ES2305024T3

ES2305024T3 - Receptores para interleuquina-12 humana.

Info

Publication number: ES2305024T3
Application number: ES01127361T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Andreas Gubler; David Howard Presky
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1996-07-23
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2016-07-23
Also published as: JPH09132598A; EP1243597A2; JP2948150B2; US5852176A; EP0759466A3; EP1243597B1; DE69637599D1; DK1243597T3; US5840530A; DE69635639D1; EP0759466B1; EP1950226A2; DK0759466T3; PT1243597E; EP0759466A2; ATE400586T1; ES2255067T3; EP1243597A3; DE69635639T2; ATE314468T1

Abstract

Un anticuerpo dirigido contra una proteína del receptor beta2 de interleuquina 12 (IL-12) con baja afinidad de unión, o sus fragmentos, cuya proteína del receptor es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO:1, (a) tiene una baja afinidad de unión para IL-12 desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nM, y (b) cuando se compleja con una proteína del receptor beta1 de interleuquina-12 (receptor beta1 de IL-12) forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para IL-12 desde aproximadamente 5 a aproximadamente 100 pM, en el que el fragmento de una proteína del receptor beta2 de interleuquina-12 de baja afinidad de unión tiene la secuencia de aminoácidos de una parte de una proteína del receptor beta2 de interleuquina-12 y las propiedades (a) y (b) anteriores.

Description

Receptores para interleuquina-12 humana.

Esta solicitud se refiere de forma general a receptores de interleuquina-12, especialmente a receptores de interleuquina-12 humanos.

La interleuquina-12 (IL-12), formalmente conocida como el factor de maduración de linfocitos citotóxicos o el factor estimulante de células asesinas naturales, es una citoquina heterodimérica de 75-kDa compuesta de las subunidades de 40-kDa (p40) y 35-kDa (p35) unidas por disulfuro que tiene múltiples actividades biológicas incluyendo la estimulación de la proliferación de células T activadas y NK (Gately, M. K., et al., 1991, J. Immunol., 147:874) (Kobayashi, M., et al., 1989, J. Exp. Med., 170:827), la potenciación de la actividad lítica de células NK/LAK (Kobayashi, M., et al., 1989, J. Exp. Med., 170:827; Stern, A. S., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6808), la potenciación de respuestas de células T citolíticas (Gately, M.K., et al., 1992, Cell. Immunology, 143:127), la inducción del interferón \gamma en reposo y células T y NK activadas (Kobayashi, M. et al., 1989, J. Exp. Med., 170:827; Chan, S. H., et al., 1991, J. Exp. Med., 173:869) y la promoción de respuestas de linfocitos T coadyuvantes del tipo T_{h}1 (Manetti, R., et al., 1993, J. Exp. Med., 177:1199; Hsieh, C.-S., et al., 1993, Science 260:547).

La actividad biológica de IL-12 es mediada por la unión de las moléculas IL-12 a los receptores de la superficie de celular, o membrana celular, en células T y NK activadas; sin embargo, las contribuciones de las subunidades individuales, p35 y p40, a la unión del receptor y a la transducción de la señal son todavía desconocidas. Los estudios con IL-12 marcada han demostrado que esta unión ocurre de una manera específica y saturable. La IL-12 proporciona una señal en las células diana a través de un receptor que ha sido previamente caracterizado en células T CD4+ y CD8+ activadas con fitohemaglutinina (PHA) y en células NK CD56+ activadas con IL-2 (Chizzonite, R., et al., 1992, J. Immunol., 148:3117; Desai, B., et al., 1992, J. Immunol., 148:3125).

En un estudio de más de 20 líneas celulares humanas que pertenecían a líneasT, B, NK y mielomonocíticos sólo se identificó una línea de células T CD4+ humana dependiente de IL-2 individual, (Kit 225/K6) que expresaba constitutivamente al receptor de IL-12 y respondía a IL-12 (Desai, B., et al., 1992, J. Immunol., 148:3125; Desai, B., et al., 1993, J. Immunol. 150:207A). Las células mononucleares de sangre periférica activada con PHA recién preparadas (PBMC) y la línea celular Kit 225/K6 representan así dos fuentes de células convenientes para estudiar la bioquímica del receptor funcional de IL-12; y pueden haber otras.

Con experimentos de unión en equilibrio con IL-12 marcada con I^{125} se identificaron tres sitios con afinidades de unión para IL-12 humana de 5-20 pM, 50-200 pM, y 2-6 nM en células T sensibles a IL-12 (Chizzonite, R., et al., 1994, Cytokine 6 (5):A82a).

Un cADN que codifica un receptor de IL-12 de afinidad baja ya ha sido clonado (Chua, A. et al., 1994, J. Immunology 153:128; solicitud de patente europea Nº. 0.638.644). Basado en una nomenclatura previamente sugerida (Stahl y Yancopoulos, 1993, Cell 74:587), a la cadena del receptor de IL-12 humano aislado se la llamó inicialmente la cadena de beta1.

La presente solicitud describe proteínas del receptor de IL-12 que comprenden un complejo de la proteína del receptor beta1 con la proteína del receptor de beta2, cuyo complejo es capaz de unirse a la IL-12 humana con alta afinidad. Cuando se expresa en células huésped, el ácido nucleico da lugar a proteínas del receptor de IL-12 sustancialmente homogéneas. La invención se refiere a anticuerpos capaces de unirse a células que expresan las moléculas del receptor de IL-12.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Secuencia de ADN del cADN del receptor beta2 de IL-12 humano. (codon de iniciación = nucleótido 641; codon de terminación = nucleótido 3226.) (SEQ ID NO:1).

Figura 2: Secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana. (restos de aminoácidos con subrayado sencillo en la secuencia del extremo N-terminal = péptido señal; números de aminoácidos 623-646 = zona de transmembrana, marcada por doble subrayado; los 9 sitios potenciales de glicosilación N-unidos en la parte extracelular están marcados por las letras cursivas y también están subrayados; los motivos caja 1 y 2 conservada en el dominio citoplásmico están en sombra [números de restos de aminoácidos 667-669, 699-704, 786-798]) (SEQ ID NO:2).

Figura 3: Secuencia de ADN del cADN del receptor beta1 de IL-12 humano (codon de iniciación = nucleótido 65; codon de terminación = nucleótido 2050) (SEQ ID NO:3).

Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana. (restos de aminoácido subrayados de la secuencia N-terminal = secuencia del péptido señal; restos de aminoácidos números de 541 a 571 = zona de transmembrana marcada por - - - - - -; 6 sitios potenciales de glicosilación N-unidos en la parte extracelular marcada por - - - - - - -; los motivos de caja 1 y 2 conservados en el dominio citoplásmico se marcan por \upbar{-\ -\ -\ -\ -\ -\ -\ -} [restos de aminoácidos números de 577 a 584 y de 618 a 629]) (SEQ ID NO:4).

Figura 5A: Análisis de Scatchard de la unión de IL-12 recombinante humano a células COS transfectadas que expresan a la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana.

Figura 5B: Análisis de Scatchard de la unión de IL-12 recombinante humano a células COS transfectadas que expresan a la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana.

Figura 5C: Análisis de Scatchard de la unión de IL-12 recombinante humano a células COS transfectadas que coexpresan la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana y la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana.

Figura 6: Análisis de proliferación, en presencia de varias concentraciones de IL-12 humano, de células Ba/F3 establemente transfectadas con cADN para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana (- - \blacklozenge - -), con cADN para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana (- - \Box - -), o con cADN tanto para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana como para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana

\hbox{(-  -
 \bullet   -  -), midiendo la incorporación de timidina
tritiada.}

La presente solicitud describe a una proteína del receptor beta2 de interleuquina 12 (IL-12) con baja afinidad de unión, o sus fragmentos, que tiene baja afinidad de unión para IL-12, y que cuando se compleja con una proteína del receptor beta1 de IL-12 forma un complejo que tiene alta afinidad de unión con IL-12. En una realización preferida de la presente invención la proteína del receptor beta2 de IL-12 tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a SEQ ID NO:2 o que es codificada por un ácido nucleico que es sustancialmente homólogo a SEQ ID NO:1. En una realización más preferida, el ácido nucleico que codifica a la proteína del receptor beta2 de IL-12 es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:1 o que comparte al menos el 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferiblemente al menos una homología de secuencia de aproximadamente el 95% con el polipéptido que tiene la SEQ ID NO:1. Especialmente, la solicitud describe a la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana que tiene, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o formas alélicas o sus variantes.

Además, la solicitud de la invención proporciona un complejo capaz de unirse a IL-12 con alta afinidad, que comprende la proteína del receptor beta2 de IL-12, o sus fragmentos, como se define anteriormente complejada con la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, o sus fragmentos, que tiene baja afinidad de unión para IL-12, y cuando se compleja con una proteína del receptor beta2 de IL-12

\hbox{forma un complejo que tiene alta  afinidad de unión con
IL-12.}

El complejo anterior comprende una proteína del receptor beta1 de IL-12 que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a SEQ ID NO:4 o que es codificada por un ácido nucleico que es sustancialmente homólogo a SEQ ID NO:3. Además, el ácido nucleico que codifica a la proteína del receptor beta1 de IL-12 es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:3 o que comparte al menos el 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferiblemente al menos una homología de secuencia de aproximadamente el 95% con el polipéptido que tiene la SEQ ID NO:3. Especialmente, la solicitud describe a la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana que tiene, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o formas alélicas o sus variantes.

