas, la identidad de secuencia puede por ejemplo ser al menos del 75%, al menos del 90% o al menos del 95%. La alineación óptima de secuencias para comparaciones de identidad puede ser realizada usando una variedad de algoritmos, tales como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineamiento por homología Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, la investigación para el métodos de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85: 2444, y las aplicaciones computarizadas de estos algoritmos (tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.). El alineamiento de secuencias puede también efectuarse usando el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et Al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (usando los ajustes por defecto publicados). El software para realizar el análisis BLAST puede estar disponible a través del centro nacional para la información biotecnológica (a través de Internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). El algoritmo BLAST implica primero identificar los pares de secuencias de alta puntuación (hsps) para identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia buscada que coincide o que satisface una puntuación T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntuación de palabra vecina. Las palabras comunes iniciales vecinas actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largas. Las palabras comunes son extendidas en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que la puntuación de alineación acumulativa pueda ser aumentada. La extensión de las palabras comunes en cada dirección es detenida cuando se encuentran los siguientes parámetros: las caídas de puntuación de alineamiento acumulativa por la cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o a que el final de cada secuencia es alcanzado. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. Los programas BLAST pueden usar por defecto una longitud de palabra (W) de 11, los alineamientos (B) de 50 de la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89: 10915-10919), expectación (E) de 10 (que puede ser cambiada en formas de realización alternativas a 1 o 0,1 o 0,01 o 0,001 o 0,0001; aunque los valores de E muy superiores a 0,1 no pueden identificar secuencias funcionalmente similares, es útil examinar las palabras comunes con menor importancia, los valores de E entre 0,1 y 10, para regiones breves de similitud), M=5, N=4, para ácidos nucleicos una comparación de ambas cadenas. Para comparaciones de proteínas, BLASTP puede ser usado con valores por defecto como sigue: G=11 (coste para abrir un espacio); E=1 (coste para extender un espacio); E=10 (valor de expectación, en este ajuste, se prevé que 10 palabras comunes con puntuaciones iguales o mejores que la puntuación de alineación definida, S, ocurran por casualidad en una base de datos del mismo tamaño que aquella que se está buscando; el valor de E puede ser aumentado o disminuido para alterar la astringencia de la búsqueda.); y W=3 (tamaño de palabra, valor por defecto es 11 para BLASTN, 3 para otros programas blast).

La matriz BLOSUM asigna una puntuación de probabilidad para cada posición en una alineación que está basada en la frecuencia con la cual es sabe que esa sustitución ocurre entre los bloques de consenso dentro de las proteínas relacionadas. La matriz de sustitución BLOSUM62 (coste de existencia de espacio = 11; por coste de espacio de residuo = 1; proporción de lambda = 0,85) se usa por defecto en BLAST 2,0. Una variedad de otras matrices puede ser usada como alternativa a BLOSUM62, incluyendo: PAM30 (9,1,0,87); PAM70 (10,1,0,87) BLOSUM80 (10,1,0,87); BLOSUM62 (11,1,0,82) y BLOSUM45 (14,2,0,87). Una medida de la similitud estadística entre dos secuencias que usan el algoritmo BLAST es la probabilidad más pequeña de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede ocurrir por casualidad. En formas de realización alternativas de la invención, las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos están consideradas sustancialmente idénticas si la probabilidad más pequeña de suma en una comparación de las secuencias de prueba es inferior a aproximadamente 1, preferiblemente inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01, y de la forma más preferible inferior a aproximadamente 0,001.

Es bien conocido en la técnica que algunas modificaciones y cambios pueden ser hacerse en la estructura de un polipéptido sin alterar sustancialmente la función biológica de este péptido, para obtener un polipéptido biológicamente equivalente. En un aspecto de la invención, la LPL S447X terapéutica puede incluir péptidos que difieren de una parte de la secuencia de LPL de tipo salvaje por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Como se utiliza en este caso, el término "sustituciones de aminoácidos conservadas" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro en una ubicación dada en el péptido, donde la sustitución puede hacerse sin pérdida de función. Al hacer tales cambios, las sustituciones de residuos aminoácidos como pueden hacerse, por ejemplo, en base a la similitud relativa de sustituciones de la cadena lateral, por ejemplo, su tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y similares, y tales sustituciones pueden ser evaluadas para su efecto en la función del péptido por una prueba rutinaria.

En algunas formas de realización, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos conservadas donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar (p. ej., dentro de un valor de más o menos 2,0), donde los valores de hidrofilicidad siguientes son asignados para residuos aminoácidos (según se detalla en la patente estadounidense nº. 4,554,101): Arg (+3,0); Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2); Gln (+0,2); Gly (0); Pro (-0,5); Thr (-0,4); Ala (- 0,5); His (-0,5); Cys (-1,0); Met (-1,3); Val (-1,5); Leu (-1,8); Ile (-1,8); Tyr (-2,3); Phe (-2,5); y Trp (-3,4).

En formas de realización alternativas, sustituciones de aminoácidos conservadas pueden hacerse donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro que tiene un índice hidropático similar (p. ej., dentro de un valor de más o menos 2.0). En tales formas de realización, a cada residuo de aminoácido se le puede asignar un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y de carga, como sigue: Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (- 0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); y Arg (-4.5).

En formas de realización alternativas, sustituciones de aminoácidos conservadas pueden hacerse donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro en la misma clase, donde los aminoácidos están divididos en clases básicas y neutras, no polares, acídicas, como sigue: no polares: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; acídicas: Asp, Glu; básicas: Lys, Arg, His; neutras: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen la LPL S447X terapéutica. En algunas formas de realización, tales composiciones pueden incluir una LPL S447X terapéutica en una cantidad eficaz, suficiente para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico deseado, y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente. Una "cantidad eficaz" incluye una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilacticamente eficaz.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y a períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado, tal como alteración de parámetros en el metabolismo lipídico, tal como la elevación de la actividad LPL, elevación de colesterol HDL o reducción de niveles de triglicéridos. Una cantidad terapéuticamente eficaz de LPL S447X terapéutica puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad de la LPL S447X terapéutica para suscitar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también normalmente aquella donde cualquier efecto tóxico o perjudicial de la LPL S447X terapéutica es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y a períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado, tal como prevención o inhibición de varias condiciones, incluso de condiciones sensibles a LPL, tal como cardiopatía coronaria, enfermedad cardiovascular, arteriopatía coronaria, triglicéridos altos y/o HDL bajo. Una dosis profiláctica puede ser usada en sujetos antes de o en una fase anterior de la enfermedad, y una cantidad profilacticamente eficaz puede ser alrededor de una cantidad terapéuticamente eficaz en algunos casos.

En formas de realización particulares, una gama para cantidades terapéuticamente o profilácticamente eficaces de LPL S447X terapéutica pueden ser 0,01 nM-0,1M, 0,1 nM-0,1M, 0,1 nM-0,05M, 0,05 nM-15 \muM o 0,01 nM-10 \muM. Debe ser notado que los valores de dosificación pueden variar con la gravedad de la enfermedad que se debe tratar. Para un sujeto particular cualquiera, los regímenes de dosificación específicos pueden ser ajustados en el tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la administración personal o la supervisión de la administración de las composiciones. Las gamas de dosificación expuestas aquí son ejemplares sólo y no limitan las gamas de dosificación que pueden ser seleccionadas por profesionales médicos.

