ES2311462T3 - Uso de citocinas y mitogenos para inhibir las respuestas inmunes patologicas. - Google Patents

Abstract

Uso de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las cuales se han obtenido de un paciente con un trastorno autoinmune mediado por células, y se han tratado con una composición reguladora que comprende TGF-Beta, para la preparación de un medicamento para tratar dicho trastorno autoinmune mediado por células en dicho paciente.

Description

Uso de citocinas y mitógenos para inhibir las respuestas inmunes patológicas.

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere de forma general al uso de medicamentos para tratar trastornos autoinmunes mediados por células.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades autoinmunes están causadas por la incapacidad del sistema inmune para distinguir lo propio de lo ajeno. En estas enfermedades, el sistema inmune reacciona contra los propios tejidos, y esta respuesta, en último lugar, causa la inflamación y lesión del tejido. Las enfermedades autoinmunes pueden clasificarse en dos categorías básicas: enfermedades mediadas por anticuerpos, tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE), el pénfigo vulgar, la miastenia gravis, la anemia hemolítica, la trombocitopenia púrpura, la enfermedad de Grave, la enfermedad de Sjogren, y la dermatomiositis; y las enfermedades mediadas por células, tales como la enfermedad de Hashimoto, la polimiositis, la enfermedad inflamatoria intestinal, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus, la artritis reumatoide, y la esclerodermia.

En muchas enfermedades autoinmunes, la lesión del tejido está causada por la producción de anticuerpos contra el tejido nativo. Estos anticuerpos se denominan autoanticuerpos, puesto que son producidos por un mamífero y tienen sitios de unión en el propio tejido del mamífero. Algunos de estos trastornos tienen altibajos característicos en la cantidad de anticuerpos circulantes, causando síntomas variables a lo largo del tiempo.

De los diferentes tipos de trastornos autoinmunes mediados por anticuerpos, el SLE es un trastorno que se ha estudiado y documentado correctamente. El SLE es un trastorno de autoinmunidad generalizada caracterizado por la hiperactividad de las células B, con numerosos anticuerpos contra antígenos nucleares, citoplásmicos, y de la superficie celular. Esta enfermedad autoinmune tiene una patogénesis multifactorial, con factores desencadenantes genéticos y medioambientales (revisada en Hahn, B.H., Dubois' Lupus Erythematosus, 5ª edición (1997), pp. 69-76 (editores D.J. Wallace et al., Williams and Wilkins, Baltimore)). Entre los numerosos defectos de los linfocitos descritos en el SLE, hay un fallo de la células T reguladores para inhibir la función de la células B (Horwitz, D.A., Dubois' Lupus Erythematosus, 5ª edición (1997), pp. 155-194 (editores D.J. Wallace et al., Williams and Wilkins, Baltimore). La producción sostenida de IgG policlonal y autoanticuerpos in vitro requiere la ayuda de las células T (Shivakumar, S. et al. (1989), J. Immunol. 143:103-112).

Las células T reguladoras pueden regular a la baja la síntesis de anticuerpos mediante mecanismos líticos o mediados por citocinas. Estos últimos implican el factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta) y otras citocinas inhibidoras (Wahl, S.M. (1994), J. Exp. Med. 180:1587-190). Los linfocitos B circulantes que de forma espontánea secretan anticuerpos están incrementados en los pacientes con SLE activo (Klinman, D.M. et al. (1991), Arthritis Rheum. 34:1404-1410).

Las manifestaciones clínicas del SLE incluyen un sarpullido (especialmente en la cara, en una distribución "en mariposa"), la glomerulonefritis, la pleuritis, la pericarditis y la implicación del sistema nervioso central. La mayoría de los pacientes son mujeres, y son relativamente jóvenes (la edad promedio de diagnóstico es de 29 años).

El tratamiento del SLE depende de las manifestaciones clínicas. Algunos pacientes con síntomas clínicos suaves responden a medidas simples como los agentes antiinflamatorios no esteroideos. Sin embargo, los síntomas más graves habitualmente requieren esteroides con una potente acción antiinflamatoria e inmunosupresora, tales como la prednisona. Otros fármacos inmunosupresores potentes que pueden usarse son la azatioprina y la ciclofosfamida. Los esteroides y otros fármacos inmunosupresores tienen efectos secundarios debido a la reducción global del sistema inmune del mamífero. No hay un tratamiento ideal para el SLE y la enfermedad no puede curarse.

Actualmente se ha centrado una considerable atención en la identidad de los genes que potencian la susceptibilidad o resistencia al SLE, la identificación de determinantes antigénicos que activan la enfermedad, el mecanismo molecular de la activación de las células T que resulta en su supervivencia o apoptosis, las citocinas que determinan la función de las células T, y las propiedades de las células B formadoras de autoanticuerpos. Se han descrito muchos ejemplos de desregulación de la células T en el SLE (revisado en Horwitz, D.A. et al., Dubois' Lupus Erythematosus, 5ª edición (1997), pp. 83-96 (editores D.J. Wallace et al., Williams and Wilkins, Baltimore). Aunque está claramente reconocido que el papel principal de ciertos linfocitos es desregular las respuestas inmunes, los progresos en la elucidación de la identidad y mecanismos requeridos para la generación de estas células han sido lentos.

Previamente, se ha considerado que la interleucina-2 (IL-2) desempeñaba un papel importante en la generación de células T supresoras no específicas para antígeno. Los anticuerpos anti-IL-2, administrados a ratones coincidiendo con la inducción de la enfermedad de injerto contra huésped, resultaron en varias características del SLE (Via, C.S. et al. (1993), International Immunol. 5:565-572). Si la IL-2 es directa o indirectamente importante en la generación de la supresión ha sido un tema controvertido (Fast, L.D. (1992), J. Immunol. 149:1510-1515; Hirohata, S. et al. (1989), J. Immunol. 142:3104-3112; Baylor, C.E. (1992), Advances Exp. Mol. Biol. 319:125-135). Recientemente, se ha mostrado que la IL-2 induce a las células CD8+ a suprimir la replicación el VIH en células CD4+ T mediante un mecanismo no lítico. Este efecto está mediado por citocina, por la citocina específica no se ha identificado (Kinter, A.L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10985-10989; Barker, T.D. et al. (1996), J. Immunol. 156:4478-4483). La producción de IL-2 por parte de células T está disminuida en el SLE (Horwitz, D.A. et al. (1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5ª edición (1997), pp. 83-96 (editores D.J. Wallace et al., Williams and Wilkins, Baltimore).

Las células T CD8+ procedentes de sujetos con el SLE, en vez de suprimir, mantienen la producción de IgG policlonal (Linker Israeli, M. et al. (1990), Arthritis Rheum. 33:1216-1225). Las células T CD8+ procedentes de donantes sanos puede estimularse para potenciar la producción de anticuerpos (Takahashi, T. et al. (1991), Clin. Immunol. Immunopath. 58:352-365). Sin embargo, no se halló que la IL-2 o las células T CD4+, por sí mismas, indujeran las células T CD8+ a desarrollar un actividad supresora intensa. Cuando se incluyeron células NK en los cultivos, apareció una intensa actividad supresora (Gray, J.D. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1937-1942). Se cree que la contribución de las células NK en el cultivo fue producir factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta) en su forma activa. Se descubrió entonces que concentraciones no inmunosupresoras (2-10 pg/ml) de esta citocina servían como un cofactor para la generación de efectos supresores intensos sobre la producción de IgG e IgM (Gray, J.D. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1937-1942). Además, se cree que las células NK son la fuente principal de TGF-\beta en los linfocitos no estimulados (Gray, J.D. et al. (1998), J. Immunol. 160: 2248-2254).

Los TGF-\beta son una familia multifuncional de citocinas importantes en la reparación de tejidos, en la inflamación y en la inmunoregulación (Massague, J. (1980), Ann. Rev. Cell Biol. 6:597). El TGF-\beta es diferente de la mayoría de las otras citocinas en que la proteína liberada es biológicamente inactiva e incapaz de unirse a receptores específicos (Spom, M.B. et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 1039-1045). El complejo latente se corta extracelularmente para liberar la citocina activa, como se discute más abajo. La respuesta al TGF-\beta requiere la interacción de dos receptores de superficie (el TGF-\beta-R1 y el TGF-\beta-R2), los cuales se hallan de forma ubicua sobre las células mononucleares (Massague, J. (1992), Cell 69:1067-1070). Por tanto, la conversión del TGF-\beta latente a activo es el paso crítico que determina los efectos biológicos de esta citocina.