La presente solicitud también describe las proteínas anteriores o los complejos que son solubles.

Un aspecto de la presente solicitud es una proteína o un complejo codificado por un ácido nucleico que comprende dos subsecuencias, en el que una de dichas subsecuencias codifica una proteína soluble como se define anteriormente, y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de Ig humana distintos que el primer dominio de dicha región constante. La invención también incluye proteínas codificadas por un primero y un segundo ácido nucleico, en el que el primer ácido nucleico comprende dos subsecuencias, en el que una de dichas subsecuencias codifica un fragmento soluble de una proteína del receptor beta2 de IL-12 mencionado anteriormente y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de Ig humana distintos que el primer dominio de dicha región constante, y el segundo ácido nucleico comprende dos subsecuencias en el que una de dichas subsecuencias codifica un fragmento soluble de una proteína del receptor beta1 de IL-12 y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de Ig humana distintos que el primer dominio de dicha región constante.

La expresión "proteína del receptor beta2 de IL-12 humana" se refiere a (1) la proteína de SEQ ID NO:2, o (2) cualquier proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 y que tiene las propiedades siguientes:

1): La proteína o el polipéptido tiene baja afinidad de unión para IL-12 humano, y

2): La proteína o el polipéptido, cuando se complejan con la proteína del receptor beta1 humano forman un complejo que tiene alta afinidad de unión para IL-12 humano.

La expresión "proteína del receptor beta1 de IL-12 humana" se refiere a (1) la proteína de SEQ ID NO:4, o (2) cualquier proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4 y que tiene las propiedades siguientes:

1): La proteína o el polipéptido tienen baja afinidad de unión para IL-12 humano, y

2): La proteína o el polipéptido, cuando se complejan con la proteína del receptor beta2 humano forman un complejo que tiene alta afinidad de unión para IL-12 humano.

Como se usa en este documento, las expresiones "proteína del receptor beta2 de IL-12" y "proteína del receptor beta1 de IL-12" incluyen proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, por mutagénesis dirigida o por mutaciones aleatorias. Las expresiones también incluyen las variantes que pueden ser preparadas a partir de los grupos funcionales que aparecen como cadenas laterales sobre los restos o grupos del extremo N- o C-terminal, por medios conocidos en la técnica, y son incluidas en la invención siempre que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, no destruyan la actividad de la proteína y no confieran propiedades tóxicas en las composiciones que las contienen. Estas variantes pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol que pueden enmascarar sitios antigénicos y ampliar el tiempo de residencia de las proteínas en los fluidos corporales. Otras variantes incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los restos de aminoácido formados con restos de acilo (por ejemplo, grupos alcanoílo o aroílo carbocíclicos) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de restos serilo o treonilo) formados con restos de acilo.

"Sustancialmente homólogo", que puede referirse tanto a secuencias de ácidos nucleicos como a aminoácidos, significa que una secuencia objeto particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de la secuencia de referencia por una o varias sustituciones, deleciones, o adiciones, cuyo efecto neto no causa una desemejanza funcional adversa entre las secuencias de referencia y objeto. Para los objetivos de la presente invención, las secuencias que tienen más que una homología del 80%, más preferible más que del 90% y todavía más preferiblemente más que una homología del 95%, propiedades biológicas equivalentes, y características de expresión equivalentes son consideradas sustancialmente homólogas. Para los objetivos de determinar la homología, el truncamiento de la secuencia madura debería despreciarse. Las secuencias que tienen grados menores de homología, una bioactividad comparable y características de expresión equivalentes son consideradas sustancialmente equivalentes. Generalmente, las secuencias de ADN homólogas pueden ser identificadas por hibridación cruzada bajo condiciones de hibridación de alta severidad.

"Un fragmento de la proteína del receptor beta2 de IL-12" significa cualquier proteína o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una parte o fragmento de una proteína del receptor beta2 de IL-12, y que (a) tiene baja afinidad de unión para IL-12, y (2) cuando se compleja con una proteína del receptor beta1 de IL-12, forma un complejo que tiene alta afinidad de unión para IL-12.

"Un fragmento de la proteína del receptor beta1 de IL-12" significa cualquier proteína o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una parte o fragmento de la proteína del receptor beta1 de IL-12, y que cuando se compleja con una proteína del receptor beta2 de IL-12, forma un complejo que tiene alta afinidad de unión para IL-12.

Un "fragmento soluble" se refiere a un fragmento de una proteína del receptor de IL-12 que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a todo o parte de la región extracelular de la proteína y que conserva la actividad de unión de IL-12 de la proteína del receptor de IL-12 intacta. Por ejemplo, un fragmento soluble de una proteína del receptor beta2 de IL-12 es un fragmento de una proteína del receptor beta2 de IL-12 que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a todo o parte de la región extracelular de una proteína del receptor beta2 de IL-12 humana.

Conforme a la invención, un "complejo" que comprende a la proteína del receptor beta2 de IL-12, o sus fragmentos, complejado con la proteína del receptor beta1 de IL-12, o sus fragmentos, puede ser expresado sobre la superficie celular de la célula huésped. Cuando se expresa sobre la superficie celular de la célula huésped, el complejo tiene una alta afinidad de unión para IL-12, mientras que la proteína del receptor beta1 de IL-12 y la proteína del receptor beta2 de IL-12 sola cada una tiene una afinidad de unión baja para IL-12.

Conforme a esta invención, la proteína del receptor beta2 de IL-12 puede ser expresada sobre la superficie de una célula huésped.

Esta solicitud describe, no sólo a la proteína del receptor beta2 de IL-12, sino que también a los fragmentos de la proteína del receptor beta2 de IL-12 que (1) tiene baja afinidad de unión para IL-12 y (2) que cuando se compleja con una proteína del receptor beta1 de IL-12 forma un complejo que tiene alta afinidad de unión. Los fragmentos de la proteína del receptor beta2 de IL-12 pueden ser obtenidos por medios convencionales, tales como (i) degradación proteolítica de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, (ii) síntesis química por métodos rutinarios de la técnica, o (iii) métodos recombinantes estándar.

Para los objetivos de la presente invención, una proteína del receptor de IL-12 humana que tiene una alta afinidad de unión para IL-12 humano es una proteína que se une a IL-12 humano con una afinidad de unión de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 pM. Para los objetivos de la presente invención, una proteína del receptor de IL-12 humana que tiene una afinidad de unión baja para IL-12 humano es una proteína que se une a IL-12 humano con una afinidad de unión de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nM. La afinidad de unión de una proteína para IL-12 puede ser determinada por medios convencionales, como se describe en R. Chizzonite et al., 1992, J. Immunol., 148:3117 y como se expone en adelante en el Ejemplo 5.

Los fragmentos de la proteína del receptor beta2 de IL-12 también pueden ser medidos para detectar la afinidad de unión de IL-12 por medios convencionales, tal como se describe en R. Chizzonite et al., 1992, J. Immunol., 148:3117 y como se expone en adelante en el Ejemplo 5. Los fragmentos de la proteína del receptor beta2 de IL-12 pueden ser medidos para detectar la afinidad de unión de IL-12 solo o complejados con la proteína del receptor beta1 de IL-12, o un fragmento de la proteína del receptor beta1 de IL-12 que cuando se compleja con una proteína del receptor beta2 de IL-12 forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión.

La presente solicitud también proporciona ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN, cADN, ARN, mARN, etc. que codifican las proteínas anteriores, por ejemplo, un complejo capaz de unirse a IL-12 humano con alta afinidad, comprendiendo el complejo a la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, y la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, o sus fragmentos. Preferiblemente estos ácidos nucleicos codifican a la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana tal como un ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO:1 y/o la proteína del receptor beta1 de IL-12 tal como un ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO:3. La presente solicitud también describe a vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico anterior, a vectores de expresión, y especialmente a vectores de expresión en los que el ácido nucleico anterior está operativamente unido para controlar las secuencias reconocidas por una célula huésped. La solicitud proporciona células huésped eucariotas y procariotas transformadas con uno o varios de los vectores anteriores y especialmente a células huésped en las que las proteínas o complejos son expresados sobre la superficie de las células huésped y a células huésped en las que estas células proliferan en presencia de IL-12. Las células huésped anteriores pueden ser transformadas con un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta2 de IL-12 como se define anteriormente y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta1 de IL-12 como se define anteriormente o con un vector individual que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína del receptor beta2 de IL-12 y un ácido nucleico que codifica una proteína del receptor beta1 de IL-12.

