ES2301168T3

ES2301168T3 - Nuevos peptidos opiaceos selectivos para receptores kappa.

Info

Publication number: ES2301168T3
Application number: ES96918080T
Authority: ES
Inventors: Colette T. Dooley; Richard A. Houghten
Original assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Current assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2016-06-03
Also published as: JP3784835B2; CA2551157C; CA2551182A1; DE69637430D1; ATE386048T1; EP1978025A1; EP0833652B1; DE69637430T2; JP2006104214A; CA2551157A1; JP4081501B2; JP2007077163A; WO1996040206A1; CA2223176C; EP0833652A4; EP0833652A1; JPH11512075A; CA2551182C; US5610271A; AU699543B2

Abstract

LA INVENCION ACTUAL PROPORCIONA UNOS NOVEDOSOS PEPTIDOS OPIACEOS QUE SON SELECTIVOS PARA EL RECEPTOR KAPPA DE OPIACEOS. EN UNA APLICACION DE ESTA INVENCION, LOS PEPTIDOS OPIACEOS SELECTIVOS DEL RECEPTOR KAPPA TIENEN LA ESTRUCTURA GENERAL AC A1 (SEQ ID NO. 28), EN DONDE A1 ES TYR O ARG, B2 ES ARG O PHE, Y C3 ES THR, PHE, O MET. EN OTRAS APLICACIONES, LOS PEPTIDOS OPIACEOS KAPPA-SELECTIVOS TIENEN LA SIGUIENTE ESTRUCTURA GENERAL (D)PHE ID NO. 30), DONDE EN AMBAS FORMULAS D4 ES (D)NAPALA O (D)PHE, E5 ES (D)NLE, TRP, O (D)ILE, Y F6 ES (D)ARG O (D)CHALA.

Description

Nuevos péptidos opiáceos selectivos para receptores kappa.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de la química peptídica y, más específicamente, a nuevos péptidos opiáceos que pueden inhibir la unión de ligandos a un receptor opiáceo.

Información sobre antecedentes

Existen, por lo menos, tres subtipos conocidos de receptores opiáceos, mu (\mu), delta (\sigma) y kappa (\kappa), a los cuales se unen respectivamente la morfina, las encefalinas y las dinorfinas. Los tres subtipos de receptores poseen propiedades analgésicas. Sin embargo, el tipo de dolor que se inhibe y las funciones secundarias varían con cada tipo de receptor. El receptor K es potente para afectar a la analgesia en respuesta al dolor, incluyendo a los estímulos químicos. El receptor K induce asimismo la diuresis y la sedación, y se asocia con efectos disfóricos y psicométricos, así como con la dependencia de drogas o de cualesquiera otra física. El receptor \mu se considera generalmente como asociado con el alivio del dolor, depresión respiratoria, motilidad intestinal, antidiuresis, respuesta inmunitaria y dependencia de las drogas o de cualesquiera otra física. El receptor \sigma, por otra parte, se asocia con analgesia térmica y, en menor grado, con la respiración y la adicción. Estas diferencias en las funciones de los receptores opiáceos alientan la investigación para medicamentos que produzcan analgesia pero sin efectos secundarios perjudiciales.

La utilización de péptidos sintéticos ha resultado decisiva para el trazado de estos subtipos y para proporcionar análogos que pueden utilizarse para estudiar las interacciones de ligandos específicos para estos sistema receptores tanto en sistemas in vitro como in vivo. Ciertos compuestos opiáceos son agonistas (se unen al receptor y producen un efecto), mientras que otros son antagonistas (se unen al receptor, pero no producen un efecto). La mayoría de los agonistas y antagonistas previamente conocidos de los receptores opiáceos son análogos de las encefalinas y péptidos relacionados, incluyendo las dinorfinas, por ejemplo, el documento US-A-5 017 689, las dermencefalinas y las casomorfinas. Los compuestos de la presente invención tienen poca, sino ninguna homología secuencial con alguno de estos péptidos opiáceos conocidos.

