ES2305856T3 - Mezcladura en dispositivos microfluidos. - Google Patents

Abstract

Un método para mezclar líquidos en dispositivos microfluídicos que comprende: (a) aportar al menos un primer líquido y un segundo líquido a una primera cámara (18) para formar un líquido combinado; (b) descargar dicho líquido combinado de (a) procedente de dicha primera cámara (18) a una segunda cámara (22) a través de al menos un pasaje (20) capilar en comunicación hidráulica con dicha primera cámara (18), para completar la mezcladura de dichos líquidos combinados, caracterizado porque dicha primera cámara (18) y dicha segunda cámara (22) tienen volúmenes mayores que los del líquido combinado de (a).

Description

Mezcladura en dispositivos microfluídicos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere generalmente a dispositivos microfluídicos, particularmente a dispositivos usados para el análisis de muestras biológicas, tales como sangre, orina y similares. Estos dispositivos microfluídicos ponen en contacto pequeñas cantidades de una muestra líquida con reactivos para proporcionar una medida cualitativa o cuantitativa de la presencia o ausencia de un analito de interés. Típicamente, una cantidad medida de la muestra se mueve a través de una o más cámaras que contienen reactivos o agentes acondicionadores usados para preparar la muestra para entrar en contacto con los reactivos. La cantidad de la muestra es habitualmente menor de 10 \mul y las cámaras son de un tamaño similar. Están interconectadas por pasajes capilares a través de los cuales la muestra se mueve mediante fuerzas capilares o mediante una fuerza aplicada, tal como la fuerza centrífuga.

En muchas casos, es necesario poner en contacto la muestra con un líquido acondicionador para diluir la muestra o preparar de otro modo la muestra para la reacción subsiguiente. Por ejemplo, los ensayos a menudo requieren que una muestra sea puesta en contacto para minimizar la interferencia, para controlar condiciones de reacción tales como pH, cofactores o fuerza iónica, para formar complejos tales como ligandos multidentados, proteínas tales como complejos anticuerpo-antígeno, ácidos nucleicos, policarbohidratos, lípidos o metales, para someter a lisis a células, por ejemplo bacterias, glóbulos rojos o glóbulos blancos, y para hacer reaccionar analitos y metabolitos en forma detectable. La mezcladura de la muestra con un líquido acondicionador presenta problemas relativos al pequeño tamaño del dispositivo microfluídico. El movimiento de pequeñas cantidades de líquidos a través de pasajes estrechos por fuerzas capilares implica la interacción del líquido con las paredes de los pasajes. Si el líquido es acuoso, lo que es típico de las muestras biológicas, y las paredes de los pasajes son hidrófilas y estrechas, por ejemplo de 200 a 200 \mum de anchura de y 1 a 200 \mum de altura, la energía superficial del líquido crea una fuerza que puede mover el líquido a través del pasaje. La gran relación de superficie a volumen significa que los efectos superficiales sobre el líquido son grandes. El Número de Reynolds, una unidad adimensional que se refiere al carácter del flujo de líquido, es muy bajo, indicando que el flujo de líquido es laminar, y no turbulento. El flujo laminar es un flujo currentiforme, incrementándose la velocidad con la distancia desde la pared.

La mezcladura de una muestra con líquidos acondicionadores es difícil cuando predomina el flujo laminar. La mezcladura se realiza habitualmente creando condiciones turbulentas. En gran parte de la técnica anterior relativa a la microfluídica, los líquidos en flujo laminar se ponen en contacto estrecho, basándose en la difusión de moléculas de una capa de líquido a otra para crear una mezcla de los líquidos. En micromezcladores activos que usan técnicas a macroescala, por ejemplo agitación mecánica, incluir elementos activos puede requerir dispositivos muy complejos y costosos.

En la Patente de EE.UU. 6.136.272, Weigi y otros describen un dispositivo que crea dos o más capas laminares delgadas para facilitar la difusión de moléculas desde una capa hasta una capa adyacente. Los titulares de la patente indicaban que su dispositivo estaba diseñado de modo que el Número de Reynolds estuviera por debajo de 1, preferiblemente menor de 0,1. Observaron que cuando el Número de Reynolds es mayor que 1, el flujo puede ser laminar, pero que tales sistemas tienden a desarrollar turbulencia cuando se perturba el patrón de flujo. Así, el sistema de los titulares de la patente estaba diseñado para asegurar un flujo laminar con mezcladura por difusión. La difusión mejorada se crea entre corrientes paralelas en el flujo laminar en otra Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2002/0076300 (Weigi y otros).

La Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2002/0097532 describía un disco que contenía muchos canales. Dos líquidos se hacían pasar a través de un canal en zigzag en flujo laminar mientras el disco se hacía girar, indicándose que la mezcladura se producía mediante difusión.

Un detector en forma de T se muestra en la Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2001/0042712. El detector entra en contacto con una muestra líquida con un líquido indicador, fluyendo las corrientes en flujo laminar paralelo con difusión entre ellas.

La Solicitud de EE.UU. Publicada 2001/0048637 describe un dispositivo similar, que vence el "efecto mariposa" provocado por la mayor difusión en las paredes que en el centro de las corrientes de flujo laminar paralelas.

La Solicitud de EE.UU. Publicada 2002/0076350 ilustra otro método para mejorar la difusión entre corrientes de flujo laminar. La corrientes de flujo laminar paralelas se hacían mover a través de vueltas de 90º para cambiar la relación de dimensiones de las corrientes, mejorando de ese modo la difusión entre las corrientes.

Se describen micromezcladores en U.S. 6.190.034 B1 y U.S. 6.241.379 B1. Los líquidos se mezclan creando capas finas para facilitar la mezcladura mediante difusión.

Las patentes y solicitudes analizadas anteriormente se refieren a hacer pasar una corriente de reactivo adyacente a una corriente de muestra de modo que mediante difusión se produzca una reacción y a continuación se mida. En otras patentes y solicitudes, la mezcladura se intenta por diversos medios, a pesar de que los líquidos tengan flujo laminar.

En la Solicitud de EE.UU. Publicada 2001/0048900, se mezclan corrientes separadas creando una turbulencia en una cámara. En algunas realizaciones, los inventores indican que se alcanza un Número de Reynolds de 320 y los fluidos primero y segundo tienen Números de Reynolds entre 1 y 2000. Por lo tanto, el flujo está en una región entre el flujo laminar y el flujo turbulento.

La Patente de EE.UU. 5.921.678 describe un mezclador de líquidos en el que dos corrientes de líquido se encuentran de frente y salen juntas en un canal a 90º desde los canales de entrada. Se dice que el Número de Reynolds de las corrientes es 2000-6000. Se muestran pilares de bordes agudos para ayudar a generar turbulencia en la intersección de las corrientes que se mezclan.

La Solicitud de EE.UU. Publicada 2002/0048535 muestra un dispositivo en el que dos líquidos se combinan durante la rotación del dispositivo para transferir los líquidos de un recipiente a otro.

La Patente de EE.UU. 6.264.900 proporciona la mezcladura de corrientes de flujo laminar paralelas para llevar a cabo reacciones químicas rápidas.

La Patente de EE.UU. 6.065.864 describe un sistema de micromezcladura que incluye bombas y válvulas controladas por burbujas para establecer un flujo de circulación en una cámara de mezcladura.

La Solicitud de EE.UU. Publicada 2003.0133358 A1 describe un mezclador de apertura microfluídico de múltiples corrientes. En una realización, estos dispositivos contienen canales microfluídicos que se forman en diversas capas de una estructura tridimensional. La mezcladura puede efectuarse con diversas manipulaciones de la trayectoria del fluido y/o contactos entre corrientes fluidas. En diversas realizaciones, estructuras tales como solapamientos de canales, platinas, regiones convergentes/divergentes, vueltas y/o aperturas pueden diseñarse en un dispositivo de mezcladura. Un dispositivo microfluídico para mezclar múltiples corrientes de fluido puede incluir múltiples canales de entrada que emergen en un canal de unión y múltiples regiones de contracción/expansión en comunicación hidráulica con el canal de unión. Cada una de las regiones de contracción/expansión incluye un pequeño orifico o abertura.

