ES2300114T3

ES2300114T3 - Polipeptidos de fusion que comprenden un dominio de enlazamiento de ige y un componente de hsa, y sus usos diagnosticos y terapeuticos.

Info

Publication number: ES2300114T3
Application number: ES97940030T
Authority: ES
Inventors: Mary Ellen Digan; Philip Lake; Hermann Gram
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: AR008077A1; AU722069B2; CN1146664C; PT917581E; EP0917581B1; MY120425A; CA2261562A1; KR20000029563A; PE99498A1; CZ24699A3; IL128094A0; NO323611B1; AU4202597A; IL128094A; CN1229439A; CZ297634B6; ZA976666B; RU2209211C2; NO990328L; NO990328D0

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A POLIPEPTIDOS DE FUSION Y SALES DE LOS MISMOS, QUE COMPRENDEN AL MENOS UN DOMINIO DE UNION A IGE, FUSIONADO AL MENOS CON UN CONSTITUYENTE DE LA ALBUMINA SERICA HUMANA, OPCIONALMENTE POR MEDIO DE UNA UNION PEPTIDICA, ASI COMO, EN PARTICULAR, POLIPEPTIDOS DE FUSION DIMEROS QUE COMPRENDEN LA PROTEINA DE HSA FUSIONADA, EN SUS TERMINACIONES AMINO Y CARBOXI, A UN DOMINIO EXTRACELULAR DE LA CADENA AL DEL RECEPTOR HUMANO DE ALTA AFINIDAD DE IGE (FC EP RL AL . ASIMISMO, SE PRESENTA UN PROCESO DE PREPARACION DE LOS MISMOS, POLIPEPTIDOS FUNCIONALMENTE EQUIVALENTES QUE SON INTERMEDIARIOS EN SU PREPARACION, OLIGONUCLEOTIDOS INTERMEDIARIOS Y SUS VECTORES. DICHOS POLIPEPTIDOS SIRVEN PARA PREVENIR Y/O TRATAR ENFERMEDADES ALERGICAS MEDIADAS POR IGE Y DE ALTERACIONES RELACIONADAS, COMO DERMATITIS ATOPICA, ASMA ATOPICA Y URTICARIA CRONICA.

Description

Polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de enlazamiento de IgE y un componente de HSA, y sus usos diagnósticos y terapéuticos.

Campo de la técnica

La invención se relaciona con polipéptidos de fusión. Se ocupa de polipéptidos de fusión que contienen un dominio de enlazamiento de IgE y un componente de albúmina de suero humano (HSA) y las sales de los mismos. También se relaciona con polinucleótidos que son intermediarios en la preparación de tales polipéptidos de fusión; con vectores apropiados de expresión recombinante para éstos, con los correspondientes sistemas procariotas y eucariotas de expresión, y con procesos para la síntesis de los polipéptidos de fusión.

Antecedentes

La interacción entre la inmunoglobulina E (IgE) y sus receptores tiene un papel establecido en la defensa contra infecciones parasitarias en humanos (M. Capron y A.Capron. Science 264 [1994]11876-1877). En países industrializados, sin embargo, con mejores condiciones higiénicas, el encuentro con parásitos es menos frecuente que la perturbación de la red de la IgE por la sobreproducción de la IgE en respuesta a alérgenos del medio ambiente, resultando en alergias y en otros estados de enfermedad mediados por la IgE o por el receptor de la IgE.

La IgE es el anticuerpo primario involucrado en la iniciación de una respuesta alérgica inmediata y es un participante principal en el mantenimiento de la respuesta en fase tardía. La IgE se sintetiza en los linfocitos B y ejerce sus efectos después de enlazarse al receptor de alta afinidad por la IgE, esto es, Fc\epsilonRI, que se encuentra sobre la superficie de las células responsables de la alergia tal como los mastocitos, basófilos y eosinófilos. La IgE también ejerce funciones inductoras a través del enlazamiento a su receptor sobre las células que presentan antígeno, tal como las células de Langerhans, las células B y los monocitos (G-C. Mudde y colaboradores, Allergy 50 [1995] 193-199).

Una respuesta o condición alérgica se manifiesta cuando las moléculas de IgE se enlazan a la superficie de las células responsables de la alergia a través del receptor de IgE, Fc\epsilonRI, y son entrelazadas por el alérgeno, efectuando así la señalización para iniciar la desgranulación de gránulos citoplasmáticos en las células, con la liberación concomitante de mediadores de alergia tales como histamina, serotonina, prostaglandinas y citoquinas, y el consecuente edema del tejido local y el influjo de células inflamatorias. Un medio alternativo de estimular alergia y condiciones asociadas es la interacción del receptor de la IgE, Fc\epsilonRI, con anticuerpos circulantes contra Fc\epsilonRI.

Fc\epsilonRI existe típicamente como un tetrámero que contiene una cadena \alpha, una cadena \beta y dos cadenas y (estos es, "subunidades"), aunque sobre monocitos y células de Langerhans, está ausente la subunidad \beta.

Se ha observado que el sitio de enlazamiento de la IgE de Fc\epsilonRI está contenido completamente dentro de su subunidad \alpha (denominada como Fc\epsilonRI\alpha) (J. Hakimi y colaboradores, J. Biol. Chem. 265 [19901 22079-22081; U. Blank y colaboradores, J. Biol. Chem. 266 [1991] 2639-2646). Se ha encontrado que los ratones con "desactivación genética" recombinante a los cuales se les ha suprimido genéticamente la subunidad \alpha completa son incapaces de montar una respuesta alérgica al reto del alérgeno (D. Dombrowicz y colaboradores, Cell 75 [1993] 969-976).

Fc\epsilonRI\alpha es un péptido considerablemente glicosilado con peso molecular aproximadamente de 60 kD, que contiene un dominio hidrófobo transmembrana así como dominios extracelulares hidrofílicos ("ecto") y citoplasmáticos que están expuestos a la superficie exterior de la célula. La capacidad de enlazamiento de la IgE de Fc\epsilonRI\alpha ha sido localizada adicionalmente en su porción extracelular. (J. Hakimi y colaboradores [1990], referido arriba: Leder y colaboradores, patentes estadounidense No. 4.962.035). Es posible producir una molécula soluble que puede ser secretada cortando la porción transmembrana y las secuencias secuencia debajo de allí (C. Ra y colaboradores, Int. Immunol. 5 [1993] 47-54); y el truncamiento resultante, que consiste esencialmente del dominio extracelular de Fc\epsilonRI\alpha humano, tiene la actividad de enlazamiento de la IgE in vitro e in vivo (M. Haak-Frendscho y colaboradores, Immunol. 151 [1993) 351-358: residuos aminoácidos 1-204 de Fc\epsilonRI\alpha fusionados a una región C de cadena H de la IgGI truncada; C. Ra. y colaboradores[1993] referido arriba: residuos 1-172 de Fc\epsilonRI\alpha allí dentro, correspondientes a los residuos 26-197 de la SEQ. ID. NO. 1 de ésta). Los rasgos estructurales de este fragmento incluyen dos potenciales puentes disulfuro y siete sirios potenciales de glicosilación (M. Haak-Frendscho y colaboradores [1993], referido arriba). Por lo tanto, los truncamientos de Fc\epsilonRI\alpha que consisten esencialmente del domino extracelular potencialmente se pueden administrar terapéuticamente a un mamífero para enlazar la IgE del suero con el propósito de evitar su enlazamiento a su receptor de alta afinidad sobre células responsables de la alergia, y también para suprimir nuevamente la biosíntesis deIgE en linfocitos humanos (Y. Yanagihara y colaboradores, J. Clin. Invest. 94[1994] 2162-2165).

Sin embargo, el uso efectivo de un polipéptido de enlazamiento de IgE tal como el dominio extracelular de Fc\epsilonRI\alpha para el tratamiento sistémico de trastornos alérgicos mediados por IgE o por el receptor de IgE en mamíferos ha sido obstaculizado por su transitoriedad extrema in vivo debido al rápido despeje del plasma circulante. Considerando que las enfermedades mediadas por IgE o por el receptor de IgE dan cuenta del 10 al 20% del contacto médico-paciente, un tratamiento efectivo constituiría un beneficio significativo para pacientes que sufren de tales condiciones y un importante avance en el tratamiento clínico de los trastornos mediados por IgE y por el receptor de IgE tales como alergia y condiciones relacionadas con la alergia.

Sería benéfico por lo tanto, obtener un polipéptido de enlazamiento de IgE que tiene una vida efectiva prolongada en el suero y por lo tanto una utilidad clínica mejorada en el tratamiento de una alergia, y en particular el tratamiento sistémico de dermatitis atópica, asma atópico y urticaria crónica, así como una actividad mejorada en una forma eficiente y rentable.

Resumen

Se ha encontrado ahora que por medio de la fusión de un dominio de enlazamiento de IgE a un componente de albúmina de suero humano (HSA) mostrado en la Seq ID 3, el polipéptido de fusión resultante tiene una vida media más larga en el suero con relación únicamente al dominio de enlazamiento de IgE, sin pérdida de la actividad de enlazamiento de IgE, resultando en los polipéptidos de enlazamiento de IgE indicados para el uso en el tratamiento sistémico de alergia y de otros desordenes mediados por IgE. El polipéptido de enlazamiento de IgE administrado sistémicamente se enlazará al IgE del suero así como a los autoanticuerpos circulantes contra el receptor de IgE, Fc\epsilonRI\alpha, evitando que ellos se enlacen a FcRIot enlazado a la célula, y por lo tanto evitando y/o inhibiendo una reacción alérgica y sus manifestaciones asociadas.