Avances recientes en los procedimientos para la preparación y rastreo de grandes números de péptidos individuales, han conducido a la identificación de numerosos péptidos útiles en todas las áreas de la investigación biomédica, que incluyen la investigación con respecto a la interacción de un ligando con el receptor opiáceo. Tanto los agonistas como los antagonistas específicos de receptores son necesarios como herramientas farmacológicas y como agentes terapéuticos (Schiller et al., Progress in Medicinal Chemistry, Amsterdam, Elsevier 1991, 28:301-340; Henby et al., Medicinal Research Reviews 1989, 9.343-401). Incluso con estos avance, sin embargo, la investigación básica y el descubrimiento de medicamentos ha estado limitado por la disponibilidad del necesario gran número de diversos agonistas y antagonistas requeridos para establecer la relación entre un ligando para un subtipo de receptor opiáceo en particular. De este modo, es necesario un gran número de péptidos individuales para la utilización en la investigación biomédica, incluyendo aquéllos para el estudio de las interacciones receptor-ligando opiáceo, Asimismo, son necesarios péptidos opiáceos que presenten valor terapéutico. La presente invención satisface estos requerimientos y proporciona también ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona nuevos péptidos opiáceos que son selectivos para el receptor opiáceo K. Los péptidos opiáceos tienen la estructura general Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 28), en la que A1 es Tyr o Arg, B2 es Arg o Phe, y C3 es Thr, Phe o Met.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos péptidos opiáceos que pueden inhibir la unión del ligando opiáceo [H^{3}]U69,593. Los péptidos tienen la estructura generalAc-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 28), en la que A1 es_{ }Tyr o Arg, B2 es Arg o Phe, y C3 es Thr, Phe o Met. Ejemplos de péptidos abarcados_{ }por esta fórmula incluyen los siguientes: Ac-Tyr-Arg-Thr-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 1); Ac-Tyr-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 2); Ac-Arg-Phe-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 3);_{ }Ac-Tyr-Arg-Met-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 4); y Ac-Arg-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 5).

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Las siguientes abreviaturas estándar se utilizan en la presente memoria para identificar los residuos aminoácidos.

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Los aminoácidos se indican mediante estos códigos conocidos habitualmente tal como se proporcionan anteriormente y (D) indica un aminoácido que presenta la configuración "D", opuesta a los L-aminoácidos que se encuentran de modo natural. Cuando no se indica una configuración específica, un experto en la materia entenderá que el aminoácido es un L-aminoácido.

Un experto en la materia sabrá que uno o más de los aminoácidos presentes en el interior de los péptidos mencionados como ejemplo podrá ser modificado o substituido, por ejemplo, mediante una substitución aminoácida conservadora de uno o más de los aminoácidos específicos que se muestran en aquellos péptidos. Un cambio sustitutivo conservador puede incluir, por ejemplo, la substitución de un aminoácido básico por otro aminoácido básico, de un aminoácido hidrofóbico por otro aminoácido hidrofóbico u otras substituciones conservadoras bien conocidas en la técnica, que incluyen la utilización por Ag de aminoácidos que no se encuentran de forma natural, tales como la ornitina (Orn) o la homoArginina (homoArg). Dichas substituciones incluyen el (D)-aminoácido correspondiente cuando es descrito en la configuración (L), y viceversa.

Además de los tipos mencionados de modificaciones o substituciones, puede utilizarse asimismo un imitador de uno o más aminoácidos, (que dan lugar a un péptido), conocido también como péptido mimético. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "imitador" significa un aminoácido o un análogo de éste, que posee las mismas o similares características funcionales de un aminoácido. Así, por ejemplo, un análogo de la (D) arginina puede ser un imitador de la (D) arginina si el análogo contiene una cadena lateral que posee una carga positiva a pH fisiológico, como es característico del grupo reactivo de la cadena lateral de guanidina de la arginina. Un péptido mimético o peptidomimético es una molécula orgánica que conserva los grupos farmacóforos de la cadena peptídica de una forma similar a como se encuentran en el péptido correspondiente.

