ES2305289T3 - Metodo de manipulacion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un método para reproducir y amplificar una secuencia de ácido nucleico objetivo que comprende: a) la reacción de dos cebadores con una doble cadena de ácido nucleico en presencia de la proteína UvsX del bacteriófago T4 para formar un intermediario de recombinación, sin desnaturalizar previamente dicha doble cadena de ácido nucleico, siendo los dos cebadores diseñados para recocerse en sitios complementarios que flanquean una secuencia de ácido nucleico objetivo dentro de dicha doble cadena de ácido nucleico; b) la mezcla de una polimerasa con dicho intermediario de recombinación para formar un complejo de polimerasa, según el cual la polimerasa reproduce la secuencia objetivo.
Description
Método de manipulación de ácidos nucléicos.
La presente invención hace referencia a un
proceso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico
objetivo contenida en un ácido nucleico mayor independiente de la
utilización de un termociclo o una polimerasa termoestable. A
diferencia de las tecnologías actuales que emplean un termociclo y
dependen por lo tanto de una polimerasa termoestable, la presente
invención tiene en cuenta la asociación de plantilla de cebador
específica a una temperatura baja que permanecerá constante a lo
largo de la duración de la reacción.
Se describe un método para la amplificación en
un sitio específico de una región de ácido nucleico. La tecnología
de amplificación actual está basada en la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (RCP). Se puede considerar este sistema de RCP como uno
que implica tres componentes principales. En primer lugar se
necesitan oligonucleótidos de ADN complementarios a los extremos
que flanquean la secuencia objetivo. Estos oligonucleótidos de ADN
sirven como cebadores para la iniciación de la replicación de ADN
mediante el segundo componente del sistema, una ADN polimerasa
dependiente de ADN termoestable, como por ejemplo la polimerasa
Taq. El uso de una ADN polimerasa termoestable es absolutamente
necesario en la RCP de manera que la actividad de la polimerasa
pueda sobrevivir al tercer componente, el ciclo térmico. El ciclo
térmico utiliza temperaturas altas, normalmente de 95 grados
Celsius, para fundir el ADN bicatenario objetivo de modo que la
temperatura de recocido posterior, normalmente en la gama de 50 -
60 grados Celsius, permita el recocido de los cebadores en las
ubicaciones adecuadas que flanquean el ADN objetivo. Después del
paso de recocido, el ciclo térmico incorpora una temperatura de
polimerización, normalmente de 72 grados Celsius, que es la
temperatura óptima de polimerización para las polimerasas
termoestables actuales utilizadas en la RCP.
El requisito de un ciclo térmico para facilitar
el recocido de los cebadores que flanquean el ADN objetivo a ser
amplificado tiene varios inconvenientes. La temperatura de recocido
de los cebadores es un parámetro importante en la consecución de
éxito en la amplificación del RCP. La temperatura de recocido es
característica de cada oligonucleótido: es una función de la
longitud y composición básica del cebador así como de la fuerza
iónica del tampón de reacción. El valor teórico de la amplificación
nunca se consigue en la práctica. Varios factores impiden que esto
ocurra, incluyendo: competencia de las hebras hija complementarias
con los cebadores para el nuevo recocido (es decir, el nuevo
recocido de dos hebras hija no da como resultado una
amplificación); pérdida de actividad encimática debido a la
desnaturalización térmica, especialmente en los ciclos posteriores;
incluso sin desnaturalización térmica, la cantidad de enzimas se
convierte en un factor restrictivo debido al exceso de objetivo
molar en los ciclos posteriores (es decir, tras 25 - 30 ciclos
demasiados cebadores necesitan extenderse); posible recocido de
cebador in sitio secundario y cebado no productivo. Además, los
cebadores deben evitar tramos de secuencias polifásicas (por
ejemplo, poli dG) o motivos recurrentes - estos pueden hibridar con
un registro inadecuado en la plantilla. También deberían evitarse
las secuencias de repetición invertida para impedir la formación de
una estructura secundaria en el cebador, que impediría la
hibridación de la plantilla.
Un inconveniente adicional es la costosa
necesidad de baños térmicos, a los que se exige que cambien sus
temperaturas elevándolas o bajándolas rápidamente, y de una manera
programada y automática. Éstos se conocen como secuenciadores
térmicos o máquinas de RCP.
