ES2301818T3 - Composiciones, procedimientos y kits para la deteccion de un antigeno sobre una celula y en una mezcla bilogica. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro de detección de la presencia de un resto que lleva un antígeno sobre una célula, comprendiendo dicho procedimiento, a) poner en contacto una célula con un bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con dicho resto que lleva un antígeno, en el que dicho bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia de dicho ácido nucleico se conoce al menos parcialmente; b) desnaturalizar dicho cualquier bacteriófago unido específicamente con dicha célula para liberar dicho ácido nucleico; y c) detectar dicho ácido nucleico, en el que la detección de dicho ácido nucleico detecta la presencia de dicho resto que lleva un antígeno sobre dicha célula, detectando de ese modo la presencia de dicho resto que lleva un antígeno sobre dicha célula.

Description

Composiciones, procedimientos y kits para la detección de un antígeno sobre una célula y en una mezcla biológica.

Antecedentes de la invención

Cada año sólo en los Estados Unidos, se realizan cientos de millones de tipificaciones de antígenos de glóbulos rojos (RBC) en unidades de sangre donadas y en los pacientes que las reciben. Además, se examinan números equivalentes de antisueros de pacientes para determinar la presencia de anticuerpos anti-RBC preexistentes, cuyas especificidades deben identificarse antes de la selección de sangre compatible. La tecnología usada en los bancos de sangre para realizar estas pruebas es esencialmente la misma que la mostrada por Landsteiner hace más de 100 años (la aglutinación de RBC por un antisuero apropiado). Los sistemas de ensayo de este tipo requieren mucha mano de obra y requieren normalmente equipos de tecnólogos médicos sumamente formados que agitan manualmente tubos de ensayo sobre espejos de aumento y evalúan los patrones de aglutinación a ojo. En consecuencia, los bancos de sangre requieren significativamente más tecnólogos de laboratorio por prueba que cualquier otro tipo de laboratorio clínico, tal como se refleja en el coste de 10 a 100 veces mayor por prueba para el laboratorio de transfusión que los de otras áreas de la medicina de laboratorio. Además, las instalaciones de donación de sangre, los bancos de sangre y los servicios de transfusión de los hospitales a lo largo del país se enfrentan a una escasez creciente de personal especializado para realizar tales pruebas debido a la falta de candidatos cualificados e interesados. Esto es particularmente preocupante dada la extraordinaria importancia de pruebas precisas previas a la transfusión y la capacidad para proporcionar componentes sanguíneos a pacientes en un plazo oportuno, a menudo de emergencia.

En contraposición a otras formas de pruebas de laboratorio tales como las de bioquímica clínica, coagulación y hematología, las pruebas de los bancos de sangre se han resistido al desarrollo de una automatización rápida, de alto rendimiento. Los procedimientos para la automatización de bancos de sangre que están disponibles actualmente requieren, en esencia, el uso de una máquina que detecta la aglutinación de glóbulos rojos, pero la aglutinación (o alguna variante de la misma) es todavía el criterio de valoración tanto como lo era hace casi 100 años. Las razones de la dificultad en el desarrollo de sistemas de determinación del grupo sanguíneo realmente automatizados son múltiples, pero en gran parte tienen que ver con la necesidad de trabajar con células intactas con el fin de detectar la presencia de moléculas polimórficas específicas sobre sus superficies. Esto es a diferencia de otras pruebas de laboratorio que simplemente cuentan números de células o miden las concentraciones de proteínas o electrolitos en plasma
solubles.

Aunque es cierto que las pruebas de citometría de flujo también detectan el fenotipo de la superficie celular, las indicaciones para tales pruebas, en general, no requieren resultados rápidos en tiempo real tales como los requeridos en la medicina transfusional, en la que el objetivo es evitar la transfusión de sangre incompatible, a menudo durante emergencias tales como traumatismos o cirugía no prevista, en las que el tiempo y la precisión son de fundamental importancia. Además, diferencias esenciales en la naturaleza de las pruebas de los bancos de sangre han descartado el desarrollo de dispositivos de prueba en el "punto de atención", tales como los disponibles actualmente para las determinaciones de glucosa o electrolitos o para el diagnóstico rápido "en el lugar de los hechos" del infarto de miocardio. El desarrollo de procedimientos de pruebas de bancos de sangre novedosos podría conducir al desarrollo de pequeños dispositivos portátiles para las pruebas previas a la transfusión que podrían facilitar las pruebas en el "punto de atención" (por ejemplo, el campo de batalla) que no son posibles usando enfoques convencionales.

Otra cuestión significativa en las pruebas de los bancos de sangre es la no disponibilidad creciente de paneles completos de reactivos inmunológicos de alta calidad para la tipificación. Los suministros de fuentes convencionales provienen de antisueros policlonales humanos clonados cuyo control de calidad es difícil y cuyo suministro está reduciéndose debido a problemas éticos crecientes referentes a la hiperinmunización deliberada de los donantes de reactivos. Debido a que las respuestas inmunitarias frente a muchos antígenos de grupo sanguíneo se montan sólo en seres humanos (que carecen del antígeno particular) y no en animales (por ejemplo, ratones, cuyos sistemas inmunitarios no pueden detectar generalmente los polimorfismos humanos sutiles frente a los que se necesita dirigir los antisueros), los esfuerzos para producir reactivos de tipificación monoclonales han requerido la capacidad de transformar células B humanas, lo que es un empeño muy ineficaz y caro. Por tanto, la disponibilidad de suministros sin límites de anticuerpos frente a RBC monoclonales bien caracterizados, análogos a los que revolucionaron la automatización de otros ensayos basados en la inmunología, tales como aquellos para la endocrinología o para detectar enfermedades infecciosas, ha sido problemática en el campo de la medicina transfusional.

Anualmente, se extraen en los Estados Unidos más de 20 millones de unidades de sangre, superando las extracciones en todo el mundo los 40 millones de unidades. Los centros de extracción de sangre (por ejemplo, la Cruz Roja americana, centros de donación hospitalarios), hospitales y otros bancos de sangre y centros de transfusión tienen todos necesidades continuas de determinar el grupo sanguíneo de forma rápida y precisa, de una manera con alto rendimiento. Los instrumentos de determinación del grupo sanguíneo pequeños, automatizados también tendrían aplicaciones en el "punto de atención" en consultas médicas tales como las de obstetras en las que es necesario determinar el tipo de Rh del paciente con el fin de administrar apropiadamente inmunoglobulina Rh(D). Se determina el grupo de cada unidad de sangre que se extrae para al menos 3 antígenos (es decir, A, B, Rh(D) y a menudo se somete a prueba la sangre para la detección de muchos antígenos más (por ejemplo, Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fy^{a}, Fy^{b}, M, N, S, s, Jk^{a}, Jk^{b} y similares).

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Tras la recepción de unidades por un banco de sangre, las normas requieren que cada unidad vuelva a someterse a prueba para A y B para garantizar el etiquetado apropiado. Cada unidad de sangre extraída se separa en glóbulos rojos, plaquetas y plasma con el fin de tratar a 3 pacientes diferentes con necesidades diferentes. Aproximadamente, se tipifican para A, B y Rh(d) (y a menudo otros antígenos) el doble de pacientes que los que reciben realmente sangre (es decir, la proporción de prueba cruzada/transfusión es de aproximadamente 2). Además, se extraen muestras de sangre cada setenta y dos horas en pacientes hospitalizados con el fin de tener muestras recientes disponibles para fines de pruebas cruzadas de modo que se determina y vuelve a determinarse muchas veces el grupo sanguíneo de muchos pacientes durante su hospitalización. Por tanto, el número de determinaciones del grupo sanguíneo realizadas en todo el mundo anualmente es de cientos de millones de pruebas.

Tal como se indicó previamente, de manera esencial todos los procedimientos para la tipificación de RBC, ya sean manuales o automatizados, usan la aglutinación como el criterio de valoración. Las desventajas de los procedimientos manuales incluyen los costes de mano de obra, bajo rendimiento y el error humano. Las desventajas de los procedimientos automatizados actuales incluyen la incapacidad de multiplexar reacciones de prueba y el rendimiento relativamente bajo en comparación con otras pruebas de laboratorio. Adicionalmente, las desventajas significativas de los procedimientos actuales tanto manuales como automatizados incluyen su dependencia de fuentes convencionales de antisueros, fuentes cuyo suministro está reduciéndose y pueden transmitir potencialmente enfermedades humanas, o los pocos anticuerpos producidos en hibridomas humanos o de ratón que son difíciles y caros de producir. La presente invención proporciona suministros sin límite de reactivos anti-RBC presentados en fago económicos que pueden usarse no sólo en una tecnología de "fenotipificación-genotipificación mediante reactivo" automatizada tal como se da a conocer en el presente documento, sino que también son compatibles con procedimientos de aglutinación manuales y automatizados convencionales que usan anticuerpo anti-M13 como agente aglutinante (es decir, "Coombs") (por ejemplo, patente estadounidense número 5.985.543, concedida a Siegel).

Huie, M.A. et al. (PNAS 98, 2001, 2682-2687) dan a conocer un procedimiento para identificar anticuerpos contra antígenos de glóbulos rojos nucleados fetales usando una biblioteca de anticuerpos en fago no inmunitarios y técnicas de huella de PCR. Pereira, S. et al. (J. Immun. Meth. 203, 1997, 11-24) describen un sistema modelo para la detección y el aislamiento de anticuerpos contra antígenos de superficie de células tumorales usando una presentación de anticuerpos en fago. Las secuencias de ácido nucleico de SEC ID NO 1-3, 5, 6 y 9 comparten homología con los números de acceso de EMBL I17331, AR037776, E39261, AX074066, AX175376 y AR063335.

En resumen, existe por tanto una necesidad profunda y largamente sentida de reactivos y procedimientos de determinación del grupo sanguíneo mejorados que permitan la automatización de tales pruebas disminuyendo de ese modo los costes, mejorando la eficacia y precisión y obviando la necesidad de dificultad actual para obtener reactivos. La presente invención satisface estas necesidades.

Breve sumario de la invención

La invención incluye un procedimiento de detección de la presencia de un resto que lleva un antígeno sobre una célula. El procedimiento comprende, a) poner en contacto una célula con un bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con el resto que lleva un antígeno, en el que el bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia del ácido nucleico se conoce al menos parcialmente; b) desnaturalizar cualquier bacteriófago unido específicamente con la célula para liberar el ácido nucleico; y c) detectar el ácido nucleico, en el que la detección del ácido nucleico detecta la presencia del resto que lleva un antígeno sobre la célula, detectando de ese modo la presencia del resto que lleva un antígeno sobre la célula.

En un aspecto, el procedimiento comprende además amplificar el ácido nucleico antes de la etapa (c).

En otro aspecto, el procedimiento comprende además lavar la célula entre la etapa (a) y la etapa (b).

Aún en otro aspecto, la célula es un glóbulo rojo y el resto que lleva un antígeno es un antígeno de glóbulo rojo.

En un aspecto adicional, el antígeno de glóbulo rojo se selecciona del grupo constituido por A, B, Rh(D), Rh(C), Rh (c), Rh(E), Rh(e), K, Fy^{a}, Fy^{b}, M, N, S, s, Jk^{a} y Jk^{b}.

En un aspecto, la célula es un glóbulo blanco y el resto que lleva un antígeno se selecciona del grupo constituido por un antígeno de linfocito, un antígeno de monocito y un antígeno de granulocito.

Aún en otro aspecto, la célula es una plaqueta y el resto que lleva un antígeno es un antígeno de plaqueta.

En un aspecto adicional, el antígeno de plaqueta se selecciona del grupo constituido por HPA-1a, HPA-1b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-6b, HPA-7b, HPA-8b, HPA-9b, HPA-10b, Gov^{a} y Gov^{b}.

En otro aspecto, el ácido nucleico comprende una secuencia complementaria a una sonda de baliza molecular ("molecular beacon probe").

En un aspecto adicional, la secuencia es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 3 y la secuencia de SEC ID NO: 4.

Aún en un aspecto adicional, la secuencia de la sonda de baliza molecular se selecciona del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 7, la secuencia de SEC ID NO: 8, la secuencia de SEC ID NO: 9 y la secuencia de SEC ID NO: 10.

En otro aspecto, la sonda de baliza molecular comprende un fluoróforo.

En un aspecto, el ácido nucleico se amplifica usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En otro aspecto, la PCR comprende usar un cebador seleccionado del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 1 y la secuencia de SEC ID NO: 2.

Aún en otro aspecto, el ácido nucleico se amplifica mediante transcripción usando inmunodetección amplificada mediante ARN de T7 (IDAT).

La invención incluye un procedimiento de detección de la presencia de al menos dos restos diferentes que llevan un antígeno sobre una célula. El procedimiento comprende: a) poner en contacto una célula con un primer bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con un primer resto que lleva un antígeno, en el que el primer bacteriófago comprende un primer ácido nucleico y en el que la secuencia del primer ácido nucleico se conoce al menos parcialmente; b) poner en contacto la célula con un segundo bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con un segundo resto que lleva un antígeno, en el que el segundo bacteriófago comprende un segundo ácido nucleico y en el que la secuencia del segundo ácido nucleico se conoce al menos parcialmente y en el que la secuencia del primer ácido nucleico es diferente de manera detectable de la secuencia del segundo ácido nucleico; c) detectar la unión del primer bacteriófago con el resto que lleva un antígeno detectando la presencia del primer ácido nucleico, en el que la detección del primer ácido nucleico detecta la presencia del primer resto que lleva un antígeno sobre la célula; d) detectar la unión del segundo bacteriófago con el resto que lleva un antígeno detectando la presencia del segundo ácido nucleico, en el que la detección del segundo ácido nucleico detecta la presencia del segundo resto que lleva un antígeno sobre la célula; detectando de ese modo la presencia de al menos dos restos diferentes que llevan un antígeno sobre la célula.

La invención también incluye un procedimiento de detección de la presencia de un anticuerpo anti-glóbulos rojos en suero humano. El procedimiento comprende: a) poner en contacto un glóbulo rojo humano que expresa al menos un antígeno de glóbulo rojo humano sobre la superficie de dicha célula con dicho suero; b) lavar la célula para eliminar cualquier anticuerpo unido de manera no específica con dicha célula; c) poner en contacto la célula con un bacteriófago que expresa un reactivo anti-globulina humana, en el que dicho bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia del ácido nucleico se conoce al menos parcialmente; d) desnaturalizar cualquier bacteriófago unido específicamente con la célula para liberar el ácido nucleico; y e) detectar el ácido nucleico, en el que la detección del ácido nucleico detecta la presencia del anticuerpo anti-glóbulos rojos en el suero.

En un aspecto, el reactivo anti-globulina humana se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo anti-IgG humana, un anticuerpo anti-IgM humana, un anticuerpo anti-cadena ligera kappa/lambda humana, una proteína A estafilocócica, una proteína G estreptocócica y una proteína L peptoestreptocócica.

En otro aspecto, el procedimiento comprende además amplificar el ácido nucleico antes de la etapa (e).

Aún en otro aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo constituido por un autoanticuerpo y un aloanticuerpo.

La invención incluye un procedimiento de detección de la presencia de un autoanticuerpo anti-glóbulos rojos en un ser humano. El procedimiento comprende: a) obtener un glóbulo rojo del ser humano, b) lavar la célula para eliminar cualquier anticuerpo unido de manera no específica con la célula, c) poner en contacto la célula con un bacteriófago que expresa un reactivo anti-globulina humana, en el que el bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia del ácido nucleico se conoce al menos parcialmente; d) desnaturalizar cualquier bacteriófago unido específicamente con la célula para liberar el ácido nucleico; y e) detectar el ácido nucleico, en el que la detección del ácido nucleico detecta la presencia del autoanticuerpo anti-glóbulos rojos en el ser humano.

En un aspecto, el procedimiento comprende además amplificar dicho ácido nucleico antes de la etapa (e).

La invención incluye un procedimiento de detección de la presencia de un ligando en una muestra: el procedimiento comprende: a) poner en contacto una célula con un bacteriófago que expresa un receptor que se sabe que se une específicamente con el ligando, en el que el bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia del ácido nucleico se conoce al menos parcialmente; b) desnaturalizar cualquier bacteriófago unido específicamente con la célula para liberar el ácido nucleico; y c) detectar el ácido nucleico, en el que la detección del ácido nucleico detecta la presencia del ligando en la muestra.

En un aspecto, el ligando está presente sobre una célula.

En otro aspecto, la muestra es una muestra biológica obtenida de un ser humano.

Aún en otro aspecto, la muestra biológica es una muestra celular.

En un aspecto adicional, la muestra celular comprende un glóbulo rojo y el ligando es un antígeno de glóbulo rojo y además el receptor es un anticuerpo.

En otro aspecto, el procedimiento comprende además amplificar el ácido nucleico antes de la detección en la etapa (c).

La solicitud da a conocer un kit para detectar la presencia de un resto que lleva un antígeno sobre una célula. El kit comprende un bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con el resto que lleva un antígeno, en el que el bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia del ácido nucleico se conoce al menos parcialmente. El kit comprende además un aplicador y material de instrucciones para el uso del kit.

En un aspecto, el resto que lleva un antígeno es un antígeno de glóbulo rojo seleccionado del grupo constituido por A, B, Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fy^{a}, Fy^{b}, M, N, S, s, Jk^{a}, y Jk^{b}.

En otro aspecto, el kit comprende además una sonda de baliza molecular en el que la secuencia de ácido nucleico de la sonda se selecciona de una secuencia complementaria a una secuencia seleccionada del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 3 y la secuencia de SEC ID NO: 4.

Aún en otro aspecto, la secuencia de la sonda de baliza molecular se selecciona del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 7, la secuencia de SEC ID NO: 8, la secuencia de SEC ID NO: 9 y la secuencia de SEC ID NO: 10.

En un aspecto adicional, el kit comprende además un cebador de PCR.

Aún en un aspecto adicional, la secuencia del cebador se selecciona del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 1 y la secuencia de SEC ID NO: 2.

Breve descripción de los dibujos

Para los fines de ilustrar la invención, se representan en los dibujos ciertas realizaciones de la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones e instrumentalidades precisas de las realizaciones representadas en los dibujos.

La figura 1 es un perfil esquemático del plan técnico que ilustra el uso de (A) anticuerpos anti-RBC presentados en fago, (B) amplificación de ADN de fago y (C) detección de ADN de fago.

