ES2305098T3 - Dispositivo bioreactor. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo bioreactor (12) que comprende un soporte (14) que contiene una matriz tridimensional (18) de material de espuma, teniendo el material de espuma un interior poroso y que contiene, en su interior poroso y ancladas por él, células hepáticas, comprendiendo también el dispositivo bioreactor (12) un líquido contenido en el soporte (14), siendo dicho líquido un portador de oxígeno que satura y sumerge la matriz (18), comprendiendo el líquido, al menos en parte, un constituyente portador de oxígeno sintético o semi-sintético, caracterizándose el dispositivo bioreactor (12) porque la matriz (18) es una masa continua integral o unitaria de un material de espuma, siendo el material de espuma un material de espuma de celdas abiertas y formando parte el dispositivo (12) de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno, dispuesto para la circulación del líquido portador de oxígeno en el interior del soporte (14), para la circulación de dicho líquido por perfusión a través de la matriz (18) en la que se anclan células vivas, y para la circulación del mismo hacia el exterior del soporte (14).

Description

Dispositivo bioreactor.

Esta invención se refiere a un dispositivo bioreactor. La invención se refiere también a un procedimiento de cultivo de células vivas.

El documento US 5.510.262 revela un aparato y un procedimiento de cultivo de células mediante el flujo de un medio a través de un lecho empaquetado de partículas cerámicas macroporosas biocompatibles dispuestas en un reactor de cultivo celular. El documento US 5.510.262 revela tanto el lecho empaquetado de partículas cerámicas macroporosas que tiene una estructura porosa de celdas abiertas en cuyos poros se cultivan células dependientes de anclaje y a través de cuyos poros tiene lugar un flujo de convección de medio líquido que contiene perfluorocarbono como portador de oxígeno, como un soporte monolítico que tiene poros en los que se cultivan las células y que contienen un medio líquido a través del cual el oxígeno disuelto migra por difusión. Sin embargo, el documento US 5.510.262 no revela la combinación de un soporte unitario o integral que tiene una estructura de espuma de celdas abiertas en cuyos poros están contenidas las células dependientes de anclaje y a través de cuyos poros de celdas abiertas el líquido portador de oxígeno circula por perfusión.

Según la invención, se proporciona un dispositivo bioreactor que comprende un soporte que contiene una matriz tridimensional de un material de espuma de celdas abiertas, teniendo el material de espuma un interior poroso y que contiene, en su interior poroso y anclado a él, células vivas, comprendiendo también el dispositivo bioreactor un líquido contenido en el soporte, siendo el líquido un portador de oxígeno que satura y sumerge a la matriz, comprendiendo el líquido, al menos en parte, un constituyente sintético o semi-sintético que transporta oxígeno, siendo la matriz un masa continua unitaria o integral del material de espuma, siendo el material de espuma un material de espuma de celdas abiertas y formando parte el dispositivo de una circulación del líquido portador de oxígeno, dispuesta para la circulación del líquido portador de oxígeno en el interior del soporte, para la circulación de dicho líquido por perfusión a través de la matriz en la que se cultivan las células vivas, y para la circulación del mismo fuera del soporte.

Por sintético se entiende que el constituyente que transporta el oxígeno está fabricado por un proceso artificial sin etapas del proceso biológicas, significando semi-sintético que el constituyente se sintetiza de forma artificial a partir de materiales de partida producidos biológicamente.

El material de espuma de celdas abiertas podría ser bio-compatible y bio-estable, siendo un material de espuma polimérico. Así, el material de espuma podría ser una espuma de un polímero seleccionado entre el grupo constituido por polímeros de poliuretano, polímeros de cloruro de polivinilo, polímeros de polietileno, polímeros de polipropileno, polímeros de poliestireno, copolímeros de los mencionados anteriormente, copolímeros de estireno-butadieno, copolímeros de estireno-acrilonitrilo, copolímeros de estireno-butadieno-acrilonitrilo, polímeros de poli(metil metacrilato), polímeros de poliamida, polímeros de poli(hexametileno adipamida), polímeros de poli(hexametileno sebacamida), polímeros de policapralactona, polímeros de poli(etileno tereftalato), polímeros de poli(butileno tereftalato), polímeros de policarbonato, polímeros de poliacetal, polímeros de alcohol polivinílico, polímeros de urea-formaldehído, polímeros que contienen flúor, polímeros que contienen silicona y mezclas de los polímeros y copolímeros mencionados anteriormente.

Como se indicó anteriormente, la matriz es una masa continua unitaria o integral del material de espuma.

Las células vivas podrían ser células animales, en particular células de mamíferos, formando el líquido portador de oxígeno un sustituto de la sangre que actúa también como un portador de dióxido de carbono. Durante el uso, como se describirá con más detalle aquí posteriormente, el portador líquido de oxígeno se perfunde a través del dispositivo bioreactor y a través de la matriz en el dispositivo, en la que las células vivas absorben el oxígeno a partir del líquido portador de oxígeno y en la que el líquido portador de oxígeno absorbe el dióxido de carbono producido por las células. Así, aunque el líquido portador de oxígeno tiene como una importante función el transporte de oxígeno, ésta no es su única función, y actuará también como portador de dióxido de carbono y tendrá otras funciones que se describirán aquí posteriormente. Más particularmente, el líquido portador de oxígeno podría comprender un líquido acuoso, teniendo el líquido portador de oxígeno, como constituyente portador de oxígeno sintético o semi-sintético, al menos, un miembro seleccionado entre el grupo constituido por hemoglobinas libres de células, hemoglobinas reticuladas, hemoglobinas encapsuladas en liposomas y perfluorocarbonos, preferentemente perfluorocarbonos. El constituyente sintético o semi-sintético podría ser un perfluorocarbono, siendo el líquido portador de oxígeno una emulsión de una fase orgánica y una fase acuosa, comprendiendo la fase orgánica el perfluorocarbono y siendo, normalmente, la fase dispersa de la emulsión, y siendo la fase acuosa, la fase continua de la emulsión y la que comprende el líquido acuoso, comprendiendo normalmente la fase acuosa plasma sanguíneo. En lugar de esto, el constituyente sintético o semi-sintético podría ser una hemoglobina libre de células, estando la hemoglobina libre de células disuelta en el líquido acuoso, tal como plasma sanguíneo. En lugar de esto, el constituyente sintético o semi-sintético podría ser una hemoglobina encapsulada en liposomas, estando resuspendida la hemoglobina encapsulada en liposomas como una suspensión de la misma en un líquido acuoso, tal como plasma sanguíneo. De esta forma, se pretende que el término liquido portador de oxígeno incluya a las emulsiones, disoluciones y suspensiones, en las que el constituyente sintético o semi-sintético está disperso por emulsión, disolución o suspensión del mismo en un líquido acuoso tal como plasma
sanguíneo.