Como se usa en este documento, la expresión "ácido nucleico" se refiere a un polímero de ácidos nucleicos, en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico más grande, que ha sido derivado a partir de un ácido nucleico aislado al menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permita la identificación, manipulación y recuperación de la secuencia y sus secuencias de nucleótidos componentes por métodos bioquímicos estándar, por ejemplo, usando un vector de clonación. Tales secuencias son proporcionadas preferiblemente en la forma de un ADN o un cADN con un marco de lectura abierto ininterrumpido por secuencias internas no traducidas, o intrones, que están típicamente presentes en genes eucariotas. Sin embargo, es evidente que también podría ser usado ADN genómico que contiene las secuencias relevantes. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes 5' ó 3' desde el marco de lectura abierto, donde el mismo no interfiere con la manipulación o la expresión de las regiones de codificación.

El "vector de expresión" es un elemento genético capaz de replicación en su propio control, tal como un plásmido, bacteriófago o cósmido, al cual otro segmento de ácido nucleico puede ser unido para causar la replicación del segmento unido. Esto comprende una unidad transcripcional que comprende una ensamblaje de (1) un elemento genético o elementos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores y potenciadores, (2) una secuencia estructural o codificante que es transcrita en mRNA y traducida en la proteína, y (3) la iniciación de la transcripción apropiada y secuencias de terminación.

El "clon" es un grupo de moléculas de ADN idénticas derivadas a partir de una longitud original de secuencia de ADN y producida por una bacteria o virus usando técnicas de ingeniería genética, implicando a menudo a plásmidos.

Además, la solicitud describe una proteína purificada, recombinante, que comprende dos cadenas de polipéptidos diferentes (una proteína heterodimérica) que puede ser preparada por métodos conocidos. Las dos cadenas de polipéptidos diferentes son cada una codificadas por un polinucleótido quimérico diferente que tiene dos subsecuencias de ácidos nucleicos fusionadas en marco. La primera subsecuencia de ácidos nucleicos del primer polinucleótido quimérico, localizado en su extremo 5', es una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un fragmento soluble de una proteína del receptor beta2 de IL-12. La segunda subsecuencia de ácidos nucleicos del primer polinucleótido quimérico, localizado en su extremo 3', es una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (preferiblemente IgG) excepto el primer dominio de la región constante. La primera subsecuencia de ácidos nucleicos del segundo polinucleótido quimérico, localizada en su extremo 5', es una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta1 de IL-12. La segunda subsecuencia de ácidos nucleicos del segundo polinucleótido quimérico, localizada en su extremo 3', es una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (preferiblemente IgG) excepto el primer dominio de la región constante.

Los materiales de partida para las proteínas purificadas, recombinantes, de la solicitud pueden ser obtenidos por métodos conocidos en la técnica. En particular, sobre la base de la secuencia de ADN que codifica para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana descrita en la Figura 1 y de las secuencias de ácidos nucleicos ya conocidas para ciertos receptores, aquellas secuencias de ácidos nucleicos parciales que codifican para un fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 pueden ser determinadas y manipuladas a partir de la secuencia de ADN que codifica para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana descrita en la Figura 1 usando métodos conocidos, véase Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Asimismo, sobre la base de la secuencia de ADN que codifica para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana descrita en la Figura 3 y de la secuencia de ADN ya conocida para ciertos receptores, aquellas secuencias de ADN parciales que codifican para un fragmento soluble de la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana pueden ser determinadas y manipuladas a partir de la secuencia de ADN que codifica para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana descrita en la Figura 3 usando métodos conocidos, véase Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Se conocen fuentes para secuencias de ADN que codifican aisladas para los dominios constantes de inmunoglobulinas humanas en la técnica y son descritas, por ejemplo, en Ellison et al., Nucl. Acid Res. 10, 4071-4079 (1982) para IgG1 o Huck et al., Nucl. Acid Res. 14, 1779-1789 (1986) para IgG3.

La secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana puede ser fusionada en marco, por métodos conocidos [Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], a la secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (preferiblemente IgG) excepto el primer dominio de la región constante. El polinucleótido quimérico resultante tiene localizado en su extremo 5' la secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana y en su extremo 3' la secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de la cadena pesada de Ig humana excepto el primer dominio de la región constante.

Asimismo, la secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana puede ser fusionada en marco, por métodos conocidos [Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], a la secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (preferiblemente IgG) excepto el primer dominio de la región constante. El polinucleótido quimérico resultante tiene localizado en su extremo 5' la secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana y en su extremo 3' la secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana excepto el primer dominio de la región constante.

Los polinucleótidos quiméricos entonces pueden ser integrados usando métodos conocidos [Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] en vectores de expresión adecuados para la expresión en una célula de mamífero no humana, tal como una célula CHO. Para hacer la proteína homodimérica de la solicitud, el polinucleótido quimérico que tiene localizado en su extremo 5' la secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana se integra en un vector de expresión adecuado. Para hacer la proteína heterodimérica de la invención, el polinucleótido quimérico que tiene localizado en su extremo 5' la secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana y el polinucleótido quimérico que tiene localizado en su extremo 5' la secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana se integran en un vector de expresión individual adecuado, o dos vectores de expresión separados adecuados.

Preferiblemente, el(los) polinucleótido(s) quimérico(s) se co-transfecta(n) junto con un marcador seleccionable, por ejemplo, neomicina, higromicina, dihidrofolato reductasa (dhfr) o hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (hgpt) usando métodos que se conocen en la técnica. La secuencia de ADN establemente incorporada en el cromosoma puede ser amplificada posteriormente. Un marcador de selección adecuado para esto es, por ejemplo, dhfr. Las células de mamífero, por ejemplo, células CHO, que no contienen ningún gen intacto de dhfr, son así incubadas con cantidades crecientes de metotrexato después de que la transfección haya sido realizada. De esta manera, pueden ser obtenidas líneas celulares que contienen un número más alto de la secuencia de ADN deseada que las células no amplificadas.

El sistema de expresión de baculovirus también puede ser usado para la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto. Las modificaciones postranslacionales realizadas por células de insecto son muy similares a las que se dan en células de mamífero. Para la producción de un baculovirus recombinante que expresa la proteína deseada se usa un vector de transferencia. Un vector de transferencia es un plásmido que contiene el(los) polinucleótido(s) quimérico(s) en el control de un promotor fuerte, por ejemplo, él de un gen poliedro, rodeado a ambos lados por secuencias virales. El vector de transferencia entonces es transfectado en las células de insecto junto con la secuencia de ADN del baculovirus de tipo silvestre. Los virus recombinantes que causan las células por recombinación homóloga pueden ser identificados entonces y aislados de acuerdo con métodos conocidos. Usando el sistema de expresión de baculovirus, las secuencias de ADN que codifican la parte de inmunoglobulina tienen que estar en forma de cADN.

La proteína recombinante expresada puede ser purificada, por ejemplo, por métodos conocidos. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de afinidad con proteína G para purificar la proteína homodimérica de la invención. La cromatografía de columna, o cualquier otro método que permita la diferenciación entre proteínas homodiméricas y proteínas heterodiméricas, puede ser usada para purificar la proteína heterodimérica de la invención.

Expresión de la proteína del receptor de IL-12 humana que tiene alta afinidad de unión a IL-12 humano:

El cADN de células de las que se sabe que se encuentra el receptor de IL-12 se incorpora por métodos convencionales en un huésped bacteriano para establecer una genoteca de cADN. Células PBMC PHA-activadas y de la línea celular Kit 225/K6 son ejemplos de fuentes de células para el cADN. El ARN de las células es extraído, caracterizado y transcrito en cADN monocatenario por métodos convencionales. El cADN monocatenario es convertido en cADN bicatenario por métodos convencionales. El cADN bicatenario se incorpora por técnicas convencionales en un vector de expresión, tal como pEF-BOS. El ADN del plásmido del vector de expresión entonces se incorpora en un huésped bacteriano por métodos convencionales para formar una genoteca de recombinantes.

La genoteca de cADN se rastrea mediante métodos de rastreo de expresión convencionales, como se describe en Hara y Mijayima, 1992, EMBO, 11:1875, para los cADN, que cuando se expresan con el cADN para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, da lugar a un receptor de IL-12 humano de alta afinidad. Un pequeño número de clones de la genoteca es cultivado en grupos. El ADN es extraído por métodos convencionales a partir de los grupos de clones. El ADN extraído a partir de un grupo de clones entonces es transfectado por métodos convencionales, con una pequeña cantidad de ADN a partir de un plásmido que contiene el cADN que codifica la proteína del receptor beta1 de IL-12 humano, en células huésped no humanas. Las células huésped no humanas son preferiblemente de mamífero, tal como las células COS. La IL-12 recombinante humana marcada es añadida entonces a las células huésped no humanas antes transfectadas como se describe anteriormente y se determina la señal de unión del grupo. Este procedimiento es repetido para cada grupo. Los grupos que muestran una señal de unión positiva para IL-12 pueden entonces ser divididos posteriormente en grupos más pequeños y analizados de nuevo de la manera anterior hasta que un clon individual sea seleccionado mostrando una señal de unión positiva.

El ADN del plásmido del clon seleccionado se secuencia en ambas cadenas usando métodos convencionales, tal como un secuenciador de ADN automatizado de ABI junto con una ADN polimerasa termoestable y didesoxinucleótidos marcados con tinte como terminadores. Las alineaciones de la secuencia de aminoácidos pueden ser llevadas a cabo como se describe en M. O. Dayhoffet et al., Methods Enzymology 91:524 (1983) con la matriz de datos de mutación, una falta de rotura de 6 y 100 corrimientos aleatorios.