La figura 2 es un diagrama de una representación esquemática de anticuerpos frente a RBC monoclonales humanos presentados en fago anti-B (parte superior) y anti-Rh(D) (parte inferior).

La figura 3 es una imagen que representa la fenotipificación de RBC para anticuerpos frente a Rh(D) y el grupo sanguíneo B en un ensayo de anticuerpos en fagos múltiplex. Se incubaron cuatro posibles fenotipos de RBC (positivo o negativo para el antígeno del grupo sanguíneo B y positivo o negativo para el antígeno Rh(D)) con anticuerpo anti-B solo, anticuerpo anti-Rh(D) solo, anticuerpo anti-B y anti-Rh(D) juntos presentados en fago, o tampón. Tras eliminar por lavado cualquier reactivo de fago no unido, se resuspendieron los RBC en anticuerpo en fago anti-M13, se retiró una alícuota de la suspensión celular, se diluyó 200 veces en agua y se sometieron a PCR 2 microlitros de fago diluido/RBC lisados. Se puso el resto de las muestras de RBC resuspendidas en anticuerpo anti-M13 en pocillos de placas de microtitulación y se sometieron a ensayo para determinar la aglutinación tal como se describe en otra parte en el presente documento (por ejemplo, Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85). Obsérvese que la aglutinación (panel superior, pocillos con sedimentos celulares reticulados grandes) se produce sólo con la combinación de anticuerpo/fenotipo celular apropiada tal como se esperaba. De la manera más notable, sólo se detectó la secuencia de anticuerpo apropiada (producto de 1600 pb con RBC que expresaban el antígeno del grupo sanguíneo B; producto de 1000 pb con RBC que expresaban el antígeno Rh(D)) y no había fondo detectable (es decir, no se detectó producto de ADN anti-B con RBC de tipo O que no expresa antígenos del grupo A o B; y no se detectó producto de ADN anti-Rh(D) usando células negativas para Rh(D)). Para la amplificación por PCR de los insertos, el cebador directo ("5-prima LC") fue el siguiente 5'-AAGACAGCTATCGCGATTG-3' (SEC ID NO: 1); y el cebador inverso ("GBACK") fue el siguiente: 5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3' (SEC ID NO: 2).

La figura 4, que comprende las figuras 4A y 4B, representa un diagrama que ilustra diversos constructos de fagémido para partículas de fago que expresan anticuerpo anti-B (figura 4A) y partículas de fago que expresan anticuerpo anti-Rh(D) (figura 4B). El diagrama ilustra la clonación de insertos de aproximadamente 140 pares de bases de tamaño (más específicamente, 142 pb) en el fagémido de anticuerpo anti-B ("B140") o en el fagémido de anticuerpo anti-Rh(D) ("D140") en sentido 3' del sitio del promotor de la ARN polimerasa de T7 de 20 pb. Los insertos de 142 pb son idénticos excepto por una región interna de 33 pb con la que hibridan balizas moleculares u oligonucleótidos microalineados específicos para B o Rh(D) ("B-Baliza/Oligo" y "D-Baliza/Oligo", respectivamente). B140 y D140 pueden amplificarse mediante PCR con un conjunto idéntico de cebadores de oligonucleótido ("PCR-F" y "PCR-R") o transcribirse usando la ARN polimerasa de T7. La secuencia del inserto "B140" es 5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT
CATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCT GCATGCACTGGATGCACTCTATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGA
TGGTCTCTTTTAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTCCCCCCACT-3' (SEC ID NO: 3) y la secuencia del inserto "D140" es 5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGCATGCACTGG
ATGCACTCTGTTTTACCTCATTA TCCTTCTGCCAGCGCTAGCTTTTAAC ATTTGCATGGCTGCTTGATGTCC
CCCCACT-3' (SEC ID NO: 4). El cebador de PCR directo ("PCR-F") es: 5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC
TCT-3' (SEC ID NO: 5) y la secuencia del cebador de PCR inverso ("PCR-R") es: 5-AGTGGGGGGACATCAAG
CAGCCATGCAAAT-3' (SEC ID NO: 6). Las secuencias de B-Baliza y D-Baliza son las siguientes, mostrando los derivados fluorescentes y las estructuras de tallo en minúsculas. La secuencia de "B-Baliza" es la siguiente: 6-FAM-gcgagcATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTCgctcgc-DABCYL (SEC ID NO: 7. La de "D-Baliza" es: TAMRA-cgagcGTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGCgctcgc-DABCYL (SEC ID NO: 8). Las letras mayúsculas en las secuencias de baliza representan las secuencias respectivas en B140 y D140 con las que se reasocian las balizas. Por tanto, las letras mayúsculas son las secuencias de los oligonucleótidos que se usan para la detección de alineamientos de ADN. Es decir, un B-oligo es: 5'-ATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC-3' (SEC ID NO: 9) y un "D-oligo" es: 5'-GTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGC-3' (SEC ID NO: 10).

Descripción detallada de la invención Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con él en esta sección.

Los artículos "un", "uno" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Por la expresión "resto que lleva un antígeno" tal como se usa en el presente documento, se quiere decir una molécula con la que se une un anticuerpo. El resto que lleva un antígeno puede ser una proteína unida a membrana que se selecciona del grupo constituido por un antígeno y un receptor. En otro aspecto, la proteína unida a membrana es un antígeno, tal como un antígeno de glóbulo rojo, tal como el antígeno Rh. Cuando el resto que lleva un antígeno es un hidrato de carbono, puede ser un hidrato de carbono expresado en un glicolípido, por ejemplo un antígeno del grupo sanguíneo P u otro antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, los aminoácidos se representan mediante el nombre completo de los mismos, mediante el código de tres letras correspondiente a los mismos o mediante el código de una letra correspondiente a los mismos, tal como se indica en la siguiente tabla:

1

2

Tal como se usa en el presente documento, "aliviar" una enfermedad significa reducir la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad.

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"Antisentido" se refiere en particular a la secuencia de ácido nucleico de la cadena no codificante de una molécula de ADN bicatenaria que codifica una proteína, o a una secuencia que es sustancialmente homóloga a la cadena no codificante. Tal como se define en el presente documento, una secuencia antisentido es complementaria a la secuencia de una molécula de ADN bicatenaria que codifica una proteína. No es necesario que la secuencia antisentido sea complementaria únicamente a la parte codificante de la cadena codificante de la molécula de ADN. La secuencia antisentido puede ser complementaria a las secuencias reguladoras especificadas en la cadena codificante de una molécula de ADN que codifica una proteína, secuencias reguladoras que controlan la expresión de las secuencias codificantes.

Los términos "bacteriófago" y "fago" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a virus que infectan bacterias. Por el uso de los términos "biblioteca de bacteriófagos" o "biblioteca de fagos" tal como se usan en el presente documento, se quiere decir una población de virus bacterianos que comprenden ADN heterólogo, es decir, ADN que no está codificado de manera natural por el virus bacteriano.

Por el término "aplicador", tal como se usa el término en el presente documento, se quiere decir cualquier dispositivo incluyendo, pero sin limitarse a, una jeringuilla hipodérmica, una pipeta y similares, para administrar el bacteriófago que expresa un receptor (por ejemplo, un reactivo antiglobulina, un anticuerpo, un anti-anticuerpo y similares), una célula, una muestra, cebadores, sonda de baliza molecular, dNTP, ARN polimerasa de T7 y similares, de la invención, a una célula, una muestra y similares.

"Muestra biológica", o simplemente "muestra" tal como se usa el término en el presente documento, significa una muestra, tal como una que se obtiene, pero no necesita obtenerse, de un animal, muestra que va a evaluarse para determinar la presencia de un organismo biológico o componente del mismo, de modo que la muestra pueda usarse para evaluar la presencia, la ausencia y/o el nivel de un antígeno o ligando de interés según los procedimientos de la invención. Tal muestra incluye, pero no se limita a, cualquier fluido biológico (por ejemplo, sangre, linfa, semen, esputo, saliva, flema, lágrimas y similares), materia fecal, una muestra de cabello, una muestra de uñas, una muestra de cerebro, una muestra de riñón, una muestra de tejido intestinal, una muestra de tejido de la lengua, una muestra de tejido cardiaco, una muestra de tejido de la glándula mamaria, una muestra de tejido pulmonar, una muestra de tejido adiposo, una muestra de tejido muscular y cualquier muestra obtenida de un animal que pueda someterse a ensayo para determinar la presencia o la ausencia de un antígeno. Además, la muestra puede comprender una muestra acuosa (por ejemplo, una muestra de agua) obtenida como sea, para evaluar la presencia de un organismo o un componente del mismo, tal como una muestra de agua potable, antes o después de cualquier tratamiento, en la que se evalúa la presencia de un organismo biológico (por ejemplo, un organismo Cryptosporidium).

Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento" según se aplica a un ácido nucleico puede tener generalmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, preferiblemente, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, más normalmente, de aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente, al menos de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, incluso más preferiblemente, al menos de aproximadamente 80 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos, incluso aún más preferiblemente, al menos de aproximadamente 90 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, incluso más preferiblemente, al menos de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos, incluso aún más preferiblemente, al menos de aproximadamente 150 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, incluso más preferiblemente, al menos de aproximadamente 200 nucleótidos a aproximadamente 250 nucleótidos, incluso aún más preferiblemente, al menos de aproximadamente 250 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, más preferiblemente, de aproximadamente 300 nucleótidos a aproximadamente 350 nucleótidos, preferiblemente, al menos de aproximadamente 350 nucleótidos a aproximadamente 360 nucleótidos; y lo más preferiblemente, el fragmento de ácido nucleico será mayor de aproximadamente 365 nucleótidos de longitud.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento" según se aplica a un polipéptido, puede tener generalmente al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente, al menos aproximadamente 30 aminoácidos, más normalmente, desde aproximadamente 40 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, preferiblemente, al menos de aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 80 aminoácidos, incluso más preferiblemente, al menos de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 90 aminoácidos, incluso aún más preferiblemente, al menos de aproximadamente 90 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, incluso más preferiblemente, al menos de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 120 aminoácidos, y lo más preferiblemente, el fragmento de aminoácidos tendrá más de aproximadamente 123 aminoácidos de longitud.

Por el término "Fab/fago" tal como se usa en el presente documento, se quiere decir una partícula de fago que expresa la parte Fab de un anticuerpo.

Por el término "scFv-fago" tal como se usa en el presente documento, se quiere decir una partícula de fago que expresa la parte FV de un anticuerpo como una cadena sencilla.

"Fago", o "partícula de fago", tal como se usan estos términos en el presente documento, incluyen los que contienen ácido nucleico de fago que codifica, entre otros, un anticuerpo. Esto se debe, tal como apreciaría el experto, a diferencia de la presentación en fago de péptidos (en la que el inserto de ADN del péptido es pequeño y se clona realmente en el ADN del fago), los insertos de ADN de scFv o Fab se clonan realmente en, entre otras cosas, un plásmido. Por tanto, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo, por ejemplo, un plásmido tal como, pero sin limitarse a, pComb3, no sólo comprende un origen de replicación de plásmido, si no también una secuencia de origen de replicación de fago (por ejemplo, M13) y una secuencia de empaquetamiento, de manera que cuando se produce el ácido nucleico, puede usarse un fago auxiliar para proporcionar las proteínas del fago requerido (por ejemplo, M13) en trans para producir partículas "similares a fago". Es decir, estas partículas se parecen al fago en el exterior, pero en el interior contienen ADN de plásmido (también denominado "fagémido"). En otras palabras, el ADN de fagémido no necesita codificar ninguna proteína del fago M13, excepto una pieza del gen III de M13 fusionada al ADN del anticuerpo o péptido. Por tanto, debe entenderse que los términos "fago", "partícula de fago", "partícula similar a fago" y "fagémido" se usan de manera intercambiable en el presente documento.

Una "enfermedad" es un estado de salud de un animal en el que el animal no puede mantener la homeostasis, y en el que si la enfermedad no se mejora, entonces la salud del animal continúa deteriorándose.

En cambio, un "trastorno" en un animal es un estado de salud en el que el animal puede mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si se deja sin tratar, un trastorno no provoca necesariamente un descenso adicional en el estado de salud del animal.

"Homólogo" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la similitud de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptido. Cuando una posición de subunidad está ocupada en las dos moléculas por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones homólogas o apareadas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias de compuestos son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas al 50%, si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, están apareadas o son homólogas, las dos secuencias comparten el 90% de homología. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN 5'ATTGCC3' y 5'TATGGC3' comparten el 50% de homología.

"Material de instrucciones", tal como se usa la expresión en el presente documento, incluye una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad del ácido nucleico, péptido y/o compuesto de la invención en el kit para detectar la presencia de un resto que lleva un antígeno sobre una célula de interés, y/o para detectar un autoanticuerpo en suero. El material de instrucciones del kit, por ejemplo, puede fijarse a un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o compuesto de la invención o expedirse junto con un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o compuesto. Como alternativa, el material de instrucciones puede expedirse por separado del recipiente con la intención de que el receptor use el material de instrucciones y el compuesto de manera cooperativa.

Un "ácido nucleico aislado" se refiere a un segmento o fragmento de ácido nucleico que se ha separado de las secuencias que lo flanquean en un estado que se produce de manera natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que son normalmente adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que se produce de manera natural. La expresión también se aplica a ácidos nucleicos que se han purificado sustancialmente de otros componentes que acompañan de manera natural al ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN o proteínas, que lo acompañan de manera natural en la célula. Por tanto, la expresión incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, como un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido mediante PCR o digestión con enzimas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias de polipéptido adicionales.

"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tienen secuencias que no se unen de manera natural entre sí. Puede incluirse un polinucleótido recombinante amplificado o ensamblado en un vector adecuado, y puede usarse el vector para transformar una célula huésped adecuada.

Un polinucleótido recombinante puede servir también para una función no codificante (por ejemplo, promotor, origen de replicación, sitio de unión a ribosomas, etc.).

Una célula huésped que comprende un polinucleótido recombinante se denomina "célula huésped recombinante". Un gen que se expresa en una célula huésped recombinante en la que el gen comprende un polinucleótido recombinante, produce un "polipéptido recombinante".

Un "polipéptido recombinante" es uno que se produce tras la expresión de un polinucleótido recombinante.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede usarse para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen en la técnica numerosos vectores incluyendo, pero sin limitarse a polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por tanto, el término "vector" incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. El término también debe interpretarse para incluir compuestos que no son plásmidos ni virus que facilitan la transferencia de ácido nucleico en las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociado, vectores retrovirales y similares.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión operativamente unidas a una secuencia de nucleótidos que va a expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; pueden suministrarse otros elementos para la expresión por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido recombinante.

Mediante la descripción de dos polinucleótidos como "operativamente unidos", se quiere decir que un resto de ácido nucleico monocatenario o bicatenario comprende los dos polinucleótidos dispuestos dentro del resto de ácido nucleico de tal manera que al menos uno de los dos polinucleótidos puede ejercer un efecto fisiológico mediante el cual se caracteriza con el otro. A modo de ejemplo, un promotor operativamente unido a la región codificante de un gen puede promover la transcripción de la región codificante.

Preferiblemente, cuando el ácido nucleico que codifica la proteína deseada comprende además una secuencia promotora/reguladora, la secuencia promotora/reguladora se ubica en el extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína deseada de modo que dirige la expresión de la proteína deseada en una célula. Juntos, el ácido nucleico que codifica la proteína deseada y su secuencia promotora/reguladora comprenden un "transgén".

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico operativamente unido a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que expresa el producto génico de una manera específica de tejido.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se une operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula humana viva en la mayoría o todas las condiciones fisiológicas de la célula.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está operativamente unida con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula humana viva sustancialmente sólo cuando está presente en la célula un inductor que corresponde al promo-
tor.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está operativamente unida con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula humana viva sustancialmente sólo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

Una "secuencia de poliadenilación" es una secuencia de polinucleótido que dirige la adición de una cola de poli A sobre una secuencia de ARN mensajero transcrita.

Un "polinucleótido" significa una única cadena o cadenas paralelas y antiparalelas de un ácido nucleico. Por tanto, un polinucleótido puede ser o bien un ácido nucleico monocatenario o bien bicatenario.

El término "ácido nucleico" se refiere normalmente a polinucleótidos grandes.

El término "oligonucleótido" se refiere normalmente a polinucleótidos cortos, generalmente, no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), ésta también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" sustituye a "T".

En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico que se producen de manera común. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citidina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

Se usa la notación convencional en el presente documento para describir secuencias de polinucleótido: el extremo a mano izquierda de una secuencia de polinucleótido monocatenario es el extremo 5'; la dirección a mano izquierda de una secuencia de polinucleótido bicatenaria se denomina dirección en 5'.

La dirección de adición de nucleótidos de 5' a 3' a trascritos de ARN nacientes se denomina dirección de transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina "cadena codificante"; las secuencias en la cadena de ADN que se ubican en 5' respecto a un punto de referencia en el ADN se denominan "secuencias en sentido 5'"; las secuencias en la cadena de ADN que están en 3' respecto a un punto de referencia en el ADN se denominan "secuencias en sentido 3'".

Una "parte" de un polinucleótido significa al menos veinte residuos de nucleótido secuenciales del polinucleótido. Se entiende que una parte de un polinucleótido puede incluir cada residuo de nucleótido del polinucleótido.

"Cebador" se refiere a un polinucleótido que puede hibridar específicamente con un molde de polinucleótido designado y que proporciona un punto de iniciación para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis se produce cuando el cebador de polinucleótido se coloca en las condiciones en las que se induce la síntesis, es decir, en presencia de nucleótidos, un molde de polinucleótido complementario y un agente para la polimerización tal como ADN polimerasa. Un cebador es normalmente monocatenario, pero puede ser bicatenario. Los cebadores son normalmente ácidos desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores que se producen de manera natural y sintéticos son útiles para muchas aplicaciones. Un cebador es complementario al molde respecto al que se diseña para que hibride para servir como un sitio para la iniciación de la síntesis, pero no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. En tal caso, la hibridación específica del cebador con el molde depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Los cebadores pueden marcarse con, por ejemplo, restos cromogénicos, radiactivos o fluorescentes y usarse como restos detectables.