El soporte podría ser un recipiente o contenedor que tenga una entrada del líquido portador de oxígeno, convenientemente en un nivel alto, y una salida del líquido portador de oxígeno, convenientemente en un nivel bajo, estando la salida de líquido portador de oxígeno a un nivel inferior al de la entrada del líquido portador de oxígeno y formando un drenaje del líquido portador de oxígeno a un nivel bajo, estando opcionalmente provisto el soporte con un dispositivo de regulación de la temperatura para regular la temperatura de la matriz y del líquido portador de oxígeno, por ejemplo, una camisa de calentamiento/enfriamiento que tiene una entrada y una salida para un líquido de calentamiento/enfriamiento tal como agua. El dispositivo podría, así, formar parte de un circuito líquido de regulación de la temperatura para la circulación de un líquido regulador de la temperatura dentro y fuera del soporte, estando el soporte provisto con un dispositivo de regulación de la temperatura en forma de una camisa reguladora de la temperatura hueca, para el soporte, teniendo la camisa al menos una entrada y una salida para el líquido de regulación de la temperatura, comprendiendo el circuito regulador de la temperatura un dispositivo de circulación del líquido para la circulación del líquido regulador de la temperatura a lo largo y alrededor del circuito regulador de la temperatura, un termostato y un dispositivo de transferencia del calor distante del soporte y operativo en respuesta a señales procedentes del termostato, para controlar la temperatura del líquido regulador de la temperatura y, por ello, regular la temperatura de la matriz y del líquido portador de oxígeno. En lugar de esto, el aparato o la instalación completos podrían estar contenidos en un ambiente de temperatura regulada.

El dispositivo bioreactor podría formar parte de un aparato portátil, o podría formar parte de una instalación fija, extendiéndose consecuentemente la invención a este aparato o instalación. En este aparato o instalación el dispositivo bioreactor, como se indicó anteriormente, forma parte de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno dispuesto para que el líquido portador de oxígeno circule en el interior del soporte, por ejemplo, mediante su entrada, a través de la matriz a la que están ancladas las células vivas, y fuera del soporte, por ejemplo, mediante su salida. El aparato o instalación podría incluir también, opcionalmente, un dispositivo de eliminación de toxinas, tal como una columna de absorción o una unidad de intercambio iónico.

El circuito de circulación del líquido portador de oxígeno podría incluir, al menos, un dispositivo que se selecciona entre el grupo constituido por dispositivos de circulación de líquidos tales como bombas para la circulación del líquido portador de oxígeno a lo largo y alrededor del circuito, dispositivos de eliminación de biomasa tales como filtros para eliminar biomasa del líquido portador de oxígeno que surge del soporte, dispositivos de separación para la separación del constituyente sintético o semi-sintético del líquido portador de oxígeno de otros constituyentes del mismo, dispositivos de eliminación de dióxido de carbono para la eliminación del dióxido de carbono del líquido portador de oxígeno, dispositivos de oxigenación para la oxigenación del líquido portador de oxígeno y dispositivos de eliminación de aire para eliminar el aire del líquido portador de oxígeno. En una forma de realización particular, el circuito de circulación podría incluir múltiples dispositivos del grupo, estando los dispositivos dispuestos, comenzando con el soporte, en una secuencia que comprende un único dispositivo de eliminación de la biomasa, seguido a su vez por un único dispositivo de separación, un único dispositivo de eliminación de dióxido de carbono, un único dispositivo de oxigenación, un único dispositivo de eliminación de aire y un único dispositivo de circulación del líquido, estando el soporte a continuación del dispositivo de circulación del líquido, de forma que el circuito es un circuito sin final o cerrado, y estando dispuesto el dispositivo de circulación del líquido para hacer circular al líquido portador de oxígeno a lo largo y alrededor del circuito en la dirección en la que los dispositivos del grupo siguen uno al otro en dicha secuencia. En este caso y cuando el líquido portador de oxígeno es una emulsión que contiene un perfluorocarbono como su constituyente sintético emulsionado con un líquido acuoso tal como plasma sanguíneo, el perfluorocarbono se separará físicamente, mediante un dispositivo de separación, del plasma y de cualquier medio de crecimiento presente, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración, opcionalmente después de que se haya roto la emulsión; pero para otros constituyentes sintéticos, tales como hemoglobina libre o hemoglobina encapsulada en liposomas, se pueden usar otras técnicas de separación, diseñadas para los constituyentes del portador de oxígeno sintético en cuestión; y una función adicional de este dispositivo de separación es que puede actuar como un recipiente para el líquido del circuito de circulación de plasma. Como se indicó anteriormente, en una disposición particular, el circuito de circulación de plasma contiene todos los dispositivos enumerados anteriormente, y en este caso, estos pueden estar uno a continuación del otro en una serie en la secuencia especificada anteriormente, en la dirección del flujo a lo largo del circuito, estando la bomba inmediatamente antes del dispositivo bioreactor, y el filtro de biomasa inmediatamente después del dispositivo bioreactor. En otras palabras, la secuencia comprende, en la mencionada dirección del flujo, y comenzando con el dispositivo bioreactor, el dispositivo para eliminar la biomasa, seguido a su vez por el dispositivo de separación, el dispositivo de eliminación de dióxido de carbono, el dispositivo de oxigenación, el dispositivo de eliminación de aire y la bomba, estando el dispositivo bioreactor a continuación de la bomba. El dispositivo de eliminación de dióxido de carbono y el dispositivo de oxigenación pueden ser, opcionalmente, un dispositivo único.