El ADN del clon seleccionado entonces se co-transfecta por métodos convencionales con el ADN de un plásmido que contiene el cADN que codifica la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana en una célula huésped no humana, preferiblemente una célula de mamífero no humana tal como una célula COS o una célula Ba/F3.

De forma alternativa, por métodos recombinantes convencionales, puede ser manipulado un plásmido que contenga unidades de transcripción (promotor, cADN, y regiones polyA) tanto para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana como para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana. El ADN del plásmido es transfectado por métodos convencionales en una célula huésped no humana, preferiblemente una célula de mamífero no humana tal como una célula COS o una célula Ba/F3.

El ADN puede ser aislado, el cual codifica la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, cuyo fragmento (1) tiene baja afinidad de unión para IL-12 humano y (2) cuando se compleja con la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, forma un complejo que tiene alta afinidad de unión con IL-12 humano.

Una secuencia de ácidos nucleicos aislada se refiere a un polímero de ácido nucleico, en forma de un fragmento separado o como un componente de un construcción de ácidos nucleicos más grande, que ha sido derivado a partir del ácido nucleico aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura, es decir sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permita la identificación, manipulación y la recuperación de la secuencia y sus secuencias de nucleótidos componentes por métodos bioquímicos estándar, por ejemplo, usando un vector de clonación. Tales secuencias, por ejemplo, el ADN, preferiblemente se proporcionan en forma de un marco de lectura abierto no interrumpido por secuencias no traducidas internas, o intrones, que están típicamente presentes en genes eucariotas. El ADN genómico que contiene las secuencias relevantes también podría ser usado como una fuente de secuencias codificantes. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en 5' o 3' desde el marco de lectura abierto, donde las mismas no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones de codificación.

Una célula de mamífero que tiene la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana o el complejo expresado sobre su superficie y que prolifera en respuesta a la IL-12 humana es útil para determinar la bioactividad de IL-12. Por ejemplo, tales células son útiles para determinar si un compuesto dado inhibe la actividad biológica de la IL-12 humana o es un agonista de IL-12.

Además, por la capacidad de expresarse de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana sobre una superficie celular de mamífero no humana, también se pueden expresar los fragmentos de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, y se puede determinar si estos fragmentos, cuando se complejan con la subunidad beta1, o su fragmento activo, tienen las mismas propiedades y una alta afinidad de unión para IL-12 como el complejo intacto.

El ADN aislado que codifica a la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana puede ser usado para preparar una proteína purificada, recombinante, que sea soluble, y que se una a IL-12 con la misma afinidad que la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana. El ADN aislado que codifica la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana también puede ser usado para preparar una proteína purificada, recombinante, que sea soluble, y que se una a IL-12 con la misma afinidad que el complejo del receptor de IL-12 recombinante humano de la proteína del receptor de beta1 con la proteína del receptor de beta2 [Véase, por ejemplo, Charnow, S. M. et al., Trends in Biotechnology, Vol. 14, 52-60 (1996)].

Tales proteínas purificadas, recombinantes, que se unen a IL-12 humano, son útiles para prevenir o tratar condiciones patológicas causadas por la actividad en exceso o inadecuada de células que poseen receptores de IL-12, inhibiendo la unión de IL-12 a tales células. Las condiciones patológicas causadas por la actividad en exceso de células que poseen receptores de IL-12 incluyen disfunciones autoinmunes, tales como, sin restricción, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino y la esclerosis múltiple.

Una proteína purificada, recombinante, que es soluble, y que se une a IL-12 con la misma afinidad que la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana es la fusión de un fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana y una cadena pesada de Ig humana (tal como IgG, IgM o IgE, preferiblemente IgG) que tiene todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante. Esta proteína recombinante, que es homodimérica, está codificada por un polinucleótido quimérico que tiene 2 subsecuencias de ADN fusionadas en marco. La primera subsecuencia de ADN, en el extremo 5' del polinucleótido quimérico, es una secuencia de ADN aislada que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana. La segunda subsecuencia de ADN, localizada en el extremo 3' del polinucleótido quimérico, es una secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de una cadena humana pesada de Ig (preferiblemente IgG) excepto el primer dominio de la región constante. La proteína recombinante deseada puede ser generada por transfección del polinucleótido quimérico en una célula de mamífero no humana, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO). La proteína recombinante expresada puede ser purificada, por ejemplo, por cromatografía de afinidad de la proteína G.

Una proteína purificada, recombinante, que es soluble, y que se une a IL-12 con la misma afinidad que el complejo del receptor de IL-12 recombinante humano del receptor de beta1 con el receptor de beta2 se codifica por dos polinucleótidos quiméricos, que cada uno tiene dos subsecuencias de ADN fusionadas en marco. La primera subsecuencia de ADN del primer polinucleótido quimérico, localizado en el extremo 5', es una secuencia de ADN aislada que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana. La segunda subsecuencia de ADN del primer polinucleótido quimérico, localizado en el extremo 3', es una secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (por ejemplo, IgG, IgM, IgE, preferiblemente IgG) excepto el primer dominio de la región constante. La primera subsecuencia de ADN del segundo polinucleótido quimérico, localizado en el extremo 5', es una secuencia de ADN aislada que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana. La segunda subsecuencia de ADN del segundo polinucleótido quimérico, localizado en el extremo 3', es una secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (por ejemplo, IgG, IgM, IgE, preferiblemente IgG) excepto el primer dominio de la región constante. La proteína recombinante deseada puede ser generada por la cotransfección de los dos polinucleótidos quiméricos en una célula de mamífero no humana, tal como una célula CHO. La proteína expresada puede ser purificada, por ejemplo, por cualquier método que permita la diferenciación de proteínas homodiméricas a partir de proteínas heterodiméricas, tales como, por ejemplo, la cromatografía de columna.

Además, la solicitud también proporciona un procedimiento para la preparación de una proteína anteriormente mencionada que comprende la expresión de un ácido nucleico anteriormente mencionado en una célula huésped adecuada.

Además, también pueden ser producidos por métodos conocidos anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, o el complejo, [Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, ed. por Coligan, J.E. et al., J. Wiley y Sons (1992)] y usado para impedir o tratar condiciones patológicas causadas por una actividad en exceso de células que poseen receptores de IL-12 inhibiendo la unión de IL-12 en tales células.

Las proteínas recombinantes purificadas son útiles para prevenir o tratar condiciones patológicas causadas por la actividad en exceso o inadecuada de células que poseen receptores de IL-12 inhibiendo la unión de IL-12 en tales células.

El término "purificado", según se usa para definir la pureza de una proteína recombinante codificada por las secuencias de ADN combinadas descritas anteriormente, o sus composiciones proteicas, significa que la proteína o la composición proteica está sustancialmente sin otras proteínas de origen natural o endógeno y contiene menos de aproximadamente el 1% en masa de contaminantes de proteína residuales de procesos de producción. Tales composiciones, sin embargo, pueden contener otras proteínas añadidas tales como estabilizadores, cardas, excipientes o sustancias co-terapéuticas. Una proteína es purificada si es detectable, por ejemplo, como una banda de proteína individual en un gel de poliacrilamida mediante tinción de plata.

Pueden ser administradas proteínas recombinantes purificadas como se describe anteriormente (así como anticuerpos frente a proteínas del receptor beta2 de IL-12 humanas y sus fragmentos, y anticuerpos frente al complejo de esta invención) en el tratamiento clínico de disfunciones autoinmunes, tales como, sin restricción, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino y la esclerosis múltiple.

Las proteínas recombinantes purificadas descritas anteriormente (así como los anticuerpos frente a proteínas del receptor beta2 de IL-12 humanas y sus fragmentos, y los anticuerpos frente al complejo de esta invención) pueden ser usadas en combinación con otros antagonistas de citoquina tales como anticuerpos frente al receptor de IL-2, el receptor de TNF soluble (factor de necrosis tumoral), el antagonista de IL-1, y similares para tratar o prevenir los trastornos o las condiciones anteriores.

Además, la solicitud describe composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína o un anticuerpo mencionado anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios antagonistas de citoquina.

Además, la solicitud proporciona el uso de una proteína o un anticuerpo mencionado anteriormente para la preparación de un medicamento. Estos compuestos son especialmente útiles para el tratamiento de disfunciones auto-
inmunes.

Los intervalos de dosis para la administración de las proteínas recombinantes purificadas descritas anteriormente (así como anticuerpos frente a las proteínas del receptor beta2 de IL-12 humanas y sus fragmentos, y los anticuerpos frente al complejo de esta solicitud) pueden ser determinados por los expertos ordinarios en la técnica sin una experimentación excesiva. En general, las dosificaciones apropiadas son las que son lo bastante grandes para producir el efecto deseado, por ejemplo, bloqueando la unión de IL-12 endógeno frente a su receptor natural. La dosificación no debería ser tan grande que causara efectos secundarios adversos, tales como reacciones inespecíficas no deseadas, reacciones anafilácticas, y otras por el estilo. Generalmente, la dosificación variará con la edad, la condición, el sexo y el grado de enfermedad en el paciente, indicaciones contrarias, si existiera alguna, la tolerancia inmune y otras tales variables, siendo ajustada por el médico individual. Las proteínas recombinantes purificadas descritas anteriormente (así como los anticuerpos frente a las proteínas del receptor beta2 de IL-12 humanas y sus fragmentos, y los anticuerpos frente al complejo de esta solicitud) pueden ser administrados parenteralmente por inyección o por perfusión gradual con el tiempo. Pueden ser administrados intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente o subcutáneamente.