Se halló que los pacientes de SLE tienen una producción disminuida de TGF-\beta1 por parte de las células NK. En un estudio de 38 pacientes de SLE se documentaron los defectos en el TGF-\beta constitutivo producido por las células NK, así como en el TGF-\beta inducido (Ohtsuka, K. et al. (1998), J. Immunol. 160:2539-2545). Ni la adición de IL-2 o TNF-alfa recombinantes, ni el antagonismo de la IL-10, normalizaron el defecto de TGF-\beta en el SLE. La producción disminuida de TGF-\beta en SLE no se correlacionó con la actividad de la enfermedad y, por tanto, podría ser un defecto primario.

Han et al ((1996, J. Autoimmunity, 9:331-339) describe que una clon de células T CD4+ autoreactivas, aislado a partir de ratones NOD diabéticos, secreta TGF-\beta.

La administración sistémica de TGF-\beta, IL-2, o de una combinación de ambas puede conducir a serios efectos secundarios. Estas citocinas tienen numerosos efectos sobre diferentes tejidos del cuerpo y no es muy seguro suministrarlas sistémicamente a un paciente. Por consiguiente, es un objeto de la invención proporcionar procedimientos y equipos para tratar células de mamífero que son responsables de controlar la regulación de los autoanticuerpos, para incrementar la población de células que regulan a la baja la producción de autoanticuerpos.

En consecuencia, la presente invención proporciona el uso de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las cuales se han obtenido de un paciente con un trastorno autoinmune mediado por células, y se han tratado con una composición reguladora que comprende TGF-\beta, para la preparación de un medicamento para tratar dicho trastorno autoinmune mediado por células en dicho paciente.

Por tanto, la presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades autoinmunes mediadas por células. El uso médico implica extraer células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente, y tratar las células con una composición reguladora, durante un tiempo suficiente para suprimir la lesión del tejido por parte de células inmunitarias. Las células tratadas, se reintroducen a continuación en el paciente, con una mejora resultante de los síntomas autoinmunes. La composición reguladora comprende TGF-\beta y agentes que permiten a las células T responder al TGF-\beta.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 ilustra los efectos del TGF-\beta sobre la producción en células de T de TNF-\alpha e IL-10. Las células T purificadas (1 \times 10^{5} células/pocillo), en medio AIM.V sin suero, se añadieron a micropocillos de fondo plano, y se estimularon con una dosis baja (0,5 \mug/ml) o una dosis elevada (5 \mug/ml) de Con A, con o sin IL-2 (10 U/ml), en presencia o ausencia de TGF-\beta (1 ng/ml). Se recogieron los sobrenadantes a los 2 días y a los 5 días, y se ensayó la presencia de TNF-\alpha y IL-10 mediante ELISA. La producción máxima de TGF-\beta se halló a los 2 días, y para IL-10 a los 5 días. El TGF-\beta suprimió la producción de IL-10 y reguló al alza la producción de TNF-\alpha.

La Figura 2 muestra que el TNF-\alpha es un intermedio esencial para la generación de células T reguladoras por el TGF-\beta. Se incubaron células CD8+ durante la noche con Con A (2,5 \mug/ml), IL-2 (10 U) y TGF-\beta (10 pg/ml). Después de lavarlas, estas células se añadieron a células B CD4+ y se estimularon con anti-CD2. En algunos pocillos se incluyó anticuerpo anti-TNF-\alpha (10 \mug/ml) o anticuerpo control del mismo isotipo (10 \mug/ml). Transcurridos 7 días, los sobrenadantes se evaluaron por su contenido en IgG mediante un ELISA. La actividad reguladora de las células CD8+ fue revocada por el anti-TNF-\alpha.

La Figura 3 ilustra que la producción potenciada de citocinas Th1 por parte de células T cebadas con TGF-\beta es dependiente del TNF-\alpha. Se cultivaron células T nativas purificadas con Con A (5 \mug/ml) e IL-2 (10 U/ml) en presencia de TGF-\beta (1 ng/ml). Algunas células también recibieron anticuerpo neutralizador anti-TNF-\alpha (10 \mug/ml) o un anticuerpo control del mismo isotipo (10 \mug/ml). Después de 5 días de cultivo, las células se lavaron y sembraron de nuevo a 1 \times 10^{5} células/ml en medio reciente. Al día siguiente se estimularon de nuevo con Con A e IL-2 durante 6 horas y, en presencia de brefeldina A (10 \mug/ml), se tiñeron las células para CD8 y las citocinas indicadas. Se muestra el porcentaje de células CD8+ y CD8- que expresaban TNF-\alpha, IL-2 e IFN-\gamma. Hay que destacar que la neutralización del TNF-\alpha en cultivos primarios suprimió los efectos potenciadores del TGF-\beta sobre la producción de citocinas Th1.

La Figura 4 ilustra el efecto del TGF-\beta sobre la generación de supresores de la actividad citotóxica de las células T. Las células T procedentes del donante A, preparadas mediante el ensayo de la roseta E, se dividieron en dos porciones. Una porción se usó como respondedoras para una reacción de linfocitos mixtos alogénicos (alloMLR). La otra porción se usó para preparar los subgrupos indicados de células T mediante selección negativa, después de teñir las células con anticuerpos monoclonales apropiados y eliminar las células teñidas usando cuentas inmunomagnéticas. Las células T respondedoras se mezclaron con células T estimuladoras procedentes del donante B (células mononucleares de sangre periférica, empobrecidas en células T, e irradiadas) y se cultivaron durante 5 días para generar células asesinas. Los controles consistían en los subgrupos de células T cultivadas durante 5 días con o sin células estimuladoras. A continuación, se lavaron las células, se contaron, y se usaron para ensayar la actividad de las células T alocitotóxicas. Las células respondedoras procedentes del donante A se mezclaron con linfoblastos marcados con cromo procedentes del donante B en las proporciones efectora-a-diana mostradas, y se midió la liberación de cromo en un ensayo estándar de 4 horas (cuadrados blancos). Los subgrupos de células T cultivadas con estimuladores se añadieron en una proporción de 1 célula reguladora por cada 4 células respondedoras (círculos blancos). Los subgrupos de células T cultivadas con estimuladores con TGF-beta se muestran como círculos negros. En todos los experimentos, los efectos máximos del TGF-beta fueron sobre las células CD4 CD45RA+ y CD45RO- indiferenciadas.

La Figura 5 ilustra el efecto de las células CD4 cebadas con TGF-beta sobre la actividad de los linfocitos T alocitotóxicos (CTL). La adición de células CD4 CD45RA que se habían cultivado durante 5 días sin estimuladores no tuvo efecto alguno sobre la actividad de los CTL (no se muestran los resultados). El cultivo de estas células T con células estimuladoras resultó en una actividad supresora de modesta a moderada. En todos los experimentos, el cultivo de estas células T con TGF-beta (1 ng/ml) suprimió destacadamente, o abolió la actividad de los alo-CTL.

La Figura 6 demuestra que las células T reguladoras requieren el contacto celular para inhibir la actividad de los CTL. Las células 4 reguladoras se prepararon a partir de células CD4 CD45RA cultivadas con TGF-beta según se describió más arriba. Algunas de estas células se mezclaron con células respondedoras y células diana marcadas con cromo, mientras que otras se separaron de las células asesinas mediante una membrana. La inhibición de la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL) sólo se observó cuando las células reguladoras estaban en contacto directo con las células asesinas.

La Figura 7 ilustra la supresión de la proliferación de los linfocitos por parte de células T CD4+ reguladoras inducidas con TGF-\beta. Se mezclaron células T CD4+ indiferenciadas procedentes del donante A con células estimuladores según se describió más arriba, y se añadieron a células respondedoras y estimuladoras recientes en las proporciones indicadas. Las barras muestran la captación de timidina tritiada \pm SEM después de 7 días de cultivo. La barra ligeramente sombreada (Nil) indica la respuesta proliferativa de las células T respondedoras sin células CD4+ añadidas. La barra sombreada más oscura indica el efecto de las células CD4+ control que se habían cultivado con células estimuladoras sin TGF-\beta. La barra negra indica el efecto de las células CD4+ que se habían mezclado con células estimuladores en presencia de TGF-\beta (1 ng/ml). Se muestra el efecto de estas células CD4+ sobre la respuesta proliferativa de células respondedoras recientes añadidas a células estimuladoras irradiadas después de 7 días de cultivo. Las barras indican la captación media de timidina tritiada.

