ES2300358T3

ES2300358T3 - Procedimiento para la precipitacion de monocapas y capas multiples de acidos organofosforicos y organofosfonicos y sus sales, asi como su uso.

Info

Publication number: ES2300358T3
Application number: ES01969680T
Authority: ES
Inventors: Rolf Hofer; Michael Pawlak; Marcus Textor; Eveline Schurmann-Mader; Markus Ehrat; Samuele Tosatti
Original assignee: Bayer Technology Services GmbH
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-09-05
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2021-08-31
Also published as: ATE386268T1; US7740896B2; DE50113602D1; WO2002020873A3; US20090061506A1; AU2001289859A1; WO2002020873A2; US7517546B2; EP1315968B1; US20030186914A1; US20100280601A1; US8034395B2; EP1315968A2

Abstract

procedimiento para la precipitación de monocapas o capas múltiples de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I(A) Y-B-OPO3H2 (IA) o de ácidos organofosfónicos de la fórmula general I(B) Y-B-PO3H2 (IB) y sus sales, en las que B significa un resto alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hetarilo o hetarilalquilo y Y hidrógeno o un grupo funcional de la serie de hidroxi, carboxi, amino, monoalquilamino o dialquilamino eventualmente sustituidos por alquilo inferior, tiol o un grupo ácido negativo de la serie éster, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, maleimida, succinimidilo, epoxi, acrilato, pudiendo acoplado a B o Y mediante reacción de adición o sustitución un elemento de reconocimiento biológico, bioquímico o sintético, pudiendo estar adicionados también compuestos que confieren a la superficie del sustrato una resistencia contra la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular y en B eventualmente pueden estar contenidos en la cadena en lugar de uno o más grupos -CH2- uno o más grupos óxido de etileno, sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos puros o mixtos de metales y semiconductores, caracterizado porque para el tratamiento de estas superficies, en especial como superficies de plataformas sensoras, implantes y aparatos auxiliares médicos, se usan sales hidrosolubles de un compuesto de la fórmula (IA) o (IB) en solución acuosa.

Description

Procedimiento para la precipitación de monocapas y capas múltiples de ácidos organofosfóricos y organofosfónicos y sus sales, así como su uso.

La invención se refiere a un procedimiento para la precipitación de monocapas o capas múltiples de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I(A)

(IA)Y-B-OPO_{3}H_{2}

o de ácidos organofosfónicos de la fórmula general I(B)

(IB)Y-B-PO_{3}H_{2}

y sus sales, en las que B significa un resto alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hetarilo o hetarilalquilo y Y hidrógeno o un grupo funcional de la serie de hidroxi, carboxi, amino, monoalquilamino o dialquilamino eventualmente sustituidos por alquilo inferior, tiol o un grupo ácido negativo de la serie éster, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, maleimida, succinimidilo, epoxi, acrilato, pudiendo estar acoplado a B o Y mediante reacción de adición o sustitución un elemento de reconocimiento biológico, bioquímico o sintético, pudiendo estar adicionados también compuestos que confieren a la superficie del sustrato una resistencia contra la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular y en B eventualmente pueden estar contenidos en la cadena en lugar de uno o más grupos -CH_{2}- uno o más grupos óxido de etileno, sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos puros o mixtos de metales y semiconductores, caracterizado porque para el tratamiento de estas superficies, en especial como superficies de plataformas sensoras, implantes y aparatos auxiliares médicos, se usan sales hidrosolubles de un compuesto de la fórmula (IA) o (IB) en solución acuosa. La invención se refiere además a su uso como parte de plataformas sensoras, implantes y aparatos auxiliares médicos recubiertos.

Las compuestos eventualmente sustituidas de las fórmulas (IA) y (IB) en las que los agrupamientos B e Y tienen los significados arriba indicados, es decir, significan conjuntamente alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hetarilo o hetarilo eventualmente sustituidos, se agruparán de ahora en adelante bajo las denominaciones de ácidos organofosfóricos o ácidos organofosfónicos.

Para la preparación de superficies sensoras con elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos inmovilizados sobre un denominado transductor para la fijación altamente eficaz y altamente selectiva de uno o varios analitos que hay que detectar en una muestra, la naturaleza de la superficie del transductor tiene una gran importancia. Para alcanzar los máximos límites de detección posibles, es deseable inmovilizar en un pequeño espacio cuantos más elementos de reconocimiento sea posible a los que en el posterior procedimiento de detección se podrán fijar cuantas más moléculas de analito de un tipo sea posible. Al mismo tiempo, es deseable mantener en la inmovilización la reactividad y la funcionalidad biológica o bioquímica de los elementos de reconocimiento en la mayor medida posible, es decir, minimizar cualquier fenómeno de desnaturalización a consecuencia de la inmovilización. Otro objetivo es impedir en la mayor medida posible la fijación o la absorción inespecíficas de moléculas de analito, que en muchos casos actúan limitando los límites de detección que pueden alcanzarse. Para conseguir estos objetivos se ha desarrollado toda una serie de métodos distintos para la modificación química, con el fin de preparar superficies denominadas biocompatibles. Exigencias en parte similares se imponen en medicina a la naturaleza de las superficies de implantes.

En el campo de los implantes médicos, como p. ej. implantes dentales, articulaciones coxofemorales artificales o mallas intravasculares, o en aparatos biomédicos auxiliares como p. ej. catéteres o endoscopios, la naturaleza de la superficie desempeña un papel importante para la funcionalidad de la pieza (B. Kasemo, J. Lausmaa, "Surface Science Aspects on Inorganic Biomaterials", CRC Crit. Rev. Biocomp. 2 (1986), 335-380). La principal causa es el hecho de que, tras una implantación en el cuerpo, la superficie del implante forma la interfaz entre el entorno biológico y el material alóctono, en la que tienen lugar procesos importantes tales como reacciones frente a cuerpos extraños, inflamaciones, adhesion celular y neoplasia de tejidos. Tiene especial importancia la adsorción de proteínas desde humores corporales (sangre, líquido intercelular, etc.), ya que estos procesos tienen lugar al poco tiempo de la implantación y controlan los otros procesos biológicamente importantes, en especial la acumulación de células. Las propiedades de la superficie del implante son decisivas al respecto ya que determinan directamente el tipo de las proteínas, su fuerza de enlace a la superficie y su conformación y orientación (B. Ratner, "New ideas in biomaterials science - a path to engineered biomaterials", J. Biomed. Mat. Res. 27 (1993), 837-850). Estas observaciones son válidas para las más diversas aplicaciones. Ejemplos en el campo de los implantes metálicos son:

1.: Componentes de acero, aleaciones de cobalto-cromo, titanio o aleaciones de titanio implantados de manera permanente o temporal en el área ósea, como p. ej. articulaciones coxofemorales artificiales, implantes en la raíz dental, placas o tornillos de osteosíntesis. Aquí se desea una adsorción de proteínas citoadheivas que influyen favorablemente sobre la integración de la pieza en el hueso (osteointegración).

2.: Piezas metálicas de acero, titanio o aleaciones de níquel-titanio que asumen funciones en contacto con sangre, como p. ej. las mallas intravasculares en las vías sanguíneas para impedir de modo permanente la oclusión de arterias o venas. Las piezas de este tipo deben presentar una compatibilidad con la sangre correspondiente a exigencias específicas. Se exige aquí a menudo una superficie del implante que sea resistente frente a la adsorción de proteínas y a la adhesión de las plaquetas y que constituya con ello una superficie que presente una tendencia escasa o nula a la formación de trombosis indeseadas.

3.: Piezas de titanio o acero que están en contacto con tejidos blandos, p. ej. en las aplicaciones de osteosíntesis para favorecer la curación de fracturas óseas o en el caso de los implantes dentales en la zona de contacto con la encía. Es deseable aquí a menudo que auque el tejido blando esté apretado contra el implante, no se produzca una unión firme.

Si se consigue ajustar selectivamente las superficies de los implantes de este tipo a las condiciones de uso, se puede influir favorablemente sobre los citados procesos y mejorarse con ello de manera decisiva la funcionalidad del implante. Existe toda una serie de características superficiales que de forma manifiesta o hipotética influyen sobre la compatibilidad con la aplicación específica en el cuerpo:

1.: La humectabilidad de la superficie o el rechazo del agua de la superficie (hidrofilidad/hidrofobicidad de la superficie, medido p. ej. como ángulo de contacto frente al agua), que está relacionado con la energía superficial. Puede resultar ventajoso a este respecto ajustar para una aplicación determinada una humectabilidad ideal frente al agua.

2.: La carga de la superficie (positiva, negativa o sin carga) muestra una fuerte influencia sobre el comportamiento de las células en la superficie del implante, por ejemplo frente a los osteoblastos (J. E. Davies, B. Causton, Y. Bovell, K. Davy, C. S. Sturt, "The migration of Osteoblasts Over Substrata of Discrete Surface-Charge", Biomaterials, Vol. 7 (1986), 231-233; R. M. Shelton, I. M. Whyte, J. E. Davies, "Interaction between Primary Bone Cell and Biomaterials. Part 4: Colonization of Charged Polymer Surfaces"; Biomaterials and clinical applications: proceedings of the Sisth European Conference on Biomaterials, Bolonia, Italia, 14-17 septiembre 1986; Elsevier; 1987; 597-602).

3.: La presencia de grupos funcionales o moléculas biológicas que se aplican sobre la superficie del implante y que después de la implantación inflluyen sobre el acontecer biológico en la superficie. Pertenecen a ellos p. ej. péptidos, proteínas o factores de crecimiento específicos (S.-J. Xiao, M. Textor, N.D. Spencer, H. Sigrist, "Covalent Attachment of Cell-Adhesive, RGF-Containing Peptides on Titanium Surfaces", Langmuir 14 (1998), 5508-16, 1998).

4.: La presencia en la superficie de moléculas refractarias a las proteínas, como p. ej. óxido de polietileno, polietilenglicol o heparina.

Las propiedades químicas de la superficie de los implantes comerciales no están a menudo optimizadas hacia la aplicación en la medida que sería deseable para el uso médico. Además, en su fabricación comercial con frecuencia sólo se controla de modo incompleto. Se han detectado impurezas que son consecuencia de las condiciones de tratamiento o almacenamiento. Las impurezas de este tipo son potencialmente dañinas para el uso en el cuerpo. Además, por lo general no son constantes entre las distintas tandas de fabricación o a lo largo del tiempo de almacenamiento y constituyen un riesgo en lo que respecta a la garantía de calidad de los productos médicos. Resultan especialmente afectados los implantes metálicos como p. ej. los de acero u otras aleaciones de hierro, titanio y sus aleaciones (TiAlV, TiAlNb, etc.), aleaciones de cobalto-cromo (CoCr, CoCrMo), que están cubiertos de una delgada capa natural de óxido de elevada energía superficial y que son especialmente sensibles a la contaminación por el entorno (p. ej. debido a la adsorción de componentes orgánicos procedentes del aire, tales como hidrocarburos, alcoholes, etc., o debido a la adsorción a partir de líquidos (adsorción de aceites de silicona, etc.)).

El objetivo de la invención es facilitar un procedimiento de este tipo para el tratamiento de las superficies, especialmente de óxidos, nitruros o carburos de metales o semiconductores o sus mezclas o bien metales o semiconductores cubiertos de óxido, usando capas sencillas o múltiples de los correspondientes ácidos organofosfóricos u organofosfónicos antes definidos o sus derivados, en especial sus sales, que origine superficies que presenten composiciones químicas reproducibles y adapte a medida las propiedades de estas superficies para el caso de aplicación especial en el campo de los biomateriales/implantes o en el campo de la biosensórica.

En los documentos US 5,997,621 y US 5,873,931 se describen mezclas de recubrimiento y procedimientos para el recubrimiento antirreflexión y antimoho de superficies. Se menciona el uso de una serie de diferentes anfífilos pero su combinación con óxidos metálicos porosos, tal como se presentan por ejemplo en una dispersión, sólo sirve para formar una red de óxidos metálicos y anfífilos que se aplica después por su parte sobre la superficie que hay que recubrir. No se encuentran indicaciones sobre un recubrimiento con anfífilos en un proceso de autoorganización (formación de "self assembled monolayer").

En el documento US 5,922,550 se describe la transferencia de monocapas autoorganizadas sobre películas de plástico con recubrimiento metálico mediante un procedimiento de estampillado, acumulándose receptores específicos del analito en las monocapas que hay que transferir. No se describen sustratos macizos u otros materiales como soportes de la capa metálica (de oro, plata, aluminio, cromo, cobre, circonio, platino y níquel, así como sus óxidos).

No se menciona en especial un proceso de precipitación de la SAM sobre una película de óxido metálico, que sería adecuado como guía de ondas óptico conforme a una forma de realización preferida de nuestro procedimiento según la invención. Aunque se mencionan fosfonatos alquílicos o ácidos alquilfosfónicos, no se mencionan fosfatos alquílicos o ácidos alquilfosfóricos.

El uso de sal amónica de dodecilfosfato (sal amónica de DDPO_{4}, DDPO_{4}(NH_{4})_{2}) se describe en una serie de patentes (por ejemplo US 4,005,173; US 4,491,531; US 4,838,556; US 5,873,931; US 5,997,621), sin embargo no su uso para la formación de una monocapa autoorganizada sobre un sustrato macroscópico mediante precipitación a partir de una solución acuosa.

En J. G. van Alsten "Self-assembled monolayers on engineering metals: structure, derivatization and utility", Langmuir 15 (1999) 7605-14, se describe la precipitación de SAM basada en ácidos alquilfosfónicos a partir de soluciones acuosas y alcohólicas sobre los denominados "engineering metals" (acero, aluminio, cobre, latón), aunque no la formación de SAM basada en ácidos alquilfosfóricos o sus derivados.

En el documento WO 98/29580 se describe un procedimiento para el tratamiento de superficies metálicas de cinc, magnesio, aluminio o sus aleaciones mediante pulverización, inmersión o laminación para mejorar la adherencia y la resistencia a la corrosión de productos barnizados y recubiertos de plásticos. Se describen ácidos alquilfosfóricos o ácidos alquilfosfónicos y sus derivados respectivamente con 2-50 átomos de carbono en la cadena alquílica y distintos grupos funcionales terminales. La precipitación se produce a partir de una solución acuosa, aumentándose la solubilidad de algunos de estos compuestos mediante la adición de disolventes orgánicos. No se describen los ácidos fosfónicos con grupo metilo terminal poco hidrosolubles, como p. ej. ácido dodecano-1-fosfónico o ácido octadecano 1-fosfórico. Por el contrario, se describen las moléculas con terminación hidroxi como p. ej. el ácido 12-hidroxidodecano-1-fosfórico. La aplicación de esta clase de moléculas está limitada a los metales anteriormente indicados y según el tratamiento de la superficie se aplica encima una capa cobertora orgánica y compacta adicional, p. ej. un barniz o plástico. Por lo tanto, la capa metálica modificada por ejemplo con ácidos alquilfosfóricos o alquilfosfónicos o sus derivados no sirve nunca como capa más exterior expuesta al entorno.

Desde hace algunos años se modifican superficies por medio de las llamadas monocapas autoorganizadas ("self-assembled monolayers", de ahora en adelante abreviadas como "SAM"). Se trata de capas monomoleculares muy delgadas que se forman espontáneamente al ponerse en contacto una superficie con una solución de la correspondiente molécula y que se caracterizan por una estructura ordenada de las moléculas. Las más conocidas son los alquiltioles de cadena larga, cuyas SAM se forman sobre superficies de oro (R. G. Nuzzo, F. A. Fusco, D. L. Allara, "Spontaneously Organized Molecular Assemblies .3. Preparation and Properties of Solution Adsorbed Monolayers of Organic Disulfices On Gold Surfaces"; Journal of American Chemical Society, 109 (1987), 2358-2368)). Aunque las superficies de oro/alquiltiol-SAM de este tipo se aplican en el campo de la biomedicina como superficies modelo gracias a las propiedades superficiales químicas perfectamente controladas, para la fabricación de implantes carecen de importancia ya que en este campo de aplicación el oro posee sólo una relevancia secundaria.

Por el contrario, las superficies de oro desempeñan un mayor papel en la bioanalítica. Por ejemplo, el fenómeno de la resonancia de plasmón superficial es característico de un determinado tipo de películas metálicas delgadas, en especial de oro. Por ese motivo, en los pasados años las modificaciones superficiales mediante la preparación de SAM a partir de alquiltioles encontraron aplicación especialmente aquí. Por otro lado, se demostró que los fosfatos de alquilo se adsorben en superficies oxídicas. Esto se demostró por primera vez sobre superficies de mica (J. T. Woodward et al., Langmuir 12 (1996) 6429) así como sobre superficies de aluminio (D. L. Allara, R. G. Nuzzo, "Spontaneously Organized Molecular Assemblies .1. Formation, Dynamics, and Physical-Properties of Normal-Alkanoic Acids Adsorbed From Solution On an Oxidized Aluminium Surface", Langmuir 1 (1985), 45-52; D. L. Allara, R. G. Nuzzo, "Spontaneously Organized Molecular Assemblies .2. Quantitative Infrared Spectroscopic Determination of Equilibrium Structures of Solution-Adsorbed Normal-Alkanoic Acids On an Oxidized Aluminium Surface", Langmuir 1 (1985), 52-66; I. Maege, E. Jaehne, A. Henke, H.-P. Adler, C. Bram, C. Jung, M. Stratmen, Macromol. Symp. 126 (1997), 7-24). Las monocapas formadas sobre mica, sin embargo, eran poco estables y por consiguiente de escasa relevancia para aplicaciones técnicas. Se descubrió, por el contrario, que octadecilfosfato forma sobre óxido de tántalo (Ta_{2}O_{5}) SAM que son estructuralmente muy similares a las de tioles sobre oro y que además son considerablemente más estables que sobre mica (M. Textor, L. Ruiz, R. Hofer, A. Rossi, K. Feldman, G. Hähner, N. D. Spencer, "Structural Chemistry of Self-Assembled Monolayers of Octadecylphosphoric Acid on Tantalum Oxide Surfaces" Langmuir 16 (2000), 3257-3271; D. Brovelli, G. Hähner, L. Ruiz, R. Hofer, G. Kraus, A. Waldner, J. Schlösser, P. Oroszlan, M. Ehrat, N. D. Spencer, "Highly Oriented, Self-Assembled Alkanephosphate Monolayers on Tantalum(V) Oxide Surface", Langmuir 15 (1999), 4324-4327). La técnica de las capas autoorganizadas a partir de octadecilfosfato permite hacer extremadamente hidrófoba (ángulo de contacto frente al agua: 112-115º) a la superficie de óxido de tántalo gracias a la estructura ordenada de las cadenas de alquilo hidrófobas (Fig. 1 y 2).