Otro problema con la RCP es la falta de
fidelidad de las varias polimerasas (Tabla 1) bajo diferentes
condiciones. Sin embargo, con un número cada vez mayor de ciclos
mayor es la probabilidad de generar varios artefactos (por ejemplo,
productos de cebado incorrecto). Es inusual encontrar
procedimientos que tengan más de 40 ciclos. Los errores cometidos
por el ADN polimerasa pueden afectar a la reacción de extensión de
la RCP durante cinco pasos bien diferenciados: (1) la unión del
dNTP correcto mediante la polimerasa; (2) el porcentaje de formación
de uniones fosfodiester; (3) el porcentaje de liberación de
pirofosfatos; (4) la continuación de la extensión tras una
incorporación incorrecta; y (5) la capacidad de la enzima de
adaptarse a una base incorrectamente incorporada proporcionando
actividad de corrección de la exonucleasa 3'-5'. Los
porcentajes de incorporación incorrecta de diferentes polimerasas
se describen en términos de errores por nucleótido polimerizado, y
el porcentaje se puede ver enormemente afectado por muchos
parámetros. Varios estudios han concluido que diferentes ADN
polimerasas termoestables tienen porcentajes de error tan altos como
errores 2,1 x 10^{-4} a 1,6 x 10^{-6} por nucleótido por
extensión
(Tabla 2).
(Tabla 2).
Otro inconveniente principal es que los
protocolos estándar de la RCP pueden amplificar las secuencias de
ADN de 3000 pares base (3 kb) o menos. La RCP larga eficiente
necesita el uso de dos polimerasas: una polimerasa que no es de
corrección es la polimerasa principal de la reacción, y una
polimerasa de corrección (exo 3'-5') está presente
a una concentración menor. Siguiendo los resultados de Cheng et
al. [Cheng, S., Fockler, C., Barnes, W., Higuchi, R. Effective
amplification of long targets from cloned inserts and human genomic
DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 5695-5699 (1994)]
la enzima Tth (ABI/Perkin-Elmer) ha sido utilizada
como la polimerasa de componente principal y Vent (New England
Biolabs) como la polimerasa de componente fraccionado. Otras
combinaciones de polimerasas de corrección y de
no-corrección son difíciles de emplear porque
diferentes actividades en sistemas tampón específicos limitan qué
combinaciones de polimerasas se pueden utilizar. Además, todos los
problemas asociados con las reacciones estándar de la RCP se hacen
incluso más críticos cuando intentan amplificar las regiones de ADN
de 3kb o
mayores.
mayores.
La presente invención elimina estos problemas
con la RCP tradicional eliminando la necesidad de un ciclo térmico
y una polimerasa termoestable en la amplificación de una secuencia
de ADN intercalada dentro de un ADN objetivo más largo. La presente
invención sustituye el ciclo término necesario para recocer los
cebadores a los extremos que flanquean una plantilla objetivo
utilizando las enzimas activas durante la recombinación homóloga,
más específicamente durante el emparejado homólogo o la formación
de bucle-D.
En el bacteriófago T4, la replicación de ADN,
además de iniciarse a partir de orígenes específicos de
replicación, también se inicia de forma muy eficiente a partir de
intermediarios de recombinación. Por consiguiente, la presente
invención está dirigida a un sistema que ceba la replicación de
ADN, de una manera específica, por medio de intermediarios de
recombinación formados en extremos opuestos de una secuencia
objetivo insertada dentro de una secuencia más larga. Esto permite
que se lleve a cabo la reacción a temperatura ambiente y por
consiguiente permite el uso de una polimerasa estable no térmica.
La ventaja principal de emplear una polimerasa no termoestable es
que se han caracterizado varias polimerasas que tienen una
fidelidad muchísimo superior. Por otra parte, la caracterización de
factores accesorios, tales como las proteínas de abrazadera
deslizante, se sabe que incrementa la longitud del ADN que puede
amplificarse hasta genomas completos. Además, la utilización de
enzimas para suministrar los cebadores elimina todos los problemas
asociados con el recocido de los cebadores dentro del contexto de
un ciclo térmico anteriormente mencionado. Por otro lado, la
reacción de emparejado homólogo catalizada por las proteínas del
bacteriófago T4 es extremadamente eficiente y eliminaría el
problema del cebado incorrecto.