La Figura 8 ilustra la actividad reguladora de las células T CD4 CD25+. Las células CD4+ se estimularon con células alogénicas, que no eran células T, \pm TGF-\beta (1 ng/ml) durante 5 días. Después del lavado, se tiñeron las células CD4+ con DII, y las células T respondedoras recientes se tiñeron con carboxifluoresceína. Se añadieron células CD4+ control o cebadas con TGF-\beta a las células T respondedoras y a las células aloestimuladoras en una proporción 1:4. Transcurridos 5 días, se recolectaron las células y se analizaron mediante citometría de flujo. La intensidad de la CFSE en las células CD8+ se determinó sincronizando con las células negativas para DII. Hay que destacar que la adición de células CD4+ cebadas con TGF-\beta a las células T respondedoras disminuyó destacadamente la división celular por células CD8+.

La Figura 9 ilustra que las células CD4+ reguladoras expresan receptores para el CD25+ (IL-2) sobre su superficie. Las células T reguladoras control e inducidas con TGF-\beta se prepararon tal y como se describió más arriba. Después de condicionarlas con células aloestimuladoras y TGF-\beta, las células CD4+ se dividieron en los subgrupos CD25+ y CD25- mediante clasificación celular, y se añadieron a células T respondedoras recientes y a células estimuladoras irradiadas. Se muestra la capacidad de estas células respondedoras para matar linfoblastos T estimuladores en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 horas.

En la Figura 9A los cuadrados blancos muestran la actividad de los CTL sin células CD4+ adicionales. Las células T reguladoras control o inducidas con TGF-\beta se añadieron en una proporción 1:4 con las células respondedoras. Los círculos blancos muestran que las células CD4+ control no alteraron la actividad de los CTL. Los círculos negros muestran que las células CD4+ inducidas con TGF-\beta suprimieron casi completamente la actividad de los CTL. Los rombos negros muestran que la actividad supresora estaba contenida exclusivamente en el subgrupo CD25+. El subgrupo CD25- (cuadrados negros) no tenía actividad supresora alguna.

La Figura 9B muestra el efecto de disminuir el número de células CD4+ reguladoras añadidas al MLR. La disminución del número hasta sólo un 3% tuvo un efecto mínimo sobre la disminución de los efectos supresores.

La Figura 10 ilustra que la estimulación repetida de las células T con una dosis baja de enterotoxina B de estafilococo (SEB) induce las células T a producir niveles inmunosupresores de TGF-\beta. Se estimularon células T CD4+ con SEB (0,01 ng/ml) y con células B irradiadas, como células presentadoras de superantígeno, con o sin TGF-\beta, en los instantes indicados por las flechas. El TGF-\beta activo se midió 2 ó 5 días más tarde.

La Figura 11 ilustra que la estimulación repetida de las células T CD4+ con una dosis baja de SEB, permite a estas células producir niveles inmunosupresores de TGF-\beta. Se estimularon células T CD4+ con SEB (0,01 ng/ml) y con células B irradiadas, como células presentadoras de superantígeno, con o sin TGF-\beta, en los instantes indicados por las flechas. El TGF-\beta activo se midió 2 ó 5 días más tarde.

La Figura 12 muestra los efectos de la SEB sobre células T CD4+ y CD8+ (CD45RA+ y CD45RO-) indiferenciadas. Las células se estimularon con SEB cada 5 días durante un total de tres estimulaciones. Después de cadas estimulación se determinó el porcentaje de cada subgrupo de células T y de las células que expresaban el marcador de activación del receptor IL2 de CD25. Los recuadros A y C muestran que si el TGF-\beta (1 ng/ml) se incluía en la estimulación inicial, las células T CD4+ pasaban a ser el subgrupo predominante en los cultivos después de la estimulación repetida. Los recuadros B y D muestran que la expresión del CD25 por parte de células estimuladas con SEB disminuye hacia la tercera estimulación en los cultivos control. Sin embargo, la expresión del CD25 permanece elevada si las células T se han cebado con TGF-\beta.

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Descripción detallada

Las composiciones empleadas en los usos médicos descritos en la presente invención potencian las respuestas inmunes mediadas por células, respuestas que son frecuentemente defectuosas en los pacientes con trastornos autoinmunes mediados por células; es decir, los paciente con trastornos autoinmunes mediados por células pueden tratarse para mejorar sus síntomas medidos por células defectuosas.

Alternativamente, las composiciones se usan para tratar una enfermedad autoinmune mediada por células. En esta realización, las composiciones inducen las células inmunes a generar células T supresoras. Estas células T supresora impiden que otras células T se conviertan en citotóxicas y ataquen las células y el tejido de un individuo afectado. Por tanto, la composición disminuye la citotoxicidas y de ese modo mejora los síntomas de los trastornos autoinmunes mediados por células.

Esta estrategia es diferente de casi todos las otras modalidades de tratamiento actualmente en uso, las cuales son antiinflamatorias o inmunosupresoras. Los corticosteroides comúnmente usados suprimen la producción de citocina y bloquean los sucesos terminales que causan la lesión del tejido, pero generalmente no alteran la respuesta autoinmune subyacente. Los fármacos citotóxicos o los compuestos biológicos experimentales diseñados genéticamente, tales como los anticuerpos monoclonales, pueden empobrecer también ciertas poblaciones de linfocitos o interferir con su función. Generalmente, estos fármacos son sólo moderadamente exitosos y tienen graves efectos secundarios perjudiciales. Ciertas citocinas se han administrado sistémicamente a pacientes, pero estos agentes también tienen acciones amplias con graves efectos secundarios perjudiciales asociados.

Por contra, la estrategia de la presente invención es producir la remisión restaurando la función celular reguladora normal y, por tanto, "reseteando" el sistema inmunitario. Otra ventaja potencial significativa de esta estrategia es una baja probabilidad de efectos secundarios perjudiciales serios. Puesto que sólo se devolverán al paciente cantidades traza de composiciones reguladores, tales como las citocinas, debería haber una toxicidad mínima.

Los linfocitos B circulantes que espontáneamente secretan IgG están incrementados en los pacientes con SLE activo (Blaese, R.M., et al. (1980), Am J. Med 69:345-350; Klinman, D.M. et al. (1991), Arthritis Rheum. 34:1404-1410). La producción sostenida de IgG policlonal y autoanticuerpos in vitro requiere la ayuda de las células T (Shivakumar, S. et al. (1989), J. Immunol. 143:103-112). Estudios previos de la regulación por parte de células T de la producción espontánea de IgG muestran que, mientras que las células T CD8+ inhiben la producción de anticuerpos en individuos sanos, en el SLE estas células respaldan en cambio la función de las células B (Linker-Israeli, M. et al. (1990), Arthritis Rheum 33: 1216-1225). En otras enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple, las células T y no el anticuerpo son las responsable del daño del tejido y de la inflamación resultante (Panayi GS, et al. Arthritis Rheum (1992) 35:725-773), Allegretta M et al. Science (1990) 247:718-
722.

En consecuencia, en una realización preferida, la presente invención se refiere a tratar enfermedades autoinmunes mediadas por células, lo que comprende extraer células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente con la enfermedad autoinmune, y tratar algunas de estas células con una composición reguladora.

Sin estar atados por la teoría, parece ser que hay varias formas en las que pueden funcionar los procedimientos de la invención. En primer lugar, el tratamiento de las células con una composición regulador conduce a la supresión directa de la producción de anticuerpo en las células tratadas, lo que puede conducir a la mejora de los síntomas autoinmunes mediados por anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el tratamiento de las células induce las células reguladoras a regular a la baja la producción de anticuerpos en otras células. Anticuerpo en este contexto incluye todas las formas de anticuerpo, incluyendo el las IgA, IgM. IgG, IgE, etcétera. El resultado neto es una disminución en la cantidad de anticuerpo en el sistema.

Adicionalmente, el tratamiento de las células potencia las respuestas inmunes mediadas por células en pacientes con síntomas autoinmunes mediados por anticuerpo. Sin estar atados por la teoría, parece ser que el tratamiento de las células restaura el equilibrio entre la IL-10 y el TNF-\alpha, lo que conduce a una producción potenciada de citocinas Th1 y a una normalización de la inmunidad mediada por células.