Walter y otros, Fluiddynamische Aspekte in Mikrostrukturreaktoren, Chemie Ingenieur Technik, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 1999. Vol. 71, Nº 5 (447 - 455) describe un reactor de microcanales que tiene hasta 100 microcanales. Se investiga la dinámica de fluidos en dispositivos con 20 ó 30 microcanales.

US-A-2003/0044322 describe un método y un aparato de acuerdo con el preámbulo de las reivindicaciones 1 y 21.

Los presentes inventores deseaban proporcionar la mezcladura eficaz de reactivos líquidos o líquidos acondicionadores con fluidos de muestra en dispositivos microfluídicos. Tal mezcladura se hace difícil por el desajuste entre la viscosidad y el volumen de los líquidos que han de mezclarse. Su solución al problema se describirá con detalle posteriormente.

Sumario de la invención

Se mezclan líquidos en un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 21 mediante un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que al menos dos líquidos se aportan a una primera cámara para combinar los líquidos. En una realización preferida, los líquidos se aportan a la primera cámara desde pocillos que contienen los líquidos. En una segunda etapa, los líquidos combinados se descargan de la primera cámara a través de al menos un pasaje capilar hacia una segunda cámara para mezclar los líquidos. En algunas realizaciones, se usan dos o más pasajes capilares paralelos. En otra realización, la segunda cámara está en comunicación hidráulica con al menos una tercera cámara de mezcladura a través de al menos un pasaje capilar.

La mezcladura de los líquidos resulta cuando entran y salen las cámaras que son grandes con relación a los canales estrechos a través de los cuales entran y salen. Se considera que la perturbación en el patrón de flujo de los líquidos es responsable de la mezcladura que se observa que se produce. En algunos casos, se ha observado que se forman gotículas cuando los líquidos salen de un pasaje capilar hacia una cámara grande. Tales gotículas pueden contribuir a la mezcladura ya que sufren coalescencia dentro de la cámara.

El proceso de mezcladura se completa forzando los líquidos de la primera cámara a través de uno o más pasajes capilares hacia la segunda cámara. En dispositivos microfluídicos que usan el método de la invención, los pasajes capilares tienen dimensiones de sección transversal entre 1 y 2000 \mum, preferiblemente de 200 a 1000 \mum, o según pueda ser requerido por las propiedades de los líquidos. La longitud de los capilares entre las dos cámaras estará entre 0,5 y 100 mm, preferiblemente 1-50 mm. No se cree que la conformación de sección transversal de los pasajes capilares sea crítica. Típicamente, los pasajes tienen una sección transversal rectangular, pero la conformación puede estar determinada por el método usado para formar los pasajes. Las dimensiones en un diseño típico se elegirán para proporcionar una velocidad del líquido de 1 mm/s o más en los pasajes, teniendo en cuenta la viscosidad del líquido y la fuerza aplicada.

Cada una de las dos cámaras es mayor que el volumen total de los líquidos que se mezclan. Preferiblemente, el volumen de cada cámara es aproximadamente dos veces mayor que el volumen de los líquidos combinados o más. La altura de cada cámara es suficiente para proporcionar espacio libre por encima de los líquidos después de que hayan entrado en la cámara. Preferiblemente, el espacio por encima del líquido será suficiente para permitir que el líquido que entra en la cámara se separe en gotículas, por ejemplo aproximadamente 100 \mum o más. Más preferiblemente, la altura de la cámara será aproximadamente dos veces la altura necesaria para contener el volumen de líquidos combinados que se mezclan. Los pasajes capilares están situados preferiblemente en el espacio libre por encima de los líquidos de las cámaras.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la mezcladura de dos líquidos de acuerdo con la invención.

La Figura 2 muestra una realización alternativa de la invención.

La Figura 3 ilustra un dispositivo microfluídico.

Descripción de las realizaciones preferidas Flujo en los Microcanales

Los dispositivos microfluídicos que emplean la invención usan típicamente canales que tienen dimensiones de sección transversal en el intervalo de aproximadamente 1 a 2000 \mum, preferiblemente de aproximadamente 200-1000 \mum. Cuando los canales tienen una sección transversal que es generalmente rectangular, la dimensión puede referirse a la diagonal del rectángulo. Se cree que la dimensión mínima para tales canales es aproximadamente 5 \mum para muchas aplicaciones prácticas, ya que los canales menores pueden separar por filtración efectivamente los componentes de la muestra que se analiza. Cuando no hay problema, pueden usarse dimensiones menores. Los canales en el intervalo preferido hacen posible mover muestras líquidas solo mediante fuerzas capilares. También es posible detener el movimiento mediante paredes capilares que se han tratado para volverse hidrófobas con relación al fluido de muestra o mediante cambios notables en las dimensiones de los canales. La resistencia al flujo puede vencerse aplicando una diferencia de presión, por ejemplo, mediante bombeo, vacío, electroósmosis, calentamiento, materiales absorbentes, capilaridad adicional o fuerza centrífuga. Como resultado, los líquidos pueden aforarse y moverse de una región del dispositivo a otra según se requiera para el análisis que se lleva a cabo en el dispositivo microfluídico.

Puede usarse un modelo matemático para relacionar la diferencia de presión (por ejemplo, fuerza centrífuga), las propiedades físicas del fluido, la tensión superficial del fluido, la energía superficial de las paredes capilares, el tamaño de los capilares y la energía superficial de las partículas obtenidas en fluidos que han de analizarse. Es posible predecir el caudal de un fluido a través del capilar y los grados deseados de hidrofobia o hidrofilia. Los siguientes principios generales pueden extraerse de la relación de estos factores.

Para cualquier pasaje dado, la interacción de un líquido con la superficie del pasaje puede o no tener un efecto significativo sobre el movimiento del líquido. Cuando la relación de superficie a volumen del pasaje es grande, es decir el área de la sección transversal es pequeña, las interacciones entre el líquido y las paredes del pasaje se vuelven muy significativas. Este es especialmente el caso cuando se trata de pasajes con diámetros nominales menores de aproximadamente 200 \mum, donde predominan las fuerzas capilares relacionadas con las energías superficiales de la muestra líquida y las paredes. Cuando las paredes están humedecidas por el líquido, el líquido se mueve a través de los pasajes sin que se apliquen fuerzas externas. A la inversa, cuando las paredes no están humedecidas por el líquido, el líquido intenta retirarse del pasaje. Estas tendencias generales pueden emplearse para hacer que un líquido se mueva a través de un pasaje o para detener el movimiento en la unión con otro pasaje que tiene un área de la sección transversal diferente. Si el líquido está en reposo, entonces puede moverse mediante una diferencia de presión, tal como aplicando fuerza centrífuga. Podrían usarse otros medios, incluyendo presión de aire, vacío, electroósmosis, calentamiento, materiales absorbentes, capilaridad adicional y similares, que son capaces de aplicar la diferencia de presión necesaria en la unión entre pasajes que tienen áreas de la sección transversal o energías superficiales diferentes. En la presente invención, están disponibles fuerzas capilares grandes, haciendo posible mover líquidos solo mediante fuerzas capilares, sin requerir fuerzas externas, excepto durante períodos cortos en los que debe vencerse un tapón capilar. Sin embargo, los pasajes más pequeños son inherentemente más propensos a ser sensibles a la obstrucción por partículas de las muestras biológicas o los reactivos. Por consiguiente, la energía superficial de las paredes del pasaje se ajusta según se requiera para el uso con el fluido de muestra que ha de probarse, por ejemplo sangre, orina o similares. Esta característica permite elaborar diseños más flexibles de dispositivos analíticos.