Ya que por ejemplo los fosfatos de alquilo en los que B e Y tienen los significados anteriormente indicados pueden dotarse fundamentalmente también con otros grupos terminales distintos a metilo, p. ej. con hidroxilo (-OH), amina (-NH_{2}) o carboxilo (-COOH), la técnica ofrece naturalmente la posibilidad de tratar químicamente de manera selectiva superficies de implantes médicos o sensores (ópticos) recubiertos de óxido y mantener estables y adaptar a medida del caso de uso las propiedades químicas de las superficies.

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Estas capas de fosfato de alquilo ordenadas sobre óxido de tántalo se prepararon poniendo en contacto las superficies oxidadas con una solución del fosfato de alquilo a base de disolventes orgánicos (heptano/isopropanol). Por ese motivo no pudieron usarse soluciones acuosas ya que estos fosfatos de alquilo de cadena larga no son suficientemente hidrosolubles.

Aunque los fosfatos de alquilo de cadena corta serían suficientemente hidrosolubles, apenas forman capas SAM ordenadas ya que para la formación de cadenas orientadas y orden se requieren las interacciones entre las cadenas de alquilo largas dentro de la capa de adsorbato organizada.

Si el proceso de tratamiento de la superficie debe realizarse en disolventes orgánicos surgen problemas que al menos limitan mucho, si no imposibilitan por completo, las aplicaciones comerciales:

1.: Este tipo de modificación está limitado a superficies de sustratos cuyos materiales presentan una resistencia frente a disolventes orgánicos suficientemente alta. Por ejemplo, casi hay que excluir un proceso de este tipo de modificación de la superficie de películas metálicas o de óxido metálico sobre sustratos de plástico.

2.: El uso de disolventes orgánicos volátiles va unido a emisiones que contaminan el puesto de trabajo, el entorno y la atmósfera. La legislación a este respecto se ha vuelto muy estricta en muchos países y en muchas industrias ha conducido a que tales disolventes hayan sido sustituidos totalmente por procesos que no causan problemas medioambientales o muy pocos.

3.: Si hay que eliminar estas emisiones hay que calcular un elevado gasto adicional (instalaciones cerradas, depuración de aire de salida, recuperación del disolvente). Con ello se generan costes más elevados que a menudo empeoran tanto el balance económico de los procesos de este tipo que los hace poco atractivos para una producción comercial.

4.: Específicamente en el caso de los biomateriales e implantes, los disolventes orgánicos tienen la desventaja agravante de que a menudo tienen un efecto tóxico sobre las células o influyen negativamente sobre el desarrollo de células y tejidos. Ya que las capas SAM de este tipo obtenidas a partir de disolventes orgánicos nunca están libres al cien por ciento de disolventes orgánicos, existe siempre el riesgo de que las moléculas volátiles orgánicas que quedan en la capa SAM actúen después negativamente en el cuerpo.

5.: A menudo hay que contar con que las propiedades específicas deseadas no pueden conseguirse mediante un único tipo de moléculas, sino que exigen el empleo de una mezcla de moléculas SAM. Ya que las distintas SAM tienen solubilidad muy diferente en disolventes orgánicos (en especial en grupos terminales \omega de distinta polaridad), a menudo es difícil o imposible encontrar un único disolvente que permita la preparación de una mezcla de ambas (o más) moléculas para la precipitación de una capa SAM mixta.

Según la presente invención, se ha puesto como objetivo eliminar las desventajas anteriormente indicadas en la preparación de capas SAM basadas en los organofosfatos u organofosfonatos o sus derivados anteriormente definidos, en especial sales, organofosfatos funcionalizados o los correspondientes fosfonatos, y desarrollar un procedimiento que permita la formación de capas SAN bien definidas sobre una serie de superficies de metal, semiconductor, óxido, carburo o nitruro sin usar disolventes así como que permita la preparación de capas que consten de dos o más organofosfatos u organofosfonatos funcionalizados y/o no funcionalizados distintos.

(IA)Y-B-OPO_{3}H_{2}

o de ácidos organofosfónicos de la fórmula general I(B)

(IB)Y-B-PO_{3}H_{2}

y sus sales, en las que B significa un resto alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hetarilo o hetarilalquilo e Y significa hidrógeno o un grupo funcional de la serie hidroxi, carboxi, amino, mono- o dialquilamino eventualmente sustituidos por alquilo inferior, tiol o un grupo ácido negativo de la serie éster, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, maleimida, succinimidilo, epoxi, acrilato, pudiendo estar aoplado a B o Y mediante reacción de adición o sustitución un elemento de reconocimiento biológico, bioquímico o sintético, pudiendo estar adicionados también compuestos que confieren a la superficie del sustrato una resistencia contra la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular y pudiendo en B estar contenidos en la cadena eventualmente en lugar de uno o más grupos -CH_{2}- uno o más grupos de óxido de etileno, sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos puros o mixtos de metales y semiconductores,

caracterizado porque para el tratamiento de estas superficies, en especial como superficies de placas sensoras, implantes y aparatos auxiliares médicos, se usan sales hidrosolubles de un compuesto de la fórmula (IA) o (IB) en solución acuosa. La invención se refiere además a su uso como parte de plataformas sensoras, implantes o aparatos auxiliares médicos recubiertos.

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La invención se refiere en primer lugar a procedimientos para la precipitación de monocapas o capas múltiples de ácidos organofosfóricos de la fórmula I(A) o de ácidos organofosfónicos de la fórmula I(B) y sus sales, en las que los grupos B e Y significan un grupo alquilo o un grupo alquilo de 2-24 átomos de C eventualmente sustituido.

La invención se refiere en especial a procedimientos para la precipitación de monocapas o capas múltiples de ácidos organofosfóricos de la fórmula I(A) o de ácidos organofosfónicos de la fórmula I(B) y sus sales en las que los grupos B e Y significan conjuntamente un grupo alquilo o un grupo alquilo de 2-12 átomos de C eventualmente sustituido.

Sin embargo, de especial importancia según el fin de uso pueden ser también procedimientos para la precipitación de monocapas o capas múltiples de ácidos organofosfóricos de la fórmula I(A) o de ácidos organofosfóricos de la fórmula I(B) y sus sales en las que los grupos B e Y significan conjuntamente un grupo alquilo o un grupo alquilo con 2-5 átomos de C eventualmente sustituido.

Como sustituyentes entran en consideración en primer lugar los enumerados bajo Y al principio.

Las capas preferidas, es decir, monocapas y capas múltiples de ácidos organofosfóricos de la fórmula I(A) y ácidos organofosfónicos de la fórmula I(B) sirven también para usar como parte de plataformas sensoras, implantes y aparatos médicos auxiliares recubiertos.

Según el fin de uso, se pueden usar preferentemente compuestos de la fórmula I(A) o I(B) con distintas longitudes de cadena, tal como se ha indicado anteriormente.

Alquilo es por ejemplo alquilo C2-C24, como etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo, eicosanilo, heneicosanilo, docosanilo, tricosanilo o tetracosanilo.

Alquenilo es por ejemplo etileno, propileno, butileno, pentileno, 2-metil-penteno-(1) y otros miembros superiores como por ejemplo hexadecenilo, heptadecenilo o también octadecenilo.

Alquinilo es por ejemplo etinilo, 2-propinilo, 2- o 3-butinilo o también miembros superiores como por ejemplo 4-pentinilo.

Arilo como tal es p. ej. fenilo o naftilo, como p. ej. 1- o 2-naftilo o fenilo o naftilo sustituidos, como p. ej. fenilo o naftilo que además de Y también están sustituidos adicionalmente por alquilo inferior, haloalquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, alcanoiloxi inferior, halógeno y/o ciano. Arilo es preferentemente fenilo no sustituido o sustituido tal como se ha indicado anteriormente, en especial fenilo.

Arilalquilo es preferentemente arilalquilo inferior, en especial fenilalquilo inferior, muy especialmente feniletilo o bencilo.

Alcoxi inferior es p. ej. n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi o tert-butoxi, preferentemente etoxi y sobre todo metoxi.

Alcanoiloxi inferior es por ejemplo propioniloxi o pivaloiloxi, preferentemente acetiloxi.

Halógeno es por ejemplo cloro o flúor, también bromo y yodo.

Haloalquilo inferior es por ejemplo 2- o 3-haloalquilo inferior, como por ejemplo 2-halopropilo, 3-halopropilo o 3-halo-2-metilpropilo.

Por hetarilo debe entenderse un resto de carácter aromático especialmente monocíclico, pero también bi- o policíclico. Hetarilo bi- o policíclico puede estar compuesto por varios anillos heterocíclicos o constar preferentemente de un heterociclo y uno o más, p. ej. uno o dos y especialmente un anillo carbocíclico condensado, en especial un anillo benzo. Cada anillo individual contiene p. ej. 3, 5, 6, 7 y especialmente 5 o 6 elementos.

Hetarilo representa en especial un resto aza-, tia-, oxa-, tiaza-, oxaza-, diaza y tetrazacíclico.

Hetarilo representa en primer lugar restos monoaza-, monotia- o monooxacíclicos monocíclicos, como por ejemplo 2-pirrilo o 3-pirrilo, piridilo, tienilo, p. ej. 2- o 3-tienilo, o furilo, p. ej. 2-furilo, restos monoaza-, monotia- o monotiacíclicos bicíclicos, p. ej. indolilo, p. ej. 2- o 3-indolilo, quinolinilo, p. ej. 2- o 4-quinolinilo, isoquinolilo, 1-isocninolino, benzofurano, p. ej. 2- o 3-benzofuranilo, o benzotienilo, p. ej. 2- o 3-benzotienilo, restos diaza-, triaza-, tetraza-, oxaza-, tiaza- o tiadiazacíclicos monocíclicos, como imidazolilo, p. ej. 2-imidazolilo, pirimidinilo, p. ej. 2- o 4-pirimidinilo, triazolilo, p. ej. 1,2,4-triazol-3-ilo, tetrazolilo, p. ej. 1- o 5-tetrazolilo, oxazolilo, p. ej. 2-oxazolilo, isoxazolilo, p. ej. 3- o 4-isoxazolilo, tiazolilo, p. ej. 2-tiazolilo, isotiazolilo, p. ej. 3- o 4-isotiazolilo o 1,2,4- o 1,3,4-tiadiazolilo, p. ej. 1,2,4-tiadiazol-3-ilo o 1,3,4-tiadiazol-2-ilo o restos diaza-, oxaza-, tiazacíclicos bicíclicos, como benzimidazolilo, p. ej. 2-benzimidazolilo, benzoxazolilo, p. ej. 2-benzoxazolilo o benzotiazolilo, p. ej. 2-benzotiazolilo.

Restos hetarilo son sustituyentes no sustituidos o básicos tal como se indican bajo arilo.

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Hetarilo es sobre todo piridilo, tienilo, piridilo o furilo.

Los restos hetarilalquilo se componen de los restos hetarilo arriba citados y los restos alquilo anteriormente citados.

Los ácidos organofosfóricos de la fórmula I(A) y organofosfónicos de la fórmula I(B) usados en el procedimiento según la invención pueden formar con bases sales, p. ej. sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos correspondientes, p. ej. sales de sodio, potasio o magnesio, además también sales de metales de transición, como sales de cinc y sales de cobre, o en especial sales con amoniaco o aminas orgánicas, como aminas cíclicas, como mono-, di- o trialquilaminas inferiores, como hidroxialquilaminas inferiores o polihidroxialquilaminas inferiores. Aminas cíclicas son p. ej. morfolina, tiomorfolina, piperidina o pirrolidina. Como monoalquilaminas inferiores entran en consideración por ejemplo etil- y tert.-butilamina, como dialquilaminas inferiores por ejemplo dietilpropilamina y diisopropilamina y como trialquilaminas por ejemplo trimetilamina y trietilamina, que forman sales amonio cuaternarias.

Hidroxialquilaminas inferiores correspondientes son p. ej. mono-, di- y trietanolamina, hidroxialquilaminas inferiores son p. ej. N,N-dimetil-mino- y N.N-dietilamino-etanol. Se incluyen además las ya mencionadas sales de transición que eventualmente son inadecuadas para el uso, aunque pueden usarse ventajosamente para el aislamiento o la depuración de ácidos organofosfóricos de la fórmula I(A) o ácidos organofosfónicos de la fórmula I(B).

También el sustituyente Y como grupo carboxilo puede formar sales básicas análogas.

Ácidos organofosfóricos de la fórmula general I(A) o ácidos organofosfónicos de la fórmula general I(B) pueden presentar como sustituyentes también un agrupamiento básico Y.

Por ejemplo, cuando Y significa amino o amino sustituido eventualmente por alquilo inferior o dialquilo inferior. Compuestos con un grupo básico Y pueden ser p. ej. sales de adición de ácidos con ácidos minerales adecuados, como hidrácidos de halógenos, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, p. ej. hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos de hidrógeno o fosfatos, sales con ácidos alifáticos o aromáticos o ácidos sulfámicos N-sustituidos adecuados, p. ej. metanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato o N-ciclohexilsulfaminato (ciclamato), o sales con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, como ácidos alcanocarboxílicos inferiores.

Objeto de la invención son también nuevos ácidos organofosfóricos de la fórmula

(IA)Y-B-OPO_{3}H_{2}

y

(IB)Y-B-PO_{3}H_{2}

en las que B e Y tienen los significados anteriormente indicados con la excepción del significado común de alquilo y sus sales.

La invención se refiere en especial a nuevos ácidos organofosfóricos de la fórmula I(A) y ácidos organofosfónicos de la fórmula I(B) en las cuales B e Y significan conjuntamente un arilo o un resto arilalquilo y sus sales.

Se da a conocer la preparación de una sal del ácido organofosfórico o ácido organofosfónico libres en agua, en otro disolvente o una mezcla y la simultánea o subsiguiente precipitación de la correspondiente sal introduciendo una base que forma el catión en la sal formada. La precipitación se produce de manera espontánea o bien tras un enfriamiento o concentración correspondientes de la solución. Como cationes se consideran todas las partículas con carga positiva habituales, como los metales alcalinos (p. ej. Na^{+}, K^{+}), los metales alcalinotérreos, amonio (NH_{4}^{+}) u otros iones amonio cuaternarios (como p. ej. tetrabutilamonio). La formación de la sal se produce introduciendo la correspondiente base acuosa (p. ej. KOH o NH_{4}OH) en la solución del ácido organofosfórico u organofosfónico, o introduciendo una base en un disolvente orgánico (p. ej. tetrabutilamonio hidróxido en solución alcohólica) en la solución de ácido organofosfórico u organofosfónico, o bien introduciendo una base (como p. ej. amoniaco o una amina volátil) volátil (gaseosa) a temperatura ambiente o a temperatura elevada en la solución del ácido organofosfórico u organofosfónico. El compuesto salino formado tiene entonces en la solución elegida una solubilidad insuficiente y precipita espontáneamente en forma de sal, o bien la precipitación se consigue mediante enfriamiento o concentrando el volumen de la solución. Se prefiere usar como sales de los compuestos de las fórmulas I(A) y/o I(B) en especial sales de sodio, potasio o amonio. Se prefiere en especial la formación de la sal de amonio, ya que en el posterior proceso de SAM el amonio no perturba en modo alguno la formación de la capa de SAM gracias a su escasa afinidad hacia las superficies.

Otra ventaja de estas sales para su uso en el procedimiento según la invención es el hecho de que al final se pueden purificar fácilmente mediante recristalización y liberar de las contaminaciones indeseadas de los ácidos libres.

Una característica importante del procedimiento según la invención es por lo tanto que antes de la precipitación de las citadas monocapas o capas múltiples, la sal hidrosoluble de un compuesto de las fórmulas I(A) y/o I(B) se aísla en solución acuosa.

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Aunque ya se ha descrito la preparación de la sal de amonio del ácido dodecanfosfórico (véase anteriormente), no se ha hecho para la aplicación como sal en un posterior proceso de SAM basado en una solución acuosa de la correspondiente sal.

El empleo según la invención de las sales formadas se refiere al uso de soluciones acuosas de la sal en el proceso de formación de las SAM para el tratamiento de superficies de óxido, carburo o nitruro tal que se ha especificado anteriormente. Por un lado se preparan capas SAM que están libres de las indeseadas contaminaciones con disolvente, por otro lado es muy sencillo preparar mezclas acuosas de varias sales de distintos organofosfatos y/o organofosfonatos funcionalizados y/o no funcionalizados.

Otra característica importante y ventajosa del procedimiento según la invención es, por lo tanto, que las mencionadas monocapas o capas múltiples de compuestos de la fórmula (IA) y/o (IB) están libres de disolventes orgánicos.

En el documento WO 98/29580 se describe igualmente la preparación de capas SAM a partir de solución acuosa de los derivados (solubles) de organofosfato u organofosfonato, así como la formación de sales de sodio y de potasio de los organofosfatos u organofosfonatos directamente en solución acuosa (véase anteriormente). Las diferencias con la presente invención son las siguientes:

1.: Según la descripción en el documento WO 98/29580, las sales no se aíslan sino que simplemente se prepara in situ. Con ello desaparece la posibilidad preferida de purificación mediante recristalización de la sal antes del uso como agente formador de SAM. Esta técnica permite además el ajuste muy controlado de la estequiometría de la solución de SAM que debe usarse.

2.: Las aplicaciones afectan a campos totalmente distintos con exigencias totalmente distintas (adherencia del barniz, protección contra la corrosión para productos barnizados) sobre otros materiales de sustrato (de cinc, aluminio, magnesio o sus aleaciones).