"Sonda" se refiere a un polinucleótido que puede hibridar específicamente con una secuencia designada de otro polinucleótido. Una sonda hibrida específicamente con un polinucleótido complementario diana, pero no necesita reflejar la secuencia complementaria exacta del molde. En tal caso, la hibridación específica de la sonda con la diana depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden marcarse con, por ejemplo, restos cromogénicos, radiactivos o fluorescentes y usarse como restos detectables.

"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que no están unidas de manera natural entre sí. Puede incluirse un polinucleótido recombinante amplificado o ensamblado en un vector adecuado, y el vector puede usarse para transformar una célula huésped adecuada.

Un polinucleótido recombinante puede servir también para una función no codificante (por ejemplo, promotor, origen de replicación, sitio de unión a ribosomas, etc.).

Un "polipéptido recombinante" en uno que se produce tras la expresión de un polinucleótido recombinante.

"Polipéptido" se refiere a un polímero compuesto por residuos de aminoácido, variantes estructurales que se producen de manera natural relacionadas y análogos de los mismos que se producen de manera no natural sintéticos unidos mediante enlaces peptídicos, variantes estructurales que se producen de manera natural relacionadas y análogos de los mismos que se producen de manera no natural sintéticos. Pueden sintetizarse polipéptidos sintéticos, por ejemplo, usando un sintetizador polipeptídico automatizado.

El término "proteína" se refiere normalmente a polipéptidos grandes.

El término "péptido" se refiere normalmente a polipéptidos cortos.

Se usa en el presente documento la notación convencional para describir secuencias polipeptídicas: el extremo a mano izquierda de una secuencia polipeptídica es el extremo amino terminal; el extremo a mano derecha de una secuencia polipeptídica es el extremo carboxilo terminal.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "gen indicador" significa un gen cuya expresión puede detectarse usando un procedimiento conocido. A modo de ejemplo, puede usarse el gen lacZ de Escherichia coli como gen indicador en un medio debido a que puede detectarse la expresión del gen lacZ usando procedimientos conocidos añadiendo un sustrato cromogénico, por ejemplo, o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido, al medio (Gerhardt et al., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC, p. 574).

Un "receptor" es un compuesto que se une específicamente con un ligando. Este término incluye una proteína, tal como un anticuerpo, un reactivo antiglobulina y similares, que cuando se expresan mediante un fago y se ponen en contacto con su ligando análogo, se unen específicamente con el mismo.

El término "ligando", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína o proteínas que puede(n) interaccionar con un dominio de unión a receptor, teniendo así una "afinidad de unión" por tal dominio. Los ligandos pueden ser solubles o unidos a membrana, y pueden ser una proteína que se produce de manera natural, o producida de manera sintética o recombinante. El "ligando" también puede ser una molécula no proteica que actúa como ligando cuando interacciona con el dominio de unión a receptor. Las interacciones entre el ligando y el dominio de unión a receptor incluyen, pero no se limitan a, cualquier interacción covalente o no covalente. El dominio de unión a receptor es cualquier región de la molécula receptora que interacciona directa o indirectamente con el ligando.

Por la expresión "se une específicamente", tal como se usa en el presente documento, se quiere decir una molécula, por ejemplo una proteína, un ácido nucleico, un anticuerpo, un compuesto y similares, que reconoce y se une a una molécula específica, pero no reconoce o se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo que reconoce y se une a un ligando análogo (es decir, un resto que lleva un antígeno presente en una célula) en una muestra, pero no reconoce o se une sustancialmente a otras moléculas en la muestra.

"Tratar" una enfermedad tal como se usa el término en el presente documento, significa reducir la frecuencia de la enfermedad o trastorno reduciendo la frecuencia con la que se experimenta un síntoma de los uno o más síntomas de la enfermedad o el trastorno por un animal.

Descripción

La invención se refiere a procedimientos para detectar la presencia de una molécula de interés sobre una célula o en una muestra biológica. Normalmente, se detecta un antígeno de glóbulo rojo expresado sobre la superficie de un RBC, pero la invención abarca detectar la presencia de numerosos antígenos de interés en una amplia plétora de células, incluyendo, pero sin limitarse a, glóbulos rojos y blancos, así como plaquetas y células usadas para terapia de transplante, y la identificación de antígenos sobre células para fines forenses (por ejemplo, células de cabello, piel, uñas, esperma, saliva y otras células), entre otros muchos usos.

La invención también se refiere a la detección de un antígeno de interés en una muestra biológica. Una muestra de este tipo incluye una muestra acuosa para detectar la presencia de cualquier organismo, o componente del mismo, en la muestra.

La invención se refiere a usar un anticuerpo, específico para un antígeno conocido, presentado por un fago (por ejemplo, un M13, T7, lambda, eucariota y similares), para detectar la presencia del antígeno sobre una célula o en una muestra biológica. Más específicamente, se detecta el fago unido específicamente con una célula sometiendo a ensayo para detectar el ácido nucleico contenido en la partícula de fago. Es decir, la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico contenido en el fagémido es al menos parcialmente conocida, de modo que pueden usarse técnicas para detectar ácidos nucleicos para evaluar la presencia de la secuencia, detectando de ese modo, en un procedimiento novedoso denominado en el presente documento "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación", el antígeno.

Esencialmente, el ácido nucleico del bacteriófago actúa como una etiqueta para detectar un antígeno reconocido por el anticuerpo codificado por el fago. De esta forma, las propiedades de selección de alto rendimiento y alta sensibilidad de los procedimientos de detección de ácido nucleico pueden aplicarse a la detección inmunológica de un antígeno, combinando de ese modo las ventajas de ambas tecnologías. Las características cruciales de este enfoque son que la especificidad del anticuerpo presentado por el bacteriófago y la secuencia de ácido nucleico, o una parte de la misma, del ADN contenido dentro del fago, son ambas conocidas. Se entendería, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que la naturaleza precisa del antígeno, sea una proteína, un hidrato de carbono, un lípido o cualquier otro compuesto, reconocido por el anticuerpo, no necesita conocerse, sólo que se conozca la especificidad del anticuerpo para ese antígeno. Por ejemplo, cuando se sabe que un anticuerpo se une con e identifica una célula cancerígena (o cualquier célula asociada con una enfermedad), pero no se une con una célula por lo demás idéntica que no es cancerosa (o asociada con una enfermedad), el anticuerpo puede usarse para detectar un cáncer (o estado patológico) usando los procedimientos de la invención. Es decir, la unión del anticuerpo con una célula de prueba o una muestra biológica, puede detectarse detectando el ácido nucleico presente en la partícula de fago que codifica la parte de anticuerpo, detectando de ese modo una célula cancerígena, sin tener que conocer la naturaleza precisa del antígeno presente sobre la célula cancerígena (o asociada a enfermedad).

La invención se refiere además a la detección de múltiples antígenos de interés sobre una célula en un único tubo de ensayo. Es decir, puede usarse el bacteriófago que codifica anticuerpos específicos para al menos dos antígenos diferentes para detectar los antígenos sobre una célula. Más específicamente, cada fago codifica un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno conocido y cada fago codifica un anticuerpo que reconoce un antígeno diferente, o antígeno-resto. Además, cada fago contiene una molécula de ADN que comprende una secuencia que es conocida, en el que la secuencia difiere entre el fago. Usando este enfoque, puede evaluarse fácilmente la presencia de una pluralidad de antígenos de interés usando simplemente un panel de fago, que presenta cada uno un anticuerpo específico para uno de los antígenos, en el que la molécula de ácido nucleico de cada fago comprende una secuencia conocida que puede distinguirse de la de cualquier otro fago en el panel. De esta forma, pueden someterse a ensayo múltiples antígenos para usar una única etapa de reacción. Este procedimiento de "multiplexación" no es posible usando procedimientos convencionales que identifican la unión de anticuerpos específicos de antígeno a una célula ya que el anticuerpo anti-anticuerpo secundario usado para detectar los anticuerpos específicos de antígeno normalmente reaccionan de manera cruzada con todos los anticuerpos de unión a antígeno, o no puede determinarse con qué anticuerpo específico de antígeno está unido el segundo anticuerpo. En el caso de procedimientos convencionales para fenotipar glóbulos rojos, en los que los anticuerpos aglutinan directamente el tipo celular apropiado (es decir, no se necesita anticuerpo secundario), si se mezclan entre sí, asimismo no sería posible determinar qué anticuerpo específico de antígeno era responsable de la aglutinación. Este enfoque de múltiplex permite la detección simultánea rápida de una pluralidad de antígenos usando sólo una única muestra.

Además, la invención se refiere a la identificación de anticuerpos anti-glóbulos rojos en suero. Es decir, un panel de RBC, que expresan diversos antígenos conocidos en sus superficies, puede ponerse en contacto con una muestra de suero. Los RBC reactivos, que expresan antígenos caracterizados, están disponibles comercialmente (por ejemplo, Johnson & Johnson, Raritan, NJ). Entonces se lavan las células para eliminar cualquier anticuerpo que se adhiera de manera no específica a las células y entonces se ponen en contacto las células con bacteriófagos que presentan un reactivo anti-globulina.

Adicionalmente, pueden detectarse autoanticuerpos presentes en un paciente obteniendo RBC del paciente, lavándolos para eliminar cualquier anticuerpo y/o complemento que no esté unido de manera específica con las células, y entonces pueden ponerse en contacto las células con un fago que expresa un reactivo anti-globulina humana. Por tanto, detectando una secuencia de ácido nucleico contenido por el fago, puede detectarse fácilmente la presencia de autoanticuerpos sobre las células del paciente, así como la presencia de complemento depositado sobre las células debido a los autoanticuerpos, según los procedimientos de "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación" novedosos dados a conocer en el presente documento.

De manera convencional, la selección e identificación de anticuerpos séricos usando glóbulos rojos reactivos que presentan antígenos conocidos se denomina en la técnica una "prueba de antiglobulina", una prueba de este tipo es una reacción de Coombs. Estos ensayos detectan la presencia de un anticuerpo o complemento depositado por el mismo sobre una célula de interés. Debido a que el complemento, aunque no un anticuerpo, se considera una "globulina", los reactivos usados para detectar anticuerpos y/o complemento se denominan en la técnica reactivos "antiglobulina".

Estos ensayos, que detectan fragmentos de complemento y/o anticuerpo (por ejemplo, C3d) sobre glóbulos rojos del paciente para detectar autoanticuerpos anti-glóbulos rojos, o el complemento que depositan, y también para detectar aloanticuerpos del paciente, o el complemento que depositan, pueden usarse para identificar autoanticuerpos, aloanticuerpos o ambos, que podrían ser células autólogas destructoras o células transfundidas en una reacción de transfusión hemolítica.

Tal como se usa en el presente documento, un "reactivo antigobulina" es un reactivo que puede detectar anticuerpos, complemento o ambos. Por tanto, la presente invención incluye, tal como entendería un experto en la técnica provisto de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, reactivos antiglobulina que comprenden, entre otros, por ejemplo, anticuerpos anti-anticuerpo, anticuerpos anti-complemento, proteína A, proteína G o proteína L, es decir, la invención abarca la expresión mediante fagos de una amplia plétora de reactivos que el experto entendería que se unen específicamente con una globulina, tal como un anticuerpo, complemento y similares. Es decir, la presente invención incluye usar un reactivo antiglobulina expresado por un fago incluyendo, pero sin limitarse a un "anticuerpo anti-anticuerpo", un anticuerpo anti-complemento y cualquier reactivo que se sabe que se une a una globulina (por ejemplo, un anticuerpo, complemento y similares). Adicionalmente, se han descrito previamente fagos que expresan proteína A o un dominio de unión a inmunoglobulina de la misma (por ejemplo, Djojonegoro et al., 1994, Bio/Technol. 12:169-172). Puede usarse tal fago que expresa reactivo antiglobulina en los procedimientos dados a conocer en el presente documento tal como entendería un experto en la técnica provisto de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.

La invención se refiere a identificar autoanticuerpos en una muestra de suero obtenida de un paciente, o fragmentos de complemento o autoanticuerpo depositados previamente sobre células del paciente in vivo, ambos característicos de una enfermedad tal como, pero sin limitarse a anemia hemolítica autoinmunitaria. Es decir, el suero obtenido del paciente se pone en contacto con una alícuota de RBC reactivos, tal como los que están disponibles comercialmente. Los autoanticuerpos frente a RBC se unen a antígenos comunes presentes sobre esencialmente todos los glóbulos rojos, no sólo del paciente. Por tanto, el paciente no puede transfundirse con sangre de otro ser humano ya que los autoanticuerpos presentes en el suero del paciente también reaccionan con los RBC del donante. Debido a que los RBC del paciente están ya revestidos con los autoanticuerpos, pueden detectarse los autoanticuerpos ya sobre las células, porque se han unido in vivo, según los procedimientos de la invención sometiendo a ensayo las células directamente usando reactivo anti-globulina humana expresado en un fago. Como alternativa, se realiza la detección de los autoanticuerpos de la misma forma que la detección de aloanticuerpos, poniendo en contacto el suero del paciente con glóbulos rojos reactivos. En el caso de aloanticuerpos, sólo ciertos RBC reactivos se unirán a los anticuerpos, y el conocimiento del fenotipo preciso de esas células identifica la especificidad de antígeno. En el caso de autoanticuerpos, normalmente todos los glóbulos rojos reactivos se unirán a los anticuerpos debido a que los autoantígenos están presentes sobre todas las células. Entonces se detecta cualquier anticuerpo unido específicamente con los RBC según los procedimientos de la invención tales como, tal como se da a conocer más completamente en otra parte en el presente documento, poniendo en contacto las células con un fago que expresa un reactivo antiglobulina y detectando la unión del fago con las células detectando un ácido nucleico contenido por el fago, es decir, realizando "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación" según los procedimientos de la invención. De esta forma, pueden detectarse fácilmente autoanticuerpos presentes en suero humano usando los procedimientos dados a conocer en el presente documento análogos a la "prueba de antiglobulina indirecta" convencional. Además, poniendo en contacto RBC del paciente con partículas de fago que expresan antiglobulina y detectando la unión del fago con las células detectando un ácido nucleico contenido por el fago, puede detectarse la presencia de fragmentos de complemento y/o anticuerpo autólogos depositados in vivo sobre RBC del paciente. Este ensayo es análogo a la "prueba de antiglobulina directa" convencional.

Además, la invención se refiere a realizar pruebas de compatibilidad entre suero del paciente y glóbulos rojos extraídos de unidades prospectivas de sangre que van a transfundirse al paciente (es decir, "pruebas cruzadas" paciente/donante). Es decir, puede ponerse en contacto una alícuota de RBC de una unidad prospectiva de sangre de donante con una muestra de suero de un posible receptor de transfusión. Entonces se lavan las células para eliminar cualquier anticuerpo que se adhiere de manera no específica a las células y entonces se ponen en contacto las células con bacteriófagos que presentan un reactivo antiglobulina. Por tanto, la presente invención proporciona procedimientos para detectar un aloanticuerpo en un paciente que va a transfundirse permitiendo de ese modo pruebas cruzadas paciente/donante apropiadas para evitar una transfusión incompatible.

I. Procedimientos A. Procedimientos de detección de un antígeno

La invención incluye un procedimiento para detectar la presencia de un resto que lleva un antígeno sobre una célula. El procedimiento comprende poner en contacto una célula con un bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con el resto que lleva un antígeno cuando está presente sobre una célula. Tales anticuerpos presentados en fagos, así como procedimientos para su producción, se conocen bien en la técnica y se describen en, entre otros, las patentes estadounidenses número 5.876.925, número 5.985.543 y número 6.255.455, concedidas todas a Siegel. Estos bacteriófagos que presentan anticuerpos se ejemplifican en el presente documento mediante fagos que presentan anticuerpos específicos anti-Rh(D) y anti-B. Sin embargo, el experto entendería, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que la invención no se limita a estos, o cualquiera de otros anticuerpos particulares presentados en el bacteriófago específico dado a conocer en el presente documento. En su lugar, el anticuerpo presentado por el fago puede ser específico para cualquier componente celular y se conocen bien en la técnica técnicas para producir fagos que presentan anticuerpos frente a antígenos de interés, y están abarcadas en la presente invención.

Los procedimientos para producir una biblioteca de bacteriófagos que comprende ADN heterólogo se conocen bien en la técnica y se describen en el presente documento, así como también en por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente. Puede diseñarse por ingeniería genética un bacteriófago que codifica un anticuerpo deseado de modo que la proteína del anticuerpo se presente sobre la superficie del mismo de tal manera que esté disponible para la unión a su proteína de unión correspondiente, por ejemplo, el antígeno contra el que se dirige el anticuerpo. Por tanto, cuando se incuban bacteriófagos que expresan un anticuerpo específico en presencia de una célula que expresa el antígeno correspondiente, el bacteriófago se unirá a la célula. El bacteriófago que no expresa el anticuerpo no se unirá a la célula. Tales técnicas de selección se conocen bien en la técnica y se describen por ejemplo, en Wright et al (citado anteriormente).

Se han desarrollado procedimientos tales como los descritos anteriormente para la producción de anticuerpos humanos usando la presentación en el bacteriófago M13 (Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191-280). Se exponen procedimientos referentes a la producción de tales bibliotecas de presentación, y el examen de las mismas en la patente estadounidense número 6.255.455, concedida a Siegel.

Esencialmente, se genera una biblioteca de ADNc a partir de ARNm obtenido de una población de células productoras de anticuerpos. El ARNm codifica genes de inmunoglobulinas transpuestos y por tanto, el ADNc codifica los mismos. Se clona el ADNc amplificado en vectores de expresión M13 (o fagémidos con señales de empaquetamiento de M13) creando una biblioteca de fagos que expresan fragmentos Fab (o scFv) humanos sobre su superficie. Se seleccionan los fagos que presentan el anticuerpo de interés mediante la unión a antígeno y se propagan en bacterias para producir inmunoglobulina Fab (o scFv) humana soluble. Por tanto, a diferencia de la síntesis de anticuerpos monoclonales convencional, este procedimiento inmortaliza el ADN que codifica inmunoglobulina humana en lugar de células que expresan inmunoglobulina humana.