Se ha encontrado adicionalmente que se pueden obtener mejoras significativas en la actividad de enlazamiento de IgE por medio del uso de polipéptidos de fusión de la invención definida en las reivindicaciones que comprenden más de un dominio de enlazamiento de IgE por molécula. Por ejemplo, se ha encontrado que una molécula "dímera" de la invención tiene una actividad de enlazamiento de IgE significativamente mayor con relación a un "monómero" de la invención.

El término "dímero" se refiere aquí a un polipéptido de fusión de la invención que posee dos dominios de enlazamiento de IgE. Se ha encontrado adicionalmente que una molécula de dímero de la invención posee actividad inesperadamente favorable.

La invención por lo tanto está dirigida a polipéptidos de fusión y a sales de los mismos de la SEQ. ID. NO. 3 o de residuos de val_{26}-Leu_{978} de la SEQ. ID. NO. 3.

La invención está dirigida adicionalmente por esto a intermediarios de polinucleótido.

La invención está dirigida adicionalmente a un método para la prevención y/o el tratamiento de desordenes mediados por IgE o por un receptor de IgE, y en particular, a reacciones alérgicas tales como dermatitis atópica, asma atópica y urticaria crónica, que comprende la administración de los polipéptidos de fusión de la invención o de sales farmacéuticamente aceptables de los mismos a un individuo que requiera de tal tratamiento; y para composiciones farmacéuticas que contienen a los polipéptidos de fusión de la invención o a sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto con al menos un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención está dirigida adicionalmente a polinucleótidos que son intermediarios en la preparación de los polipéptidos de fusión, a oligonucleótidos intermediarios utilizados para construirlos; a los polipéptidos codificados por tales oligonucleótidos; a vectores recombinantes para la expresión de las moléculas de fusión; a sistemas de expresión procariotas o eucariotas (especialmente, de mamífero); y a procesos para preparar los polipéptidos de fusión o a los equivalentes fisiológicamente funcionales de los mismos utilizando tales sistemas de expresión.

Descripción de las SEQ. ID. NO. y definiciones relacionadas

SEQ. ID. NO. 1: Secuencia de aminoácidos de una forma dominante de Fc\epsilonRI\alpha humana nativa de longitud completa, incluyendo una secuencia de señal.

El término "pre-IgE^{R}" se refiere a los residuos Met_{1}-Leu_{204} de la SEQ. ID. NO. 1. El término "IgE^{R}" se refiere a la forma madura de pre-IgE^{R} y a los residuos constituyentes Val_{26}-Leu_{204} de la SEQ. ID. NO. 1 (esto es, el dominio extracelular de Fc\epsilonRI\alpha).

SEQ. ID. NO. 2: Secuencia de aminoácidos de una forma dominante de HSA prepro nativa (denominada aquí como "prepro HSA I"), que comprende los residuos Met_{1}-Leu_{609}.

La forma dominante de la proteína nativa madura (denominada aquí como "HSA I") se representa por medio de los residuos Asp_{25}-Leu_{609} de la SEQ. ID. NO. 2.

El término "prepro HSA II" representa un truncamiento de la secuencia nativa por un aminoácido (Leu_{609}) en el carboxilo terminal, y se refiere por lo tanto a los residuos Met_{1}-Gly_{608} de la SEQ. ID. NO. 2.

La forma madura de prepro-HSA II, denomina aquí como "HSA II", se representa por medio de los residuos Asp_{25}-Leu_{608} de la SEQ. ID. NO. 2.

SEQ. ID. NO. 3: Secuencia de aminoácidos codificada por el fragmento EcoRI del plásmido R-H-R/SK #50 preparado en el Ejemplo 5, que comprende: la secuencia "pre-IgER" en los residuos 1-204; al enlazador AlaSer(Gly)_{4}Ser (denominado de aquí en adelante como "L1") en los residuos 205-211; la secuencia HSA II en los residuos 212-795: al enlazador (Gly)_{3}Ser (denominado de aquí en adelante como "L2") en los residuos 796-799; y la secuencia "IgER" en los residuos 800-978.

Un polipéptido de fusión dimérico maduro de la invención, denominado de aquí en adelante como "IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IGE^{R}" o, alternativamente, como "Dímero IgE^{R} - HSA - IgE^{R}", expresado a partir de células CHO en la forma descrita en el Ejemplo 7, tiene la secuencia de aminoácidos Val_{26}-Leu_{978} de la SEQ. ID. NO. 3.

SEQ. ID. NO. 4: Secuencia de nucleótidos del fragmento EcoRI del plásmido R-H-R/SK #50 del Ejemplo 5, que comprende: una secuencia de polinucleótidos que codifica a "pre-IgE^{R}" en las posiciones 10-621; un oligonucleótido que codifica a L_{1} en las posiciones 622-642; un polinucleótido que codifica a HSA II en las posiciones 643-2394; un oligonucleótido que codifica a L_{2} en las posiciones 2395-2406; y un polinucleótido que codifica a "IgER" en las posiciones 2407-2943; con 2 codones de detención en las posiciones 2944-2949. Los sitios de restricción en los extremos de los fragmentos de codificación y en las regiones enlazadoras están en las posiciones 1-6; 622-627; 637-642: 2387-2393; 2401-2406; y 2950-2955. Una secuencia Kozak está en las posiciones de los nucleótidos 7-9.

Las mutaciones puntuales que difieren de la secuencia de nucleótidos de consenso de HSA están en las posiciones 804, 1239; 1290; 1446, 1815, 2064 y 2079. Debido a que las mutaciones puntuales están en la posición bamboleante, no afectan a la secuencia de aminoácidos.

Seq. ID. NO. 5: La secuencia de nucleótidos de la forma dominante de prepro-HSA nativa correspondiente a la Fig. 12 y a la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. NO. 2.

Seq. ID. NO. 6: La secuencia de nucleótidos de la forma dominante de Fc\epsilonRI\alpha humana nativa de longitud completa, incluyendo la secuencia de señal, correspondiente a la Fig. 13 y a la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. NO. 1.

Descripción de las figuras

En las Figuras siguientes, las moléculas indicadas se leen en forma direccional, esto es, el lado izquierdo corresponde al terminal amino (o 5'-) y el lado derecho corresponde al terminal carboxilo (o 3'-).

Figs. 1A-C: Vida media en suero en ratones: Concentración de proteína in vivo (en picomoles de proteína por ml de suero) con el transcurso del tiempo (10-800 minutos después de la inyección) de

(A): Proteína HSA I libre, y

(B): Proteína IgE^{R} (denominada como "Cadena alfa libre") y el polipéptido dimérico de fusión IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IgE^{R} (denominado como dímero "IgE^{R} - HSA - IgE^{R}") preparado a partir de células CHO como se describe en el Ejemplo 7.

(C): Vida media en suero de HSA I libre de (A) comparada con aquella del polipéptido dimérico de fusión ("IgE^{R} - HSA - IgE^{R}") de (B) normalizando en 1 con respecto a las concentraciones en suero 10 minutos después de la inyección.

Fig. 2: Extravasación resultante de la reacción de anafilaxis cutánea pasiva en ratones de diluciones seriales administradas en forma intravenosa (10 mg/kg, 50 mg/kg ó 500 mg/kg) del polipéptido IgE^{R} - L_{1}- HSA II - L_{2} - IgE^{R} ("Dímero IgE^{R} - HSA - IgE^{R}") preparado como se describe en el Ejemplo 7 (el grupo de control recibe 0 mg/kg); área en mm^{2}; en intervalos de 5, 15 ó 30 minutos antes de la sensibilización por medio de inyección intradérmica del anticuerpo monoclonal anti-dinitrofenilo (DNP) de IgE de ratón y reto posterior con una solución de albúmina de suero bovino con DNP que contenía azul de Evans al 1%.

Fig. 3: Representación esquemática de tres polipéptidos de fusión de la invención (dos monómeros y un dímero), mostrando también a los enlazadores de polipéptido:

I. Monómeros

(1.): El monómero que conduce a HAS contiene HSA II (denominado en la Figura como "HSA") fusionado a través de L_{2} ("GGGS") a IgE^{R}. Los nucleótidos que codifican las posiciones Leu_{607}Gly_{608} de HSA II contienen un sitio único MstII como se indica, y los nucleótidos que codifican a GlySer de L_{2} contienen un sitio BamHI (aminoácidos codificados subrayados);

(2.): El monómero que conduce al dominio de enlazamiento de IgE que contiene a la IgE^{R} fusionada a su terminal carboxilo a través de L_{1} (esto es, "ASGGGGS") a HSA II (denominada en la Figura como "HSA"). El oligonucleótido que codifica a L_{1} contiene un sitio NheI y un sitio BamHI, respectivamente (aminoácidos codificados AlaSer y GlySer de L_{1} están subrayados).

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II. Dímero

: El dímero que conduce al dominio de enlazamiento de IgE contiene una primera IgE^{R} fusionada a su terminal carboxilo a través de L_{1} al terminal amino de HSA II (denominado en la Figura como "HSA"), cuyo terminal carboxilo está fusionado a una segunda IgE^{R} a través de L_{2} con sitios de restricción en el polinucleótido codificador como se describió anteriormente para el monómero.