Dispositivos Analíticos Microfluídicos

Los dispositivos analíticos de la invención pueden denominarse "chips". Generalmente son pequeños y planos, típicamente de aproximadamente 25 a 50 mm cuadrados (de 1 a 2 pulgadas cuadradas), o discos que tienen un radio de aproximadamente 40 a 80 mm. El volumen de las muestras será pequeño. Por ejemplo, contendrán solo de aproximadamente 0,1 a 10 \mul para cada ensayo, aunque el volumen total para un espécimen puede variar de 10 a 200 \mul. Las cámaras que contienen los líquidos de muestra y los reactivos típicamente serán relativamente anchas y delgadas para que las muestras puedan observarse fácilmente y los cambios resultantes de la reacción de las muestras puedan medirse mediante un equipo adecuado. Los pasajes capilares de interconexión tendrán típicamente una dimensión de la sección transversal en el intervalo de 1 a 2000 \mum, preferiblemente de 200 a 500 \mum. La conformación estará determinada por el método usado para formar los pasajes, pero se prefieren pasajes que tienen secciones transversales rectangulares. La altura de los pasajes será de al menos 5 \mum en muchas aplicaciones prácticas en las que las muestras contienen partículas, pero pueden ser menores cuando la naturaleza de la muestra lo permita.

Aunque existen varios modos en los que pueden formarse los capilares y las cámaras, tales como moldeo por inyección, ablación lasérica, molienda con diamante o abollonado, se prefiere usar moldeo por inyección para reducir el coste de los chips. Generalmente, una porción de base del chip contendrá la red deseada de cámaras y capilares. Después de que los compuestos reactivos se hayan puesto en las cámaras según se desea, una porción de tapa se unirá sobre la base para completar el chip.

Los chips habitualmente están destinados a ser desechables después de un solo uso. Por consiguiente, se elaborarán de materiales económicos hasta donde sea posible, mientras que sean compatibles con los reactivos y las muestras que han de analizarse. En la mayoría de los casos, los chips se elaborarán de plásticos tales como policarbonato, poliestireno, poliacrilatos o poliuretano, alternativamente, pueden elaborarse a partir de silicatos, vidrio, cera o metal.

Los pasajes capilares se ajustarán para que sean bien hidrófobos o bien hidrófilos, propiedades que se definen con respecto al ángulo de contacto formado en una superficie sólida por una muestra o reactivo líquidos. Típicamente, una superficie se considera hidrófila si el ángulo de contacto del agua sobre la superficie es menor de 90º e hidrófoba si el ángulo de contacto es mayor de 90º. Preferiblemente, la energía superficial se ajusta mediante polimerización inducida por plasma en la superficie de los pasajes. Los dispositivos analíticos de la invención también se elaborarán con otros métodos usados para controlar la energía superficial de las paredes de los capilares, tales como revestimiento con materiales hidrófilos o hidrófobos, injerto o tratamientos en corona. La energía superficial de las paredes de los capilares se ajustará para el uso con el fluido de muestra pretendido, por ejemplo, para evitar depósitos sobre las paredes de un pasaje hidrófobo o para asegurar que ninguno de los líquidos se quede en un pasaje. Para la mayoría de los pasajes en los dispositivos microfluídicos de la invención, la superficie es generalmente hidrófila ya que el líquido tiende a humedecer la superficie y las fuerzas de tensión superficial hacen que el líquido fluya por el pasaje. Por ejemplo, la energía superficial de los pasajes capilares se ajusta de modo que el ángulo de contacto del agua sobre la superficie esté entre 10º y 60º cuando el pasaje ha de entrar en contacto con sangre entera o un ángulo de contacto del agua sobre la superficie de 25º a 80º cuando el pasaje ha de entrar en contacto con orina.

El movimiento de los líquidos a través de los capilares puede evitarse mediante tapones capilares, que, como el nombre sugiere, evitan que los líquidos fluyan a través del capilar. Si el pasaje capilar es hidrófilo y promueve el flujo de líquido, entonces puede usarse un tapón capilar hidrófobo, es decir un pasaje más pequeño que tiene paredes hidrófobas. El líquido no es capaz de pasar a través del tapón hidrófobo debido a que la combinación del pequeño tamaño y las paredes no humedecibles da como resultado una fuerza de tensión superficial que se opone a la entrada del líquido. Alternativamente, si el capilar es hidrófobo, no es necesario un tapón entre una cámara y el capilar. Se evita que el líquido de la cámara entre en el capilar hasta que se aplica una fuerza suficiente, tal como mediante fuerza centrífuga, para hacer que el líquido venza la fuerza de tensión superficial opuesta y pase a través del pasaje hidrófobo. Sin embargo, la fuerza centrífuga solo es necesaria para comenzar el flujo de líquido. Una vez que las paredes del pasaje hidrófobo están totalmente en contacto con el líquido, la fuerza de oposición se reduce debido a que la presencia de líquido disminuye la barrera energética asociada con la superficie hidrófoba. Por consiguiente, el líquido ya no requiere fuerza centrífuga para fluir. Aunque no se requiera, puede ser conveniente en algunos casos continuar aplicando fuerza centrífuga mientras el líquido fluye a través de los pasajes capilares para facilitar un análisis rápido.

Cuando un tapón hidrófobo se sitúa en un capilar hidrófilo, debe aplicarse diferencia de presión para vencer el efecto del tapón hidrófobo. En general, la diferencia de presión necesaria es una función de la tensión superficial del líquido, el coseno de su ángulo de contacto con el capilar hidrófilo y el cambio en las dimensiones del capilar. Esto es, un líquido que tenga una alta tensión superficial requerirá menos fuerza para vencer un tapón hidrófobo que un líquido que tenga una tensión superficial inferior. Un líquido que humedezca las paredes del capilar hidrófilo, es decir tenga un ángulo de contacto bajo, requerirá más fuerza para vencer el tapón hidrófobo que un líquido que tenga un ángulo de contacto superior. Cuanto más pequeño sea el canal hidrófobo, mayor será la fuerza que debe aplicarse.

Cuando los pasajes capilares son hidrófilos, un líquido de muestra (que se supone que es acuoso) fluirá naturalmente a través del capilar sin requerir una fuerza adicional. Si se necesita un tapón capilar, una alternativa es usar una sección hidrófoba más estrecha que pueda servir como un tapón según se describe anteriormente. También puede usarse un tapón hidrófilo, aún cuando el capilar sea hidrófilo. Tal tapón es más ancho y más alto que el capilar formando un "salto capilar" y así la tensión superficial del líquido crea una fuerza inferior que promueve flujo de líquido. Si el cambio en las dimensiones entre el capilar y el tapón más ancho es suficiente, entonces el líquido se detendrá a la entrada al tapón capilar. Se ha encontrado que el líquido finalmente se deslizará a lo largo de las paredes hidrófilas del tapón, pero mediante el diseño apropiado de la conformación, este movimiento puede retrasarse suficientemente de modo que el tapón sea eficaz, aún cuando las paredes sean hidrófilas.

Para diseñar chips en los que se aplica fuerza centrífuga para vencer tapones hidrófilos o hidrófobos, pueden usarse pruebas empíricas o simulación informática del flujo para proporcionar una información útil que permita disponer la posición de cámaras que contienen líquido sobre los chips y dimensionar los canales capilares de interconexión de modo que la muestra líquida pueda moverse según se requiera proporcionando la fuerza necesaria al ajustar la velocidad rotacional.