Como se indicó anteriormente, el aparato o instalación podría incluir un circuito de líquido de calentamiento/enfriamiento para la circulación del líquido de calentamiento/enfriamiento a través de la camisa de calentamiento/enfriamiento, teniendo opcionalmente este circuito su propio dispositivo de circulación de líquido, tal como una bomba, un termostato en la camisa y los medios para el calentamiento/enfriamiento del líquido, distantes del dispositivo bioreactor y operativos en respuesta a señales del termostato, comprendiendo convenientemente el termostato un termopar conectado a un controlador lógico programable.

El aparato o instalación podría incluir un circuito de circulación de sangre, por ejemplo, para recibir o retirar sangre de un paciente humano o de un animal, para hacer circular la sangre en contacto con el circuito de circulación de plasma para liberar los constituyentes de la sangre, tales como plasma sanguíneo al líquido portador de oxígeno y para recibir o retirar los constituyentes acuosos del líquido portador de oxígeno y devolverlos al paciente. El circuito de circulación de sangre podría incluir un dispositivo de circulación de líquido tal como una bomba para la circulación de la sangre y los constituyentes de la sangre alrededor y a lo largo del circuito de circulación de sangre; un dispositivo de separación de plasma para separar la sangre del paciente en una fracción de plasma sanguíneo que este libre de células sanguíneas y una fracción que contiene células sanguíneas y una parte residual del plasma; y un dispositivo de eliminación del aire del suero. El dispositivo de separación de plasma podría incluir, opcionalmente, un dispositivo adicional, tal como un filtro de sangre. La secuencia de los dispositivos que forman parte del circuito de circulación de sangre podría ser en la secuencia en la que se enumeraron anteriormente, en la dirección del flujo de líquido a lo largo y alrededor del circuito. Así, comenzando con el paciente, el primer dispositivo podría ser la bomba, seguido a su vez por el dispositivo de separación de plasma y por el dispositivo de eliminación de aire, estando seguido el dispositivo de eliminación de aire por el paciente. En otras palabras, el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno podría estar conectado a un circuito de circulación de sangre para la circulación de la sangre en contacto con el líquido portador de oxígeno, en el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno, para la liberación de los constituyentes sanguíneos libres de células en el circuito del líquido portador de oxígeno, y para recibir o retirar los constituyentes del líquido acuoso portador de oxígeno libre de células del circuito del líquido portador de oxígeno, incluyendo el circuito de circulación de sangre un dispositivo de circulación de sangre para la circulación de la sangre a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre, un dispositivo de separación de plasma para la separación de la sangre que circula a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre en una fracción de plasma sanguíneo libre de células y en una fracción que contiene células sanguíneas que contiene células de sangre y parte del plasma sanguíneo, y un dispositivo para la eliminación del aire para eliminar el aire de la sangre que circula a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre. Como se indicó anteriormente, los dispositivos del circuito de circulación de sangre se podrían disponer en una secuencia, en la que el dispositivo de circulación de sangre está seguido, a su vez, por el dispositivo de separación de plasma y por el dispositivo de eliminación de aire, estando dispuesto el dispositivo de circulación de sangre para hacer circular sangre a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre en la dirección en la que los dispositivos del circuito de circulación de sangre están uno a continuación del otro en dicha secuencia.

El dispositivo de separación de plasma se podría conectar al circuito de circulación de plasma, de forma que el dispositivo de separación de plasma este dispuesto para alimentar plasma a partir de la sangre del paciente en el circuito de circulación de plasma, convenientemente después del dispositivo de eliminación de aire del circuito de circulación de plasma y antes de su bomba y del dispositivo bioreactor; y el dispositivo de separación del circuito de circulación de plasma podría estar conectado al circuito de circulación de sangre en una forma tal que el dispositivo de separación esté dispuesto para alimentar el líquido acuoso separado a partir del líquido portador de oxígeno en el circuito de circulación de sangre, convenientemente después del dispositivo de separación de plasma y antes del dispositivo de eliminación de aire del circuito de circulación de sangre. En otras palabras la conexión entre el circuito de circulación de líquido con oxígeno y el circuito de circulación de sangre podría ser una conexión entre el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno y el dispositivo de separación de plasma del circuito de circulación de sangre.

El aparato o la instalación incluyen, convenientemente, una o más líneas de flujo de suministro de nutrientes, una línea de flujo de suministro del líquido portador de oxígeno y una línea de alimentación de oxígeno (dicha línea de alimentación de oxígeno podría ser para la alimentación de oxígeno o de una mezcla de oxígeno y otros gases tales como dióxido de carbono), alimentando cada de ellas el dispositivo de oxigenación del circuito de circulación de plasma; y el aparato o instalación podrían incluir un o más líneas de vacío para la retirada del dióxido de carbono a partir del dispositivo de eliminación del dióxido de carbono y conectada con el mismo, y una línea de flujo de biomasa, conectada al dispositivo de eliminación de biomasa, para descargar, a residuos, la bio-masa eliminada mediante el dispositivo de eliminación de biomasa a partir del líquido portador de oxígeno. La instalación podría incluir también una línea de alimentación para el acondicionamiento de sangre para la alimentación de sustancias acondicionadoras de sangre en el circuito de plasma, por ejemplo para controlar el pH o corregir otros desequilibrios químicos y para alimentar convenientemente el dispositivo de oxigenación.