Fig. 4: iniciadores PCR para el ADNc de Fc\epsilonRI\alpha humana truncada de longitud completa (denominado como "ADNc Receptor de IgE") para obtener ADN que codifica a:

(i): IgE^{R}

: [sitio BamHI añadido al extremo 5' de la cadena de codificación para Fc\epsilonRI\alpha por medio del oligonucleótido #18; y un codón de detención y los sitios EcoRI y SalI añadidos al extremo 3' de la cadena no codificada por el oligonucleótido #19];

(ii): pre-IgE^{R}

: [oligonucleótido #20 que añade los sitios SstI, EcoRI, y Kozak al extremo 5' de la cadena que codifica para Fc\epsilonR1\alpha; oligonucleótido #31 que añade NotI y NheI (y supresión de un segundo sitio NheI) en una cadena que no codifica para Fc\epsilonRI\alpha];

(iii): pre-IgE^{R}

: [oligonucleótidos #20 y #19 usados como se describió anteriormente]:

(A.): "que conducen a HSA": subclonación de (i) anterior en el vector SK, que provee al clon pEK1 del vector de clonación TA clone pEK1 utilizado en la construcción del monómero que conduce a HSA II;

(B.): "que conducen a IgE^{R}": subclonación de (ii) en el vector SK, que provee a la construcción IgE^{R}/TA#1 utilizada para preparar al monómero que conduce a IgE^{R};

(C.): "IgE^{R} sola": subclonación de (iii) en el vector SK, que provee la construcción IgE^{R} FL/TA#34 utilizada en la expresión de IgE^{R} madura para uso como un estándar.

El doble asterisco representa dos codones de detención.

Fig. 5: Pares de iniciadores PCR para ADNc de prepro-HSA I humana truncada de longitud completa para producir ADNc que codifica a:

(i): prepro-HSA 11 fusionada en el terminal carboxilo a L_{2}

: [oligonucleótido # 24 que añade las secuencias SpeI, EcoRI y Kozak al extremo 5' de la cadena codificadora; oligonucleótidos #28 y #29 que añaden un enlazador que codifica los sitios MstII y HindIII en el terminal 3' de HSA II):

(ii): L_{1} fusionado al terminal 5' de HSA II

: [oligonucleótido #26 que añade los sitios NotI.NheI.enlazador y BamHI a la cadena de codificación; oligonucleótido #27 que contiene al sitio NcoI en una cadena no codificadora];

(iii): prepro-HSA I

: [oligonucleótido #24 usado como anteriormente; y oligonucleótido #25 que añade los sitios de detención, EcoRI y HindIII al extremo 3' de la cadena no codificadora]:

(A.): "que conduce a HSA": subclonación de (i) en el vector SK, que provee a pEK7 usado para construir al monómero que conduce a HSA II:

(B.): "que conduce a la IgE^{R}": subclonación de (ii) en el vector SK, que provee a HSA/SK#5 usado para construir al monómero que conduce a la IgE^{R};

(C.): "HSA sola": subclonación de (iii) en el vector SK, que provee un HSA/SK#17 que codifica a una proteína madura de albúmina de suero humano nativo (esto es, HSA I) para uso como estándar.

Fig. 6: Oligonucleótidos para la secuenciación de albúmina de suero humano (HSA) #1-10, 12, 16, 17, 22 y 30, usados como materiales de secuencia clonados en TA y después del enlazamiento a los fragmentos de enlazamiento de IgE.

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Fig. 7: Oligonucleótidos para la secuenciación del receptor de IgE #11, 13 y 23, usados como fragmentos de secuencia clonados en TA y después del enlazamiento al componente HSA.

Fig. 8

(A): Oligonucleótidos mutagénicos #14 y #15 para albúmina de suero humano;

(B): Oligonucleótidos PCR y del enlazador #18-20, 24-29 y 31 para la construcción de polipéptidos de fusión.

Fig. 9: Construcción del vector HSA-IgER/SK#49, que contiene un polinucleótido que codifica a prepro-HSA II (denominado en la Figura como "HSA") fusionada al terminal 3' a través del oligonucleótido que codifica al enlazador L_{2} (representado en la Fig.9 por "GGG") al terminal 5'del polinucleótido que codifica a la IgE^{R} (denominado en la Figura como "IgER"), ligando al fragmento BamHI, SalI de pEK1 dentro de pEK7 cortado por BamHI.SaII.

Fig. 10: Construcción del vector IgER-HSA/SK#1, que contiene un polinucleótido que codifica a pre-IgER (denominado en la Figura como "IgER") fusionado al terminal 3' a través del oligonucleótido para el enlazador L_{1} (representado por "GGG") al terminal 5' del polinucleótido que codifica a HSA II ("HSA"), ligando al fragmento SstI, NheI de IgER/TA#I dentro de HSA/SK#5 cortado por SstI, NheI.

Fig. 11: Construcción del vector HSA-IgER Pst Sal/SK#37, que contiene un polinucleótido que codifica a HSA II (indicado por "HSA3") que se fusiona al terminal 3' a través del oligonucleótido para L_{2} (no descrito) al terminal 5' del polinucleótido que codifica a IgER (indicado como "IgER"), ligando el fragmento PstI, SalI de HSA-IgER/SK#49 en el vector SK. También se muestra la construcción de un vector R-H-R/SK #50 que contiene un polinucleótido que codifica a pre-IgER (denominada como "IgER") fusionada a su terminal 3' a través del oligo para L_{1} (no descrito) al terminal 5' del polinucleótido que codifica a HSA II ("HSA"), que a su vez se fusiona a través del oligonucleótido para L_{2} (no descrito) a un polinucleótido que codifica a IgER ("IgER"). El vector se prepara ligando el fragmento PstI, KpnI de HSA-IgER Pst Sal/SK#37 en IgERHSA/SK#1 cortado por PstI.KpnI.

Fig. 12: Secuencia del nucleótido de albúmina de suero humano y secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ. ID. NO. 2 y a la SEQ. ID. NO. 5.

Fig. 13: Secuencia del nucleótido de IgER y secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ. ID. NO. 1 y a la SEQ. ID. NO. 6.

Fig. 14: Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del fragmento EcoRI de R-H-R/SK #50 correspondiente a la SEQ. ID. NO. 3 y a la SEQ. ID. NO. 4, que codifica a la proteína dimérica de fusión R1 - HSA - R1. La secuencia de HSA se muestra en letras itálicas. Las secuencias enlazadoras se muestran en minúsculas. Las mutaciones puntuales que difieren de la secuencia de consenso del ácido nucleico de HSA se muestran en minúsculas en negrilla. Debido a que las mutaciones puntuales están en la posición bamboleante, ellas no afectan la secuencia de aminoácidos. Los sitios de restricción en los extremos de los fragmentos y en la región enlazadora están subrayados.

Fig. 15: SDS-PAGE del polipéptido de fusión maduro purificado del Ejemplo 7:

Cantidades totales aplicadas al gel: 8 mg (senda 1), 6 mg (senda 2), 4 mg (senda 3) y 2 mg (senda 4); pesos moleculares estándar: 97,4; 66,2; 45,31; 21,5 y 14,4 kDa (senda 5).

Descripción detallada

La invención se relaciona con polipéptidos de fusión y con las sales de los mismos de la SEQ. ID. NO 3 o de los residuos Val_{26}-Leu_{978} de la SEQ. ID. NO 3.

Se conocen al ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de Fc\epsilonRI\alpha humana (J.Kochan y colaboradores, Nucleic Acids Research 16 [1988] 3584; y Leder y colaboradores, patente estadounidense No. 4.962.035). La Fc\epsilonRI\alpha humana codifica a un péptido señal NH_{2} terminal [residuos aminoácidos (incluido el primer Met) Met_{1}-Ala_{25}], dos dominios extracelulares tipo inmunoglobulina (residuos de Val_{26}-Leu_{204}), una región hidrófoba transmembrana (Gln_{205}-Ile_{224}), y una cola hidrofílica citoplasmática (residuos de Ser_{225}-Asn_{257}) (con referencia a la SEQ. ID. NO. 1). El péptido señal se escinde durante el procesamiento intracelular. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la forma dominante de Fc#RIa humana nativa está incluida aquí como la SEQ. ID. NO. 1.

"IgE^{R}" se refiere aquí a la secuencia de aminoácidos Val_{26}-Leu_{204} de la SEQ. ID. NO. 1 (que codifica al dominio extracelular); y el término "pre-IgE^{R}" se refiere a los residuos Met_{1}-Leuz_{204} de la SEQ. ID. NO. 1 (que codifica a la secuencia de señal secuencia arriba del dominio extracelular).

El otro constituyente principal de las fusiones recombinantes de la invención, la albúmina de suero humano (HSA), constituye la proteína más abundante del plasma, contribuyendo con un 60% con base en el peso del contenido total de proteína del plasma. Una molécula de albúmina de suero humano consiste de una cadena de polipéptido no glicosilada de 585 aminoácidos de peso molecular 66,5 kDa. Una característica específica para la albúmina es su patrón complejo de enlace de disulfuro (F.F. Clerc y colaboradores, J. Chromatogr. 662 [1994] 245-259). La albúmina de suero humano está ampliamente distribuida a través de todo el organismo, en particular en los compartimientos intestinal y sanguíneo donde está principalmente involucrada, como la proteína más abundante del suero, en el mantenimiento de la osmolaridad y del volumen del plasma. Además, es lentamente eliminado por el hígado y muestra una vida media in vivo de 14-20 días en humanos (T.A. Waldmann, "Albumin Structure. Function and Uses", Pergamon Press [1977] 255-275). La albúmina de suero humano está desprovista de función enzimática o inmunológica. Es un portador natural involucrado en el transporte endógeno y el suministro de diferentes moléculas naturales así como terapéuticas (H. Lu y colaboradores, FEBS Lett. 356 [1994]56-59; WO 93/15199; EP 648499; P. Yeh y colaboradores, PNAS USA 89 [1992] 1904-1908; EP 413622).