Más aún, la estimulación de las células inmunes con composiciones reguladores que incluyen el TGF-\beta puede suprimir las respuestas inmunes mediadas por células. Sin estar atados por la teoría, parece ser que las células T CD4+ pueden estimularse para producir niveles inmunosupresores de TGF-\beta activo, que suprime entonces las respuestas inmunes mediadas por células. Alternativamente, las células T CD4+ pueden estimularse, para suprimir las funciones de activación y/o efectoras de otras células T, mediante un mecanismo de acción dependiente de contacto. Estos efectos requieren que las células CD4+ se activen en presencia de TGF-\beta.

Por tanto, la presente invención inhibe las respuestas inmunes aberrantes. En los pacientes con trastornos autoinmunes mediados por anticuerpo, la presente invención restablece la capacidad de las células T de sangre periférica para regular a la baja la producción de anticuerpos, y restablece las respuestas inmunitarias mediadas por células tratándolas con una composición reguladora ex vivo. En los pacientes con trastornos mediados por células, la presente invención genera células T reguladora que suprimen la actividad de las células T citotóxica en otras células T.

En la presente invención, por "respuesta inmune" se quiere indicar respuestas del huésped contra antígenos ajenos o propios. En la presente invención, por "respuestas inmunes aberrantes" se quiere indicar la incapacidad del sistema inmune para distinguir los propio de los ajeno, o la incapacidad para responder a antígenos ajenos. Dicho de otro modo, las respuestas inmunes aberrantes son respuestas inmunes inapropiadamente reguladas que conducen a los síntomas del paciente. En la presente invención, por "inapropiadamente reguladas" se quiere indicar inapropiadamente inducida, inapropiadamente suprimida, y/o sin respuesta. Las respuestas inmunes aberrantes incluyen, pero no se limitan a la lesión del tejido y a la inflamación causadas por la producción de anticuerpos contra el propio tejido de un organismo, la producción dañada de IL-2, TNF-\alpha e IFN-\gamma, y el daño del tejido causado por mecanismos de acción citotóxicos o no citotóxicos.

En la presente invención, por "defectos en la respuesta inmune mediada por células" se quiere indicar una defensa del huésped dañada contra una infección. La defensa dañada del huésped contra la infección incluye, pero no se limita a, la hipersensibilidad retrasada dañada, la citotoxicidad dañada de las células T, y la producción dañada de TGF-\beta. Otros defectos, incluyen, pero no se limitan a, producción incrementada de IL-10 y producción disminuida de IL-2, TNF-\alpha y IFN-\gamma. Usando los procedimientos de la presente invención, las células T purificadas se estimulan para incrementar la producción de IL-2, TNF-\alpha e IFN-\gamma, y para disminuir la producción de IL-10. Las células T que pueden estimularse usando los procedimientos actuales incluyen, pero no se limitan, las CD4+ y CD8+.

La presente invención proporciona procedimientos para tratar los trastornos autoinmunes mediados por células en un paciente. En la presente invención, por "enfermedad autoinmune mediada por células" se quiere indicar una enfermedad en la cual las células de un individuo se activan o estimulan para convertirse en citotóxicas y atacar sus propias células o tejidos. Alternativamente, las células autoinmunes del individuo pueden estimular otras células a causar el daño del tejido mediante mecanismos de acción citotóxicos o no citotóxicos. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Hashimoto, la polimiositis, la enfermedad inflamatoria intestinal, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus, la artritis reumatoide, y la esclerodermia.

En la presente invención, por "tratar" un trastorno autoinmune se quiere indicar que al menos un síntoma del trastorno autoinmune se mejora mediante los procedimientos esbozados en la presente invención. Esto puede evaluarse de un cierto número de formas, incluyendo tanto los factores objetivos como los subjetivos por parte del paciente. Por ejemplo, pueden evaluarse las manifestaciones inmunológicas de la enfermedad, por ejemplo, el nivel de anticuerpos espontáneos y la producción de autoanticuerpos, particularmente, en el caso del SLE la producción de IgG está reducida. Pueden medirse los niveles de anticuerpo total, o los de autoanticuerpos, incluyendo, pero no limitándose, a los anticuerpos anti-ADN de doble hebra (ds ADN), los anticuerpos anti-nucleoproteínas, anti-SM, anti-Rho, y anti-La. La actividad citotóxica puede evaluarse como se esboza en la presente invención. Los síntomas físicos pueden estar alterados, tales como la desaparición o reducción en el sarpullido en el SLE. Pueden realizarse ensayos de la función renal para determinar alteraciones; puede evaluarse la evidencia en laboratorio de daño del tejido relacionado con la inflamación. Los niveles disminuidos de complejos inmunes circulantes y los niveles de complemento en el suero son una evidencia adicional de mejora. En el caso del SLE, puede observase una mejora de la anemia. La capacidad para disminuir los fármacos de otro modo necesarios para el paciente, tales como los inmunosupresores, puede ser también una indicación de tratamiento exitoso. Otras evaluaciones de tratamiento exitoso serán evidentes para los especialistas en el campo de la enfermedad autoinmune concreta.

En la presente invención, por "paciente" se quiere indicar un sujeto mamífero a tratar, siendo los preferidos los pacientes humanos. En algunos casos, los procedimientos de la invención hallan uso en animales de experimentación, en aplicaciones veterinarias, y en el desarrollo de modelos animales de la enfermedad, incluyendo, pero no limitándose a, roedores, incluyendo ratones, rata y hámsteres; y primates.

Los procedimientos proporcionar la extracción de las células sanguíneas de un paciente. En general, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se extraen de un paciente usando técnicas estándares. En la presente invención, por "células mononucleares de sangre periférica" o "PBMC" se quiere indicar linfocitos (incluyendo las células T, las células B, las células NK, etcétera) y los monocitos. Tal y como se esboza más detalladamente más abajo, parece ser que, en una realización, el principal efecto de la composición reguladora es capacitar a los linfocitos T CD8+ o CD4+ suprimir las respuestas autoinmunes dañinas. En consecuencia, la población de PBMC debería comprender las células T CD8+ T. Preferiblemente, sólo se toman las PBMC, bien dejando o devolviendo al paciente sustancialmente la totalidad de los glóbulos rojos y los leucocitos polimorfonucleares. Esto se realiza como es conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, usando técnicas de leucoforesis. En general, se realiza un paso de leucoforesis de 5 a 7 litros, el cual esencialmente extrae las PBMC de un paciente, retornando el resto de componentes de la sangre. La recogida de las muestra de células se realiza preferiblemente en presencia de un anticoagulante tal como la heparina, como es conocido en el estado de la técnica.

En algunas realizaciones, no se requiere un paso de leucoforesis.

En general, la muestra que comprende las PBMC puede pretratarse en una amplia variedad de formas. Generalmente, una vez recolectadas, las células pueden concentrarse adicionalmente, si esto no se hizo simultáneamente con la recogida o para purificar y/o concentrar aún más las células. Las células pueden lavarse, contarse, y resuspenderse en tampón.

Las PBMC generalmente se concentran para su tratamiento usando técnicas estándares en el campo. En una realización preferida, el paso de recogida de leucoforesis resulta en una muestra concentrada de PBMC, en un Leukopak estéril, que puede contener reactivos y/o dosis de la composición reguladora, tal y como se esboza más detalladamente más abajo. Generalmente se realiza un paso adicional de concentración/purificación, tal como la centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, como es conocido en el estado de la técnica.

En una realización preferida, las PBMC se lavan a continuación para eliminar las proteínas del suero y los componentes solubles de la sangre, tales como los anticuerpos, inhibidores, etcétera, usando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Generalmente, esto implica la adición de medio fisiológico o tampón, seguida por centrifugación. Esto puede repetirse si es necesario. Pueden resuspenderse en medio fisiológico, preferiblemente medio AIM-V sin suero (Life Technologies) (puesto que el suero contiene cantidades significativas de inhibidores), aunque pueden usarse también tampones como la solución salina equilibrada de Hanks (HBBS) o la solución salina tamponada fisiológica (PBS).

Generalmente, a continuación se cuentan las células; en general se recolectan desde 1 \times 10^{9} hasta 2 \times 10^{9} leucocitos a partir de una paso de leucoforesis de 5-7 litros. Estas células se resuspenden en aproximadamente 200 ml de tampón o medio.