Los dispositivos microfluídicos pueden tomar muchas formas según sea necesario para los procedimientos analíticos que miden el analito de interés. Los dispositivos microfluídicos emplean típicamente un sistema de pasajes capilares que conectan cámaras que contienen reactivos o materiales acondicionadores secos o líquidos. Los procedimientos analíticos pueden incluir la preparación de una muestra aforada diluyendo la muestra, hacer reaccionar previamente el analito para prepararlo para reacciones subsiguientes, retirar componentes interferentes, mezclar reactivos, someter células a lisis, capturar biomoléculas, llevar a cabo reacciones enzimáticas o incubar para episodios de unión, tinción o deposición. Tales etapas preparativas pueden llevarse a cabo antes o durante el aforo de la muestra, o después de aforar pero antes de llevar a cabo reacciones que proporcionan una medida del analito.

En tales procedimientos analíticos, una muestra se combinará con un líquido acondicionador o con un líquido reactivo y a continuación se transferirá a una cámara de mezcladura antes de que se envíe al procesamiento subsiguiente. Será evidente que la mezcladura íntima de la muestra con el líquido reactivo o acondicionador es importante para unos resultados exactos y reproducibles. Como se sabe bien, el flujo en los dispositivos microfluídicos es típicamente laminar, esto es, la viscosidad del líquido tiene un efecto mayor que la inercia del líquido que fluye, de modo que el líquido fluye linealmente sin ser turbulento. Una consecuencia de las condiciones de flujo laminar es que la mezcladura de dos o más líquidos es lenta ya que resulta principalmente de difusión molecular. Según se analiza anteriormente, algunos dispositivos microfluídicos se han diseñado para mejorar la difusión entre capas de líquidos en el flujo laminar. Muchos de estos dispositivos no pretenden que se produzca una mezcladura completa, pero en otros se proporciona el suministro para un contacto estrecho de corrientes líquidas.

En la presente invención se desea la mezcladura completa. Se ha encontrado que la mezcladura a fondo puede alcanzarse mediante el diseño apropiado del dispositivo, de modo que se producen mezclas uniformes combinando muestras líquidas con reactivos o agentes acondicionadores líquidos que tienen viscosidades y volúmenes diferentes.

Mezcladura de Líquidos

Si han de obtenerse resultados analíticos exactos, es importante la mezcladura de las muestras con volúmenes mayores de reactivos líquidos o líquidos acondicionadores. Aunque se ha observado que la mezcladura a fondo se produce en la combinación de cámaras y capilares que se describen en la presente memoria, el proceso por el que se produce la mezcladura no se entiende completamente. Gran parte de la técnica anterior supone que el flujo laminar evita la mezcladura eficaz y de ese modo enfatiza la creación de capas finas de líquido que fluyen en paralelo para facilitar la mezcladura por difusión. Los presentes inventores creen que en sus métodos se producen efectos localizados que benefician la mezcladura, pero son difíciles de medir. Cuando los líquidos pasan a través de los capilares, tienen flujo laminar; por lo tanto, podría esperarse que se produjera poca mezcladura. Sin embargo, a medida que los líquidos entran y salen de capilares que conectan cámaras relativamente grandes, es probable que se creen algunos remolinos o perturbaciones localizados según los líquidos aumenten o disminuyen la velocidad y fluyen alrededor de distintos bordes. Así, aunque el flujo puede ser de naturaleza nominalmente laminar, los efectos creados en la intersección de las paredes de los capilares y las cámaras con el líquido pueden contribuir a la mezcladura de los líquidos. Por otra parte, se añade energía a los líquidos mediante la aplicación de fuerza centrífuga (u otra) para forzar a los líquidos a vencer los tapones capilares. Los líquidos serán acelerados y decelerados a medida que se mueven desde sus posiciones iniciales a través de los capilares hacia cámaras grandes. Se ha observado que a menudo se forman gotículas a medida que los líquidos salen de los capilares. Formar gotículas que combinan diferentes líquidos puede inducir la mezcladura de los líquidos. Se presume que combinar las gotículas individuales proporciona mezcladura adicional en un procedimiento análogo a la estratificación. Esto es, si dos líquidos incompatibles se combinan dividiéndolos y estratificándolos sucesivamente, finalmente las capas se hacen tan delgadas que son indistinguibles. Así, si se combinan miles de gotículas, cualquier separación de los dos líquidos no es evidente y los líquidos están efectivamente completamente mezclados. Además, se presume que se produce un cierto grado de mezcladura mediante difusión molecular a medida que avanza la subdivisión de los líquidos y se reduce la distancia que deben moverse las moléculas. Aunque el grado de mezcladura puede determinarse después de que se haya producido, el diseño de las características microfluídicas necesarias variará dependiendo de los volúmenes relativos de los líquidos que han de mezclarse y de sus propiedades físicas y puede requerir confirmación experimental.

Esta descripción general del proceso de mezcladura se aplica a diversos líquidos. Sin embargo, las condiciones usadas requieren modificación dependiendo de la viscosidad y los volúmenes relativos de los líquidos que se mezclan. Será evidente que mezclar un líquido viscoso con uno que sea mucho menos viscoso será más difícil que mezclar dos líquidos que tengan viscosidades bajas similares. Mezclar dos líquidos viscosos también será difícil de realizar uniformemente. Se espera que combinar dos líquidos que tengan volúmenes significativamente diferentes será más difícil que mezclar líquidos de volúmenes iguales. Se ha encontrado que pueden usarse ciertos parámetros para definir las condiciones necesarias para producir la mezcladura de líquidos de acuerdo con la invención. En general, dos o más líquido se combinan en una primera cámara, que se vacía a través de al menos un pasaje capilar de conexión en una segunda cámara, donde los líquidos completan el proceso de mezcladura. Uno de tales procesos se muestra en un diagrama simplificado en la Fig. 1, analizado posteriormente. El movimiento de los líquidos típicamente requiere la aplicación de fuerza para vencer la resistencia a fluir inherente en el uso de pasajes pequeños y la resultante de tapones capilares añadidos para evitar que los líquidos fluyan. La fuerza centrífuga se usa a menudo para este propósito, pero pueden necesitarse otros métodos que pueden producir la fuerza necesaria, incluyendo presión de aire, vacío, electroósmosis, materiales absorbentes, capilaridad adicional y similares. La fuerza aplicada es suficiente para crear un flujo de líquido en los pasajes capilares de 1 mm/s o más. Estos pasajes tienen dimensiones de la sección transversal entre 1 \mum y 2000 \mu, preferiblemente de 200 a 1000 \mum, según se determina por las propiedades físicas de los líquidos. Los pasajes tendrán una longitud entre 0,5 y 100 mm, preferiblemente 1-50 mm, dependiendo de la disposición de las cámaras y los pasajes en el chip. La diferencia de dimensiones entre las de los pasajes capilares y las cámaras asociadas es tan grande que el movimiento de líquidos de una cámara a otra crea una perturbación en el flujo. Además, se cree que la tensión superficial de los líquidos es responsable de las gotículas que se ha observado que se forman en el punto en el que los líquidos salen de los pasajes capilares y entran en una cámara mayor para la mezcladura. Las gotículas son forzadas al exterior de la cámara receptora por la fuerza centrífuga (en el caso típico), donde se combinan.

Las cámaras tendrán diversas conformaciones, pero típicamente serán generalmente circulares o cuadradas. Deben contener figuras internas tales como escalones o rampas. Se cree que tales figuras tienen un efecto secundario sobre la mezcladura de los líquidos, aunque pueden incluirse por otras razones. Se considera importante que se proporcione espacio suficiente en las cámaras de mezcladura por encima de los líquidos que se mezclan. Se cree que al menos 100 \mum de espacio libre serán necesarios en una cámara típica que contiene de aproximadamente 0,1 a 50 \mul. Preferiblemente, las cámaras tendrán un volumen de aproximadamente dos veces el volumen total de los líquidos que se mezclan y la altura de las cámaras será aproximadamente dos veces la del nivel de líquido dentro de la cámara. Se supone que cámaras mayores y alturas mayores proporcionan mezcladura mejorada, pero pueden no ser óptimas. Las cámaras menores y las alturas menores pueden proporcionar resultados satisfactorios, aunque se espera que la mezcladura esté dificultada cuando esté disponible menos espacio de aire por encima de los líquidos.