Las células humanas sintetizan albúmina de suero inicialmente en la forma de un polipéptido prepro. Una secuencia señal de 18 aminoácidos (incluida la primera Met) es removida cuando la proteína pasa a través del lumen del retículo endoplasmático, dejando aún 6 aminoácidos en el N terminal (en la forma predominante: Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg) que son luego sometidos a escisión proteolítica durante o inmediatamente después del transporte a través del aparato secretor.

Se sabe que la albúmina de suero humano es polimórfica (D.C. Carter y JX. Ho, Adv. Prot. Chem. 45 [1994] 153-203). Por ejemplo, la albúmina de los Naskapi tiene Lys_{372} en lugar de Glut_{372}, y la proalbúmina de Christchurch tiene una secuencia pro alterada, esto es, Glu_{24} en vez de Arg_{24} (Latta y colaboradores, patente estadounidense No. 5.100.784). Se conoce la secuencia completa de aminoácidos de la forma dominante de una proteína de ocurrencia natural, denominada aquí como "prepro-HSA I" (A. Dugaiczyk y colaboradores, PNAS USA 79[1982]71-75) (SEQ. ID. NO. 2). La forma dominante de la proteína madura ("HSA I") está representada por Asp_{25}-Leu_{609} de la SEQ. ID. NO. 2.

Se prefiere especialmente al polipéptido de fusión del Ejemplo 7, especialmente sin secuencia líder, esto es, el polipéptido Val_{26}-Leu_{978} de la SEQ. ID. NO. 3.

Cualquier enlazador de péptido (expresado aquí como "L" en las formulas I-V) preferiblemente permite el plegamiento independiente y la actividad del dominio de enlazamiento de IgE; está libre de una propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que podría interferir con el dominio de enlazamiento de IgE o provocar una reacción inmunológica en el paciente, y tiene características hidrófobas mínimas o de carga que podrían interactuar con el dominio de enlazamiento de IgE.

Los enlazadores de la presente invención incluyen: GlyGlyGlySer ("L_{1}" aquí) y AlaSerGlyGlyGlyGlySer ("L_{2}" aquí).

La invención también contiene polinucleótidos que son intermediarios en la preparación de los polipéptidos recombinantes de fusión de la invención.

Como un aspecto adicional, se provee un proceso para preparar un polipéptido recombinante de fusión como se definió anteriormente o una sal del mismo, que comprende:

(a): transformar una célula huésped con un vector que contiene ADN que codifica a un polipéptido de fusión como se definió anteriormente;

(b): expresar al polipéptido de fusión en esa célula para producir un polipéptido de fusión como se definió anteriormente;

(c): y recobrar al polipéptido resultante de la célula huésped, preferiblemente como un producto secretado, opcionalmente en la forma de una sal del mismo.

Todavía un aspecto adicional de la presente invención provee vectores, preferiblemente plásmidos, para uso en la expresión de los polipéptidos de fusión. Estos vectores contienen ADN que codifica a los polinucleótidos definidos anteriormente. En general, los vectores apropiados que pueden transformar microorganismos capaces de expresar a los polipéptidos de fusión incluyen vectores de expresión que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos de fusión unidos a secuencias reguladoras transcripcionales y de traducción, tal como promotores, que constituyen juntos un casete de expresión. Los promotores se pueden derivar de genes del huésped particular utilizado, o tales regiones de control pueden ser modificadas, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio, por medio de la introducción de elementos de control adicionales o de secuencias sintéticas. El casete de expresión específicamente utilizado en la presente invención incluye por lo tanto también una región de terminación de la transcripción y de la traducción que es funcional en el huésped deseado y que se posiciona en el extremo 3' de la secuencia que codifica a la macromolécula hibrida. Además del casete de expresión, el vector incluirá uno o varios marcadores que permiten seleccionar al huésped transformado. Tales marcadores incluyen a los marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como G418. Estos genes de resistencia se colocarán bajo el control de las señales apropiadas de transcripción y de traducción permitiendo la expresión en un huésped dado.

Más particularmente, la preparación de polipéptidos recombinantes de fusión de la invención se puede efectuar, por ejemplo, como sigue:

A. Construcción de vectores de expresión de proteína de fusión

La primera etapa en la construcción de polipéptidos recombinantes de fusión es la subclonación de porciones de los polipéptidos de fusión en vectores de clonación. En este contexto, un "vector de clonación" es una molécula de ADN, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que se puede replicar en forma autónoma en una célula huésped procariota. Los vectores de clonación contienen típicamente uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de una endonucleasa de restricción en los cuales se pueden insertar secuencias foráneas de ADN en una determinada forma sin la pérdida de una función biológica esencial del vector, así como un gen marcador que es adecuado para ser utilizado en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proveen resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. Los vectores de clonación adecuados son descritos en J. Sambrook y colaboradores, (eds.). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989]) y se pueden obtener, por ejemplo, a partir de diferentes fuentes.

El clon pGEM-3-110B-1 de ADNc de Fc\epsilonRI\alpha, es descrito en A. Shimizu y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 [1988] 1907-1911 y se puede obtener a partir de la American Type Tissue Collection (ATCC cepa #67566). El ADNc monocatenario de hígado humano se puede obtener con Clontech (PCR-ready Quick Clone cDNA, Cat. D#7113-1). La secuencia de HSA está disponible en el GenBank bajo los números de acceso #: VOO495, JOOO78, LOO132, LOO133. El ADNc de HAS se puede obtener por medio de amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos #24 y 25, como se describe en el Ejemplo 2.

Se puede preparar un polinucleótido que codifica a un dominio adecuado de enlazamiento de IgE o un ADN componente de HSA utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR utiliza un molde de ADNc monocatenario y una mezcla de iniciadores oligonucleótidos. El procedimiento de la PCR se lleva a cabo a través de una metodología conocida (ver por ejemplo, C.R.M. Bangham, "The Polymerase Chain Reaction: Getting Started" en Protocols in Human Molecular Genetics, Human Press [1991], Capítulo I, páginas 1-8). Los kits para PCR y el material que se utiliza con los kits están disponibles comercialmente a partir de diferentes fuentes. Los kits y los métodos para su utilización son descritos adicionalmente por ejemplo en la patente estadounidense No. 5.487.993).

Se pueden añadir secuencias de ADN que codifican péptidos señal por medio de la PCR o si es necesario utilizando oligonucleótidos sintéticos que codifican secuencias conocidas de péptidos señal. Las secuencias de ADN que codifican a un péptido señal heterólogo se subclonan en un marco con secuencias de ADN que codifican al N terminal del polipéptido de fusión.

La fusión de los polinucleótidos se puede lograr por medio de la subclonación en vectores intermedios. Alternativamente, se puede clonar un gen directamente en un vector que contiene al otro gen. Se pueden utilizar enlazadores y adaptadores para unir las secuencias de ADN.

La subclonación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, tales como el uso de digestión con una enzima de restricción para proveer los terminales apropiados, el uso de un tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseada de moléculas de ADN, y la ligación con ligasas apropiadas. Las técnicas para tal manipulación son descritas en la literatura y son conocidas en el estado del arte.

B. Clonación para la expresión de polipéptidos de fusión

La proteína de fusión clonada es luego escindida del vector de clonación e insertada en un vector de expresión. Los vectores de expresión adecuados típicamente contienen:

(1): elementos de ADN de procariota que codifican para un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia al antibiótico para permitir el crecimiento y la selección del vector de expresión en un huésped bacteriano;

(2): elementos de ADN de eucariota que controlan la iniciación de la transcripción, tales como un promotor; y

(3): elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcritos, tal como una secuencia de poliadenilación/terminación de la trascripción.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se relaciona con vectores, preferiblemente vectores plásmidos, para uso en la expresión de los polipéptidos de fusión de la invención, que contienen las secuencias de polinucleótidos descritas aquí que codifican para los polipéptidos de fusión de la invención. Los vectores de expresión apropiados que pueden transformar células eucariotas o procariotas incluyen a los vectores de expresión que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas de fusión unidas a secuencias reguladoras transcripcionales y de traducción que se seleccionan de acuerdo con las células huésped utilizadas. Para la expresión en E. coli, se pueden utilizar vectores tales como aquellos descritos por M.W. Robertson, J. Biol. Chem. 268 [1993] 12736-12743. Se espera que el producto esté enlazado por medio de puentes de disulfuro, pero no glicosilado. Para la expresión en levadura, se puede utilizar un vector de expresión tal como pHIL-D2 suministrado con el kit de expresión de Pichia pastoris de Invitrogen (San Diego, CA, Estados Unidos de América) (catálogo # K1710-01). Se espera que el producto proteínico esté enlazado por medio de puentes de disulfuro y glicosilado. Otros sistemas adecuados de expresión de levadura incluyen a Saccharomyces cerevisiae y Kluveromyces lactis. Para la expresión en baculovirus, son útiles vectores tales como pAC360, pVL1392 y pVL1393 (Invitrogen. San Diego, CA, Estados Unidos de América) para la infección de células de insectos, que se esperaría que segregaran un producto glicosilado y enlazado por medio de puentes de disulfuro.

