ES2307058T3

ES2307058T3 - Compuesto quimico y ensayo.

Info

Publication number: ES2307058T3
Application number: ES04793802T
Authority: ES
Inventors: Brian AstraZeneca R & D Charnwood SPRINGTHORPE; Gert Strandlund
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2003-10-20
Filing date: 2004-10-18
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2024-10-18
Also published as: DE602004014633D1; JP2007513874A; ATE399322T1; EP1678499A2; US20070048215A1; SE0302775D0; CN1871516A; TW200526255A; WO2005037052A2; WO2005037052A3; EP1678499B1; HK1089233A1

Abstract

Un compuesto que posee la Fórmula I o sales, hidratos o solvatos del mismo y que comprende al menos un átomo radiomarcado: (Ver fórmula) en el que el compuesto comprende al menos 1, 2 ó 3 sustituciones por tritio en posición meta.

Description

Compuesto químico y ensayo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un compuesto marcado del tipo ligando que es útil en métodos de identificación, ensayo y/o evaluación selectiva de compuestos que modulan los canales iónicos, en particular, los canales I_{Kr} miocárdicos, tales como los codificados por ERG, incluyendo hERG. El compuesto ligando se usa, por tanto, para evaluar la afinidad de compuestos preclínicos hacia el canal de potasio ERG.

Antecedentes de la invención

Actualmente se reconoce que algunas muertes súbitas inducidas por fármacos son secundarias al desarrollo de una arritmia llamada Torsades de Pointes (TdP) (Vandenberg JI, Walker BD, Campbell TJ. HERG K+ channels: friend and foe. Trends Pharmacol Sci 2001; 22 (5): 240-6).

Recientes avances en el entendimiento de este fenómeno indican que el evento primario es la inhibición por tales fármacos del componente rápido de la corriente de potasio rectificadora retardada (I_{Kr}). Estos compuestos se fijan a las subunidades \alpha formadoras de poros de la proteína del canal que transporta esta corriente, subunidades que son codificadas por el gen humano relacionado con éter-\alpha-go-go (hERG). Puesto que la I_{Kr} juega un papel clave en la repolarización del potencial de acción cardiaco, su inhibición ralentiza su repolarización y este hecho se manifiesta como una prolongación del intervalo QT. Si bien la prolongación del intervalo QT no es un problema de seguridad per se, conlleva un alto riesgo de efectos cardiovasculares adversos, pudiendo llevar, en un pequeño porcentaje de personas, a TdP y degeneración en la fibrilación ventricular.

Muchos compuestos fallan a la hora de convertirse en fármacos comercializables debido a la inhibición del canal I_{Kr} miocárdico, codificado por hERG. Los pacientes con síndrome LQT 2, en los que el gen humano éter-\alpha-go-go (hERG) se encuentra mutado, presentan también Torsades de Pointes. El canal hERG contiene un sitio de enlace, por ejemplo, para las metanosulfonanilidas antiarrítmicas de clase III (dofetilida, E-4031 y MK-449) y muchos fármacos que causan QT prolongado en el aspecto clínico de tal sitio. En consecuencia, dichos fármacos llevan etiquetas de aviso (por ejemplo, pimozida) o bien han sido retirados del mercado (por ejemplo, terfenadina). La falta de un margen terapéutico adecuado entre actividad hacia el canal hERG y el objetivo deseado impedirá a un fármaco potencial su progresión posterior. Es necesario, por tanto, evaluar la actividad hERG tan pronto como sea posible con objeto de conseguir una reducción de esta actividad para nuevas clases de compuestos.

Con objeto de evaluar la actividad ERG, en particular la hERG, y la capacidad enlazante de nuevos compuestos, se hace necesario un ensayo adecuado. Para determinar la afinidad de nuevas clases de compuestos se han desarrollado ensayos preclínicos usando compuestos radiomarcados que se enlazan al hERG y permiten estudios de desplazamiento. Sin embargo, existe la necesidad de ligandos alternativos para uso en tales ensayos.

Presentación de la invención

En el documento WO 02/04446 se describen compuestos de bispidina y su uso en el tratamiento de arritmias cardiacas.