Aunque los bacteriófagos que presentan anticuerpos de interés en el presente documento se ejemplifican mediante el fago M13, la presente invención no se limita a éste o cualquier otro vector que presenta un anticuerpo. En su lugar, el experto en la técnica apreciará, provisto de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que puede usarse cualquier vector que pueda presentar un anticuerpo, en el que el vector comprende un ácido nucleico cuya secuencia es al menos parcialmente conocida, en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. Por tanto, aunque los bacteriófagos que presentan anticuerpos dados a conocer en el presente documento se ejemplifican mediante M13, también pueden ser útiles en el procedimiento de la invención otros bacteriófagos, tales como el fago lambda o el fago T7. Se han generado bibliotecas de presentación en fago lambda que presentan péptidos codificados por ADN heterólogo sobre su superficie (Sternberg et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1609-1613) al igual que bibliotecas de presentación en fago T7 (Hansen et al., 2001, Int. J. Oncol. 19:1303-1309).

Además, se contempla que el procedimiento de la invención pueda extenderse para incluir virus diferentes de bacteriófagos, tales como virus eucariotas. De hecho, pueden generarse virus eucariotas que codifican genes adecuados para su administración a un mamífero y que codifican y presentan un anticuerpo que puede seleccionar como diana un tipo celular o tejido específico en el que va a administrarse el gen. Por ejemplo, se han generado vectores retrovirales que presentan fragmentos de anticuerpo funcionales (Russell et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21:1081-1085). Pueden usarse estos y cualquier otro vector que expresen un anticuerpo en los procedimientos de la invención y están abarcados por la misma.

Además, aunque el procedimiento de la invención tal como se ejemplifica en el presente documento describe el uso de un fago que codifica la parte Fab o una parte scFv de una molécula de anticuerpo, el procedimiento no debe interpretarse como limitado únicamente al uso de fagos que codifican anticuerpos Fab o scFv. Las moléculas de Fab comprenden la cadena ligera de Ig completa, es decir, comprenden tanto la región variable como la constante de la cadena ligera, pero incluyen sólo la región variable y el primer dominio de región constante (CH1) de la cadena pesada. Las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla comprenden una cadena sencilla de proteína que comprende el fragmento Fv de Ig. Un fragmento Fv de Ig incluye sólo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, sin tener la región constante contenida en el mismo. Pueden generarse bibliotecas de fagos que comprenden ADN de scFV siguiendo los procedimientos descritos en Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597. Se realiza la selección de fagos así generados para el aislamiento de un anticuerpo deseado tal como se describe en el presente documento para las bibliotecas de fagos que comprenden ADN de Fab.

La invención también debe interpretarse como que incluye bibliotecas de presentación en fagos sintéticas en las que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden sintetizarse de modo que incluyan casi todas las especificidades posibles. Por tanto, las bibliotecas que presentan anticuerpos pueden ser "naturales" o "sintéticas" (Barbas, 1995, Nature Medicine 1:837-839; de Kruif et al., 1995, J. Mol Biol. 248:97-105). Se generan bibliotecas que presentan anticuerpos que comprenden anticuerpos "naturales" tal como se describe en, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.876.925, concedida a Siegel. Se generan bibliotecas que presentan anticuerpos que comprenden anticuerpos "sintéticos" siguiendo el procedimiento descrito en Barbas (1995, citado anteriormente) y las referencias citadas en el mismo.

El experto apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que los anticuerpos frente a glóbulos rojos frente a los que pueden generarse anticuerpos usando procedimientos conocidos y que entonces pueden usarse en el procedimiento de la invención incluyen, pero sin limitarse a, antígenos Rh, incluyendo Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e) y otros antígenos que no son Rh, incluyendo antígenos de glóbulos rojos en los grupos sanguíneos Kell, Duffy, Lutheran y Kidd.

Por tanto, el procedimiento de la invención puede usarse para la detección de cualquier antígeno de RBC u otro antígeno celular, tal como, pero sin limitarse a antígenos específicos de tumor, antígenos bacterianos y similares. El procedimiento de la invención también es útil para tipificar plaquetas generando anticuerpos en fagos específicos para varios antígenos de plaquetas clínicamente importantes, particularmente, HPA-1a/1b, HPA-2a/2b, HPA-3a/3b y similares.

La invención es además útil para tipificar glóbulos blancos de donante para antígenos HLA para los fines de compatibilizar donantes y receptores para determinar la compatibilización del posible transplante en el caso de transplantes de órganos o tejidos tanto sólidos (por ejemplo, riñón, corazón, hígado, pulmón) como no sólidos (por ejemplo, médula ósea).

Además, los procedimientos de la presente invención pueden usarse para fines forenses, para detectar cualquier antígeno de interés en una muestra, en los que la muestra puede ser, pero sin limitarse a hueso, cabello, piel, semen, saliva o cualquier otra muestra que puede obtenerse de un organismo o muestra biológica. La única característica requerida es que la muestra contenga un antígeno que pueda reconocerse específicamente por un anticuerpo expresado por un bacteriófago, u otro vector que presente anticuerpos. Por tanto, la presente invención no se limita en ningún modo a la detección de ningún antígeno particular; en su lugar, la invención abarca detectar una amplia plétora de antígenos de interés usando los procedimientos de detección por "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación" novedosos dados a conocer en el presente documento.

Por tanto, la invención abarca la detección de un antígeno de interés sobre un glóbulo rojo, denominada en el presente documento "fenotipificación", detectando la unión de un fago que expresa un anticuerpo frente a glóbulos rojos, en la que el fago se detecta detectando una secuencia conocida presente en el ácido nucleico contenido por la partícula de fago, lo que se denomina en el presente documento "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación". Además, la invención incluye examinar sueros de pacientes para seleccionar anticuerpos anti-glóbulos rojos usando partículas de fago que presentan anticuerpos anti-IgG humana (o anticuerpos anti-IgM o anticuerpos anti-cadena ligera kappa/lambda que recogerían cualquier isotipo de Ig). De nuevo, se detecta el fago unido con los RBC detectando una secuencia de ácido nucleico presente en el ácido nucleico contenido por el fago.

Adicionalmente, la invención abarca el uso del procedimiento de fenotipificación mediante reactivo-genotipificación en un ensayo inmunitario, tanto si el antígeno que se está detectando está sobre una célula como si no (por ejemplo, antígenos tales como, pero sin limitarse a cualquiera medido para fines clínicos o de investigación desde una citocina hasta HCG para una prueba de embarazo). Es decir, la presente invención combina la especificidad conferida por las inmunoglobulinas para una sustancia dada, especificidad que tiene en cuenta cualquier modificación postraduccional (por ejemplo, fosforilación, glicosilación y similares), con la sensibilidad conferida por los procedimientos de detección de ácido nucleico, así como la capacidad de realizar ensayos múltiplex. Es decir, se aplicaría una muestra que está sometiéndose a ensayo de modo que sus componentes se fijaran a un soporte sólido, tal como el revestimiento del pocillo de una placa para un ELISA, filtro de nitrocelulosa, perla o cualquier otro soporte sólido, y el fago que expresa una proteína que se une específicamente con un ligando análogo puede dejarse unir con los componente fijados al soporte sólido. Cualquier fago específicamente unido a un ligando análogo puede detectarse detectando una secuencia de ácido nucleico conocida especificada por el ácido nucleico contenido dentro del fago. Por tanto, puede detectarse la presencia de cualquier ligando de interés usando el procedimiento de "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación" dado a conocer en el presente documento incluso cuando la muestra que está sometiéndose a ensayo no comprende una célula.

Además, el experto apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que la invención abarca la fenotipificación de otras células sanguíneas (por ejemplo, plaquetas, glóbulos blancos y similares) y la detección de anticuerpos frente a esas células en la sangre (por ejemplo, auto-anticuerpos o aloanticuerpos anti-plaquetas, anticuerpos anti-HLA, etc.), de modo que la presente invención no se limita a los glóbulos rojos. De hecho, la invención no se limita a las células sanguíneas en absoluto, sino que puede usarse para detectar cualquier molécula de interés presente sobre cualquier clase de célula. Por tanto, un experto en la técnica apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que la presente invención incluye, pero no se limita a la detección de una molécula de interés sobre una célula en la que se usaría por lo demás citometría de flujo de modo que la amplia plétora de anticuerpos ahora disponible (por ejemplo, cientos de anticuerpos anti-CD, tales como anti-CD4 o CD-8 para células T auxiliares/supresoras, anti-CD20 para células B y similares) puede expresarse en un fago y usarse para detectar, según los procedimientos novedosos dados a conocer en otra parte en el presente documento, si el antígeno está presente en una célula. La presente invención incluye el uso de anticuerpos que van a desarrollarse en el futuro frente a antígenos de interés a medida que éstos se desarrollen y usen según los procedimientos dados a conocer en el presente documento.

El experto apreciaría, basándose en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que la detección de cualquier molécula de interés, por ejemplo, con respecto a la aplicación forense de los procedimientos dados a conocer en el presente documento, proporciona una ventaja importante sobre los presentes procedimientos porque muchos antígenos importantes para identificar el origen de fluidos (sangre o sustancias solubles en saliva y similares) son hidratos de carbono (como los antígenos A y B). El uso de pruebas genéticas sobre la mancha minúscula para el ADN no puede amplificar el ADN que codifica hidratos de carbono debido a que el ADN no codifica hidratos de carbono que son productos de la modificación postraduccional de proteínas. Los procedimientos de la técnica anterior referentes a la detección de hidratos de carbono se limitan a la detección de ADN para las enzimas (por ejemplo, las glicosiltransferasas) que son responsables del ensamblaje de restos de azúcar sobre la proteína o lípido. El problema de los ensayos de detección convencionales es que la expresión última de un azúcar particular es el resultado de la herencia de varias enzimas que actúan en una secuencia precisa para ensamblar las cadenas de modo que necesitarían detectarse los genes para todas las enzimas con el fin de identificar la identidad de la persona de la que se derivó la muestra. Por ejemplo, con el fin de que un individuo sea del grupo sanguíneo A, se requiere la enzima que añade N-acetilgalactosamina sobre su azúcar precursor, dado que es la enzima (una fucosil transferasa) para ensamblar el azúcar precursor. Otros hidratos de carbono (como P) son incluso más complicados en sus estructuras y ensamblaje. Si la muestra comprende una mezcla de secreciones en una mancha de diferentes individuos, las pruebas de ADN recogerían todas las enzimas y la prueba no podría distinguir si una persona tenía todas las enzimas y podría preparar un antígeno de azúcar particular o si la muestra comprendía ADN de diversas personas que podrían producir cada uno sólo los diversos componentes de azúcar. A diferencia de las pruebas basadas en ácido nucleico convencionales, la presente invención proporciona la ventaja de combinar la especificidad exquisita de un anticuerpo que puede reconocer una estructura compleja, tal como un glucano, y la capacidad de detectar cantidades minúsculas de un ácido nucleico; por tanto, la detección del ácido nucleico contenido por el fago, combinada con la especificidad de un anticuerpo, proporciona un ensayo novedoso con las extraordinarias sensibilidad y especificidad requeridas en usos
forenses.

Un experto en la técnica, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, entendería que aunque el término "fenotipificación" se usa generalmente en la técnica para detectar una característica mostrada por una célula o un organismo, el término, tal como se usa en el presente documento con respecto a "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación", se refiere a la identificación de cualquier antígeno de interés, tanto si el antígeno está asociado o no con una célula, mediante la detección de una secuencia de ácido nucleico. Por tanto, por ejemplo, la identificación de un fármaco en una mancha seca sobre una puerta de un coche usando un anticuerpo anti-fármaco presentado en fago según los procedimientos de la invención, sería "fenotipificación" tal como se usa el término en el presente documento. Por tanto, los procedimientos de la invención, en los que un anticuerpo expresado por un fago se une con un antígeno análogo y el antígeno se detecta sometiendo a ensayo para detectar una secuencia de ácido nucleico presente en el ADN de fago, es "fenotipificación" tal como se usa en el presente documento.

De hecho, el experto, provisto de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, se daría cuenta de que la presente invención no se limita a la detección de un "antígeno" usando el anticuerpo presentado en fagos (anticuerpo que se detecta luego detectando una secuencia de ácido nucleico codificada por el ADN de fago). En su lugar, la presente invención abarca el uso una proteína que no es un anticuerpo expresada por un fago, proteína que se une específicamente con un ligando análogo presente sobre una célula, en una muestra o ambos. Se conocen bien en la técnica muchos de tales pares de unión y se han identificado usando una amplia variedad de ensayos, incluyendo ensayos de unión de dos y tres híbridos de levadura, entre una amplia plétora de otros ensayos. Por tanto, cuando se conoce un par de unión en la técnica, puede expresarse una de las dos moléculas por el fago (la proteína del par de unión expresada por el fago se denomina en el presente documento "receptor") y puede detectarse la presencia del otro miembro del par de unión (denominado "ligando" o "diana") detectando una secuencia de ácido nucleico contenido por el fago que expresa la proteína receptora. El ligando que va a detectarse mediante su pareja de unión/receptor análogo expresado por el fago puede incluir, pero no se limita a, una hormona, o una parte de una hormona en la que la parte puede unirse con el receptor presentado por el fago. Además, los procedimientos de la presente invención pueden usarse para, entre otros, medir la expresión de un receptor de hormonas sobre una célula evaluando la cantidad de un fago que presente la hormona, o una parte de la misma, que se une con la célula que está sometiéndose a ensayo. El fago unido específicamente con la célula debido a la interacción receptor/ligando (receptor de hormona/hormona expresada por el fago, respectivamente) puede detectarse detectando una secuencia de ácido nucleico presente en el ácido nucleico contenido por el fago tal como se da a conocer más completamente en otra parte en el presente documento.

Un experto en la técnica entendería, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que la presente invención abarca la detección de una molécula de interés que no está asociada con una célula. Es decir, la presente invención incluye ensayos para determinar la presencia de una molécula de interés en cualquier muestra en los que la muestra puede aplicarse a un soporte sólido de modo que la molécula de interés puede inmovilizarse. Entonces puede ponerse en contacto un fago que expresa un receptor que se sabe que se une específicamente con esa molécula (denominada en el presente documento una molécula "ligando" o "diana") con la muestra inmovilizada y puede detectarse la unión de cualquier fago sometiendo a ensayo para determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico contenido por el fago tal como se describe más completamente en otra parte en el presente documento. De esta forma, la presente invención puede usarse para detectar una molécula de interés (ligando) presente en cualquier muestra usando los procedimientos de "fenotipificación mediante reactivo-tipificación" dados a conocer en el presente documento.

El experto también apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que un fago puede expresar fácilmente un péptido que se sabe que detecta células cancerígenas pero en el que no se sabe con qué componente se une el péptido sobre la célula cancerígena. Por tanto, puede usarse la proteína que se sabe que se une a células cancerígenas para detectar una célula cancerígena incluso aunque no se sepa la identidad del ligando/pareja de unión que se une con la proteína, detectando el fago unido mediante la detección de una secuencia de ácido nucleico contenido por el fago, todo tal como se describe más completamente en otra parte en el presente documento.

Adicionalmente, cuando se usa el fago para detectar la unión de anticuerpos séricos a un glóbulo rojo reactivo, el fago puede expresar la proteína A de estafilococos, o una parte de la misma, en lugar de anticuerpo anti-IgG, para detectar inmunoglobulinas unidas con los RBC. Por tanto, el experto apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que puede expresarse una amplia plétora de moléculas por el fago para detectar una pareja de unión análoga sobre una célula, en un tejido o muestra acuosa y similares, y la presente invención no se limita en modo alguno a fagos que expresan un anticuerpo, o a la detección de un antígeno sobre una célula, tal como se ejemplifica en otra parte en el presente documento. Es decir, una vez que se conoce un par de unión, el experto, provisto de la descripción proporcionada en el presente documento, podría detectar fácilmente uno del par de unión usando los procedimientos de la invención, es decir, expresando un miembro del par de unión en un fago y poniendo el contacto el fago con una muestra, detectando luego cualquier fago unido específicamente con la muestra detectando una secuencia de ácido nucleico codificada por el ácido nucleico del fago. Esto permite la detección rápida y sensible de una molécula de interés, o diversas moléculas de interés cuando se usa la multiplexación, cuando la molécula no es un ácido nucleico, detectando un ácido nucleico.

Las condiciones específicas en las que se permite que el anticuerpo o receptor presentado por el bacteriófago se una específicamente con un antígeno o ligando de interés dependerán del complejo antígeno-anticuerpo y/o receptor-ligando específico implicado en la reacción. El experto entendería, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que tales condiciones pueden determinarse fácilmente para cada antígeno/par de unión que está detectándose y el anticuerpo/receptor que está usándose para hacerlo, tal como se ejemplifica en el presente documento para la detección de antígenos Rh(D) y B sobre glóbulos rojos intactos usando fagos que expresan anticuerpos específicos para estos antígenos. Estas técnicas para determinar las condiciones de unión se practican de manera rutinaria en la técnica, y por tanto no se describen adicionalmente en el presente documento.

Una vez que el bacteriófago que expresa el anticuerpo (o receptor) está unido específicamente con la célula o ligando en una muestra, mediante la interacción entre el resto que lleva un antígeno sobre una molécula de interés presente sobre la célula (ligando) y el anticuerpo expresado por el fago (receptor), se detecta la presencia del fago unido detectando el ácido nucleico contenido en la partícula de bacteriófago. Para el fago M13 ejemplificado en el presente documento, el ácido nucleico es una molécula de ADN monocatenario, pero la presente invención no se limita a ningún ácido nucleico particular; en su lugar, puede detectarse cualquier ácido nucleico usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, tal como se describe en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; y Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York), algunas de las cuales se dan a conocer en el presente documento, así como técnicas que van a desarrollarse en el futuro, y todas estas técnicas se abarcan en la invención.

La presente invención también abarca la amplificación del ácido nucleico para ayudar en su detección. Sin embargo, la presente invención no se limita a procedimientos que requieren la amplificación del ácido nucleico. En su lugar, el experto, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, apreciaría que se abarcan en la presente invención procedimientos de detección que no requieren amplificación del ácido nucleico. Tales procedimientos de detección incluyen, pero no se limitan a, la detección de un ácido nucleico transferido directamente a un chip en el que un oligonucleótido marcado de manera fluorescente (o enzimática) complementario a la secuencia del fago/fagémido puede detectar el ácido nucleico no amplificado. Por tanto, mientras que la figura 1 es ilustrativa de las diversas técnicas que pueden usarse para detectar la secuencia de ácido nucleico de interés, la invención no se limita a procedimientos que requieren amplificación antes de la detección de la secuencia. Por tanto, se prefieren la PCR, IDAT u otras reacciones de amplificación, pero no se requieren, para poner en práctica la
invención.