Para los vectores de terapia genética, la dosificación que debe ser administrada puede depender en gran parte de la condición y tamaño del sujeto que en tratamiento así como de la formulación terapéutica, frecuencia de tratamiento y la forma de administración. Los regímenes para la terapia de continuación, incluyendo dosis, formulación, y frecuencia pueden ser guiados por la respuesta inicial y juicio clínico. La vía parenteral de inyección en el espacio intersticial tisular puede ser preferida, aunque otras vías parenterales, tales como la inhalación de una formulación de aerosol, puede ser requerida en una administración específica. En algunos protocolos, una formulación que comprende el gen y sistema de entrega de genes en un portador acuoso es inyectado en el tejido en cantidades apropiadas. El tejido diana puede ser específico, por ejemplo el músculo o tejido del hígado, o puede ser una combinación de diferentes tejidos, por ejemplo el músculo y tejidos del hígado. Tejidos diana ejemplares pueden ser músculo hepático, esquelético, músculo cardíaco, depósitos adiposos, riñón, pulmón, endotelio vascular, células epiteliales y/o hematopoyéticas.

La cantidad de compuesto activo en las composiciones de la invención pueden variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, un único bolo puede ser administrado, diferentes dosis divididas pueden ser administradas en el tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o aumentada como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. "Forma de dosificación unitaria" como se utiliza en este caso se refiere a unidades físicamente específicas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos que deben ser tratados; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención puede ser dictada por las únicas características del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que debe ser conseguido, y por las limitaciones inherentes en la técnica de componer tal compuesto activo para el tratamiento de una condición en individuos.

Como se utiliza en este caso "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicidas, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. En una forma de realización, el portador es conveniente para la administración parenteral. De forma alternativa, el portador puede ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual u oral. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. A menos que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención está contemplado.

Compuestos suplementarios activos pueden también ser incorporados en las composiciones farmacéuticas de la invención. Por ejemplo, ApoCII (en forma de ácido nucleico o de proteína) puede en algunas formas de realización actuar como un coactivador de una LPL S447X terapéutica. Compuestos alternativos activos pueden incluir compuestos que aumentan las propiedades o acción de una LPL S447X terapéutica. En algunas formas de realización la LPL S447X terapéutica puede ser coadministrada con un agente terapéutico, tal como la insulina, para tratar una condición alternativa, tal como la diabetes. En algunas formas de realización, los moduladores del sistema inmunitario, tales como la ciclosporina, pueden ser coadministrados con la LPL S447X terapéutica, por ejemplo para mejorar una respuesta inmunitaria a la LPL S447X terapéutica. Para la evaluación del riesgo de una respuesta inmunitaria contra una LPL S447X terapéutica, un análisis del gen de la LPL de un paciente puede ser realizado para caracterizar la LPL natural del paciente. Una guía para la coadministración de una terapéutica adicional puede por ejemplo encontrarse en el Compendio de Farmacia y Especialidades (CPS) de la Asociación de Farmacéuticos Canadiense.

Las composiciones farmacéuticas son normalmente estériles y estables bajo las condiciones de producción y almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para recibir una elevada concentración de fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas derivadas adecuadas. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada incluyendo en la composición un agente retardante de la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. La LPL S447X terapéutica puede ser administrada en una formulación de liberación temporal o controlada, por ejemplo en una composición que incluye un polímero de liberación lenta u otros portadores que protegen el compuesto contra la liberación rápida, incluyendo implantes y sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biodegradables, biocompatibles pueden por ejemplo ser usados, tales como acetato de vinilo y etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos y poliglicólicos (PLG). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica.

Soluciones estériles inyectables pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados aquí, según se requiera, seguido de la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos entre los enumerados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo de la sustancia activa más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Conforme a un aspecto alternativo de la invención, una LPL S447X terapéutica puede ser formulada con uno o más compuestos adicionales que aumentan la solubilidad de la LPL S447X terapéutica.

Compuestos de la LPL S447X terapéutica de la invención pueden incluir derivados, tales como derivados de hidroximetilo C-terminales, derivados O-modificados (p. ej., hidroximetil bencil éter C-terminal), y derivados modificados N-terminalmente que incluyen amidas sustituidas tales como alquilamidas e hidrazidas.

Dentro de un péptido de LPL S447X de la invención, una estructura peptídica puede ser acoplada directa o indirectamente a un grupo modificador. El término "grupo modificador" se destina a incluir estructuras que son directamente fijadas a la estructura peptídica (p. ej., por acoplamiento covalente), al igual que aquellas que son indirectamente fijadas a la estructura peptídica (p. ej., por una asociación estable no covalente o por acoplamiento covalente a residuos aminoácidos adicionales, o miméticos, análogos o derivados de los mismos, que pueden flanquear la estructura peptídica del núcleo MCP-3). Por ejemplo, el grupo modificador puede ser acoplado al término amino o término carboxi de una estructura peptídica de LPL S447X, o a una región peptídica o peptidomimética flanqueante del dominio del núcleo. De forma alternativa, el grupo modificador puede ser acoplado a una cadena lateral de un residuo de aminoácido del péptido de LPL S447X o a una región peptídica o peptidomimética flanqueante del dominio del núcleo (p. ej., a través del grupo epsilon amino de un residuo(s) de lisilo, a través del grupo carboxilo de un residuo(s) de ácido aspártico o un residuo(s) de ácido glutámico, a través de un grupo hidroxi de un(os) residuo(s) de tirosilo, un(os) residuo(s) de serina o un(os) residuo(s) de treonina u otro grupo adecuado reactivo en una cadena lateral del aminoácido). Los grupos modificadores acoplados de manera covalente a la estructura peptídica pueden ser unidos mediante y usando métodos bien conocidos en la técnica para conectar estructuras químicas, incluyendo, por ejemplo, enlaces de amida, de alquilamino, de carbamato o de úrea.

En algunas formas de realización, el grupo modificador puede comprender un grupo cíclico, heterocíclico o policíclico. El término "grupo cíclico", como se utiliza en este caso, incluye un grupo cíclico saturado o insaturado (es decir, aromático) que tiene de 3 a 10, 4 a 8, o 5 a 7 átomos de carbono. Grupos ejemplares cíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y ciclooctilo. Grupos cíclicos pueden ser insustituidos o sustituidos en una o más posiciones del anillo. Un grupo cíclico puede por ejemplo ser sustituido con halógenos, alquilenos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, heterociclos, hidroxilos, aminos, nitros, tioles, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, sulfonatos, selenoéteres, cetonas, aldehidos, ésteres, -CF_{3}, -CN.

El término "grupo heterocíclico" incluye grupos cíclicos, saturados, insaturados y aromáticos que tienen de 3 a 10, 4 a 8, o 5 a 7 átomos de carbono, donde la estructura anular incluye aproximadamente uno o más heteroátomos. Los grupos heterocíclicos incluyen pirrolidina, oxolano, tiolano, imidazol, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina. El anillo heterocíclico puede ser sustituido en una o más posiciones con sustituyentes tales como, por ejemplo, halógenos, alquilenos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, aritos, otros heterociclos, hidróxilo, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldehidos, ésteres, -CF_{3}, -CN. Heterociclos pueden también ser unidos por un puente o fusionados con otros grupos cíclicos como se describe más abajo.

El término "grupo policíclico" como se utiliza en este caso se destina a referirse a dos o más anillos cíclicos saturados, insaturados o aromáticos donde dos o más carbonos son comunes para dos anillos adyacentes, de modo que los anillos son "anillos fusionados". Los anillos que son unidos a través de átomos no contiguos son denominados anillos "unidos por puente". Cada uno de los anillos del grupo policíclico pueden ser sustituidos con sustituyentes tales como se ha descrito anteriormente, como por ejemplo, halógenos, alquilenos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, hidróxilo, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldehidos, ésteres, -CF_{3}, o -CN.