El polipéptido de fusión de la invención normalmente es una glicoproteína, particularmente cuando se expresa en células de mamífero, y la invención incluye polipéptidos de fusión en cualquier estado de glicosilación o formación de puentes de disulfuro. En particular, el análisis mutacional sugiere que la glicosilación enlazada a N en las posiciones primera, segunda y séptima de los sitios de glicosilación enlazados a N de la cadena \alpha del receptor de IgE (A. Shimizu y colaboradores, PNAS USA 85 [1988] 1907-1911, Figura 2) (correspondiente a los residuos aminoácidos 46, 67 y 191 de la SEQ. ID. NO. 1), promueve la actividad biológica de la molécula de IgE^{R} y de los monómeros y dímeros que la contienen. El sistema de expresión más preferido es uno en el cual cualquiera de los azúcares añadidos será el más similar a aquellos en la molécula nativa a partir de la cual se deriva el polipéptido. Se sabe que las células de levadura y de insecto modifican a las glicoproteínas en forma diferente que a las células de mamífero, mientras que E. coli no añade moléculas de azúcar después de la secreción. Por lo tanto, mientras que la expresión de cualquiera de estos sistemas de expresión puede producir un producto proteínico que es adecuado para aplicaciones diagnósticas (por ejemplo, la detección de una condición alérgica), la forma más preferida para expresar este producto para uso como una molécula terapéutica es la expresión en células de mamífero o posiblemente la expresión en la leche de mamíferos transgénicos. Para la expresión en un huésped mamífero, las señales reguladoras transcripcionales y de traducción utilizadas en un casete de expresión se pueden derivar de fuentes virales, tales como adenovirus, virus de papiloma bovino o virus de simio, en los cuales las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un nivel alto de expresión. Las secuencias reguladoras adecuadas transcripcionales y de traducción pueden ser obtenidas también a través de genes de mamífero, tales como los genes que codifican para actina, colágeno, miosina, y metalotioneina. Las secuencias reguladoras transcripcionales incluyen una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN en una célula de mamífero. Los ejemplos de células típicas de mamífero son las células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS), HeLa. BHK, células NIH de embrión de ratón suizo, rata, fibroblastos de mono o de humano, o células de hepatoma de rata.

Para la expresión en células de mamífero, el método preferido es la secreción de células CHO. Ni las células CHO ni las células humanas añaden los residuos de galactosa enlazados a \alpha1,3 que son típicos de la expresión en células de múrido tales como las células C127 y SP2/0. Los anticuerpos para este enlace de azúcar están presentes en suero humano [C.F. Goochee y colaboradores, BioTechnol. 9 [1991] 1347-1355] y pueden afectar la vida media, la accesibilidad y el despeje de productos recombinantes expresados a partir de estas células de múrido. Las células CHO, dhfr son mutantes para la dihidrofolato reductasa (DHFR), y por lo tanto son incapaces de sintetizar purinas, timidina y glicina nuevamente. El número de copias de plásmidos integrados en forma cromosomal que soportan copias de tipo natural del gen que codifica para DHFR se puede incrementar o amplificar por medio de la exposición de células transformadas con estos plásmidos para incrementar los niveles de metotrexato, un análogo de folato que compite por el enlazamiento de folato en el sitio activo de la enzima. Un vector adecuado para la expresión en células CHO, células dhfr es el vector pMT2 (R.J. Kaufman y colaboradores, EMBO J. 6 [1987] 187-193)]. El vector pMT2 tiene una copia de tipo natural del gen que codifica para DHFR que se transcribe como un ARNm único con el gen foráneo. Por lo tanto, después del tratamiento de células CHO transformadas, células dhfr con concentraciones crecientes de metotrexato, tanto el gen foráneo como el gen que codifica para DHFR se amplifican en forma conjunta. El producto secretado a partir de
estas células se espera que esté enlazado por medio de puentes de disulfuro y glicosilado en un patrón de mamífero.

Se puede introducir un vector de expresión en células huésped utilizando una variedad de técnicas incluida la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por un liposoma, electroporación, y similares. Preferiblemente, las células transfectadas se seleccionan y se propagan en donde el vector de expresión se integra en forma estable en el genoma de la célula huésped para producir transformantes estables. Las células se pueden cultivar, por ejemplo, en medio DMEM. El polipéptido segregado en el medio se puede recuperar por medio de aproximaciones bioquímicas estándar después de la expresión transitoria 24-72 horas después de la transfección de las células o después del establecimiento de líneas celulares estables después de la selección por ejemplo por medio de resistencia a antibióticos.

Los métodos convencionales para recuperar un polipéptido expresado a partir de un cultivo incluyen el fraccionamiento de la porción del cultivo que contiene al polipéptido utilizando técnicas bioquímicas conocidas. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos de filtración por gel, cromatografía en gel, ultrafiltración, electroforesis, intercambio iónico o cromatografía de afinidad, tal como se conoce para los fraccionamientos de proteína, para aislar las proteínas expresadas encontradas en el cultivo. Además, se pueden llevar a cabo métodos inmunoquímicos convencionales, tales como inmunoafinidad o inmunoabsorción. También se conocen técnicas para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación del producto (ver por ejemplo, J. Sambrook y colaboradores, [1989], referido arriba; R.J. Kaufman, Genetic Engineering: Principles and methods, Plenum Press, Vol. 9 [1987] 156-198).

Los polipéptidos de fusión de la invención son indicados para tratar terapéuticamente mamíferos, y en particular, humanos, pacientes que sufren de alergias. El dominio de enlazamiento de IgE de los polipéptidos de fusión compite por la IgE con el receptor de IgE presente en forma natural sobre mastocitos, basófilos y células de Langerhans, de modo que IgE se enlaza a la proteína administrada e impide el enlazamiento a estas células responsables de la alergia para mediar la respuesta alérgica. El dominio de enlazamiento de IgE también compite con el receptor de IgE, Fc\epsilonRI, por medio del enlazamiento a autoanticuerpos para Fc\epsilonRI.

Por lo tanto, la presente invención provee una composición farmacéutica para enlazar competitivamente a la IgE (y/o autoanticuerpos a Fc\epsilonRI), y/o para inhibir la producción de IgE, y de esta forma para el tratamiento preventivo y/o por supresión de trastornos mediados por IgE o por el receptor de IgE, y más específicamente, alergias y condiciones asociadas con alergia, tal como la dermatitis atópica, asma atópica y urticaria crónica.

Por "trastornos mediados por IgE o por el receptor de IgE" se entiende los trastornos asociados con el enlazamiento del receptor de IgE enlazado a la célula, Fc\epsilonRI, a la IgE o a los autoanticuerpos para Fc\epsilonRI, por ejemplo reacciones de tipo alérgico ("síndrome de hiper-IgE") tal como el asma bronquial, el asma atópica, la fiebre del heno, la alergia al polen, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, el eczema, la anafilaxis, así como la urticaria crónica, y también la enfermedad no alérgica de Kimura, y otras enfermedades pulmonares, dermatológicas o autoinmunes.

En particular, la dermatitis atópica, una de las manifestaciones más dramáticas de atopía, es una enfermedad crónica inflamatoria de la piel asociada con altos niveles de IgE en suero y una sensibilización a diferentes alérgenos del medioambiente (M.-A. Morren y colaboradores, J. Am. Acad. Dermatol. 31 [1994] 467-473). El tratamiento actual de la dermatitis atópica se concentra en el uso de cremas que contienen esteroides, y los casos severos de dermatitis atópica han sido exitosamente tratados con ciclosporina A (H. Granlund y colaboradores, Br. J. Dermatol. 132 [1995] 106-112), pero los efectos secundarios restringen este tratamiento a una minoría de los pacientes. Un agente que inhibe las funciones de la IgE tales como la desgranulación de mastocitos y la presentación de antígenos mediada por la IgE por parte de las células B y de otras células que presentan antígeno sería superior a cualquier tratamiento actualmente conocido de dermatitis atópica y además también puede ser útil para otras formas más suaves de alergia.

Además de la dermatitis atópica y del asma atópico, se pueden utilizar los polipéptidos de la invención para tratar o prevenir la urticaria crónica (CU), en la cual juega un papel la desgranulación de los mastocitos a través de la activación de Fc\epsilonRI\alpha. Los polipéptidos fusión de la invención pueden despejar la circulación de anticuerpos contra Fc\epsilonRI\alpha, en contraste con los anticuerpos monoclonales anti-IgE procesados alternativamente para el tratamiento de la enfermedad.

Se pueden administrar los polipéptidos en la forma de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de la invención, preferiblemente un polipéptido no modificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El término "sal" se refiere en particular a las sales farmacéuticamente aceptables preparadas a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables para formar sales de adición ácido por ejemplo de un grupo amino de la cadena del polipéptido, o de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables para forma sales básicas por ejemplo de un grupo carboxílico de la cadena del polipéptido. Tales sales se pueden formar como sales y/o como sales del terminal amino o del terminal de ácido carboxílico del polipéptido de la invención.

Las sales adecuadas de adición ácida farmacéuticamente aceptables son aquellas de ácidos orgánicos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, ácidos poliméricos, o ácidos inorgánicos. Los ejemplos de ácidos orgánicos adecuados comprenden a los ácidos acético, ascórbico, benzóico, bencenosulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isotiónico, láctico, maléico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, oxálico, pamóico, pantoténico, fosfórico, salicílico, succínico, sulfúrico, tartárico y p-toluenosulfónico, así como ácidos poliméricos tales como el ácido tánico o la carboximetil celulosa. Los ácidos inorgánicos adecuados incluyen ácidos minerales tales como el ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico y nítrico.

Los ejemplos de bases inorgánicas adecuadas para formar sales de un grupo carboxílico incluyen a las sales de metal alcalino tal como las sales de sodio, potasio y litio; a las sales de metal alcalinotérreo tal como las sales de calcio, bario y magnesio; y las sales de amonio, cobre, ferrosas, férricas, de zinc, manganeso, aluminio y las sales mangánicas. Se prefieren las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio. Los ejemplos de bases orgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para la formación de sales de un grupo carboxílico incluyen aminas orgánicas, tales como la trimetilamina, trietilamina, tri(n-propil)amina, diciclohexilamina, \beta-(dimetilamino)etanol, tris(hidroximetil) aminometano, trietanolamina, \beta-(dietilamino)etanol, arginina, lisina, histidina, N-etilpiperidina, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazinas, piperidinas, cafeína y procaína.