Los intervalos de dosis para la administración de las proteínas del receptor de IL-12 y sus fragmentos pueden ser determinados por los expertos ordinarios en la técnica sin una experimentación excesiva. En general, las dosificaciones apropiadas son las que son lo bastante grandes para producir el efecto deseado, por ejemplo, bloqueando la unión de IL-12 endógena frente a su receptor natural. La dosificación no debería ser tan grande que causara efectos secundarios adversos, tales como reacciones inespecíficas no deseadas, reacciones anafilácticas, y otras por el estilo. Generalmente, la dosificación variará con la edad, la condición, el sexo y el grado de enfermedad en el paciente, indicaciones contrarias, si existiera alguna, la tolerancia inmune y otras tales variables, siendo ajustada por el médico individual. El intervalo de dosis esperado es de aproximadamente 1 ng/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día. Las proteínas del receptor de IL-12 y sus fragmentos pueden ser administradas parenteralmente por inyección o por perfusión gradual con el tiempo. Pueden ser administrados intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente o subcutáneamente.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones de alcohol/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lacteado o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen rellenos de fluidos y sustancias nutritivas, rellenos de electrólitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y otros por el estilo. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes anti-microbianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes y otros por el estilo. Véase, generalmente, "Remington's Pharmaceutical Science", 16ª Ed., Mack Eds., 1980.

Ensayos para determinar si un compuesto dado bloquea la actividad de IL-12:

La solicitud describe el uso de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana o del complejo de esta invención como un agente de rastreo para productos farmacéuticos. Conforme a esta solicitud, se puede determinar si un compuesto dado bloquea la actividad de IL-12 humano o actúa como un agonista de IL-12.

Una actividad biológica de IL-12 humano es la estimulación de la proliferación de células T y NK activadas. La proliferación de células T activadas causa respuestas inmunes inducidas por aloantígenos, tales como el rechazo alo-injerto (tales como trasplantes de piel, riñón y corazón) y reacción de injerto-contra-huésped en pacientes que han recibido trasplantes de médula ósea. Esta actividad biológica de IL-12 humano es mediada por la unión de las moléculas de IL-12 humano a receptores de la superficie celular en células T activadas.

Un compuesto que bloquea la actividad de IL-12 humano, por lo tanto, inhibiría la proliferación de células T activadas y sería útil para tratar o prevenir respuestas inmunes inducidas por aloantígenos.

Para determinar si un compuesto bloquea la actividad de IL-12 humano, primero, se proporciona una pluralidad de células que tienen expresada sobre su superficie la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana o sus fragmentos, o el complejo de la invención, cuyas células proliferan en presencia de IL-12 humano. La proteína del receptor beta2 de IL-12 humana o sus fragmentos se unen a IL-12 humano con una afinidad de unión baja, pero cuando se complejan con la proteína del receptor de beta1 humana forma un complejo que tiene alta afinidad de unión para IL-12 humano. El complejo de la invención se une a IL-12 humano con alta afinidad de unión y comprende un complejo de (1) la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, que cuando se compleja con la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana forma un complejo que tiene alta afinidad de unión frente a IL-12 humano, y (2) la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, o sus fragmentos, que cuando se compleja con una proteína del receptor beta2 de IL-12 humana forma un complejo que tiene alta afinidad de unión frente a IL-12 humano. Segundo, se ponen en contacto las células con IL-12 humano y el compuesto dado. Tercero, se determina si la presencia del compuesto dado inhibe la proliferación de las células.

Para determinar si un compuesto es un agonista de IL-12 humano, primero, se proporciona una pluralidad de células que tienen expresada sobre su superficie la proteína del receptor beta2 de IL-12 o sus fragmentos, o el complejo de la invención, y cuyas células proliferan en presencia de IL-12 humano. La proteína del receptor beta2 de IL-12 humana o sus fragmentos se unen a IL-12 humano con una afinidad de unión baja, pero cuando se compleja con la proteína del receptor beta1 humana forma un complejo que tiene alta afinidad de unión para IL-12 humano. El complejo de la invención se une a IL-12 humano con alta afinidad de unión y comprende un complejo de (1) la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, que cuando se compleja con una proteína del receptor beta1 de IL-12 humana forma un complejo que tiene alta afinidad de unión frente a IL-12 humano, y (2) la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, o sus fragmentos, que cuando se compleja con una proteína del receptor beta2 de IL-12 humana forma un complejo que tiene alta afinidad de unión frente a IL-12 humano. Segundo, se ponen en contacto las células con IL-12 humano o el compuesto dado. Tercero, se determina si la presencia del compuesto dado estimula la proliferación de las células.

Los ejemplos de células capaces de expresar sobre su superficie el complejo, cuyas células proliferan en presencia de IL-12 humano incluyen, sin restricción, PBMC activado con PHA, células Kit 225/K6 y células Ba/F3 transfectadas con cADN tanto para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana como para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana. Los ejemplos de células capaces de expresar sobre su superficie la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, cuyas células proliferan en presencia de IL-12 humano incluyen, sin restricción, células Ba/F3 transfectadas con cADN para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana.

Para determinar si la presencia del compuesto dado inhibe la proliferación de de las células, puede ser llevado a cabo el procedimiento siguiente. Las células sensibles a IL-12 humano, que han expresado sobre su superficie la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, o el complejo del receptor de IL-12 humano de la invención, se ponen en placas en los pocillos de una placa de microtítulo. El IL-12 humano entonces es añadido a algunos pocillos de la placa de microtítulo (pocillos estándar) y se deja reaccionar con las células. El compuesto que se analiza se añade antes o simultáneamente con IL-12 humano a los diferentes pocillos de la placa de microtítulo (pocillos de la muestra) y se deja reaccionar con las células. Cualquier disolvente usado debe ser no tóxico para la célula. La proliferación de las células entonces es medida por métodos conocidos, por ejemplo, marcando las células después del contacto con IL-12 humano y el compuesto (tal como por la incorporación de timidina tritiada en el ADN de replicación), midiendo la acumulación de metabolitos celulares (tal como el ácido láctico), y otros por el estilo. La proliferación de las células de los pocillos estándar es comparada con la proliferación de las células de los pocillos de la muestra. Si las células de los pocillos de la muestra proliferan considerablemente menos que las células de los pocillos estándar, el compuesto bloquea la actividad de IL-12.

Para determinar si la presencia del compuesto dado simula la proliferación de las células, puede ser llevada a cabo el procedimiento siguiente. Las células sensibles a IL-12 humano que han expresado sobre su superficie la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o sus fragmentos, o el complejo del receptor de IL-12 humano de la invención se ponen en placas en los pocillos de una placa de microtítulo. La IL-12 humana entonces se añade a algunos pocillos de la placa de microtítulo (pocillos estándar) y se deja reaccionar con las células. El compuesto que se analiza se añade a los pocillos diferentes de la placa de microtítulo (pocillos de la muestra) y se deja reaccionar con las células. Cualquier disolvente usado debe ser no tóxico para la célula. La proliferación de las células entonces es medida por métodos conocidos, por ejemplo, marcando las células después del contacto con el compuesto (tal como por la incorporación de timidina tritiada en el ADN de replicación), midiendo la acumulación de metabolitos celulares (tal como el ácido láctico), y otros por el estilo. La proliferación de las células de los pocillos estándar es comparada con la proliferación de las células de los pocillos de la muestra. Si las células de los pocillos de la muestra proliferan considerablemente más que las células que no fueron expuestas a IL-12 humano, el compuesto es un agonista de IL-12 humano.

En consecuencia, la presente solicitud describe un método para seleccionar compuestos útiles para la inhibición de la actividad de IL-12 o compuestos útiles como los agonistas de la actividad de IL-12, que comprende poner en contacto un compuesto que se sospecha que inhibe la actividad de IL-12 o que es un agonista de actividad de IL-12, con una proteína mencionada anteriormente, seguido de la detección del efecto biológico.

Los ejemplos siguientes son ofrecidos para su ilustración, no para su limitación.

Ejemplos Materiales y métodos 1. Proteínas, Plásmidos y Cepas

La IL-12 recombinante humana fue obtenida como se describe en esta publicación (U. Gubler et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4143).

La IL-2 recombinante humana fue obtenida como se describe en esta publicación (H.W. Lahm et al., 1985, J. Chromatog., 326:357).

El plásmido pEF-BOS está basado en una estructura pUC 119 y contiene el promotor alfa del factor de elongación 1 para dirigir la expresión de genes insertados en el sitio BstXI (S. Mizushima y S. Nagata, Nucl. Acids Res., 1990, 18:5322).