El experto entendería, una vez provisto de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que, tal como se ejemplifica en el presente documento, el ácido nucleico puede amplificarse usando ensayos de reacción en cadena de la polimerasa convencionales. Es decir, puede desarrollarse un conjunto de secuencias de cebador basándose en la secuencia conocida del ácido nucleico contenido por el bacteriófago. Tal como se trata en otra parte en el presente documento, los cebadores pueden ser específicos para cualquier parte del ácido nucleico, o bien la secuencia única comprendida en la parte del ácido nucleico que codifica la parte CDR3 del anticuerpo, o bien cualquier otra secuencia presente en el ácido nucleico. Por tanto, un cebador puede ser complementario a una secuencia genérica contenida en el ADN de fago (independientemente de la especificidad del anticuerpo) y el otro cebador puede ser complementario a, por ejemplo, una secuencia específica para ese fago, tal como, pero sin limitarse a, la región hipervariable CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo (es decir, la secuencia que es única para un anticuerpo dado).

La detección del ácido nucleico amplificado indica la presencia del antígeno reconocido por el anticuerpo específico codificado por el bacteriófago. La producción de cebadores de PCR y sondas que hibridan con la secuencia amplificada mediante la PCR se conocen bien en la técnica, y estos procedimientos se describen en, entre otros, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

Adicionalmente, el experto apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que pueden insertarse secuencias en el ácido nucleico que codifica el anticuerpo expresado por el bacteriófago, secuencia insertada que luego puede detectarse usando diversos ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, tal como se trata en otra parte en el presente documento, las "balizas moleculares", o tal como se usa en el presente documento, "balizas" o "secuencias de baliza", son oligonucleótidos con estructura de tallo y bucle con un marcador fluorescente en el extremo 5' y un extintor universal en el extremo 3' (véase, por ejemplo, Tyagi y Kramer, 1996, Nature Biotech. 14:303-308; Broude, 2002, Trends in Biotechnology 20:249-256). Cuando el tallo está cerrado (en ausencia de ácido nucleico complementario), el fluoróforo y el extintor están en proximidad estrecha y el extintor absorbe energía fluorescente y se extingue la fluorescencia y no puede detectarse. En presencia de ácido nucleico complementario, el bucle de la baliza hibrida y el fluoróforo y el extintor se separan de modo que no se produce extinción. Entonces se emiten fotones del fluoróforo, no extinguidos, a la longitud de onda específica para ese fluoróforo y entonces puede detectarse la fluorescencia. Combinado varias balizas en un tubo, cada una con un fluoróforo diferente en sus extremos 5', pueden detectarse simultáneamente múltiples ADN (Tyagi et al, 1998, Nature Biotech. 16:49-53) o ARN (de Baar et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39:1895-1902) midiendo el espectro de colores emitidos a partir del vaso de reacción.

Pueden incorporarse balizas moleculares de dos o más colores diferentes en una reacción de PCR y/o transcripción (por ejemplo, IDAT) para detectar la presencia de ADN específico de anticuerpo. Tal como se describe en otra parte en el presente documento, el ácido nucleico de cada bacteriófago, que codifica un anticuerpo específico para un antígeno de interés, puede modificarse para insertar una única secuencia de baliza y cada sonda de baliza molecular puede conjugarse con un único par de extintor/fluoróforo de modo que cada baliza, cuando está unida con su secuencia complementaria, fluorescerá a una única frecuencia. De esta forma, puede usarse cada baliza para detectar un anticuerpo que se une con un antígeno de modo que la reacción "múltiplex" puede proporcionar resultados que muestran qué antígenos están presentes sobre una célula que está examinándose evaluando qué fluoróforos están presentes en la muestra. El diseño y la producción de tales secuencias "baliza", y secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias complementarias a las mismas, se conocen bien en la técnica.

Provisto de la descripción proporcionada en el presente documento, el experto entendería que la presente invención no está limitada en el número de moléculas de interés que pueden detectarse en una única reacción múltiplex. Es decir, el diseño de secuencias únicas que pueden detectarse y distinguirse entre sí en una única reacción se conoce bien en la técnica. Además, un experto en la técnica apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que pueden usarse en los procedimientos de la presente invención tal como se ejemplifica en el presente documento diversas tecnologías, tales como, pero sin limitarse a series de microchips, inmunotransferencias de manchas, uso de sondas de baliza y otros ensayos de alto rendimiento que permiten el procesamiento de muchas muestras y que proporcionan la capacidad de realizar ensayos múltiplex, tal como se conoce en la técnica, o usando técnicas que van a desarrollarse en el futuro, cuyo uso puede contemplarse fácilmente basándose en la descripción proporcionada en el presente documento. Es decir, la tecnología de chips actual proporciona ya que el número de antígenos que pueden someterse a ensayo sobre un único chip supere el número de antígenos de glóbulos rojos conocidos. Además, cuando los parámetros de ciclación de diversas reacciones de PCR son compatibles, puede usarse un único tubo que comprende numerosos pares de cebadores para multiplexar las reacciones de PCR. Por tanto, la multiplexación de las reacciones referentes a los procedimientos de la invención parecería que estuviese limitada sólo por el número de manchas sobre los chips, dado que la unión del fago a células, el número de cebadores que pueden usarse para realizar la PCR en un único tubo y similares no limitan el número de moléculas que pueden someterse a ensayo para usar los procedimientos de la invención.

El experto entendería, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que la invención abarca la amplificación del ácido nucleico de interés (es decir, el ácido nucleico contenido por el bacteriófago que expresa el anticuerpo frente a un resto que lleva un antígeno de interés que se une a la célula mediante la unión específica del anticuerpo con su antígeno análogo) usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, así como procedimientos que van a desarrollarse en el futuro. La amplificación por PCR se trató previamente en el presente documento, y se ejemplifica en otra parte en el presente documento, como IDAT, que es la amplificación del ácido nucleico usando un procedimiento basado en la transcripción. Sin embargo, estos son procedimientos de amplificación a modo de ejemplo sólo, y la presente invención no está en modo alguno limitada a éstos o cualquier otro procedimiento para amplificar el ácido nucleico contenido por el fago de interés.

La invención también abarca la detección del ácido nucleico una vez que se ha amplificado. Un experto en la técnica apreciaría, una vez provisto de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que puede usarse cualquier procedimiento para la detección de un ácido nucleico conocido en la técnica, o que va a desarrollarse en el futuro, para detectar el ácido nucleico en el procedimiento de la invención. Tales procedimientos de detección incluyen, pero no se limitan a PCR en tiempo real usando sondas fluorescentes, detección de amplicones del tamaño pronosticado usando técnicas de separación por tamaño (por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa), técnicas de transferencia de tipo Southern y Northern, hibridación con microalineamientos de oligonucleótidos y el uso de sondas de "baliza moleculares", tratados más completamente en otra parte en el presente documento. Además, tal como se da a conocer más completamente en otra parte en el presente documento, se contemplan técnicas para automatizar, acelerar o mejorar de otra manera la detección de la secuencia de ácido nucleico de interés. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a "hibridación acelerada por campo eléctrico con microalineamientos de oligonucleótido" (Su et al., 2002, Electrophoresis 23: 1551-1557), que proporciona resultados rápidos, por ejemplo, el tiempo de aplicación del ADN (o ARN) a la lectura es inferior a aproximadamente 10 minutos. Por tanto, se abarcan en la invención técnicas para mejorar la eficacia de la etapa de detección tal como entendería el experto.

B. Detección de múltiples antígenos

La presente invención abarca un procedimiento para detectar la presencia de al menos dos restos diferentes que llevan antígeno en una célula. El procedimiento comprende poner en contacto al menos dos bacteriófagos diferentes, que codifican y expresan cada uno un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, en el que los dos anticuerpos no se unen al mismo antígeno. Cualquier fago que no esté unido específicamente con la célula se elimina (por ejemplo, lavando la célula) y se detecta la presencia de cualquier bacteriófago unido detectando el ácido nucleico presente en el fago. Es decir, tal como se describe más completamente en otra parte en el presente documento, se expone la secuencia, o una parte de la misma, del ácido nucleico presente en la partícula de fago y se detecta la presencia del ácido nucleico (es decir, la presencia de su secuencia de ácido nucleico conocida) usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Debido a que cada bacteriófago comprende una secuencia de ácido nucleico que puede distinguirse de las presentes en otros bacteriófagos presentes en la misma muestra, puede detectarse la presencia de diversos antígenos en una única mezcla de muestra. Tales ensayos "múltiplex" no son posibles usando procedimientos de detección basados en anticuerpos, dado que los reactivos usados para detectar la presencia de anticuerpos unidos con la célula no pueden distinguirse fácilmente entre cada anticuerpo. Además, la determinación del grupo sanguíneo convencional no usa reactivos que detecten la presencia de anticuerpos unidos con la célula dado que muchos reactivos de determinación del grupo sanguíneo, normalmente IgM decavalentes, aglutinan directamente las células. En esos ensayos, en los que no se puede multiplexar la reacción no sería posible determinar qué reactivo provocó la aglutinación. Sin embargo, los procedimientos basados en la detección de secuencias de ácido nucleico múltiples, únicas, hacen posible los ensayos para diversos antígenos, detectando las secuencias de ácido nucleico presentes dentro de las partículas de fago unidas a/ligadas con esos antígenos mediante una molécula de anticuerpo expresada por el fago, tal como se demuestra en el presente documento.

Un experto en la técnica apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que los diversos bacteriófagos, que presentan cada uno un anticuerpo diferente que reconoce un antígeno distinto de los antígenos reconocidos por cualquier otro anticuerpo presentado en fago presente en la muestra, puede ponerse en contacto con la célula que está sometiéndose a ensayo simultáneamente, en la misma mezcla de reacción. Sin embargo, el bacteriófago puede ponerse en contacto con la célula en serie, de modo que cada bacteriófago se pone en contacto con la célula, se elimina cualquier bacteriófago no unido y puede ponerse en contacto con la célula el siguiente bacteriófago, se elimina el fago no unido y así sucesivamente, hasta que se haya permitido que todos los bacteriófagos se unan con la célula de modo que todos los antígenos de interés se hayan sometido a ensayo sobre la célula. Entonces, puede tratarse todo el fago unido para liberar los ácidos nucleicos presentes en su interior, y pueden detectarse las diversas secuencias de ácido nucleico presentes en la muestra tal como se trata más completamente en otra parte en el presente documento. Debido a que cada bacteriófago que expresa un anticuerpo único contiene un ácido nucleico que comprende una secuencia conocida que es distinta de las secuencias de todos los otros ácidos nucleicos de bacteriófago usados en el ensayo, puede determinarse la unión de cada bacteriófago por separado respecto todos los otros. Por tanto, puede determinarse la presencia de cada antígeno sometido a ensayo detectando la secuencia de ácido nucleico única asociada con el bacteriófago que presenta el anticuerpo que se une con el antígeno porque la detección de diversas secuencias de ácido nucleico en una muestra no interfiere con la detección de otras secuencias no relacionadas en esa misma muestra.

El experto apreciaría, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que cuando se desea velocidad, pueden someterse a ensayo diferentes antígenos en una única mezcla de reacción. Además, cuando se desea una mayor sensibilidad del ensayo, por ejemplo, cuando está implicada la detección forense de una muestra pequeña, o cuando la combinación particular de fagos requerida para el ensayo es de algún modo incompatible con el mismo esquema o condiciones de amplificación, entonces las diversas reacciones pueden realizarse en serie. Por tanto, aunque se prefiere que la PCR se realice añadiendo todos los cebadores relevantes en un tubo y amplificando todos los fragmentos de una vez, la invención también abarca procedimientos en los que se identifica cada antígeno/ligando en serie usando la misma muestra. Al diseñar los cebadores y los tramos de ADN de fago/fagémido para la amplificación, es preferible por tanto diseñar secuencias específicas (etiquetas) que van a amplificarse en el ADN de fago, en lugar de explotar la diferencia en la secuencia de anticuerpo o péptido, dado que pueden hacerse compatibles en cuanto a las condiciones de multiplexación y ciclación. Tal como se ejemplifica en el presente documento para la detección antígenos B y Rh(D) sobre un RBC usando anticuerpos anti-B y anti-Rh(D) presentados por un fago, los cebadores pueden diseñarse para usarse en una única reacción y los fagos se añadieron junto con los RBC y la PCR se realizó en un único tubo para producir amplicones tanto de 1100 pb como de 1600 pb. Aunque este es el procedimiento preferido, la invención no se limita a este esquema particular.

Por tanto, pueden ponerse en contacto simultáneamente con una muestra de RBC varios anticuerpos presentados en fagos diferentes (por ejemplo, anticuerpos específicos para diversos antígenos de grupos sanguíneos). El fago no unido se elimina, y se someten a ensayo los ácidos nucleicos del fago unido con las células para determinar qué fagos se unen con las células. Dado que cada bacteriófago contiene una única "etiqueta" de secuencia, pueden usarse procedimientos de ácido nucleico para determinar qué fagos, y por tanto, qué antígenos, están presentes sobre las células. Este procedimiento "múltiplex" es una enorme mejora sobre los procedimientos de la técnica anterior que requieren que cada antígeno se someta a ensayo por separado, requiriendo de ese modo reactivos adicionales, aumentando la dificultad técnica y longitud del ensayo e introduciendo más oportunidades de errores al requerir etapas y manipulaciones adicionales.

Por consiguiente, pueden ponerse en contacto simultáneamente varios anticuerpos de grupos sanguíneos presentados en fagos diferentes con la misma muestra de glóbulos rojos y puede explotarse las diferencias en la secuencia de nucleótidos del anticuerpo para determinar cuáles se unieron y cuáles no, tal como se demuestra en el presente documento usando anticuerpos anti-B y anti-Rh(D) presentados en diferentes fagos. Tal "multiplexación" no es posible mediante procedimientos de aglutinación ya que nunca se podría decir qué anticuerpo(s) provocó/provocaron la aglutinación.

Se demuestra que tal metodología es posible, es decir, que la unión simultánea de múltiples anticuerpos anti-RBC puede detectarse mediante la amplificación y detección de ADN de anticuerpo, mediante los datos dados a conocer en el presente documento en los que se empleó un sistema modelo que comprendía anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh(D) y anti-grupo sanguíneo B presentados en fagos. Sin embargo, el experto, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, apreciaría fácilmente que tal estrategia de "multiplexación" no se limita a ningún anticuerpo particular, si no que puede usarse para detectar múltiples antígenos de glóbulos rojos usando una amplia plétora de fagos que presentan anticuerpos, en la que cada fago comprende una secuencia de ADN que puede distinguirse de manera detectable del ácido nucleico de otro fago que codifica anticuerpos que tienen especificidades diferentes, o incluso fagos que codifican anticuerpos que tienen las mismas especificidades, siempre que los ácidos nucleicos del fago puedan distinguirse entre sí. De hecho, estos procedimientos no se limitan a glóbulos rojos o sus antígenos, sino que pueden aplicarse fácilmente a cualquier sistema en el que se desea detectar la presencia de múltiples antígenos sobre una célula, o en una muestra.

El experto apreciaría, tal como se trata más completamente en otra parte en el presente documento, que pueden usarse varios fagos que presentan anticuerpos, cada uno reactivo con un antígeno diferente de interés, en una reacción "múltiplex" en la que se detectan los antígenos en una única reacción y/o dentro de la misma muestra, los cebadores se seleccionan de modo que las regiones amplificadas por cada par de cebadores (es decir, cebadores directo e inverso y, si se desea, una sonda para el amplicón producido a partir de los mismos) pueden distinguirse cada una entre sí.

C. Detección de anticuerpos en suero

La presente invención incluye un procedimiento para detectar la presencia de autoanticuerpos o aloanticuerpos en suero, más específicamente, para detectar anticuerpos anti-glóbulos rojos en suero humano (prueba de antiglobulina indirecta). El procedimiento comprende poner en contacto un glóbulo rojo humano que expresa al menos un antígeno de glóbulos rojos con una muestra de suero que va a someterse a ensayo. Se lava la célula para eliminar los anticuerpos no unidos específicamente y entonces se pone en contacto la célula con bacteriófagos que presentan un reactivo antiglobulina sobre su superficie. Cuando hay un anticuerpo humano (IgG, IgM y similares) unido con la célula, el bacteriófago se unirá mediante el reactivo antigobulina presentado por el fago. Entonces puede detectarse la presencia de fago unido específicamente con la célula (mediante la unión con el anticuerpo humano sobre la célula) tal como se da a conocer en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago. De esta forma, cuando se conoce la composición de antígenos de un panel de células, puede usarse este panel de referencia de células para someter a ensayo la presencia de anticuerpos frente a estos antígenos en cualquier muestra detectando sencilla y rápidamente el ácido nucleico de un bacteriófago que presenta una antiglobulina sobre su superficie, de modo que puede usarse la "fenotipificación mediante genotipificación" para aumentar la eficacia y sensibilidad, así como para automatizar, ensayos que se realizaron previamente usando procedimientos de detección basados en anticuerpos.

D. Detección de fragmentos de complemento o anticuerpos sobre glóbulos rojos

La presente invención incluye un procedimiento para detectar la presencia de fragmentos de complemento, autoanticuerpo o aloanticuerpo unido a la superficie de glóbulos rojos, más específicamente, para el diagnóstico de anemia hemolítica autoinmunitaria o para la determinación de la destrucción aloinmunitaria de glóbulos rojos transfundidos (prueba de antigobulina directa). El procedimiento comprende lavar una muestra de glóbulos rojos para eliminar anticuerpos no específicamente unidos y luego poner en contacto las células con bacteriófagos que presentan un reactivo antiglobulina sobre su superficie. Cuando hay un complemento o anticuerpo humano unido con la célula, el bacteriófago se unirá mediante el reactivo antiglobulina presentado por el fago. Entonces puede detectarse la presencia de fago unido específicamente con la célula (mediante la unión con el complemento o anticuerpo humano sobre la célula) tal como se da a conocer en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago. De esta forma, puede usarse la "fenotipificación mediante genotipificación" para aumentar la eficacia y sensibilidad, así como para automatizar, ensayos que se realizaron previamente usando procedimientos de detección basados en anticuerpos.