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Porcentajes de error
1. Taq (Thermus aquaticus)
1,1 x 10^{-4} sustituciones base/bp [Tindall,
K.R., y Kunkel, T.A. (1988) Biochemistry 27, p
6008-6013, "Fidelity of DNA synthesis by the
Thermus aquaticus DNA polymerase"].
2,4 x 10^{-5} mutaciones del marco de
lectura/bp [Tindall y Kunkel, Id.]
2,1 x 10^{-4} errores/bp [Keohavong, P., y
Thilly, W.G. (1989) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 86(23), p
9253-9257, "Fidelity of DNA polymerases in DNA
amplification"].
7,2 x 10^{-5} errores/bp [Ling, L.L.,
Keohavong, P., Dias, C., y Thilly, W.G. (1991) PCR Methods Appl
1(1) p 63-69, "Optimization of the
polymerase chain reaction with regard to fidelity: modified T7, Taq,
and Vent DNA polymerases"].
8,9 x 10^{-5} errores/bp [Cariello, N.F.,
Swenberg, J.A., y Skopek, T.R. (1991) Nucleic Acids Res
19(15), p 4193-4198, "Fidelity of
Thermococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR
determined by denaturing gradient gel electrophoresis"].
2,0 x 10^{-5} errores/bp [Lundberg, K.S.,
Shoemaker, D.D., Adams, M.W., Short, J.M., Sorge, J.A., y Mathur,
E.J. (1991) Gene 108(1), p 1-6,
"High-fidelity amplification using a thermostable
DNA polymerase isolated from Pyrococccus furiosus"].
1,1 x 10^{-4} errores/bp [Barnes, W.M. (1992)
Gene 112(1), p 29-35, "The Fidelity of Taq
polymerase catalyzing PCR is improved by an
N-terminal deletion"].
\vskip1.000000\baselineskip
2. KlenTaq (Thermus aquaticus, mutante de
supresión de la terminal-N)
5,1 x 10^{-5} errores/bp [Barnes, W.M. (1992)
Gene 112(1), p 29-35, "The Fidelity of Taq
polymerase catalyzing PCR is improved by an
N-terminal deletion"].
\vskip1.000000\baselineskip
3. Vent (Thermococcus litoralis)
2,4 x 10^{-5} errores/bp [Cariello, N.F.,
Swenberg, J.A., y Skopek, T.R. (1991) Nucleic Acids Res
19(15), p 4193-4198, "Fidelity of
Thermococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR determined by
denaturing gradient gel electrophoresis"].
4,5 x 10^{-5} errores/bp [Ling, L.L.,
Keohavong, P., Dias, C., y Thilly, W.G. (1991) PCR Methods Appl
1(1) p 63-69, "Optimization of the
polymerase chain reaction with regard to fidelity: modified T7, Taq,
and Vent DNA polymerases"].
5,7 x 10^{-5} errores/bp [Matilla, P.,
Korpela, J., Tenkanen, T., y Pitkanen, K. (1991) Nucleic Acids Res
19(18), p 4967-4973, "Fidelity of DNA
synthesis by the Thermococcus litoralis DNA
polymerase-an extremely heat stable enzyme with
proofreading activity"].
\vskip1.000000\baselineskip
4. Vent (exo-) (Thermococcus
litoralis)
1,9 x 10^{-4} errores/bp [Matilla et
al., Id.]
\vskip1.000000\baselineskip
5. Deep Vent (especie Pyrococcus
GB-D)
No hay literatura publicada al respecto. New
England Biolabs alega que la fidelidad es igual a o mayor que la de
Vent.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Deep Vent (exo-)
No hay literatura publicada al respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Pfu (Pyrococcus furiosus)
1,6 x 10^{-6} errores/base [Lundberg, K.S.,
Shoemaker, D.D., Adams, M.W., Short, J.M., Sorge, J.A., y Mathur,
E.J. (1991) Gene 108(1), p 1-6,
"High-fidelity amplification using a thermostable
DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus"].
\vskip1.000000\baselineskip
8. Replinasa (Thermus flavis)
1,03 x 10^{-4} errores/base [Matilla, P.,
Korpela, J., Tenkanen, T., y Pitkanen, K. (1991) Nucleic Acids Res
19(18), p 4967-4973, "Fidelity of DNA
synthesis by the Thermococcus litoralis DNA
polymeme-an extremely heat stable enzyme with
proofreading activity"].