En una realización preferida, las PBMC puede enriquecerse en uno o más tipos celulares. Por ejemplo, las PBMC pueden enriquecerse en células T CD8+ o en células T CD4+. Esto se realiza como se conoce en el estado de la técnica, según se describe en Gray et al. (1998), J. Immunol. 160:2248. Generalmente, se lleva a cabo usando columnas inmunosorbentes disponibles comercialmente, o usando procedimientos de investigación (las PBMC se añaden a una columna de lana de nilón, y las células eluídas, no adherentes, se tratan con anticuerpos contra el CD4, CD16, CD11b y CD74, seguidos por tratamiento con cuentas inmunomagnéticas, dejando una población enriquecida en células T CD8+).

En una realización preferida, las PBMC se separan en un sistema cerrado, automatizado, tal como el sistema de selección de células Nexell Isolex 300i Magnetic Cell Selection System. Generalmente, esto se realiza para mantener la esterilidad y para garantizar la estandarización de la metodología usada para la separación de las células, su activación, y el desarrollo de la función celular supresora.

Una vez las células han experimentado cualquier tratamiento previo necesario, las células se tratan con una composición reguladora. En la presente invención, por "tratado" se quiere significar que las células se incuban con la composición reguladora durante un período de tiempo suficiente para desarrollar la capacidad de inhibir las respuestas inmunes, incluyendo la producción de anticuerpos y autoanticuerpos, particularmente cuando se transfieren de vuelta al paciente. La incubación generalmente se realizará a temperatura fisiológica. Como se ha destacado más arriba, esto puede suceder a resultas de la supresión directa de la producción de anticuerpo por parte de las células tratadas, o induciendo las células reguladoras a regular a la baja la producción de anticuerpo en los pacientes con órganos linfoides.

En la presente invención, por "composición reguladora" o "composición inhibidora de la producción de anticuerpo" o "composición inhibidora humoral" o "inhibidor de célula inmune no específica" o " inhibidor de célula T específica" o "composición inhibidora" o "composición supresora" se quiere indicar una composición que puede causar la supresión de las respuestas inmunes, incluyendo la inhibición de la activación de las células T, la inhibición de la producción espontánea de anticuerpos y autoanticuerpos, o de la citotoxicidad, o de ambas. Generalmente, estas composiciones son citocinas. Las composiciones reguladoras apropiadas incluyen, pero no se limitan a, los activadores de células T tales como el anti-CD2, incluyendo los anticuerpos anti-CD2 y el ligando de CD2, el LFA-3, y las mezclas o combinaciones de activadores de las células T, tales como la Concanavalina A (Con A), la enterotoxina B de estafilococo (SEB), el anti-CD3, el anti-CD28 y las citocinas tales como las IL-2, IL-4, TGF-\beta y TNF-\alpha. Una composición reguladora preferida para la supresión de anticuerpos es una mezcla que contiene un activador de células T, la IL-2 y el TGF-\beta. Una composición reguladora preferida para la supresión de la citotoxicidad es el TGF-\beta.

La concentración de la composición reguladora variará con la identidad de la composición. En una realización preferida, el TFG-\beta es un componente de la composición reguladora. En la presente invención, por "factor de crecimiento transformante-\beta" o "TGF-\beta" se quiere indicar uno cualquiera de la familia de los TGF-\beta, incluyendo las tres isoformas TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TGF\beta3: consultar Massague, J. (1980), J. Ann. Rev. Cell Biol 6:597. Los linfocitos y monocitos producen la isoforma \beta1 de esta citocina (Kehrl, J.H. et al. (1991), Int. J. Cell. Cloning 9:438-450). El TFG-\beta puede ser cualquier forma de TFG\beta que sea activa en las células de mamífero que se están tratando.

En los humanos, actualmente se prefiere el TFG-\beta recombinante. Un TGF-\beta humano preferido puede comprarse a Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA. En general, la concentración de TGF-\beta usada oscila desde aproximadamente 2 picogramos/ml de suspensión de células, hasta aproximadamente 5 nanogramos, siendo preferida desde aproximadamente 10 pg hasta aproximadamente 4 ng, y siendo especialmente preferida desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 2 ng, y siendo 1 ng/ml ideal.

En una realización preferida, en la composición reguladora se usa la IL-2. La IL-2 puede ser cualquier forma de IL-2 que sea activa en las células de mamífero que se están tratando. En los humanos, actualmente se prefiere la IL-2 recombinante. La IL-2 humana recombinante se puede comprar a Cetus, Emeryville, CA. En general, la concentración de IL-2 usada oscila desde aproximadamente 1 Unidad/ml de suspensión de células hasta aproximadamente 100 U/ml, siendo preferida con desde aproximadamente 5 U/ml hasta aproximadamente 25 U/ml, y siendo especialmente preferida 10 U/ml. En una realización preferida, IL-2 no se usa sola.

En una realización preferida, los activadores de la CD2, tales como una combinación de anticuerpos anti-CD2 mitogénicos, los cuales pueden incluir el ligando LFA-3 de la CD2, se usan como la composición reguladora. La CD2 es una glicoproteína de superficie expresada por los linfocitos T. En la presente invención, por "activadora de la CD2" se quiere significar un compuesto que iniciará la vía de señalización de la CD2. Un activador de la CD2 preferido comprende anticuerpos anti-CD2 (OKT11, American Type Culture Collection, Rockville MD; y GT2, Huets, et al., (1986) J. Immunol. 137:1420). En general, la concentración usada de activador de la CD2 será suficiente para inducir la producción de TGF-\beta. La concentración de anticuerpos anti CD2 usada oscila desde aproximadamente 1 ng/ml hasta aproximadamente 10 \mug/ml, siendo especialmente preferida con desde aproximadamente 10 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml.

En algunas realizaciones es deseable usar un mitógeno para activar las células; es decir, muchas células en fase de reposo no contienen grandes cantidades de receptores de citocinas. El uso de un mitógeno tal como la Concanavalina A o la enterotoxina B de estafilococo (SEB) puede permitir la estimulación de las células para producir receptores de citocina, lo cual, a su vez, hace más eficaces los procedimientos de la invención. Cuando se usa un mitógeno, generalmente se usa como se conoce en el estado de la técnica, se usa a concentraciones que oscilan desde 1 \mug/ml hasta aproximadamente 10 \mug/ml. Además, puede ser deseable lavar las células con componentes para eliminar el mitógeno, tal como el \alpha-metil-manósido, como es conocido en el estado de la técnica.

En una realización preferida, las células T se estimulan intensamente con mitógenos, tales como los anticuerpos anti-CD2, anti-CD3, anti-CD28 o combinaciones de anticuerpos monoclonales, o un autoantígeno específico, si se conoce, y anti-CD28 o IL-2 como un coestimulador. Para estimular las células T también se usa ConA. La presencia de TGF-\beta en la composición supresora induce las células T a desarrollar una potente actividad supresora. La estimulación repetida de las células T con o sin TGF-\beta en los cultivos secundarios puede ser necesaria para desarrollar una actividad supresora máxima.

En una realización preferida, la invención proporciona procedimientos que comprenden condicionar las células T con TGF-\beta, incluyendo, pero no limitándose a las células T CD8+ T o a las células T CD4+ T, y otros subgrupos menores de células T tales como las CD8CD4, NKT, etcétera. Estas células T impiden que otras células T se conviertan en células efectoras citotóxicas.

En una realización preferida, la invención proporciona procedimientos que comprenden condicionar células T CD4+ o CD8+ con TGF-\beta para producir niveles inmunosupresores de TGF-\beta.

En una realización preferida, la invención proporciona procedimientos que comprenden condicionar células T CD4+ o CD8+ con TGF-\beta para producir células T que suprimen mediante un mecanismo dependiente del contacto.

En una realización preferida, la invención proporciona procedimientos que comprenden tratar células T CD4+ indiferenciadas con un estimulante tal que dichas células CD4+ producen niveles inmunosupresores de TGF-\beta activo. Por "estimulante", generalmente se quiere indicar un estimulante generalizado que activa las células T, tal como el anti-CD2 o el anti-CD3.

En una realización preferida, la invención proporciona procedimientos que comprenden CD4+ T en presencia de TGF-\beta para expandir población de células CD4+.

En una realización preferida, la invención proporciona procedimiento que disminuyen la producción de IL-10 e incrementan correspondientemente la producción de TNF-\alpha.

La composición reguladora se incuba con las células durante un período de tiempo suficiente para causar un efecto. En una realización preferida, el tratamiento de las células con la composición reguladora va seguido por el trasplante inmediato de vuelta al paciente. En consecuencia, en una realización preferida, las células se incuban con la composición reguladora durante 12 horas hasta aproximadamente 7 días. Este tiempo variará con la actividad supresora deseada. Para la supresión de la producción de anticuerpos se prefieren especialmente 48 horas, y 5 días son especialmente preferidos para la supresión de la citotoxicidad.

