ES2302612B2 - METHOD FOR THE DIAGNOSIS AND MONITORING OF THE EFFECTIVENESS OF DRY EYE TREATMENT. - Google Patents
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Abstract
Método para el diagnóstico y seguimiento de la efectividad del tratamiento del ojo seco.Method for diagnosis and monitoring of effectiveness of dry eye treatment.
La presente invención se refiere a un método de diagnóstico del ojo seco en pacientes con dicha patología y al seguimiento de la efectividad del tratamiento por medio de la concentración del dinucleótido diadenosina tetrafosfato (Ap_{4}A). Este método permite analizar las concentraciones del compuesto diadenosina tetrafosfato, Ap_{4}A, de una muestra de lagrima del paciente para determinar su presencia, que en los casos de ojo seco se encuentra anormalmente elevada. De este modo objetivamente se puede confirmar o descartar la presencia de esta patología.The present invention relates to a method of dry eye diagnosis in patients with said pathology and at monitoring of the effectiveness of the treatment through concentration of diadenosine tetraphosphate dinucleotide (Ap_ {4} A). This method allows to analyze the concentrations of the diadenosine tetraphosphate compound, Ap4A, from a sample of tear of the patient to determine its presence, which in cases Dry eye is abnormally elevated. In this way objectively you can confirm or rule out the presence of this pathology.
El método de diagnóstico de la presente invención comprende: la detección por medio de la técnica de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de la molécula Ap_{4}A, para cuyo calculo se empleará una muestra estándar del Ap_{4}A de origen comercial y concentración conocida; y la utilización un método luminométrico para la detección y cuantificación del dinucleótido Ap_{4}A, mediante el empleo de luciferin-luciferasa.The diagnostic method of this invention comprises: the detection by means of the technique of High pressure liquid chromatography (HPLC) molecule Ap_ {4} A, for whose calculation a standard sample of the Ap4A of commercial origin and known concentration; and the use a luminometric method for detection and quantification of Ap4A dinucleotide, by using Luciferin-Luciferase.
Description
Método para el diagnóstico y seguimiento de la efectividad del tratamiento del ojo seco.Method for diagnosis and monitoring of effectiveness of dry eye treatment.
La presente invención se refiere a un método de diagnóstico molecular del ojo seco en pacientes con dicha patología y al seguimiento de la efectividad del tratamiento por medio de la determinación de la concentración del dinucleótido diadenosina tetrafosfato (Ap_{4}A).The present invention relates to a method of molecular diagnosis of dry eye in patients with said pathology and to monitor the effectiveness of the treatment through the determination of the concentration of diadenosine dinucleotide tetraphosphate (Ap4A).
La película lagrimal constituye una barrera natural que separa al ojo del medio externo (Records, 1979). Esta película está formada por tres capas de diferente naturaleza, una de mucina, otra acuosa y por último una lipídica. La función de la lágrima puede establecerse en torno a tres frentes fundamentales: 1) mantener húmeda y lubricada la superficie ocular, 2) aportar elementos nutricionales a la córnea y eliminar los cuerpos extraños y restos celulares con el parpadeo y 3) constituir la primera barrera de defensa frente a las infecciones (Dilly, 1994).The tear film constitutes a barrier natural that separates the eye from the external environment (Records, 1979). This film consists of three layers of different nature, a of mucin, another watery and finally a lipid. The function of the Tear can be established around three fundamental fronts: 1) keep the ocular surface moist and lubricated, 2) provide nutritional elements to the cornea and remove foreign bodies and cell debris with blinking and 3) constitute the first defense barrier against infections (Dilly, 1994).
En condiciones normales existe un equilibrio entre la composición y la función de la película lagrimal de modo que cuando éste se ve alterado puede dar lugar a numerosas complicaciones en la superficie ocular. Estas complicaciones se conocen genéricamente como problemas de ojo seco y dependiendo del grado del desequilibrio, serán más o menos severas.Under normal conditions there is a balance between the composition and function of the tear film so that when it is altered it can lead to numerous complications on the ocular surface. These complications are generically known as dry eye problems and depending on the degree of imbalance, will be more or less severe.