Como sustratos para la aplicación de las técnicas de tratamiento de superficies según la invención se toman en consideración los materiales/superficies siguientes: óxidos, nitruros o carburos de tántalo, niobio, titanio, vanadio, circonio, hafnio, molibdeno, wolframio, silicio o sus mezclas usados en forma de cuerpos macizos o como capas sobre sustratos discrecionales. Especialmente adecuados son metales o aleaciones de metales que presentan en la superficie una capa de óxido natural, que se forma espontáneamente o que se prepara artificialmente (p. ej. mediante anodización), tratándose preferentemente de los metales titanio, tántalo, niobio, vanadio, circonio, hafnio, molibdeno, wolframio, silicio o aleaciones de estos metales o semiconductores.

Para las aplicaciones en el campo de la biosensórica óptica, p. ej. para sensores basados en el principio de la técnica de conducción de ondas ópticas, tienen gran importancia a este respecto los óxidos ópticamente transparentes. Pertenecen a ellos en especial, pero no exclusivamente, óxidos metálicos con índice de refracción elevado tales como óxido de tántalo (Ta_{2}O_{5}), óxido de niobio (Nb_{2}O_{5}), óxido de titanio (TiO_{5}), óxido de circonio (ZrO_{5}) y mezclas de estos óxidos.

En el campo de los biomateriales cabe mencionar sobre todo los materiales oxidocerámicos como p. ej. óxido de aluminio (Al_{2}O_{3}) y óxido de circonio (ZrO_{5}). Puesto que los materiales metálicos con propiedades biocompatibles forman en la superficie prácticamente siempre una capa de óxido natural (capa pasiva, responsable de la resistencia a la corrosión y de la biocompatibilidad), la técnica según la invención puede aplicarse ventajosamente a toda una serie de materiales para implantes. Pueden citarse en este campo los materiales titanio (con superficie de TiO_{2}), niobio (con superficie Nb_{2}O_{5}), circonio (con superficie ZeO_{2}) y tántalo (con superficie Ta_{2}O_{5}). La técnica puede aplicarse también para aleaciones, en especial para Ti-Al-V, Ti-Al-Nb, Ti-Nb-Zr, Ti-Nb-Zr-Ta, aceros cromo-níquel (Fe-Cr-Ni, Fe-Ni-Mo), Co-Cr y Co-Cr-Mo.

Mientras que en el campo de la sensórica se emplean a menudo (aunque no exclusivamente, un ejemplo son los sensores basados en capilares) sustratos lisos y esencialmente planos, en el campo de los biomateriales o de los implantes tienen interés muchas veces las superficies rugosas o estructuradas topográficamente de manera selectiva, ya que en determinados casos concretos desencadenan en el cuerpo reacciones biológicas preferidas. En especial en el caso de los implantes metálicos para el área ósea (articulaciones coxo-femorales artificiales, implantes dentales, placas y tornillos de osteosíntesis) se usan a menudo superficies rugosas o hechas rugosas específicamente (Sittig 98). Las superficies de este tipo con topografía o porosidad superficial complejas plantean a menudo dificultades especiales cuando de lo que se trata es de un ajuste selectivo de propiedades químicas. La técnica según la invención de la formación de capas SAM basada en fosfatos de alquilo, alquilfosfonatos y sus derivados funcionalizados (véase también más adelante) abre posibilidades especialmente interesantes para funcionalizar las superficies metálicas rugosas complejas de este tipo, ya que la técnica es perfectamente aplicable también a superficie rugosas, estructuradas o porosas de metales cubiertos de óxidos y óxidos metálicos. Esto se explica con detalles en el
Ejemplo 2.

El procedimiento según la invención para la modificación de superficies es adecuado, pues, para sustratos que presentan una superficie casi lisa con baja rugosidad o también que poseen superficies rugosas, presentando eventualmente estas superficie una estructuración adicional.

En especial para las aplicaciones en la biosensórica se prefiere que se seleccionen como elementos de reconocimiento bioquímicos, biológicos o sintéticos (fijados a B o Y) aquellos del grupo de los ácidos nucleicos, como p. ej. ADN, ARN, oligonucleótidos, análogos de ácidos nucleicos, como p. ej. ANP, anticuerpos monoclonales o policlonales, péptidos, enzimas, aptámeros, estructuras peptídicas sintéticas, proteínas solubles unidas a membrana y aisladas a partir de una membrana, como p. ej. receptores, sus ligandos, antígenos para anticuerpos, biotina, "componentes de cola de histidina (tag-histidina)" y sus asociados de formación del complejo.

Por el contrario, especialmente para aplicaciones del procedimiento según la invención para la modificación de superficies biológicamente tolerable de implantes se prefiere que un elemento de reconocimiento biológicamente activo comprenda péptidos, proteínas, glicoproteínas, factor de crecimiento, como p. ej. TGF-\beta o MBP (Bone Morphogenic Protein).

Con el procedimiento según la invención también es posible preparar superficies hidrófobas que, por ejemplo, mediante contacto con albúminas (por ejemplo albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero de bovino (BSA)) pueden pasivizarse para conseguir una superficie resistente a las proteínas. Esto puede ser importante para aplicaciones por ejemplo en el campo de los dispositivos en contacto con sangre (compatibilidad sanguínea, evitación de adsorción de plaquetas y formación de trombos).

Para ello puede estar adicionado ventajosamente en B o Y un compuesto que confiera a la superficie del sustrato una resistencia frente a la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular, seleccionándose preferentemente este compuesto del grupo de compuestos formados por oligo(óxido de etileno), fosforilcolina, heparina, sacáridos, albúminas, en especial albúmina de suero de bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos inespecíficos, policlonales o monoclonales, de distinta especie o empíricos para el o los analitos que hay que detectar (en especial para inmunoensayos), detergentes -como por ejemplo Tween 20-, ADN natural o sintético fragmentado que no hibrida con polinucleótidos que haya que analizar, como por ejemplo un extracto de esperma de arenque o de salmón (en especial para ensayos de hibridación de polinucleótidos), o también polímeros no cargados pero hidrófilos como por ejemplo polietilenglicol o dextrano. Grupos como el oligo(óxido de etileno) muestran un comportamiento especialmente bueno con respecto a la resistencia a las proteínas y ya se han descrito en el caso de otros sistemas, p. ej. SAM basadas en tiol sobre superficies de oro (P. Harder, M. Grunze, R. Dahint, G. M. Whitesides, P. E. Laibinis, J. Phys. Chem. B, 102 (1998), 426-436). Aplicaciones típicas sirven por ejemplo para mejorar la compatibilidad sanguínea de mallas intravasculares o reducir la adsorción de plaquetas y la formación de tumores en contacto con sangre circulante.

También es posible que compuestos de la fórmula (IA) y/o (IB) comprendan distintos grupos funcionales y/o elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos y/o compuestos para conferir una resistencia a la superficie frente a la adsorción de proteínas y/o adhesión celular en una molécula en la misma molécula de SAM, p. ej. un grupo oligo(óxido de etileno) resistente a proteínas en combinación con un elemento de reconocimiento biológico, como por ejemplo biotina.

En el sentido de la invención es posible, además, que sobre una primera monocapa de organofosfatos y/o organofosfonatos se precipite una segunda o secuencialmente varias monocapas, de tal manera que sobre las mencionadas superficies de sustrato se genere una capa doble o capa múltiple.

Una posible variante del procedimiento se caracteriza porque mediante la primera monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos se genera una superficie hidrófoba, sobre la cual precipita una capa adicional de lípidos sintéticos o naturales.

Una forma especial de realización se caracteriza porque la mencionada capa adicional de lípidos sintéticos o naturales se genera a partir de una suspensión de vesículas de lípido mediante deposición espontánea de las vesículas en la superficie hidrófoba de una primera monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos, seguida de la extensión de la membrana de vesículas sobre esta primera monocapa.

Los lípidos sintéticos o naturales pueden seleccionarse del grupo formado por fosfoglicerolípidos etc. ..., o una mezcla de estas moléculas. Para ello a la capa adicional mencionada se pueden asociar grupos moleculares Y y/o B y/o elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos y/o compuestos de confieran a la superficie una resistencia frente a la adsorción de proteínas y/o adhesión celular según sus formas de realización anteriormente descritas.

Una forma de realización preferida del procedimiento según la invención se caracteriza porque sobre una capa múltiple con una primera monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos sobre una superficie de sustratos se inmovilizan vesículas o microsomas sintéticos o naturales, eventualmente con elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos asociados, que se seleccionan del grupo formado por ácidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN, oligonucleótidos) y análogos de ácidos nucleicos (p. ej. ANP), anticuerpos mono- o policlonales, péptidos, enzimas, aptámeros, estructuras peptídicas sintéticas, proteínas solubles unidas a membrana y aisladas a partir de una membrana, como por ejemplo receptores, sus ligandos, antígenos para anticuerpos, biotina, "componentes de cola de histidina (tag-histidina)" y sus asociados de formación de complejo.

Otra forma de realización es el uso de mezclas de distintas moléculas SAM. Las capas SAM mixtas de este tipo pueden prepararse de dos maneras: mediante preparación de una solución acuosa que contiene ambos tipos de SAM, seguido de un tratamiento de la superficie en esta mezcla, o bien mediante adsorción secuencial usando soluciones SAM puras. Un ejemplo de un uso de este tipo de mezclas de distintas moléculas SAM en solución acuosa para formar sistemas SAM mixtos en la superficie es la precipitación a partir de una mezcla de moléculas SAM que contienen un elemento de reconocimiento biológico, como por ejemplo biotina, y aquellas moléculas SAM que comprenden un grupo tal como oligo(óxido de etileno) para la preparación de una superficie con trasfondo resistente a proteínas en presencia simultánea de una función biológicamente específica (biotina).

Se designan por SAM mixtas aquellas que contienen como mínimo dos moléculas en una proporción de mezcla discrecional, pudiendo estar representadas en cualquier combinación discrecional las clases anteriormente citadas de moléculas.

Otro objeto de la invención es, por consiguiente, un procedimiento para precipitar monocapas o capas múltiples mixtas de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I(A)

(IA)Y-B-OPO_{3}H_{2}

y/o de ácidos organofosfónicos de la fórmula general I(B)

(IB)Y-B-PO_{3}H_{2}

y sus sales en las que B significa un resto alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hetarilo o hetarilalquilo y Y hidrógeno o un grupo funcional de la serie de hidroxi, carboxi, amino, monoalquilamino o dialquilamino eventualmente sustituidos por alquilo inferior, tiol o un grupo ácido negativo de la serie éster, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, maleimida, succinimidil, epoxi, acrilato, pudiendo estar acoplado a B o Y mediante reacción de adición o sustitución un elemento de reconocimiento biológico, bioquímico o sintético, pudiendo estar adicionados también compuestos que confieren a la superficie del sustrato una resistencia contra la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular y en B eventualmente pueden estar contenidos en la cadena en lugar de uno o más grupos -CH_{2}- uno o más grupos óxido de etileno, sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos puros o mixtos de metales y semiconductores, caracterizado porque para el tratamiento de estas superficies, en especial como superficies de plataformas sensoras, implantes y aparatos auxiliares médicos, se usan sales hidrosolubles de un compuesto de la fórmula (IA) o (IB) en solución acuosa.

Se prefiere también que antes de la precipitación de las mencionadas monocapas o capas múltiples se aísle en solución acuosa la sal hidrosoluble de un compuesto de la fórmula (IA) y/o (IB).

También en el caso de SAM mixtas el procedimiento según la invención se caracteriza porque las mencionadas monocapas o capas múltiples de compuestos de la fórmula (IA) y/o (IB) están libres de disolventes orgánicos.

También aquí se usan preferentemente como sales de los compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) en especial sales de sodio, potasio y amonio.

Como sustratos son adecuados también para esta forma de realización del procedimiento según la invención óxidos, nitruros o carburos de tántalo, niobio, titanio, vanadio, circonio, hafnio, molibdeno, wolframio, silicio o sus mezclas en forma de cuerpos macizos o como capas sobre sustratos discrecionales.

Una forma de realización preferida del procedimiento según la invención para la precipitación de monocapas o capas múltiples mixtas se caracteriza porque para el recubrimiento se usan compuestos de la fórmula (IA) y/o (IB) en las que los grupos B e Y significan conjuntamente un grupo alquilo o un grupo alquilo de 2-24 átomos de C eventualmente sustituido.

En especial para las aplicaciones en la biosensórica se prefiere que se seleccionen como elementos de reconocimiento bioquímicos, biológicos o sintéticos (acoplados a B o Y) aquellos del grupo de los ácidos nucleicos, como p. ej. ADN, ARN, oligonucleótidos, análogos de ácidos nucleicos, como p. ej. ANP, anticuerpos monoclonales o policlonales, péptidos, enzimas, aptámeros, estructuras peptídicas sintéticas, proteínas solubles unidas a membrana y aisladas a partir de una membrana, como p. ej. receptores, sus ligandos, antígenos para anticuerpos, biotina, "componentes de cola de histidina (tag-histidina)" y sus asociados de formación de complejo.

Por el contrario, especialmente para aplicaciones del procedimiento según la invención para la modificación de superficies biológicamente tolerables de implantes se prefiere que un elemento de reconocimiento biológicamente activo comprenda péptidos, proteínas, glicoproteínas, factor de crecimiento, como p. ej. TGF-\beta o MBP (Bone Morphogenic Protein).

Con el procedimiento según la invención para precipitar monocapas o capas múltiples mixtas también es posible preparar superficies hidrófobas que, por ejemplo, mediante contacto con albúminas (por ejemplo albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero de bovino (BSA)) pueden pasivizarse para conseguir una superficie resistente a las proteínas.

Para ello puede estar adicionado ventajosamente en B o Y un compuesto que confiera a la superficie del sustrato una resistencia frente a la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular, seleccionándose preferentemente este compuesto del grupo de compuestos formados por oligo(óxido de etileno), fosforilcolina, heparina, sacáridos, albúminas, en especial albúmina de suero de bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos inespecíficos, policlonales o monoclonales, de distinta especie o empíricos para el o los analitos que hay que detectar (en especial para inmunoensayos), detergentes -como por ejemplo Tween 20-, ADN natural o sintético fragmentado que no hibride con los polinucleótidos que haya que analizar, como por ejemplo un extracto de esperma de arenque o de salmón (en especial para ensayos de hibridación de polinucleótidos), o también polímeros no cargados pero hidrófilos como por ejemplo polietilenglicol o dextrano.

También es posible que compuestos de la fórmula (IA) y/o (IB) comprendan distintos grupos funcionales y/o elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos y/o compuestos para conferir una resistencia a la superficie frente a la adsorción de proteínas y/o adhesión celular en una molécula en la misma molécula de SAM.

Los sustratos pueden presentar también una superficie lisa con baja rugosidad o superficies rugosas, presentando estas superficies eventualmente una estructuración adicional.

Un carácter especial del procedimiento según la invención para la preparación de SAM mixtas es que crea la posibilidad de controlar la hidrofilicidad o hidrofobicidad de la superficie seleccionando la proporción de mezcla. Esto abre la posibilidad de un ajuste controlado de la humectabilidad de la superficie (ángulo de contacto contra el agua). La humectabilidad es una característica importante en el campo de la biocompatibilidad. Para determinadas aplicaciones puede ser ventajoso ajustar ángulos de contacto medios. Como ejemplo de realización se describirá más adelante la preparación y caracterización de una SAM mixta de dodecilfosfato/\omega-hidroxi-dodecilfosfato (véase Ejemplo 1).

Otra característica es que seleccionando las proporciones de mezcla puede ajustarse en la superficie una densidad controlada de cargas positivas y/o negativas. La superficie de carga desempeña un gran papel con respecto a la interacción con células biológicas (J. E. Davies, B. Causton, Y. Bovell, K. Davy, C. S. Sturt, "The Migration of Osteoblasts Over Substrata of Discrete Surface-Charge", Biomaterials 7 (1986), 231-233; R. M. Shelton, I. M. Whyte, J. E. Davies, "Interaction between Primary Bone Cell and Biomaterials. Part 4: Colonization of Charged Polymer Surfaces", Biomaterials and clinical applications: preceedings of the Sixth European Conference on Biomaterials, Bolonia, Italia, 14-17 septiembre, 1986; Elsevier (1987), 597-602). Como sistema se consideran p. ej.: organofosfatos u organofosfonatos con grupos amino terminales (cargados positivamente con un pH del cuerpo de 7,4) o bien organofosfatos u organofosfonatos con grupo químico-funcional \omega-terminal de carga negativa, tal como fosfato o fosfonato, sulfato o sulfonato, carboxilato, etc.

El procedimiento según la invención hace posible, además, que seleccionando la proporción de mezcla se pueda ajustar una densidad controlada de grupos reactivos y/o elementos de reconocimiento bioquímicos o "funciones" biológicas.

Ya que al usar soluciones acuosas de los organofosfatos u organofosfonatos se observan propiedades de adsorción selectivas (véase Ejemplo 1), esta técnica permite en una única etapa de tratamiento la preparación de superficies que sólo localmente se dotan con la SAM, mientras que otras zonas de la superficie permanecen sin ser recubiertas.

Otro objeto de la invención es, por lo tanto, un procedimiento para generar superficies estructuradas químicamente mediante precipitación local de monocapas o capas múltiples de organofosfatos y/u organofosfonatos sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos de metales o semiconductores puros o mezclados, caracterizado porque para el tratamiento de las superficies se usan compuestos salinos hidrosolubles de los correspondientes ácidos organofosfóricos o ácidos organofosfónicos y porque la precipitación de las monocapas o capas múltiples puras o mixtas se realiza mediante una de las formas de realización del procedimiento anteriormente mencionadas.

El óxido de silicio en especial no muestra prácticamente ninguna tendencia a la adsorción de organofosfatos u organofosfonatos desde solución acuosa. Con ello pueden usarse superficies estructuradas químicamente, tal como pueden prepararse p. ej. mediante técnicas litográficas o de otro tipo, para la producción selectiva de superficies que presentan propiedades químicas selectivamente distintas (véase Ejemplo 1). Esta técnica resulta útil tanto para la estructuración química de superficies de biomaterial o implante para controlar localmente p. ej. la adsorción de proteínas, factores de crecimiento o la adhesión de células, y con ello ejercer influencia sobre la respuesta específica del entorno biológico (in vitro o en el cuerpo) sobre la superficie del material ajeno, como también para la estructuración de las superficies de biosensores, con propiedades modificables localmente de manera correspondiente.