En una realización, las células se tratan durante un período de tiempo, se lavan para eliminar la composición reguladora, y pueden reincubarse para expandir las células. Antes de su introducción al paciente, las células preferiblemente se lavan como se esboza en la presente invención para eliminar la composición reguladora. También pueden realizarse incubaciones adicionales para ensayar o evaluar, oscilando en tiempo desde unas pocas horas hasta varios días. Si es deseable la evaluación de la producción de anticuerpo antes de la introducción al paciente, las células se incubarán durante varios días para permitir que ocurra la producción de anticuerpos (o la ausencia de los
mismos).

Una vez se han tratado las células, éstas pueden evaluarse o ensayarse antes de autotrasplantarlas de nuevo al paciente. Por ejemplo, puede retirarse una muestra para realizar: ensayos de esterilidad; tinción de Gram; estudios microbiológicos; estudios LAL; estudios de micoplasma; citometría de flujo para identificar los tipos celulares; estudios funcionales, etcétera. De forma similar, estos y otros estudios de linfocitos pueden hacerse antes y después del tratamiento.

En una realización preferida, puede evaluarse la cantidad o calidad, es decir, el tipo de producción de anticuerpo. De ese modo, por ejemplo, pueden evaluarse los niveles totales de anticuerpo, o los niveles de tipos específicos de anticuerpo, por ejemplo, pueden evaluarse anticuerpos IgA, IgG, IgM, autoanticuerpos anti-DNA, anticuerpos anti-nucleoproteína (NP), etcétera. Las células T reguladoras pueden ensayarse también por su capacidad para suprimir la activación de las células T, o para impedir la citotoxicidad in vitro de las células T contra células diana específicas.

En una realización preferida, los niveles de anticuerpo, particularmente de IgG, se ensayan usando técnicas bien conocidas, incluyendo los ensayos de ELISA, según se describen en Abo et al. (1987), Clin. Exp. Immunol. 67:544 y Linker-Israeli et al. (1990), Arthritis Rheum. 33:1216. Estas técnicas pueden usarse también para detectar los niveles de anticuerpos específicos, tales como los autoanticuerpos.

En una realización preferida, el tratamiento resulta en una disminución significativa en la cantidad de IgG y autoanticuerpos producidos, siendo preferida una disminución de al menos el 10%, siendo especialmente preferida de al menos el 25%, y siendo particularmente preferida de al menos el 50%. En muchas realizaciones se observan disminuciones del 75% o superiores.

En una realización preferida, también puede ensayarse la cantidad de TGF-\beta total o activo antes del trasplante. Como se destaca en la presente invención, el TGF-\beta se sintetiza como un precursor latente que es activado de forma posterior a la traducción.

Después del tratamiento, las células se trasplantan o reintroducen de nuevo en el paciente. Generalmente, esto se realiza como es conocidos en el estado de la técnica, y usualmente comprende inyectar o introducir las células tratadas de vuelta en el paciente, a través de administración intravenosa, como será apreciado por los especialistas en el campo. Por ejemplo, las células pueden colocarse en una bolsa de infusión Fenwall de 50 ml mediante inyección, usando jeringas estériles u otros mecanismos de transferencia estériles. Las células pueden infundirse entonces inmediatamente a través de administración IV a lo largo de un período de tiempo, tal como 15 minutos, en una línea IV de flujo libre, al paciente. En algunas realizaciones, también pueden añadirse reactivos adicionales tales como tampones o
sales.

Después de reintroducir las células en el paciente, puede evaluarse el efecto del tratamiento, si se desea, tal como se esbozó más arriba de forma general. Por tanto, puede hacerse la evaluación de las manifestaciones inmunológicas de la enfermedad; por ejemplo, pueden medirse los títulos de anticuerpo total o de inmunoglobulinas específicas, los ensayos de función renal, la evaluación del daño del tejido, etcétera. También pueden realizarse los ensayos de función de las células T, tales como los números de células T, el fenotipo, el estado de activación, y la capacidad para responder a antígenos y/o mitógenos.

El tratamiento puede repetirse según se necesite o precise. Por ejemplo, el tratamiento puede realizarse una vez por semana durante un período de semanas, o múltiples veces por semana durante un período de tiempo, por ejemplo, 3-5 veces a lo largo de un período de dos semanas. Generalmente, la mejora de los síntomas de la enfermedad autoinmune persisten durante cierto período de tiempo, preferiblemente al menos meses. Con el tiempo, el paciente puede experimentar una recaída de los síntomas, momento en el que pueden repetirse los tratamientos.

En una realización preferida, la invención proporciona además equipos para la práctica de los procedimientos de la invención, es decir, la incubación de las células con las composiciones reguladoras. El equipo puede tener un cierto número de componentes. El equipo comprende un contenedor de tratamiento de células, que está adaptado para recibir células procedentes de un paciente con un trastorno autoinmune mediado por anticuerpo o mediado por células. El contenedor debería ser estéril. En algunas realizaciones, el contenedor de tratamiento de las células se usa para la recolección de las células, por ejemplo, está adaptado para conectarlo a una máquina de leucoforesis usando un puerto de entrada. En otras realizaciones, puede usarse un contenedor separado para la recolección de células.

En una realización preferida, el equipo comprende un contenedor de tratamiento de células, que está adaptado para recibir células procedentes de un paciente con un trastorno mediado por células. El equipo puede estar también adaptado para su uso en un sistema cerrado automatizado para purificar subgrupos de células T específicos, y expandirlas para su transferencia de nuevo al paciente.

La forma y composiciones del contenedor de tratamiento de las células pueden variar, como será apreciado por los especialistas en el campo. Generalmente el contenedor puede adoptar un cierto número de formas diferentes, incluyendo una bolsa flexible, similar a una bolsa de IV, o un contenedor rígido similar a un frasco de cultivo de células. Puede estar configurado para permitir la agitación. Generalmente, la composición del contenedor será cualquier material apropiado, biológicamente inerte, tal como el vidrio o plástico, incluyendo el polipropileno, el polietileno, etcétera. El contenedor para el tratamiento de células puede tener uno o más puertos de entrada o salida, para la introducción o eliminación de células, reactivos, composiciones reguladoras, etcétera. Por ejemplo, el contenedor puede comprender un puerto de muestreo para la extracción de una fracción de las células para su análisis antes de la reintroducción en el paciente. De forma similar, el contenedor puede comprender un puerto de salida para permitir la introducción de las células en el paciente; por ejemplo, el contenedor puede comprender un adaptador para su conexión a un dispositivo de IV.

El equipo comprende además al menos una dosis de una composición reguladora. En este contexto, "dosis" significa una cantidad de la composición reguladora, tal como las citocinas, que es suficiente para causar un efecto. En algunos casos, pueden incluirse múltiples dosis. En una realización, la dosis puede añadirse al contenedor de tratamiento de la célula usando un puerto; alternativamente, en una realización preferida, la dosis ya está presente en el contenedor de tratamiento de células. En una realización preferida, la dosis está en una forma liofilizada para su estabilidad, la cual puede reconstituirse usando el medio de las células, u otros reactivos.

En algunas realizaciones, el equipo puede comprender adicionalmente al menos un reactivo, incluyendo los tampones, sales, medios, proteínas, fármacos, etcétera. Por ejemplo, pueden incluirse mitógenos, anticuerpos monoclonales, y cuentas magnéticas tratadas para la separación de las células.

En algunas realizaciones, el equipo puede comprender adicionalmente instrucciones escritas para usar los equipos.

Los ejemplos siguientes sirven para describir más completamente la manera de usar la invención descrita más arriba, así como para establecer los mejores modos contemplados para llevar a cabo varios aspectos de la invención. Se entiende que estos ejemplos en modo alguno sirven para limitar el ámbito real de esta invención, sino que más bien se presentan con propósitos ilustrativos.