Entre las causas que pueden provocar este desequilibrio podemos encontrar una deficiencia en la secreción lagrimal (de ahí el término ojo seco) que puede estar motivada, por un síndrome denominado de Sjögren o una inestabilidad de la película lagrimal debido al porte y/o deterioro de las lentes de contacto. Todas estas complicaciones muestran que los síntomas que puede tener un paciente y los signos que nos advierten de esta patología no están correlacionados. Lo que implica que podemos encontrar pacientes con un volumen de la secreción lagrimal bajo y ningún síntoma ocular y otros con un volumen lagrimal normal y los síntomas oculares característicos del ojo seco. La falta de correlación entre síntomas y signos ha sido reportada en la literatura especializada (Nichols y col., 2004; McArthy y col., 1998; Schein y col., 1997). Esta situación contradictoria, hace que existan grandes diferencias entre la etiología y patofisiología (Lemp, 1995; 1998), motivo por el cuál es difícil un diagnóstico preciso del ojo seco.Among the causes that can cause this imbalance we can find a deficiency in secretion tear (hence the term dry eye) that may be motivated by a syndrome called Sjögren or a film instability tear due to bearing and / or deterioration of contact lenses. All these complications show that the symptoms you may have a patient and the signs that warn us of this pathology not They are correlated. Which implies that we can find patients with a low volume of tear secretion and no eye symptom and others with normal tear volume and symptoms Eyepieces characteristic of dry eye. The lack of correlation between symptoms and signs has been reported in the literature specialized (Nichols et al., 2004; McArthy et al., 1998; Schein and col., 1997). This contradictory situation, makes large differences between etiology and pathophysiology (Lemp, 1995; 1998), why an accurate diagnosis of the eye is difficult dry.
Hoy en día existen numerosos cuestionarios y pruebas que muestran los síntomas que padecen los pacientes y miden los signos que presentan. Entre estas pruebas, el Dry Eye Workshop propuso el uso de un cuestionario validado de síntomas, una prueba para evaluar el daño de la superficie ocular, la medida de la inestabilidad lagrimal y la demostración de la hiperosmolaridad lagrimal, como elementos para enjuiciar esta patología.Today there are numerous questionnaires and tests that show the symptoms that patients suffer and measure the signs they present. Among these tests, the Dry Eye Workshop proposed the use of a validated symptom questionnaire, a test to assess the damage of the ocular surface, the measure of the tear instability and the demonstration of hyperosmolarity tear, as elements to prosecute this pathology.
El cuestionario de síntomas es poco reproducible, al igual que la medida de inestabilidad lagrimal, debido a la subjetividad tanto del paciente como del examinador. La evaluación del daño superficial como prueba aislada no es útil ya que no valora exclusivamente el ojo seco, y su correlación con las otras pruebas propuestas por el Dry Eye Workshop es baja.The questionnaire of symptoms is little reproducible, like the measure of tear instability, due to the subjectivity of both the patient and the examiner. The Surface damage assessment as an isolated test is no longer useful that does not exclusively value dry eye, and its correlation with Other tests proposed by the Dry Eye Workshop is low.
Para la medida de la osmolaridad lagrimal, si queremos que sea fiable y precisa, se necesita un volumen de lágrima grande, esto es difícil de obtener en pacientes con sequedad ocular sin estimular el componente reflejo de la secreción lagrimal. Este componente falsearía el valor de la osmolaridad del sujeto. Además, la medida de la osmolaridad lagrimal requiere ser realizada inmediatamente a continuación de la recogida para evitar que la lágrima se evapore y falsee los resultados. En la actualidad existen micro osmométros que pueden medir la osmolaridad con cantidades pequeñas de lágrima pero su fiabilidad y reproducibilidad son deficientes.For the measurement of tear osmolarity, if we want it to be reliable and accurate, a volume of big tear, this is difficult to obtain in patients with dry eye without stimulating the reflex component of the secretion tear This component would falsify the osmolarity value of the subject. In addition, the measure of tear osmolarity requires to be done immediately after collection to avoid Let the tear evaporate and fake the results. Nowadays there are micro osmometers that can measure osmolarity with small amounts of tear but its reliability and Reproducibility are poor.