Una variante preferida del procedimiento consiste en que la superficie de sustrato presenta un modelo definido con óxido de silicio u óxidos de metales de transición. Un perfeccionamiento de esta variante se caracteriza porque sobre las zonas de óxido de silicio se realiza otra precipitación de monocapas o capas múltiples de organofosfatos y/u organofosfonatos en solución acuosa.

Por último, la técnica es adecuada para el recubrimiento parcial de piezas. Esto tiene interés p. ej. en el campo de los implantes médicos, donde a menudo las diversas zonas del implante están sometidas a diferentes exigencias. Por ejemplo, los implantes de raíz dentales presentan zonas que después de la implantación están en contacto con el tejido óseo mientras que otras zonas del mismo implante están en contacto con la encía. Estas dos zonas se pueden modificar con la técnica según la invención de tal manera que estas zonas presenten una composición superficial optimizada hacia el perfil de exigencias local. Las distintas capas SAM pueden aplicarse localmente de manera selectiva, p. ej. mediante inmersión parcial, pincelado, extensión, impresión o mediante técnicas de inyección de tinta.

Para la aplicación de las monocapas o capas múltiples especialmente en sustratos planos existe una pluralidad de métodos utilizables. Se prefiere que la precipitación de las monocapas o capas múltiples se produzca, eventualmente de manera selectiva local, usando un método de precipitación seleccionado del grupo formado por inmersión, extensión, pincelado, "Ink jet spotting", "spotting" mecánico mediante rotulador, pluma o capilares, "micro contact printing", contacto fluídico de la superficie del sustrato con microcanales paralelos o cruzados bajo la acción de diferencias de presión o potenciales eléctricos o electromagnéticos'' etc.

Una forma de realización especial del procedimiento según la invención para generar superficies estructuradas químicamente se caracteriza porque mediante precipitación de monocapas o capas múltiples de organofosfatos y/u organofosfonatos sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos de metales o semiconductores puros o mixtos se generan zonas locales hidrófilas o hidrófobas y a continuación su superficie de sustrato circundante se cubre con una monocapa terminal hidrófoba o hidrófila respectivamente.

Un perfeccionamiento consiste en el procedimiento que sobre una superficie estructurada químicamente generada conforme al procedimiento según la invención se precipitan localmente de manera secuencial una o más monocapas, tal como se describieron anteriormente, y se general con ello capas dobles o múltiples locales.

Tal como se explicó anteriormente, el procedimiento de precipitación según la invención es adecuado especialmente para preparar superficies de sustrato en dos campos de aplicación distintos. Un objeto preferido de la invención se refiere a la preparación de superficies de implante con implantes de metales, como p. ej. titanio, tántalo, niobio, aleaciones como titanio-aluminio-vanadio, titanio-aluminio-niobio, titanio-niobio-circonio, titanio-niobio-circonio-tántalo, cobalto-cromo, cobalto-cromo-molibdeno, hierro-níquel-cromo cubiertos de óxido, produciéndose sobre la superficie la precipitación de monocapas o capas múltiples puras o mixtas de organofosfatos y/u organofosfonatos según una de las formas de realización anteriormente mencionadas.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para preparar superficies de plataformas sensoras, caracterizado porque sobre la superficie se realiza la precipitación de monocapas o capas múltiples puras o mixtas de organofosfatos y/u organofosfonatos según una de las formas de realización mencionadas anteriormente.

La invención comprende también un implante con una monocapa o capa múltiple de organofosfatos y/u organofosfanatos como superficie, caracterizado porque la generación de la superficie se realiza con un procedimiento de precipitación según unas de las formas de realización anteriormente mencionadas.

El implante según la invención puede seleccionarse del grupo de implantes de raíz para el campo dental, prótesis artificiales, como p. ej. diáfisis, rótulas o acetábulos de articulaciones coxo-femorales, articulaciones de la rodilla artificiales, componentes de osteosíntesis como p. ej. placas óseas, tornillos, "fixateur externe", componentes para la reparación de daños en la zona craneal ("maxillofacial devices"), componentes en el área de la cirugía de la columna vertebral ("spinal surgery implants"), mallas intravasculares, componentes de marcapasos cardiacos.

Otro objeto de la invención son aparatos médicos auxiliares de metales o cerámica con una monocapa o capa múltiple de organofosfatos y/u organofosfonatos como superficie, caracterizados porque la generación de la superficie se realiza con un procedimiento de precipitación según una de las formas de realización anteriormente mencionadas.

Los aparatos médicos auxiliares de metales o cerámica según la invención pueden seleccionarse del grupo que comprende catéteres, catéteres de globo, endoscopios, componentes para sistemas conductores de sangre extracorpóreos como p. ej. máquinas de asistencia cardiocirculatoria.

Otro objeto de la invención es una plataforma sensora con una monocapa o capa múltiple de organofosfatos y/u organofosfonatos como superficie, caracterizada porque la generación de la superficie se realiza con un procedimiento de precipitación según una de las formas de realización anteriormente mencionadas.

Se prefiere que la plataforma sensora comprenda como mínimo un array de áreas de medición discretas de elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos inmovilizados para el reconocimiento específico y/o el enlace de uno o más analitos y/o interacciones específicas con dichos analitos.

Muchas formas de realización posibles de la plataforma sensora según la invención se caracterizan porque la detección de uno o más analitos se realiza con ayuda demarcadores, que se seleccionan del grupo formado, por ejemplo, por marcadores luminiscentes, en especial intercaladores luminiscentes o "molecular beacons", marcadores de absorción, marcadores de masa, en especial coloides metálicos o cuentas de plástico, marcadores de espín, tal como marcadores REE o RMN, marcadores radioactivos.

Una posible variante se caracteriza porque la detección de analitos se basa en la determinación de una modificación del índice de refracción efectivo debido a adsorción o desorción molecular sobre las zonas de medición.

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Una subvariante consiste en que la detección de los analitos se basa en la determinación de una modificación de las condiciones para generar un plasmón superficial en la capa metálica de un sistema de capas múltiples, consistiendo preferentemente la capa metálica en oro o plata.

Una forma de realización preferida de la plataforma sensora según la invención se caracteriza porque la detección de los analitos se basa en la determinación de una modificación de una o más luminiscencias.

Una posible variante se caracteriza porque la luz de excitación se irradia en una excitación por luz reflejada.

Dependiendo de la forma de realización específica se prefieren aquellas variantes caracterizadas porque el material en contacto con las zonas de medición de la plataforma sensora es transparente o absorbente dentro de una profundidad de cómo mínimo 200 nm de las zonas de medición para como mínimo una longitud de onda de excitación.

Otra forma de realización posible está configurada de tal manera que la luz de excitación se irradia en una disposición de transmisión. Para esta forma de realización es necesario que el material de la plataforma sensora sea transparente como mínimo para una longitud de onda de excitación.

Una forma de realización preferida de la plataforma sensora según la invención se caracteriza porque la plataforma sensora está configurada como guiaondas ópticos, que preferentemente es plano en esencia.

Se prefiere que la plataforma sensora comprenda un material ópticamente transparente del grupo formado por silicatos, p. ej. vidrio o cuarzo, plástico termoplástico o inyectable transparente, por ejemplo policarbonato, poliimida, acrilatos, en especial polimetacrilato de metilo, o poliestiroles.

Una forma de realización especialmente preferida de la plataforma sensora según la invención se caracteriza porque ésta comprende un guiaondas óptico de capa fina con una capa (a) transparente como mínimo a una longitud de onda de excitación sobre una capa (b) igualmente transparente como mínimo a esta longitud de onda de excitación y con un índice de refracción menor que la capa (a).

Distintas formas de realización de plataformas sensoras de este tipo y procedimientos para detectar uno o más analitos usando tales plataformas sensoras se describen ampliamente por ejemplo en las patentes US 5,822,472, US 5,959,292 y US 6,078,705 así como las solicitudes de patente WO 96/35940, WO 97/37211, WO 98/08077, WO 99/58963, PCT/EP 00/04869 y PCT/EP 00/07529. Las formas de realización allí descritas de plataformas sensoras cuya superficie se modificó según el procedimiento según la invención, y los procedimientos para detectar o más analitos usando plataformas modificadas de este tipo son asimismo objeto de la presente invención.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa simultánea de una pluralidad de analitos, caracterizado porque una o más muestras líquidas que hay que analizar para los mencionados analitos se ponen en contacto con las zonas de medición sobre una plataforma sensora según la invención y se miden las modificaciones resultantes de las señales procedentes de las zonas de medición.

Se prefiere que la detección de los analitos se base en la determinación de la modificación de una o más luminiscencias.

Una posible forma de realización del procedimiento según la invención consiste en que la luz de excitación de una o más fuentes de luz de excitación se irradia en una excitación por luz reflejada.

Otra posible forma de realización se caracteriza porque la luz de excitación de una o más fuentes de luz de excitación se irradia en una disposición de transmisión.

Se prefiere que la plataforma sensora esté configurada como un guiaondas ópticos que preferentemente sea en esencia plano, y que la luz de excitación de una o más fuentes de luz se acople en el guiaondas óptico mediante un procedimiento que se selecciona del grupo formado por acoplamiento de superficies frontales, acoplamiento a través de fibras ópticas dispuestas como conductor de luz, acoplamiento por prismas, acoplamiento en retículo o acoplamiento evanescente mediante solapamiento del campo evanescente del citado guiaondas óptico con el campo evanescente de otro guiaondas colocado para ello en contacto de campo próximo.

La adición de una o más muestras y los reactivos de detección que deben usarse en el procedimiento de detección puede realizarse secuencialmente en varias etapas. Se prefiere que la muestra o más muestras se incuben previamente con una mezcla de distintos reactivos de detección para determinar los analitos que hay que detectar en las citadas muestras y que entonces, en un único paso de adición, se añadan estas mezclas en los arrays previstos para ello sobre la plataforma sensora.

Otro objeto de una forma de realización según la invención del procedimiento es que la calibración de las luminiscencias generadas a consecuencia del enlace de uno o más analitos o a consecuencia de la interacción específica con uno o más analitos en el campo próximo de la capa (a), comprenda la adición de una o más soluciones de calibración con concentraciones conocidas de los mencionados analitos que hay que determinar sobre las mismas u otras zonas de medición o segmentos de las zonas de medición o arrays de zonas de medición sobre una plataforma sensora, a las que en la misma o en una etapa de adición distinta se añadan la muestra o las varias muestras que hay que analizar.

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Parte integrante de la invención es un procedimiento según una de las formas de realización anteriormente citadas para la determinación cuantitativa o cualitativa, simultánea o secuencial, de uno o más analitos del grupo de anticuerpos o antígenos, receptores o ligandos, queladores o "componentes de cola de histidina (tag-histidina)", oligonucleótidos, hebras de ADN o ARN, análogos de ADN o ARN, enzimas, cofactores enzimáticos o inhibidores, lectinas e hidratos de carbono.

Posibles formas de realización del procedimiento se caracterizan también porque las muestras que hay que analizar son fluidos corporales existentes de modo natural tales como sangre, suero, plasma, linfa u orina o yema de huevo o líquidos ópticamente turbios o líquidos tisulares o agua superficial o extractos de suelo o de plantas o caldos de procesos de síntesis o biosíntesis u obtenidos de piezas de tejidos biológicos o de cultivos o extractos celulares.

Otro objeto de la invención es el uso de una plataforma sensora según la invención y/o de un sistema analítico según la invención y/o de un procedimiento según la invención para análisis cuantitativos o cualitativos para determinar analitos químicos, bioquímicos o biológicos en procedimientos de cribado en investigación farmacológica, de química combinatoria, de desarrollo clínico y preclínico, para estudios de enlace en tiempo real y para determinar parámetros cinéticos en cribado de afinidad y en la investigación de determinaciones cualitativas y cuantitativas de analitos, en especial para la analítica de ADN y ARN, para la elaboración de estudios de toxicidad y para la determinación de perfiles de expresión de genes o proteínas así como para la detección de anticuerpos, antígenos, agentes patógenos o bacterias en el desarrollo y la investigación de productos farmacéuticos, del diagnóstico humano y veterinario, del desarrollo y la investigación de productos agroquímicos, del diagnóstico sintomático y presintomático de plantas, para la estratificación de pacientes en el desarrollo de productos farmacéuticos y para la selección terapéutica de medicamentos, para la detección de agentes patógenos, sustancias perjudiciales y agentes causantes, en especial de salmonelas, priones, virus y bacterias, en la analítica de alimentos y medioambiental.

En los siguientes ejemplos de realización se explicará la invención a modo de ejemplo.

Ejemplo 1 Preparación de SAM de dodecilfosfato y SAM de hidroxidodecilfosfato así como de SAM mixtas sobre sustrato de óxido metálico a partir de una solución acuosa de las correspondientes sales amonio 1.1 Objetivo y planteamientos

El objetivo de este ejemplo de realización es demostrar que la aplicación según la invención de sales amonio de fosfatos de alquilo en solución acuosa permite la modificación selectiva de distintas superficies con óxido. En el ejemplo de la sal amonio del ácido dodecilfosfórico con terminación hidroxi se demuestra, además, que la invención también permite la preparación de capas SAM perfectamente definidas en el caso de fosfatos de alquilo funcionalizados terminalmente. Se demuestra además que la aplicación de mezclas de distintos fosfatos de alquilo permite el ajuste fino selectivo y "continuo" de estados superficiales, lo cual tiene una importancia decisiva tanto para la funcionalización de las superficies de plataformas sensoras ("chips biosensores") como también de superficies de implantes y su funcionalidad.

1.2 Materiales y métodos 1.2.1 Sustratos

Ta_{2}O_{5}, Nb_{2}O_{5}: se recubrieron cubreobjetos (15 x 15 x 1 mm) con una capa de 150 nm de espesor de Ta_{2}O_{5} o Nb_{2}O_{5} (Balzers AG, Balzers, Liechtenstein).

Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2}, Fe_{2}O_{3}, ZrO_{2}, SiO_{2}: se recubrieron portaobjetos AF45 (8 x 12 x 1 mm) con una capa de 200 nm de espesor de Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2}. Para los análisis de las superficies de Fe_{2}O_{3}, ZrO_{2} y SiO_{2} se precipitó como capa más externa una capa adicional (espesor: 14 nm) del correspondiente óxido metálico (Microvacuum, Ltd., Budapest, Hungría).

TiO_{2}: se recubrieron portaobjetos mediante sublimación catódica con una capa de 100 nm de espesor de TiO_{2} (Paul Scherrer Institut, Villigen, Suiza).

Al_{2}O_{3}: se anodizaron en un electrolito de capa de detención muestras de Al (99,9% de pureza) de 1 mm de espesor a una tensión de 25 V, lo que dio lugar a un espesor de capa de óxido de aprox. 30 nm (Alusuisse Technology Center, Neuhausen am Rheinfall, Suiza).

1.2.2 Fosfatos de alquilo

a) DDPO_{4}(NH_{4})_{2}

Precipitación de la sal de amonio

Se disolvieron 2,00 g de dodecilfosfato (DDPO_{4}) (calidad industrial, Aldrich) en 200 ml de 2-propanol (UVASOL, Merck), se calentaron a 82ºC y se llevaron a ebullición con reflujo. Se añadieron después 6 ml de amoniaco (15% ac., p.a., Merck).Tras enfriamiento en agua con hielo se filtró la sal amonio precipitada de DDP, se enfrío con agua con hielo y se secó a 60ºC y vacío de 10 kPa durante 20 h. Se aislaron 61 g de un polvo blanco (P.f: 225º), lo que equivale a un rendimiento del 71%.

Control mediante RMN-^{1}H

(DMSO o CD_{3}OD): 0,88 ppm (t, 3H, -(CH_{2})_{n}CH_{3}), 1,28 ppm (m, 18H, -CH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}(CH_{3}), 1,54 ppm (m, 2H, -CH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}(CH_{3}), 3,72 ppm (q, 2H, -OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}(CH_{3}), 4,9 (s, 8H, NH_{4}). La RMN-^{31} consta de un único pico lo que indica un enlace puro.

Análisis elemental

Calculado como monosal amonio: [C] 50,87%, [H] 10,67%, [N] 4,94% [O] 22,59%, [P] 10,93%

Análisis experimental: [C] 50,61%, [H] 10,94%, [N] 4,95% [O] 22,75%, [P] 10,69%

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b) OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2}

Precipitación de la sal de amonio

Se disolvieron 500 mg de hidroxidodecilfosfato (OH-DDPO_{4}) en 20 ml de 2-propanol (UVASOL, Merck) y se hizo pasar durante 5 minutos gas NH_{3} a través de la solución. La sal amonio precipitada de OH-DDPO_{4} se aisló mediante centrifugación, se lavó y se secó en una corriente gaseosa de nitrógeno seco. Se aislaron 551 mg de polvo blanco (rendimiento: 91%).

Control mediante RMN-^{1}H

(DMSO o CD_{3}OD): 1,24 ppm (m, 16H, -CH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{8}(CH_{2}CH_{2}OH), 1,38 ppm (m, 2H, -CH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{8}(CH_{2}
CH_{2}OH), 1,44 ppm (m, 2H -CH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{10}OH), 3,35 ppm (t, 2H, -(CH_{2})_{n}(CH_{2}OH), 3,57 ppm (q, 2H, -OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{10}OH), 5,2 (s, 8H, NH_{4}).

Análisis elemental

Calculado como disal de amonio: [C] 45,6%, [H] 10,5%, [N] 8,9%

Análisis experimental: [C] 44,1%, [H] 9,6%, [N] 5,7%

El análisis elemental muestra que en comparación con la disal de amonio el contenido de nitrógeno es algo inferior al esperado. Esto podría atribuirse a una cierta pérdida de amoniaco y conversión en la monosal de amonio. Los espectros RMN, que no contienen picos no identificables, permiten deducir que no hay contaminaciones en concentraciones más altas.

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1.2.3 Preparación de la solución de tratamiento

A): Se disolvieron 150 mg de DDPO_{4}(NH_{4})_{2} en 5 ml de agua purísima, calentándose la solución ligeramente a 50ºC. El volumen se completó a 100 ml.

B): Se disolvieron 158 mg de OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} en 5 ml de agua purísima mediante calentamiento a aprox. 80ºC. Se filtró la solución a través de un filtro de 0,22 \mum 8MILLEX-GV, MILLIPORE, Bedford, MA) y se llevó el volumen a 100 ml.