El término "alquilo" se refiere al radical de grupos saturados alifáticos, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (aliciclicos), grupos cicloalquilo alquilo sustituidos, y grupos alquilo cicloalquilo sustituidos. En algunas formas de realización, un alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada tiene 20 átomos de carbono o menos en su esqueleto (C_{1}-C_{20} para cadena lineal, C_{3}-C_{20} para cadena ramificada), o 10 átomos de carbono o menos. En algunas formas de realización, los cicloalquilos pueden tener de 4-10 átomos de carbono en su estructura anular, tales como 5, 6 o 7 anillos de carbono. A menos que el número de carbonos sea especificado de otro modo, "alquilo inferior" como se utiliza en este caso significa un grupo alquilo, tal como se ha definido anteriormente, que tiene de uno a diez átomos de carbono en su estructura de esqueleto. Asimismo, "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" tiene longitudes de cadena de diez o menos carbonos.

El término "alquilo" (o "alquilo inferior") según se usa en toda la especificación y reivindicaciones se destina a incluir ambos "alquilos insustituidos" y "alquilos sustituidos", estos últimos se refieren a fracciones de alquilo que tienen sustituyentes que remplazan un hidrógeno en uno o más carbonos del esqueleto de hidrocarburo. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, halógeno, hidróxilo, carbonilo (tales como carboxilo, cetonas (incluyendo grupos alquilcarbonilo y arilcarbonilo), y ésteres (incluyendo grupos alquiloxicarbonilo y ariloxicarbonilo), tiocarbonilo, aciloxi, alcoxilo, fosforilo, fosfonato, fosfinato, amino, acilamino, amido amidina, imino, ciano, nitro, azido, sulfhidrilo, alquiltio, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamida, heterociclilo, aralquilo, o una fracción aromática o heteroaromática. Las fracciones sustituidas en la cadena de hidrocarburo pueden ellas mismas ser sustituidas, si fuera apropiado. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas e insustituidas de aminos, azidos iminos, amidos, fosforilos (incluyendo fosfonatos y fosfinatos), sulfonilos (incluyendo sulfatos, sulfonamidos, sulfamoilos y sulfonatos), y grupos sililo, al igual que éteres, alquiltios, carbonilos (incluyendo cetonas, aldehidos, carboxilatos, y ésteres), -CF_{3}, -CN y similares. Alquilenos ejemplares sustituidos están descritos más abajo. Los cicloalquilos pueden ser adicinalmente sustituidos con alquilenos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos, alquilos carbonilo sustituidos, -CF_{3}, -CN, y similares.

Los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a grupos insaturados alifáticos análogos en longitud y posible sustitución por los alquilos anteriormente descritos, pero que contienen al menos un enlace doble o triple respectivamente.

El término "aralquilo", como se utiliza en este caso, se refiere a un grupo alquilo o alquilenilo sustituido con al menos un grupo arilo. Aralquilos ejemplares incluyen bencilo (es decir, fenilmetilo), 2-naftiletilo, 2-(2-piridil)propilo, 5-dibenzosuberilo, y similares.

El término "alquilcarbonilo", como se utiliza en este caso, se refiere a -C(O)-alquilo. De forma similar, el término "arilcarbonilo" se refiere a -C(O)-arilo. El término "alquiloxicarbonilo", como se utiliza en este caso, se refiere al grupo -C(O)-O-alquilo, y el término "ariloxicarbonilo" se refiere a -C(O)-O-arilo. El término "aciloxi" se refiere a -O-C(O)-R_{7}, donde R_{7} es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo o heterociclilo.

El término "amino", como se utiliza en este caso, se refiere a -N(R_{\alpha})(R_{\beta}), donde R_{\alpha} y R_{\beta} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, alquienilo, alquinilo, aralquilo, arilo, o donde R_{\alpha} y R_{\beta} con el átomo de nitrógeno al que están fijados forman un anillo que tiene 4-8 átomos. Así, el término "amino", como se utiliza en este caso, incluye grupos amino insustituidos, monosustituidos (p. ej., monoalquilamino o monoarilamino), y disustituídos (p. ej., dialquilamino o alquilarilamino). El término "amido" se refiere a -C(O)-N(R_{8})(R_{9}), donde R_{8} y R_{8} son tal como se ha definido anteriormente. El término "acilamino" se refiere a - N(R'_{8})C(O)-R_{7}, donde R_{7} es tal como se ha definido anteriormente y R'_{8} es alquilo.

Como se utiliza en este caso, el término "nitro" significa -NO_{2}; el término "halógeno" designa -F, -Cl, -Br o -I; el término "sulfhidrilo" significa -SH; y el término "hidroxilo" significa -OH.

El término "arilo" como se utiliza en este caso incluye grupos aromáticos de 5, 6 y 7-miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos en el anillo, por ejemplo, fenilo, pirrolilo, furilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazol, tiazolilo, triazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, piridazinilo y pirimidinilo, y similares. Estos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura anular pueden también denominarse "heterociclos de arilo" o "heteroaromáticos". El anillo aromático puede ser sustituido en una o más posiciones del anillo por sustituyentes tales como se ha descrito anteriormente, como por ejemplo, halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidróxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamida, cetona, aldehído, éster, un heterociclilo, una fracción aromática o heteroaromática, -CF_{3}, -CN, o similar. Grupos arilo pueden también ser parte de un grupo policíclico. Por ejemplo, grupos arilo incluyen fracciones fusionadas aromáticas tales como naftilo, antracenilo, quinolilo, indolilo, y similares.

Grupos modificadores pueden incluir grupos que comprenden estructuras de biotinilo, grupos con fluoresceína, un grupo de dietileno-triaminapentaacetilo, un grupo (-)-mentoxiacetilo, un grupo N-acetilneuraminilo, una estructura de colilo o un grupo iminiobiotinilo. Un péptido de LPL S447X puede ser modificado en su término carboxi con un grupo colilo según métodos conocidos en la técnica (por ejemplo véase: Wess, G. et al. (1993) Tetrahedron Letters, 34:817-822; Wess, G. et al. (1992) Tetrahedron Letters 33:195-198; and Kramer, W. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:18598-18604). Derivados y análogos de colilo pueden también ser usados como grupos modificadores, tales como Aic (3-(O-aminoetil-iso)-colilo), que tiene un grupo amino libre que puede utilizarse para modificar adicionalmente el péptido de LPL S447X. Un grupo modificador puede ser una "estructura de biotinilo", que incluye grupos de biotinilo y análogos y derivados de los mismos (tales como un grupo 2- iminobiotinilo). En otra forma de realización, el grupo modificador puede comprender un "grupo conteniendo fluoresceína", tal como un grupo derivado de la reacción de un péptido de LPL S447X con 5-(y 6-)-carboxifluoresceína, éster succinimidílico o isotiocianato de fluoresceína. En varias otras formas de realización, el(los) grupo(s) modificador(es) puede(n) comprender un grupo N-acetilneuraminilo, un grupo trans-4-cotininacarboxilo, un grupo 2-imino-1-imidazolidineacetilo, un grupo (S)-(-)-indolina-2-carboxilo, un grupo (-)-mentoxiacetilo, un grupo 2-norbornanoacetilo, un gamma-oxo-5-acenaftenobutirilo, un grupo (-)-2-oxo-4-tiazolidinacarboxilo, un grupo tetrahidro-3-furoilo, un grupo 2-iminobiotinilo, un grupo dietilentriaminopentaacetilo, un grupo 4-morfolinacarbonilo, un grupo 2-tiofenoacetilo o un grupo 2-tiofenosulfonilo.