La presente invención considera un método para
la replicación y amplificación de una secuencia de ácido nucleico
objetivo tal y como viene definido en la reivindicación 1. El
método utiliza dos cebadores que están diseñados para recocerse en
sitios complementarios flanqueando una secuencia de ácido nucleico
objetivo dentro de un ácido nucleico bicatenario. Los cebadores
reaccionan con el ácido nucleico bicatenario en presencia de un
factor de recombinación para formar un intermediario de
recombinación, sin desnaturalizar de forma previa el ácido nucleico
bicatenario. El intermediario de recombinación así formado es
entonces mezclado con una polimerasa para formar un complejo de
polimerasa, según el cual la polimerasa reproduce la secuencia
objetivo. Preferentemente, la polimerasa es una holoenzima
polimerasa. Más preferentemente, la holoenzima polimerasa consta de
una enzima de polimerasa, una proteína de abrazadera, y una
proteína de cargador de la abrazadera. El factor de recombinación es
la proteína UvsX del bacteriófago T4, la polimerasa es
preferentemente la polimerasa de producto de gen (pg) 43 del
bacteriófago T4, la proteína de abrazadera es preferentemente la
proteína de abrazadera de pg 45 del bacteriófago T4 y el cargador de
la abrazadera es preferentemente el complejo de cargador de la
abrazadera de pg 44/pg 62 del bacteriófago T4.
En otra realización preferente, el complejo de
holoenzima polimerasa consta de un complejo de holoenzima
polimerasa del bacteriófago. Preferentemente, el bacteriófago es el
T4, y el complejo de holoenzima incluye la polimerasa de producto
de gen 43. Preferentemente, el bacteriófago es el T4, y el complejo
de holoenzima incluye la proteína de abrazadera de producto de gen
45.
En otro aspecto, un método considerado utiliza
una proteína de unión de hebra única para facilitar la síntesis del
desplazamiento descendente de la hebra mediante el complejo de
holoenzima polimerasa. La proteína de hebra única es
preferentemente de producto de gen 32 del sistema del bacteriófago
T4.
En todavía otro aspecto, un método considerado
utiliza una proteína de unión de hebra única para desestabilizar la
hélice en o cerca del punto de la unión de la plantilla del
cebador.
En los dibujos aparece oscurecida una parte de
la descripción:
La Fig. 1 representa la formación del complejo
de holoenzima polimerasa en un bucle-D de
recombinación.
La Fig. 2 representa un sistema de amplificación
de gen utilizando un método de la invención.
El proceso de la invención comprende tratar un
ácido nucleico, tal como ARN o ADN, con cebadores oligonucleótidos
que son complementarios de sitios que flanquean una secuencia
objetivo predeterminada dentro de ese ácido nucleico.
Preferentemente, el ácido nucleico es de doble hebra, tal como en
la forma de un ADN heterodúplex. Un proceso de la invención
considera hacer reaccionar hebras complementarias independientes de
un ácido nucleico heterodúplex con un exceso molar de dos cebadores
oligonucleótidos. De forma significativa, este tratamiento no
necesita la desnaturalización previa de las hebras complementarias
del ácido nucleico heterodúplex. En vez de ello, la hibridización
del cebador con su secuencia objetivo se logra mediante un factor
de recombinación. El factor de recombinación funciona para formar
un intermediario de recombinación. Un intermediario de
recombinación ejemplar es una estructura de bucle-D
entre el cebador y las hebras complementarias del ácido nucleico
heterodúplex. Se puede utilizar el factor de recombinación para
pre-tratar el cebador a temperaturas por debajo de
los 90ºC, más preferentemente por debajo de los 45ºC, y aún más
preferentemente a 37ºC.
El factor de recombinación es el producto de gen
UvsX del bacteriófago T4. Un factor de recombinación, como por
ejemplo el UvsX, puede necesitar componentes adicionales, tales
como el ATP, para funcionar de forma óptima. La proteína UvsX del
bacteriófago T4 funciona para facilitar la formación de un
filamento presináptico capaz de someterse a un emparejado homólogo
(Véase la Figura 1). Cuando se mezcla con el ácido nucleico
objetivo, los intermediarios de recombinación resultantes,
posicionados en extremos opuestos del ácido nucleico objetivo,
pueden servir como sitios para la unión de una polimerasa. Una
polimerasa preferente es una holoenzima polimerasa.