En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un derivado radiomarcado de un compuesto de bispidina como el descrito en el documento WO 02/04446 o de sus sales, hidratos o solvatos. De manera adecuada, dicho compuesto comprende sustituciones por átomos radiomarcados, en particular, sustituciones por tritio. En una forma de realización preferida, el compuesto comprende al menos 1, 2 ó 3 sustituciones por tritio.

En una forma de realización preferida, la invención se refiere a un compuesto que posee la Fórmula I o a sus sales, hidratos o solvatos, que comprenden al menos un átomo radiomarcado:

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De manera adecuada, dicho compuesto comprende al menos 1, 2 ó 3 sustituciones por tritio, preferiblemente en las posiciones orto con respecto al grupo nitro.

Tales radioligandos o compuestos radiomarcados son útiles para evaluar la afinidad de compuestos hacia el canal I_{Kr} codificado por ERG, en particular por hERG.

En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona un compuesto de Fórmula II, que es:

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o sales del mismo.

Las sales adecuadas del mismo incluyen sales de adición de ácido o básicas. En el artículo de Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977), se puede encontrar una revisión de algunas sales adecuadas. Las sales se forman, por ejemplo, con ácidos inorgánicos fuertes, tales como ácidos minerales, por ejemplo, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácidos halohídricos; con ácidos orgánicos carboxílicos fuertes, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono que están sustituidos o no sustituidos (por ejemplo, por halógeno), tales como ácido acético; con ácidos dicarboxílicos saturados o no saturados, por ejemplo, ácido oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tereftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo, ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo, ácido aspártico o glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como ácidos (C_{1}-C_{4})-alquil- o aril-sulfónicos que están sustituidos o no sustituidos (por ejemplo, por un halógeno), tales como los ácidos metano- o p-tolueno sulfónico.

La invención incluye también todos los enantiómeros y tautómeros de los compuestos radiomarcados de Fórmula I o II. Los expertos en la técnica reconocerán los compuestos que poseen propiedades ópticas (uno o más átomos de carbono quirales) o características tautoméricas. Los enantiómeros y/o tautómeros correspondientes se pueden aislar/preparar por métodos conocidos en la técnica.

Además, la invención incluye cualesquiera estereoisómeros y/o isómeros geométricos de los compuestos radiomarcados de Fórmula I o II. Por ejemplo, puede haber uno o más centros asimétricos y/o geométricos, de manera que el compuesto puede existir en dos o más formas estereoisómeras y/o geométricas. La presente invención contempla el uso de todos los estereoisómeros individuales e isómeros geométricos de esos agentes y las mezclas de los mismos. Los términos usados en las reivindicaciones abarcan estas formas, siempre que dichas formas retengan la actividad funcional apropiada (aunque no necesariamente en el mismo grado).

La presente invención incluye también otras variaciones isotópicas del compuesto o de sus sales. Una variación isotópica de un agente de la presente invención o de una sal del mismo farmacéuticamente aceptable se define como una variación en la que al menos un átomo está sustituido por un átomo que posee el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica más comúnmente encontrada en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos adicionales que se pueden incorporar en el compuesto incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como ^{2}H, ^{3}H, ^{13}C, ^{14}C, ^{15}N, ^{17}O, ^{18}O, ^{31}P, ^{32}P, ^{35}S, ^{18}F y ^{36}Cl, respectivamente. Como conjunto destacable en la Fórmula II, la forma tritiada, es decir, ^{3}H, se prefiere particularmente. Los isótopos de Carbono-14, es decir, ^{14}C, pueden también usarse, siendo preferidos por su fácil preparación y detectabilidad. Las variaciones isotópicas pueden prepararse generalmente por procedimientos convencionales, mediante el uso de variaciones isotópicas apropiadas de los reactivos adecuados.

La presente invención también incluye el uso de formas solvatadas del compuesto. Los términos usados en las reivindicaciones abarcan estas formas.

El uso con éxito de un compuesto del tipo radioligando en un ensayo de fijación depende de un número de parámetros que incluye la afinidad del radioligando por el canal de interés así como la velocidad de salida del compuesto una vez que se ha enlazado. En el caso ideal, un radioligando adecuado tendrá una afinidad que permite la competición con un compuesto candidato que puede enlazarse al mismo sitio, así como una velocidad de salida que permite al radioligando permanecer en contacto el tiempo suficiente para que su fijación sea detectable. Estas propiedades de un compuesto no se pueden predecir. En consecuencia, la presente invención se refiere al descubrimiento de que se puede sintetizar un compuesto de Fórmula I que está 1, 2 ó 3 tritio-sustituido, o un compuesto de Fórmula II, que es adecuado para uso en un ensayo de fijación competitivo.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para caracterizar la actividad de un compuesto como bloqueante del canal I_{Kr}, que incluye el uso de un compuesto según la invención.