E. Realización de pruebas de compatibilidad donante/receptor

La presente invención incluye un procedimiento para garantizar la compatibilidad, es decir, la no reactividad, entre anticuerpos en sueros de pacientes y una alícuota de glóbulos rojos extraída de una unidad de sangre destinada a la transfusión (pruebas cruzadas). El procedimiento comprende poner en contacto una muestra de glóbulos rojos de donante caracterizada con una muestra de suero de paciente que va a someterse a prueba. Se lavan las células para eliminar anticuerpos no específicamente unidos y entonces se pone en contacto la célula con bacteriófagos que presentan un reactivo antiglobulina sobre su superficie. Cuando hay un anticuerpo humano unido con la célula, tal como sería el caso con una prueba cruzada incompatible, el bacteriófago se unirá mediante el reactivo antiglobulina presentado por el fago. Entonces puede detectarse la presencia de fago unido específicamente con la célula (mediante la unión con el anticuerpo humano sobre la célula) tal como se da a conocer en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago. De esta forma, puede usarse la "fenotipificación mediante genotipificación" para aumentar la eficacia y sensibilidad, así como para automatizar, ensayos que se realizaron previamente usando procedimientos de detección basados en
anticuerpos.

II. Kits

La solicitud da a conocer diversos kits que comprenden un compuesto, tal como un bacteriófago que presenta un anticuerpo con especificidad conocida por un antígeno de interés, un par de cebadores para amplificar una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el fago, un baliza molecular para detectar una secuencia conocida presente en el ácido nucleico contenido en el bacteriófago, un reactivo para su uso en una reacción IDAT (por ejemplo, ARN polimerasa de T7, ADN polimerasa I, dNTP y similares) y/o composiciones de la invención, un aplicador y materiales de instrucciones que describen el uso del compuesto para realizar los procedimientos de la invención, y cualquier combinación de los componentes anteriores. Aunque se describen a continuación kits a modo de ejemplo, el contenido de otros kits útiles resultará evidente para el experto a la luz de la presente descripción.

En un aspecto, la aplicación ilustra un kit para detectar la presencia de un resto que lleva un antígeno sobre una célula. El kit se usa de acuerdo con los procedimientos dados a conocer en la invención. En resumen, el kit puede usarse para poner en contacto un bacteriófago que presenta un anticuerpo que se une específicamente con el resto que lleva un antígeno cuando está presente sobre una célula. Esto se debe a que, tal como se trata más completamente en otra parte en el presente documento, la unión del bacteriófago con la célula y la detección posterior de una secuencia de ácido nucleico que se sabe que está presente en el fago, indica que el fago se une con la célula, indicando de ese modo que el anticuerpo presentado por el fago se une con su antígeno análogo, por tanto, a su vez, indicando que el antígeno está presente sobre la célula, detectando de ese modo el antígeno mediante este procedimiento de "fenotipificación mediante genotipificación" novedoso de la invención.

El kit comprende además un aplicador útil para administrar el bacteriófago, cebadores de PCR, balizas moleculares y similares a una muestra. El aplicador particular incluido en el kit dependerá, por ejemplo, del procedimiento usado para detectar el antígeno usando la "fenotipificación mediante genotipificación" tal como se da a conocer en el presente documento, y tales aplicadores se conocen bien en la técnica y pueden incluir, entre otras cosas, una pipeta, una jeringuilla, un cuentagotas y similares. Además, el kit comprende material de instrucciones para el uso del kit. Estas instrucciones plasman simplemente la descripción proporcionada en el presente documento.

En un aspecto, el kit comprende además un bacteriófago que expresa un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno de glóbulos rojos tal como, pero sin limitarse a, antígenos de RBC A, B, Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fy^{a}, Fy^{b}, M, N, S, s, Jk^{a}, Jk^{b}.

Además, en otro aspecto, el kit comprende además una sonda de baliza molecular en la que la secuencia de ácido nucleico de la sonda es complementaria con una secuencia tal como, por ejemplo, de la secuencia de SEC ID NO: 3 y la secuencia de SEC ID NO: 4, tal como se ejemplifica en el presente documento. Estas secuencias están contenidas dentro del ácido nucleico contenido por el bacteriófago de modo que las secuencias que hibridan con las mismas pueden detectar la presencia de ácido nucleico de fago/fagémido. Más específicamente, el kit comprende una sonda de baliza molecular que tiene una secuencia tal como, pero sin limitarse a la secuencia SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10.

Aún en otro aspecto, el kit comprende un cebador de PCR que puede amplificar la secuencia de ácido nucleico presente en el fago. Tal cebador de PCR incluye, pero no se limita a la secuencia de SEC ID NO: 1 y la secuencia de SEC ID NO: 2.

El kit incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición se proporciona en una cantidad apropiada tal como se expone en otra parte en el presente documento.

También se incluyen kits adicionales, tales como aquéllos para detectar complemento y auto- y aloanticuerpos en una muestra, así como kits para detectar cualquier ligando de interés en los que se conoce un par de unión ligando/receptor conocido, tal como apreciaría fácilmente un experto en la técnica basándose en la descripción proporcionada en el presente documento.

La invención se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan para el fin de ilustración sólo y la invención no debe interpretarse en modo alguno como limitada a estos ejemplos, si no que en su lugar debe interpretarse que abarca cualquiera y todas las variaciones que resultan evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Ejemplos

Las tecnologías actuales usadas en instalaciones de extracción de sangre, bancos de sangre y laboratorios de servicios de transfusión requieren mano de obra de manera extraordinaria, son propensas al error humano y un orden de magnitud más caras por prueba que las de otros laboratorios clínicos. Asociado con una escasez creciente de tecnólogos médicos especializados, una reducción de los suministros de reactivos de fenotipificación derivados de plasma humano y una dificultad inherente para automatizar completamente las metodologías de aglutinación basadas en las de los años 50, la capacidad de realizar cientos de millones de pruebas previas a la transfusión al año de una manera rápida, precisa y económica es un desafío significativo.

La presente invención se refiere al desarrollo de tecnologías moleculares novedosas y reactivos pertinentes para las mismas, para desarrollar una nueva clase de reactivos para pruebas de bancos de sangre renovables, baratos y de alta calidad que funcionen en un sistema de ensayo rápido, de alto rendimiento y automatizable.

Una característica central de las tecnologías novedosas dadas a conocer en el presente documento son anticuerpos monoclonales específicos de antígenos de glóbulos rojos presentados sobre la superficie de partículas de bacteriófago. Se ha aprovechado la presencia de secuencias de ADN únicas que se producen en la naturaleza dentro de las partículas de fago para desarrollar un sistema de ensayo en el que se determina el fenotipo de un glóbulo rojo sometiendo a ensayo el genotipo del reactivo de detección, es decir, el fago que lleva un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno presente sobre un glóbulo rojo.

Una estrategia de este tipo ofrece una sensibilidad y especificidad extraordinarias, requiere cantidades minúsculas de materiales y reactivos de prueba, se adapta fácilmente a la automatización y es adecuado para estrategias de multiplexación, ofreciendo de ese modo la capacidad de realizar perfiles antigénicos simultáneos de una muestra de glóbulos rojos en un único recipiente de reacción, todo lo cual ofrece una mejora sustancial con respecto a los procedimientos de la técnica anterior.

Se desarrolla un panel de reactivos de anticuerpos presentados en fago específicos para antígenos de glóbulos rojos clínicamente significativos usando tecnologías de bibliotecas de presentación de anticuerpos en fago. Se han descrito previamente ejemplos de estos reactivos y metodologías para su producción (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.876.925 y 6.255.455), y se ejemplifican mediante los reactivos usados en el presente documento. Se ha demostrado que estos reactivos de anticuerpos presentados en fagos son superiores a los reactivos de bancos de sangre convencionales y que pueden usarse con todos los procedimientos de determinación del grupo sanguíneo basados en la aglutinación disponibles actualmente. Además, se da a conocer una plataforma de determinación del grupo sanguíneo novedosa basada en esta nueva generación de anticuerpos anti-glóbulos rojos, plataforma novedosa que hace un uso completo de las propiedades fenotípicas/genotípicas acopladas de estos reactivos
novedosos.

Por tanto, los datos dados a conocer en el presente documento demuestran que la presente invención supera varios obstáculos técnicos de hace mucho tiempo en el campo de la determinación del grupo sanguíneo. Los datos dados a conocer en el presente documento demuestran el desarrollo de una nueva clase de reactivos para pruebas de bancos de sangre renovables, baratos y de alta calidad y metodologías pertinentes para los mismos, que funcionan en un sistema de ensayo rápido, de alto rendimiento y automatizable.

Una característica de la tecnología novedosa dada a conocer en el presente documento son anticuerpos monoclonales específicos de antígenos de RBC presentados sobre la superficie de partículas de fago filamentoso que se aíslan usando varias tecnologías bien conocidas en la técnica, y tales tecnologías tal como se desarrollen en el futuro. Las partículas de fago ligan físicamente el fenotipo de un anticuerpo presentado sobre el fago (el resto que lleva un antígeno) con su genotipo (la secuencia única de ADN dentro de la partícula que codifica la secuencia de aminoácidos de ese resto particular que lleva un antígeno). Adicionalmente, la partícula de fago puede ligar el fenotipo del anticuerpo presentado sobre su superficie y el ADN presente en la partícula de fago porque puede detectarse otra parte del ADN, que no codifica la parte de unión a antígeno de la molécula pero que está asociada con la misma (es decir, una secuencia de baliza), de modo que la detección de la identidad del antígeno unido por el anticuerpo presentado sobre el fago puede determinarse fácilmente detectando la presencia de la baliza.

Por tanto, se ha aprovechado en el presente documento la presencia de secuencias de ADN únicas que se producen en la naturaleza dentro de las partículas desarrollando un sistema de ensayo novedoso en el que se determina el fenotipo de un RBC que está sometiéndose a ensayo, sometiendo a ensayo el genotipo del reactivo de detección, es decir, el fago que presenta anticuerpos y la molécula de ADN que codifica tal anticuerpo, u otra secuencia de ADN única (es decir, una secuencia de baliza) dentro del ADN contenido por el fago. La justificación en la que se basa el desarrollo de este enfoque de "fenotipificación -genotipificación mediante reactivo" novedoso es el reconocimiento de que las metodologías que usan esquemas de detección de ácido nucleico ofrecen la más alta sensibilidad y especificidad, requieren cantidades minúsculas de materiales y reactivos de prueba y pueden adaptarse fácilmente a la automatización.

Además, los ensayos basados en ácido nucleico son adecuados para estrategias de multiplexación que, en el caso de la determinación del grupo sanguíneo, ofrecerían la posibilidad de determinar simultáneamente el perfil antigénico de una muestra de RBC dada en un único recipiente de reacción. La capacidad de multiplexar reacciones de tipificación usando la tecnología propuesta en esta aplicación de investigación representaría una ventaja significativa tanto para las instalaciones de extracción de sangre como para los servicios de transfusión que históricamente se han limitado a la metodología de aglutinación de "un tubo/un resultado" convencional. Por tanto, los ensayos novedosos descritos en el presente documento permiten que la detección de múltiples restos que llevan un antígeno sobre un RBC se detecte fácil y rápidamente.

Tecnología de presentación en fago

En el centro de la tecnología propuesta, se encuentran anticuerpos monoclonales específicos de antígenos de RBC que se presentan sobre la superficie de partículas de bacteriófago filamentoso (revisado en Siegel, 2001, Transfusion Med. Rev. 15:35-52). A diferencia de los procedimientos celulares convencionales caros y que requieren mucho tiempo para generar anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos B, la presentación de anticuerpos en fago funciona inmortalizando los genes de inmunoglobulinas en lugar de las células de las que se derivaron. Usando procedimientos moleculares en lugar de transformación celular, se producen "bibliotecas" de partículas de fago a partir de poblaciones de células B, presentando cada partícula una especificidad de anticuerpo particular sobre el exterior y conteniendo la secuencia de ADN única del anticuerpo en el interior.

Se han descrito previamente procedimientos para seleccionar partículas de fago específicas para antígenos de superficie celular particulares a partir de tales bibliotecas (por ejemplo, Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85; patente estadounidense número 5.876.925, concedida Siegel) y se han producido hasta la fecha cientos de anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh(D) únicos presentados en fago (por ejemplo, Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85; Chang y Siegel, 1998, Blood 91:3066-3078; patente estadounidense número 6.255.455, concedida Siegel). Aunque los anticuerpos monoclonales producidos de esta forma pueden expresarse como moléculas de anticuerpos solubles (no unidas a fago) que pueden aglutinar RBC usando la reacción de antiglobulina indirecta convencional (es decir, Coombs) (véase Siegel y Silberstein, 1994, Blood 83:2334-2344), se ha establecido que las partículas de fago reales que presentan los anticuerpos monoclonales recombinantes pueden usarse en reacciones de aglutinación sustituyendo el anticuerpo anti-fago M13 por el reactivo de Coombs (Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85; patente estadounidense número 5.985.543, concedida a Siegel). Una ventaja de este procedimiento en los ensayos de aglutinación usando un fago intacto que presenta el anticuerpo es el aumento de sensibilidad dado que se necesitan tan sólo aproximadamente 10 partículas de fago que expresan anticuerpo anti-Rh(D) (en comparación con aproximadamente 150 - 1000 de IgG convencionales) para inducir la aglutinación debido al mayor grado de reticulación mediante el anticuerpo anti-M13 proporcionado por el tamaño relativamente grande (aproximadamente 0,5 micrómetros) de las partículas.

Lo que es más importante para la aplicación comercial, es la capacidad de tales anticuerpos presentados en fago de dirigir su propia replicación dentro de E. coli, permitiendo que se produzca reactivo suficiente para su uso en la tipificación convencional de glóbulos rojos de casi 500.000 unidades de sangre para un coste de reactivos de unos cuantos dólares (véase Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85).

La sustitución de los reactivos de tipificación de bancos de sangre convencionales por anticuerpos recombinantes presentados en fago en ensayos de aglutinación es una mejora enorme con respecto a las metodologías de aglutinación basadas en Coombs de la técnica anterior en y por sí misma por las razones establecidas anteriormente (la capacidad de clonar anticuerpos humanos sin necesidad de transformación de células B, mayor sensibilidad del ensayo, producción barata en cultivo bacteriano y otras (Siegel, 2001, Transfusion Med. Rev. 15:35-52). Sin embargo, los datos dados a conocer en el presente documento demuestran la espectacular mejora adicional con la tecnología basada en fagos mediante el aprovechamiento de la presencia de secuencias de ADN únicas que se producen en la naturaleza contenidas dentro de las partículas de fago que expresan anticuerpos para facilitar la automatización de alto rendimiento y la tipificación de múltiples antígenos en un único recipiente de reacción (multiplexación). El procedimiento de la invención puede comprender las diversas etapas ilustradas en la figura 1, y se da a conocer con más detalle en otra parte en el presente documento.

Usando la presentación de anticuerpos en fago y otras tecnologías disponibles en la técnica, puede clonarse y producirse un conjunto de reactivos monoclonales novedosos específicos para antígenos de RBC clínicamente significativos, y pueden validarse las características de rendimiento de los mismos según las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, así como procedimientos conocidos en la técnica y que van a desarrollarse en el futuro. Por ejemplo, los estudios previos demostraron la producción y el aislamiento de tales reactivos con especificidades para antígenos de RBC B, anti-Rh(D), M y N (véanse, por ejemplo, Chang y Siegel, 2001, Transfusion. 41:6-12; Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85; Chang y Siegel, 1998, Blood 91:3066-3078; Czerwinski et al., 1995, Transfusion. 35: 137-144; Czerwinski et al., 1999, Transfusion. 39:364-371). Tales procedimientos pueden aplicarse al desarrollo, entre otros, de anticuerpos anti-A, anti-Rh(C, c, E, e) así como anticuerpos de los grupos sanguíneos Kell, Duffy, Kidd y Ss. Estos reactivos pueden usarse en ensayos de aglutinación convencionales manuales y automatizados, así como en los procedimientos novedosos dados a conocer en el presente documento.

Se produjo un conjunto de índice de fago anti-grupo sanguíneo B y anti-Rh(D) y se insertan etiquetas de secuencias de ADN únicas (es decir, secuencias de baliza), sitios de hibridación y de cebador de oligonucleótido, y promotores de polimerasa en el ADN que codifica cada anticuerpo. Se evalúan las características de rendimiento de varios esquemas de amplificación/detección de ácido nucleico para identificar y cuantificar la unión a RBC de cada reactivo, tal como se ejemplifica en el presente documento usando reactivos de fago de grupo B y anti-Rh(D).

Los datos dados a conocer en el presente documento demuestran que pueden usarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la electroforesis en gel de agarosa para detectar y diferenciar simultáneamente la unión de dos especificidades de anticuerpo anti-RBC diferentes. Estos datos demuestran que puede realizarse la selección rápidamente usando estos procedimientos, y pueden aumentarse a escala y automatizarse para su aplicación comercial.

Amplificación de ADN de fago usando la reacción en cadena de la polimerasa

En un aspecto, se detectó la unión de un anticuerpo presentado en fago específico de RBC, por ejemplo una partícula de fago que expresa anticuerpo anti-Rh(D), a través de la adición de cebadores de oligonucleótido específicos para la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo anti-Rh(D) expuesta cuando, por ejemplo, se calentaron las partículas de fago unidas para desnaturalizar la cubierta del fago. Un cebador puede ser complementario a una secuencia genérica contenida en el ADN del fago (independientemente de la especificidad de anticuerpo) y el otro cebador puede ser complementario a, por ejemplo, una secuencia específica para ese fago, tal como, pero sin limitarse a la región hipervariable CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo (es decir, la secuencia que es única para un anticuerpo dado). La medición del ADN del anticuerpo amplificado resultante puede indicar la presencia de ese antígeno relacionado con el anticuerpo sobre la superficie de una célula que está examinándose. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, pueden ponerse en contacto simultáneamente varios anticuerpos de grupos sanguíneos presentados en fago diferentes con la misma muestra de glóbulos rojos y pueden aprovecharse las diferencias en la secuencia de nucleótidos del anticuerpo para determinar cuáles se unen y cuáles no se unen tal como se demuestra en el presente documento usando anticuerpos anti-B y anti-Rh(D) presentados en un fago diferente. Tal "multiplexación" no es posible mediante procedimientos de aglutinación ya que nunca se podría decir qué anticuerpo(s) provocó/provocaron la aglutinación.