Las dos soluciones a) y b) se mezclaron en diversas proporciones, de 0 a 100% en volumen con respecto a OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2}. Se prepararon 11 soluciones distintas cuyo contenido de OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} se aumentó cada vez un 10%. El contenido total de fosfato se mantuvo constante a 0,5 mM.

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1.2.4 Tratamiento de las muestras

Los sustratos para los ensayos de modificación de la superficie se depuraron durante 15 minutos en agua purísima y a continuación 15 minutos en 2-propanol bajo la acción de ultrasonido. Después del secado se sometieron durante 3 minutos a un tratamiento con plasma de oxígeno (Harrick Plasma Cleaner/Sterilizer PDC-32G, Ossining, NY, EE.UU.). Se llevaron después a un recipiente de vidrio en el que a continuación se añadió la solución acuosa del fosfato de alquilo. Después de un tiempo de tratamiento de 48 h se retiraron las muestras, se lavaron con agua y se secaron en corriente de nitrógeno.

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1.3 Resultados

a) DDPO_{4} sobre distintos sustratos

Los fosfatos de alquilo se aplicaron sobre las siguientes superficies: AL_{2}O_{3}, Ta_{2}O_{5}, Nb_{2}O_{5}, ZrO_{2}, Fe_{2}O_{3}, TiO_{2}, Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2} y SiO_{2}. El tratamiento se realizó en 0,5 mM DDPO_{4}(NH_{4})_{2} tal como se indicó en el anterior apartado.

1. Ángulo de contacto

Los ángulos de contacto (de avance, "advancing") se resumen en la Tabla 1. Los resultados muestran que sobre todos los óxidos metálicos se forman monocapas autoorganizadas y altamente hidrófobas. Un ángulo de contacto de \geq 110º es típico para las SAM impecables. Son excepciones el óxido de silicio (SiO_{2}) y Ti_{0,6}Si_{0,4}O_{2}. El punto isoeléctrico no desempeña ningún papel visible; varía de 2.7-3,0 para Ta_{2}O_{5} hasta 7,8-8,6 para Fe_{2}O_{3} (Tabla 1). Sobre la superficie de SiO_{2} el ángulo de contacto se mantiene en el intervalo de los valores previos al tratamiento, es decir, la superficie se mantiene completamente hidrófila. Con ello queda claro que esta superficie no reacciona con los fosfatos de alquilo y no forma ninguna capa SAM.

La capa de Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2} sobre los chips de vidrio consta de una estructura heterogénea de TiO_{2} y SiO_{2}. Las superficies Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2} forman en la solución de tratamiento una capa DSAM incompleta, pues aunque aumenta el ángulo de contacto sólo alcanza valores de aprox. 64º. Estro concuerda con la observación de que sobre TiO_{2} se forman SAM pero no sobre SiO_{2}.

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TABLA 1 Valores procedentes de la literatura de los puntos isoeléctricos (PIE) de los óxidos metálicos usados, ángulo de contacto (AC) medido experimentalmente tras el tratamiento con solución acuosa de DDPO_{4}(NH_{4})_{2} y densidad de microgotas (DMG) medida tras la formación de figuras de condensación en las mismas superficies tratadas con DDPO_{4}(NH_{4})_{2}

1

2. Densidad de microgotas

Las SAM de DDPO_{4} sobre óxidos metálicos puros muestran después de la formación de la película de condensación una densidad de microgotas muy baja de 120-260 gotas/mm^{2} (Tabla 1) y una distribución homogénea de las gotas sobre la superficie. SiO_{2} permanece hidrófilo y se forma una película de agua continua ya que la elevada densidad de microgotas conduce rápidamente a coalescencia. Sobre la superficie de Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2} recubierta de DDPO_{4} se crea una DMG de aprox. 350 gotas/mm^{2}. Este valor es, según se esperaba, mayor que sobre las superficies de óxido metálico puro que forman SAM e indica un ligamiento incompleto de la SAM.

Mediante precipitación desde la fase gaseosa se aplicaron tiras de Fe_{2}O_{3} sobre cubreobjetos revestidos de Ti_{0,4}Si_{0,6}
O_{2} en forma de tiras de 2 mm de ancho. Durante el proceso de lavado, después del recubrimiento en la solución DDPO_{4} se puso de manifiesto que sólo las zonas de Fe_{2}O_{3} se volvieron hidrófobas, mientras que las zonas de Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2} permanecieron hidrófilas. Las tiras hidrófobas de 2 mm de ancho observadas en la Figura 4 corresponden a la zona de Fe_{2}O_{3}.

3. Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X

Tras el tratamiento por inmersión de las superficies de óxido metálico y óxido de silicio en una solución acuosa 0,5 mM de DDPO_{4}(NH_{4})_{2} se analizaron las superficies mediante espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS) con dos ángulos de salida distintos. Con un ángulo de salida de los electrones de 15º (con respecto a la superficie), el análisis XPS es muy sensible a la superficie, mientras que con un ángulo de 75º también se analizan conjuntamente zonas más profundas (sustrato).

Las concentraciones de C, O, P y los correspondientes cationes de óxido metálico se cuantificaron mediante factores se sensibilidad estándar (Tablas 2a y b).

La cantidad de capa SAM analizada se encuentra en el mismo intervalo para todos los óxidos metálicos estudiados e indica un revestimiento de la superficie como monocapas. Coincidiendo con las mediciones de ángulo de contacto y de densidad de microgotas no pudo constatarse ninguna capa SAM sobre las muestras SiO_{2} (ninguna señal de fósforo y comparativamente poco carbono). Sobre la capa mixta (Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2}) se observa aproximadamente la mitad de titanio que sobre la capa de óxido de titanio (TiO_{2}). De manera correspondiente también se encuentra sólo aproximadamente la mitad de las concentraciones de P y C, comparado con la correspondiente superficie de TiO_{2}. Esto vuelve a demostrar que la capa SAM se forma sólo sobre TiO_{2} pero no sobre SiO_{2}.

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TABLAS 2a y 2b) Concentraciones atómicas medidas con XPS de sustratos de óxido metálico recubierto de DDPO_{4}. Ángulo de salida de los electrones: 15º y 75º con repsecto a la superficie. Los valores entre paréntesis corresponden a las concentraciones atómicas de titanio a partir del sustrato bajo la muestra de Fe_{2}O_{3} recubierta mediante sublimación catódica o la concentración atómica de silicio en el caso de la muestra de Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2}

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2

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b) DDPO_{4} sobre Ta_{2}O_{5} y Nb_{2}O_{5}

Se prepararon capas autoorganizadas de 12-hidroxidodecilfosfato (OH-DDPO_{4}) sobre muestras recubiertas de Ta_{2}O_{5} y Nb_{2}O_{5} mediante inmersión en una solución acuosa 0,5 mM de OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} tal como se describe en la parte experimental (véase anteriormente).

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1. Ángulo de contacto y XPS

El ángulo de contacto de avance se midió inmediatamente después del tratamiento de la superficie de las muestras. Vale aprox. 50º, es decir, en comparación con la capa con metilo terminal de DDPO_{4} la superficie es claramente más hidrófila, pero menos hidrófila que la superficie de óxido metálico depurada (ángulo de contacto < 10º).

Esto es una clara indicación de que los grupos hidroxi están efectivamente expuestos en la superficie. Para demostrarlo se midieron espectros XPS a distintos ángulos de salida. La variación de la intensidad de la señal como función del ángulo de salida permite obtener indicaciones sobre la posición del correspondiente elemento. La señal O (1 s) se muestra en la Figura 5 para los dos ángulos de salida distintos 11,5º y 20,5º. En comparación con la capa DDPO_{4} pura, la señal de oxígeno (O1s) muestra un hombro adicional para una energía de enlace de 533,4 eV (Figura 5), siendo la señal a 11,5º significativamente más alta que a 20,5. La posición de la señal O(1s) es típica de las funciones
hidroxi.

No se detectó ningún nitrógeno, lo que indica que el catión amonio no participa en la formación de la SAM sobre las superficies aquí analizadas.

Ya se había demostrado que el ángulo de contacto con el agua se correlaciona con el grado de recubrimiento de la SAM. Se determinaron ángulos de contacto de 50-80º de las capas SAM con hidroxi terminal. Para comprobar si también los alquifosfatos con hidroxi terminal forman una capa densamente empaquetada similar a como DDPO_{4}, se compararon las intensidades XPS C1s de las SAM de DDPO_{4} con las correspondientes de las SAM de OH-DDPO_{4} a distintos ángulos de salida (Figura 6). Los resultados muestran que las correspondientes señales C1s se pueden comparar muy bien. Esto demuestra que el alquilforfato con hidroxi terminal (OH-DDPO_{4}) forma igualmente capas densamente empaquetadas tal como son típicas para SAM ordenadas.

Las concentraciones atómicas de C, O, P y del catión de sustrato Ta o Nb se calcularon a partir de las correspondientes intensidades XPS (Tabla 3). Los datos son consistentes con el modelo de una superficie en la que los fosfatos están unidos al óxido metálico mientras que los grupos terminales (hidroxi o metilo) señalan hacia fuera de la superficie (configuración "tail-up").

Las señales de oxígeno O1s se descompusieron en tres componentes: a) el oxígeno del óxido metálico (530,2 eV), b) el oxígeno del fosfato (531,4 eV para P-O-metal y P=O y 532,6 eV para R-O-P y P-OH) y c) el oxígeno del hidroxi (OH) a 533,4 eV. Esta asignación se basa en un análisis detallado correspondiente de los espectros XPS. Los datos demuestran que no sólo el fosfato de alquilo puro sino que también el OH-DDPO_{4} se une a la superficie de un modo orientado (Figura 7).

El aumento de la señal de oxígeno del sustrato de óxido metálico al aumentar el ángulo de detección viene condicionado por la creciente profundidad de información del método (máxima profundidad analizada en el caso de detección perpendicular (90º). La señal de oxígeno del grupo fosfato disminuye ligeramente al aumentar el ángulo de detección. Esto es típico para los elementos que se encuentran en la interfaz. La señal de oxígeno del grupo hidroxi aumenta ligeramente al disminuir el ángulo de detección, típico para una posición del grupo hidroxi en la interfaz SAM/aire o vacío.

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(Tabla pasa a página siguietne)

TABLAS 3a y b Concentraciones atómicas XPS de capas OH-DDPO_{4} autoorganizadas sobre Ta_{2}O_{5} y Nb_{2}O_{5} en función del ángulo de detección \Theta usado. La señal de oxígeno se descompuso en tres componentes

3

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4

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c) SAM mixtas de OH-DDPO_{4}/ DDPO_{4} sobre Ta_{2}O_{5} y TiO_{2}

Se prepararon soluciones acuosas mixtas de 0,5 M OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} y 0,5 mM DDPO_{4}(NH_{4})_{2} según los datos de la parte experimental. Se depuraron cubreobjetos recubiertos de Ta_{2}O_{5} y se trataron en las soluciones según los datos de la parte experimental.

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1. Ángulo de contacto y densidad de microgotas

El ángulo de contacto se midió inmediatamente después de la preparación de las superficies. Los resultados (Figura 8) muestran una clara correlación con la proporción de mezcla molar de los dos componentes SAM de la solución.

La densidad de microgotas está distribuida homogéneamente sobre la superficie a escala macrométrica y micrométrica, de modo que puede deducirse que los dos componentes SAM están distribuidos homogéneamente en este orden de magnitudes. La diferencia de humectabilidad (ángulo de contacto) influye de manera despreciable sobre la densidad de microgotas (Tabla 4). Es de esperar un aumento de esta densidad en caso de que aumenten la rugosidad, la carga superficial y/o el desorden de las capas. La baja densidad de las gotitas de 100-200 por mm^{2} permite deducir que las capas están relativamente bien ordenadas y que son lisas (Tabla 4). La incorporación de OH-DDPO_{4} en la capa de fosfato de alquilo no modifica tampoco esencialmente el grado de orden de las capas SAM.

TABLA 4 Ángulo de contacto y densidad de microgotas de la SAM de OH-DDPO_{4}/ DDPO_{4} sobre Ta_{2}O_{5}

5

1.4 Conclusión

Se pudo demostrar que los fosfatos de alquilo de soluciones acuosas de las sales correspondientes (p. ej. sales de amonio) forman capas autoorganizadas perfectamente definidas ("SAM") sobre una serie de superficies de óxido metálico. Mediante XPS no se pudo detectar ningún nitrógeno, de modo que puede concluirse que estas capas SAM son especialmente puras, es decir, que no contienen el catión de la sal ni disolventes orgánicos. Únicamente puede esperarse una cierta porción de agua en la interfaz. Pero esto no es crítico para la aplicación de biomateriales (implantes) ni de biosensores.

En el caso del fosfato de alquilo puro, con el procedimiento según la invención pudieron prepararse superficies altamente hidrófobas. Se mostró que el fosfato de alquilo forma selectivamente capas SAM ordenadas sobre óxidos de metales de transición y sobre óxido de aluminio, mientras que no recubre el óxido de silicio. Esto abre posibilidades de preparación de superficies químicamente estructuradas en el intervalo de milímetros hasta submicrómetros o nanómetros al aplicar el tratamiento según la invención sobre superficies químicamente estructuradas (p. ej. usando técnicas de microfabricación como la litografía). Por ejemplo, modelos litográficos de rayos de electrones o fotolitográficos discrecionales que localmente están formados por (óxido de)silicio o por un óxido de metal de transición u óxido de aluminio, pueden recubrirse selectivamente con fosfatos de alquilo o con fosfatos de alquilo funcionalizados de modo terminal. Además, las superficies de óxido de silicio se pueden funcionalizar en un segundo paso con otro método. Eso incluye también la posibilidad de precipitar sobre estas superficies fosfatos de alquilo o fosfatos de alquilo funcionalizados a partir de disolventes orgánicos, ya que se sabe que a partir de soluciones acuosas de este tipo se puede recubrir también el óxido de silicio. Así pueden prepararse p. ej. modelos con propiedades hidrófilas/hidrófobas locales. Igualmente es posible también introducir grupos funcionales localmente distintos. Esto incluye diferentes cargas (uso p. ej. de grupos amino o amonio terminales con carga positiva, grupos carboxi, fosfato o fosfonato cargados negativamente. Otra posibilidad es la introducción local de grupos resistentes a las proteínas y a la adhesión celular (p. ej. usando fosfatos de alquilo modificados terminalmente con oligoóxido de etileno), mientras que otras zonas de la superficie tienen carácter adhesivo al presentar propiedades adsorbentes de las proteínas. Estas últimas pueden intensificarse introduciendo en estas zonas fosfatos de alquilo que contienen proteínas, como p. ej. péptidos que contienen RGD, unidas en posición terminal. De este modo es posible dirigir selectivamente células biológicas a ciertas zonas de la superficie y aprovechar los modelos de comportamiento específicos de las células de este tipo colocadas aisladas. Igualmente para las aplicaciones en la biosensórica es posible colocar de manera local y selectiva unidades de reconocimiento como p. ej. anticuerpos de proteínas, ADN de una hebra o cadenas de ARN, etc., y crear con ello la posibilidad de llevar a cabo ensayos de bioafinidad de manera selectiva sobre determinadas zonas de la superficie. Esto es interesante en la sensórica con respecto a la técnica "multiarray".

Las realizaciones anteriores rigen lógicamente también para sales de los ácidos alquilfosfóricos, cuyas propiedades son muy similares, en particular con respecto a la modificación de superficies con óxidos metálicos.

Ejemplo 2 Preparación de SAM de dodecilfosfato y SAM de hidroxidodecilfosfato así como de SAM mixtas sobre superficies lisas y rugosas de implantes metálicos de titanio 2.1 Objetivo y planteamientos

Este ejemplo de aplicación pretende demostrar que la aplicación según la invención de sales de distintos ácidos alquilfosfóricos o alquilfosfónicos en solución acuosa también es aplicable para la modificación de superficies metálicas de implantes recubiertas de óxido. Pretende demostrar, además, que no sólo se pueden tratar con éxito superficies lisas (p. ej. pulidas) sino también superficie rugosas topográficamente estructuradas.

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2.2 Materiales y métodos

Sustratos: muestras metálicas de titanio cp (comercialmente puro) que presentan siempre una capa de óxido de titanio formada de modo natural se trataron del modo siguiente en dos variantes distintas:

A): Rectificado y pulimentado mecánico, a continuación depuración en los disolventes orgánicos hexano, acetona y alcohol, seguido de una pasivación en solución de HNO_{3} al 30% y una limpieza final en plasma de oxígeno. Esto da lugar a una superficie limpia y lisa.

B): Chorreado con partículas de óxido de aluminio, seguido de corrosión en ácido sulfúrico que contiene cloruro. Esto da lugar a una superficie fuertemente rugosa como la mostrada en la imagen al microscopio electrónico de cribado de la Figura 9. Las superficies de este tipo se usan preferentemente para implantes en el ámbito de los huesos ya que presentan una excelente capacidad de curación completa en los huesos ("oseointegración").

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2.2.1 Fosfatos de alquilo

Se usaron los mismos materiales que en el Ejemplo 1.

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2.2.2 Preparación de las soluciones de tratamiento y tratamientos de las muestras metálicas

Se usaron los mismos procedimientos que en el Ejemplo 1.

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2.3 Resultados

a) DDPO_{4}(NH_{4})_{2} y OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} sobre superficie lisa de titanio

Se usaron soluciones acuosas tanto de DDPO_{4}(NH_{4})_{2} puro o OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} puro como también distintas proporciones de mezcla de estas dos sustancias, para el tratamiento de superficies de titanio lisas y rugosas.

La Tabla 5 muestra los resultados XPS de las superficies tratadas. Análogamente a como en el Ejemplo 1, estos datos demuestran que conforme al procedimiento según la invención también las superficies metálicas de titanio (con capa pasiva de óxido) pueden recubrirse con las moléculas correspondientes de manera análoga a como las capas de óxido de titanio puras.

La Figura 10 muestra los correspondientes ángulos de contacto medidos frente a agua. Son muy similares a las superficies recubiertas de óxido metálico tratadas de manera correspondiente (Ejemplo 1). Se constata de nuevo una dependencia característica del ángulo de contacto con la composición de la solución SAM. Por lo tanto la técnica también es adecuada en el caso de estos materiales para el ajuste selectivo de propiedades relevantes para la superficie (aquí la humectabilidad).