De manera adecuada, dicho método es un ensayo que comprende las siguientes etapas:

a): incubación de la membrana de células que contiene el canal I_{Kr} en presencia del compuesto radioligando de Fórmula II en presencia o en ausencia de un compuesto objeto de ensayo o de una mezcla de compuestos objeto de ensayo;

b): cuantificación del compuesto marcado específicamente enlazado en presencia o en ausencia de un compuesto objeto de ensayo;

c): cálculo de la inhibición de la fijación del compuesto marcado por el compuesto objeto de ensayo o mezcla de compuestos objeto de ensayo.

Tal ensayo es útil para la identificación y caracterización de compuestos que tienen efectos colaterales potencialmente cardiotóxicos. El ensayo mide la capacidad del compuesto objeto de ensayo para desplazar al compuesto radioligando de Fórmula II del canal I_{kr}, que es, preferiblemente, el canal ERG. De manera adecuada, el ensayo se puede efectuar en un sistema de ensayo de alto rendimiento. El ensayo posibilita que compuestos adecuados (es decir, aqué-
llos que poseen una afinidad hacia el canal I_{kr} que no es baja o reducida) sean seleccionados para desarrollo posterior.

Alternativamente, tal ensayo es útil en la identificación de compuestos que son capaces de enlazarse al canal I_{kr} y, por tanto, potencialmente útiles en el tratamiento de pacientes con arritmias.

En una forma de realización preferida, dicho ensayo comprende las etapas de:

a): preparar disoluciones del compuesto objeto de ensayo en una o más concentraciones;

b): mezclar el compuesto radioligando de Fórmula II con la membrana de células que contiene el canal I_{Kr};

c): incubar las disoluciones del compuesto objeto de ensayo con la mezcla de compuesto radioligando de Fórmula II y la membrana de células que contiene el canal I_{Kr};

d): aislar la membrana de las disoluciones y medir la radiactividad de la membrana;

e): calcular la radiactividad de las muestras en presencia del compuesto objeto de ensayo en comparación con un control en ausencia del compuesto objeto de ensayo.

De manera adecuada, se calcula la concentración del compuesto objeto de ensayo que da lugar a un 50% de inhibición del enlace del compuesto radioligando a la membrana de células (IC_{50}). Estos valores se pueden usar para predecir la concentración del compuesto responsable de causar efectos colaterales indeseables en seres humanos.

En una forma de realización, el ensayo es un ensayo de mancha. En otra forma de realización, se analiza en el ensayo una gama de concentraciones y, preferiblemente, cinco o más concentraciones.

Los métodos adecuados para aislar la membrana y medir la radiactividad incluyen ensayos de fijación con filtro, tales como el ensayo descrito en este documento. Alternativamente, se puede medir la radiactividad usando un ensayo basado en recuento, tal como un ensayo de centelleo por proximidad (SPA, Amersham Biosciences).

Preferiblemente, el canal I_{Kr} es ERG humano (hERG/HERG).

En una forma de realización, la membrana de células que comprende el canal I_{kr} se deriva de una línea celular transfectada con el gen ERG. De manera adecuada, el gen ERG es humano (hERG), de primate o canino.

El HERG se ha expresado como canales funcionales estables o transitoriamente expresados en células renales embrionarias humanas (HEK) (véanse, por ejemplo, los documentos Circulation 2001 Nov 27; 104(22):2645-8 Phospholipid metabolite 1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine enhances human ether-\alpha-go-go-related gene (HERG) K(+) channel function. Wang J, Wang H, Han H, Zhang Y, Yang B, Nattel S, Wang Z; J Biol Chem 1998 Aug 14; 273(33):21061-6 HERG channel dysfunction in human long QT syndrome. Intracellular transport and functional defects. Zhou Z, Gong Q, Epstein ML, January CT).