La sustitución de los aminoácidos por aminoácidos que no se encuentran de forma natural y los peptidomiméticos tales como los descritos anteriormente, pueden potenciar la actividad global u otras propiedades de un péptido individual, basadas en las modificaciones de las funciones de la cadena lateral. Por ejemplo, estos tipos de alteraciones en los péptidos mencionados como ejemplo pueden potenciar la estabilidad peptídica para la fragmentación enzimática, o aumentar la actividad biológica, o disminuir la inmunogenicidad.

Un experto en la materia, utilizando las fórmulas anteriores, puede sintetizar fácilmente los péptidos de la presente invención. En la técnica, son bien conocidos los procedimientos estándar para preparar péptidos sintéticos. Los nuevos péptidos opiáceos pueden sintetizarse utilizando el procedimiento de síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) de Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964), o las modificaciones del SPPS, o los péptidos pueden sintetizarse utilizando procedimientos estándar de solución bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Bodanzsky, M., Principles of peptide Synthesis, 2ª edición revisada (Springer.Verlag, 1988 y 1993. Alternativamente, pueden utilizarse técnicas múltiples simultáneas de síntesis peptídica (SMPS), bien conocidas en la técnica. Los péptidos preparados mediante el procedimiento de Merrifield pueden sintetizarse utilizando un sintetizador peptídico automático tal como el Sintetizador Peptídico 431A-01 de Applied Biosystems (Mountain View, CA), o utilizando la técnica manual de síntesis peptídica descrita por Hougten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:5131 (1985).

Los péptidos pueden sintetizarse utilizando aminoácidos o análogos de éstos, cuyos grupos activos están protegidos lo necesario, utilizando, por ejemplo, un grupo t-butildicarbonato (t-BOC) o un grupo fluoronilmetoxi carbonilo (FMOC). Los aminoácidos o sus análogos pueden obtenerse comercialmente (Sigma Chemical Co; Advanced Chemtec) o sintetizarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los péptidos sintetizados utilizando el procedimiento en fase sólida pueden unirse a resinas, que incluyen la 4-metil-benzidrilamina (MBHA), la 4-(oximetil)-fenilacetamido metilo y la 4-(hidroximetil)fenoximetil-copoli (estireno al 1%-divinilbenceno) (resina Wang), todas las cuales están comercialmente disponibles, o el polímero p-nitrobenzofenona oxima (resina oxímica), que puede sintetizarse tal como se describe por De Grado y Kaiser, J.Org. Chem. 47:3258 (1982).

En los péptidos que se mencionan como ejemplos, la expresión "Ac" indica un grupo acetilo en el extremo amino y la expresión "NH_{2}"_{ }significa un grupo amida en el extremo carboxilo. Los péptidos pueden manipularse, por ejemplo, mientras están todavía unidos a una resina para obtener compuestos modificados en el extremo N-terminal, o pueden liberarse de la resina utilizando fluoruro de hidrógeno o un reactivo equivalente de fragmentación, modificándolo entonces. Los compuestos sintetizados que contienen el grupo carboxilo C-terminal (resina Wang) pueden modificarse después de liberación a partir de la resina, o, en algunos casos antes de la síntesis en fase de solución._{ }Los procedimientos para modificar el extremo N o el extremo C tales como procedimientos para la acetilación del extremo N, o procedimientos para la amidación del extremo C, son bien conocidos en la técnica.

Un péptido sintetizado de nuevo puede purificarse utilizando un procedimiento tal como la cromatografía líquida de fase inversa de alta resolución (RP-HPLC), el cromatoenfoque, u otros procedimientos de separación basados en el tamaño o carga del péptido, o mediante técnicas de inmuno-purificación. Además, el péptido purificado puede caracterizarse utilizando estos y otros procedimientos bien conocidos, tales como el análisis aminoácidos y la espectrometría de masas.