Preferentemente, la holoenzima polimerasa es la holoenzima
polimerasa del bacteriófago T4.
La formación del complejo de holoenzima
polimerasa del bacteriófago T4 se muestra en la Fig. 2. Este
complejo de holoenzima polimerasa incluye el ADN polimerasa de
producto de gen (pg) 43, la proteína de abrazadera de producto de
gen 45, y los productos de gen 44 y 62, que juntos facilitan la
asociación de la abrazadera de gen 45 con la polimerasa de producto
de gen 43 explícitamente en la unión de plantilla/cebador del
intermediario de la recombinación (Véase la Figura 2).
La proteína de unión de hebra única de producto
de gen 32 se añade para facilitar la síntesis de desplazamiento de
la hebra mediante el complejo de holoenzima polimerasa (Véase la
Figura 2). También se considera la adición de factores accesorios
para estabilizar el factor de recombinación. Por ejemplo, la
proteína UvsY del bacteriófago, un factor accesorio de la proteína
UvsX, sirve para estabilizar el filamento presináptico inicial
permitiendo la introducción del complejo de helicasa replicativa
del bacteriófago T4, los productos de los genes 41 y 59. Se monta
así una horquilla de replicación intacta que puede extender la gama
de la amplificación de ácido nucleico específico de un sitio más
allá de lo que se pueda esperar utilizando polimerasas
termoestables disponibles solamente durante un termociclo.
En algunas realizaciones de un método de la
invención, se utiliza una polimerasa con gran fidelidad y gran
procesividad, concretamente el ADN polimerasa de pg 43 del
bacteriófago T4. Se ha mostrado que esta polimerasa posee una
precisión en la replicación que es de órdenes de magnitud mayores
que las polimerasas comúnmente asociadas con la RCP y con la
técnica de RCP. Esta polimerasa posee una función de
edición/corrección incorporada que, cuando se usa en conexión con
un proceso de duplicación de ADN autocontenido, aumenta de forma
significativa la precisión de ese proceso de duplicación.
Este incremento en procesividad no solamente
produce un duplicado más exacto, amplía la capacidad de la técnica
para reproducir de forma precisa ácidos nucleicos objetivo con
muchos miles de pares bases. Se encuentran holoenzimas polimerasa
homólogas en otras especies, tales como por ejemplo la ADN
polimerasa III que se encuentra en los sistemas procarióticos, y las
holoenzimas ADN polimerasa épsilon y delta en sistemas
eucarióticos.
En otras realizaciones de un método de la
invención, el uso de un complejo de holoenzima, una abrazadera de
gen, y un complejo de helicasa, permite que la polimerasa funcione
de forma eficiente a lo largo de secuencias de ácido nucleico más
largas de las que pueden duplicarse de manera previsible con las
tecnologías de RCP existentes.
Todo el proceso de duplicación y amplificación
puede ocurrir a temperaturas por debajo de alrededor de los 90ºC,
más preferentemente por debajo de alrededor de los 45ºC, y más
preferentemente a alrededor de 37ºC, debido a la naturaleza
catalítica de los procesos implicados. Dado que ninguna enzima
termoestable se corresponde, se evitan los problemas asociados con
las soluciones de cloruro de magnesio y sus concentraciones. De
forma similar, se elimina el uso del aceite mineral.
Dado que la presente invención está basada en la
creación de un intermediario de recombinación, tal como un
bucle-D, sin desnaturalizar previamente la doble
cadena, y se puede llevar a cabo a temperaturas de alrededor de
37ºC, elimina el recocido no específico/no deseable y superfluo que
ocurre a lo largo de la longitud de la doble cadena
desnaturalizada, y elimina cuestiones de tener las concentraciones
de cebador erróneas, dificultades en la programación con máquinas
de RCP, y tener plantillas excesivas o insuficientes.
Evitando estos problemas comúnmente asociados
con la RCP aumenta más aún la capacidad de un proceso de la
invención para reproducir y amplificar con mayor fidelidad y
procesividad.