En consecuencia, las líneas celulares adecuadas incluyen células HEK (renales embrionarias humanas), tales como las células HEK 293. Otras líneas celulares adecuadas incluyen células CHO (ovario de hámster chino), CHL (pulmón de hámster chino) o COS (mono). Además, el canal se puede expresar en células bacterianas, de levaduras o de insectos, tales como las células SF9.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un compuesto de la invención en un ensayo para caracterizar la actividad bloqueante del canal I_{Kr} de uno o más compuestos objeto de ensayo.

En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un compuesto de Fórmula II en un ensayo para identificar uno o más compuestos candidatos capaces de enlazarse a un canal I_{kr}.

De manera adecuada, el ensayo es un ensayo de fijación competitivo.

Todavía en otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para preparar un compuesto de Fórmula II como se ha definido en este documento, comprendiendo dicho proceso la tritiación de 3,7-Bis[2-(4-nitrofenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano en presencia de hexafluorofosfato de (1,5-ciclooctadien)bis(metildifenil-fosfina)iridio(I).

De manera adecuada, el 3,7-Bis[2-(4-nitrofenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano y el hexafluorofosfato de (1,5-ciclooctadien)bis(metildifenil-fosfina)iridio(I) se encuentran disueltos en diclorometano.

En una forma de realización, la tritiación se lleva a cabo usando un colector de tritiación.

En una forma de realización particularmente preferida, el proceso para preparar un compuesto de Fórmula II es sustancialmente como el descrito en este documento.

En los siguientes ejemplos no limitantes se muestra el uso de la síntesis y el uso del compuesto de Fórmula II.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis del ligando radiactivo La síntesis de 3,7-bis[2-(4-nitrofenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano previa al radiomarcado se encuentra descrita en el documento WO 02/04446.

El radiomarcado para obtener el compuesto de Fórmula II:

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3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.11]nonano (Fórmula II) se lleva a cabo de la manera siguiente:

Se disuelven en diclorometano (1 mL) 3,7-Bis[2-(4-nitrofenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano (1,62 mg,
3,82 \mumol) y hexafluorofosfato de (1,5-ciclooctadien)bis(metildifenil-fosfina)iridio(I) (8,6 mg, 10,3 \mumol) y se trasfieren a un matraz de 2 ml de fondo redondo de paredes de vidrio reforzado. Se conecta el matraz a un colector de tritiación RC Tritec y se somete a un ciclo de congelación, evacuación a <0.01 mbar y descongelación para desgasificar la muestra. Finalmente, se congela la disolución de diclorometano en nitrógeno líquido y se introduce gas tritio (aproximadamente 130 GBq, 61 \mumol), generado en el lecho primario de uranio del colector, en el espacio vacío que se encuentra encima de la disolución. Se deja calentar la reacción hasta temperatura ambiente y se agita durante 20 horas, por medio de una barra magnética agitadora.

Se vuelve a congelar la disolución en nitrógeno líquido y se reabsorbe el gas tritio residual en el lecho secundario de almacenamiento de uranio del colector. Se retira el matraz del colector y se somete la disolución a dos ciclos de liofilización, usando etanol (2 x 5 mL) para remover el tritio lábil. El residuo resultante se disuelve en etanol (10 mL) para formar la disolución madre de 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano (19,33 GBq, pureza radioquímica 34%).

Se toma una porción alícuota (2mL, 3,87 GBq) de la disolución madre, se evapora el disolvente bajo corriente de nitrógeno y se redisuelve el residuo en acetonitrilo/ácido trifluoroacético acuoso 0,5% v/v, 1:1 en volumen (400 \muL). La muestra se purifica en aproximadamente cinco inyecciones iguales usando las siguientes condiciones de HPLC: Xterra MS C-8 150 x 8 mm, acetonitrilo 35%/ácido trifluoroacético acuoso 0,5% v/v a 3 mL min^{-1}, detección a 240 nm. Las fracciones debidas a 3,7-Bis[2-(4-nitrofenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano (tiempo de retención 10,77 min) se recogen cada vez y se combinan (pureza radioquímica >97%). Se añade tiosulfato de sodio acuoso (50% p/v, 50 \muL) a las fracciones combinadas para estabilizar la muestra antes de remover el disolvente orgánico a presión reducida. La disolución acuosa resultante se seca-congela para dar un residuo blanco que se reconstituye en etanol/agua, 2:1 en volumen (15 mL) para proporcionar el material de partida purificado de 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano (881,7 MBq; pureza radioquímica 97,5%). La radiactividad molar específica se determina por espectrometría de masas, encontrándose un valor de 2941,5 GBq mmol^{-1}.