Se demuestra que tal metodología es posible, es decir, que puede detectarse la unión simultánea de múltiples anticuerpos anti-RBC mediante la amplificación y detección de ADN de anticuerpos, mediante los datos dados a conocer en el presente documento en los que se empleó un sistema modelo que comprendía anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh(D) y anti-grupo sanguíneo B presentados en fago. Sin embargo, el experto, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, apreciaría que tal estrategia de "multiplexación" no se limita a ningún anticuerpo particular, sino que puede usarse para detectar múltiples antígenos de glóbulos rojos usando una amplia plétora de fagos que presentan anticuerpos, en la que cada fago comprende una secuencia de ADN que puede distinguirse de manera detectable del ácido nucleico de otro fago que codifica anticuerpos que tienen especificidades diferentes, o incluso fagos que codifican anticuerpos que tienen las mismas especificidades, siempre que los ácidos nucleicos del fago puedan distinguirse entre sí. Usando PCR y electroforesis en gel de agarosa para amplificar y luego detectar secuencias codificantes únicas dentro de cada tipo de partícula de fago basándose, por ejemplo, en el tamaño de los amplicones, los datos dados a conocer en el presente documento demuestran que se determinó el fenotipo simultáneamente de una muestra de RBC para B y Rh(D) con extraordinaria sensibilidad. Es decir, el ensayo individual detectó el equivalente de 20 atogramos de IgG convencional y requirió 10.000 veces menos RBC (135 picol o aproximadamente 1500 RBC totales) que una reacción de aglutinación convencional.

Sin embargo, en la práctica, puede usarse una lectura de ADN rápida, que puede aumentarse a escala y automatizable en lugar de la electroforesis en gel de agarosa. Se conocen bien en la técnica muchos procedimientos, y se tratan con más detalle varios de tales procedimientos en otra parte en el presente documento. No obstante, el experto entendería, una vez provisto con las enseñanzas de la invención, que puede usarse una amplia plétora de procedimientos para detectar ácidos nucleicos en los procedimientos de la invención, y que la invención no se limita en modo alguno a los procedimientos ejemplificados y tratados en el presente documento.

Amplificación de ADN de fago usando amplificación mediada por transcripción

Además de usar PCR para la etapa de amplificación de ADN de fago (etapa B de la figura 1), pueden usarse procedimientos basados en la detección de la transcripción de ADN de anticuerpos en fagos, en lugar de su amplificación, en los procedimientos de la invención. Más específicamente, se ha usado la inmunodetección mediante este procedimiento para detectar la unión de anticuerpos a los que se han conjugado químicamente oligonucleótidos que contienen el sitio del promotor de la ARN polimerasa de T7 con glutaraldehído tal como se describe en Zhang et al. (2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5497-5502). Esta técnica para la transcripción de ADN que está unido in vivo a un anticuerpo en virtud de su asociación física en partículas de fago puede usarse como una alternativa a la PCR y otras técnicas de amplificación. Esta tecnología se ha denominado IDAT, que significa inmunodetección amplificada mediante ARN de T7 (Zhang et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5497-5502). Colocando el sitio del promotor de la ARN polimerasa de T7 en sentido 5' respecto a una etiqueta de secuencia arbitraria en el ADN de fagémido, la adición de la ARN polimerasa de T7 y NTP produce rápidamente (100 bases por segundo) transcritos de etiqueta a través de la unión progresiva y consecutiva de enzimas de T7 a su promotor.

Dado que no se produce la unión de la ARN polimerasa de T7 a productos de ARN, la amplificación es lineal, no exponencial como en la PCR. Para la fenotipificación de RBC, tal amplificación lineal proporciona una ventaja con respecto a la PCR (y ciertamente con respecto a los procedimientos de aglutinación convencionales) porque puede determinarse simultáneamente información cuantitativa (es decir, número relativo de copias del antígeno por célula) sobre múltiples antígenos a partir de una única muestra de células. Un ejemplo, entre otros, en el que tal cuantificación puede ser útil en los bancos de sangre es la detección de fenotipos "Rh(D) débiles", tal como se revisa en Mollison et al. (1997, en: Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra).

Una ventaja adicional de los procedimientos de detección basados en la transcripción tales como, pero sin limitarse a IDAT con respecto a la PCR es la eliminación de la ciclación de la temperatura una vez que se libera el ADN de fago de anticuerpo de las partículas. La eliminación de las reacciones de ciclación de la temperatura simplifica el diseño instrumental y disminuye el coste del ensayo. No obstante, la PCR y los procedimientos de transcripción tienen cada uno ventajas y desventajas que se conocen bien en la técnica de modo que el experto puede determinar fácilmente qué procedimiento, o cualquier otro procedimiento, puede usarse para cualquier ensayo particular y las condiciones deseadas para el mismo. Esto es debe a que la PCR, la transcripción y muchos otros procedimientos para detectar un ácido nucleico pueden usarse satisfactoriamente en los procedimientos de la presente invención y el experto apreciaría qué procedimiento emplear basándose en factores reconocidos en la técnica.

Detección de ADN de fago usando balizas moleculares

Las balizas moleculares son oligonucleótidos con estructura de tallo y bucle con una marca fluorescente en el extremo 5' y un atenuador universal en el extremo 3' (véase, por ejemplo, Tyagi y Kramer, 1996, Nature Biotech. 14:303-308; Broude, 2002, Trends in Biotechnology 20:249-256). Cuando el tallo está cerrado (en ausencia de ácido nucleico complementario), el fluoróforo y el atenuador están en estrecha proximidad y el atenuador absorbe energía fluorescente y se atenúa la fluorescencia y no puede detectarse. En presencia de ácido nucleico complementario, el bucle de la baliza se hibrida y el fluoróforo y el atenuador se separan de modo que no se produce atenuación. Entonces se emiten fotones del fluoróforo, no atenuados, a la longitud de onda específica para ese fluoróforo y entonces puede detectarse la fluorescencia. Combinando varias balizas en un tubo, cada una con un fluoróforo diferente en sus extremos 5', pueden detectarse simultáneamente múltiples dianas de ADN (Tyagi et al, 1998, Nature Biotech. 16:49-53) o ARN (de Baar et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39:1895-1902) midiendo el espectro de colores emitidos a partir del vaso de reacción.

Se incorporan balizas moleculares de dos colores diferentes en las reacciones de PCR y transcripción para detectar la presencia de ADN específico de anticuerpo. Tal como se describe en otra parte en el presente documento, se modifica el ADN de fagos anti-Rh(D) y anti-B para que contenga secuencias de ADN cortas que puedan amplificarse (o transcribirse) y posteriormente detectarse usando balizas moleculares tal como se describe en otra parte en el presente documento. El diseño y producción de tales secuencias "de baliza" y secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias "complementarias" a las mismas se conoce bien en la técnica. De hecho, hay programas informáticos disponibles comercialmente para ayudar en el diseño de tales secuencias, incluyendo las secuencias de sondas de balizas moleculares complementarias a una secuencia de interés.

Además, tales balizas y secuencias que se unen con las mismas, tal como las ejemplificadas en la figura 4, comprenden las siguientes secuencias: la secuencia del inserto "B140" es 5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT
CATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGC ATGCACTGGATGCACTCTATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGA
TGGTCTCTTT TAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTCCCCCCACT-3' (SEC ID NO: 3) y la secuencia del inserto "D140" es 5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGC ATGCACTG
GATGCACTCTGTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGCTTT TAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTC
CCCCCACT-3' (SEC ID NO: 4). El cebador de PCR directo ("PCR-F") es: 5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC
TCT-3' (SEC ID NO: 5) y la secuencia del cebador de PCR inverso ("PCR-R") es: 5-AGTGGGGGGACATCAAG
CAGCCATGCAAAT-3' (SEC ID NO: 6). Las secuencias B-Baliza y D-Baliza son tal como sigue, mostrando los derivados fluorescentes en los extremos y las estructuras de tallo en letras minúsculas. La secuencia "B-Baliza" es tal como sigue: 6-FAMgcgagcATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTCgctcgc-DABCYL (SEC ID NO: 7. La "D-Baliza" es: TAMRAcgagcGTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGCgctcgc-DABCYL (SEC ID NO: 8). Las letras mayúsculas en las secuencias de baliza representan las secuencias respectivas en B140 y D140 con las que se reasocian las balizas. Por tanto, las letras mayúsculas son las secuencias de los oligonucleótidos que se usan para la detección de alineamiento de ADN. Es decir, un "B-oligo" es: 5'-ATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC-3' (SEC ID NO: 9), y un "D-oligo" es: 5'-GTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGC-3' (SEC ID NO:
10).

La presente invención no se limita a estas secuencias a modo de ejemplo; en su lugar, la invención abarca secuencias adicionales tales como pueden diseñarse fácilmente por el experto una vez provisto con la descripción proporcionada en el presente documento. Es decir, el diseño y uso de las secuencias de baliza se conoce bien en la técnica y no se trata adicionalmente en el presente documento y las secuencias dadas a conocer en el presente documento son meramente un ejemplo de las secuencias que pueden usarse para poner en práctica la invención. Por ejemplo, se conocen en la técnica muchos pares de sustancia fluorescente-atenuador, incluyendo, pero sin limitarse a, los ejemplificados en el presente documento que abarcan 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA) y DABCYL (un cromóforo no fluorescente que sirve como atenuador universal para cualquier fluoróforo en una baliza molecular: ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo)-benzoico). Tales moléculas se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.395.517 y 6.615.063 y no se tratan adicionalmente en el presente documento.

Detección de ADN de fago usando microalineamientos de olignucleótidos

Además de balizas moleculares, puede usarse la hibridación de amplicones (a partir de PCR) o transcritos (producidos usando mAT) de anticuerpos en fagos frente a RBC fluorescentes con alineamientos de sondas de oligonucleótidos complementarias para cuantificar indirectamente la cantidad (si hay alguno) de anticuerpo unido en una muestra. Además, aunque el uso de procedimientos convencionales para la hibridación de tales microalineamientos están limitados por difusión y pueden requerir varias horas para obtener señales fluorescentes adecuadas, este procedimiento puede acelerarse en 2-3 órdenes de magnitud a través de la aplicación de un campo eléctrico a lo largo de la superficie de un portaobjetos de vidrio revestido con indio/óxido de estaño barato tal como se describe en Su et al. (2002, Electrophoresis 23:1551-1557). Este procedimiento, conocido en la técnica como "hibridación acelerada por campo eléctrico con microalineamientos de oligonucleótidos" proporciona rápidos resultados, por ejemplo el tiempo desde la aplicación del ADN (ARN) hasta la lectura es inferior a aproximadamente 10 minutos. Por tanto, puede usarse la hibridación acelerada por campo eléctrico para potenciar adicionalmente la detección rápida de antígenos de interés presentes sobre una célula (por ejemplo, un glóbulo rojo, una plaqueta y similares).

La presente invención no se limita a la determinación del grupo sanguíneo sino que tiene amplios usos potenciales en muchas otras áreas de la medicina de transfusión, tales como, pero sin limitarse a pruebas de antígenos de plaquetas, y tiene amplia aplicación en la inmunología de transplante (tipificación del antígeno HLA) y particularmente la medicina forense, en la que la multiplexación de las reacciones puede proporcionar la mayor cantidad de información a partir de cantidades minúsculas de muestras de prueba. Además, puede usarse la construcción de reactivos antiglobulina (por ejemplo, componente del complemento anti-IgG, -IgM, -C3) expresados sobre partículas de fago para realizar la exploración de suero para detectar anticuerpos anti-RBC preformados, tipificación de grupo inversa o para realizar pruebas de Coombs directas/indirectas usando una metodología que detecta el ADN asociado a los reactivos antiglobulina. Pueden aislarse los reactivos en fago de antiglobulina a partir de bibliotecas de presentación en fago murinas inmunitarias o a través de la clonación de ARNm de inmunoglobulina de hibridoma preexistente usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Tipificación anti-grupo sanguíneo B y anti-Rh(D) usando análisis de ADN en fago

Los datos dados a conocer en el presente documento demuestran la detección de antígenos anti-grupo sanguíneo B y anti-Rh(D) sobre RBC usando los procedimientos novedosos de la invención. Es decir, se usaron dos anticuerpos monoclonales humanos presentados en fagos (uno anti-grupo sanguíneo B y uno anti-Rh(D)) aislados previamente ambos a partir de la selección de bibliotecas de presentación en fagos construidas a partir de individuos inmunizados (Chang y Siegel, 2001, Transfusion. 41:6-12; Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85) demostrando la detección de multiplexación de estos dos antígenos.

Para los fines de este estudio, se expresó un anticuerpo (el anti-B denominado FB5.7) como un fragmento Fab presentado en fago y el otro (el anti-Rh(D), denominado E1M2) como un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) (figura 2). Estos anticuerpos se describieron previamente en Chang y Siegel, 2001, Transfusion. 41:6-12; Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206:73-85; Chang y Siegel, 1998, Blood 91:3066-3078; y la patente estadounidense número 5.876.925, número 5.985.543 y número 6.255.455, concedidas todas a Siegel. Estos datos demuestran que pueden usarse fácilmente diversas formas de anticuerpo (por ejemplo, Fab, scFv y similares) en los procedimientos de la invención.

Se pronosticó que la amplificación por PCR de las regiones que codifican el anticuerpo del ADN de fagémido correspondiente produce productos de longitudes diferentes (es decir, 1600 pb y 1000 pb) y entonces se usó la electroforesis en gel de agarosa para determinar genéticamente la presencia de anticuerpos anti-B y/o anti-Rh(D) en lugar de procedimientos de detección a base de anticuerpos convencionales basados en los diferentes tamaños de los amplicones pronosticados.

Antes de realizar los ensayos de unión de los reactivos presentados en fagos con RBC, se realizó una serie de reacciones de PCR con diluciones en serie de las preparaciones de fagos anti-B o anti-Rh(D) para validar el procedimiento de detección genética novedoso y para determinar su sensibilidad. La PCR de las regiones que codifican el anticuerpo del fagémido produjo los tamaños de producto pronosticados de 1600 pb para el ADN de Fab que codifica anti-B y de 1000 pb para el ADN de scFv que codifica anti-Rh(D). Sorprendentemente, la sensibilidad de la detección cuando se visualiza sólo el 10% de los productos de reacción de PCR totales, fue de aproximadamente 100 partículas de anticuerpo en fago. Este valor representa el equivalente de sólo 1,7 x 10^{-22} moles o aproximadamente 2 x 10^{-17} g de IgG (aproximadamente 20 atogramos), un nivel de sensibilidad asombroso no alcanzado por procedimientos previos de determinación del grupo sanguíneo.

Para la amplificación por PCR de los insertos, el cebador directo ("5-prime LC") fue el siguiente: 5'-AAGA
CAGCTATCGCGATTG-3' (SEC ID NO: 1); y el cebador inverso ("GBACK") fue el siguiente: 5'-GCCCCCTTAT
TAGCGTTTGCCATC-3' (SEC ID NO: 2).

Para determinar si este ensayo genético de uso de anticuerpos anti-B y anti-Rh(D) presentados en fagos podía usarse para fenotipar correctamente RBC, se realizó un experimento que demostró la perfecta concordancia entre los fenotipos conocidos de los RBC reactivos, los resultados de la prueba basada en aglutinación convencional usando los anticuerpos en fagos y los resultados del procedimiento de pruebas genéticas novedoso (figura 3). Por tanto, los datos dados a conocer en el presente documento demuestran la eficacia de la "fenotipificación mediante reactivo-genotipificación" novedosa así como la capacidad de multiplexar las determinaciones fenotípicas.

Además, usando el protocolo de PCR dado a conocer en el presente documento, el ensayo es sorprendentemente sensible dado que los resultados mostrados en los carriles del gel de agarosa representado en la figura 3 representan sólo el 10% del producto de reacción total, y el número de RBC añadidos a cada reacción de PCR fue sólo de aproximadamente 1500, o el equivalente de 135 picol de RBC. En cambio, los procedimientos convencionales utilizan aproximadamente 10.000 veces más RBC por ensayo de aglutinación.

Desarrollo de reactivos de tipificación anti-RBC presentados en fago

Los procedimientos utilizados para clonar, producir y validar las características de rendimiento de los anticuerpos monoclonales anti-RBC presentados en fagos han sido el centro de numerosas publicaciones (por ejemplo, Siegel, 2002, en: Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols, vol. 178, págs. 219-226, Aitkem & O'Brien, eds., Humana Press, Totowa, NJ; Siegel, 2000, en: Phage Display of Proteins and Peptides: A Laboratory Manual, vol. 23, págs. 23.21-23.32, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Siegel y Chang, 1997, en: Antibody Engineering: New Technologies, Applications, & Commercialization, IBC, Boston, MA), así como de varias patentes estadounidenses concedidas (véase anteriormente). Ya se han archivado muestras (sangre periférica residual, tejido de bazo, médula ósea y similares) a partir de las que se aislaron especificidades de antígeno de RBC diferentes de B, Rh(D), M y N, usando material de paciente de diagnóstico residual.

Metodología de detección de anticuerpos en fagos rápida y que puede aumentarse a escala

Se modifica el ADN de fagémido de anticuerpos anti-grupo sanguíneo de RBC, por ejemplo anti-B y anti-Rh(D), de modo que los anticuerpos en fagos contienen cada uno una etiqueta única que puede amplificarse mediante PCR o transcribirse mediante la ARN polimerasa de T7 y posteriormente detectarse mediante un par correspondiente de balizas moleculares únicas u oligonucleótidos microalineados. Las etiquetas se insertan en el ADN de fagémido fuera de la región que codifica anticuerpo anti-B o anti-Rh(D) de manera que no altere la expresión del anticuerpo y se presente sobre el revestimiento del fago (véase, por ejemplo, la figura 4). Se realiza un número seleccionado de esquemas de amplificación/detección de ácido nucleico usando el conjunto modificado de anticuerpos anti-RBC presentados en fagos con el fin de evaluar las características de rendimiento con el fin de maximizar la eficacia de la fenotipificación de RBC rápida, multiplexada.

Para la modificación de ADN de fagémido, se secuenciaron B140 y D140. Se han realizado ensayos de PCR-F y PCR-R, junto con B-Baliza/Oligo en PCR cinética (baliza molecular) para medir el nivel de ADNc de gag de VIH (O'Doherty et al., 2000, J. Virol. 74:10074-10080). Se ligan B140 y D140 en fagémidos anti-B o anti-Rh(D) usando técnicas de clonación convencionales. Se producen partículas de fago que expresan anticuerpos a partir de sus ADN modificados y se validan sus propiedades de unión tal como se describió previamente (Chang y Siegel, 1998, Blood 91:3066-3078; Siegel, 2002, en: Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols, vol. 178, págs. 219-226, Aitkem & O'Brien, eds., Humana Press, Totowa, NJ; Siegel, 2000, en: Phage Display of Proteins and Peptides: A Laboratory Manual, vol. 23, págs. 23.21-23.32, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Siegel y Chang, 1997, en: Antibody Engineering: New Technologies, Applications, & Commercialization, IBC, Boston, MA).