Después de la preparación, los péptidos pueden ensayarse con respecto a la actividad de unión al receptor K, utilizando el ensayo del radioreceptor K, tal como se da a conocer en el Ejemplo 1. Para datos adicionales con respecto a la especificidad de los péptidos, los resultados a partir del ensayo del radioreceptor K pueden compararse con los de los ensayos del radioreceptor \mu y \sigma, tal como se dan a conocer en el Ejemplo II. Para probar la actividad agonista o antagonista in vitro de los péptidos, pueden llevarse a cabo ensayos in vivo rutinariamente, tales como el ensayo en el íleo de cobaya, tal como se describe en el Ejemplo III. Además, se conocen en la técnica algunos otros ensayos in vivo fidedignos que son útiles para ensayar los péptidos opiáceos y las composiciones de la presente invención. Ensayos que se mencionan a título de ejemplo incluyen los de las sacudidas de la cola del ratón, los ensayos de pellizcado de la cola y de su retorcimiento con HCl, así como los ensayos de calentamiento de la placa de la rata, y los ensayos de inmersión, movimientos de la cola del ratón y de su retorcimiento con aire todos los cuales se dan a conocer en Vonvoigtlander et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 224 (1):7-12 (1983). Uno de los ensayos más utilizados habitualmente, de los que se han descrito anteriormente, el modelo animal in vivo del movimiento de la cola del ratón, es asimismo descrito por Dixon et al., Drug Res., 27:1968 (1977), Jiang et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 262:526 (1992), y Dooley et al., Science, 266:2019 (1994).

A causa de que los péptidos de la presente invención se unen al receptor K, pueden utilizarse en ensayos in vitro para estudiar los subtipos de receptores opiáceos. Por ejemplo, en un receptor de tipo u origen desconocido de la muestra, los péptidos, después de haber sido marcados con un marcador detectable tal como un radioisótopo, pueden ponerse en contacto con la muestra del receptor bajo condiciones que favorezcan específicamente la unión a un subtipo de receptor particular, tal como el subtipo K. El receptor no unido y el péptido pueden eliminarse, por ejemplo, lavando con una solución salina, y el receptor unido puede entonces detectarse utilizando procedimientos bien conocidos para los expertos en la materia. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención son útiles in vitro para el diagnóstico de subtipos pertinentes de receptores opiáceos, y en particular del tipo K, en el cerebro y en otras muestras tisulares.

Además de su utilidad en los procedimientos de rastreo in vitro, los péptidos son útiles también in vivo. Por ejemplo, los péptidos opiáceos pueden utilizarse diagnostícamente in vivo para localizar subtipos de receptores opiáceos. Los péptidos son útiles asimismo como medicamentos, principalmente como analgésicos, o para tratar patologías asociadas con otros compuestos que interaccionan con el sistema receptor de los opiáceo. Por tanto, los péptidos de la presente invención pueden utilizarse en medicamentos para tratar patologías asociadas con un receptor K y como analgésicos. Por ejemplo, puede preverse que estos péptidos pueden utilizarse con propósitos terapéuticos para bloquear los efectos periféricos de un agente que elimine el dolor y que actúe centralmente. Por ejemplo, la morfina es un agente que elimina centralmente el dolor. La morfina, sin embargo, presenta diversos efectos perjudiciales en la periferia que no son necesarios para los efectos analgésicos deseados, tal como estreñimiento y prurito (picor). Aunque se sabe que muchos péptidos no atraviesan fácilmente la barrera hemato-encefálica, y, por tanto, no provocan efectos centrales, los péptidos pueden servir para bloquear los efectos periféricos de la morfina, tal como el picor y el estreñimiento.