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Ejemplo 2 Protocolo para el Ensayo de Fijación hERG Placas de Ensayo

Placas de polipropileno de 96 pocillos (Costar C3600)

Placas filtrantes Whatman GF/B (Packard (6005177N))

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Ensayo y tampón de lavado

HEPES 10 mM

NaCl 130 mM

KCl 5 mM

EGTA 1 mM

MgCl_{2} 0,8 mM

pH 7,4 con NaOH

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Disolución de recubrimiento de la placa GF/B

Polietilenimina 0,3% (v/v)

BSA 0,2% (p/v)

Las placas filtrantes GFB se someten a prerremojo en la disolución de recubrimiento durante un mínimo de 20 minutos antes de la recolección.

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Membranas

Las membranas para uso en el ensayo se preparan como sigue:

Se cultivan células HEK (riñón embrionario humano) con el uso de métodos estándar para lograr el número requerido, siendo a continuación recolectadas y peletizadas. El pelet final se prepara en medio libre de suero y se mide el volumen de las células empaquetadas (pcv).

El pelet se vuelve a suspender en 4 veces el pcv de disolución tampón hipotónica (3 partes de agua: 1 parte de medio libre de suero o de tampón), añadiéndose un comprimido/50 mL de inhibidor de proteasa Boehringer (nº Cat 1 697 498).

Se deja que las células se hinchen durante un par de minutos en hielo y a continuación se someten a lisis mediante el uso de un conjunto homogenizador de tejidos Polytron a 22.000 rpm. La suspensión celular se mantiene en hielo y se deja que el Polytron acumule velocidad, apagándolo a continuación y dejándolo enfriar durante 30 segundos antes de la repetición. Normalmente, 3 arranques deben ser suficientes para completar la lisis de las células. Se comprueba una muestra microscópicamente para garantizar que la lisis es completa, repitiéndose el proceso si fuera
necesario.

Se añaden 10 mL de disolución de sacarosa fría al 41% a un tubo(s) de ultracentrífuga Beckmam de 38 mL (nº Cat 344058). La disolución membranaria sometida a lisis se deposita cuidadosamente a modo de recubrimiento sobre la capa de amortiguación al 41%. Se enjuaga con tampón cualquier residuo que pueda estar adherido a las paredes del tubo del Polytron. El tubo de ultracentrífuga se suplementa con tampón frío para llenar completamente el tubo (esto impide que el tubo colapse durante la centrifugación). La centrifugación se lleva a cabo a 28.000 rpm durante 1 hora a una temperatura de 4ºC, usando un rotor basculante SW-28 con freno a 800 rpm.

Las membranas se visualizan como una banda blanca en la interfase sacarosa/tampón. Se descarta la capa superior de tampón, se recolecta seguidamente toda la banda de la membrana con la menor cantidad posible de sacarosa y se añade a un tubo de centrífuga recién preparado. Dicha banda se diluye y se mezcla bien con al menos 3 volúmenes de tampón enfriado en hielo que contiene inhibidor de proteasa. La centrifugación se lleva a cabo a 23.000 rpm a una temperatura de 4ºC durante 20 minutos con interrupción a cero.

El sobrenadante se descarta y el pelet se vuelve a suspender en el tampón de ensayo + inhibidores de proteasa, sobre hielo, hasta una concentración de 1 x 10^{8} equivalentes de células/mL. Esta preparación se divide seguidamente en porciones alícuotas y se congela a una temperatura de -80ºC o inferior.

Para su uso en el ensayo, la disolución de la membrana se diluye 65 veces, por ejemplo, se diluyen 0,5 mL de disolución de membrana hasta 32,5 mL con el tampón de ensayo por placa de ensayo. La fijación total del 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano no sobrepasa el 10% del total añadido.