Las sales de adición ácida de los polipéptidos se pueden preparar en forma convencionales poniendo en contacto al polipéptido con uno o más equivalentes del ácido orgánico o inorgánico deseado tal como el ácido clorhídrico. Las sales de los grupos carboxílicos del péptido se pueden preparar convencionalmente poniendo en contacto al péptido con uno o más equivalentes de una base deseada tal como una base de hidróxido metálico, por ejemplo hidróxido de sodio; una base de carbonato o bicarbonato metálico tal como carbonato de sodio o bicarbonato de sodio; o una base de amina tal como trietilamina o trietanolamina.

La invención se relaciona por lo tanto también con composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de fusión nuevo como se definió anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. El excipiente es preferiblemente un líquido estéril, libre de pirógenos, parenteralmente aceptable. Los excipientes o diluyentes líquidos preferidos son agua, suero fisiológico, dextrosa acuosa, y glicoles, particularmente para soluciones inyectables (cuando son isotónicas). La composición puede ser un liofilizado preparado en forma convencional.

Las composiciones se pueden administrar sistémicamente, esto es en forma parenteral (por ejemplo en forma intramuscular, intravenosa, subcutánea o intradérmica) o por medio de administración intraperitoneal. Para la administración parenteral, se prefiere que los polipéptidos de fusión sean esencialmente solubles en el suero o el plasma del paciente, por ejemplo que al menos 1 miligramo de polipéptido sea soluble en un mililitro de suero o de plasma.

Las composiciones se pueden administrar también por medio de técnicas conocidas para administración tópica. Los ejemplos de formas de dosificación adecuadas incluyen atomizadores, soluciones oftálmicas, soluciones nasales y ungüentos. Por ejemplo, se puede fabricar un atomizador disolviendo el péptido en un solvente adecuado y colocándolo en un atomizador que sirva como un aerosol para una terapia de inhalación comúnmente empleada. Una solución oftálmica o nasal se puede elaborar disolviendo el ingrediente activo en agua destilada, añadiendo cualquier agente auxiliar requerido, tal como un amortiguador, un agente de isotonización, un espesante, un preservante, un estabilizador, un tensoactivo o un antiséptico, ajustando la mezcla de un pH 4 a un pH 9. Los ungüentos se pueden obtener por ejemplo preparando una composición de una solución polimérica, tal como un polímero carboxivinílico acuoso al 2%, y una base, tal como hidróxido de sodio al 2%, mezclando hasta obtener un gel, y mezclando con el gel una cantidad de polipéptido de fusión purificado.

La composición se administra preferiblemente en forma subcutánea o intravenosa, y lo más típicamente, en forma subcutánea.

La invención también comprende un método de tratamiento de condiciones alérgicas que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo a un paciente que necesite de tal tratamiento. El método de tratamiento se práctica durante el transcurso de un estado de enfermedad alérgica (esto es, cuando se requiere especialmente el alivio de los síntomas); o como un tratamiento continuo o profiláctico (esto es, antes del inicio de un trastorno anticipado mediado por IgE o un receptor de IgE, tal como una reacción alérgica).

La dosis efectiva de acuerdo con esto puede variar en un rango amplio teniendo en consideración por ejemplo, el grado o la severidad de la condición que está siendo tratada, la edad, el sexo y la condición del individuo, la duración del tratamiento, y la potencia de la proteína de fusión particular, factores que se pueden determinar por medio de métodos convencionales.

Ya que los individuos particulares varían ampliamente en su contenido de IgE (así como de anticuerpo para Fc\epsilonRI) una dosis terapéuticamente efectiva de acuerdo con esto se puede describir mejor como estando entre 5 x 10^{2} y 1 x 10^{4} veces el contenido total de IgE en suero y de anticuerpos para Fc\epsilonRI, sobre una escala molar. El paciente puede ser tratado diariamente con base en una administración única o múltiple. Se puede administrar también la composición con base en una dosis mensual (o con intervalos semanales según sea apropiado), ya sea con administraciones múltiples o únicas.

Para un individuo promedio (70 kg), una dosis mensual adecuada puede estar en el rango entre una dosis menor aproximadamente de 0,5 mg por mes hasta una dosis superior aproximadamente de 500 mg por mes, preferiblemente aproximadamente desde 1 mg hasta aproximadamente 300 mg, más preferiblemente aproximadamente desde 20 mg hasta aproximadamente 250 mg, por mes, del polipéptido de fusión de la invención, tal como el dímero del Ejemplo 7, convenientemente administrado en dosis divididas una o dos veces al mes. Los rangos de dosis más altas, por ejemplo de 500 mg por mes hasta 2 g por mes, pueden ser indicados en pacientes que tienen altas concentraciones de IgE en suero o en fases tempranas del tratamiento.

La dosis y el tiempo que dure la administración pueden variar. Las administraciones iniciales de la composición pueden estar en las dosis más altas dentro de los rangos anteriores, y se pueden administrar más frecuentemente que las administraciones posteriores en el tratamiento de la enfermedad. Las dosis apropiadas se pueden determinar midiendo el contenido de IgE y los anticuerpos para Fc\epsilonRI en el suero del paciente, como se indicó anteriormente. Por ejemplo, temprano en el transcurso de la enfermedad, el polipéptido de fusión de la invención, tal como el dímero del Ejemplo 7, se puede administrar en dosis semanales de 200-500 mg de polipéptido en el paciente promedio (70 kg). Después del despeje de la IgE del suero y del anticuerpo para Fc\epsilonRI, el régimen de tratamiento se puede reducir a tratamientos semanales o a tratamientos cada dos semanas, con dosis en el rango desde 50 \mug hasta 100 mg de polipéptido por tratamiento.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar ya sea solas o en combinación con otros compuestos de la presente invención o agentes farmacéuticos adicionales tales como antihistaminas o corticosteroides.

La invención también comprende el uso de los polipéptidos de fusión de la invención en un ensayo de diagnóstico in vitro de cualquier formato estándar, por ejemplo ELISA, para determinar el nivel de IgE o de autoanticuerpos para Fc\epsilonRI (por ejemplo, en pacientes con urticaria crónica) en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente humano, por ejemplo muestras de sangre o de tejido. El componente HSA facilita convenientemente el enlazamiento y la detección de IgE o de autoanticuerpos para Fc\epsilonRI en un ensayo formateado para ELISA. La cantidad de IgE o de autoanticuerpos presentes en la muestra pueden servir como una medida de la respuesta alérgica del paciente a una sustancia a la cual ha sido expuesto el paciente. Los niveles de IgE o de autoanticuerpo pueden ser medidos también para determinar la eficiencia de las terapias contra la alergia, y para monitorear el estado alérgico de un paciente con el trascurso del tiempo.

La invención comprende además un método para llevar a cabo terapia génica en humanos utilizando un polinucleótido que codifica a un polipéptido de fusión de la invención, para el tratamiento de trastornos mediados por la IgE o el receptor de la IgE. El método de la terapia génica comprende la modificación de células de un paciente por medio de la introducción en ellas de un polinucleótido que codifica a un polipéptido de fusión de la invención y expresar al polipéptido a partir de tales células. Por ejemplo, se pueden remover primero células somáticas de un paciente, luego modificarlas genéticamente en un medio de cultivo por medio de la inserción del polinucleótido, y se reintroducen las células resultantes modificadas en el paciente, con lo cual un polipéptido de la invención se expresa por medio de las células del paciente.

Alternativamente, las células se pueden modificar in vivo por medio de inserción directa del ADN que codifica al polipéptido en el vector.

Las células adecuadas para modificación incluyen a las células endoteliales o a leucocitos. Para aplicaciones en terapia génica, el polinucleótido de la invención está preferiblemente bajo el control de un promotor regulable (por ejemplo inducible). La expresión del polipéptido puede por lo tanto hacerse dependiente de la exposición del paciente a un factor exógeno utilizando sistemas regulables conocidos del promotor.

La invención también incluye la utilización de métodos de terapia génica para preparar animales transgénicos no humanos o recombinantes somáticos no humanos que expresan a los polipéptidos de fusión de la invención, por ejemplo en la leche. Tales animales no humanos modificados también forma parte de la invención. Los ejemplos de animales no humanos útiles incluyen ratones, ratas, conejos, cerdos, ovejas, cabras y ganado, todos los cuales se han vuelto transgénicos utilizando técnicas estándar (por ejemplo, D.R. Hurwitz y colaboradores, Transgenic Research 3 [1994] 365-375). Los animales no humanos pueden ser utilizados para propósitos de moderación o para la producción efectiva de una proteína. En particular, la invención se relaciona con un ratón, cabra, vaca o cerdo transgénicos que expresan un polipéptido de fusión de la invención. Los métodos para elaborar tales animales no humanos son conocidos. Un polinucleótido que codifica a la proteína de fusión de la invención se puede introducir en las células somáticas de los animales no humanos, in vitro o in vivo, para producir animales no humanos recombinantes somáticos que están modificados genéticamente pero que no pueden pasar la modificación genética a la descendencia. Alternativamente, se puede insertar el polinucleótido en células de embriones no humanos para la producción de animales transgénicos no humanos capaces de pasar sobre la capacidad de expresar las proteínas de la invención a la
descendencia.

La transfección de células no humanas para terapia génica se puede lograr en forma convencional, por ejemplo por medio de electroporación, precipitación con fosfato de calcio, un procedimiento con base en lipofectina, inyección intramuscular, microinyección, o a través del uso de una "pistola génica". Los vectores con base en un plásmido contienen preferiblemente un marcador tal como el gen para resistencia a la neomicina para selección de transfectantes estables con el aminoglucósido G418 citotóxico en células eucariotas.