El intermediario de recombinación así formado se
mezcla entonces con una polimerasa para formar un complejo de
polimerasa, según el cual la polimerasa reproduce la secuencia de
ácido nucleico objetivo. El cebador se pre-trata
preferentemente con proteína de unión de ácido nucleico de hebra
única. También se prefiere que el cebador sea
pre-tratado con UvsX del bacteriófago T4. Una
polimerasa preferente es el ADN polimerasa de producto de gen 43
del bacteriófago T4.
Tal y como lo entiende una persona que tenga
conocimientos ordinarios de la técnica, la replicación y
amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo por una
polimerasa necesita la presencia de nucleótidos trifosfatos en
concentraciones suficientes para permitir el alargamiento de las
copias nacientes. Además, las concentraciones de los otros
componentes de un método de la invención pueden ser fácilmente
determinadas por una persona que tenga conocimientos ordinarios de
la técnica, basándose en determinaciones empíricas así como en los
ejemplos que siguen a continuación.
Por otra parte, tal y como lo entiende bien una
persona que tenga conocimientos ordinarios de la técnica, un método
de la presente invención permite series, o ciclos, adicionales de
replicación de una secuencia de ácido nucleico objetivo, en virtud
de la reiniciación de un método de la invención. Como tal, no
solamente se copia o reproduce una secuencia de ácido nucleico
objetivo, sino que se amplifica como resultado de la repetición de
un método de la invención. Aunque no desea estar unido en teoría,
se cree que la presencia de un exceso molar de un cebador en
realizaciones de la invención permite la formación repetida de un
intermediario de recombinación y la replicación posterior de un
ácido nucleico objetivo. En este sentido, la presente invención
proporciona una alternativa a la amplificación objetivo de la
RCP.
Esta pluralidad de regiones de ADN de una sola
hebra se trata con un factor de recombinación para formar una
pluralidad de regiones de ADN de una sola hebra
pre-tratadas. Por ejemplo, en una realización
preferente, en presencia de los productos de gen UvsY y UvsX del
bacteriófago T4 y una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo
no digerida, ocurre una reacción cruzada inicial de tres hebras de
una manera aleatoria tal y como lo dicta la distribución de la
digestión de exonucleasas del primer ácido nucleico sobre el que se
forma el filamento presináptico.
Entonces se añade un segundo ácido nucleico de
doble hebra a la pluralidad de las regiones de ADN de una sola
hebra pre-tratadas para formar una pluralidad de
uniones cruzadas de tres hebras. La pluralidad de las uniones
cruzadas de tres hebras se incuba con una helicasa para formar una
pluralidad de uniones Holliday. La pluralidad de las uniones
Holliday así formadas se descompone mediante la incubación con una
endonucleasa. Preferentemente, el factor de recombinación es UvsX
del bacteriófago T4. Preferentemente, la helicasa es los productos
de gen 41 y 59 del bacteriófago T4. Una helicasa aún más preferente
es la UvsW del bacteriófago T4. Una endonucleasa preferente es el
pg 49 del bacteriófago T4.
Con la adición de la actividad de la helicasa
derivada de los productos de los genes 41 y 59, la migración de
rama extiende las regiones de ADN heterodúplex más allá de las
regiones de homología parcial o sin homología. Los productos
finales de la reacción pueden descomponerse con la proteína del
producto de gen 49 del bacteriófago, una endonucleasa que de forma
específica reconocerá y partirá las uniones cruzadas de
recombinación (uniones Holliday) (Véase la figura 3).
Se pueden utilizar enzimas de otras especies en
un método considerado de la invención, además de las enzimas del
sistema del bacteriófago T4. Por ejemplo, se pueden utilizar las
enzimas de E. coli, incluyendo RecA, RecF, RecO, RecR, RuvA,
RuvB, RecG y RuvC. Un factor de recombinación útil en algunas
realizaciones de un método de la invención incluye la proteína UvsX
del bacteriófago T4, la proteína RecA de E. coli, y la
proteína Rad5l de la levadura, así como los homólogos Rad5l de
otras especies eucarióticas. Un factor accesorio útil en algunas
realizaciones de un método de la invención incluye la proteína UvsY
del bacteriófago T4, las proteínas Rec F, O y R de E. coli,
y la proteína Rad52 de la levadura, así como los homólogos Rad52 de
otras especies eucarióticas.