Una LPL S447X terapéutica de la invención puede ser adicionalmente modificada para alterar las propiedades específicas del compuesto mientras que se retiene la funcionalidad deseada del compuesto. Por ejemplo, en una forma de realización, el compuesto puede ser modificado para alterar una propiedad farmacocinética del compuesto, tal como la estabilidad in vivo o vida media. El compuesto puede ser modificado para marcar el compuesto con una sustancia detectable. El compuesto puede ser modificado para acoplar el compuesto a una fracción terapéutica adicional. Para modificar el compuesto químicamente aún más, así como para alterar sus propiedades farmacocinéticas, se pueden derivatizar grupos reactivos. Modificaciones C-terminales potenciales incluyen aquellas que reducen la capacidad del compuesto para actuar como un sustrato para carboxipeptidasas. Ejemplos de modificadores C-terminales incluyen un grupo amida, un grupo etilamida y varios aminoácidos anaturales, tales como D-aminoácidos y beta-alanina. De forma alternativa, cuando el grupo modificador es fijado al extremo carboxi terminal del dominio del núcleo de agregación, el extremo aminoterminal del compuesto puede ser adicionalmente modificado, por ejemplo, para reducir la capacidad del compuesto para actuar como un sustrato para aminopeptidasas.

Una LPL S447X terapéutica puede ser adicionalmente modificada para marcar el compuesto reaccionando el compuesto con una sustancia detectable. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales adecuados fluorescentes incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material adecuado radiactivo incluyen ^{14}C, ^{123}I ^{124}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{99}Tc, ^{35}S o ^{3}H. Una LPL S447X terapéutica puede ser radioactivamente marcada con ^{14}C, bien por incorporación de ^{14}C en el grupo modificador o una o más estructuras de aminoácido en el compuesto. La LPL S447X terapéutica marcada puede ser usada para evaluar la farmacocinética in vivo de los compuestos, al igual que para detectar la progresión de la enfermedad o propensión de un sujeto para desarrollar una enfermedad, por ejemplo para fines diagnósticos. La distribución en el tejido de la LPL S447X terapéutica puede ser detectada usando una LPL S447X terapéutica marcada bien in vivo o en una muestra in vitro derivada de un sujeto. Para el uso como un agente diagnóstico in vivo, una LPL S447X terapéutica de la invención puede por ejemplo ser marcada con tecnecio radiactivo o yodina. Un grupo modificador puede ser elegido que proporciona un sitio en el que puede ser introducido un grupo de quelación para el marcador, tal como un derivado Aic de ácido cólico, que tiene un grupo amino libre. Por ejemplo, un residuo de fenilalanina dentro de la secuencia peptídica de LPL S447X puede ser sustituido con yodotirosilo radiactivo. Cualquiera de los distintos isótopos de yodina radiactiva pueden ser incorporados para crear un agente diagnóstico. ^{123}I (vida media = 13,2 horas) puede ser usada para escintografía de cuerpo entero, ^{124}I (vida media = 4 días) puede ser usada para tomografía por emisión de positrones (PET), ^{125}I (vida media = 60 días) puede ser usada para estudios de producción metabólica y ^{131}I (vida media = 8 días) puede ser usada para un recuento de cuerpo entero y estudios de formación de imágenes de baja resolución retardada.

En una modificación química alternativa, una LPL S447X terapéutica de la invención puede ser preparada en una forma "profármaco", donde el compuesto por sí mismo no actúa como un agente terapéutico, sino que es capaz de ser transformada, por metabolismo in vivo, en una LPL S447X terapéutica tal y como se define aquí. Por ejemplo, en este tipo de compuesto, el grupo modificador puede estar presente en una forma profármaco que es capaz de ser convertida por el metabolismo en forma de una LPL S447X terapéutica activa. Tal forma de profármaco de un grupo modificador se denomina en este caso como un "grupo modificador secundario". Una variedad de estrategias son conocidas en la técnica para preparar profármacos peptídicos que limiten el metabolismo para optimizar la entrega de la forma activa del fármaco basado en el péptido (véase p. ej., Moss, J. (1995) in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M. D. y Amidon, G. L. (Eds), capítulo 18).

Análogos peptídicos de LPL S447X de la invención pueden ser preparados por técnicas estándar conocidas en la técnica. Análogos peptídicos de LPL S447X pueden estar compuestos, al menos en parte, de un péptido sintetizado usando técnicas estándar (tales como aquellas descritas en Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993); Grant, G. A. (ed.). Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992); o Clark-Lewis, I., Dewald, B., Loetscher, M., Moser, B., y Baggiolini, M., (1994) J. Biol. Chem., 269, 16075-16081). Sintetizadores de péptidos automatizados están comercialmente disponibles (p. ej., Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Los péptidos pueden ser evaluados para actividad conforme a métodos estándar. Los péptidos pueden ser purificados por HPLC y analizados por espectrometría de masas. Los péptidos pueden ser dimerizados por medio de un puente disulfuro formado por oxidación suave de las cisteínas usando un 10% de DMSO en agua. Después de la purificación por HPLC, la formación del dímero puede ser verificada, por espectrometría de masas. Uno o más grupos modificadores pueden ser fijados a un péptido de LPL S447X por métodos estándar, por ejemplo usando métodos para reacción a través de un grupo amino (p. ej., el grupo alfa-amino en el término amino de un péptido), un grupo carboxilo (p. ej., en el término carboxi de un péptido), un grupo hidróxilo (p. ej., en un residuo de tirosina, serina o treonina) u otro grupo adecuado reactivo en una cadena lateral de aminoácido (véase p. ej., Greene, T. W. y Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York (1991)).

En otro aspecto de la invención, los péptidos de LPL S447X pueden ser preparados según técnicas de ADN recombinante estándar usando una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido. Una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de interés puede ser determinada usando el código genético y una molécula oligonucleótida que tiene esta secuencia de nucleótidos puede ser sintetizada por métodos de síntesis de ADN estándar (p. ej., usando un sintetizador de ADN automatizado). De forma alternativa, una molécula de ADN que codifica un compuesto peptídico puede ser derivada del gen de la proteína precursora natural o ADNc (p. ej., usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o digestión con la enzima de restricción) según las técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, el fragmento de ADNc de la LPL tipo salvaje humana puede ser clonado por RT-PCR del ARN total del tejido adiposo humano usando los siguientes cebadores 5' y 3' UTR respectivamente; 5'-ATA GM TTC GGA TCC ATC GAT/GC TCC TCC AGA GGG ACG GCG CCC CG-3' (que introduce un sitio 5' EcoRI, BamHI y ClaI de la secuencia codificante de LPL) y 5'-TAT GTC GAC TAG ATA TC/GCC GTT CTT TGT TCT GTA GAT TCG CCC-3' (que introduce los sitios 3' SalI, XbaI y EcoRV de la secuencia codificante de LPL). Los ADNcs de LPL S447X pueden ser derivados del ADNc de LPL de 1.6kb de tipo salvaje humana por mutagénesis sitio dirigida (que puede ser confirmada por secuenciación, véase Henderson et Al., 1991, Journal of Clinical Investigación 87, 2005-2011; y, Zhang et Al., 1996Biochimica et Biophyisica Acta 1302, 159-166).

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de LPL S447X de la invención. El término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN y moléculas de ARN que pueden ser monocatenarias o bicatenarias. En formas de realización alternativas, el ácido nucleico aislado codifica un péptido donde uno o más aminoácidos son alterados o delecionados.