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Radiomarcado

El 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano se prepara según el protocolo anterior y se proporciona en etanol 67% (v/v), agua 33% (v/v) que contiene 3,3 mg/L de tiosulfato de sodio. El lote radiomarcado usado en estos estudios tiene una actividad específica de 2941,5 GBq/mmol (79,5 Ci/mmol) y una concentración de 20 \muM. El material radiomarcado de partida se diluye 2000 veces hasta 10 nM y se añaden 20 \muL por pocillo para un volumen final de ensayo de 200 \muL, para dar una concentración final de radioligando de 1 nM.

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Fijación Total

La fijación total, en ausencia de un ligando competitivo, se define en presencia de un vehículo de control. En este caso se usó DMSO al 1% (v/v) (20 \muL por pocillo de una solución de partida de DMSO al 10% (v/v) en el tampón de ensayo).

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NSB

La fijación no específica (NSB) se determina midiendo la fijación de 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano en presencia de astemizol 10 \muM (20 \muL por pocillo de una disolución de partida 100 \muM en DMSO al 10% (v/v) en el tampón de ensayo).

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Compuestos de ensayo

Los compuestos objeto de ensayo se disuelven en DMSO hasta una concentración de partida 10 mM. Típicamente, se ensayan hasta 7 compuestos por placa, con un patrón interno. Dichos compuestos se diluyen simultáneamente en una placa de 96 pocillos usando una pipeta de 8 canales. Los compuestos se diluyen en serie en DMSO a 100x las concentraciones a ser usadas en el ensayo final, típicamente en medias unidades logarítmicas, de 3 mM a 30 \muM. Esto se consigue adicionando 30 \muL de cada dilución sucesiva a 65 \muL de DMSO en una placa de 96 pocillos. Las diluciones adicionales se llevan a cabo en tampón de ensayo de la manera siguiente: los compuestos se diluyen 10 veces con el tampón de ensayo para dar 5 concentraciones del compuesto en DMSO al 10%. Se añaden entonces 20 \muL de cada una de estas diluciones a la placa de ensayo. Cuando se efectúan las otras adiciones, se consigue un volumen total de 200 \muL y una concentración final de DMSO de 1% (v/v).

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Patrón de ensayo

Como patrón de ensayo se usa Pimozida, un compuesto activo hacia hERG. Su pIC_{50} fue 7,7 \pm 0,1 (media \pm SEM, n=7, intervalo 7,5 - 8,0) (SEM = error típico de la media). El compuesto se prepara como disolución de partida 10 mM en DMSO y se congela en porciones alícuotas a una temperatura de -20ºC para uso en cada uno de los experimentos. En cada placa de ensayo se ensaya un compuesto patrón.

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Procedimiento de ensayo

Los ensayos se efectúan en placas Costar de 96 pocillos de fondo redondo en polipropileno. Cada placa de ensayo contiene controles para fijación total y fijación no específica. Los compuestos se ensayan normalmente en duplicata en cinco diluciones en serie logarítmica. Esto permite disponer de ocho compuestos a ser ensayados por placa de ensayo. Típicamente, los compuestos se ensayan en la gama de 30 \muM a 0,3 \muM. Las adiciones a cada placa de ensayo se recogen en la Tabla 1:

TABLA 1 Contenido de los pocillos para las placas de ensayo

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Una vez efectuadas todas las adiciones, se colocan las placas sobre un agitador de placas durante 1 minuto para permitir la mezcla. A continuación, se incuban las placas durante 3 horas a temperatura ambiente (18-20ºC). Durante este tiempo, se sumerge en disolución de recubrimiento una placa filtrante GF/B por cada placa de ensayo. Después de la incubación, se recolectan los contenidos de los pocillos de ensayo usando un recolector Tomtec y se lavan siete veces con aproximadamente 250 \muL de tampón de lavado por ciclo (1750 \muL en total). La distribución de la placa se transpone al recolector, de manera que el pocillo A1 de la placa de ensayo se recolecta en el pocillo A12 de la placa GF/B.

Se añaden 20 \muL de 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano 10 nM a una placa filtrante seca para determinar la radiactividad total añadida a los pocillos de ensayo. Las placas se secan en una estufa a una temperatura de 58ºC durante 2 horas o bien durante toda la noche a temperatura ambiente. Se adhiere un sellante posterior (BackSeal) a la parte de abajo de cada placa y se añaden 50 \muL/pocillo de Microscint 0 en cada filtro. Se añade un sellante superior (TopSeal) a cada placa y se cuenta la radiactividad con un Contador Packard TopCount siguiendo un protocolo [^{3}H] con la orientación de la placa invertida permitida para corregir la distribución transpuesta efectuada durante la filtración.