Recientemente, el Dry Eye Workshop ha presentado los nuevos criterios que deben seguir las pruebas subjetivas y objetivas para los ensayos clínicos del ojo seco. No obstante, en el panorama actual, no dejan de aparecen nuevas pruebas invasivas y no invasivas para el diagnóstico del ojo seco. Dichas pruebas intentan identificar y analizar marcadores biológicos que permitan detectar claramente si un individuo tiene o no ojo seco (Grus y col., 2005). Pero son pruebas con poco utilidad práctica ya que los instrumentos necesarios para realizarlas son muy caros y requieren una formación muy especializada para su utilización.Recently, the Dry Eye Workshop has presented the new criteria that subjective tests must follow and objectives for clinical trials of dry eye. However, in the current scenario, new invasive tests do not stop appearing and Non-invasive for the diagnosis of dry eye. Such tests they try to identify and analyze biological markers that allow clearly detect whether or not an individual has a dry eye (Grus and col., 2005). But they are tests with little practical utility since instruments needed to perform them are very expensive and require a very specialized training for its use.
La patente US 5,884,630 describe un método de diagnóstico del ojo seco basado en los cambios de temperatura en la superficie corneal y en la velocidad de evaporación de la lágrima. El hecho de que las condiciones atmosféricas sean tan estrictas (24 grados de temperatura y 40% de humedad) para que este método sea eficaz, lo convierte en poco práctico.US Patent 5,884,630 describes a method of dry eye diagnosis based on temperature changes in the corneal surface and at the rate of evaporation of the tear. The fact that the atmospheric conditions are so strict (24 degrees of temperature and 40% humidity) so that this method is effective, makes it impractical.
Recientemente, se ha descrito la presencia de una familia nueva de compuestos en la película lagrimal (Pintor y col., 2002). Estos compuestos, los diadenosina polifosfatos, son nucleótidos naturales que presentan numerosas acciones biológicas tanto a nivel intracelular como a nivel extracelular (McLennan, 2000). Estos dinucleótidos están formados por dos moléculas del nucleósido adenosina unidas por una cadena variable de grupos fosfato, abreviados como ApnA (n = 2-7).Recently, the presence of a new family of compounds in the tear film (Painter and col., 2002). These compounds, diadenosine polyphosphates, are natural nucleotides that have numerous biological actions both intracellularly and extracellularly (McLennan, 2000). These dinucleotides are formed by two molecules of the nucleoside adenosine linked by a variable chain of groups phosphate, abbreviated as ApnA (n = 2-7).
Aunque la actividad de estos nucleótidos en tejidos oculares no se ha investigado completamente, se sabe que estos compuestos, actuando a través de los receptores P2, modulan la presión intraocular en los conejos (Pintor y col., 2002a).Otra acción de estos dinucleotidos, en este caso en la superficie ocular, es la estimulación de la secreción lagrimal, cuando los dinucleótidos Ap_{4}A, Ap_{5}A, y Ap_{6}A, son instilados de forma tópica(Pintor y col., 2002b). Por otra parte, el nucleótido uridin trifosfato, UTP y el Ap_{4}A mejoran la cicatrización de las heridas corneales superficiales en los conejos de la raza Nueva Zelanda (Pintor y col., 2004).Although the activity of these nucleotides in eye tissues have not been fully investigated, it is known that these compounds, acting through the P2 receptors, modulate intraocular pressure in rabbits (Pintor et al., 2002a) .Other action of these dinucleotides, in this case on the surface ocular, is the stimulation of tear secretion, when dinucleotides Ap 4 A, Ap 5 A, and Ap 6 A, are instilled from topical form (Pintor et al., 2002b). On the other hand, the nucleotide uridine triphosphate, UTP and Ap4A improve the scarring of superficial corneal wounds in rabbits of the New Zealand breed (Pintor et al., 2004).