El cADN del receptor beta1 de IL-12 humano en el plásmido pEF-BOS fue obtenido como se describe en A. Chua et al., 1994, J. Immunology 153:128 y en la publicación de solicitud de patente europea Nº. 0638644.

La DH-10B de E. coli electrocompetente (S. Grant et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:4645) fue obtenida del laboratorio de investigación Bethesda (Bethesda, Maryland).

2. Marcaje de IL-12 humano con ^{125}I

Se marcó a IL-12 recombinante humano con ^{125}I como sigue. El yodogen fue disuelto en cloroformo. Alícuotas de 0,05 mg de yodogen fueron secadas en tubos de vidrio de borosilicato de 12 x 150 mm. Para el radiomarcaje, fue añadido Na^{125}I 1,0 mCi al tubo de vidrio de borosilicato revestido con yodogen, que también contenía 0,05 ml de tampón de yodación-Tris (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,4 M y EDTA 1 mM) para formar una disolución de ^{125}I. La disolución de ^{125}I fue activada incubando durante 6 minutos a temperatura ambiente. La solución de ^{125}I activada fue transferida a un tubo que contenía de 0,05 a 0,1 ml de IL-12 recombinante humano (31,5 mg) en tampón de yodación Tris. La mezcla resultante de la solución de ^{125}I activada y la IL-12 recombinante humana fue incubada durante 6 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, fueron añadidos 0,05 ml de tampón de paro de yodogen (tirosina del 10 mg/ml, glicerol del 10% en solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (PBS), pH 7,40) y se hizo reaccionar durante 3 minutos. La mezcla resultante entonces fue diluida con 1,0 ml de tampón Tris-yodación que contenía albúmina de suero bovina del 0,25% (BSA), y fue aplicada a una columna de desalación P10DG de Bio-Gel para realizar la cromatografía. La columna fue eluida con tampón Tris-yodación que contenía 0,25% de BSA. Fracciones de 1 ml que contenían las cantidades eluidas máximas de IL-12 recombinante humano marcado fueron combinadas. Las fracciones combinadas fueron diluidas a 1x10^{8} cpm/ml con 1% de BSA en tampón Tris-yodación. La incorporación de ^{125}I en IL-12 recombinante humano fue controlada por la precipitación con ácido tricloroacético (TCA). La radiactividad del TCA precipitable (concentración final de 10% de TCA) fue típicamente superior al 95% de la radiactividad total. La actividad radioespecífica del IL-12 recombinante humano marcado fue típicamente de 1000 a 2000 cpm/fmol.

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Ejemplo 1

Preparación de linfoblastos activados con PHA humanos

Fueron aisladas células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de la sangre recogida de donantes sanos como se describe en Gately et al., J. Natl. Cancer Inst. 69, 1245 (1982). La sangre fue recogida en jeringuillas heparinizadas, fue diluida con un volumen igual de la solución salina equilibrada de Hank y fue estratificada en medio de separación de linfocitos (LSM® obtenido de la empresa Organon Teknika, Durham, Carolina del Norte) en tubos. Se centrifugaron los tubos a 2000 revoluciones por minuto durante 20 minutos a temperatura ambiente. El PBMC en el interfaz de la solución de sangre acuosa y el medio de separación de linfocitos fueron recogidos. El PBMC recogido fue granulado a 1500 revoluciones por minuto durante 10 minutos a través de un relleno de 15 ml de sacarosa del 20% en solución salina equilibrada de Hank. El PBMC granulado fue resuspendido en medio de cultivo de tejido (mezcla 1:1 de RPMI 1640 y medio Eagle modificado de Dulbecco, suplementado con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, 60 mg/ml de arginina HCl, tampón Hepes 10 mM, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 0,05 mM, y 1 mg/ml de dextrosa) (TCM) más suero humano del 5% y fue lavado dos veces en TCM.

El PBMC entonces fue activado para formar linfoblastos. En particular, 0,5 - 1x10^{6} células/ml en TCM más suero humano del 5% más 0,1% (v/v) de PHA-P (Difco, Detroit, MI) fue cultivado durante 3 días a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} del 5%.

Después de tres días, los cultivos celulares fueron divididos 1:1 en volumen en TCM más suero humano del 5% y 50 U/ml de IL-2 recombinante humano para proporcionar > 95% de células T. Estas células fueron utilizadas para la preparación de una genoteca de cADN.

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Ejemplo 2

Extracción y caracterización de ARN

PBMC aislados como en el Ejemplo 1, activados con PHA durante 2-3 días, fueron cultivados y el ARN total fue extraído usando isotiocianato de guanidina/fenol como se describe en P. Chomczynski y N. Sacchi, Anal. Biochem., 162:156, 1987. Fue aislado el ARN de PolyA^{+} del ARN total por una adsorción estacionaria a perlas de látex de oligo dT como ha sido descrito (K. Kuribayashi et al., Serie del Simposio de Nucl. Acids Res. 19:61, 1988). El rendimiento en masas de esta purificación fue de aproximadamente el 4% de ARN de PolyA^{+}.

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Ejemplo 3

Genoteca de cADN

A partir del ARN de PolyA^{+} anterior, fue establecida una genoteca de cADN en el vector de expresión pEF-BOS de mamífero como sigue.

3 mg del ARN de PolyA^{+} fueron retrotranscritos en cADNs monocatenarios usando RNasaH menos transcriptasa inversa en presencia de un ^{32}P-dCTP. Los cADN monocatenarios resultantes fueron convertidos en cADN bicatenarios de extremo romo como se describe en U. Gubler y A. Chua, Volumen II de "Essential Molecular Biology Volume", T.A. Brown, editor, pp. 39-56, IRL Press 1991. Los enlazantes BstXI (A. Aruffo y B. Seed, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 84, 8573, 1987) fueron ligados a los cADN bicatenarios resultantes.

Las moléculas de cADN que tenían un tamaño mayor que 800 pares de bases (bp) fueron rastreadas por cromatografía de exclusión de tamaños como sigue. Una columna Sephacryl SF 500 (0,8 x 29 cm) fue empaquetada por gravedad en Tris-HCl 10 mM, pH 7,8 - EDTA 1 mM - NaAcetato 100 mM. El cADN radiactivo con enlazantes BstXI añadidos fue aplicado a la columna y fueron recogidas fracciones de 0,5 ml. La distribución de tamaños del cADN radiactivo fue determinada realizando la electroforesis en una pequeña alícuota de cada fracción en un gel de agarosa del 1%, secando el gel, y visualizando el tamaño por la exposición del gel a una película de rayos X. Las moléculas de cADN más grandes de 800 bp fueron rastreadas por tamaño de esta manera.

Las moléculas de cADN seleccionadas fueron reunidas y concentradas por precipitación con etanol. Las moléculas de cADN reunidas y concentradas seleccionadas fueron ligadas posteriormente al plásmido pEF-BOS como sigue. El plásmido había sido restringido con BstXI y purificado en dos geles de agarosa del 1% consecutivos. 300 ng del ADN del plásmido restringido y purificado fueron ligados a 30 ng de cADN seleccionado por tamaños en 60 ml de tampón de ligadura (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 - MgCl_{2} 10 mM - DTT 10 mM - rATP 1 mM - 25 mg/ml de BSA) a 15ºC de la noche a la mañana.

Al día siguiente, el plásmido ligado con el cADN seleccionado por tamaños fue extraído con fenol. Fueron añadidos 6 mg de glucógeno de mejillón al extracto resultante, y los ácidos nucleicos fueron precipitados con etanol. El precipitado resultante fue disuelto en agua y los ácidos nucleicos fueron reprecipitados con etanol, seguido de un lavado con etanol del 80%. Un pelete fue formado a partir de los ácidos nucleicos precipitados y lavados. El pelete fue disuelto en 6 ml de agua. Alícuotas de 1 ml del pelete disuelto posteriormente fueron electroporadas en cepas DH-10B de E. Coli. Bajo la electroporación de 5 alícuotas paralelas, fue generada una genoteca de aproximadamente 10 millones de recombinantes.

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Ejemplo 4

Rastreo de expresión para los cADN que codifican receptores de IL-12 de alta afinidad

La genoteca fue rastreada de acuerdo con el método de rastreo de expresión general descrito por Hara y Miyajima, 1992, EMBO, 11:1875.

Grupos de aproximadamente 100 clones de E. coli de la genoteca anterior fueron cultivados y el ADN del plásmido fue extraído a partir de los grupos por métodos convencionales. 2 x 10^{5} células COS fueron puestas en placas por cultivo de pocillos de 35 mm. Fueron transfectadas células COS con un cóctel de transfección usando la técnica de DEAE dextrano estándar descrita en "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2ª ed., J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ("Molecular Cloning"). El cóctel de transfección contenía (1) 1 mg de ADN del plásmido extraído a partir de los grupos del clon de E. Coli derivados a partir de la genoteca anterior, y (2) 0,1 mg de ADN del plásmido pEF-BOS que contenía el cADN del receptor beta1 de IL-12
humano.