La invención se extiende a un procedimiento de cultivo de células vivas, comprendiendo el procedimiento la circulación de un líquido que es un portador de oxígeno y que comprende, al menos en parte, un constituyente portador de oxígeno, sintético o semi-sintético, a través de la matriz de material de espuma que tienen un interior poroso, en el que se pueden anclar células vivas, formando la matriz parte de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno dispuesto para la circulación del líquido portador de oxígeno, en el interior de un soporte que contiene una matriz tridimensional, a través de la matriz, y fuera del soporte, absorbiendo las células el oxígeno y los nutrientes a partir del líquido y absorbiendo el líquido el dióxido de carbono y otros productos metabólicos de las células, siendo la matriz una masa unitaria o integral del material de espuma de celdas abiertas, y siendo la circulación del líquido portador de oxígeno a través de la matriz por perfusión del líquido portador de oxígeno a través de la matriz.

La matriz podría formar parte de un dispositivo bioreactor que podría ser, más detalladamente, como se describió anteriormente; y el líquido portador de oxígeno podría a su vez describirse como anteriormente en referencia al aparato o instalación de la invención. Naturalmente, las células vivas absorberán constituyentes del líquido portador de oxígeno, distintos de oxígeno, tales como nutrientes, y el líquido portador de oxígeno absorberá los productos metabólicos de las células distintos de dióxido de carbono.

El dispositivo bioreactor, como se indicó anteriormente, forma parte de un aparato o instalación como el descrito en este documento, de forma que la perfusión del líquido a través de la matriz es por circulación del líquido a lo largo y alrededor de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno, tal como un circuito de circulación de plasma, y a través de la matriz en el soporte, incluyendo el procedimiento, opcionalmente, una o más entre las etapas de:

control de la temperatura de la matriz y del interior del soporte del dispositivo bioreactor monitorizando la temperatura en ellos y haciendo circular un líquido de calentamiento/enfriamiento a lo largo del circuito del líquido de calentamiento/enfriamiento a un caudal y una temperatura apropiadas para mantener la temperatura de la matriz y del interior del soporte en un intervalo de valores deseado;

filtrado de la bio-masa del líquido portador de oxígeno mediante un filtro de bio-masa y eliminando ésta a residuos a lo largo de la línea de flujo de biomasa;

separación del líquido portador de oxígeno en una fase acuosa, tal como una fase de plasma, y un fase que contiene el constituyente sintético, tal como una fase orgánica de polifluorocarbono en el dispositivo de separación, a la vez que se alimenta la fase que contienen el constituyente sintético separado a lo largo del circuito de circulación de plasma y se alimenta la fase acuosa separada en el interior del circuito de circulación de sangre;

eliminación del dióxido de carbono del líquido portador de oxígeno mediante un dispositivo de eliminación de dióxido de carbono, retirándose el dióxido de carbono eliminado del dispositivo de eliminación de dióxido de carbono a lo largo de la línea de vacío;

oxigenación del líquido portador de oxígeno en el dispositivo de oxigenación y, opcionalmente, alimentación de suministro de nutrientes, del suministro del líquido portador de oxígeno y de las sustancias de acondicionamiento de sangre en el líquido portador de oxígeno en el dispositivo de oxigenación; y

eliminación del aire del líquido portador de oxígeno en el circuito de circulación de plasma,

haciéndose circular el líquido portador de oxígeno alrededor y a lo largo del circuito de circulación de plasma mediante la bomba.

En particular, el líquido portador de oxígeno podría comprender un constituyente acuoso en forma de plasma sanguíneo, perfundiendo el líquido a través de la matriz al hacer circular el líquido a lo largo y alrededor de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno y a través de la matriz; y el procedimiento que incluye la etapa de regulación de la temperatura de la matriz y del líquido portador de oxígeno, para mantener la temperatura de la matriz y del líquido portador de oxígeno en un intervalo de valores deseado. En este caso, el procedimiento podría incluir la etapa de separación de la biomasa del líquido portador de oxígeno que circula a lo largo y alrededor del circuito del líquido portador de oxígeno y la eliminación de la biomasa separada a residuos. El procedimiento podría incluir también la separación del líquido portador de oxígeno que circula a lo largo y alrededor del circuito del líquido portador de oxígeno en una fase acuosa y en una fase que contiene un constituyente portador de oxígeno semi-sintético o sintético, estando la fase acuosa sustancialmente libre de dichos constituyentes portadores de oxígeno; y el procedimiento que incluye la retención de una fase separada que contiene un constituyente semi-sintético o sintético en el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno y la alimentación de la fase acuosa separada en el interior de un circuito de circulación de sangre, conectado con el circuito de circulación del líquido portador de
oxígeno.

Cuando se usa como un hígado artificial, el dispositivo bioreactor requiere que se suministre a las células vivas en su interior, entre otras cosas, oxígeno y nutrientes, a la vez que se eliminan de ellas el dióxido de carbono y otros subproductos metabólicos; y al mismo tiempo las células vivas deben estar expuestas a sangre o a fracciones separadas de sangre, tales como fracciones de plasma, sobre las que los hepatocitos realizan sus pretendidas funciones metabólicas, tales como la eliminación de las mismas de neurotoxinas y toxinas hepáticas, la producción de factores neurotróficos y hepatotróficos, y la producción de factores de coagulación específicos de hígado. A este respecto, el dispositivo de separación de plasma podría, por ejemplo, proporcionar una barrera semi-permeable, tal como una membrana, que permita pasar al líquido libre de células hacia el interior del líquido portador de oxígeno, pero que evite que las células de la sangre hagan lo mismo, y se aplican consideraciones similares al filtro de biomasa y al dispositivo de separación en el circuito de circulación del plasma, que podrían también, por ejemplo, proporcionar barreras semipermeables que permitan al líquido acuoso libre de células, del que se han separado la mayoría de los constituyentes sintéticos del líquido portador de oxígeno, la entrada de nuevo en el circuito de circulación de sangre. Naturalmente, en lugar de estos, se pueden utilizar otros dispositivos de separación, tales como centrífugas.