Se realizan experimentos de amplificación de ADN de fago mediante PCR sobre muestras incubadas con fago/RBC tal como se describió previamente en otra parte en el presente documento, excepto por el uso del ciclador térmico espectrofotométrico ABI 7700, la adición de uno o ambos de B-BALIZA o D-BALIZA, o el uso de una mezcla de marcaje con fluoresceína de PCR (dNTP con puntas de dUTP de fluoresceína) dependiendo del procedimiento de detección. Para la amplificación de ADN de fago mediante trancripción, se realiza una serie de experimentos análogos a los realizados usando PCR usando el siguiente procedimiento de amplificación de ARN: se calientan las partículas de fago hasta 94ºC durante 2 minutos para desnaturalizar el revestimiento del fago y liberar el ADN de fagémido monocatenario. Dado que la ARN polimerasa de T7 requiere ADN bicatenario como molde, se usan la ADN polimerasa I, dNTP y el cebador inverso que contiene Not I usado para clonar D140/B140 para sintetizar ADN de segunda cadena durante la síntesis de ARN. Para iniciar la amplificación de ARN, se añade tampón de amplificación que contiene ARN polimerasa de T7 (Zhang et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5497-5502) en presencia de una o ambas balizas moleculares o fluoresceína-12-UTP dependiendo del procedimiento de detección tal como se describe a continuación.

Para la detección de ADN de fago amplificado usando balizas moleculares, están presentes las estructuras de tallo y bucle B-Baliza (marcado con FAM) y D-Baliza (marcado con TAMRA) tanto de manera única como en combinación durante la formación del amplicón de PCR y durante la transcripción del ARN. Se determina el tiempo hasta el positivo más corto (los menores ciclos de PCR/el tiempo más corto para la transcripción del ARN), en el que el positivo es al menos 2 logs de la fluorescencia por encima del fondo. Inicialmente, se realizan ensayos de sensibilidad usando diluciones en serie del fago y seguido por experimentos de unión usando RBC positivos y negativos para el antígeno. Se evalúa la capacidad de multiplexar reacciones con anticuerpos anti-B y anti-Rh(D) y se examinan numerosas variables de titulación incluyendo las concentraciones relativas de cada baliza, la cantidad de anticuerpos en fagos aportados, el número de RBC, el tiempo de incubación de RBC/fago y el número de lavados. Además, se evalúa el efecto sobre la señal fluorescente como una función del número de copias del antígeno por RBC (por ejemplo, en comparación con los fenotipos de Rh(D) R_{2}R_{2}, R_{1}R_{1}, R_{1}r, D^{w}, Rh(D) parcial y similares) (Mollison et al., 1997, en: Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra) y se compara la cuantificación de la densidad de antígeno con la amplificación exponencial (PCR) y lineal
(transcripción).

Para la detección de ADN de fago amplificado en microalineamientos de oligonucleótidos potenciados por campo eléctrico, se sintetizan oligonucleótidos que corresponden a los nucleótidos de hibridación de B-Baliza y D-Baliza y se aplican a portaobjetos de vidrio revestidos con indio-óxido de estaño usando un alineador. Se procesan los portaobjetos, se incuban con amplicones de PCR o transcritos de ARN marcados fluorescentemente y se lavan tal como se describe (Su et al., 2002, Electrophoresis 23:1551-1557) y se analizan usando un dispositivo de exploración de microalineamiento ScanArray 5000.

Similar al enfoque tomado en los experimentos con balizas moleculares descritos anteriormente, la detección de ADN de fago asociado con anticuerpo anti-B y anti-Rh(D) en el tiempo más corto se optimiza haciendo variar parámetros similares. Debido a que se incluyen RBC con y sin cada antígeno, hay muestras de prueba con uno o ambos (o ninguno de los) anticuerpos de fago, y un microalineamiento con múltiples manchas, varios controles internos positivos y negativos presentes que permitirán una evaluación precisa de la proporción señal/ruido. Basándose en la experiencia previa, se estima que se requieren menos de 10 minutos desde el momento de aplicación de la muestra hasta la hibridación y lectura.

Se usan procedimientos de clonación molecular rutinarios y la resolución de problemas es sencilla. Además, no es probable que haya ningún efecto adverso sobre la expresión de anticuerpos o la presentación resultante de la introducción de B 140/D 140. Se han clonado otras secuencias de nucleótidos de manera satisfactoria en el sitio Not I de pComb3X sin ningún efecto desfavorable. Además, hay otros sitios de restricción únicos convenientes en los que puede clonarse B140/D140 (o un conjunto de etiquetas alternativo), si es necesario o se desea. Las características importantes de los ensayos son el tiempo relativo hasta el positivo para la estrategia de amplificación/detección usada y se presta a la multiplexación de la fenotipificación de RBC. Los estudios de PCR dados a conocer en el presente documento demostraron sensibilidad y especificidad. El procedimiento de transcripción, aunque es lineal, ofrece la simplicidad de reacciones de amplificación isotérmica y, con una entrada de 10^{7} - 10^{9} ADN de molde por muestra, probablemente la sensibilidad no será un factor limitante. De hecho, estudios previos utilizando procedimientos de transcripción con anticuerpos monoclonales/oligonucleótidos conjugados con glutaraldehído demostraron una sensibilidad de 10^{9} a 10^{11} veces superior que los ensayos ELISA y los ensayos de inmunotransferencia tipo Western con quimioluminiscencia potenciada, respectivamente, con una capacidad notificada para detectar tan sólo unas pocas copias de antígeno en un lisado celular (Zhang et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5497-5502).

Además, los procedimientos dados a conocer en el presente documento presentan una amplia mejora con respecto a instrumentos, tales como, pero sin limitarse a, el analizador automatizado Olympus PK7200, que se consideran estado de la técnica para un dispositivo que usa tecnología de hemaglutinación. Esto es porque con un rendimiento notificado de varios cientos de muestras por hora, los procedimientos dados a conocer en el presente documento representan viabilidad y en última instancia superioridad dado que el tiempo hasta el positivo (incluyendo tiempos de incubación con fago/RBC) está en el intervalo de 30 minutos, las reacciones tienen lugar en un formato de 96 pocillos y pueden tener lugar determinaciones de múltiples antígenos (multiplexación) en un único pocillo.

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Detección de auto- y aloanticuerpos en suero

Este ensayo se realiza de una manera similar a la prueba de antiglobulina indirecta convencional (véase, por ejemplo, Mollison, 1997, en: Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra) con la sustitución de partículas de fago que expresan antiglobulina para el reactivo de antiglobulina convencional, y la detección de reactivo de fago unido tal como se describe en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago. En resumen, los miembros de un panel de glóbulos rojos reactivos de composición antigénica conocida se incuban cada uno con una alícuota de sueros de pacientes. Se lavan las células para eliminar los anticuerpos unidos de manera no específica y entonces se ponen en contacto las células con bacteriófago que presenta un reactivo de antiglobulina. El reactivo de antiglobulina puede ser específico para todos los isotipos de inmunoglobulina humana si se desea, o específico sólo para una clase tal como IgM o IgG. Usando algoritmos bien conocidos en el campo de la inmunohematología, se determina(n) la especificidad o especificidades de anticuerpos anti-glóbulos rojos presentes en los sueros del paciente basándose en el patrón de reactividad de los sueros con los glóbulos rojos del panel.

Detección de fragmentos de complemento o anticuerpo sobre glóbulos rojos

Este ensayo se realiza de una manera similar a la prueba de antiglobulina directa convencional (véase, por ejemplo, Mollison, 1997, Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra) con la sustitución de partículas de fago que expresan antiglobulina por el reactivo de antiglobulina convencional, y la detección de reactivo de fago unido tal como se da a conocer en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago. En resumen, se lava una muestra de glóbulos rojos para eliminar los anticuerpos unidos de manera no específica y después se pone en contacto con bacteriófago que presenta un reactivo de antiglobulina sobre su superficie. La preparación de anticuerpo de antiglobulina puede comprender moléculas específicas para IgG, para complemento C3d, o ambas (por ejemplo, anticuerpo anti-IgG, anticuerpo anti-C3d, ambos y similares). Cuando hay anticuerpo o complemento humanos unidos a la célula, el bacteriófago se une mediante el reactivo de antiglobulina presentado por el fago. Entonces se detecta la presencia de fago unido de manera específica a la célula (mediante unión al anticuerpo o complemento humanos en la célula) tal como se da a conocer en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago.

Realización de pruebas de compatibilidad entre donante/receptor

Este ensayo se realiza de una manera similar a la prueba cruzada de Coombs convencional (véase, por ejemplo, Mollison, 1997, en: Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra) con la sustitución de partículas de fago que expresan antiglobulina por el reactivo de antiglobulina convencional, y la detección de reactivo de fago unido tal como se da a conocer en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago. En resumen, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra de glóbulos rojos de donante con una muestra de suero de paciente. Se lavan las células para eliminar los anticuerpos unidos de manera no específica y después se pone en contacto la célula con bacteriófago que presenta un reactivo de antiglobulina (por ejemplo, anti-IgM o anti-IgG) sobre su superficie. Cuando hay anticuerpo humano unido a la célula, tal como sería el caso con una prueba cruzada incompatible, el bacteriófago se une mediante el reactivo de antiglobulina presentado por el fago. Se detecta la presencia de fago unido de manera específica a la célula (mediante la unión con el anticuerpo humano en la célula) tal como se da a conocer en el presente documento basándose en la detección de una secuencia de ácido nucleico conocida presente en el bacteriófago.

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<110> Los administradores de la Universidad de Pensilvania Siegel, Donald L.

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<120> COMPOSICIONES, PROCEDIMIENTOS Y KITS PARA LA DETECCIÓN DE UN ANTÍGENO SOBRE UNA CÉLULA Y EN UNA MEZCLA BIOLÓGICA

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<130> EP34382HVpau

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<140> Documento EP 03 754 675.1

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<141> 13-04-2005

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<150> Documento PCT/US2003/029231

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<151> 18-09-2003

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<150> Documento US 60/411.693

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<151> 18-09-2002

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<160> 10

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador directo "5-prima LC"

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagacagcta tcgcgattg

\hfill

19

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<210> 2

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso "GBACK"

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccccttat tagcgtttgc catc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> B140

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

3

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<210> 4

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<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D140

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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4

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR directo "PCR-F"

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgctatgtca cttccccttg gttctct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR inverso "PCR-R"

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> B-baliza

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagcatcc cattctgcag cttcctcatt gatggtctcg ctcgc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D-baliza

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagcgttt tacctcatta tccttctgcc agcgctagcg ctgc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> B-oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccattct gcagcttcct cattgatggt ctc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D-oligo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttacctc attatccttc tgccagcgct age

\hfill

33

Claims (28)

1. Un procedimiento in vitro de detección de la presencia de un resto que lleva un antígeno sobre una célula, comprendiendo dicho procedimiento,

a)

poner en contacto una célula con un bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con dicho resto que lleva un antígeno, en el que dicho bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia de dicho ácido nucleico se conoce al menos parcialmente;

b)

desnaturalizar dicho cualquier bacteriófago unido específicamente con dicha célula para liberar dicho ácido nucleico; y

c)

detectar dicho ácido nucleico, en el que la detección de dicho ácido nucleico detecta la presencia de dicho resto que lleva un antígeno sobre dicha célula, detectando de ese modo la presencia de dicho resto que lleva un antígeno sobre dicha célula.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además amplificar dicho ácido nucleico antes de la etapa (c).

3. El procedimiento según la reivindicación 1, comprendiendo además dicho procedimiento lavar dicha célula entre la etapa (a) y la etapa (b).

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha célula es un glóbulo rojo y dicho resto que lleva un antígeno es un antígeno de glóbulo rojo.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho antígeno de glóbulo rojo se selecciona del grupo constituido por A, B, Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fy^{a}, Fy^{b}, M, N, S, s, Jk^{a} y Jk^{b}.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha célula es un glóbulo blanco y en el que dicho resto que lleva un antígeno se selecciona del grupo constituido por un antígeno de linfocito, un antígeno de monocito y un antígeno de granulocito.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha célula es una plaqueta y en el que además dicho resto que lleva un antígeno es un antígeno de plaqueta.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho antígeno de plaqueta se selecciona del grupo constituido por HPA-1a, HPA-1b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-6b, HPA-7b, HPA-8b, HPA-9b, HPA-10b, Gov^{a} y Gov^{b}.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia complementaria a una sonda de baliza molecular.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha secuencia es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 3 y la secuencia de SEC ID NO: 4.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la secuencia de dicha sonda de baliza molecular se selecciona del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 7, la secuencia de SEC ID NO: 8, la secuencia de SEC ID NO: 9 y la secuencia de SEC ID NO: 10.

12. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha sonda de baliza molecular comprende un fluoróforo.

13. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico se amplifica usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha PCR comprende usar un cebador seleccionado del grupo constituido por la secuencia de SEC ID NO: 1 y la secuencia de SEC ID NO: 2.

15. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico se amplifica mediante transcripción usando inmunodetección amplificada mediante ARN de T7 (IDAT).

16. Un procedimiento in vitro de detección de la presencia de al menos dos restos diferentes que llevan un antígeno sobre una célula, comprendiendo dicho procedimiento,

a)

poner en contacto una célula con un primer bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con un primer resto que lleva un antígeno, en el que dicho primer bacteriófago comprende un primer ácido nucleico y en el que la secuencia de dicho ácido nucleico se conoce al menos parcialmente;

b)

poner en contacto dicha célula con un segundo bacteriófago que expresa un anticuerpo que se sabe que se une específicamente con un segundo resto que lleva un antígeno, en el que dicho segundo bacteriófago comprende un segundo ácido nucleico y en el que la secuencia del segundo ácido nucleico se conoce al menos parcialmente y en el que la secuencia de dicho primer ácido nucleico es diferente de manera detectable de la secuencia de dicho segundo ácido nucleico;

c)

detectar la unión de dicho primer bacteriófago con dicho resto que lleva un antígeno detectando la presencia de dicho primer ácido nucleico, en el que la detección de dicho primer ácido nucleico detecta la presencia de dicho primer resto que lleva un antígeno sobre dicha célula;

d)

detectar la unión de dicho segundo bacteriófago con dicho resto que lleva un antígeno detectando la presencia de dicho segundo ácido nucleico, en el que la detección de dicho segundo ácido nucleico detecta la presencia de dicho segundo resto que lleva un antígeno sobre dicha célula;

detectando de ese modo la presencia de al menos dos restos diferentes que llevan un antígeno sobre dicha célula.

17. Un procedimiento in vitro de detección de la presencia de un anticuerpo anti-glóbulos rojos en suero humano, comprendiendo dicho procedimiento,

a)

poner en contacto un glóbulo rojo humano que expresa al menos un antígeno de glóbulo rojo humano sobre la superficie de dicha célula con dicho suero;

b)

lavar dicha célula para eliminar cualquier anticuerpo unido de manera no específica con dicha célula;

c)

poner en contacto dicha célula con un bacteriófago que expresa un reactivo anti-globulina humana, en el que dicho bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia de dicho ácido nucleico se conoce al menos parcialmente;

d)

desnaturalizar dicho cualquier bacteriófago unido específicamente con dicha célula para liberar dicho ácido nucleico; y

e)

detectar dicho ácido nucleico, en el que la detección de dicho ácido nucleico detecta la presencia de dicho anticuerpo anti-glóbulos rojos en dicho suero.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho reactivo anti-globulina humana se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo anti-IgG humana, un anticuerpo anti-IgM humana, un anticuerpo anti-cadena ligera kappa/lambda humana, una proteína A estafilocócica, una proteína G estreptocócica y una proteína L peptoestreptocócica.

19. El procedimiento según la reivindicación 17, comprendiendo además dicho procedimiento amplificar dicho ácido nucleico antes de la etapa (e).

20. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo constituido por un autoanticuerpo y un aloanticuerpo.

21. Un procedimiento in vitro de detección de la presencia de un autoanticuerpo anti-glóbulos rojos en un ser humano, comprendiendo dicho procedimiento,

a)

lavar un glóbulo rojo obtenido de dicho ser humano para eliminar cualquier anticuerpo unido de manera no específica con dicha célula;

b)

poner en contacto dicha célula con un bacteriófago que expresa un reactivo anti-globulina humana, en el que dicho bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia de dicho ácido nucleico se conoce menos parcialmente;

c)

desnaturalizar dicho cualquier bacteriófago unido específicamente con dicha célula para liberar dicho ácido nucleico; y

d)

detectar dicho ácido nucleico, en el que la detección de dicho ácido nucleico detecta la presencia de dicho autoanticuerpo anti-glóbulos rojos en dicho ser humano.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, comprendiendo además dicho procedimiento amplificar dicho ácido nucleico antes de la etapa (d).

23. Un procedimiento in vitro de detección de la presencia de un ligando en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento,

\newpage

a)

poner en contacto una célula con un bacteriófago que expresa un receptor que se sabe que se une específicamente con dicho ligando, en el que dicho bacteriófago comprende un ácido nucleico y en el que la secuencia de dicho ácido nucleico se conoce al menos parcialmente;

b)

desnaturalizar dicho cualquier bacteriófago unido específicamente con dicha célula para liberar dicho ácido nucleico; y

c)

detectar dicho ácido nucleico, en el que la detección de dicho ácido nucleico detecta la presencia de dicho ligando en dicha muestra.

24. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicho ligando está presente sobre una célula.

25. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicha muestra es una muestra biológica obtenida de un ser humano.

26. El procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha muestra biológica es una muestra celular.

27. El procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha muestra celular comprende un glóbulo rojo y en el que dicho ligando es un antígeno de glóbulo rojo y en el que además dicho receptor es un anticuerpo.

28. El procedimiento según la reivindicación 23, comprendiendo además dicho procedimiento amplificar dicho ácido nucleico antes de la detección en la etapa (c).