3 días después de la transfección, los pocillos de células COS fueron incubados con IL-12 recombinante humano marcado 10 pM (actividad específica = 1000-2000 cpm/fmol) durante 90 minutos a temperatura ambiente. El IL-12 recombinante humano marcado fue retirado, y la monocapa de células COS fue lavada durante una hora tres veces con tampón de unión (RPMI 1640, suero bovino fetal del 5% (FBS), HEPES 25 mM, pH 7) para después seleccionar las células COS que expresaban sólo receptores de IL-12 de alta afinidad (la unión del ligando de IL-12 frente a los sitios de afinidad baja fue después reducida porque los sitios de afinidad baja tienen una velocidad de disociación más alta). Posteriormente, las monocapas de células fueron lisadas e incluidas en un contador gamma. Después del rastreo de 440 grupos (representando a aproximadamente 44.000 clones), un grupo mostró coherentemente una señal de unión positiva (300 cpm en una línea de fondo de 100 cpm). A partir de este grupo, un clon individual fue aislado posteriormente por selección filial. Este clon individual (B5-10) contenía un inserto de cADN de aproximadamente 3 kilobytes que fue completamente secuenciado.

El inserto de cADN del clon B5-10 era incompleto con respeto a la región que codificaba a la proteína porque no contenía un codon de terminación en marco. La genoteca de cADN del Ejemplo 3 fue rastreada de nuevo mediante técnicas de hibridación de ADN convencionales con el inserto de cADN a partir del clon B5-10, como se describe en "Molecular Cloning" y en Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72:3961. Clones adicionales fueron aislados de este modo y luego fueron parcialmente secuenciados. La secuencia de nucleótidos de un clon (Nº. 3) fue encontrada que (i) sobrelapaba con el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos del clon B5-10, (ii) se extendía más allá de la secuencia de nucleótidos del clon B5-10 y (iii) contenía un codon de terminación en
marco.

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Esta secuencia de ADN compuesta se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). En la Figura 2 se muestra la secuencia de aminoácidos deducida para la proteína del receptor codificada. Basado en la nomenclatura antes sugerida de Stahl y Yancopolous, 1993, Cell 74:587, los inventores llaman a la cadena del receptor de IL-12 humana recién aislada la cadena beta2.

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Ejemplo 5

Ensayos de unión

Fueron transfectadas células COS (4-5x10^{7}) por electroporación usando un Gene Pulser de BioRad (250 mF, 250 voltios) con (1) 25 mg del ADN del plásmido de B5-10 que expresaba la proteína del receptor beta2 de IL-12 recombinante humana, (2) 25 mg del ADN del plásmido pEF-BOS que expresaba a la proteína del receptor beta1 de IL-12 recombinante humana, o (3) una mezcla de 12,5 mg del ADN del plásmido de B5-10 que expresaba a la proteína del receptor beta2 de IL-12 recombinante humana y 12,5 mg del ADN del plásmido pEF-BOS que expresaba a la proteína del receptor beta1 de IL-12 recombinante humana. Las células electroporadas fueron puestas en placas en una placa de cultivo de 600 cm^{2}, fueron recolectadas después de 72 horas raspando, lavando y resuspendiéndolas en tampón de unión.

Las células fueron analizadas para determinar las afinidades de los receptores de IL-12 expresados para IL-12 humano. En particular, la unión en equilibrio de IL-12 recombinante humano marcado con las células fue realizada y analizada como se describe en R. Chizzonite, et al., 1992, J. Immunol., 148:3117. Las células electroporadas (8x10^{4}) fueron incubadas con concentraciones crecientes de IL-12 recombinante I^{125}-marcado humano a temperatura ambiente durante 2 horas. Las incubaciones fueron llevadas a cabo en dos muestras o por triplicado.

La radiactividad unida a las células fue separada a partir del IL-12 marcado con ^{125}I libre por centrifugación de la mezcla de células electroporadas e IL-12 humano recombinante marcado con ^{125}I a través de 0,1 ml de una mezcla de aceite (mezcla 1:2 de Thomas Silicone Fluid 6428-R15 {A.H. Thomas} y aceite de silicona AR 200 {Gallard-Schlessinger}) a 4ºC durante 90 segundos a 10.000 x g para formar un pelete de células en un tubo. El pelete de células fue excindido desde la punta del tubo en el cual fue formado, y la radiactividad de las células unidas fue determinada en un contador gamma.

Fueron analizados los datos de unión del receptor y las afinidades fueron calculadas de acuerdo con Scatchard usando el método descrito por McPherson, J., 1985, Pharmacol. Methods, 14:213.

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Ejemplo 6

Producción de la línea celular sensible a IL-12

Células Ba/F3 tipo silvestre, una célula pro-B de ratón dependiente de IL-3 (Palacios, R. et al., 1985, Cell 41:727) y células Ba/F3 que expresan a la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana (Chua, A., et al., 1994, J. Immunology 153:128) fue cotransfectada con (1) 80 mg de ADN del plásmido pEF-BOS que expresa la proteína del receptor beta2 de IL-12 recombinante humano y (2) 8 mg del plásmido que expresa el gen de la resistencia a la higromicina (Giordano, T.J., et al., 1990, Gene 88:285) por electroporación usando un Gene Pulser BioRad (960 mF, 400
voltios).

Todas las células fueron resuspendidas a una densidad de 2 x 10^{5} células/ml viables en un medio de crecimiento de RPMI 1640, 10% de FBS, glutamina (2 mM), penicilina G (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), y medio del 10% condicionado a partir de la línea celular WEHI-3 (Nº. ATCC TIB 68, Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, Maryland). La línea celular WEHI-3 es una fuente de IL-3. Las células resuspendidas entonces fueron incubadas a 37ºC bajo CO_{2} del 5% durante 120 horas.

Las células fueron seleccionadas por su capacidad de crecer en (1) el medio de crecimiento anterior en presencia de 1 mg/ml de higromicina o (2) un medio de crecimiento de RPMI 1640 que contenía IL-12, 10% de FBS, glutamina (2 mM), penicilina G (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), y varias concentraciones (10, 50 ó 250 ng/ml) de IL-12 humano.

Células Ba/F3 que expresan a la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana transfectadas con el ADN del plásmido pEF-BOS que expresaba la proteína del receptor beta2 de IL-12 recombinante humana cultivada en el medio de crecimiento que contenía IL-12, demostrando que la coexpresión de la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana y la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana conferían sensibilidad de IL-12 humano a las células Ba/F3.

Además, las células Ba/F3 que expresaban a la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana crecían en el medio de crecimiento que contenía IL-12, demostrando que la expresión de la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana confería sensibilidad de IL-12 humano a las células Ba/F3.

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Ejemplo 7

Efecto de IL-12 humano en líneas celulares Ba/F3 transfectadas

Células Ba/F3 (1) que expresaban la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, (2) que expresaban la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, o (3) que coexpresaban la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana y la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con FBS del 10%, 100 U/ml de penicilina G, 100 mg/ml de estreptomicina, y L-glutamina 2 mM a 2 x 10^{4} células/pocillo en microplacas de fondo plano Costar 3596 durante 24 horas. Varias diluciones de IL-12 humano, como se muestra en la Figura 6, fueron añadidas entonces a las microplacas y las células fueron incubadas durante 42 horas a 37ºC en una atmósfera humedecida del 5% de CO_{2} en aire. 50 ml de ^{3}H-timidina, 10 mCi/ml en medio de cultivo, fueron añadidos entonces a cada pocillo. Los cultivos fueron incubados después durante 6 horas a 37ºC. Posteriormente, el contenido del cultivo fue recolectado en filtros de fibra de vidrio mediante una cultivadora de células. La incorporación de ^{3}H-timidina fue medida por el uso de un contador de centelleo líquido. Todas las muestras fueron analizadas por
cuadriplicado.

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Ejemplo 8

Análisis de secuencia de clones de cADN del receptor de IL-12 y proteína del receptor de IL-12 codificada

La proteína del receptor beta2 de IL-12, compuesta de 862 aminoácidos y un peso molecular calculado de 97231, tenía las propiedades siguientes: péptido señal N-terminal, dominio extracelular, dominio transmembrana y cola citoplásmica. Se predijo que el péptido señal N-terminal hidrófobo clásico tenía 23 aminoácidos de longitud. La división del péptido señal ocurre sobre todo después de los aminoácidos Ala, Ser, Gly, Cys, Thr, Gln (von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Research, 14:4683). Para el receptor de IL-12, la división podría ocurrir así después de Ala23 en la secuencia mostrada en la Figura 2, dejando una proteína madura de 839 aminoácidos basado en la división en Ala23. El dominio extracelular del receptor se predijo que abarcaba la región desde el extremo C-terminal del péptido señal al aminoácido Nº. 622 en la secuencia mostrada en la Figura 2. El análisis de hidrofobia muestra que el área desde el aminoácido Nº. 623 al 646 es hidrófoba, como se esperaría para una región de ancla transmembrana. Los restos de parada de transferencia cargados pueden ser encontrados en el extremo N-terminal así como en el extremo C-terminal de esta zona de transmembrana predicha. El dominio extracelular del receptor es así de 599 aminoácidos y contiene los 9 sitios de glicosilación predichos unidos por N. La parte citoplásmica tiene 215 aminoácidos (resto de aminoácidos números de 647 a 862).