Las células de hígado tales como los hepatocitos son dependientes de anclaje de forma que el anclaje de los mismos en una matriz tridimensional adecuada facilita su crecimiento y división celular, y aumenta su funcionalidad en cuanto a las funciones metabólicas del hígado. La matriz de espuma de celdas abiertas de la presente invención proporciona un área de superficie adecuada en la matriz tridimensional para la adhesión celular aceptable y el anclaje en la misma, efectuándose dicho anclaje por las mismas células; pero si las células son incapaces de anclarse en su sitio, o si el anclaje se tiene que mejorar, las células se podrían encapsular en un revestimiento polimérico, que podría ser poroso o permeable, provocándose o permitiéndose que el revestimiento se adhiera a la matriz o que sea parte integral de la mima. En lugar de esto, la misma espuma se podría revestir con una sustancia que aumente el anclaje, tal como colágeno.

La invención se describirá ahora por medio de ejemplos ilustrativos, no limitantes, en referencia al diagrama que los acompaña, en el que la única Figura es un diagrama de flujo esquemático de una instalación según la presente invención.

En el dibujo, el número de referencia 10 designa generalmente una instalación no portátil según la presente invención. La parte primera de la instalación 10 es un dispositivo bioreactor 12 que comprende un soporte en forma de un recipiente o tanque de reacción 14 provisto de una camisa de calentamiento/enfriamiento 16 y que contiene una matriz (mostrada con rayas entrecruzadas en 18) de una espuma de poliuretano bioestable y biocompatible, de celdas abiertas. La espuma, en el interior de sus celdas, contiene hepatocitos humanos (no mostrado) en una cantidad de aproximadamente 2,5 x 10^{11} células, esto es, una cantidad que constituye, normalmente, del 20-30% del promedio de un hígado adulto. Se muestra que la camisa 16 tiene, a un nivel bajo, una línea de flujo de entrada 20 de agua de calentamiento/enfriamiento y, a un nivel alto, una línea de flujo de salida 22 para el agua de calentamiento/enfriamiento. Las líneas de flujo 20 y 22 permiten el suministro de agua de calentamiento/enfriamiento (no mostrado) que circula a través de la camisa 16, mediante una bomba (no mostrado), a una velocidad y/o temperatura controladas por un termostato (tampoco se muestra) unido a o en el recipiente 14, por lo que se controla la temperatura en el recipiente 14 de forma que permanece a un valor deseado, específicamente 37ºC, para los hepatocitos humanos.

El dispositivo bioreactor 12 tiene una entrada de líquido, a un nivel alto, alimentada por una bomba 24 que bombea a lo largo de la línea de flujo 26 a un caudal < 600 ml/minuto, preferentemente 100-250 ml/minuto; y el dispositivo 12 tiene una salida de líquido, a un nivel bajo, que alimenta, a lo largo de una línea de flujo 28, un filtro de bio-masa 30. El filtro de bio-masa 30 tiene una membrana del filtro 32 y una salida de bio-masa que alimenta, a lo largo de una línea de flujo de bio-masa 32, los residuos, y la salida de filtrado que alimenta, a lo largo de una línea de flujo de filtrado 36, un dispositivo de separación 38. El dispositivo 38 es para la separar una de otra las fases líquidas de una emulsión, específicamente, una fase líquida acuosa de una fase líquida de perfluorocarbono, cuando se utiliza un constituyente líquido portador de oxígeno sintético de perfluorocarbono, como se describirá posteriormente en este documento. Cuando se utilizan otros constituyentes líquidos portadores de oxígeno sintéticos tales como una hemoglobina libre de células disuelta o una hemoglobina encapsulada en liposomas resuspendida, se usarán, naturalmente, mecanismos de separación que utilicen otras técnicas de separación.

El dispositivo de separación 38 tiene una membrana de separación de fase 40 y tiene un par de salidas, específicamente, una salida de la fase de perfluorocarbono a una línea de flujo de perfluorocarbono 42, que conduce a un dispositivo de eliminación de dióxido de carbono 44, y una salida de la fase de plasma o acuosa a un línea de flujo de la fase de plasma o acuosa 46, que conduce a un dispositivo de eliminación del aire 48. El dispositivo 44 tienen una salida de líquido a una línea de flujo de líquido 50, que conduce a un dispositivo de oxigenación 52, y una salida de gas dióxido de carbono a una línea de flujo de vacío de dióxido de carbono 54, que conduce a una bomba de vacío (no mostrada).

El dispositivo de oxigenación 52 se alimenta por una línea de alimentación de una disolución de nutrientes 56 y una línea de flujo de suministro de una fase orgánica 58, también mediante una línea de alimentación de gas oxígeno 60. El dispositivo 52 tiene una salida de líquido que alimenta el interior de una línea de flujo de líquido 62, que conduce a un dispositivo de eliminación de aire 64, que, a su vez, tiene una salida de líquido hacia una línea de flujo 66, que conduce a la entrada de la bomba 24. Una línea de alimentación de acondicionamiento de sangre (no mostrada) podría alimentar el interior del dispositivo 52, que sería para la alimentación de sustancias acondicionadoras de sangre hacia el líquido en el dispositivo 52.

La bomba 24, el bioreactor 12, el filtro 30, el dispositivo de separación 38, el dispositivo de eliminación de dióxido de carbono 44, el dispositivo de oxigenación 52 y el dispositivo de eliminación del aire 64, y las líneas de flujo que los conectan, todos ellos forman un circuito de circulación del plasma.