Además de la polimerasa del bacteriófago T4, la
abrazadera y el complejo de carga de abrazadera, la holoenzima ADN
polimerasa III, la abrazadera beta-abrazadera y el
complejo de carga de abrazadera gama-complejo de la
especie procariótica pueden utilizarse en un método de la
invención. Aún más, las holoenzimas ADN polimerasa épsilon y delta,
la abrazadera PCNA, y el complejo de carga de abrazadera del
complejo C de factor de replicación de la especie eucariótica
pueden utilizarse en un método de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La recombinación homóloga dirigió la
amplificación de ácido nucleico de ADN plasmídico circular cerrado
utilizando el complejo de holoenzima T4 y las proteínas de
recombinación homóloga T4 UvsX y el producto de gen 32 se llevaron
a cabo de la manera que sigue. Los cebadores oligonucleótidos
fueron diseñados para amplificar un fragmento de par base 3220 del
ADN plasmídico M13mp18 de la manera que sigue:
Estos cebadores fueron utilizados para la
amplificación de un fragmento de par base 3220 del ADN plasmídico
M13mp18 circular cerrado. Se establecieron condiciones de reacción
para facilitar el montaje de la holoenzima polimerasa, incluyendo
los productos de gen 43, 45, y 44/62 del bacteriófago T4, en
intermediarios de recombinación formados por la acción de la
proteína UvsX del bacteriófago T4. La concentración de ADN
plasmídico M13mp18 circular cerrado de doble hebra fue establecido
a 10 microgramos por mililitro (2,1 nanomolares como nucleótidos).
Ambos oligonucleótidos, 1940 (Nº DE ID. DE LA SECUENCIA: 1) y 5160
(Nº DE ID. DE LA SECUENCIA: 2), fueron utilizados en una
concentración de 210 nanomolares (como moléculas). La concentración
de UvsX estuvo presente para garantizar alrededor del 50% de
cobertura de los cebadores oligonucleótidos de 40mer (monómero
UvsX/tamaño del sitio básico 4). La concentración de ATP se
estableció en 2 milimolares durante la reacción de
bucle-D, y se empleó un sistema de regeneración de
ATP consistente en fosfocreatina quinasa y fosfoenol piruvato. La
proteína de una sola hebra de producto de gen (pg) 32 estuvo
presente a 25 micromolares. La holoenzima se construyó utilizando
un pg 43 de 1 micromolar (polimerasa), un pg 45 de 1 micromolar
(como los trímeros, abrazadera deslizante) y un complejo de pg 44/62
de 500 nanomolares (cargador de la abrazadera dependiente de ATP).
Los desoxirribonucleótidos estuvieron presentes en 3
milimolares.
El orden de reacción fue diseñado para permitir
la formación inicial de un intermediario de recombinación, o
bucle-D, seguido de la formación de un complejo de
holoenzima polimerasa. La plantilla de ADN de doble hebra circular
cerrado M13mp18 fue incubada por primera vez en un tampón de
formación de complejo de holoenzimas (20 milimolares Tris (pH 7,5),
150 milimolares KOAc, 10 milimolares Mg(OAc)_{2})
en presencia de los cebadores, 2 milimolares de ATP, fosfoenol
piruvato y piruvato quinasa.
El emparejamiento homólogo, o formación de
bucle-D, se inició entonces mediante la adición de
la proteína de transferasa de hebra UvsX de T4. Tras 2 minutos a
37ºC, se añadieron 1 milimolar de ATP adicional, 3 milimolares de
mezcla de desoxirribonucleótidos, una proteína de unión de una sola
hebra de pg 32 y la polimerasa de pg 43 y los factores accesorios
de pg 45 y pg 44/62 para iniciar la formación de la holoenzima
polimerasa en intermediarios de recombinación e iniciar la síntesis
de ADN de desplazamiento de la hebra. A los 10, 20 y 30 minutos se
extrajeron alícuotas de la mezcla de reacción y se enfriaron con
SDS y EDTA seguido de calentamiento a 60ºC durante 10 minutos. Las
reacciones se cargaron entonces en un gel de agarosa en TBE al 1,0%
y se visualizaron utilizando bromuro de etidio.