Las Figuras 1A y B muestran la mezcladura de acuerdo con la invención en una forma simplificada, tal como la que se producirá en dispositivos microfluídicos. Un líquido de muestra en el recipiente 10 es retenido en el recipiente 10 hasta que se libera aplicando fuerza, por ejemplo fuerza centrífuga, para vencer el tapón 12 capilar. De forma similar, un reactivo líquido o un líquido acondicionador, por ejemplo una solución tamponadora, permanece en el recipiente 14 mediante un tapón 16 capilar hasta que se ha aplicado la fuerza necesaria. Los dos líquidos fluyen a través de capilares hacia la primera cámara 18. La cámara 18 recibe la muestra y el segundo líquido al mismo tiempo de modo que se produce mezcladura preliminar, a medida que los líquidos entran en la cámara 18. En la mayoría de los casos, la mezcladura no es adecuada y se necesita una segunda etapa. Los líquidos combinados abandonan la primera cámara 18 a través de al menos un pasaje 20 capilar y entran en la segunda cámara 22 de mezcladura. El líquido puede formar pequeñas gotículas a medida que abandona el capilar 20 y entra en la cámara de mezcladura. Mezclando de ese modo los líquidos dentro de las gotículas a medida que se forman. Se efectúa mezcladura adicional a medida que las gotículas se recombinan en el fondo de la cámara 22 de mezcladura.

En otra realización de la Fig. 1, se usan tres pasajes capilares, por ejemplo 20, 20a y 20b, para conectar la primera cámara 18 a la segunda cámara 22 de mezcladura. Pueden usarse más de tres capilares, como en el Ejemplo 1 posterior. Preferiblemente, los capilares no tendrán el mismo diámetro de modo que la velocidad en los capilares varía, produciendo gotículas de diferente tamaño, y mejorando adicionalmente la mezcladura. Si se usan múltiples capilares, pueden disponerse para hacer que los líquido salientes se encuentren dentro de la cámara 22.

Otra alternativa mostrada en las Figs. 2A y B es particularmente útil cuando se mezclan líquidos que tienen diferentes viscosidades. Los capilares 20 y otros descargarán en una cámara 24 de premezcladura, a partir de la cual capilares 21 y otros adicionales trasportarán los líquidos combinados hasta la cámara 22 de mezcladura. Cámaras de premezcladura adicionales podrían proporcionarse para mejorar adicionalmente la mezcladura. En ambas vistas en sección, Fig. 1B y Fig. 2B, puede observarse que los pasajes 20 y 21 capilares estarán situados típicamente en la parte superior de un chip que contiene las cámaras de más altura. Así, cuando se aplica fuerza a los líquidos, se mueven hasta los pasajes y a continuación entran en la siguiente cámara.

Habiendo descrito varias realizaciones que se encuentra que proporcionan en la práctica mezcladura eficaz, se entenderá que se sugieren ciertas variantes para considerar en casos particulares. Una alternativa sería combinar los capilares que suministran los líquidos separados antes de entrar en la primera cámara. Esto tendría la ventaja de crear un grado de mezcladura en el capilar combinado a medida que se incrementa la velocidad del líquido, lo que conduciría a más mezcladura creada por la entrada en la cámara. A continuación, además, la primera cámara podría estar provista de microestructuras para crear remolinos o perturbaciones localizados para mejorar la mezcladura. En el caso más simple, los líquidos podrían depositarse directamente en la primera cámara 18 en vez de situarse en los pocillos 10 y 14.

Ya se ha sugerido que cuando se usan múltiples capilares para suministrar los líquidos a la segunda cámara de mezcladura, los capilares podrían tener diferentes diámetros y que podrían disponerse para colisionar a medida que las corrientes/gotículas de líquido entran en la cámara de mezcladura. Otra alternativa sería dividir los varios capilares antes de entrar en la segunda cámara de mezcladura para obtener las ventajas asociadas con los remolinos creados a la entrada y los cambios en la velocidad del líquido. La segunda cámara de mezcladura también podría estar provista de microestructuras para ayudar a la mezcladura.

El dispositivo microfluídico ilustrado en la Fig. 3 se describirá en el Ejemplo 3 según se usa en un procedimiento analítico particular. El dispositivo mezcla un líquido en la cámara 18 con una muestra aforada contenida en el capilar 14 y la cámara 16. Los líquidos son recibidos en la cámara 20 y transferidos a la cámara 30 de mezcladura, a partir de la cual los líquidos mezclados fluyen hacia fuera para el análisis.

Otro aspecto de la invención se refiere al movimiento de líquidos mezclados hacia cámaras aguas abajo para el procesamiento adicional. Será evidente que la mezcladura debe completarse antes de que los líquidos se muevan. Se han considerado varios medios posibles para prevenir el movimiento prematuro de los líquidos antes de que la mezcladura sea completa. En un método, los líquidos mezclados entran en un capilar situado por encima de la altura normal del líquido en el pocillo de mezcladura. Se ha encontrado que, después de que se reduzca la fuerza centrífuga que mantiene al líquido en posición en la cámara de mezcladura, el líquido tiende a deslizarse ascendentemente a lo largo de las paredes de la cámara y puede alcanzar el capilar de salida. En un segundo método, el capilar de salida se introduce desde debajo del nivel de líquido en la cámara de mezcladura pero no hasta que se venza la resistencia de un tapón hidráulico mediante la aplicación de la fuerza necesaria. En un tercer método, el capilar de salida se sitúa por encima de la altura de líquido en la cámara de mezcladura y la tendencia natural para que el líquido se mueva mediante fuerzas capilares es apoyada proporcionando microestructuras, por ejemplo una rampa ranurada que conduce al capilar de salida.

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Aplicaciones

Los dispositivos microfluídicos pueden tener muchas aplicaciones. Pueden llevarse a cabo análisis sobre muestras de muchos fluidos biológicos, incluyendo, pero no limitados a, sangre, orina, agua, saliva, fluido espinal, fluido intestinal, alimento y plasma sanguíneo. La sangre y la orina son de particular interés. Una muestra del fluido que ha de probarse se deposita en el pocillo de muestra y subsiguientemente se mide en uno o más capilares o pocillos de aforo en la cantidad que ha de analizarse. La muestra aforada se ensayará con respecto al analito de interés, incluyendo, por ejemplo, una proteína, una célula, una molécula orgánica pequeña o un metal. Ejemplos de tales proteínas incluyen albúmina, HbA1c, proteasa, inhibidor de proteasa, CRP, esterasa y BNP. Células que pueden analizarse incluyen E. coli, pseudomonas, glóbulos bancos, glóbulos rojos, h. pylori, strep a, chlamdia y mononucleosis. Metales que pueden detectarse incluyen hierro, manganeso, sodio, potasio, litio, calcio y magnesio.

En muchas aplicaciones, se mide el color desarrollado por la reacción de reactivos con una muestra. Son posibles otros análisis espectroscópicos de la muestra, usando detectores situados para detectar la absorbancia, la reflectancia, la transmisión y la emisión, tal como fluorescencia, fosforescencia, luminiscencia y otros cambios en las longitudes de onda del infrarrojo cercano y lejano, Raman y ultravioleta. También es factible realizar medidas eléctricas de la muestra, usando electrodos situados en los pequeños pocillos del dispositivo. Ejemplos de tales análisis incluyen transductores de señales electroquímicas basados en métodos de detección amperométricos, impedimétricos y potenciométricos. Ejemplos incluyen la detección de químicas oxidativa y reductiva y la detección de episodios de unión.