La instalación 10 incluye, además, un dispositivo de separación de plasma 68 que tiene una membrana semi-permeable 70. El dispositivo 68 tiene una salida de plasma a la línea de flujo de plasma 72, que conduce a la línea 66, y una salida de sangre completa que contiene células a una línea de flujo 74, que alimenta la línea 46, entre el dispositivo de separación 38 y el dispositivo de eliminación del aire 48. El dispositivo de separación de plasma 68 se alimenta por la bomba 76 a lo largo de la línea 78.

Finalmente, se muestra una línea de suministro de sangre 80, que alimenta la entrada de la bomba 76, a la vez que se muestra que el dispositivo de eliminación del aire 48 tiene una salida a una línea de retorno de sangre 82, conduciendo las líneas 80 y 82 desde y hacia, respectivamente, el sistema venoso del paciente (no mostrado), con él que están en comunicación. La bomba 76, el dispositivo de separación 68 y el dispositivo de eliminación de aire 48, junto con el paciente y las líneas de flujo que los conectan, forman un circuito de circulación de sangre.

De acuerdo con el procedimiento de la invención, la sangre venosa se retira continuamente del paciente a partir de la línea 80 mediante la bomba 76, a un caudal < 400 ml/minuto, preferentemente 150-250 ml/minuto, que la bombea a lo largo de la línea 78 hasta el dispositivo de separación 68, en el que se separa en una fracción de sangre completa y una fracción de plasma. La fracción se sangre circula a partir del dispositivo 68, a un caudal <200 ml/minuto, preferentemente 50-150 ml/minuto, a lo largo de la línea 72 hasta encontrarse con la línea 66, en 84, y la fracción de sangre completa circula a lo largo de la línea 74, a un caudal <200 ml/minuto, preferentemente 50-150 ml/minuto, hasta encontrarse con la línea 46, en 86. La línea 66, en el lugar en el que deja al dispositivo 64, contiene una fase perfluorocarbono que comprende un perfluorocarbono adecuado, específicamente, perfluoro-octilbromuro en una concentración volumétrica del 10-60%. El plasma del dispositivo 68 se mezcla con una emulsión formada previamente que comprende perfluorocarbono, que circula desde el dispositivo 64 hacia el interior de la línea 66, comprendiendo la emulsión lecitina de yema de huevo como emulsionante, teniendo la emulsión perfluorocarbono como su fase dispersa y entrando la emulsión en la parte superior del recipiente 14.

En el recipiente 14 la emulsión perfunde de forma descendente hacia la matriz 18, en contacto con los hepatocitos vivos anclados en la matriz. El flujo de agua a lo largo de las líneas 20 y 22, desde y hacia la camisa 16, controla la temperatura de la emulsión en la matriz a, sustancialmente, 37ºC. Los hepatocitos absorben oxígeno y nutrientes a partir de la emulsión y la emulsión absorbe dióxido de carbono y otros productos metabólicos de los hepatocitos. La emulsión abandona el dispositivo 12 a lo largo de la línea 28 hasta el filtro de biomasa 30.

En el filtro 30, la emulsión se filtra para eliminar la biomasa de la misma, circulando la biomasa filtrada a lo largo de la línea 34 desde el filtro 30 hasta los residuos. La emulsión filtrada circula desde el filtro 30 a lo largo de la línea 36 hasta el dispositivo de separación 38, en el que la emulsión se separa en una fase acuosa o de plasma y una fase de perfluorocarbono. La fase de perfluorocarbono abandona el dispositivo 38 a lo largo de la línea de flujo 42 hasta el dispositivo de eliminación de dióxido de carbono 44 y la fase acuosa o de plasma abandona el dispositivo 38 a lo largo de la línea de flujo 46 hasta el dispositivo de eliminación de aire 48, recibiendo la fase acuosa o de plasma, en 86, antes del dispositivo 48, la sangre total desde la línea 74. Se elimina el aire de la sangre que comprende dicha sangre total y dicha fase acuosa o de plasma en el dispositivo de aireación 48 y retorna a lo largo de la línea 82 hasta el sistema venoso del paciente.

En el dispositivo 44, el dióxido de carbono se retira mediante vacío y se elimina a lo largo de la línea 54, abandonando la fase de perfluorocarbono el dispositivo 44 a lo largo de la línea 50 hasta el dispositivo de oxigenación 52. El dióxido de carbono se puede eliminar, naturalmente, por otras técnicas.

En el dispositivo de oxigenación 52, la fase de perfluorocarbono se alimenta con nutrientes a lo largo de la línea 56, abasteciéndose con perfluorocarbono a lo largo de la línea 58 y con oxígeno a lo largo de la línea 60, abandonando la fase de perfluorocarbono el dispositivo 52 a lo largo de la línea 62 hasta el dispositivo 64, en el que se elimina el aire de esta fase. Las sustancias acondicionadoras de sangre, tales como sustancias de control del pH, se pueden alimentar también hacia la fase de perfluorocarbono en el dispositivo 52, a partir de una línea de alimentación para ello (no mostrada).

El dispositivo de separación 68 actúa para evitar que las células de sangre inmunocompetentes entren en el líquido portador de oxígeno, con el fin de reducir la posibilidad de una activación inmune cuando las células inmunocompetentes del paciente entran en contacto con la células xenogénicas en el sistema del bioreactor.

Una característica de la invención es que la separación del circuito de circulación de transporte de plasma y el circuito de circulación de sangre, permite que el líquido portador de oxígeno circule a través del dispositivo bioreactor a una velocidad superior a la que la sangre se puede retirar del paciente de una forma continua. En relación a esto, el dispositivo de separación 38 puede actuar como un reservorio del líquido portador de oxígeno. Una característica adicional es que los distintos dispositivos y líneas de flujo deberían estar aislados de forma adecuada o deberían tener la temperatura regulada mediante un calentamiento y/o enfriamiento adecuado, para mantener a todos los líquidos incluidos en la instalación a una temperatura, lo más cercana posible a 37ºC.