No se conoce ninguna patente en la que se describa a algún dinucleótido, como el Ap_{4}A, como molécula de interés diagnóstico. Existen, sin embargo, patentes que describen el empleo de dinucleótidos para el tratamiento de diversas patologías. Así por ejemplo las patentes US 2003207825 y CN 1575181 tratan del empleo de los dinucleósidos polifosfatos para el tratamiento de procesos edematosos oculares especialmente enfocados a la retina. Por otro lado la patente US 2003207825 describe el uso de estos mismos compuestos para el tratamiento de afecciones relacionadas con las secreciones mucosas, de fluidos en general así como para procesos de agregación plaquetaria. En este mismo orden de cosas la patente US 2003036527 describe el empleo de dinucleósidos polifosfatos para la limpieza de mucosidades en el ojo, pulmones, oídos etc. Por último, la patente WO0112644 describe el empleo de dinucleósidos polifosfatos como agentes terapéuticos para el tratamiento de las infecciones con el virus VIH.No patent is known in which describe some dinucleotide, such as Ap4A, as a molecule of diagnostic interest There are, however, patents that describe the use of dinucleotides for the treatment of various pathologies For example, US patents 2003207825 and CN 1575181 they deal with the use of dinucleoside polyphosphates for treatment of specially focused ocular edematous processes to the retina On the other hand, US patent 2003207825 describes the use of these same compounds for the treatment of conditions related to mucous secretions, of fluids in general as well as for platelet aggregation processes. In this same order of things US Patent 2003036527 describes the use of polyphosphate dinucleosides for cleaning mucus in the eye, lungs, ears etc. Finally, WO0112644 describes the use of dinucleoside polyphosphates as therapeutic agents for the treatment of infections with the HIV virus.
Es, por consiguiente, de extraordinario interés encontrar una molécula estable que presente en la lágrima pueda cambiar sus concentraciones en diversas condiciones de sequedad ocular, haciendo fácil y más preciso el diagnostico, el seguimiento y la mejora de los tratamientos para el ojo seco.It is, therefore, of extraordinary interest find a stable molecule present in the tear can change their concentrations under various dry conditions eyepiece, making diagnosis and monitoring easier and more accurate and the improvement of treatments for dry eye.
La presente invención se refiere a un método de diagnóstico del ojo seco que se caracteriza por analizar una muestra para determinar la presencia del compuesto diadenosina tetrafosfato, Ap_{4}A, que en los casos de ojo seco se encuentra anormalmente elevado. De este modo objetivamente se puede confirmar o descartar la presencia de esta patología.The present invention relates to a method of dry eye diagnosis characterized by analyzing a sample to determine the presence of the diadenosine compound tetraphosphate, Ap4A, which in cases of dry eye is found abnormally high In this way objectively you can confirm or rule out the presence of this pathology.
La muestra puede obtenerse a partir de la lágrima del paciente a través de diversos métodos de extracción, entre los cuales destacamos el denominado test de Schirmer, o la extracción por medio de una pipeta o tubo capilar.The sample can be obtained from the tear of the patient through various extraction methods, among which we highlight the so-called Schirmer test, or the extraction by means of a pipette or capillary tube.
El método de diagnóstico de la presente invención comprende adicionalmente la detección por medio de la técnica de cromatografia líquida de alta presión (HPLC) de la molécula Ap_{4}A.The diagnostic method of this invention further comprises detection by means of the high pressure liquid chromatography (HPLC) technique of the Ap4A molecule.
La presente invención tiene también por objeto proporcionar un método de análisis para estudiar la evolución de los posibles tratamientos que para el ojo seco se pudiesen prescribir a los pacientes con dicha patología, basado en la determinación de los niveles del dinucleótido Ap_{4}A.The present invention also aims at provide an analysis method to study the evolution of the possible treatments that could dry the eye prescribe to patients with said pathology, based on the determination of the levels of Ap4 A dinucleotide.
Por otro lado, la presente invención, tiene como objetivo adicional proporcionar un método de análisis de compuestos para identificar aquellos que sean terapéuticamente útiles para el tratamiento del ojo seco basándose en la determinación del dinucleótido Ap_{4}A.On the other hand, the present invention has as its additional objective to provide a method of compound analysis to identify those that are therapeutically useful for dry eye treatment based on the determination of Ap 4 A dinucleotide.
Existe una dificultad manifiesta para el diagnóstico del ojo seco, ya que se dan situaciones muy diferentes como las que se han comentado con anterioridad, la presente invención demuestra que la determinación de los niveles del dinucleótido Ap_{4}A supone tener por primera vez una herramienta molecular gracias a la cuál los cambios en los niveles de esa molécula permiten conocer de forma totalmente clara la existencia o no de ojo seco. Además según sea la concentración del Ap_{4}A en la lágrima se podrá conocer el nivel de severidad de esta patología.There is a manifest difficulty for the dry eye diagnosis, since there are very different situations such as those discussed above, this invention demonstrates that the determination of the levels of Dinucleotide Ap_ {A} means having a tool for the first time molecular thanks to which the changes in the levels of that molecule allow to know in a totally clear way the existence or not dry eye. Also according to the concentration of Ap4 A in the tear can know the severity level of this pathology.