Para facilitar la expresión de un compuesto peptídico en una célula huésped por técnicas estándar de ADN recombinante, el ácido nucleico aislado que codifica el péptido puede ser incorporado en un vector de expresión recombinante. Por consiguiente, la invención también proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención. Como se utiliza en este caso, el término "vector" se refiere a un ácido nucleico, proteína, lípido u otra molécula capaz de transportar un ácido nucleico al que ha sido operativamente enlazado. Los vectores pueden incluir plásmidos de ADN bicatenario circular y vectores víricos. Ciertos vectores son capaces de hacer la replicación autónoma en una célula huésped en la que son introducidos (tales como vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (tales como vectores de mamífero no episómicos) pueden ser integrados en el genoma de una célula huésped por introducción en la célula huésped, y de ese modo se pueden replicar a lo largo del genoma huésped. Ciertos vectores pueden ser capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente enlazados.

En vectores recombinantes de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido puede ser operativamente enlazada a una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células huéspedes que deben ser usadas para la expresión. Los términos "operativamente enlazado" u "operablemente enlazado" significan que las secuencias que codifican el péptido están enlazadas a la(s) secuencia(s) regulador(as) en cierto modo que permite la expresión del compuesto peptídico. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, intensificadores, señales de poliadenilación y otros elementos de control de la expresión. Tales secuencias reguladoras están descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huéspedes, aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en células huéspedes determinadas (tales como secuencias reguladoras específicas del tejido) y aquellas que dirigen la expresión de una manera regulable (tal como sólo en presencia de un agente de inducción). El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped para ser transformada y el nivel de expresión del compuesto peptídico deseado.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden ser diseñados para la expresión de compuestos peptídicos en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, compuestos peptídicos pueden ser expresados en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus) células de levadura o células mamíferas. Las células huéspedes adecuadas son discutidas adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). De forma alternativa, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa. Ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerivisae incluyen pYepSecl (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et Al., (1987) Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.). Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas o péptidos en células de insecto cultivadas (p. ej., células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow, V. A., y Summers, M. D., (1989) Virology 170:31-39). Ejemplos de vectores de expresión mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195). Cuando se usa en células mamíferas, las funciones de control del vector de expresión son frecuentemente proporcionadas por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, promotores comúnmente usados son derivados de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus Símico 40.

Además de secuencias de control reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden contener secuencias de nucleótidos adicionales, tales como un gen marcador seleccionable para identificar las células huéspedes que han incorporado el vector. Los genes marcadores seleccionables son conocidos en la técnica. Para facilitar la secreción del compuesto peptídico de una célula huésped, en particular de células huéspedes mamíferas, el vector de expresión recombinante preferiblemente codifica una secuencia señal operativamente enlazada a las secuencias que codifican el término amino del compuesto peptídico, de manera que tras la expresión, el compuesto peptídico es sintetizado con la secuencia señal fusionada a su término amino. Esta secuencia señal dirige el compuesto peptídico en la vía secretora de la célula y es luego dividida, permitiendo la liberación del compuesto del péptido maduro (es decir, el compuesto peptídico sin la secuencia señal) de la célula huésped. El uso de una secuencia señal para facilitar la secreción de proteínas o péptidos de células huéspedes mamíferas es bien conocido en la técnica.

Un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un compuesto peptídico puede ser introducido en una célula huésped para producir el compuesto peptídico en la célula huésped. Por consiguiente, la invención también proporciona células huéspedes que contienen los vectores de expresión recombinantes de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" son usados de forma intercambiable en la presente. Tales términos se refieren no sólo a la célula objetivo particular sino a la progenie o progenie potencial de tal célula. Como ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones posteriores debido sea a la mutación o influencias medioambientales, tal progenie no puede, de hecho, ser idéntica a la célula madre, sino que además están incluidas dentro del alcance del término según se utiliza en este caso. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un compuesto peptídico puede ser expresado en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, levadura o células mamíferas El compuesto peptídico puede ser expresado in vivo en un sujeto para el sujeto por terapia genética (discutido adicionalmente más abajo).

El vector de ADN puede ser introducido en células procarióticas o eucarióticas por medio de técnicas de transformación o de transfección convencionales. Los términos "transformación" y "transfección" se refieren a técnicas para introducir un ácido nucleico externo en una célula huésped, incluyendo fosfato cálcico o coprecipitación de cloruro de calcio, transfección mediada por dextrano DEAE, lipofección, electroporación, microinyección y transfección mediada vírica. Métodos adecuados para transformar o transfectar células huéspedes pueden por ejemplo encontrarse en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros manuales de laboratorio. Los métodos para introducir ADN en células mamíferas in vivo son también conocidos, y pueden ser usados para entregar el ADN vector de la invención a un sujeto para la terapia genética.

Para la transfección estable de células mamíferas, es sabido que, dependiendo del vector de expresión y técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extranjero en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como resistencia a los antibióticos) puede ser introducido en las células huéspedes junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Los ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable puede ser introducido en una célula huésped en el mismo vector que aquel que codifica el compuesto peptídico o puede ser introducido en un vector separado. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por selección de fármaco (las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirá, mientras que las otras células morirán).

Un ácido nucleico de la invención puede ser entregado a células in vivo usando métodos tales como la inyección directa de ADN, la absorción de ADN mediada por receptor, la transfección mediada por virus o la transfección no vírica y la transfección basada en lípidos, todos ellos pueden implicar el uso de vectores de la terapia genética. La inyección directa ha sido usada para introducir ADN desnudo en células in vivo (véase p. ej., Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). Un aparato de entrega (p. ej., una "pistola de genes") para inyectar ADN en células in vivo puede ser usado. Tal aparato puede estar comercialmente disponible (p. ej., de BioRad). El ADN desnudo puede también ser introducido en células complejando el ADN a un catión, tal como polilisina, que es acoplada a un ligando para un receptor de la superficie celular (véase por ejemplo Wu, G. y Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; y Pat. estadounidense Nº. 5,166,320). La unión del complejo de ligando de ADN al receptor puede facilitar la absorción del ADN por endocitosis mediada por receptor. Un complejo de ligando de ADN enlazado a cápsidas de adenovirus que disgregan endosomas, liberando de ese modo material en el citoplasma, puede ser usado para evitar la degradación del complejo por lisosomas intracelulares (véase por ejemplo Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 88:8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90:2122-2126).

Los retrovirus defectuosos están bien caracterizados para el uso como vectores de terapia genética (para una revisión véase Miller, A. D. (1990) Blood 76:271). Protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus pueden ser encontrados en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de líneas de virus de empaquetamiento adecuadas incluyen .p\psii.Crip, .p\psii.Cre, .p\psii.2 y .p\psii.Am. Los retrovirus han sido usados para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de médula ósea, in vitro y/o in vivo (véase por ejemplo Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos y Mulligan (1988) Proc.. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; Pat. estadounidense Nº. 4,868,116; Pat. estadounidense Nº. 4,980,286; solicitud de PCT WO 89/07136; solicitud de PCT WO 89/02468; solicitud de PCT WO 89/05345; y solicitud de PCT WO 92/07573).