Una ventaja de la invención, particularmente como se ilustra y se describe en referencia a los dibujos, es que permite a los hepatocitos mantenerse viable a la vez que se mantiene su actividad metabólica hasta 14 días o más. Las células puede eliminar neurotoxinas y toxinas hepáticas de la sangre del paciente, a la vez que producen factores neurotróficos, factores hapatotróficos y factores de coagulación específicos de hígado, y a la vez que llevan a cabo otras actividades metabólicas de los hepatocitos. Esto puede permitir, si el dispositivo contiene un número suficiente de hepatocitos, por ejemplo el 20% o más del número de estas células en el hígado del paciente, que el hígado del paciente se regenere, o que pueda sustentar al paciente durante un periodo puente hasta que sea posible un transplante de hígado.

Claims (19)

1. Un dispositivo bioreactor (12) que comprende un soporte (14) que contiene una matriz tridimensional (18) de material de espuma, teniendo el material de espuma un interior poroso y que contiene, en su interior poroso y ancladas por él, células hepáticas, comprendiendo también el dispositivo bioreactor (12) un líquido contenido en el soporte (14), siendo dicho líquido un portador de oxígeno que satura y sumerge la matriz (18), comprendiendo el líquido, al menos en parte, un constituyente portador de oxígeno sintético o semi-sintético,

caracterizándose el dispositivo bioreactor (12) porque la matriz (18) es una masa continua integral o unitaria de un material de espuma, siendo el material de espuma un material de espuma de celdas abiertas y formando parte el dispositivo (12) de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno, dispuesto para la circulación del líquido portador de oxígeno en el interior del soporte (14), para la circulación de dicho líquido por perfusión a través de la matriz (18) en la que se anclan células vivas, y para la circulación del mismo hacia el exterior del soporte (14).

2. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 1, caracterizado porque el material de espuma de celdas abiertas es bio-compatible y bio-estable, siendo un material de espuma polimérico.

3. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 2, caracterizado porque el material de espuma es una espuma de un polímero seleccionado entre el grupo constituido por polímeros de poliuretano, polímeros de cloruro de polivinilo, polímeros de polietileno, polímeros de polipropileno, polímeros de poliestireno, copolímeros de los mencionados anteriormente, copolímeros de estireno-butadieno, copolímeros de estireno-acrilonitrilo, copolímeros de acrilonitrilo-butadieno-estireno, polímeros de poli(metil metacrilato), polímeros de poliamida, polímeros de poli(hexametileno adipamida), polímeros de poli(hexametileno sebacamida), polímeros de policapralactona, polímeros de poli(etileno tereftalato), polímeros de poli(butileno tereftalato), polímeros de policarbonato, polímeros de poliacetal, polímeros de alcohol polivinílico, polímeros de urea-formaldehído, polímeros que contienen flúor, polímeros que contienen silicona y mezclas de los polímeros y copolímeros mencionados anteriormente.

4. Un dispositivo como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células vivas son células de mamífero, formando el líquido portador de oxigeno un sustituto de la sangre que actúa también como un portador de dióxido de carbono.

5. Un dispositivo como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el líquido portador de oxígeno comprende un líquido acuoso, teniendo el líquido portador de oxígeno, como el constituyente portador de oxígeno sintético o semi-sintético, al menos, un miembro seleccionado entre el grupo constituido por hemoglobinas libres de células, hemoglobinas reticuladas, hemoglobinas encapsuladas en liposomas y perfluorocarbonos.

6. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 5, caracterizado porque el constituyente portador de oxígeno sintético o semi-sintético es un perfluorocarbono sintético, siendo el líquido portador de oxígeno una emulsión de una fase orgánica y una fase acuosa, comprendiendo la fase orgánica el perfluorocarbono y constituyendo la fase dispersa de la emulsión, y siendo la fase acuosa, la fase continua de la emulsión y la que comprende el líquido acuoso.

7. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 5, caracterizado porque el constituyente sintético o semi-sintético es una hemoglobina libre de células, estando la hemoglobina libre de células disuelta en el líquido acuoso, y siendo el líquido acuoso plasma sanguíneo.

8. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 6, caracterizado porque el constituyente sintético o semi-sintético es una hemoglobina encapsulada en liposomas, estando resuspendida la hemoglobina encapsulada en liposomas como una suspensión de la misma en un líquido acuoso, y siendo el líquido acuoso plasma sanguíneo.

9. Un dispositivo como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el soporte (14) es un recipiente o contenedor de reacción (14) que tiene una entrada del líquido portador de oxígeno y una salida del líquido portador de oxígeno, estando la salida del líquido portador de oxígeno a un nivel inferior a la entrada del líquido portador de oxígeno y formando un drenaje del líquido portador de oxígeno, estando provisto el soporte (14) con un dispositivo de regulación de la temperatura (16) para la regulación de la temperatura de la matriz (18) y del líquido portador de oxígeno.

10. Un dispositivo como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque forma parte de un circuito de líquido regulador de la temperatura para la circulación de un líquido regulador de la temperatura dentro y fuera del soporte (14), estado provisto el soporte (14) de un dispositivo de regulación de la temperatura (16) en forma de una camisa hueca para la regulación de la temperatura (16) para el soporte (14), teniendo la camisa (16) una entrada (20) y una salida (22) para un líquido regulador de la temperatura, comprendiendo el circuito de regulación de la temperatura un dispositivo de circulación del líquido para la circulación del líquido regulador de la temperatura a lo largo y alrededor del circuito de regulación de la temperatura, un termostato y un dispositivo de transferencia del calor distante del soporte (14) y operativo en respuesta a señales procedentes del termostato, para controlar la temperatura del líquido regulador de la temperatura y, por ello, regular la temperatura de la matriz (18) y del líquido portador de oxígeno.