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Análisis de datos

Se calculan los valores medios de CPM para fijación total, fijación no específica y [^{3}H] total añadido. Se calcula también el valor medio de CPM para cada concentración de compuesto objeto de ensayo y se substrae la media de NSB. Se construye una curva concentración-efecto para cada compuesto objeto de ensayo representando el valor medio de CPM frente a la concentración de compuesto objeto de ensayo. Se determina entonces el valor de pIC_{50}.

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Resultados

El 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano se enlaza reversiblemente a membranas de células HEK hERG-transfectadas con alta afinidad (Kd 0,91 \pm 0,01 nM; Bmax 23,1 \pm 0,4 pmol/mg proteína; media \pm SEM, n=3).

Para ensayos de desplazamiento competitivo se usa una concentración de radioligando 1nM, que proporciona una ventana de fijación de 10 veces frente a fijación no específica y demostró características enlazantes de sitio único y reversibles.

Comparación con los datos publicados de [^{3}H]-dofetilida

El 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano es completamente desplazado de las membranas HEK hERG-transfectadas por una gama de compuestos descritos previamente como bloqueantes del canal hERG.

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TABLA 2 Comparación de los valores de pIC_{50} para bloqueantes conocidos del canal hERG derivados de los ensayos de fijación competitivos usando 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano y [^{3}H]-dofetilida (Finlayson et al.) en membranas HEK hERG-transfectadas (media \pm SEM, n \geq4)

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Los valores de pIC_{50} para estos compuestos están en buen acuerdo con los datos publicados observados usando dofetilida de Pfizer como radioligando (Tabla 2; datos de Finlayson et al.). Esta correlación es consistente con la consideración de que el 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano ocupa un sitio de enlace similar al ocupado por muchos de los fármacos que se sabe interaccionan con el canal hERG.

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Comparación con los datos de electrofisiología para bloqueantes de hERG conocidos

Una comparación de los valores de pIC_{50} de fijación del 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano con los valores de pIC_{50} de electrofisiología para estos bloqueantes del canal hERG demuestra que el ensayo de fijación puede predecir aquellos compuestos que interaccionarán funcionalmente con el canal (Tabla 3).

TABLA 3 Comparación de los valores de pIC_{50} para bloqueantes conocidos del canal hERG derivados de los ensayos de fijación competitivos usando 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano y de electrofisiología

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Comparación con los datos de electrofisiología para una gama de compuestos candidatos

Se evalúa selectivamente en el ensayo de fijación de 3,7-Bis[2-(4-nitro[3,5-^{3}H]fenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano una gama de compuestos representativos de una gama diversa de clases estructurales. La comparación de estos datos con los datos de pIC_{50} funcional de los estudios de electrofisiología demuestra que la mayoría de los compuestos fueron de 3 a 10 veces menos activos en el ensayo de fijación que en electrofisiología. Sin embargo, todos los compuestos con actividad funcional mayor que 10 micromolar se detectaron en el ensayo de fijación.

Los datos para los compuestos patrón indican que el ensayo de fijación sería apropiado para investigar SAR (siglas en inglés de Structure Activity Relationship, Relación Estructura Actividad) de los bloqueantes de los canales. En contraste con los patrones, cuando se trabaja con compuestos mucho menos potentes, como es habitual para compuestos de proyecto, una SAR clara no está dentro de la sensibilidad del ensayo.

Lo que el ensayo de fijación proporciona claramente es un medio conveniente de detección rápida y temprana de la capacidad de compuestos de proyecto para interaccionar con el canal hERG.

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Conclusión

Se ha desarrollado un ensayo simple y sólido de fijación de radioligando en el que se identifica la actividad hERG-enlazante de una gama diversa de clases estructurales.

Para la mayoría de los compuestos, la actividad en el ensayo de fijación fue más baja que la actividad determinada por electrofisiología, si bien la correlación positiva global entre las pruebas sistemáticas garantiza que las clases de compuestos con actividad significativa en la prueba sistemática funcional serán detectadas en el ensayo de fijación. El ensayo de fijación se puede usar para detectar clases de compuestos con potencial para causar prolongación de QT.