Los nuevos péptidos que se reivindican pueden incorporarse a composiciones farmacéuticas. En la técnica, se conocen bien los transportadores farmacéuticamente aceptables e incluyen soluciones acuosas tales como soluciones salinas tamponadas fisiológicamente u otros tampones o disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como el aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables. Un transportador farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúen, por ejemplo, estabilizando el péptido opiáceo o aumenten su absorción. Dichos compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. El experto en la materia sabrá que la selección de un transportador farmacéuticamente aceptable, que incluye un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración y de las características físico-químicas particulares del péptido opiáceo específico.

Los procedimientos para administrar un medicamento son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a la administración oral, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. La administración puede llevarse a cabo continua o intermitentemente, y variará con el individuo, dependiendo del tipo de tratamiento y de la potencia del péptido que se haya utilizado.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar y no a limitar la presente invención.

Ejemplo I Identificación de péptidos opiáceos selectivos Kappa mediante un ensayo radioreceptor

Este ejemplo describe la identificación de péptidos individuales como inhibidores del ligando [H^{3}]-U69, 593., K-selectivo. Los péptidos individuales se identificaron como capaces de inhibir [H^{3}]-U69, 593 mediante un ensayo radioreceptor.

Bibliotecas sintéticas combinatorias (SCLs) obtenidas mediante mezclas de decenas de millones de péptidos distintos, pueden utilizarse para identificar rápidamente compuestos activos individuales. Ya que las bibliotecas están en solución (es decir, no unidas a una perla, alfiler, fago, cristal, etc), pueden rastrearse virtualmente en cualquier sistema de ensayo. Se prepararon inicialmente todos los péptidos opiáceos y se dispusieron en el interior de una biblioteca sintética combinatoria de rastreo posicional (PS-SCL). Las bibliotecas pueden utilizarse a la vez que un procedimiento iterativo de selección para identificar péptidos individuales capaces de inhibir [H^{3}]-U69, 593 en el ensayo radioreceptor.

Tal como se detalla a continuación, las bibliotecas de péptidos se rastrearon en un ensayo radioreceptor, utilizando homogenados de cerebro de rata y [H3]-U69, 593 como radioligando y se determinaron los valores Ic_{50} para los péptidos que inhibieron significativamente la unión de_{ }[H3]-U69, 593.

Ensayos del radioreceptor selectivos para el receptor Kappa

A partir de Harlan Bioproducts for Science (Indianapolis, IN) se obtuvieron cerebros de cobayas congelados en nitrógeno líquido. Los cerebros congelados se descongelaron, extrayéndose y pesándose cerebelos y córtex. Los córtex y cerebelos combinados se homogenizaron en 40 ml de tampón Tris-HCl (50 mm, pH 7,4, 40ºC) que contenía 100 \muM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 5 mM MgCl_{2}, y 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), y que se centrifugó (39000 x g) (Modelo J2-HC; Beckman Instruments, Fullerton, CA) durante 10 minutos a 4ºC. Los sedimentos se volvieron a suspender en tampón Tris-HCl recién preparado, incubándose a 37ºC durante 40 minutos. Después de la incubación, las suspensiones se centrifugaron como anteriormente, volviéndose a suspender los sedimentos resultantes en 100 volúmenes de tampón Tris, realizándose la combinación de las suspensiones. Se prepararon las suspensiones de las membranas y se utilizaron de la misma forma. El contenido proteico de los homogenados en bruto osciló entre 0,1 y 0,3 mg/ml, tal como se determinó mediante el procedimiento descrito por Bradford en Anal. Biochem. 72.248-254 (1976).