TABLA 5 Concentración superficial de superficies metálicas de titanio lisas, tratadas conforme al procedimiento según la invención con soluciones acuosas de las sales DDPO_{4}(NH_{4})_{2}, OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} o sus mezclas en distintas proporciones de concentración

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b) DDPO_{4}(NH_{4})_{2} y OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} sobre superficie rugosa de titanio

La Tabla 6 muestra los datos XPS de las superficies metálicas rugosas tratadas con soluciones acuosas de las sales DDPO_{4}(NH_{4})_{2}, OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} o sus mezclas. Estas muestras presentan una estructura superficial tal como se muestra en la Figura 9. De nuevo las concentraciones superficiales indican una formación completa de las correspondientes capas SAM. Las concentraciones difieren ligeramente de las de superficies lisas, lo cual debe atribuirse a la influencia de la topografía superficial sobre la medición XPS.

La Figura 11 muestra los correspondientes ángulos de contacto análogamente a la Figura 10. Los ángulos de contacto muestran un desarrollo claramente distinto al de las curvas correspondientes de las superficies lisas. Esto debe atribuirse a la influencia de la topografía superficial. Se sabe que las superficies hidrófobas rugosas (estructuradas topográficamente) presentan ángulos de contacto claramente mayores (humectación reducida) que las superficies hidrófobas lisas (Ref). Este efecto se ha observado también en la naturaleza y a las correspondientes observaciones se les dio el nombre de "efecto loto" ya que, p. ej., los pétalos de loto utilizan exactamente esta combinación de rugosidad e hidrofobia para formar una superficie autolimpiante.

Los grandes ángulos de contacto de las superficies tratadas con DDPO_{4}(NH_{4})_{2} son un claro indicio de que estas superficies rugosas ha sido recubiertas perfectamente con la capa SAM de DDPO_{4}.

TABLA 6 Concentración superficial de superficies metálicas de titanio rugosas, tratadas según la invención con soluciones acuosas de las sales DDPO_{4}(NH_{4})_{2}, OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} o sus mezclas en distintas proporciones de concentración

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Se ha mostrado por lo tanto que no sólo las superficies de titanio lisas sino también las que tiene una alta superficie específica y una rugosidad compleja tal como se usan a menudo para implantes, p. ej. para implantes óseos, pueden recubrirse con éxito conforme al procedimiento según la invención.

Ejemplo 3 Inmunoensayo tipo sándwich sobre chips sensores recubiertos de DDP: detección cuantitativa del analito inmunoglobulina (IgG de conejo) y de la citocina humana interleucina 6 (hIL-6) mediante detección por fluorescencia sobre guiaondas planos como plataforma sensora

El objetivo del experimento era mostrar que mediante la modificación de la superficie según la invención de un guiaondas plano de capa fina como plataforma sensora, aplicando monocapas de fosfatos de alquilo o alquilfosfonatos puede conseguirse un aumento claro de la sensibilidad en comparación con las plataformas sensoras sin un tratamiento previo según la invención de este tipo. Las sensibilidades de detección conseguidas se sitúan en el rango de pg/ml inferior. Una sensibilidad de este tipo sólo puede conseguirse si sobre la superficie sensora en forma activa, es decir, sin desnaturalizar, pueden colocarse un número correspondientemente alto de anticuerpos de reconocimiento. Esto puede conseguirse aplicando una SAM de dodecilfosfato (DDP-SAM). Se trataba de demostrar, además, que los ensayos sobre chips sensores sin una previa precipitación de una monocapa de DDP, pero con el mismo tratamiento previo en los restantes aspectos, presentan señales de ensayo correspondientemente más bajas. Había que demostrar además que una monocapa de DDP, y con ello el número de moléculas de reconocimiento ligadas a la superficie, se mantiene estable durante una duración del experimento de varias horas y que también con un estrés mecánico adicional, como p. ej. un lavado intenso de la superficie con tampones de medición, no sufre ningún daño. La estabilidad se manifiesta mediante una respuesta uniforme de la señal de fluorescencia después de realizado un experimento de enlace.

3.1. Plataformas sensoras

Como plataformas sensoras se usaron chips de guiaondas planos y rectangulares formados por una capa guiaondas delgada altamente refractiva sobre un sustrato transparente de 0,7 mm de espesor, con las dimensiones exteriores de 16 mm de alto x 48 mm de ancho x 0,7 mm de espesor. El material de sustrato ópticamente transparente del chips sensor consistía en vidrio AF45 (índice de refracción n = 1,52 a 633 nm). En el sustrato había estructuradas cinco retículas de relieve superficial con una anchura de 0,5 mm (en el sentido de extensión de la luz de excitación que hay que acoplar a través de la estructura de retícula en la capa de la plataforma sensora) a lo largo de la altura del sustrato. Las retículas estaban colocadas con una separación de 9 mm a lo largo de la anchura del chip. La superficie entre dos retículas se usó como superficie de medición. Las retículas de relieve presentan un período de 360 nm y una profundidad de 12 nm. La capa ópticamente transparente, conductora de ondas y formada por Ta_{2}O_{5} tenía un índice de refracción de 2,11 a 633 nm (espesor de la capa 150 nm).

Las retículas de relieve sirven para el acoplamiento de la luz de láser a una longitud de onda definida (aquí 633 nm) en la capa sensora. La luz acoplada en la capa sensora y allí guiada se usa para excitar fluoróforos próximos a la superficie, es decir, en el campo evanescente de la luz guiada. La luz fluorescente generada de esta manera en la superficie sirve de señal de medición para el enlace de moléculas de analito a los elementos de reconocimiento específicos inmovilizados sobre la superficie sensora. A partir de la intensidad de la fluorescencia emitida se puede determinar el número de moléculas de analito ligadas.

Para poner en contacto la muestra de analito con el chip sensor se unió una estructura de celdas de flujo con la plataforma sensora previamente tratada. La estructura de celdas de flujo comprendía recipientes para muestras en cada uno de los cuales existía una superficie de medición entre dos retículas sobre el chip. Cada uno de los recipientes para muestras tenía un volumen de 15 \mul con una superficie de base de 7 mm x 11 mm sobre la superficie sensora y una altura de la cámara de 0,2 mm. La muestra de análisis se podía introducir o extraer de la cámara de muestras a través de una canal de inyección o de salida (diámetro 0,5 mm). La adición de muestras/tampones se realizó mediante una bomba dispensadora a través de conexiones por tubo flexible entre la bomba y la salida.

3.2 Tratamiento previo del chip

Antes de su encaje en la estructura de celdas de flujo, la superficie sensora se limpió químicamente en húmedo, primero varias veces con isopropanol, a continuación con ácido sulfúrico concentrado que contenía peroxodisulfato amónico al 2,5%. A continuación se precipitó una capa monomolecular (monocapa) de dodecilfosfato (DDP) en un proceso de autoorganización (Self-Assembly) a partir de fase acuosa sobre la superficie guiaondas hidrófila. Para la precipitación se usó una solución 0,5 mM de DDP/sal amonio en agua. La superficie sensora se incubó durante 2 h en la solución de DDP bajo agitación constante y a temperatura ambiente, a continuación se lavó abundantemente en agua circulante y después se secó en una corriente de nitrógeno. La precipitación de la monocapa de DDP dio lugar a una superficie hidrófoba (ángulo de contacto aprox. 110º frente al agua).

3.3 Aplicación de los elementos de reconocimiento biológicos (A) para detección de IgG de conejo

Se incubó la superficie sensora con una solución acuosa de albúmina de suero bovino biotinilada (BSA-Biotin, Sigma, Nº de catálogo A-6043). Se uso una solución de 100 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Se incubó el chip durante 1 h a temperatura ambiente, se lavó abundantemente en agua desionizada circulante (Milipore, resistencia específica = 18 m\Omega cm) y después se seco en una corriente de nitrógeno. A continuación se bloqueó la superficie con una solución de 1 mg/ml de albúmina de suero bovino pura (BSA, Sigma, Nº de catálogo A7906) en PBS, pH 7,4. Después se incubó durante 15 minutos, volvió a lavarse en agua Millipore desionizada circulante y a continuación se seco bajo una corriente de nitrógeno. Después durante 30 minutos, la superficie bloqueada se incubó de la misma manera con 50 \mul/ml de estreptavidina (Sigma, Nº de catálogo S4762) en PBS, pH 7,4. Las moléculas de estreptavidina se unen entonces a los grupos de biotina accesibles. El exceso de estreptavidina volvió a eliminarse lavando con agua. Por último, la superficie se incubó durante 30 minutos con los anticuerpos de reconocimiento biotinilados anti-IgG de conejo (Sigma, Nº de catálogo B-7389) en una concentración de 12 \mug/ml en PBS, 7,4, volvió a lavarse abundantemente con nitrógeno. El chip seco se unió entonces a la estructura de celdas de flujo.

(B) para detección de hIL-6

Se incubó la superficie sensora en la zona de la superficie de medición con 50 \mul de una solución acuosa de anticuerpos de ratón Anti-hIL-6 monoclonales (R&D Systems, Nº de catálogo mAb206). Los anticuerpos de ratón Anti-hIL-6 liofilizados se reconstituyeron para ello en una concentración de 0,5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato al diez por ciento (10% PBS), pH 7,4, y a continuación se diluyeron con 10% PBS, pH 7,4, hasta una concentración de 10 \mug/nl. Con esta solución se incubó el chip durante 2 h a temperatura ambiente, se lavó abundantemente en agua Millipore desionizada circulante (resistencia específica = 18 m\Omega cm) y después se secó bajo una corriente de nitrógeno. A continuación se bloqueó la superficie con una solución de 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma, Nº de catálogo A7906) en PBS, pH 7,4. Después se incubó durante 15 minutos, volvió a lavarse abundantemente en agua Millipore desionizada circulante y a continuación se seco bajo una corriente de nitrógeno. El chip seco se unió con la estructura de celdas de flujo y se colocó en el aparato medidor.

3.4 Aparato de medición analítico

El chip sensor está montado sobre una unidad de ajuste controlada por ordenador que permite la traslación paralela y verticalmente a las líneas de la retícula y una rotación alrededor del eje de giro paralelamente a las líneas de la retícula de la plataforma sensora. Directamente detrás del láser usado como fuente de luz de excitación se encuentra en el recorrido óptico un obturador (shutter) para bloquear el recorrido óptico cuando no deben registrarse datos de medición. Adicionalmente pueden colocarse en el recorrido óptico filtros neutros o polarizadores en esta u otras posiciones del resto del recorrido de la luz de excitación hacia la plataforma sensora para poder variar de manera continua o discontinua la intensidad de excitación.

El rayo de luz de excitación de un láser de helio-neón a 632,8 nm (Melles-Griot 05-LHP-901, 1,1 mW) es ensanchado en una dimensión con un sistema de lentes usando una lente cilíndrica y conducido a través de un diafragma en forma de ranura (abertura de 0,5 mm x 7 mm), para generar de esto modo un haz de luz paralelo de sección aproximadamente rectangular e intensidad transversal aproximadamente homogénea. La polarización de la luz del láser está orientada paralelamente a las líneas de la retícula de la plataforma sensora, para excitar el modo TE_{0} en condiciones de acoplamiento. La luz de excitación es dirigida a través del lado posterior de la plataforma sensora, es decir, a través de la capa ópticamente transparente (c), sobre una retícula de acoplamiento situada dentro de uno de los 5 recipientes para muestras, encontrándose la retícula de acoplamiento dentro de un recipiente para muestras bajo las condiciones del ejemplo de realización en el borde izquierdo de la cámara rectangular para muestras. El ángulo entre la plataforma sensora y el haz de luz de excitación irradiado se ajusta, mediante rotación alrededor del eje de giro mencionado anteriormente, al máximo acoplamiento en la capa transparente (a). Con los parámetros de la plataforma sensora anteriormente citados, el ángulo de resonancia para el acoplamiento en aire fue de aproximadamente 2,6º.

Como detector sirve un fotomultiplicador (PMT) sensible al rojo (H6240, Hamamatsu, Japón) que se lee en el modo de conteo por fotones individuales con un contador de 225 MHz (Modelo 53131A, Hewlett-Packard, EE.UU.). El registro de la señal y el enfoque de la luz fluorescente emitida por el lado del sustrato del chip sensor sobre la ventana de detección del PMT se realiza con ayuda de un objetivo automontado (imagen 1:1, apertura numérica 0,19). En la parte paralela de la trayectoria del rayo al objetivo se encuentran, montados sobre un cambiador de filtros, dos filtros de interferencia (Omega, Brattleborough, Vermont) con longitud de onda central de 680 nm y 40 nm de anchura de banda, así como delante de la unidad de filtros una delgada placa de vidrio como divisor del rayo, que midiendo con un fotodiodo puede registrar como señal de referencia la luz de excitación dispersada desde la superficie sensora. Mediante esta disposición se garantiza que la señal de luminiscencia y la señal de referencia proceden del mismo tramo de medición. Las señales de la referencia (para la longitud de onda de excitación) y la señal de medición propiamente dicha (para la longitud de onda de luminiscencia) pueden medirse simultáneamente. Las señales de medición mostradas ya se han corregido y referenciado con ayuda de la señal de referencia para eliminar oscilaciones del intervalo de medición. Las señales de medición se determinaron como cociente de la señal de luminiscencia y la señal de referencia, multiplicado por un factor 10^{6}.

3.5. Realización del procedimiento de detección analítico

Para el reconocimiento específico de los analitos que hay que detectar (IgG de conejo o h-IL-6 respectivamente) se eligió el formato de inmunoensayo tipo sándwich.

3.5.1. Preparación de las muestras

De los analitos que hay que cuantificar (IgG de conejo o h-IL-6) se prepararon soluciones estándar de 500 \mul cada una en PBS, pH 7,4, con 0,1% BSA y 0,05% Tween20. Las concentraciones fueron en cada caso 0, 0,067, 0,67, 6,7, 67 o 670 pM para el analito IgG de conejo (Sigma, Nº de catálogo I-5006) y 0, 0,5, 1, 2,5, 5, 25, 50, 250, 500, 2500, 10.000 pg/ml para el analito hIL-6 (R&D Systems, Nº de catálogo 206-IL-06) con una adición en cada caso de un 10% de suero de ternera (Anawa, Nº de catálogo 8270-0209). Estas soluciones estándar estaban previstas para la elaboración de curvas de calibración de los analitos con el fin de poder determinar las concentraciones de muestras de cantidades desconocidas de analito.

Las soluciones de calibración, lo mismo que las muestras con concentraciones desconocidas de los analitos que hay que determinar, se mezclaron a continuación con 500 \mul cada uno de una solución que contenía anticuerpos de detección policlonales. Para la detección de IgG de conejo se usó IgG de cabra anti-conejo, marcado con colorante Cy5 (Amersham-Pharmacia, Nº de catálogo PA45004) con una relación de colorante a proteína de 4:1. Para la detección de hIL-6 se uso anticuerpo anti-hIL-6 (AF-206-NA, R&D Systems, R.U.) marcado con Cy5 y con una relación de colorante a proteína de 5:1. La solución de analito y la solución de trazador se mezclaron cada uno en la proporción 1:1 y se incubaron durante 1 h en oscuridad a 37ºC.

3.5.2 Realización de la medición

El chip sensor, seco y tratado previamente, con la estructura de celdas de flujo colocada se introdujo en el aparato de medición. Para realizar un experimento se lavó el recipiente para muestras seco con tampón de medición (PBS, pH 7,4, 0,05% Tween 20, 0,1% BSA) durante 5 minutos con un flujo continuo de 0,25 ml/min. Para optimizar las condiciones de excitación para excitar luminiscencia se ajustó el chip sensor, con las cámaras para muestras situadas encima y la solución allí dispuesta, al máximo acoplamiento de la luz de excitación a través de la estructura de retícula asignada a cada intervalo de medición y se midió la intensidad de la luz de emisión procedente del intervalo de medición durante un período de 1 s. Las soluciones estándar incubadas previamente se introdujeron en las cámaras para muestras de manera secuencial en concentración creciente a partir de un muestreador automático (autosampler) (231XL, Gilson, EE.UU.) mediante una bomba dispensadora. Al lavar se expulsó la solución restante a través de la salida de la cámara para muestras.

En el caso de la detección de la IgG de conejo se aplicó toda la muestra (1 ml) bajo flujo continuo (0,25 ml/min) durante 4 minutos y durante este tiempo se midió en tiempo real mediante el aumento de la fluorescencia la fijación del analito a la superficie sensora preparada (puntos de medición cada 30 s, Fig. 12). A continuación se lavó durante 8 minutos con solución tampón antes de aplicar la muestra con la siguiente concentración más alta. En el caso de la detección de hIL-6 la muestra sólo se inyectó de manera breve y rápida (flujo 1 ml/min) y a continuación, sin flujo, durante un período de 30 minutos y hasta alcanzarse el estado de equilibrio se midió la fijación de las moléculas de analito procedentes de la muestra estática a sus elementos de reconocimiento movilizados (puntos de medición cada 60 s, Fig. 13a). En este caso no se produjo ningún paso de lavado entre las incorporaciones secuenciales de muestras. El curso corregido de la señal a partir de los cocientes de las señales de fluorescencia y de referencia medidas, se representa en las Figuras 12 (IgG de conejo como analito) y 13a (hIL-6 como analito). A partir de la primera medición con una muestra sin analitos se determinó el grado de unión no específica. Las señales de unión netas a las distintas concentraciones de analito se determinaron entonces como la diferencia entre la señal bruta corregida y medida a la concentración de analito actual y la señal de unión no específica. A partir de aquí se generaron las curvas de señal-concentración para IgG de conejo (Figura 13b para hIL-6).

La Figura 13a muestra el curso de las señales de unión en una serie de mediciones para detectar hIL-6. Durante toda la duración del experimento, de más de 7 horas, no se observó ninguna disminución sistemática de la altura de las señales, incluso después de alcanzarse las señales de saturación en el estado estacionario para la correspondiente concentración de analito. Esto significa que no se produjo pérdida de señal por lavado del colorante ni pérdida de señal por el eventual desprendimiento desde la superficie de complejos de enlace productores de señal, lo cual permite deducir una inmovilización muy estable de los elementos de reconocimiento biológicos usados sobre la superficie de la plataforma sensora. También un lavado vigoroso (flujo 2 ml/min durante un período de 5 minutos) de la superficie del sensor con cantidades mayores de la muestra, equiparable a la aplicación de un estrés mecánico, condujo a un curso estacionario de la señal y no a una disminución de la misma, lo cual es una indicación más de la elevada estabilidad de la inmovilización.