La infección se logra por medio de la incorporación de la secuencia genética para el polipéptido de fusión dentro de un vector retroviral. Se conocen diferentes procedimientos en el estado del arte para tal incorporación. Uno de tales procedimientos que ha sido ampliamente utilizado emplea un retrovirus defectuoso de múrido para empacar al retrovirus, y una línea celular antropomórfica de empaquetamiento para preparar virus antropomórficos infecciosos para ser usados en la infección de las células donantes no humanas objetivo.

Una caracterización adicional se puede efectuar por ejemplo de la siguiente manera:

Determinación in vivo de la vida media en suero Procedimiento general

Se inyectaron ratones hembra Charles River SKHI/hr/hr con un peso aproximado de 25 g en forma intravenosa con proteínas de prueba diluidas en PBS estéril libre de Ca^{2+}, Mg^{2+}. Se dividieron los ratones en grupos de la siguiente manera:

-: Grupo (i) que recibió 130 \mug (1 nmol) del polipéptido de fusión, por ejemplo el dímero IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IgE^{R} preparado como en el Ejemplo 7, o

-: Grupo (ii) que recibió 60 \mug de IgE^{R} (2 nmoles), o

-: Grupo (iii) que recibió 65 \mug de HSA I (1 nmol).

Se toman 100 \mul de sangre de cada ratón a los 10 minutos, 30 minutos, 3 horas, 6 horas y 12 horas después de la inyección. Se prepara el suero por centrifugación. Se determinan los niveles de concentración en suero de las diferentes proteínas por medio de a) el ensayo de enlazamiento de ELISA del receptor de IgE; b) ELISA de inhibición; o c) ELISA tipo sándwich de HSA, de la siguiente manera:

a) Ensayo de enlazamiento de ELISA de IgE^{R}

Se determina la concentración en suero de IgE por medio de la detección del enlazamiento de IgE por medio del siguiente ELISA tipo sándwich: se inmovilizan 200 ng de IgE humana en una placa COSTAR de 8 pozos en línea (Cambridge, MA, Estados Unidos de América) en 100 \mul de amortiguador de recubrimiento en una cámara húmeda a 4ºC durante la noche. Se lava dos veces cada pozo con 300 \mul de PBS estéril libre de Ca^{2+}, Mg^{2+}, pH 7,2. Se bloquean las placas durante una hora a temperatura ambiente con 200 \mul de PBS estéril libre de Ca^{2+}, Mg^{2+} que contiene BSA al 5% (Sigma). Después de lavar dos veces con 300 \mul de PBS estéril libre de Ca^{2+}, Mg^{2+} que contiene Tween 20 al 0,05% (PBST), se añaden las muestras diluidas en 100 \mul de suero de ratón diluido 1:10 (en PBS estéril libre de Ca^{2+}, Mg^{2+}) y se incuban durante una hora a temperatura ambiente.

Se lavan dos veces los pozos con 300 \mul de PBS y se incuba con 100 \mul (Ing) de un anticuerpo monoclonal del receptor de IgE antihumano tal como 5H5/F8 durante una hora a temperatura ambiente. Nuevamente, se lavan los pozos dos veces con 300 \mul de PBST y se incuba con 100 \mul de IgG-HRP antiratón de cabra (BioRad, diluido 1:2000 en PBS libre de Ca^{2+}, Mg^{2+}) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con 300 \mul de PBST, y se detectaron los conjugados de peroxidasa de rábano de caballo (HRP) con 100 \mul de sustrato ABTS (BioRad). Se detiene la reacción después de 5 minutos con 100 \mul de ácido oxálico al 3%. Se mide la intensidad de color con un fotómetro EASY READER a 405 nm.

b) ELISA de inhibición

Se inmovilizan 100 ng de Fc\epsilonRI\alpha en inmunoplacas Nunc de 96 pozos (F96 cert. Maxisorb) en 100 \mul de amortiguador de recubrimiento (NaHCO_{3} 0,1 M, NaN_{3} al 0,01%, pH 9,6) en una cámara húmeda a 4ºC durante la noche. Se lava cada pozo 4 veces con 300 \mul de PBS, Tween 20 al 0,05% (amortiguador de lavado). Para diferentes juegos de pozos, se añaden o bien un control negativo (50 \mul de suero de ratón diluido 1:25 en PBS, Tween 20 al 0,05%, FCS al 2%), una serie de diluciones del estándar del polipéptido de fusión, por ejemplo el estándar IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IgE^{R} (diluciones desde 400 ng/ml hasta 1,6 ng/ml) o una serie de diluciones de las muestras. El estándar y las muestras se diluyen en suero de ratón diluido 1:25 en PBS, Tween 20 al 0,05%, FCS al 2%. Inmediatamente después se añaden 50 \mul de un conjugado de IgE-Biotina humana con una concentración de 400 \mug/\mul en un amortiguador de dilución y se mezcla. La dilución final del suero de ratón en la mezcla de incubación es de 1:50.

Después de la incubación durante dos horas a 37ºC, se lavan las placas 4 veces con 300 \mul de amortiguador de lavado, y se añaden 50 \mul del conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina (Gibco) diluido 1:1.000 en amortiguador de dilución y se incuba durante una hora a 37ºC. Se lavan las placas 4 veces con 300 \mul de amortiguador de lavado y después de la adición de 100 \mul de sustrato (1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato en amortiguador de dietanolamina, pH 9,8 [BIORAD]) se detiene la reacción después de la incubación durante 30 minutos a 37ºC con 50 \mul de NaOH 2 M. Se miden las densidades ópticas con una estación de trabajo fotométrica BIOMEK-1000 a 405 nm. La evaluación cuantitativa de las curvas estándar (ajuste logístico de la curva con 4 parámetros) se hace con un programa de evaluación IMMUNOFIT ELISA de Beckman. Cálculo:

% de enlazamiento=[OD (valor de la muestra o del estándar)/OD (valor del amortiguador)] x 100

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c) ELISA tipo sándwich de HSA

Se inmovilizan 500 ng de HSA monoclonal anti ratón (HSA-9) en inmunoplacas Nunc de 96 pozos (F96 cert. Maxisorb) en 100 \mul de amortiguador de recubrimiento (NaHCO_{3} 0,1 M, NaN_{3} al 0,01%, pH 9,6) en una cámara húmeda a 4ºC durante la noche. Se lava cada pozo 4 veces con 300 \mul con amortiguador de lavado (PBS, Tween 20 al 0,05%). Se añaden 100 \mul de suero de ratón diluido 1:100 (PBS, Tween 20 al 0,05%, FCS al 2% = amortiguador de dilución) como control negativo, o 100 \mul de estándar (1 \mug/ml - 2 ng/ml de albúmina de suero humano, KABI) o 100 \mul de muestra diluida en suero de ratón diluido 1:100. Después de la incubación durante dos horas a 37ºC, se lavan las placas 4 veces con 300 \mul de amortiguador de lavado, y se añaden 100 \mul del conjugado Biotina-anti-HSA de conejo de una concentración de 1 ng/\mul diluido en amortiguador de dilución. Se purifica el conjugado Biotina-anti-HSA por medio de cromatografía de inmunoafinidad con CH-Seph4B-HSA, y se remueven las reactividades cruzadas con suero de ratón por medio de inmunosorción con agarosa-suero de ratón. Después de incubación durante dos horas a 37ºC se lavan las placas 4 veces con 300 \mul de amortiguador de lavado, y se añaden 50 \mul del conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina (Gibco) diluido 1:1000 en amortiguador de dilución y se incuba durante una hora a 37ºC. Se lavan las placas 4 veces con 300 \mul de amortiguador de lavado y después de la adición de 100 \mul de sustrato (1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato en amortiguador de dietanolamina, pH 9,8, BIO-RAD), se detiene la reacción después de la incubación durante 15 minutos a 37ºC con 50 \mul de NaOH 2 M. Se miden las densidades ópticas con una estación de trabajo fotométrica BIOMEK-1000 a 405 nm. La evaluación cuantitativa de la curva estándar (ajuste logístico de la curva con 4 parámetros) se hace con un programa de evaluación IMMUNOFIT ELISA de Beckman.

Resultados

Las concentraciones para el polipéptido dimérico de fusión, IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IgE^{R}, para la IgE^{R} libre (denominada como "cadena alfa libre") o para HSA I (denominado como "HSA") como función del tiempo transcurrido después de la inyección, se dan en pmoles/ml de suero en la Figura 1(A) y (B).

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La Figura 1(B) muestra que el receptor libre es detectable únicamente en suero de ratón aproximadamente durante 10 minutos, mientras que el polipéptido dimérico de fusión es aún detectable aproximadamente 12 horas después de su administración.

La Figura 1(C) muestra las cinéticas relativas de despeje para HSA y el polipéptido dimérico de fusión. Después de la estabilización de la distribución en tejido-sangre en los primeros 10 minutos, el dímero y HSA muestran una curva de despeje casi idéntica. Esto confirma que la vida media en suero de un dominio de enlazamiento de IgE se puede prolongar sustancialmente por medio de la fusión a HSA.

Inhibición de la anafilaxis cutánea pasiva (PCA) en ratones Procedimiento general (a) Administración del polipéptido

Las diluciones seriales de 10, 50 ó 500 \mug/kg de polipéptido de fusión, por ejemplo IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IgE^{R} obtenido a partir de células CHO en el Ejemplo 7, se inyectan en forma intravenosa en ratones hembra Charles River SKH1/hr/hr con un peso aproximado de 25 g en intervalos variables antes de la sensibilización.