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Reactivos

El TGF-\beta recombinante y el anticuerpo monoclonal anti-TGF-\beta (1D11.16), una IgG1 múrida, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Bruce Pratt (Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA). La IL-10 recombinante y el anticuerpo monoclonal anti-IL-10 (JES3-19F1), y la IgG2a de rata de control, fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Satwant Narula (Schering Plough Pharmaceuticals, Kenilworth, NJ). La proteína de mieloma IgG1 múrida de control se compró a Calbiochem, San Diego, CA. La IL-2 recombinante humana se compró a Chiron, Emmeryville, CA. Los hibridomas secretores de anti-CD2, anticuerpos usados OKT11, se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville. MD y GT2 fueron generosamente proporcionados por A. Bernard, Nice, France. Otros anticuerpos incluidos: anti-CD4 (OKT4, ATCC), anti-CD8 (OKTB, ATCC: CD8, Dako, Carpenteria, CA), anti-CD11b (OKM1, ATCC), anti-CD16 (3G8), amablemente proporcionado por J. Unkeless, New York, NY); anti-CD20 (Leu 16, Becton Dickinson, San Jose, CA) y anti-CD74 (L243, ATCC).

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Aislamiento de células mononucleares de la sangre

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon a partir de sangre venosa heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Las células mononucleares se lavaron en PBS con EDTA 5 mM (Life Technologies, Grand Island, NY) para eliminar las plaquetas, las cuales son un fuente rica de TGF-\beta.

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Procedimientos de cultivo celular

Los procedimientos para los cultivos celulares se han descrito previamente (Wahl, S.M. (1994), J. Exp. Med. 180:1587-1590; Gray, J.D. et al. (1998), J. Immunol. 160:2248-2254). De forma resumida, se cultivaron 2 \times 10^{5} de PBMC en medio de cultivo AIM-V sin suero (Life Technologies) en los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos, con o sin las citocinas indicadas. Transcurridos tres días de cultivo, se lavaron las PBMC tres veces, a continuación se añadió medio nuevo sin suero. Después de 7 días adicionales a 37ºC, se recolectaron los sobrenadantes y se ensayaron la IgG total y los autoanticuerpos reactivos con nucleoproteína (NP) de timo de ternera mediante un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) en fase sólida, según se había descrito previamente (Linker-Israeli, M. et al. (1990), Arthritis Rheum. 33:1216-1225). Las lecturas de densidad óptica (OD) se transformaron en unidades/ml (U/ml) a partir de la curva estándar usando estándares positivos y negativos. Como control se usaron los sobrenadantes procedentes del cultivo de PBMC de pacientes de SLE (con títulos elevados de anticuerpos anti-NP) y de individuos normales.

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Análisis estadístico

Los datos se analizaron usando el programa Graph Pad Prism (San Diego, CA). Usamos el análisis de varianza (ANOVA) después de una transformación log de los datos, y el ensayo no paramétrico de Mann-Whitney.

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Ejemplo 1

Tratando células para normalizar la inmunidad mediada por células

Hay un desequilibrio entre la producción de IL-10 y TNF-\alpha que contribuye a la producción de anticuerpos en el SLE. Los niveles de IL-10 son excesivos, y los niveles de TNF-\alpha están disminuidos (Llorente et al., 1995, J. Exp. Med. 181:839-844) (Houssiau, F.A. et al., 1995, Lupus 4:393-395) (Ishida, H. et al., 1994, J. Exp. Med. 179:305-310) (Jacob, C.O. y McDevitt, H.O., 1988, Nature 331:356-358). Tenemos evidencias de que este desequilibrio se corrige activando intensamente las células T en presencia de TGF-\beta, y recientemente hemos elucidado el mecanismo de acción de este efecto.

Las células T purificadas se prepararon como se esbozó más arriba, y se incubaron con ConA e IL-2, con o sin TGF-\beta. La Figura 1 muestra que la estimulación de las células T en ausencia de TGF-\beta, resultó en una producción incrementada de IL-10. Sin embargo, cuando se añadió TGF-\beta a las células T estimuladas, la producción de IL-10 se bloqueó y la producción de TNF-\alpha se incrementó. Además, la expresión de TNFR2 se incrementó significativamente. Sin estar atados por la teoría, se cree que la señalización acelerada de TNF-\alpha a través del TNFR2 inducida por el TGF-\beta resulta en células T reguladoras que inhiben la producción de anticuerpo. Nuestros resultados apoyan esta sugerencia.

Hemos determinado que la regulación al alza del TNF-\alpha por parte de TGF-\beta es esencial para la inducción de células T reguladoras. La Figura 2 muestra dos experimentos en los que la adición de TGF-\beta a células T CD8+ activadas resultó en una supresión destacada de la producción de IgG. Esta actividad supresora depende del TNF-\alpha como un intermedio esencial, en cada uno de estos experimentos, un anticuerpo anti-TNF-\alpha neutralizante abolió completamente los efectos supresores de las células T CD8+ reguladoras (CD8reg).

Los pacientes con SLE tienen un defecto marcado en la inmunidad mediada por células, con producción deficiente de IL-2, TNF-\alpha e IFN-\gamma. (Horwitz, D.A. et al. (1997), Dubois Lupus Erythematosus, 5ª edición, (1997), pp. 83-96, editores D.J. Wallace et al., Williams and Wilkins, Baltimore). Sin estar atados por la teoría, se cree que el defecto en la producción de TGF-\beta por parte de los linfocitos es parcialmente responsable de la producción deficiente de IL-2, TNF-\alpha e IFN\gamma. Hemos hallado que la estimulación de células T en presencia de TGF-\beta incrementa significativamente la producción de IL-2, TNF-\alpha e IFN-\gamma cuando estas células se estimulan de nuevo. Más aún, este resultado era dependiente de la regulación al alza del TNF-\alpha por el TGF-\beta (ver Figura 8).

Tenemos evidencia de que la producción de TGF-\beta está disminuida en el SLE, y que este defecto contribuye al desequilibrio entre la IL-10 y el TNF-\alpha. Sin estar atados por la teoría, se cree que los niveles elevados de IL-10 en el SLE sostienen la producción de anticuerpo y son responsables de la producción disminuida de TNF-\alpha, IL-2, IFN-\gamma. La producción disminuida de estas citocinas es responsable de la inmunidad celular defectuosa en el SLE. Hemos demostrado que en condiciones especificadas, el TGF-\beta regula a la baja la IL-10 y potencia la producción de TNF-\alpha. La regulación a la baja de la IL-10 y la potenciación de la producción de TNF-\alpha por parte del TGF-\beta desempeña un papel crucial en la normalización de las actividad de las células T reguladoras en el SLE, en la restauración de la inmunidad mediada por células, y en la remisión de la enfermedad.

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Ejemplo 2

Generación de células T reguladoras que suprimen la autoinmunidad mediada por células

Los ejemplos previos usaron composiciones reguladoras para tratar las enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpo. Composiciones similares se usan para inducir células T CD4+ así como CD6+ para suprimir las enfermedades autoinmunes mediadas por célula. Nosotros mostramos que células CD8+ o CD4+ condicionadas con TGF-\beta solo suprimen la generación de citotoxicidad de células T.

En vez de usar mitógenos para inducir las células T reguladoras, para este propósito se usa la reacción de linfocitos mixtos alogénicos. En esta reacción, las células T procedentes de un individuo reconocen y responden contra antígenos de histocompatibilidad ajenos exhibidos por las PBMC de otros individuos. Estas células T respondedoras proliferan y desarrollan la capacidad de matar estas células diana.

Para desarrollar células supresoras, se cultivaron varios subgrupos de células T CD4+ y CD8+ procedentes de un individuo (donante A) con células mononucleares irradiadas, empobrecidas en células T, procedentes de otro individuo (donante B). Las células se cultivaron durante 5 días con o sin TGF-\beta (1 ng/ml) en las suspensiones. Transcurrido este tiempo, se eliminó el TGF-\beta, y las células se añadieron a células T recientes del donante A y a células no-T del donante B. La Figura 4 muestra que el TGF-\beta indujo ambos subgrupos de células T, CD4+ y CD8+, a desarrollar la capacidad de inhibir la citotoxicidad mediada por células. La Figura 5 muestra dos experimentos adicionales con células T reguladoras CD4+ inducidas mediante TGF-\beta.

Estudios adicionales revelaron que las células T CD4+ reguladoras generadas de esta manera tienen un único modo de acción. A diferencia de las células T CD8+ y CD4+ generadas previamente, las cuales suprimen mediante la secreción de citocinas inhibidoras, estas células T CD4+ reguladoras aloespecíficas tienen un mecanismo de acción dependiente del contacto (Figura 6). Sin estar atados por la teoría, se cree que estas células T reguladoras suprimen que otras células T puedan ser activadas. La adición de estas células T a células T respondedoras y a células aloestimuladoras inhibió la proliferación (Figura 7), y disminuyó la capacidad de las células CD8+ respondedoras precursoras de asesinas para pasar a estar activadas (Figura 8).