De acuerdo con el método de diagnóstico de la presente invención las pautas de análisis para conocer la existencia de ojo seco quedarían de la siguiente forma:According to the diagnostic method of the present invention the analysis guidelines to know the existence of dry eye would be as follows:
A todo paciente al que se quiera diagnosticar si tiene ojo seco se le tomará una muestra de lágrima de volumen conocido de entre 10 \muL-100 \muL por medio del test de Schirmer, pipeta o bien tubo capilar.Any patient who wants to be diagnosed if you have a dry eye, a volume tear sample will be taken known from 10 µL-100 µL by means of the Schirmer test, pipette or capillary tube.
Un volumen de inyección de 10 \muL-100 \muL de lágrima se procesa por medio de un filtro de 0.02 \mu de tamaño de poro como paso previo a la inyección en un sistema de cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Para la determinación del dinucleótido Ap_{4}A en la lágrima el sistema cromatográfico se equilibra con una fase móvil que contenga 10 mM KH_{2}PO_{4}, 2 mM tetrabutil amonio y 10-17% de acetonitrilo todo ello a pH 7,5. Alternativamente, se puede emplear otra fase móvil que contenga 0.1 M KH_{2}PO_{4}, 3-5% metanol, pH 6,5. En ambos casos la detección se llevará a cabo midiendo la absorbancia a 256-260 nm de longitud de onda. En cualquiera de las dos condiciones anteriormente descritas el compuesto diadenosina tetrafosfato es fácilmente identificable y cuantificable. Para calcular la concentración del dinucleótido Ap_{4}A en la muestra de lágrima, se empleará una muestra estándar del Ap_{4}A de origen comercial y concentración conocida.An injection volume of 10 µL-100 µL of tear is processed by means of a filter of 0.02 µ pore size as a previous step to the injection in a high pressure liquid chromatography system (HPLC). For the determination of the Ap4A dinucleotide in the tear the chromatographic system is balanced with a mobile phase containing 10 mM KH 2 PO 4, 2 mM tetrabutyl ammonium and 10-17% acetonitrile all at pH 7.5. Alternatively, another mobile phase containing 0.1 can be used M KH 2 PO 4, 3-5% methanol, pH 6.5. In both cases the detection will be carried out by measuring the absorbance at 256-260 nm wavelength. In any of the two conditions described above the diadenosine compound Tetraphosphate is easily identifiable and quantifiable. For calculate the concentration of Ap4A dinucleotide in the sample of tear, a standard sample of Ap_ {A} A of Commercial origin and known concentration.
Alternativamente, según otro aspecto de la siguiente invención, la detección y cuantificación del dinucleótido Ap_{4}A se puede realizar por un método luminométrico, tomando como en el caso anterior una muestra de 50 \muL de lágrima del paciente. Esta es calentada durante 5 min. a 100ºC, y pasado este tiempo se procede a añadir una cantidad activa de la enzima luciferín-luciferasa, permitiendo que el sistema se estabilice durante 5 min. Transcurrido este tiempo se añaden 0,3 U/mL o una cantidad que sea enzimáticamente activa, de la fosfodiesterasa de Crotalus durissus (EC 3.1.15.1) o alternativamente de la fosfodiesterasa de Crotalus adamanteus (EC 3.1.4.1). Cualquiera de estas enzimas rompen el Ap_{4}A y producen el ATP que pasa a reaccionar con la luciferín - luciferasa y como consecuencia de dicha reacción se produce luz que es captada por un equipo de medida (detector). La cantidad de luz se corresponde con la cantidad de ATP medida que, a su vez, se corresponde con la cantidad de Ap_{4}A que hay en la muestra puesto que la reacción de la fosfodiesterasa produce una molécula de ATP por molécula de Ap_{4}A. En paralelo se realizará una recta de calibrado con Ap_{4}A comercial de concentración conocida para poder cuantificar los niveles de Ap_{4}A que haya en la muestra.Alternatively, according to another aspect of the following invention, the detection and quantification of the Ap4A dinucleotide can be performed by a luminometric method, taking as in the previous case a 50 µL sample of the patient's tear. This is heated for 5 min. at 100 ° C, and after this time an active amount of the luciferin-luciferase enzyme is added, allowing the system to stabilize for 5 min. After this time, 0.3 U / mL or an amount that is enzymatically active, of Crotalus durissus phosphodiesterase (EC 3.1.15.1) or alternatively of Crotalus adamanteus phosphodiesterase (EC 3.1.4.1) are added. Any of these enzymes break the Ap4A and produce the ATP that reacts with the luciferin-luciferase and as a consequence of this reaction light is produced that is captured by a measuring device (detector). The amount of light corresponds to the amount of ATP measured which, in turn, corresponds to the amount of Ap4 A in the sample since the phosphodiesterase reaction produces one molecule of ATP per molecule of Ap_ {4} A. In parallel, a calibration line will be made with commercial Ap4A of known concentration in order to quantify the levels of Ap4A in the sample.