Para el uso como un vector de terapia genética, el genoma de un adenovirus puede ser manipulado de modo que codifique y exprese un compuesto peptídico de la invención, pero es inactivado en cuanto a su capacidad para replicarse en un ciclo de vida vírico lítico normal. Véase por ejemplo Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Los vectores adenovíricos adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5.d1324 u otras cepas de adenovirus (p. ej., Ad2, Ad3, Ad7 etc.) son conocidos por los expertos en la técnica. Los adenovirus recombinantes son ventajosos en cuanto a que no requieren células en división para ser vehículos de entrega de genes eficaces y pueden utilizarse para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluso el epitelio de las vías aéreas (Rosenfeld et al. (1992) citado supra), las células endoteliales (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89:6482-6486), los hepatocitos (Herz y Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90:2812-2816) y las células musculares (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584).

Un virus adenoasociado (AAV) puede ser usado como un vector de terapia genética para la entrega de ADN para fines de terapia genética. El AAV es un virus de origen natural defectuoso que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un herpes virus, como un virus auxiliar para la explicación eficaz y un ciclo de vida productivo (Muzyczka et Al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129). El AAV puede ser usado para integrar ADN en células que no están en división (véase por ejemplo Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Un vector de AAV tal como se describe en Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 puede ser usado para introducir ADN en las células (véase por ejemplo Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; y Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790). Los vectores lentivirales de terapia genética pueden también ser adaptados para el uso en la invención.

Métodos generales para terapia genética son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Pat. estadounidense Nº. 5,399,346 por Anderson et Al. Una cápsula biocompatible para entregar material genético está descrita en la publicación PCT WO 95/05452 por Baetge et Al. Los métodos de transferencia de genes en células hematopoyéticas también han sido proporcionados previamente (véase Clapp, D. W., et al., Blood 78: 1132-1139 (1991); Anderson, Science 288:627-9 (2000); y, Cavazzana-Calvo et al., Science 288:669-72 (2000).

La deficiencia genética de la LPL puede ser clasificada en tres categorías dependiendo de las características de la proteína LPL. Los pacientes hipertrigliceridémicos tipo I tienen una masa de proteína LPL de muy baja a ninguna. Los pacientes tipo II producen poca proteína LPL preheparina pero el nivel aumenta después del tratamiento de heparina. En la clase tipo III, hay grandes cantidades de proteína preheparina circulante con poco cambio en niveles después del desafío de heparina. Aunque la utilidad de este sistema de clasificación es limitado, con algunos pacientes heterocigotos del compuesto que se extienden en dos de estas clases, la clarificación de la presencia o ausencia de proteína LPL en el plasma puede ser importante para decidir que los pacientes son muy propensos a tolerar la transferencia de genes sin una reacción inmunológica a la LPL S447X terapéutica, con el espectro siendo de pacientes de tipo I, siendo los más propensos a desarrollar una reacción inmunológica, para pacientes tipo II, siendo los menos propensos a desarrollar una reacción inmunológica.

Ejemplo 1 Administración de proteína LPL S447X por terapia genética

Un modelo de ratón de deficiencia de LPL humana ha sido creado por focalización de genes para inactivar el gen de LPL de murina. Todas las crías (-/-) homocigotas mueren en 48 horas después del nacimiento con quilomicronemia masiva de leche lactante. Al intentar rescatar las crías -/-, la entrega intramuscular de adenovirus recombinante conteniendo el gen de LPL humana de tipo salvaje (Ad-LPL) solo no resultó en un aumento significante de masa de LPL humana en el plasma postheparina y no rescató la letalidad de una deficiencia total de LPL.

La entrega intramuscular de un vector de terapia genética Ad-447 a crías recién nacidas resultó en la aparición de masa de LPL humana en niveles altos en el plasma postheparina. En una camada de 4 crías, 2 fueron inyectadas con Ad-447 (2X10^{8} Pfu en 100 \mul de PBS) en 4 sitios (25 \mul/sitio) en 4 extremidades en el día del nacimiento. Dos días más tarde, se inyectó heparina a 1000 U/kg intraperitonealmente y las crías fueron sacrificadas por decapitación para recoger aproximadamente 10 a 20 \mul de plasma postheparina para análisis. Una extremidad anterior y una posterior fueron recolectadas y homogenizadas a 100 mg/ml en tampón de extracción. Los resultados están mostrados en la tabla 1.

TABLA 1

1

Estos resultados muestran que la entrega intramuscular de una LPL S447X terapéutica por transferencia de genes mediada por adenovirus resultó en un aumento significante de la masa de proteína LPL humana en el plasma postheparina. Estos resultados son indicativos de los resultados sorprendentemente ventajosos obtenibles usando la LPL S447X terapéutica de la invención, en comparación con LPL de tipo salvaje.

Un vector de adenovirus de la invención para terapia genética puede ser producido por ejemplo utilizando el kit Adeno-Quest^{TM} disponible por Quantum Biotechnologies Inc. (Montreal, QC, Canada). En un ejemplo de este enfoque, los ADNcs fueron clonados en el plásmido transportador pQBI-AdCMV5, que contiene el promotor CMV5 e intensificador y una poli A de globina. Los ADNcs de LPL (tipo salvaje y S447X) fueron digeridos por duplicado con HindIII y XbaI e insertados en el sitio de BamHI por medio de ligación del extremo romo. El gen de LPL humana fue insertado 1,5 unidades de mapeo (mu) hacia abajo desde el extremo 5' del genoma del adenovirus y fue seguido de 9,4-15,5 mu de Ad5 permitiendo la recombinación homóloga. El vector transportador y el extremo derecho digerido por Clal^{-}, el fragmento deleccionado con E3 del genoma Ad5 fue comodificado en 293 células por precipitación de fosfato de calcio y cubierto con el 0,8% de agarosa en DMEM/5% de FBS. Después de la purificación en placas, un clon de alta expresión fue seleccionado y amplificado. En el día 9 y 14, se seleccionaron placas in vitro por su actividad LPL. Dos clones con la actividad LPL máxima fueron elegidos, la placa fue purificada una segunda vez y amplificada en un cultivo celular de 293A en placas de 15 cm. La purificación de virus recombinantes de alta titulación (\sim3x10^{10} Pfu/ml) fue realizada por ciclos dobles de ultracentrifugación con gradiente de densidad CsCl. Las reservas de virus purificados fueron dializadas contra 4 cambios de solución salina tamponada con HEPES (HBS, 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7.3) con un 10% de glicerol durante 16-18 horas y almacenadas a -80ºC. Los títulos de las reservas víricas fueron determinados por ensayo en placas usando 293 células como se ha descrito anteriormente. La titulación fue calculada como unidades de formación de placas por mililitro (Pfu/ml) y fue 1-3 X 10^{10} Pfu/ml. Las preparaciones de virus fueron cuantificadas por el ensayo de proteína de Lowry la consistencia reveló \sim50 partículas por Pfu de todas las preparaciones de Ad-LPL y Ad-447.

Ejemplo 2

Un adenovirus de serotipo 5 conteniendo un gen de LPL S447X bajo el control del promotor CMV fue desarrollado (Ad-447 como se describe en el Ejemplo 1), y su efecto fue comparado con los efectos de una LPL tipo salvaje conteniendo adenovirus. El modelo animal empleado fue el modelo de ratón knockout de LPL +/- (Coleman et al., 1995, The Journal of Biological Chemistry 270[21], 12518-12525).

Estudios preliminares in vitro hechos en células HepG2 indicaron una relación de respuesta a la dosis para actividad LPL para el virus Ad-447 de una magnitud similar al adenovirus que contiene la LPL de tipo salvaje. Hubo, no obstante, una diferencia marcada en la cantidad de masa inmunoreactiva de LPL. La masa inmunoreactiva de LPL en células tratadas con Ad-447, a una MOI de 50 que infecta esencialmente el 100% de las células, fue aproximadamente 4 veces superior que aquella de Ad-LPL.