Los ensayos de unión se llevaron a cabo en tubos de ensayo de polipropileno. Cada tubo contenía 3 nM del ligando [^{3}H]-U69, 593 K-selectivo (actividad específica 62 Ci/mmol) (Amersham; Arlington Heights, IL), una concentración de la mezcla peptídica (del orden de 3 x 10^{4} a 3 x 10^{5} M para los péptidos individuales en la mezcla), y homogenados tisulares preparados a partir de los cerebros de los cobayas (córtex y cerebelos) utilizando tampón Tris que contenía 100 \muM PMSF, 5 nM MgCl_{2} y 1 mg/ml BSA, pH 7,4. Los tubos de ensayo se incubaron durante 2,5 horas a 25ºC. La reacción se finalizó mediante filtración a través de filtros GF-B (Wallac, Gaithesburg, MD). Los filtros se lavaron a continuación con 6 ml de tampón Tris-HCl a 4ºC. La radioactividad unida se evaluó en un Contador Placa-Beta de Centelleo Líquido (Life Technologies, Gaithersburg, MD), expresándose en contajes por minuto (cpm). Se prepararon curvas estándar utilizando 0,05-6300 nM de naloxona (Sigma, St. Louis, MO). Se llevaron a cabo ensayos de inhibición competitiva como anteriormente, utilizando diluciones en serie de las mezclas peptídicas. Los valores IC_{50} se calcularon entonces utilizando el programa GRAPHPAD (ISI, San Diego, CA) La desviación promedio estándar para los valores IC_{50} fue \pm 20%.

Los valores IC_{50} de menos de 1000 nM indican péptidos opiáceos muy activos que se unen al receptor K, con compuestos particularmente activos con valores IC_{50} de 100 nM o menores, y los compuestos más activos con valores de menos de 10 nM.

Los péptidos opiáceos que se identificaron a partir del rastreo del ensayo de una SCL tienen la estructura general Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2} (SEC ID nº 28), en la que A1 es Tyr o Arg, B2 es Arg o Phe, y C3 es Thr, Phe o Met. Los valores IC_{50} de los péptidos que están comprendidos dentro del alcance de esta fórmula se proporcionan en la Tabla 1.

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Los resultados de la Tabla 1 anterior proporcionan una serie estructuralmente única de péptidos opiáceos que son todos selectivos para el receptor opiáceo K.

Ejemplo II Especificidad del receptor kappa de los péptidos opiáceos

Este ejemplo demuestra cómo obtener datos adicionales con respecto a la especificidad de los nuevos péptidos opiáceos para los receptores K, cuando se comparan con los receptores opiáceos \mu y \sigma.

Los péptidos individuales puede sintetizarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como se consideró anteriormente. La actividad de los péptidos sintetizados individuales, en los ensayos de radioreceptores selectivos para los receptores \mu y \sigma, tal como se detalla a continuación, puede compararse con los resultados del ensayo de radioreceptores selectivos para los receptores del Ejemplo 1.

Los ensayos de radioreceptores selectivos para los receptores \mu pueden llevarse a cabo utilizando homogenados cerebrales de rata como anteriormente. Los tubos de polipropileno de las muestras se preparan de forma que contengan aproximadamente 0,5 ml de suspensión de membranas, 3 nM del péptido opiáceo [^{3}H]-DAMGO selectivo de \mu (actividad específica 36 Ci/mmol), 0,08 mg/ml de mezcla peptídica y tampón Tris-HCl en un volumen total de 0,65 ml. Los tubos de ensayo se incuban generalmente durante 60 minutos a 25ºC y la reacción se finaliza mediante filtración, a través, por ejemplo, de filtros GF-B. Los filtros se lavan a continuación con 6 ml de tampón Tris-HCl a 4ºC. La radioactividad unida se evaluó entonces, por ejemplo, en un Contador Placa-Beta de Centelleo Líquido (Life Technologies, Gaithersburg, MD), expresándose en contajes por minuto (cpm). Se pueden determinar las curvas estándar incubando [^{3}H] -DAMGO en presencia de 0,13-3900 nM de DAMGO no marcado.

Los ensayos del radioreceptor selectivos para los receptores \sigma pueden llevarse a cabo utilizando homogenados cerebrales de rata como anteriormente y [^{3}H] naltrindol (0,5 nM, actividad específica 34,7 Ci/mmol) como radioligando en tampón Tris conteniendo 100 \muM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 5 mM MgCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina sérica (BSA), pH 7,4. Las muestras se incubaron generalmente durante un periodo de 2,5 horas. Las curvas estándar se prepararon utilizando 0,10-3200 nM de [^{3}H]-D-Pen_{2}, Pen_{5}] encefalina ([^{3}H]-DPDPE). Las demás etapas son tal como se ha descrito anteriormente.