En el caso en el que se desee hacer un seguimiento de la posible eficacia de un tratamiento para el ojo seco, se procederá del mismo modo y simplemente se estudiará si los niveles del dinucleótido Ap_{4}A han disminuido a niveles normales durante y después del tratamiento, comparándolo con el valor patológico (valor inicial).In the case where you want to make a monitoring the possible efficacy of an eye treatment dry, proceed in the same way and simply study if levels of Ap4A dinucleotide have decreased to normal levels during and after treatment, comparing it with the value pathological (initial value).
Si lo que se desea es realizar un estudio de la búsqueda de sustancias terapéuticas para el tratamiento del ojo seco se tomará la lágrima del animal de experimentación que presente la condición de ojo seco y se procederá a aplicar el fármaco, después de lo cual se tomará una muestra de 10 \muL-100 \muL por medio del test de Schirmer, pipeta o bien tubo capilar, para ser posteriormente analizado como se ha descrito anteriormente. Las variaciones de los niveles del dinucleótido Ap_{4}A se contrastarán antes del tratamiento (situación patológica) y tras el tratamiento.If what is desired is to conduct a study of the search for therapeutic substances for the treatment of the eye dry will take the tear of the experimental animal that present the dry eye condition and proceed to apply the drug, after which a sample of 10 will be taken µL-100 µL by means of the Schirmer test, pipette or capillary tube, to be subsequently analyzed as It has been described above. Variations in the levels of Ap4A dinucleotide will be checked before treatment (pathological situation) and after treatment.
Para facilitar la comprensión de la invención y formando parte de esta memoria descriptiva se acompañan una serie de figuras:To facilitate the understanding of the invention and being part of this descriptive report are accompanied by a series of figures:
En la Figura 1 aparecen perfiles cromatográficos, con respecto al Tiempo de Retención en minutos. Aquí se pueden observar las diferencias existentes en la concentración del Ap_{4}A entre el individuo normal (registro superior "D"), con ojo seco y lagrimación normal (registro "C"), con ojo seco y lagrimación baja (registro "B"), y el estándar comercial(registro "A").Figure 1 shows profiles chromatographic, with respect to retention time in minutes. Here you can see the differences in the concentration of Ap_ {A} among the normal individual (registration upper "D"), with dry eye and normal tearing (record "C"), with dry eye and low tear (record "B"), and the commercial standard (register "A").
La Figura 2 muestra un diagrama de barras con los valores de concentración del Ap_{4}A (\muM) en individuos normales asintomáticos -volumen de lágrima normal-, en pacientes sintomáticos de ojo seco y con volumen de lagrimación normal "A" y en pacientes sintomáticos de ojo seco con volumen de lagrimación baja "B". Con La letra "C" se recogen los valores de concentración del Ap_{4}A para los sujetos sintomáticos de ojos seco "A y B".Figure 2 shows a bar chart with the concentration values of Ap_ {A} (µM) in individuals normal symptoms - normal tear volume - in patients symptomatic of dry eye and with normal tear volume "A" and in symptomatic dry eye patients with volume of low tear "B". With the letter "C" the Ap4 {A} concentration values for symptomatic subjects with dry eyes "A and B".