Existen diversos métodos reactivos que podrían usarse en dispositivos microfluídicos. Los reactivos sufren cambios por los que la intensidad de la señal generada es proporcional a la concentración del analito medida en el espécimen clínico. Estos reactivos contienen colorantes indicadores, metales, enzimas, polímeros, anticuerpos, ingredientes electroquímicamente reactivos y diversos otros productos químicos secados sobre portadores. Portadores usados a menudo son papeles, membranas o polímeros con diversas propiedades de captación y transporte de muestra. Pueden introducirse en las cámaras para reactivos de los dispositivos microfluídicos.

Es posible un número de usos para los reactivos. Por ejemplo, un analito puede hacerse reaccionar con un reactivo en una primera cámara y a continuación el reactivo que ha reaccionado dirigirse a una segunda cámara para una reacción adicional. Además, un reactivo puede resuspenderse en un líquido en una primera cámara y moverse hacia una segunda cámara para una reacción. Un analito reactivo puede atraparse en una cámara primera o segunda y realizarse una determinación del reactivo libre frente al unido. Un tercer reactivo líquido puede usarse para lavar materiales atrapados en la segunda cámara y para mover los materiales a la cámara residual.

La determinación de un reactivo libre frente a unido es particularmente útil para un inmunoensayo multizonal y ensayos de ácidos nucleicos. Existen diversos tipos de inmunoensayos multizonales que podrían adaptarse a estos dispositivos. En el caso de la adaptación de ensayos inmunocromatográficos, los reactivos y los filtros se ponen en cámaras separadas y no tienen que estar en contacto físico ya que no están en juego fuerzas cromatográficas. Los inmunoensayos o el ensayo de DNA pueden realizarse para la detección de bacterias tales como especies Gram negativas (por ejemplo, E. Coli, Entereobacter, Pseudomonas, Klebsiella) y especies Gram positivas (por ejemplo, Staphylococcus Aureus, Entereococc). Pueden desarrollarse inmunoensayos para grupos completos de proteínas y péptidos tales como albúmina, hemoglobina, mioglobina, \alpha-1-microglobulina, inmunoglobulinas, enzimas, glicoproteínas, inhibidores de proteasa, fármacos y citoquinas. Véanse, por ejemplo: Greenquist en U.S. 4.806.311, Multizone analytical Element Having Labeled Reagent Concentration Zone, 21 de febrero de 1989, Liotta en U.S. 4.446.232, Enzyme Immunoassay with Two-Zoned Device Having Bound Antigens, 1 de mayo de 1984.

Aplicaciones potenciales en las que se resolubilizan reactivos secados incluyen filtración, análisis por sedimentación, lisis celular, clasificación celular (diferencias de masas) y separación centrífuga. El enriquecimiento (concentración) de analito de muestra sobre una fase sólida (por ejemplo, microcuentas) puede usarse para una sensibilidad mejorada. Las microcuentas enriquecidas podrían separarse mediante centrifugación continua. Puede usarse multiplexado (por ejemplo, aforo de una variedad de cámaras para reactivo en paralelo y/o en secuencia) que permite canales múltiples, produciendo cada uno un resultado discreto definido. El multiplexado puede realizarse mediante una disposición de capilares que comprende una multiplicidad de bucles capilares de aforo, y conectados hidráulicamente con la compuerta de entrada, o una disposición de canales de dosificación y/o tapones capilares conectados a cada uno de los bucles capilares de aforo. La combinación con fuerzas secundarias tales como fuerzas magnéticas puede usarse en el diseño del dispositivo. Pueden usarse partículas tales como cuentas magnéticas como un portador para reactivos o para la captura de constituyentes de muestra tales como analitos o sustancias interferentes. Puede usarse la separación de partículas mediante propiedades físicas tales como densidad (análogo a la fraccionación separadora).

El Ejemplo 3 posterior ilustra la invención usada al llevar a cabo un ensayo para medir el contenido de hemoglobina glicada (HcA1c) de la sangre de un paciente que puede indicar el estado de pacientes diabéticos. El método usado ha sido el objeto de un número de patentes, la más reciente U.S. 6.043.043. Normalmente, la concentración de hemoglobina glicada está en el intervalo de 3 a 6 por ciento, pero, en los pacientes diabéticos puede ascender a un nivel de aproximadamente 3 a 4 veces más. El ensayo mide la concentración de glucosa en sangre media a la que se ha expuesto la hemoglobina durante un período de aproximadamente 100 días. Anticuerpos monoclonales desarrollados específicamente para el residuo peptídico N-terminal glicado en la hemoglobina A1c se marcan con partículas de látex coloreadas y se ponen en contacto con una muestra de sangre para ligar los anticuerpos marcados a la hemoglobina glicada. Antes de ligar los anticuerpos marcados, la muestra de sangre se desnaturaliza en primer lugar mediante contacto con un desnaturalizante/oxidante, por ejemplo tiocianato de litio, según se describe en U.S. 5.258.311 de Lewis. A continuación, la muestra de sangre desnaturalizada y marcada se pone en contacto con un reactivo aglutinador y la turbidez formada es proporcional a la cantidad de la hemoglobina glicada presente en la muestra. La cantidad total de hemoglobina presente también se mide para proporcionar el porcentaje de la hemoglobina que está glicado. La mezcladura de la muestra de sangre con el desnaturalizante/oxidante se lleva a cabo de acuerdo con la presente invención.

Ejemplo 1

Se elaboró un dispositivo microfluídico que tenía la configuración general mostrada en la Fig. 1, incluyendo cinco capilares, 20 y otros, paralelos que conectan las cámaras 18 y 22.

El pocillo 10 para muestra se cargó con 10 \mul de una solución de rojo fenol con tampón (pH 4,0). El pocillo 14 se cargó con 10 \mul de una solución de rojo fenol (pH 7,0). Capilares de 10 mm de longitud conectaban las cámaras para muestra y reactivo a la primera cámara 18. Cada capilar tenía 200 \mum de altura y 700 \mum de anchura, conteniendo 0,4 \mul. La primera cámara 18 tenía 5,5 mm de diámetro, 1,5 mm de altura y tenía una capacidad de aproximadamente 36 \mul. La segunda cámara 22 tenía 5,5 mm de diámetro y 1,1 mm de altura, con una capacidad de aproximadamente 26 \mul. El dispositivo se puso sobre una plataforma y se hizo girar a 2500 rpm a una distancia de aproximadamente 28 mm para vencer la resistencia de los tapones 12 y 16 y para aportar los líquidos de los pocillos 10 y 14 al mismo tiempo a una primera cámara 18. Los líquidos mezclados pasaban inmediatamente a través de cinco pasajes (20 y otros) capilares que conectaban la primera cámara 18 y la segunda cámara 22. Cada capilar tenía 3,5 mm de largo, 200 \mum de alto y 200 \mum de ancho. El color del líquido recogido en la segunda cámara 22 era uniformemente amarillo, indicando que se había producido la mezcladura completa.

Se encontró que una vez que se retiraba la fuerza centrífuga, el líquido se movía ascendentemente a lo largo de las caras de la segunda cámara 22 de mezcladura, de modo que los capilares de salida (no mostrados en la Fig. 1) podían cargarse.

Ejemplo 2

Se elaboró otro dispositivo microfluídico, que difería del dispositivo del Ejemplo 1 en que solo un pasaje capilar conectaba la primera cámara 18 y la segunda cámara 22. Además, la segunda cámara 22 estaba provista de una serie de cinco escalones descendentes en la dirección de la fuerza centrífuga que se aplicaba. La primera cámara 18 tenía 5,5 mm de diámetro, 1,5 mm de altura y tenía una capacidad de aproximadamente 36 \mul. La segunda cámara 22 tenía 5 mm de ancho y 7 mm de largo con una altura media de aproximadamente 1,2 mm y un volumen de aproximadamente 46 \mul. El único capilar (3 mm de largo, 200 \mum de alto, 500 \mum de ancho) salía por la parte superior de la rampa escalonada. La cámara de mezcladura y los dos capilares que suministraban a la cámara de dilución tenían las mismas dimensiones que en el Ejemplo 1.