Los ligandos tritiados, [^{3}H]-DAMGO y [^{3}H]-DPDPE, pueden obtenerse a partir del depósito del Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (National Institute on Drug Abuse), preparados por Multiple Peptide Systems (San Diego, CA), y el [^{3}H]-naltrindol a partir de DuPont NEN Research Products (Los Angeles, CA). La desviación media estándar para los valores IC_{5}0 fue de \pm 20%.

Los datos comparativos en los respectivos ensayos de los radioreceptores k, \mu y \sigma, pueden demostrar además la selectividad de los nuevos péptidos opiáceos para los receptores K con respecto a los receptores opiáceos \mu y \sigma.

Ejemplo III Actividad agonista o antagonista del receptor Kappa mediante el ensayo del íleo de cobaya

Este ejemplo demuestra que ciertos nuevos péptidos opiáceos pueden identificarse como agonistas o antagonistas del receptor K mediante el ensayo del íleo del cobaya.

Ensayo del íleo del cobaya

Puede llevarse a cabo un ensayo biológico del íleo del cobaya (GPI) para determinar si un péptido es un agonista opiáceo Como antes, dicha información no puede determinarse a partir de los ensayos de unión al radioreceptor que se han descrito anteriormente.

El ensayo GPI (Kosterlitz et al., Br. J. Pharma. 39:398-418 (1970), constituye uno de los ensayos más ampliamente utilizado para la determinación de las actividades in vitro de los opiáceos. El ensayo se basa en la capacidad de los agonistas opiáceos para inhibir la contracción electricamente estimulada en los tejidos El GPI no es un ensayo "limpio", ya que la preparación de íleo contiene ambos receptores, \mu y K. Sin embargo, los efectos mediados por los receptores K en el GPI pueden distinguirse de los efectos mediados por los receptores \mu determinando los valores K_{e} para el antagonista (efectos K:K_{e} \sim 20-30 nM; efectos \mu: K_{e} \sim 1-3 nM) o bloqueando los receptores \mu con un antagonista específico de \mu, tal como el CTAP ((D) Tca-Cys-Tyr- (D)Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH_{2}, en el que Tca es un análogo (D)Trp cíclico).

Los cobayas se mataron por decapitación, se extrajeron los íleos y, en una solución de Krebs (NaCl 118 mM, KCl 4,75 mM, NaH_{2}PO_{4}, 1 mM, NaHCO_{3}, 25 mM, MgSO_{4}, 1,2 mM, glucosa 11 nM y CaCl_{2} 2,5 mM), se dispusieron preparaciones de plexos músculo-mientéricos longitudinales. La solución se gaseó con O_{2} al 95% y CO_{2} al 5%, manteniéndose a 37ºC. Se suspendió el tejido bajo una tensión final de 1 g en un baño orgánico de 10 ml y se estabilizó durante 1 hora. Se aplicó una estimulación eléctrica mediante un electrodo recto de platino, de impulsos de 0,4 ms de voltaje supramáximo, suministrados a un ritmo de 0,1 Hz. A continuación se midieron las contracciones isométricas mediante transductores de fuerza indicadores tensionales, conservándose en grabadores provistos de una cinta.

Claims

1. Péptido que presenta la estructura:

Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 28),

en la que

A1 es Tyr o Arg,

B2 es Arg o Phe, y

C3 es Thr, Phe o Met.

2. Péptido según la reivindicación 1, que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por

Ac-Tyr-Arg-Thr-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 1); Ac-Tyr-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 2); Ac-Arg-Phe-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 3); Ac-Tyr-Arg-Met-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 4); y Ac-Arg-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH_{2}, (SEC ID nº 5).