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Ensayo de prestación de hIL-6 sin capa transmisora de adherencia

Para estudiar la influencia positiva de una monocapa DDP sobre la intensidad de las señales del ensayo, es decir, la cantidad de elementos de reconocimiento funcionalmente inmovilizados y con ello sobre los límites de detección alcanzables, con fines comparativos se llevó a cabo el inmunoensayo hUL-6 sobre chips sensores sin llevar aplicada la monocapa DDP pero en lo demás con la superficie tratada previamente de igual modo. Tal como se muestra en la Figura 13a, las señales de unión alcanzaban como máximo el 10% de las señales de los experimentos con la capa transmisora de adherencia de DDP precipitada. Las menores señales son atribuibles a un menor recubrimiento de la superficie y/o a la desnaturalización de los anticuerpos de reconocimiento sobre la superficie sin tratar.

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Ejemplo 4 Inmunoensayo de tipo sándwich sobre monocapas de fosfatos de alquilo con terminación hidrófoba/hidrófila mixtos

El objetivo del experimento era mostrar que las señales de ensayo, y con ello las sensibilidades de detección de los inmunoensayos, pueden aumentarse notablemente sobre las superficies sensoras que se producen mediante precipitación de monocapas de mezclas definidas de fosfatos de alquilo con terminación hidrófoba (alquilo) y con terminación hidrofila (hidroxilo). Tal como se ha mostrado ya, el ángulo de contacto de superficies de óxido metálico frente al agua se puede ajustar selectivamente mediante la correspondiente mezcla de fosfatos de alquilo con terminación hidrófila e hidrófoba. Esto permite una optimización específica del número de elementos de reconocimiento funcionalmente inmovilizados dependiendo del tipo de elementos de reconocimiento usados. Se usaron como elementos de reconocimiento los anticuerpos descritos en el Ejemplo 3.

Se prepararon superficies de chips sensores con monocapas a partir de mezclas acuosas de DDP-OH:DDP en la proporción de 0:100, 20:80, 40:60, 80:20 y 100:0 por ciento. El tratamiento posterior de los chips y la realización de las mediciones se produjeron tal como se describe en el Ejemplo 3. En la Figura 14 se representan las señales de respuesta normalizadas para las mezclas usadas. En el caso de la detección de IgG de conejo, la señal de respuesta en la mezcla óptima puede aumentarse hasta el 300% frente al valor con una capa DDP pura. La proporción de mezcla óptima se encuentra entre 80:20 y 60:40 por ciento de DDP-OH:DDP, o sea, en una superficie hidrófila. Se alcanzaron valores similares en los ensayos para la detección de hIL-6.

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Ejemplo 5 Generación de una capa doble transmisora de adherencia y biocompatible (formada por una capa DDP y una capa lipídica) libre de restos de disolventes orgánicos

Tal como ya se ha mostrado, mediante precipitación de DDP a partir de fase acuosa pueden generarse monocapas muy hidrófobas sobre superficies de óxido metálico. Las capas son muy adecuadas para la precipitación de otras monocapas, p. ej. formadas por lípidos naturales o sintéticos. Las capas dobles así generadas simulan en su superficie las propiedades de membranas celulares naturales y son especialmente adecuadas para la inmovilización funcional de elementos de reconocimiento anclados o unidos a la membrana tales como receptores celulares, o incluso partículas de membrana completas que como es conocido reaccionan muy sensibles con cambios al contacto con medios con propiedades fisico-químicas distintas a su entorno de membrana natural. De este modo, los menores cambios en la estructura proteínica a consecuencia del contacto con una superficie sensora dura hidrófoba conducen a la desaparición total de la funcionalidad de receptor.

Parte A)

Generación de capas dobles biocompatibles formadas con una primera monocapa DDP con superficie hidrófoba y una segunda monocapa de lípidos que se formó sobre la primera superficie hidrófoba por ensanchamiento espontáneo de vesículas de lípido

Conforme a la descripción en el Ejemplo 3 se generaron superficies sensoras hidrófobas con una monocapa a partir de DDP. Se prepararon vesículas de lípido a partir del lípido sintético 1-palmitoil(C_{16})-2-oleilo (C_{18})-SN-glicero-3-fosfocolina (POPC) (Avanti Polar Lipids, Nº de catálogo 850457). Para ello se recogieron 6 mg de POPC seco en 3 ml de tampón de vesículas (150 mM NaCl, 10 mM tampón fosfato, 0,002% NaN_{3}, pH 7,5), se incubaron durante 12 h en nevera a 4ºC y a continuación se mezclaron, lo cual dio lugar a una suspensión turba. Las vesículas de lípido de monocapa con un tamaño de aproximadamente 100 nm se generaron entonces mediante extrusión (aprox. 20 veces) a través de filtros de poro de 100 nm (¿extrusora?). Se continuó la formación de las vesículas por medio de un aclaramiento creciente. Las superficies hidrófobas de los chips sensores se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con suspensión de vesículas diluida (0,5 mg/ml) con los recipientes para muestras colocados. El exceso de suspensión de vesículas se expulsa mediante un lavado abundante con tampón de vesículas. La cinética de la formación de una segunda monocapa de lípidos mediante ensanchamiento de vesículas se siguió con ayuda de vesículas con marcadores fluorescentes, que contenían 0,1 % de un lípido marcado con colorante (1,2-dioleoil(C_{18})-SN-glicero-3-fosfoetanolamina-fluoresceína (DOPE-fluoresceína), mediante la medición de la fluorescencia en el aparato de medición descrito en el Ejemplo 3.4. La cinética de la formación de la segunda capa de lípidos (con 0,1% de lípido colorante) sobre la capa DDP se muestra en la Figura 5. El cambio de la señal entre la línea de base inicial y el nivel de señal final después del lavado de la superficie se corresponde con la señal de una monocapa. Esta señal vale aproximadamente el 50% de la señal en la formación de una capa doble de lípidos marcados del mismo modo con fluorescencia, si se incuba una suspensión de vesículas del mismo tipo con una capa de óxido metálico hidrófila desnuda como superficie sensora (sin primera capa hidrófoba).

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Parte B)

Demostración de la biocompatibilidad de una capa doble de lípido-DDP para la inmovilización de receptores de membrana, detectada con un ensayo de enlace en los fragmentos de membrana nativos inmovilizados sobre la doble capa con la enzima de membrana Na,K-ATPasa ligado

La enzima Na,K-ATPasa, componente integral de membranas celulares naturales, regula en su función como bomba iónica (de iones K^{+} y Na^{+}) el potencial de membrana de células vivas. Se desarrolló un ensayo basado en la fluorescencia para la unión de iones K^{+} a la enzima sobre superficies sensoras. La señal de unión de K^{+} se considera una medida sensible de la funcionalidad de la enzima, el bombeo de los iones K^{+} a través de la membrana celular. Los iones necesarios para el proceso de bombeo se facilitan fijando específicamente estos iones a la proteína.

Se inmovilizaron fragmentos de membrana naturales, que tienen fijados a su membrana la enzima de membrana Na,K-ATPasa, sobre un sistema de doble membrana DDP (en fase acuosa)-lípido descrito en la Parte A sobre un chip guiaondas plano como plataforma sensora. La inmovilización funcional y estable de los fragmentos de membrana y con ello de la enzima se detecta mediante la capacidad de generar señales de fijación de K^{+} descrita anteriormente. En la inmovilización de los fragmentos de membrana sobre chips sensores desnudos sin sistema de capa doble, por lo demás comparables, se pierde la capacidad de generar la señal de fijación de K^{+}. Con ello se demuestra la acción biocompatible de la capa transmisora de adherencia presentada, aquí un sistema de doble capa libre de restos de disolventes orgánicos y formado por una capa de fosfatos de alquilo y lípidos, sobre la inmovilización funcional de proteínas de membrana y fragmentos de membrana enteros. La inmovilización de la enzima de membrana con la posibilidad del contacto hacia la superficie sensora desnuda conduce a desnaturalización, y con ello pérdida de función, de la proteína a analizar.

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Descripción de las figuras

Fig. 1: representación esquemática de la estructura ordenada de SAM de fosfato de alquilo sobre una superficie de óxido.

Fig. 2: proporciones de unión en la capa SAM ordenada entre fosfatos de alquilo y una superficie de óxido de tántalo (Ta_{2}O_{5}).

Fig. 3: mediciones de densidad de microgotas en SAM de DDPO_{4} sobre distintas superficies de óxido metálico lisas (tamaño de la imagen: 1 mm^{2}): a) Al_{2}O_{3}, b) Ta_{2}O_{5}, c) Nb_{2}O_{5}, d) ZrO_{2}, e) Fe_{2}O_{3}, f) TiO_{2}, g) Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2} y h) SiO_{2}. Véase el texto.

Fig. 4: SAM de DDPO_{4} sobre la superficie de Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2} con una tira de 2 mm de ancho de Fe_{2}O_{3}. La superficie de Fe_{2}O_{3} está recubierta de DDPO_{4} y es hidrófoba (baja densidad de microgotas), mientras que el sustrato (Ti_{0,4}Si_{0,6}O_{2}) se mantiene más hidrófilo ya que sólo esta recubierto con DDPO_{4} de manera incompleta.

Fig. 5a: Señal XPS O1s de capas SAM de OH-DDPO_{4} sobre sustratos de Ta_{2}O_{5}: los espectros O1s a los distintos ángulos de salida (20,5º = curva superior a; 11,5º = curva media b) se comparan con la correspondiente señal de la capa SAM de DDPO_{4} (curva inferior c).

Fig. 5b: Señal XPS O1s de capas SAM de OH-DDPO_{4} sobre sustratos de Nb_{2}O_{5}: los espectros O1s a los distintos ángulos de salida (20,5º = curva superior a; 11,5º = curva media b) se comparan con la correspondiente señal de la capa SAM de DDPO_{4} (curva inferior c).

Fig. 6a: comparación de las concentraciones de carbono, determinadas mediante XPS, de SAM de OH-DDPO_{4} y DDPO_{4} sobre Ta_{2}O_{5} dependiendo del seno del ángulo de detección \Theta (OH-DDPO_{4}-carbono: círculo lleno; DDPO_{4}-carbono: cuadrado abierto).

Fig. 6b: comparación de las concentraciones de carbono, determinadas mediante XPS, de SAM de OH-DDPO_{4} y DDPO_{4} sobre Nb_{2}O_{5} dependiendo del seno del ángulo de detección \Theta (OH-DDPO_{4}-carbono: círculo lleno; DDPO_{4}-carbono: cuadrado abierto).

Fig. 7a: Superficies de pico XPS como función del seno del ángulo de detección \Theta de Nb(3d), C(1s) y P(2p) sobre Nb_{2}O_{5}. La señal O(1s) se separó en tres componentes: O(Nb_{2}O_{5}): cuadrados, O(PO_{4}): triángulos, O(ROH): círculos. Se encontraron resultados similares también en el caso del sustrato Ta_{2}O_{5}.

Fig. 7b: Superficies de pico XPS como función del seno del ángulo de detección \Theta de los distintos oxígenos para SAM de OH-DDPO_{4} sobre Nb_{2}O_{5}.La señal O(1s) se separó en tres componentes: O(Nb_{2}O_{5}): cuadrados, O(PO_{4}): triángulos, O(ROH): círculos. Se encontraron resultados similares también en el caso del sustrato Ta_{2}O_{5}.

Fig. 8: ángulo de contacto de SAM mixtos de OH-DDPO_{4}/DDPO_{4} sobre Ta_{2}O_{5}. Los resultados se representan como función de la proporción de mezcla en la solución SAM (% de volumen). La concentración total de fosfato de alquilo se mantuvo constante (0,5 mM).

Fig. 9 Superficie de la superficie de una muestra de titanio puro (cp Ti) hecha rugosa mediante radiación y corrosión química. Origen de la muestra: Institud Straumann AG, Waldenburg, Suiza. Fotografía con microscopio electrónico de cribado.

Fig. 10. Ángulo de contacto como medida de la humectabilidad de superficies metálicas de titanio lisas, tratadas con soluciones acuosas de las sales DDPO_{4}(NH_{4})_{2}, OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} o sus mezclas (serie de datos superior: ángulo de contacto de avance, serie inferior de datos: ángulo de contacto de retroceso).

Fig. 11. Ángulo de contacto como medida de la humectabilidad de superficies metálicas de titanio rugosas, tratadas con soluciones acuosas de las sales DDPO_{4}(NH_{4})_{2}, OH-DDPO_{4}(NH_{4})_{2} o sus mezclas (serie de datos superior: ángulo de contacto de avance, serie inferior de datos: ángulo de contacto de retroceso).

Fig. 12: Curso de señal corregido añadiendo concentraciones crecientes del analito IgG de conejo, detectado mediante ensayo tipo sándwich basado en fluorescencia sobre guiaondas de capa fina como plataformas sensoras, sobre las que se inmovilizaron los anticuerpos de reconocimiento específicos sobre una monocapa de dodecilfosfato (DDP). En los pasos secuenciales del ensayo a la adición del analito durante 4 minutos le sigue un paso de lavado con solución tampón (8 min).

Fig. 13a: Curso de señal corregido añadiendo concentraciones crecientes del analito hIL-6, detectado en un ensayo tipo sándwich basado en fluorescencia sobre guiaondas de capa fina como plataformas sensoras, sobre las que se inmovilizaron los anticuerpos de reconocimiento específicos en presencia y ausencia de una monocapa de dodecilfosfato (DDP). Se reconocen fácilmente los vigorosos ascensos de la señal en presencia de una monocapa DPD, lo que permite deducir una inmovilización funcional de un gran número de anticuerpos de reconocimiento.

Fig. 13b: Dependencia señal-concentración (curva de respuesta a la dosis) generada a partir de las señales de respuesta estacionarias según la Figura 13a (chip con monocapa de DDP). El curso de los puntos de datos corresponde a una isoterma de unión Langmuir (fijación 1:1) adecuada a los datos.

Fig. 14: señales de ensayo relativas de experimentos para detectar IgG de conejo (250 pM) realizados sobre superficies de chip con monocapas que se precipitaron a partir de distintas mezclas acuosas de DDP con terminación OH y DDP con terminación hidrófoba. Las barras de error muestran las desviaciones de las mediciones en dos chips. Se normalizó a las señales para el 60% de porción DDP con terminación OH.

Fig. 15: Curso de la señal en la formación de una segunda monocapa de lípidos marcados con fluorescencia (POPC con 0,1% DOPE-fluoresceína) mediante el ensanchamiento de vesículas de lípido (diámetro aprox. 110 nm) sobre una monocapa de DDP hidrófobo sobre un guiaondas de capa fina de óxido metálico como plataforma sensora.

Claims

1. Procedimiento para la precipitación de monocapas o capas múltiples de ácidos organofosfóricos de la fórmula general I(A)

(IA)Y-B-OPO_{3}H_{2}

o de ácidos organofosfónicos de la fórmula general I(B)

(IB)Y-B-PO_{3}H_{2}

y sus sales, en las que B significa un resto alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, hetarilo o hetarilalquilo y Y hidrógeno o un grupo funcional de la serie de hidroxi, carboxi, amino, monoalquilamino o dialquilamino eventualmente sustituidos por alquilo inferior, tiol o un grupo ácido negativo de la serie éster, fosfato, fosfonato, sulfato, sulfonato, maleimida, succinimidilo, epoxi, acrilato, pudiendo acoplado a B o Y mediante reacción de adición o sustitución un elemento de reconocimiento biológico, bioquímico o sintético, pudiendo estar adicionados también compuestos que confieren a la superficie del sustrato una resistencia contra la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular y en B eventualmente pueden estar contenidos en la cadena en lugar de uno o más grupos -CH_{2}- uno o más grupos óxido de etileno, sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos puros o mixtos de metales y semiconductores, caracterizado porque para el tratamiento de estas superficies, en especial como superficies de plataformas sensoras, implantes y apa-
ratos auxiliares médicos, se usan sales hidrosolubles de un compuesto de la fórmula (IA) o (IB) en solución acuosa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque antes de la precipitación de las mencionadas monocapas o capas múltiples se aísla en solución acuosa la sal hidrosoluble de un compuesto de fórmula (IA) y/o (IB).

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque como sales de los compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) se usan en especial sales de sodio, potasio y amonio.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque como sustratos se usan óxidos, nitruros o carburos de tántalo, niobio, titanio, vanadio, circonio, hafnio, molibdeno, wolframio, silicio o sus mezclas en forma de cuerpos macizos o como capas sobre sustratos discrecionales.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque para el recubrimiento se usan compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) en las que los grupos B e Y conjuntamente significan un grupo alquilo o un grupo alquilo de 2-24 átomos de C eventualmente sustituido.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque para el recubrimiento se usan compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) en las que los grupos B e Y conjuntamente significan un grupo alquilo o un grupo alquilo de 2-12 átomos de C eventualmente sustituido.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque para el recubrimiento se usan compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) en las que los grupos B e Y conjuntamente significan un grupo alquilo de 10-12 átomos de C.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque para el recubrimiento se usan compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) en las que los grupos B e Y conjuntamente significan un grupo alquilo inferior de 2-5 átomos de C.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque como elementos de reconocimiento bioquímicos, biológicos o sintéticos acoplados a B o Y se seleccionan aquellos del grupo de los ácidos nucleicos, como p. ej. ADN, ARN, oligonucleótidos, análogos de ácidos nucleicos, como p. ej. ANP, anticuerpos monoclonales o policlonales, péptidos, enzimas, aptámeros, estructuras peptídicas sintéticas, proteínas solubles unidas a membrana y aisladas a partir de una membrana, como p. ej. receptores, sus ligandos, antígenos para anticuerpos, biotina, componentes de cola de histidina ("tag-histidina)" y sus asociados de formación de complejo.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque un elemento de reconocimiento biológicamente activo comprende péptidos, proteínas, glicoproteínas, factor de crecimiento como p. ej. TGF-\beta o BMP (Bone Morphogenic Protein).