Se añadieron 10 \mul de una solución de rojo fenol (pH 7,0) a un pocillo 10 y se añadieron 10 \mul de solución de rojo fenol con tampón (pH 4,0) al pocillo 14. El dispositivo se hizo girar a una velocidad que era suficiente para vencer los tapones capilares y aportar las dos soluciones a la cámara de dilución inclinada y a continuación a la cámara de mezcladura. Se encontró que el color del líquido en la cámara de mezcladura era uniforme, indicando que se había producido la mezcladura completa.

Ejemplo 3

En este ejemplo, se llevó a cabo una prueba para HbA1c en un chip microfluídico del tipo mostrado en la Figura 3. La energía superficial de las figuras internas se había ajustado para proporcionar un ángulo de contacto de 25º para agua sobre la superficie y estaban cubiertas con una tapa de película de polipropileno (Excel 2930). Una muestra de sangre se introdujo a través de la compuerta 10 para muestra, a partir de la cual avanzaba mediante acción capilar hacia la precámara 12 y a continuación al capilar 14 de aforo. El pocillo 16 auxiliar de aforo es opcional, proporcionándose solo cuando el tamaño de la muestra requiere un volumen adicional. El volumen de la muestra en el capilar 14 y el pocillo 16 era 0,3 \mul. El líquido desnaturalizante/oxidante (9,62 \mul) (reactivo de lisis/extracción de células de mamífero Sigma) estaba contenido en el pocillo 18. Se vació a la primera cámara 20 (18,84 \mul) al mismo tiempo que el pocillo 16 dosificador y el capilar 14 dosificador asociado se vaciaban mediante la aplicación de fuerza centrífuga haciendo girar a 1200 rpm a una distancia de 29 mm para vencer los tapones capilares (no mostrados). La primera cámara 20 proporcionaba espacio para la muestra de sangre y el desnaturalizante/oxidante. Los líquidos combinados se transfirieron a través de un grupo de tres pasajes capilares de 2000 \mum de largo que tenían dimensiones de la sección transversal de 30 por 30 \mum. La segunda cámara 30 recibía y mezclaba los líquidos. A medida que la fuerza se retira el fluido sale de la parte superior de la cámara 30 hacia la cámara 24 a través del pasaje 23 capilar. Los líquidos en exceso se transfirieron al pocillo 31 residual haciendo girar a 2500 rpm a una distancia de 43 mm.

La cámara 24 proporcionaba contacto uniforme de la muestra preacondicionada con anticuerpos monoclonales marcados dispuestos sobre un sustrato seco y servía como una segunda área de dosificación. El volumen de la muestra en el capilar que conducía a la cámara 24 era 2,0 \mum. El contacto de anticuerpos marcados no unidos con el aglutinador, que estaba dispuesto sobre un sustrato, se llevó a cabo en la cámara 26, produciendo un color que se midió para determinar la cantidad de hemoglobina aplicada en la muestra. La aplicación de una fuerza centrífuga haciendo girar a 2500 rpm a una distancia de 53 mm hacía que el conjugado incubado de la cámara 24 y el tampón de lavado de la cámara 22 se vaciaran a la cámara 26. Los pocillos restantes proporcionaban espacio para muestra en exceso (28), muestra desnaturalizada en exceso (31) y para un material absorbente (32) usado para absorber la muestra sobre el sustrato en la cámara 26.

Una muestra de 2 \mul se pipeteó a la compuerta 10 para muestra, a partir de la cual pasaba a través de un pasaje situado dentro del chip (no mostrado) y entraba en la precámara 12, el capilar 14 de aforo y la cámara 16 auxiliar de aforo. Cualquier muestra en exceso pasaba al pocillo 28 de rebose, que contiene un detector de humedad. No se aplicó fuerza centrífuga, aunque se podían haber usado hasta 400 rpm. El tamaño de la muestra (0,3 \mul) se determinó mediante el volumen del capilar 14 y la cámara 16 de aforo. Un tapón capilar a la entrada del pocillo 16 de conexión capilar y la primera cámara 20 evitaba el movimiento adicional de la muestra de sangre hasta que se vencía mediante la fuerza centrífuga, en este ejemplo proporcionada haciendo girar el chip a 1200 rpm. También se evitó que la solución desnaturalizante/oxidante (reactivo de lisis/extracción de células de mamífero Sigma) abandonara el pocillo 18 mediante un tapón capilar hasta que se usaban 1200 rpm para transferir 10 \mul de la solución desnaturalizante/oxidante junto con la muestra de sangre dosificada hacia la primera cámara 20 y posteriormente a la segunda cámara 30 de mezcladura. El volumen de la primera cámara 20 era aproximadamente dos veces el tamaño de la solución desnaturalizante/oxidante y la muestra de sangre combinadas. Después de la mezcladura, 2 \mul de la mezcla abandonan la segunda cámara 30 a través de un capilar y entran en la cámara 24 donde las microestructuras aseguran el humedecimiento uniforme del sustrato (una membrana de liberación de conjugado de vidrio Whatman fibrosa) que contiene los anticuerpos monoclonales marcados con látex para HbA1c. La incubación se completó en unos pocos minutos, después de los cuales la muestra marcada se liberaba a la cámara 26 elevando la velocidad de rotación hasta 2500 rpm para vencer el tapón capilar (no mostrado) a la salida de la cámara 24. La muestra marcada ponía en contacto el aglutinador (poli(ácido aminoaspártico)/péptido de HbA1c) que se separó sobre un reactivo de nitrocelulosa de tamaño de poro de 5 \mum Whatman en concentraciones de 0,1 a 3 mg/ml. El material absorbente (membrana de fibra de vidrio Whatman) del pocillo 32 facilitaba el paso uniforme de la muestra marcada sobre la tira. Mientras la muestra marcada se liberaba a la cámara 26 a 2500 rpm, la solución tamponadora (solución salina tamponada con fosfato) abandonaba el pocillo 22 y pasaba a través de la cámara 24 y sobre la tira de la cámara 26 para mejorar la exactitud de la lectura de las bandas sobre la tira. El color desarrollado se midió leyendo la reflectancia con una cámara digital.

Ejemplo 4

El chip de la Fig. 3 se probó con dos tipos de soluciones. En la primera prueba, una solución de tampón de fosfato a pH 4 se introdujo como entrada 10 de muestra, a partir de la cual se transfirió al capilar 14 para muestra y el pocillo 16. A continuación, esta solución se combinó con el tampón de fosfato a pH 10 en la cámara 18 en la primera cámara 20 de mezcladura. Se encontró que la mezcladura de las dos soluciones tamponadoras se completaba sustancialmente en la cámara 30 a pH 7 mediante medida del colorante. Cuando la muestra era sangre, un líquido más viscoso que el tampón, mezclando con un tampón de lisis (tiocianato de litio) procedente de la cámara 18 requería el uso tanto de la primera cámara 20 como de la segunda cámara 30 de la Fig. 3.

Ejemplo 5

Para simular la mezcladura de sangre con una solución tamponadora acuosa en un dispositivo microfluídico que tiene la configuración general y los elementos de diseño de la Fig. 1, 25% de polietilenglicol (PEG pm 20.000) se añadió a una solución de NaOH 0,5 N. La viscosidad era aproximadamente la de sangre humana. Se añadieron 10 \mul (de la solución de PEG/NaOH) al pocillo 10 y se añadieron 100 \mul de un tampón de pH 4 (fosfato 50 mM) al pocillo 14. Se usó indicador de pH de rojo fenol para indicar el avance de la mezcladura a medida que las dos soluciones se combinaban en las cámaras 18 y 22. Se encontró que visualmente los líquidos tendían a aparecer como líquidos separados mientras estaban bajo fuerza centrífuga aplicada superior, pero que se producía la mezcladura completa cuando la fuerza centrífuga se reducía.