11. Un dispositivo como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno incluye, al menos, un dispositivo que se selecciona entre el grupo constituido por dispositivos de circulación del líquido (24) para la circulación del líquido portador de oxígeno a lo largo y alrededor del circuito, dispositivos de eliminación de bio-masa (30) para eliminar la bio-masa del líquido portador de oxígeno que surge desde el soporte (14), dispositivos de separación (38) para la separación del constituyente sintético o semi-sintético del líquido portador de oxígeno de los otros constituyentes del mismo, dispositivos de eliminación de dióxido de carbono (44) para la eliminación del dióxido de carbono del líquido portador de oxígeno, dispositivos de oxigenación (52) para la oxigenación del líquido portador de oxígeno, y dispositivos de eliminación del aire (64) para eliminar el aire del líquido portador de oxígeno.

12. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 11, caracterizado porque el circuito de circulación incluye múltiples dispositivos del grupo, estando dispuestos los dispositivos, comenzando por el soporte (14), en una secuencia que comprende un único dispositivo de eliminación de bio-masa (30), seguido a su vez por un único dispositivo de separación (38), un único dispositivo de eliminación de dióxido de carbono (44), un único dispositivo de oxigenación (52), un único dispositivo de eliminación de aire (64) y un único dispositivo de circulación del líquido (24), estando el soporte (14) a continuación del dispositivo de circulación del líquido (24), de forma que el circuito es un circuito sin final o cerrado, y estando dispuesto el dispositivo de circulación del líquido (24) para hacer circular al líquido portador de oxígeno a lo largo y alrededor del circuito en la dirección en la que los dispositivos del grupo siguen uno al otro en dicha secuencia.

13. Un dispositivo como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno está conectado a un circuito de circulación de sangre para hacer circular sangre para que entre en contacto con el líquido portador de oxígeno en el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno, para surtir de los constituyentes de la sangre libre de células al circuito del líquido portador de oxígeno, y para recibir o retirar los constituyentes del líquido acuoso portador de oxígeno libre de células desde el circuito del líquido portador de oxígeno, incluyendo el circuito de circulación de sangre un dispositivo de circulación de sangre (76) para hacer circular a la sangre a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre, un dispositivo de separación de plasma (68) para la separación de la sangre que circula a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre en una fracción de plasma libre de células y en una fracción que contiene células sanguíneas y parte del plasma sanguíneo, y un dispositivo de eliminación de aire (48) para eliminar el aire de la sangre que circula a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre.

14. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 13, caracterizado porque los dispositivos del circuito de circulación de sangre están dispuestos en una secuencia, en la que el dispositivo de circulación de sangre (76) está seguido a su vez por el dispositivo de separación de plasma (68) y por el dispositivo de eliminación de aire (48), estando dispuesto el dispositivo de circulación de sangre (76) para hacer circular a la sangre a lo largo y alrededor del circuito de circulación de sangre en la dirección en la que los dispositivos de circuito de circulación de sangre siguen uno al otro en dicha secuencia.

15. Un dispositivo como el reivindicado en la Reivindicación 13 o la Reivindicación 14, caracterizado porque la conexión entre el circuito de circulación del líquido con oxígeno y el circuito de circulación de sangre es una conexión entre el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno y el dispositivo de separación de plasma (68) del circuito de circulación de sangre.

16. Un procedimiento de cultivo de células vivas, comprendiendo el procedimiento la circulación de un líquido que es un portador de oxígeno y que comprende, al menos en parte, un constituyente portador de oxígeno semi-sintético o sintético, a través de una matriz (18) de un material de espuma que tiene un interior poroso en el que se anclan células vivas, formando parte la matriz de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno dispuesto para la circulación del líquido portador de oxígeno hacia el interior de un soporte (14) que contiene la matriz tridimensional (18), a través de la matriz (18) y fuera del soporte (14), absorbiendo las células oxígeno y nutrientes del líquido y absorbiendo el líquido dióxido de carbono y otros productos metabólicos de las células, estando caracterizado el procedimiento porque la matriz (18) es una masa continua unitaria o integral de un material de espuma de celdas abiertas, y la circulación del líquido portador de oxígeno a través de la matriz (18) es por perfusión del líquido portador de oxígeno a través de la matriz (18).

17. Un procedimiento como el reivindicado en la Reivindicación 16, caracterizado porque el líquido portador de oxígeno comprende un constituyente acuoso en forma de plasma sanguíneo, realizándose la perfusión del líquido a través de la matriz (18) por circulación del líquido a lo largo y alrededor de un circuito de circulación del líquido portador de oxígeno y a través de la matriz (18), e incluyendo el procedimiento la etapa de regulación de la temperatura de la matriz (18) y del líquido portador de oxígeno, para mantener la temperatura de la matriz (18) y del líquido portador de oxígeno en un intervalo de valores deseado.

18. Un procedimiento como el reivindicado en la Reivindicación 17, caracterizado porque incluye la etapa de eliminación de la bio-masa del líquido portador de oxígeno que circula a lo largo y alrededor del circuito del líquido portador de oxígeno y que elimina la bio-masa retirada a residuos.

19. Un procedimiento como el reivindicado en la Reivindicación 17 o la Reivindicación 18, caracterizado porque incluye la separación de un líquido portador de oxígeno, que circula a lo largo y alrededor del circuito del líquido portador de oxígeno, en una fase acuosa y una fase que contiene el constituyente portador de oxígeno semi-sintético o sintético, estado la fase acuosa sustancialmente libre de dichos constituyentes portadores de oxígeno, e incluyendo el procedimiento la retención de la fase que contiene el constituyente semi-sintético o sintético separado en el circuito de circulación del líquido portador de oxígeno y la alimentación de la fase acuosa separada en el interior de un circuito de circulación de sangre conectado al circuito de circulación del líquido portador de oxígeno.