También aprendimos que estas células CD4+ reguladoras expresan receptores de IL-2 (CD25) sobre su superficie celular, y que eran extremadamente potentes (Figura 9). La disminución de la proporción de células CD4+ reguladoras respecto células T respondedoras desde 1:4 (20%) hasta 1:32 (3%) sólo disminuyó mínimamente los efectos inhibidores de estas células.

Puesto que sólo se necesitan unas pocas de estas células para obtener potentes efectores reguladores a la baja, es probable que se pueda transferir a los pacientes un número suficiente para suprimir la autoinmunidad u obtener los efectos inmunosupresores deseados, tales como la inhibición del rechazo del injerto.

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Ejemplo 3

Estimulando células T CD4+ para producir niveles inmunosupresores de TGF-\beta

Las células T CD4+ que producen niveles inmunosupresores de TGF-\beta se han denominado células Th3, pero los mecanismos implicados en su desarrollo son pobremente comprendidos. Hemos obtenido evidencia de que la estimulación intensa de células CD4+ con el superantígeno enterotoxina B de estafilococo (SEB), o que la estimulación repetida de células CD4+ con una concentración más baja de SEB, indujo estas células a producir niveles inmunosupresores de TGF-\beta activo.

La Figura 10 muestra la producción incrementada de ambos, TGF-\beta activo y total, producidos por células T CD4+ estimuladas con concentraciones crecientes de SEB. La Figura 11 muestra el efecto de la estimulación repetida de las células T CD4+ con dosis bajas de SEB. Hacia la tercera vez que se estimulaban estas células T con SEB, éstas produjeron cantidades significativas de la forma activa del TGF-\beta.

La Figura 12 muestra los efectos de la SEB sobre células T CD4+ y CD8+ (CD45RA+ y CD45RO-) indiferenciadas. Las células se estimularon con SEB cada 5 días durante un total de tres estimulaciones. Después de cada estimulación se determinó el porcentaje de cada subgrupo de células T y de las células que expresaban el marcador de activación del receptor IL-2 de CD25. Los recuadros A y C muestran que incluyendo TGF-\beta 1 ng/ml en la estimulación inicial las células T CD4+ pasaban a ser el subgrupo predominante en los cultivos después de la estimulación repetida. Los recuadros B y D muestran que la expresión del CD25 por parte de células estimuladas con SEB disminuía hacia la tercera estimulación en los cultivos control. Sin embargo, la expresión del CD25 permanecía muy elevada si las células T se habían cebado con TGF-\beta. Por tanto, el TGF-\beta parece tener efectos preferentes sobre las células CD4+ si estas
células T es estimulan repetidamente, y casi todas estas células fueron CD25+ después de cultivarlas durante 20 días.

En resumen, a continuación de la estimulación de células T, los efectos reguladores predominantes del TGF-\beta están dirigidos a células CD8+. A partir de su estimulación repetida, esta citocina induce ahora las células CD4+ a pasar a ser células reguladoras, y estas células son más potentes que las células CD8+ en sus actividades supresoras.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante sólo es para provecho del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha tenido sumo cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones, y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto.

Literatura, que no son patentes, citada en la descripción

HAHN, B.H. et al., Dubois' Lupus Erythematosus, Williams and Wilkins, 1997, 69-76 [0004]

HORWITZ, D.A. et al. Dubois' Lupus Erythematosus, Williams and Wilkins, 1997, 155-194 [0004]

SHIVAKUMAR, S. et al., J. Immunol., 1989, vol. 143, 103-112 [0004] [0022]

WAHL, S.M., J. Exp. Med., 1994, vol. 180, 1587-190 [0005]

KLINMAN, D.M. et al., Arthritis Rheum., 1991, vol. 34, 1404-1410 [0005] [0022]

HORWITZ, D.A. et al. Dubois' Lupus Erythematosus, Williams and Wilkins, 1997, 83-96 [0008] [0009] [0079]

VIA, C.S. et al., International Immunol., 1993, vol. 5, 565-572 [0009]

FAST, L.D., J. Immunol., 1992, vol. 149, 1510-1515 [0009]

HIROHATA, S. et al., J. Immunol., 1989, vol. 142, 3104-3112 [0009]

BAYLOR, C.E., Advances Exp. Mol. Biol., 1992, vol. 319, 125-135 [0009]

KINTER, A.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, 10985-10989 [0009]

BARKER, T.D. et al., J. Immunol., 1996, vol. 156, 4478-4483 [0009]

LINKER-ISRAELI, M. et al., Arthritis Rheum., 1990, vol. 33, 1216-1225 [0010]

TAKAHASHI, T. et al., Clin. Immunol. Immunopath., 1991, vol. 58, 352-365 [0010]

GRAY, J.D. et al., J. Exp. Med., 1994, vol. 180, 1937-1942 [0010] [0010]

GRAY, J.D. et al., J. Immunol., 1998, vol. 160, 2248-2254 [0010]

MASSAGUE, J., Ann. Rev. Cell Biol., 1980, vol. 6, 597 [0011]

SPOM, M.B. et al., J. Cell Biol., 1987, vol. 105, 1039-1045 [0011]

MASSAGUE, J. Cell, 1992, vol. 69, 1067-1070 [0011]

OHTSUKA, K. et al., J. Immunol., 1998, vol. 160, 2539-2545 [0012]

HAN et al., J. Autoimmunity, 1996, vol. 9, 331-339 [0013]

BLAESE, R.M. et al., Am. J. Med., 1980, vol. 69, 345-350 [0022]

LINKER-ISRAELI, M. et al., Arthritis Rheum., 1990, vol. 33, 1216-1225 [0022] [0074]

PANAYI GS et al., Arthritis Rheum., 1992, vol. 35, 725-773 [0022]

ALLEGRETTA M et al., Science, 1990, vol. 247, 718-722 [0022]

GRAY et al., J. Immunol., 1998, vol. 160, 2248 [0039]

MASSAGUE, J.J., Ann. Rev. Cell Biol, 1980, vol. 6, 597 [0043]

KEHRL, J.H. et al., Int. J. Cell Cloning., 1991, vol. 9, 438-450 [0043]

ABO et al., Clin. Exp. Immunol., 1987, vol. 67, 544 [ 0059]

LINKER-ISRAELI et al., Arthritis Rheum., 1990, vol. 33, 1216 [0059]

WAHL, S.M., J. Exp. Med., 1994, vol. 180, 1587-1590 [ 0074]

GRAY. J.D. et al., J. Immunol., 1998, vol. 160, 2248-2254 [0074]

LLORENTE et al., J. Exp. Med., 1995, vol. 181, 839-44 [0076]

HOUSSIAU. F.A. et al., Lupus, 1995, vol. 4, 393-5 [ 0076]

ISHIDA, H. et al., J. Exp. Med., 1994, vol. 179, 305-10 [0076]

JACOB, C.O.; MCDEVITT, H.O., Nature, 1988, vol. 331, 356-358 [0076]

Claims (12)

1. Uso de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las cuales se han obtenido de un paciente con un trastorno autoinmune mediado por células, y se han tratado con una composición reguladora que comprende TGF-\beta, para la preparación de un medicamento para tratar dicho trastorno autoinmune mediado por células en dicho paciente.

2. El uso según la reivindicación 1, en donde dicho medicamento disminuye la citotoxicidad asociadas con dicho trastorno mediado por células.

3. El uso según la reivindicación 1, en donde dicho trastorno autoinmune mediado por células se selecciona de entre el grupo consistente en la enfermedad de Hashimoto, la enfermedad de la polimiositis, la enfermedad inflamatoria intestinal, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus, la artritis reumatoide, y la esclerodermia.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas PBMC están enriquecidas en células T CD8+.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas PBMC están enriquecidas en células T CD4+.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas PBMC están enriquecidas en células T CD4+ indiferenciadas.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha composición reguladora comprende IL-2.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha composición reguladora comprende además in anticuerpo anti-CD2.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha composición reguladora comprende además in anticuerpo anti-CD3.

10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha composición reguladora comprende además in anticuerpo anti-CD28.

11. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dichas células tratadas impiden que otras células T en dicho paciente se conviertan en células efectoras citotóxicas.

12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dichas células tratadas se inducen para producir niveles inmunosupresores de TGF-\beta activo.