Cuando la relación de respuesta a la dosis del virus Ad-447 fue evaluada en una pequeña cohorte de ratones por medio de inyección intravenosa, se obtuvieron resultados inesperados. El nivel de actividad LPL no fue sensible a aumentos dobles de virus (5x10^{8}, 1x10^{9} o 2x10^{9} Pfu/ratón). El nivel de actividad fue similar a aquel visto en la cohorte de ratones dando 5x10^{8} Pfu de Ad-LPL. No obstante, el nivel de proteína LPL visto en estos ratones fue excepcionalmente alto. A pesar de que la actividad aparentemente empezó a decrecer en el día 7, la masa inmunoreactiva siguió aumentando en las tres dosis a un nivel de aproximadamente 35-40,000 ng/ml. Se observó la mayoría de esta proteína en el día 7 en el plasma preheparina y la pequeña variación en la actividad lipolítica indicó que estaba ampliamente en una forma inactiva. Aproximadamente 5000 ng/ml se encontraron exclusivamente en el plasma postheparina. En un transcurso de tiempo de 70 días, los niveles de actividad LPL en ratones suministrados con Ad-447 siguieron a aquellos de Ad-LPL de cerca y volvieron a los niveles del punto de referencia entre 6 y 10 semanas postinyección. No obstante, los niveles de proteína inmunoreactiva LPL fueron significativamente elevados en ratones que recibieron bien Ad-LPL o Ad-447 con niveles en la cohorte de Ad 447 manteniendo niveles profundamente elevados en el grupo de Ad-LPL de tipo salvaje. Los niveles de TG fueron significativamente reducidos en las tres dosis de Ad-447 de modo similar a 5x10^{8} Pfu Ad-LPL. Ambos colesteroles total y HDL fueron significativamente reducidos hasta el día 14.

Para demostrar respuesta a la dosis, los ratones con +/- LPL (n=5/grupo) fueron suministrados con 5x10^{7} o 5x10^{8} Pfu de bien Ad 447 o Ad-LPL (una dosis 5x10^{7} Pfu es equivalente a aproximadamente 5x10^{9} partículas). A una dosis de 5x10^{8} Pfu de bien Ad-LPL o Ad-447 por ratón, hubo un aumento significante de 2,7 veces en la actividad LPL en el plasma acompañado por un aumento significante en los niveles de proteína LPL en el día 5 post-transferencia de genes. Los niveles correspondientes de TG, HDL-C y Total-C también se redujeron significativamente. A esta dosis, la única diferencia significante entre el adenovector conteniendo el ADNc de LPL tipo salvaje contra el Ad-447 fue el nivel de proteína LPL en el plasma, que fue elevado en el grupo Ad-447. Aunque los niveles de proteína LPL postheparina fueron significativamente elevados en ambos grupos sobre el punto de referencia o ratones de control, estos fueron todavía más profundamente elevados en el grupo Ad-447 (p<0.03). Las diferencias más provocativas fueron observadas sólo en la dosis inferior y estaban en las medidas de TG y de colesterol. 3 días después de la transferencia de genes, los niveles de TG fueron significativamente disminuidos en ambos grupos Ad-LPL y Ad-447, indicando la eficacia de la LPL transferida en ambos grupos de ratones. No obstante, hubo un aumento significante en ambos HDL-C y Total-C sólo en el grupo Ad-447 (p<0.01 y p<0.03 respectivamente, en comparación con el tratamiento de referencia o de Ad-LPL). La magnitud de estas alteraciones, al compararse con niveles de referencia, indica que la mayoría del aumento en Total-C está dentro de la fracción HDL-C. En esta misma dosis en la cohorte Ad-LPL, hubo una leve reducción en ambos Total-C y HDL-C con sólo la reducción en Total-C adquiriendo importancia (p=0.04). Esto ilustra un contenido de HDL-C aumentado después de la transferencia de genes mediada por adenovirus del gen de LPL S447X humana en ratones. Una elevación similar significante de la fracción de HDL-C fue observada en el día 7, resolviéndose en el día 14.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra que la masa y actividad LPL está relacionada con la gravedad de la isquemia y angina de pecho, indicando que la terapéutica con S447X de la presente invención puede ser usada para tratar condiciones de este tipo elevando la masa o actividad LPL.

En este ejemplo, los niveles postheparina de actividad y masa de LPL fueron medidos en una gran cohorte de pacientes de CHD masculinos que participaron en el estudio REGRESS, una prueba de regresión reductora de lípidos (Jukema et Al., 1995, Circulation 91: 2528-2540). Además se evaluaron las relaciones entre actividad y masa de LPL y la gravedad de angina de pecho según la clasificación NYHA y la isquemia silenciosa en un control ambulatorio (A)ECG de 24 horas. Los resultados indicaron que los pacientes en diferentes cuartiles de actividad y masa de LPL tuvieron una gravedad diferente de angina; un total del 47% de pacientes en el cuartil de LPL inferior indicó una angina de clase 3 o 4. En contraposición, sólo el 29% en el cuartil de actividad máximo (p = 0.002) tuvo una angina severa. Estos parámetros fueron apoyados por los resultados de AECG; donde la carga total isquémica en el cuartil de actividad LPL inferior fue 36,5 (104,1) mm.min, contra 14,8 (38,8) mm.min en el cuartil más alto de actividad LPL (p=0.001). Los niveles de actividad LPL estuvieron fuertemente correlacionados con la masa de LPL (r=0.70; p<0.0001). Una relación significante fue también demostrada entre la masa de la proteína LPL y la clase NYHA (p=0.012). Estos resultados demuestran una relación significante entre la masa y actividad LPL y la gravedad de la isquemia tal y como se define por la clase de angina y AECG, indicando que la LPL S447X terapéutica que ajusta una masa o actividad LPL eficaz puede ser usada para tratar la isquemia y la angina de pecho.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra que la proteína LPL S447X está relacionada con la protección contra la cardiopatía coronaria, indicando que la S447X terapéutica de la presente invención puede ser usada para tratar esta condición. De forma aleatoria se constató que un total de 1114 hombres y 1144 mujeres a partir del Framingham Offspring Study (FOS) tenían presencia del gen de LPL S447X. La frecuencia portadora del alelo de LPL S447X fue del 17%, y en el estado portador del hombre fue relacionado con los niveles totales de colesterol más alto (TC) (\Delta = 6.2 mg/dl, p = 0.03), HDL-C más alto (\Delta = 2,3 mg/dl, p = 0.01) y triglicérido inferior (TG) (\Delta = -19.4 mg/dl, p = 0.02). Además, en los hombres el alelo de LPL S447X confirió protección significante contra CHD (proporción de desigualdad: 0,43. p = 0.04).

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra la utilidad de la LPL S447X terapéutica en un modelo alternativo de enfermedad humana. El modelo animal empleado fue el modelo de ratón Knockout completamente deficitario de (-/-) ApoE. El efecto terapéutico de un serotipo 5 de adenovirus que contiene un gen de LPL S447X según el control del promotor CMV (virus Ad-447) fue comparado con el efecto terapéutico de un adenovirus que contiene LPL de tipo salvaje (Ad-LPL), al igual que a una fosfatasa alcalina de control (AP) conteniendo adenovirus (Ad-AP).

La inyección intravenosa en la vena de la cola de 5x10^{8} Pfu de Ad-447 o Ad-LPL tipo salvaje resultó en una gran reducción de los niveles de TG en el plasma y un gran aumento en la actividad LPL y en los niveles de masa de proteína en el plasma postheparina, en comparación con los ratones Ad-AP inyectados con control, revelando la eficacia sorprendente de la LPL S447X terapéutica en terapias alternativas que implican modulación de la actividad o masa de LPL.