A partir de una serie de pruebas similares, se concluía que no existía diferencia significativa en la eficacia de mezcladura entre el chip con uno y cuatro capilares, entre chips con cámaras receptoras rectangulares y cilíndricas, entre chips con y sin estructuras en forma de rampa y que es posible la mezcladura completa de fluidos viscosos.

Ejemplo 6

La eficacia de someter a lisis sangre con un tampón se probó centrifugando muestras diluidas de la sangre y el tampón mezclados y examinando la sangre y el tampón mezclados con una almohadilla reactiva para sangre oculta de Bayer. Si la lisis es incompleta, pellas rojas de sangre se forman en la centrífuga o aparecen manchas de color verde oscuro en la almohadilla para sangre oculta. Para comparación, soluciones de 50 \mul de sangre y 500 \mul de tampón de lisis (tiocianato de litio) diluido o no diluido se incubaron durante 30 minutos y a continuación se hicieron girar en una centrífuga a 1300 rpm durante 10 minutos. A continuación, la solución se diluyó 100 veces en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,0) y se centrifugó de nuevo a 1300 rpm durante 10 minutos. Se llevó a cabo la mezcladura de sangre en el tampón de lisis en un dispositivo microfluídico, después de lo cual la mezcla se recogió de la cámara de mezcladura y se diluyó 100 y 10.000 veces en tampón de fosfato y se probó mediante la centrifugación y los métodos de reactivos para sangre oculta. Se encontró que la sangre se había sometido a lisis de forma sustancialmente completa en el dispositivo microfluídico. Un estudio adicional mostraba que la lisis de sangre se producía casi instantáneamente durante la mezcladura proporcionada en el dispositivo microfluídico.

Claims (38)

1. Un método para mezclar líquidos en dispositivos microfluídicos que comprende:

(a)

aportar al menos un primer líquido y un segundo líquido a una primera cámara (18) para formar un líquido combinado;

(b)

descargar dicho líquido combinado de (a) procedente de dicha primera cámara (18) a una segunda cámara (22) a través de al menos un pasaje (20) capilar en comunicación hidráulica con dicha primera cámara (18), para completar la mezcladura de dichos líquidos combinados,

caracterizado porque

dicha primera cámara (18) y dicha segunda cámara (22) tienen volúmenes mayores que los del líquido combinado de (a).

2. Un método para mezclar líquidos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho líquido combinado de (a) se descarga a dicha segunda cámara (22) a través de más de un pasaje (20) capilar.

3. Un método para mezclar líquidos de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho líquido combinado de (a) se descarga a dicha segunda cámara (22) a través de al menos dos pasajes (20a, 20b) capilares.

4. Un método para mezclar líquidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha segunda cámara (22) está en comunicación hidráulica con al menos una tercera cámara (24) a través de al menos un pasaje (21) capilar.

5. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho líquido combinado de (a) se descarga a dicha segunda cámara (22) en forma de gotículas.

6. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha primera cámara (18) tiene un volumen de al menos aproximadamente dos veces el del líquido combinado de (a).

7. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha segunda cámara (22) tiene un volumen de al menos aproximadamente dos veces el del líquido combinado de (a).

8. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha primera cámara (18) tiene una altura de al menos aproximadamente dos veces la requerida para contener el volumen combinado de (a).

9. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha segunda cámara (22) tiene una altura de al menos aproximadamente dos veces la requerida para contener el volumen combinado de (a).

10. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que un espacio de al menos 100 \mum está por encima del nivel de líquido en la primera cámara (18).

11. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que un espacio de al menos 100 \mum está por encima del nivel de líquido en la segunda cámara (22).

12. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una dimensión de la sección transversal de 1 a 2000 \mum.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una dimensión de la sección transversal de 200 a 1000 \mum.

14. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una longitud de 0,5 a 100 \mum.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una longitud de 1 a 50 mm.

16. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que tres o más pasajes (20, 20a, 20b) capilares están en comunicación hidráulica entre dichas cámaras primera (18) y segunda (22).

17. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, en el que al menos una de dichas cámaras primera (18) y segunda (22) contiene escalones o rampas para ayudar a la mezcladura de dichos líquidos combinados.

18. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la velocidad de dichos líquidos combinados de (a) en dicho al menos un pasaje (20) capilar es al menos 1 mm/s.

19. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dichos líquidos primero y segundo son aportados desde pocillos (10, 14) a dicha primera cámara (18) a través de pasajes capilares.

20. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 19, en el que los líquidos combinados se mezclan completamente y posteriormente se mueven a cámaras aguas abajo para el procesamiento adicional.

21. Un dispositivo microfluídico que comprende:

(a)

una primera cámara (18) para recibir y combinar al menos un primer líquido y un segundo líquido;

(b)

pocillos (10, 14) que contienen dichos líquidos al menos primero y segundo y que están en comunicación hidráulica a través de pasajes capilares con dicha primera cámara (18);

(c)

una segunda cámara (22) para la mezcladura completa de dichos líquidos al menos primero y segundo, estando dicha segunda cámara (22) en comunicación hidráulica con dicha primera cámara (18) a través de al menos un pasaje (20) capilar,

caracterizado porque

dicha primera cámara (18) y dicha segunda cámara (22) tienen volúmenes mayores que el de los volúmenes combinados de dichos pocillos (10, 14).

22. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dichas cámaras primera (18) y segunda (22) están en comunicación hidráulica a través de más de un pasaje (20) capilar.

23. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dichas cámaras primera (18) y segunda (22) están en comunicación hidráulica a través de al menos dos pasajes (20a, 20 b) capilares.

24. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicha segunda cámara (22) está en comunicación hidráulica con al menos una tercera cámara (24) a través de al menos un pasaje (21) capilar.

25. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 24, en el que dicha primera cámara (18) tiene un volumen de al menos aproximadamente dos veces el volumen combinado de dichos pocillos (10, 14).

26. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 25, en el que dicha segunda cámara (22) tiene un volumen de al menos aproximadamente dos veces el volumen combinado de dichos pocillos (10, 14).

27. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 26, en el que dicha primera cámara (18) tiene una altura de al menos aproximadamente dos veces la requerida para contener el volumen combinado de dichos pocillos (10, 14).

28. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 27, en el que dicha segunda cámara (22) tiene una altura de al menos aproximadamente dos veces la requerida para contener el volumen combinado de dichos pocillos (10, 14).

29. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 28, en el que un espacio de al menos 100 \mum está por encima del nivel de líquido en la primera cámara (18) cuando se está cargando con el volumen combinado de dichos pocillos (10, 14).

30. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 29, en el que un espacio de al menos 100 \mum está por encima del nivel de líquido en la segunda cámara (22) cuando se está cargando con el volumen combinado de dichos pocillos (10, 14).

31. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 30, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una dimensión de la sección transversal de 1 a 2000 \mum.

32. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 31, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una dimensión de la sección transversal de 200 a 1000 \mum.

33. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 32, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una longitud de 0,5 a 100 mm.

34. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 33, en el que dicho al menos un pasaje (20) capilar tiene una longitud de 1 a 50 mm.

35. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 34, en el que tres o más pasajes (20, 20a, 20b) capilares están en comunicación hidráulica entre dichas cámaras primera (18) y segunda (20).

36. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 35, en el que dicho al menos un pasaje (20) está dimensionado para proporcionar una velocidad de líquidos combinados de al menos 1 mm/s cuando se está cargando con el volumen combinado de dichos pocillos (10, 14).

37. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 36, en el que al menos una de dichas cámaras primera (18) y segunda (20) contiene escalones o rampas para ayudar a la mezcladura o la retirada de dichos líquidos primero y segundo.

38. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 37, en el que dicha segunda cámara (22) contiene medios para prevenir el movimiento prematuro de dichos líquidos primero y segundo antes de que se complete la mezcladura de acuerdo con la etapa (c).