La Figura 3 corresponde a la recta de calibración de la medida luminométrica de Ap_{4}A donde se puede apreciar la correlación entre la cantidad de luz emitida (RLU) y la concentración del dinucleótido.Figure 3 corresponds to the line of calibration of the luminometric measurement of Ap_ {A} A where you can appreciate the correlation between the amount of light emitted (RLU) and the dinucleotide concentration
La figura 4 muestra la cuantificación de las concentraciones de Ap_{4}A (1 \muM) en pacientes normales no sintomáticos (muestras normales) y pacientes con sintomatología de ojo seco y con volumen de lagrimación bajo "A" calculadas con el empleo del método luminométrico y la recta de calibrado mostrada en la figura 3.Figure 4 shows the quantification of the Ap4A (1 µM) concentrations in normal patients not symptomatic (normal samples) and patients with symptoms of dry eye with tear volume under "A" calculated with the use of the luminometric method and the calibration line shown in figure 3.
El método de la presente invención se ilustra a continuación mediante tres ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance.The method of the present invention is illustrated by continuation by three examples, which are not limiting of its reach.
Medida de los niveles de Ap_{4}A en un paciente con ojo seco según los cuestionarios sobre síntomas y signos aparentes. El paciente poseía molestias típicas de sequedad ocular y lagrimación baja. Se tomó una muestra del volumen de lágrima del paciente (por medio del test de Schirmer) colocándole una tira de Schirmer en cada ojo y permitiendo que se impregnara de lágrima durante 5 min. Transcurrido ese tiempo se retiró la tira y se introdujo en un tubo que contenía 500 \muL de agua ultrapura. Se agitó el tubo durante 2 min. y su contenido se pasó a través de un filtro de 0.02 \mu de poro. Una vez filtrado se tomaron 25 \muL y se inyectaron en el cromatógrafo equilibrado con una fase móvil que contenía 10 mM KH_{2}PO_{4}, 2 mM tetrabutil amonio y 15% de acetonitrilo todo ello a pH 7.5. El Ap_{4}A se detectó a 260 nm de longitud de onda. La medida de dicha muestra demostró una concentración para el dinucleótido Ap_{4}A de 11.2 \pm 0.5 \muM. Este resultado es significativamente superior que el nivel normal del Ap_{4}A en la lágrima en individuos sin ojo seco que es de 0.108 \pm 0.018 \muM (Pintor y col., 2002).Measurement of Ap_ {4} A levels in a patient with dry eye according to the questionnaires about symptoms and apparent signs. The patient had typical discomforts of dryness ocular and low tear. A sample of the volume of tear of the patient (by means of the Schirmer test) by placing a strip of Schirmer in each eye and allowing it to be impregnated with tear for 5 min. After that time the strip was removed and it was introduced into a tube containing 500 µL of ultrapure water. The tube was stirred for 2 min. and its content was passed through a 0.02 µ pore filter. Once filtered, 25 were taken µL and were injected into the chromatograph balanced with a phase mobile containing 10 mM KH 2 PO 4, 2 mM tetrabutyl ammonium and 15% acetonitrile all at pH 7.5. Ap_ {A} A was detected at 260 nm wavelength. The measurement of said sample showed a concentration for Ap4A dinucleotide of 11.2 ± 0.5 µM. This result is significantly higher than the level normal of Ap_ {A} in tear in individuals without dry eye who is 0.108 ± 0.018 µM (Pintor et al., 2002).