TABLA 2

2

La Tabla 2 ilustra las medidas de LPL y de lípidos 3 días después de la administración de 5x10^{8} Pfu de Ad-LPL, Ad-447 o fosfatasa alcalina de control a ratones deficitarios de ApoE. De acuerdo con los datos obtenidos en ratones heterocigotos deficitarios de LPL, los triglicéridos del plasma fueron disminuidos mientras que la actividad LPL y los niveles de masa proteínica fueron aumentados en ratones que recibieron Ad-LPL o Ad-447, con Ad-447 proporcionando comparativamente una mayor reducción de TG, mayor actividad LPL y una intensificación de masa de LPL muy significante.

Un protocolo ejemplar para evaluar el efecto de entrega intravenosa e intramuscular de una LPL S447X terapéutica en un modelo de enfermedad animal son los siguientes. Un serotipo 5 de adenovirus que contiene un gen de LPL S447X según el control del promotor CMV (Ad-447) puede ser comparado con los efectos de una LPL tipo salvaje conteniendo adenovirus, Ad-LPL. El modelo animal puede ser el modelo de ratón knockout +/- LPL (Coleman et al., 1995, The Journal of Biological Chemistry 270[21], 12518-12525). Por ejemplo, una dosis total de 5x10^{8} Pfu puede ser diluida en 120 ul con una solución de solución salina estéril y dividida en 4 partes iguales. Un volumen de 30 ul puede ser inyectado directamente en el tibial anterior y el gastrocnemio de ambas patas de cada ratón para una dosis total de 5x10^{8} Pfu por ratón. La sangre puede ser obtenida en los días 3 y 7 post-tratamiento y las categorías musculares pueden ser aisladas 14 días post-tratamiento para el análisis del tejido.

Conclusión

Aunque varias formas de realización de la invención están descritas aquí, muchas adaptaciones y modificaciones pueden hacerse dentro del campo de la invención conforme al conocimiento común general de los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen la sustitución de equivalentes conocidos para cualquier aspecto de la invención para conseguir el mismo resultado sustancialmente de la misma manera. Gamas numéricas incluyen los números que definen la gama. En la especificación, la palabra "comprendiendo" se usa como un término indefinido, sustancialmente equivalente a la frase "incluyendo, pero no limitado a", y la palabra "comprende" tiene un significado correspondiente. La citación de referencias en la presente no debe ser interpretada como una admisión de que tales referencias representan la técnica anterior a la presente invención.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet WO 9527512 A [0004]

\bullet US 5658729 A [0005]

\bullet US 4554101 A [0018]

\bullet US 5166320 A [0058]

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<120> Terapia con la variante de LPL

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<130> BO 44950 EP

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<140> EP 00943499.4

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<141> 2000-06-23

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<150> EP 99202048.7

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<151> 1999-06-24

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<160> 4

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<170> Versión de patentIn 3.1

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<210> 1

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<211> 446

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

3

4

5

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<210> 2

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<211> 475

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

6

7

8

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<210> 3

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<211> 448

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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9

10

100

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<210> 4

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<211> 3549

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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11

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13

Claims (21)

1. Uso de una LPL S447X terapéutica para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición sensible a LPL en un sujeto, donde la LPL S447X terapéutica es seleccionada del grupo que consiste en:

a) una proteína LPL S447X que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada, y donde la proteína LPL S447X carece de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 447 y 448 de SEC ID NO:3 cuando están óptimamente alineados;

b) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína LPL S447X tal y como se define en a); y,

c) un ácido nucleico de LPL S447X que codifica la proteína de LPL S447X tal y como se define en a); y,

donde la condición sensible a LPL es seleccionada del grupo que consiste en: deficiencia de LPL completa, quilomicronemia, hiperlipidemia, deficiencia de LPL parcial, pancreatitis, hipertrigliceridemia, hipoalfalipoproteinemia (colesterol HDL bajo), enfermedad cardiovascular, cardiopatía coronaria, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina de pecho, hipertensión, enfermedad cerebrovascular, restenosis coronaria, enfermedad periférica vascular, diabetes, caquexia y obesidad.

2. Uso de una LPL S447X terapéutica según la reivindicación 1, donde la proteína LPL S447X tiene actividad LPL mayor que una LPL tipo salvaje de la SEC ID NO:3.

3. Uso de la LPL S447X terapéutica según la reivindicación 1 o 2, donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que codifica un ARN que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia a los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

4. Uso de la LPL S447X terapéutica según la reivindicación 1 o 2, donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que se hibrida bajo condiciones astringentes a los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

5. Uso de la LPL S447X terapéutica según la reivindicación 1 o 2, donde la LPL S447X terapéutica es la proteína LPL S447X, donde la LPL S447X tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% identidad de secuencia con la SEC ID NO:1.

6. Uso de la LPL S447X terapéutica según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y la composición farmacéutica comprende un vector de terapia genética.

7. Uso de la LPL S447X terapéutica según la reivindicación 6, donde el vector de terapia genética comprende un vector vírico.

8. Uso de la LPL S447X terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el sujeto es un humano.

9. LPL S447X terapéutica para el uso como una sustancia activa farmacéutica, donde la LPL S447X terapéutica es seleccionada del grupo que consiste en:

a) una proteína LPL S447X que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada, y donde la proteína LPL S447X carece de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 447 y 448 de SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada;

b) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína LPL S447X tal y como se define en a); y,

c) un ácido nucleico de LPL S447X que codifica la proteína LPL S447X tal y como se define en a).

10. LPL S447X terapéutica según la reivindicación 9, donde la proteína LPL S447X tiene actividad LPL mayor que una LPL tipo salvaje de la SEC ID NO:3.

11. LPL S447X terapéutica según la reivindicación 9 o 10, donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que codifica un ARN que tiene al menos un 90% identidad de secuencia a los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

12. LPL S447X terapéutica según la reivindicación 9 o 10, donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que se hibrida bajo condiciones astringentes a los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

13. LPL S447X terapéutica según la reivindicación 9 o 10, donde la LPL S447X terapéutica es la proteína LPL S447X, donde la proteína LPL S447X tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1.

14. LPL S447X terapéutica según la reivindicación 9, 10, 11 o 12, donde la LPL S447X terapéutica es el ácido nucleico de LPL S447X, y la composición farmacéutica comprende un vector de terapia genética.

15. LPL S447X terapéutica según la reivindicación 14, donde el vector de terapia genética comprende un vector vírico.

16. Vector de terapia genética que comprende un ácido nucleico de LPL S447X que codifica una proteína LPL S447X que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada, y donde la proteína LPL S447X carece de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 447 y 448 de la SEC ID NO:3 cuando está óptimamente alineada.

17. Vector de terapia genética según la reivindicación 16, donde la proteína LPL S447X tiene actividad LPL mayor que una LPL tipo salvaje de la SEC ID NO:3.

18. Vector de terapia genética según la reivindicación 16, donde el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que codifica un ARN que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

19. Vector de terapia genética según la reivindicación 16, donde el ácido nucleico de LPL S447X comprende una secuencia codificante de ADN que se hibrida bajo condiciones astringentes a los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:4.

20. Vector de terapia genética según la reivindicación 16, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 95% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:1.

21. Vector de terapia genética según la reivindicación 16, donde el vector de terapia genética comprende un vector vírico.