Otros análisis de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 muestran que la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana es un miembro de la superfamilia del receptor de citoquina, en virtud de los elementos de secuencia [Cys132- - -Cys143TW] y [W305SKWS]. Comparando la secuencia mostrada en la Figura 2 con todos los miembros de la superfamilia con el programa ALIGN se muestra que la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana tiene la homología más alta con gp130 humano. La región citoplásmica de la cadena del receptor beta2 de IL-12 contiene los motivos de caja 1 y 2 encontrados en otros miembros de la superfamilia del receptor de citoquina, así como tres restos de tirosina. La fosforilación de tirosinas está asociada comúnmente a la señalización del receptor de citoquina; la presencia de estos restos de tirosina subraya la importancia de la cadena del receptor beta2 de IL-12 en la formación de un receptor de IL-12 funcional. La cadena del receptor beta1 de IL-12 no contiene ningún resto de tirosina en su cola citoplásmica.

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Ejemplo 9

Análisis de los ensayos de unión

Los resultados de los ensayos de unión son mostrados en la Figura 5.

Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, IL-12 humano se une al receptor beta1 o beta2 de IL-12 recombinante solo con una afinidad aparente de aproximadamente 2-5 nM. Los datos de unión fueron descritos por un modelo de receptor de sitio solo, correspondiente al componente de afinidad baja del receptor de IL-12 funcional encontrado en PBMC activado con PHA (R. Chizzonite et al., 1992, J. Immunol., 148:3117; B. Desai et al., 1992, J. Immunol., 148:3125).

En contraste con estos resultados, como se muestra en la Figura 5C, fueron generados tanto sitios de unión de IL-12 de afinidad alta como baja en la cotransfección de células COS con plásmidos del receptor beta1 y beta2 de IL-12. En este caso, los datos de unión fueron descritos mediante un modelo de dos sitios de receptor, con afinidades de 50 pM y 5 nM.

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Ejemplo 10

Efecto de IL-12 humano en líneas celulares de Ba/F3 transfectadas

Se muestran los resultados del ensayo de proliferación para el efecto de IL-12 humano en células Ba/F3 (1) que expresaban la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana, (2) que expresaban la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana, y (3) que coexpresaban la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana y la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana en la Figura 6.

Las células que son transfectadas con cADN tanto para la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana como para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana responden a la estimulación por IL-12 humano proliferando en una manera dependiente de la dosis.

Además, las células que son transfectadas con los cADN para la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana responden a la estimulación por IL-12 humano proliferando en una manera dependiente de la dosis.

Por consiguiente, el cADN aislado (clon Nº. B5-10, SEQ.ID. NO:1) que codifica para una proteína transmembrana tipo I representa un segundo componente del receptor de IL-12 (IL-12R beta2) encontrado en células T humanas normales. Las cadenas beta1 y beta2 cada una se unen solo a IL-12 sólo con afinidad baja (K_{d} = 2-5 nM). En la coexpresión de beta1 y beta2, son observados dos sitios de afinidad, con valores de K_{d} de 50 pM y 5 nM.

Células Ba/F3 que expresan a la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana o que coexpresan a la proteína del receptor beta1 de IL-12 humana y la proteína del receptor beta2 de IL-12 humana son sensibles a IL-12 humano.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: HOFFMANN-LA ROCHE AG

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Grenzacherstrasse 124

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(C): CIUDAD: Basle

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(D): ESTADO: BS

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(E): PAÍS: Switzerland

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4002

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 061-688 51 08

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 061-688 13 95

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TELEX: 962292/965542 hlr ch

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptores para Interleuquina-12

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): TIPO DE LECTURA DE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Publicacion PatentIn #1.0, Version #1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4040 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: secuencia codificante

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(B): LOCALIZACIÓN: 641..3226

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

1

3

4

5

6

7

8

9

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 862 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

14

15

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2104 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

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(G): TIPO DE CÉLULA: células T humanas

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): BIBLIOTECA: biblioteca 3 días PHA/pEF-BOS

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(B): CLON: clon #5 del receptor de interleuquina-12 humano

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(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: SECUENCIA CODIFICANTE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 65..2050

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

16

17

18

19

20

21

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 662 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..20

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= " Péptido señal N-terminal (1..20 o 23 o 24)"

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 541..570

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "región transmembrana"

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(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): LOCALIZACIÓN: 571..662

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= " región citoplásmica de la cola"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 52..64

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "motivo de secuencia de la superfamilia de receptores de citoquina Cys52..Cys62SW"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 222..226

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACION: /nota= "motivo de la superfamilia de receptor de citoquina (W222SKws)"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 121..123

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "sitio de enlace N-glucosilación"

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): LOCALIZACIÓN: 329..331

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de enlace N-glucosilación"

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): LOCALIZACIÓN: 346..348

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de enlace N-glucosilación"

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): LOCALIZACIÓN: 352..354

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de enlace N-glucosilación"

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): LOCALIZACIÓN: 442..444

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de enlace N-glucosilación"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): LOCALIZACIÓN: 456..458

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de enlace N-glucosilación"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): LOCALIZACIÓN: 24..540

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(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "región extracelular"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

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100

22

23

24

25

Claims

1. Un anticuerpo dirigido contra una proteína del receptor beta2 de interleuquina 12 (IL-12) con baja afinidad de unión, o sus fragmentos, cuya proteína del receptor es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID
NO:1,

(a) tiene una baja afinidad de unión para IL-12 desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nM, y

(b) cuando se compleja con una proteína del receptor beta1 de interleuquina-12 (receptor \beta1 de IL-12) forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para IL-12 desde aproximadamente 5 a aproximadamente 100 pM,

en el que el fragmento de una proteína del receptor beta2 de interleuquina-12 de baja afinidad de unión tiene la secuencia de aminoácidos de una parte de una proteína del receptor beta2 de interleuquina-12 y las propiedades (a) y (b) anteriores.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la proteína del receptor beta2 de IL-12 comparte al menos una homología de secuencia del 80% con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:2.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que el receptor beta2 de IL-12 comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:2, o su forma alélica o variante.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el receptor beta2 de IL-12 es soluble y es codificado por un ácido nucleico, cuyo ácido nucleico comprende una subsecuencia (a) y una subsecuencia (b), en el que dicha subsecuencia (a) codifica una forma soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 y la subsecuencia (b) codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de Ig distintos que el primer dominio de dicha región constante.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, dirigido además contra un complejo que se une a IL-12 con una alta afinidad de unión desde aproximadamente 5 a 100 pM, cuyo complejo comprende:

(i): una proteína del receptor beta2 de IL-12, o sus fragmentos, cuya proteína del receptor es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO:1,

: cuya proteína del receptor

(a): tiene una afinidad de unión baja para IL-12 desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nM, y

(b): cuando se compleja con una proteína del receptor beta1 de interleuquina-12 (receptor \beta1 de IL-12) forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para IL-12 desde aproximadamente 5 a aproximadamente 100 pM,

(ii): una proteína del receptor beta2 de IL-12, o sus fragmentos, cuya proteína del receptor es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótido representada en SEQ ID NO:3,

: cuya proteína del receptor

(b): cuando se compleja con una proteína del receptor beta2 de interleuquina-12 (receptor \beta1 de IL-12) forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para IL-12 desde aproximadamente 5 a aproximadamente 100 pM,

en el que el fragmento de una proteína del receptor beta2 de interleuquina 12 de baja afinidad de unión tiene la secuencia de aminoácidos de una parte de una proteína del receptor beta2 de IL-12 y las propiedades (a) y (b) anteriores, y en el que el fragmento de una proteína del receptor beta1 de IL-12 tiene la secuencia de aminoácidos de una parte de la proteína del receptor beta1 de IL-12 y las propiedades (a) y (b) anteriores.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que la proteína del receptor beta2 de IL-12 comparte al menos una homología de secuencia del 80% con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:2.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el que la proteína del receptor beta2 de IL-12 comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:2, su forma alélica o variante.

9. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que la proteína del receptor beta1 de IL-12 comparte al menos una homología de secuencia del 80% con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:4.

10. El anticuerpo de la reivindicación 9, en el que la proteína del receptor beta1 de IL-12 comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:4, o su forma alélica o variante.

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que la proteína del receptor beta2 de IL-12 es codificada por un ácido nucleico, cuyo ácido nucleico comprende una subsecuencia (a) y una subsecuencia (b), en el que dicha subsecuencia (a) codifica una forma soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 y la subsecuencia (b) codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de Ig distintos que el primer dominio de dicha región constante.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 9-10, en el que la proteína del receptor beta1 de IL-12 es codificada por un ácido nucleico, cuyo ácido nucleico comprende una subsecuencia (a) y una subsecuencia (b), en el que dicha subsecuencia (a) codifica una forma soluble de la proteína del receptor beta2 de IL-12 y dicha subsecuencia (b) codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de Ig distintos que el primer dominio de dicha región constante.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que la proteína del receptor beta2 de IL-12 es soluble.

14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 9-10, en el que la proteína del receptor beta1 de IL-12 es soluble.

15. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que el complejo es soluble.

16. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6-15, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que el anticuerpo es purificado.