Medida de los niveles de Ap_{4}A en un paciente con ojo seco según los cuestionarios sobre síntomas (poseía molestias) y sin signos aparentes de ojo seco al tener un volumen de lagrimación normal. Se tomó una muestra de lágrima del paciente (por medio del test de Schirmer) colocándole una tira de Schirmer en cada ojo y permitiendo que se impregnara de lágrima durante 5 min. Transcurrido ese tiempo se tomó la tira y se introdujo en un tubo que contenía 500 \muL de agua ultrapura. Se agitó el tubo durante 2 min. y su contenido se pasó a través de un filtro de 0.02 \mu de poro. Una vez filtrado se tomaron 25 \muL y se inyectaron en el cromatógrafo equilibrado con una fase móvil que contenía 10 mM KH_{2}PO_{4}, 2 mM tetrabutil amonio y 15% de acetonitrilo todo ello a pH 7.5. El Ap_{4}A se detectó a 260 nm de longitud de onda. Las medidas de dicha muestra demostró una concentración para el dinucleótido Ap_{4}A de 1.7 \pm 0.3 \muM. Este resultado es significativamente superior que el nivel normal del Ap_{4}A en la lágrima en individuos sin ojo seco que es de 0.108 \pm 0.018 \muM (Pintor y col., 2002).Measurement of Ap_ {4} A levels in a dry eye patient according to symptom questionnaires (had discomfort) and no apparent signs of dry eye having a normal tear volume. A tear sample was taken from patient (through the Schirmer test) by placing a strip of Schirmer in each eye and allowing it to be impregnated with tears for 5 min. After that time he took the strip and introduced into a tube containing 500 µL of ultrapure water. Be He stirred the tube for 2 min. and its content was passed through a 0.02 µ pore filter. Once filtered 25 µL were taken and injected into the chromatograph balanced with a mobile phase containing 10 mM KH 2 PO 4, 2 mM tetrabutyl ammonium and 15% of Acetonitrile all at pH 7.5. Ap4A was detected at 260 nm Wavelength The measurements of said sample showed a concentration for Ap4A dinucleotide of 1.7 ± 0.3 µM. This result is significantly higher than the level normal of Ap_ {A} in tear in individuals without dry eye who is 0.108 ± 0.018 µM (Pintor et al., 2002).
Medida de los niveles de Ap_{4}A en individuos asintomáticos y a pacientes con ojo seco según los cuestionarios sobre síntomas (poseía molestias) y sin signos aparentes de ojo seco al tener un volumen de lagrimación normal. Se tomó una muestra de lágrima del paciente (por medio del test de Schirmer) colocándole una tira de Schirmer en cada ojo y permitiendo que se impregnara durante 5 min. Transcurrido ese tiempo se tomó la tira y se introdujo en un tubo que contenía 500 \muL de agua ultrapura. Se agitó el tubo durante 2 min y se tomó una alícuota de 50 \muL la cual se introdujo en un baño a 100ºC durante 5 min. Transcurrido ese tiempo y una vez que la temperatura de la muestra era de 37ºC, se le añadieron 110 \muL de tampón acetato, y se añadieron 20 \muL del reactivo luciferín-luciferasa para obtener una concentración final en la muestra de 2 mg/ml, se agitó la muestra, se esperó 5 minutos y posteriormente se registró la emisión basal de luz con un sistema de detección (luminómetro). A continuación se añadió un volumen de fosfodiesterasa de Crotalus durissus (EC 3.1.15.1) o alternativamente de Crotalus adamanteus (EC 3.1.4.1) para tener una concentración final de 0.3 U/mL en la muestra. Acto seguido se midió la generación de luz como consecuencia de la hidrólisis del Ap_{4}A y la concomitante aparición del ATP. Esta medida de luz se comparó con una realizada en las mismas condiciones con concentraciones conocidas del Ap_{4}A.Measurement of Ap4A levels in asymptomatic individuals and patients with dry eye according to the questionnaires about symptoms (had discomfort) and no apparent signs of dry eye having a normal tear volume. A tear sample was taken from the patient (by means of the Schirmer test) by placing a strip of Schirmer in each eye and allowing it to be impregnated for 5 min. After that time, the strip was taken and placed in a tube containing 500 µL of ultrapure water. The tube was stirred for 2 min and a 50 µL aliquot was taken which was placed in a 100 ° C bath for 5 min. After that time and once the sample temperature was 37 ° C, 110 µL of acetate buffer was added, and 20 µL of the luciferin-luciferase reagent was added to obtain a final concentration in the sample of 2 mg / ml , the sample was stirred, waited 5 minutes and subsequently the basal emission of light was recorded with a detection system (luminometer). A volume of Crotalus durissus phosphodiesterase (EC 3.1.15.1) or alternatively Crotalus adamanteus (EC 3.1.4.1) was added to have a final concentration of 0.3 U / mL in the sample. Next, light generation was measured as a result of the hydrolysis of Ap4A and the concomitant appearance of ATP. This measurement of light was compared with that performed under the same conditions with known concentrations of Ap4A.
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