Este ensayo de fijación es adecuado para uso como prueba sistemática selectiva primaria de hERG, minimizando el número de compuestos que necesitan ser ensayados por electrofisiología.

Referencias

1) Chadwick C., et al., Identification of a specific ligand for the cardiac rapidly activating delayed rectifier K+ current. Circ. Res. (1993) 72:707-714.

2) Finlayson K., et al., [3H]dofetilide binding to hERG-transfected membranes: a potential high throughput preclinical screen. Eur. J. Pharmacol. (2001) 430:147-148.

3) Kang J., et al., High affinity blockade of the hERG cardiac K+ channel by the neuroleptic pimozide. Eur. J. Pharmacol. (2000) 392:137-140.

4) Suessbrich H., et al., The inhibitory effect of the antipsychotic drug haliperidol on hERG potassium channels expressed in Xenopus oocytes. British Journal of Pharmacol. (1997) 120:968-974.

Si bien la invención se ha descrito en conexión con formas de realización específicas preferidas, debe entenderse que la invención, según se reivindica, no debe limitarse indebidamente a tales formas de realización específicas. En vez de eso, se pretende que varias modificaciones de los modos de llevar a cabo la invención descritos, que son obvios para los expertos en química o campos relacionados, entren dentro del ámbito de las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Un compuesto que posee la Fórmula I o sales, hidratos o solvatos del mismo y que comprende al menos un átomo radiomarcado:

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en el que el compuesto comprende al menos 1, 2 ó 3 sustituciones por tritio en posición meta.

2. Un compuesto de Fórmula II:

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o sales del mismo.

3. Un ensayo para caracterizar la actividad de un compuesto como bloqueante del canal I_{Kr} que comprende las etapas siguientes:

a): incubación de la membrana de células que contiene el canal I_{Kr} en presencia del compuesto de Fórmula II en presencia o en ausencia de un compuesto objeto de ensayo;

b): determinación del compuesto marcado específicamente enlazado en presencia o en ausencia de un compuesto objeto de ensayo;

c): cálculo de la inhibición de la fijación del compuesto marcado por el compuesto objeto de ensayo.

4. Un ensayo como el reivindicado en la reivindicación 3 que comprende las etapas de:

b): mezclar el compuesto de Fórmula II con la membrana de células que contiene el canal I_{Kr};

c): incubar las disoluciones del compuesto objeto de ensayo con la mezcla del compuesto de Fórmula II y la membrana de células que contiene el canal I_{Kr};

e): calcular la radiactividad de las muestras en presencia del compuesto objeto de ensayo comparada a un control en ausencia del compuesto objeto de ensayo.

5. Un ensayo como el reivindicado en la reivindicación 3 o en la reivindicación 4, en el que el canal I_{Kr} es ERG humano.

6. Un ensayo como el reivindicado en la reivindicación 5, en el que la membrana de células se deriva de una línea celular transfectada con el gen ERG humano.

7. Un ensayo como el reivindicado en la reivindicación 6, en el que la línea celular es HEK.

8. El uso de un compuesto de Fórmula II en un ensayo in vitro para caracterizar la actividad bloqueante del canal I_{kr} de uno o más compuestos candidatos.

9. Un uso como el reivindicado en la reivindicación 8, en el que el ensayo es un ensayo de fijación competitivo.

10. Un proceso para preparar un compuesto de Fórmula II como se ha definido en la reivindicación 2, comprendiendo dicho proceso la tritiación de 3,7-Bis[2-(4-nitrofenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano en presencia de hexafluorofosfato de (1,5-ciclooctadien)bis(metildifenil-fosfina)iridio(I).

11. Un proceso como el reivindicado en la reivindicación 10, en el que el 3,7-Bis[2-(4-nitrofenil)etil]-3,7-diazabiciclo[3.3.1]nonano y el hexafluorofosfato de (1,5-ciclooctadien)bis(metildifenil-fosfina)iridio(I) se disuelven en diclorometano.

12. Un proceso como el reivindicado en la reivindicación 10 o en la reivindicación 11, en el que la tritiación se lleva a cabo usando un colector de tritiación.