Los geles muestran que el fragmento de par base
3220 del ADN plasmídico M13mp18 se reproduce y amplifica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La recombinación homóloga dirigió la
amplificación de ácido nucleico del ADN plasmídico lineal
utilizando el complejo de holoenzimas de T4 y las proteínas de
recombinación homóloga de T4 UvsX y el producto de gen 32. El ADN
plasmídico circular cerrado de doble hebra M13mpl8 se transformó en
lineal mediante digestión con la endonucleasa de restricción BamH1.
10 microgramos de M13mp18 y la endonucleasa de restricción BamH 1
fueron incubadas a 37ºC utilizando condiciones de tampón estándares
durante 2 horas seguido de extracción de fenol/cloroformo y paso a
través de dos columnas de G-25. Las condiciones de
reacción fueron las descritas para el Ejemplo 1. Los resultados
muestran que el fragmento del ácido nucleico objetivo del ADN
plasmídico M13mp18 se reproduce y amplifica.
Cada una de las patentes y artículos citados en
el presente documento se incorpora como referencia. El uso del
artículo "un" se pretende que incluya una o más cosas.
Los ejemplos y la descripción anteriores se
pretende que sean ilustrativos y no se deben tomar como
restrictivos. Aún así, otras variaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones son posibles y les surgirán fácilmente a aquellas
personas expertas en la técnica.
<110> LA FUNDACIÓN DE INVESTIGACIÓN DEL
ESTADO DE PENSILVANIA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS PARA LA MANIPULACIÓN DE
ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P035659EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 02764202.4
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-04-19
\vskip0.400000\baselineskip
<150> us 60/285127
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-04-20
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Seqwin99, versión 1.02
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatacacct attccgggct atacttatat
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctcaatcg tctgaaatgg attatttaca ttggcagatt
\hfill40
Claims (11)
1. Un método para reproducir y amplificar una
secuencia de ácido nucleico objetivo que comprende:
- a)
- la reacción de dos cebadores con una doble cadena de ácido nucleico en presencia de la proteína UvsX del bacteriófago T4 para formar un intermediario de recombinación, sin desnaturalizar previamente dicha doble cadena de ácido nucleico, siendo los dos cebadores diseñados para recocerse en sitios complementarios que flanquean una secuencia de ácido nucleico objetivo dentro de dicha doble cadena de ácido nucleico;
- b)
- la mezcla de una polimerasa con dicho intermediario de recombinación para formar un complejo de polimerasa, según el cual la polimerasa reproduce la secuencia objetivo.
2. El método de la reivindicación 1 en el que
dicha polimerasa es una holoenzima polimerasa.
3. El método de la reivindicación 2 en el que
dicha holoenzima polimerasa consta de una enzima de polimerasa, una
proteína de abrazadera, y una proteína de cargador de la
abrazadera.
4. El método de la reivindicación 3 en el que
dicha enzima de polimerasa, dicha proteína de abrazadera y dicha
proteína de cargador de la abrazadera se obtienen del bacteriófago
T4.
5. El método de la reivindicación 4 en el que
dicha polimerasa es la polimerasa de producto de gen 43 del
bacteriófago T4, dicha proteína de abrazadera es la proteína de
abrazadera de producto de gen 45 del bacteriófago T4 y dicha
proteína de cargador de la abrazadera es el complejo de cargador de
la abrazadera de producto de gen 62/producto de gen 44 del
bacteriófago T4.
6. El método de la reivindicación 2 en el que
dicho complejo de holoenzima polimerasa comprende un complejo de
holoenzima polimerasa del bacteriófago.
7. El método de la reivindicación 6 en el que
dicho bacteriófago es el bacteriófago T4, y dicho complejo de
holoenzima polimerasa incluye una polimerasa de producto de gen 43
del bacteriófago T4.
8. El método de la reivindicación 6 en el que
dicho bacteriófago es el bacteriófago T4, y dicho complejo de
holoenzima polimerasa incluye una proteína de abrazadera de
producto de gen 45 del bacteriófago T4.
9. El método de la reivindicación 1 en el que
una proteína de unión de una sola hebra se utiliza para facilitar
la síntesis de desplazamiento descendente de la hebra mediante
dicha polimerasa.
10. El método de la reivindicación 9 en el que
dicha proteína de unión de una sola hebra es de producto de gen 32
del bacteriófago T4.
11. El método de la reivindicación 1 en el que
una proteína de unión de una sola hebra se utiliza para
desestabilizar la hélice en o cerca de los puntos de las uniones de
la plantilla del cebador.
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