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque como compuestos que confieren a la superficie del sustrato una resistencia frente a la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular, estos se seleccionan preferentemente del grupo de compuestos formados por oligo(óxido de etileno), fosforilcolina, heparina, sacáridos, albúminas, en especial albúmina de suero de bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos inespecíficos, policlonales o monoclonales, de distinta especie o empíricos para el o los analitos que hay que detectar, en especial para inmunoensayos, detergentes -como por ejemplo Tween 20-, ADN natural o sintético fragmentado que no hibrida con polinucleótidos que haya que analizar, como por ejemplo un extracto de esperma de arenque o de salmón, en especial para ensayos de hibridación de polinucleótidos, o también polímeros no cargados pero hidrófilos como por ejemplo polietilenglicoles o dextranos.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque los compuestos de la fórmula (IA) y/o (IB) comprenden distintos grupos funcionales y/o elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos y/o compuestos para conferir una resistencia de la superficie frente a adsorción de proteínas y/o adhesión celular en una molécula de SAM.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque sobre una primera monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos se precipitan en solución acuosa una segunda o secuencialmente más monocapas, de tal manera que sobre las mencionadas superficies de sustrato se genera una capa doble o capa múltiple.

14. Procedimiento según la reivindicación 1 y 13, caracterizado porque a través de la primera monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos se precipita en solución acuosa una superficie hidrófoba, sobre la que se precipita una capa adicional de lípidos sintéticos o naturales.

15. Procedimiento según la reivindicación 1 y 14, caracterizado porque la mencionada capa adicional de lípidos sintéticos o naturales se genera a partir de una suspensión de vesículas lipídicas mediante deposición espontánea de las vesículas en la superficie hidrófoba de una primera monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos, seguida de la extensión de las membranas de las vesículas sobre esta primera monocapa.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 14-15, caracterizado porque los lípidos sintéticos o naturales se seleccionan del grupo formado por fosfoglicerolípidos, etc. en solución acuosa, o comprenden una mezcla de estas moléculas.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 13-16, caracterizado porque con la mencionada capa adicional hay asociados grupos moleculares Y y/o B y/o elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos y/o compuestos que confieren a la superficie una resistencia frente a adsorción de proteínas y/o adhesión celular en solución acuosa, según una de las reivindicaciones 1-11.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 13-17, caracterizado porque sobre una capa múltiple con una primera monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos sobre una superficie de sustratos se inmovilizan vesículas o microsomas sintéticos o naturales en solución acuosa, eventualmente con elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos asociados, que se seleccionan del grupo formado por ácidos nucleicos, por ejemplo ADN, ARN, oligonucleótidos, y análogos de ácidos nucleicos, p. ej. ANP, anticuerpos mono- o policlonales, péptidos, enzimas, aptámeros, estructuras peptídicas sintéticas, proteínas solubles unidas a membrana y aisladas a partir de una membrana, como por ejemplo receptores, sus ligandos, antígenos para anticuerpos, biotina, componentes de cola de histidina ("tag-histidina)" y sus asociados de formación de complejo.

19. Procedimiento según las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque las capas precipitadas se trata de monocapas o capas múltiples mixtas de compuestos de las fórmulas I(A) y/o I(B) y sus sales.

20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque antes de la precipitación de las mencionadas monocapas o capas múltiples se aísla en solución acuosa la sal hidrosoluble de un compuesto de fórmula (IA) y/o (IB).

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-21, caracterizado porque como sales de los compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) se usan en especial sales de sodio, de potasio y amonio en solución acuosa.

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-21, caracterizado porque como sustratos se usan en solución acuosa óxidos, nitruros o carburos de tántalo, niobio, titanio, vanadio, circonio, hafnio, molibdeno, wolframio, silicio o sus mezclas en forma de cuerpos macizos o como capas sobre sustratos discrecionales.

23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 19-22, caracterizado porque para recubrimiento en solución acuosa se usan compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) en las que los grupos B e Y significan conjuntamente un grupo alquilo o un grupo alquilo de 2-24 átomos de C eventualmente sustituido.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-23, caracterizado porque como elementos de reconocimiento bioquímicos, biológicos o sintéticos acoplados a B o Y se seleccionan aquellos del grupo de los ácidos nucleicos, como p. ej. ADN, ARN, oligonucleótidos, análogos de ácidos nucleicos, como p. ej. ANP, anticuerpos monoclonales o policlonales, péptidos, enzimas, aptámeros, estructuras peptídicas sintéticas, proteínas solubles unidas a membrana y aisladas a partir de una membrana, como p. ej. receptores, sus ligandos, antígenos para anticuerpos, biotina, "componentes de cola de histidina (tag-histidina)" y sus asociados de formación de complejo.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-24, caracterizado porque un elemento de reconocimiento biológicamente activo comprende péptidos, proteínas, glicoproteínas, factor de crecimiento, como p. ej. TGF-\beta o BMP (Bone Morphogenic Protein).

26. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-25, caracterizado porque como compuestos que confieren a la superficie del sustrato una resistencia frente a la adsorción de proteínas y/o la adhesión celular, estos se seleccionan preferentemente del grupo de compuestos formados por oligo(óxido de etileno), fosforilcolina, heparina, sacáridos, albúminas, en especial albúmina de suero de bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos inespecíficos, policlonales o monoclonales, de distinta especie o empíricos para el o los analitos que hay que detectar, en especial para inmunoensayos, detergentes -como por ejemplo Tween 20-, ADN natural o sintético fragmentado que no hibrida con los polinucleótidos que haya que analizar, como por ejemplo un extracto de esperma de arenque o de salmón, en especial para ensayos de hibridación de polinucleótidos, o también polímeros no cargados pero hidrófilos como por ejemplo polietilenglicol o dextrano.

27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-26, caracterizado porque los compuestos de fórmula (IA) y/o (IB) comprende distintos grupos funcionales y/o elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos en una molécula de SAM.

28. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-27, caracterizado porque los sustratos presentan una superficie lisa con baja rugosidad o poseen superficies rugosas, presentando estas superficies eventualmente una estructuración adicional.

29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-28, caracterizado porque seleccionando las proporciones de mezcla se controla la hidrofilia o hidrofobia de la superficie.

30. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-29, caracterizado porque seleccionando la proporción de mezcla puede ajustarse una densidad controlada de cargas positivas y/o negativas sobre la superficie.

31. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 19-30, caracterizado porque seleccionando la proporción de mezcla puede ajustarse una densidad controlada de grupos reactivos y/o elementos de reconocimiento bioquímicos o "funciones" biológicas.

32. Procedimiento según la reivindicación 1 para la generación de superficies químicamente estructuradas mediante precipitación local de monocapas o capas múltiples de organofosfatos y/u organofosfonatos sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos puros o mixtos de metales o semiconductores, caracterizado para el tratamiento de las superficies se usan en solución acuosa compuestos salinos hidrosolubles de los correspondientes ácidos organofosfóricos o ácidos organofosfónicos y porque la precipitación de las monocapas o capas múltiples puras o mixtas se realiza mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1-31.

33. Procedimiento según la reivindicación 32 caracterizado porque la superficie de sustrato presenta un modelo definido con óxido de silicio u óxidos de metales de transición.

34. Procedimiento según la reivindicación 33 caracterizado porque sobre las zonas de óxido de silicio se realiza a partir de solución acuosa una precipitación adicional de monocapas o capas múltiples de organofosfatos y/u organofosfonatos.

35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-34 caracterizado porque la precipitación de las monocapas o capas múltiples a partir de soluciones acuosas se produce eventualmente de manera selectiva local, usando un método de precipitación seleccionado del grupo formado por inmersión, extensión, pincelado, "Ink jet spotting", "spotting" mecánico mediante rotulador, pluma o capilares, "micro contact printing", contacto fluídico de la superficie del sustrato con microcanales paralelos o cruzados bajo la acción de diferencias de presión o potenciales eléctricos o electromagnéticos'' etc.

36. Procedimiento para la generación de superficies químicamente estructuradas según una de las reivindicaciones 1, 32-35, caracterizado porque mediante precipitación local de monocapas o capas múltiples de organofosfatos y/u organofosfonatos sobre superficies de sustrato de óxidos, nitruros o carburos puros o mixtos de metales o semiconductores se generan zonas locales hidrófilas o hidrófobas y su superficie de sustrato circundante se cubre finalmente en solución acuosa con una monocapa de terminación hidrófoba o hidrófila.

37. Procedimiento caracterizado porque sobre una superficie químicamente estructurada generada conforme a un procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 32-35, se precipitan localmente de modo secuencial una o más monocapas según una de las reivindicaciones 13-18 y se generan con ello en solución acuosa capas múltiples
locales.

38. Procedimiento según la reivindicación 1 para la preparación de superficies de implante con implantes de metales, como p. ej. titanio, tántalo, niobio, aleaciones como titanio-aluminio-vanadio, titanio-aluminio-niobio, titanio-niobio-circonio, titanio-niobio-circonio-tántalo, cobalto-cromo, cobalto-cromo-molibdeno, hierro-níquel-cromo cubiertos de óxido, caracterizado porque sobre la superficie se realiza en solución acuosa la precipitación de monocapas o capas múltiples puras o mixtas de organofosfatos y/u organofosfonatos según una de las reivindicaciones 1-12 o 19-37.

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39. Procedimiento según la reivindicación 1 para la preparación de superficies de plataformas sensoras, caracterizado porque sobre la superficie se realiza en solución acuosa la precipitación de monocapas o capas múltiples puras o mixtas de organofosfatos y/u organofosfonatos según una de las reivindicaciones 1-37.

40. Implante de metal o cerámica con una monocapa de organofosfatos y/u organofosfonatos como superficie, caracterizado porque la superficie puede obtenerse mediante un procedimiento de precipitación en solución acuosa según una de las reivindicaciones 1-12 o 19-37.

41. Implante según la reivindicación 40, caracterizado porque el implante se selecciona del grupo de implantes de raíz para el campo dental, prótesis artificiales, como p. ej. diáfisis, rótulas o acetábulos de articulaciones coxo-femorales, articulaciones de la rodilla artificiales, componentes de osteosíntesis como p. ej. placas óseas, tornillos, "fixateur externe", componentes para la reparación de daños en la zona craneal ("maxillofacial devices"), componentes en el área de la cirugía de la columna vertebral ("spinal surgery implants"), mallas intravasculares, componentes de marcapasos cardiacos.

42. Aparatos médicos auxiliares de metales o cerámica con una monocapa o capa múltiple de organofosfatos y/u organofosfonatos como superficie, caracterizados porque la superficie puede obtenerse mediante un procedimiento de precipitación en solución acuosa según una de las reivindicaciones 1-12 o 19-37.

43. Aparatos médicos auxiliares de metales o cerámica según la reivindicación 42, caracterizados porque se seleccionan del grupo que comprende catéteres, catéteres de globo, endoscopios, componentes para sistemas conductores de sangre extracorpóreos como p. ej. máquinas de asistencia cardiocirculatoria.

44. Plataforma sensora con una monocapa o capa múltiple de organofosfatos y/u organofosfonatos como superficie, caracterizada porque la superficie puede obtenerse mediante un procedimiento de precipitación en solución acuosa según una de las reivindicaciones 1-37.

45. Plataforma sensora según la reivindicación 44, caracterizada porque comprende como mínimo un array de elementos de reconocimiento biológicos o bioquímicos o sintéticos inmovilizados en intervalos de medición discretos (d) para el reconocimiento y/o la fijación específicos de uno o más analitos y/o interacción específica con los mencionados analitos.

46. Plataforma sensora según una de las reivindicaciones 44-45, caracterizada porque la detección de uno o más analitos se realiza con ayuda de marcadores, que se seleccionan del grupo formado, por ejemplo, por marcadores luminiscentes, en especial intercaladores luminiscentes o "molecular beacons", marcadores de absorción, marcadores de masa, en especial coloides metálicos o cuentas de plástico, marcadores de espín, tal como marcadores EE o RMN, marcadores radioactivos.

47. Plataforma sensora según una de las reivindicaciones 44-46, caracterizada porque la detección de analitos se basa en la determinación de una modifición del índice de refracción efectivo debido a adsorción o desorción molecular en las zonas de medición (d).

48. Plataforma sensora según la reivindicación 47, caracterizada porque la detección del analito se basa en la determinación de una modificación de las condiciones para generar un plasmón superficial en la capa metálica de un sistema de capas múltiples, siendo la capa metálica preferentemente de oro o plata.

49. Plataforma sensora según una de las reivindicaciones 44-48, caracterizada porque la detección del analito se basa en la determinación de una modificación de una o más luminiscencias.

50. Plataforma sensora según la reivindicación 49, caracterizada porque la luz de excitación se irradia en una excitación de luz reflejada.

51. Plataforma sensora según una de la reivindicaciones 44-50, caracterizada porque el material de la plataforma sensora que está en contacto con la zona de medición es transparente o absorbente dentro de una profundidad de cómo mínimo 200 nm de las zonas de medición para como mínimo una longitud de onda de excitación.

52. Plataforma sensora según la reivindicación 50, caracterizada porque la luz de excitación se irradia en una disposición de transmisión.

53. Plataforma sensora según la reivindicación 52, caracterizada porque el material de la plataforma sensora es transparente como mínimo para una longitud de onda de excitación.

54. Plataforma sensora según una de las reivindicaciones 44-53, caracterizada porque la plataforma está configurada como un guiaondas óptico que preferentemente es en esencia plano.

55. Plataforma sensora según la reivindicación 53, caracterizada porque la plataforma sensora comprende un material ópticamente transparente del grupo formado por silicatos, p. ej. vidrio o cuarzo, plástico termoplástico o inyectable transparente, por ejemplo policarbonato, poliimida, acrilatos, en especial polimetacrilato de metilo, o
poliestirenos.

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56. Plataforma sensora según la reivindicación 54, caracterizada porque la plataforma sensora comprende un guiaondas de capa fina óptico con una capa transparente (a) como mínimo a una longitud de onda de excitación sobre una capa (b) igualmente transparente como mínimo a esta longitud de onda y con índice de refracción más bajo que la capa (a).

57. Procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitiva simultánea de una pluralidad de analitos, caracterizado porque una o más muestras líquidas que hay que analizar para los mencionados analitos son puestas en contacto con las zonas de medición (d) sobre una plataforma sensora según una de las reivindicaciones 44-56 y se miden las modificaciones resultantes de las señales procedentes de las zonas de medición.

58. Procedimiento según la reivindicación 57, caracterizado porque la detección analítica se basa en la determinación de la modificación de una o más luminiscencias.

59. Procedimiento según la reivindicación 58, caracterizado porque la luz de excitación de una o más fuentes de luz de excitación se irradia en una excitación de luz reflejada.

60. Procedimiento según la reivindicación 58, caracterizado porque la luz de excitación de una o más fuentes de luz de excitación se irradia en una disposición de transmisión.

61. Procedimiento según una de las reivindicaciones 58-60, caracterizado porque la plataforma sensora está configurada como un guiaondas óptico que prerentemente es en esencia plano, y porque la luz de excitación de una o más fuentes de luz se acopla en el guiondas óptico mediante un procedimiento seleccionado del grupo formado por acoplamiento de superficies frontales, acoplamiento a través de fibras ópticas dispuestas como conductor de luz, acoplamiento por prismas, acoplamiento en retículo o acoplamiento evanescente mediante solapamiento del campo evanescente del citado guiaondas óptico con el campo evanescente de otro guiaondas colocado para ello en contacto de campo próximo.

62. Procedimiento según una de las reivindicaciones 57-61, caracterizado porque la una o más muestras se incuban previamente con una mezcla de los distintos reactivos de detección para determinar los analitos que hay que detectar en las muestras mencionadas y después estas mezclas se añaden en una única etapa de adición a los arrays previstos para ello sobre la plataforma sensora.

63. Procedimiento según una de las reivindicaciones 58-62, caracterizado porque la calibración de las luminiscencias generadas a consecuencia del enlace de uno o más analitos o a consecuencia de la interacción específica con uno o más analitos en el campo próximo de la capa (a), comprende la adición de una o más soluciones de calibración con concentraciones conocidas de los mencionados analitos que hay que determinar sobre las mismas u otras zonas de medición o segmentos de las zonas de medición o arrays de zonas de medición sobre una plataforma sensora, a las que en la misma o en una etapa de adición distinta se añaden la muestra o las varias muestras que hay que analizar.

64. Procedimiento según una de las reivindicaciones 57-63 para la determinación cuantitativa o cualitativa, simultánea o secuencial, de uno o más analitos del grupo de anticuerpos o antígenos, receptores o ligandos, queladores o "componentes de cola de histidina (tag-histidina)", oligonucleótidos, hebras de ADN o ARN, análogos de ADN o ARN, enzimas, cofactores enzimáticos o inhibidores, lectinas e hidratos de carbono.

65. Procedimiento según una de las reivindicaciones 57-64, caracterizado porque las muestras que hay que analizar son fluidos corporales existentes de modo natural tales como sangre, suero, plasma, linfa u orina o yema de huevo o líquidos ópticamente turbios o líquidos tisulares o agua superficial o extractos de suelo o de plantas o caldos de procesos de síntesis o biosíntesis u obtenidos de piezas de tejidos biológicos o de cultivos o extractos celulares.

66. Uso de una plataforma sensora según una de las reivindicaciones 44-56 y/o de un procedimiento según una de las reivindicaciones 57-65 para análisis cuantitativos o cualitativos para determinar analitos químicos, bioquímicos o biológicos en procedimientos de cribado en investigación farmacológica, de química combinatoria, de desarrollo clínico y preclínico, para estudios de enlace en tiempo real y para determinar parámetros cinéticos en cribado de afinidad y en la investigación de determinaciones cualitativas y cuantitativas de analitos, en especial para la analítica de ADN y ARN, para la elaboración de estudios de toxicidad y para la determinación de perfiles de expresión de genes o proteínas así como para la detección de anticuerpos, antígenos, agentes patógenos o bacterias en el desarrollo y la investigación de productos farmacéuticos, del diagnóstico humano y veterinario, del desarrollo y la investigación de productos agroquímicos, del diagnóstico sintomático y presintomático de plantas, para la estratificación de pacientes en el desarrollo de productos farmacéuticos y para la selección terapéutica de medicamentos, para la detección de agentes patógenos, sustancias perjudiciales y agentes causantes, en especial de salmonelas, priones, virus y bacterias, en la analítica de alimentos y medioambiental.