Se establecen tres grupos de ratones dependiendo de la cantidad de polipéptido inyectado antes de la sensibilización (esto es 10 \mug/kg, 50 \mug/kg ó 500 \mug/kg). Un cuarto grupo de ratones de control recibió 200 \mug/kg de PBS en forma intravenosa en vez del polipéptido. Los cuatro grupos de ratones se dividen cada uno en tres subgrupos, que se diferencian en el intervalo entre inyecciones intravenosas del compuesto y la sensibilización intracutánea con IgE [etapa (b) más abajo]. Los intervalos probados son: 5 minutos, 15 minutos y 30 minutos.

(b) Sensibilización intracutánea

Se anestesian los ratones y se sensibilizan en la piel del lomo por medio de 4 inyecciones intradérmicas de 5 ng cada una de anticuerpo monoclonal IgE anti-dinitrofenilo (DNP) de ratón en 10 ml de PBS (BioMakor, Rehovot, Israel). En el grupo de control, se inyecta solución salina en forma intradérmica en un sitio.

(c) Reto del alérgeno

90 minutos después de la sensibilización, se anestesian nuevamente los ratones y se los desafía por medio de una inyección intravenosa de una solución que contiene 50 \mug de dinitrofenilo-albúmina de suero bovino (DNP-BSA) (Calbiochem-Behring, San Diego, Estados Unidos de América) que contiene azul de Evans al 1%. Se cuantificó la respuesta de PCA midiendo el diámetro del sitio coloreado analizado debido a extravasación.

Resultados

Estos se describen en la gráfica de barras en la Figura 2 para el polipéptido maduro de fusión del Ejemplo 7 (aminoácidos Val_{26}-Leu_{978} de la SEQ. ID. NO. 3). A una concentración de 500 \mug/kg, el polipéptido dimérico de fusión bloquea completamente la PCA en cada momento de la aplicación. Con 50 \mug/kg, el tratamiento 30 minutos antes del reto produce una reducción estadísticamente significativa del 36%. 15 minutos antes del reto, se observa una tendencia con la administración tanto de 10 como de 50 \mug/kg del dímero. Por lo tanto, el polipéptido dimérico de fusión es eficaz en la prevención de la PCA.

Los procedimientos de las técnicas para llevar a cabo la presente invención son conocidos en el estado del arte. En la medida en que su preparación no se describe aquí en forma particular, los compuestos, reactivos, vectores, líneas celulares, etc., que son utilizados son conocidos y se encuentran fácilmente disponibles o se pueden obtener en forma convencional a partir de materiales conocidos y fácilmente disponibles, o se pueden preparar materiales equivalentes en forma convencional a partir de materiales conocidos y fácilmente disponibles.

Los siguientes Ejemplos no limitativos ilustran la invención. Todas las temperaturas están en grados Centígrados.

Materiales y métodos Amplificación por PCR

La nueva síntesis química de los iniciadores de la invención se puede llevar a cabo utilizando cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, los métodos del fosfodiéster o del fosfotriéster.

Los métodos y los sistemas para la amplificación de una secuencia específica de ácido nucleico son descritos en las patentes estadounidenses Nos. 4.683.195 y 4.683.202; y en Polymerase Chain Reaction, H.A. Erlich y colaboradores, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989]. Después de la PCR, los fragmentos de ADN se cortan y se purifican utilizando el protocolo de QiaEx (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, Estados Unidos de América), luego se subclona dentro de un vector TA [TA Cloning® Kit (Invitrogen) (literatura del producto, Versión 2.2)]. Los iniciadores utilizados en la generación de ácidos nucleicos amplificados por PCR se exponen en la Fig. 8. Se secuencia el ADN utilizando el método de la Sequenasa (USB, Cleveland, OH, Estados Unidos de América).

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Plásmidos y Reactivos

El clon de ADNc de Fc\epsilonRI\alpha, pGEM-3-110B-1 (A. Shimizu y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA\cdot 85 [1988] 1907-1911) se obtiene a partir de la American Type Tissue Collection (ATCC cepa #67566). El ADNc monocatenario de hígado humano de obtiene de Clontech (PCR-ready Quick Clone cDNA, Cat. D#7113-1). La secuencia de HSA está disponible bajo los números de acceso VOO495, JOOO78, LOO132 y LOO133 del GenBank. Las enzimas de restricción se obtienen de Boehringer-Mannheim o de Gibco/BRL. La Taq ADN polimerasa se obtiene de Perkin-Elmer Cetus (PECI) o de Boehringer-Mannheim. El vector SK se obtiene de Stratagene.

pHIL-D2 se obtiene de Invitrogen (San Diego, CA, Estados Unidos de América; Catálogo no. K1710-01 [1994]) (ver "Pichia Expression Kit - Protein Expression - A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris - Versión 3.0" [Diciembre 1994]) (de aquí en adelante denominado como el "Manual de Invitrogen").

El vector pXMT3 se deriva de pMT2 (Sambrook y colaboradores, (Eds.) [1989] referido arriba) por clonación del Enlazador EcoRI a PstI de pUC8 (Pharmacia) dentro de los sitios de PstI y EcoRI de pMT2 (R.J. Kaufman y colaboradores, [1987] referido arriba).

Se describen técnicas estándar como las utilizadas más abajo en Sambrook y colaboradores, (Eds.) [1989] referido más arriba.

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Ejemplo A Vector de Clonación TA

El plásmido pCR2 se liga separadamente con cada uno de los productos de amplificación de la PCR obtenidos en los Ejemplos 1 y 2. Las reacciones de ligación se llevan a cabo utilizando una ligasa de ADN del fago T4 en la siguiente mezcla de reacción:

Tris-HCl 25 mM (pH 7,8)

MgCl_{2} 10 mM

DTT 1 mM

ATP 1 mM

50 ng del vector de ADN

100-200 ng de los productos de reacción de la PCR (no purificados)

4 unidades de ligasa de ADN del fago T4 (New England Biolabs).

Cada mezcla de reacción se mantiene a 15ºC durante 18 horas antes de ser transformada dentro de células competentes.

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Ejemplo 1 Amplificación por medio de la PCR y clonación del ADNc de Fc\epsilonRI\alpha

Se purifica el ADNc de Fc\epsilonRI\alpha a partir de pGEM-3-110B-1 utilizando el método de Qiagen. Luego:

(A): Para preparar una construcción que conduce a HSA, se lleva a cabo la amplificación por medio de la PCR del ADNc de Fc\epsilonRI\alpha con los oligonucleótidos #18 y #19 (Figs. 4, 8) utilizando la siguiente mezcla de reacción:

: 1 \mul (50 ng) de ADNc de Fc\epsilonRI\alpha;

: 50 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos #18 y #19

: 5 \mul de amortiguador para PCR 10x (PECI)

: 0,5 \mul de solución patrón de dNTP 20 mM = 200 \muM, concentración final de los dNTP

: 0,5 \mul (2,5 U) de Taq ADN polimerasa (PECI)

: agua hasta 50 \mul.

: Se cubre la mezcla de reacción con aceite mineral para evitar la evaporación, y se termocicla en un termociclador de ADN marca Perkin Elmer Cetus, modelo 480. Las condiciones de ciclización para esta reacción son: calentar hasta 95ºC durante 5 minutos, luego 30 ciclos de 94ºC durante 1,5 minutos, 53ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 3 minutos, seguido por una extensión de tres minutos a 72ºC y un remojo durante la noche a 4ºC.

: Después de la electroforesis se confirma un producto amplificado de 550 pb por medio de coloración con bromuro de etidio. El fragmento se subclona dentro del vector PCR2 para producir pEK1 que codifica a la IgE^{R} (Figuras 4, 8B).

(B): Para preparar una construcción que conduce a IgE, se lleva a cabo la amplificación por PCR del ADNc de Fc\epsilonRI\alpha de acuerdo con el procedimiento anterior de (A), excepto por que se utilizan los oligonucleótidos #20 y #31 (Fig. 8B). Después de la electroforesis sobre gel de agarosa al 0,7%, se confirma un producto amplificado de \sim600 pb por medio de coloración con bromuro de etidio. Se subclona el fragmento dentro del vector PCR2 para formar IgER/TA#1 que codifica a pre-IgE^{R} (Fig. 4).

(C): Para preparar una construcción que codifica a pre-IgE_{R} con el propósito de expresar a la proteína truncada madura para utilizarla como control en los ensayos, se lleva a cabo la amplificación por PCR del ADNc de Fc\epsilonRI\alpha como en (A) más arriba con los oligonucleótidos #20 y #19 (Fig. 8B). Después de la electroforesis, se confirma un producto amplificado de \sim620 pb por medio de coloración con bromuro de etidio. Se corta el fragmento de la PCR y se lo subclona dentro del vector PCR II para proveer IgERFL/TA#34, que codifica a pre-IgE^{R} seguido por un codón de detención (Fig. 4).

Ejemplo 2 Amplificación por PCR y clonación de ADNc de albúmina de suero humano

Para obtener una secuencia que codifique a prepro-HSA II, se lleva a cabo una amplificación por PCR del ADNc de albúmina de suero humano de longitud total con los oligonucleótidos #24 y #25 (Fig. 8B), siguiendo el procedimiento general del Ejemplo 1(A). El clon resultante HSA/TA#1 tenía la secuencia más parecida a la secuencia en el GenBank. En este clon, se detectaron siete mutaciones en la posición bamboleante y una mutación que resultó en un cambio de lisina por ácido glutámico en la base 1333. Las siete mutaciones en la posición bamboleante fueron: base 309: A por T; base 744: A por G; base 795: G por A; base 951: G por A; base 1320: C por T; base 1569: A por C; base 1584: G por A (con referencia a HSA/TA#1). La mutación de glicina por ácido glutámico fue corregida de nuevo a la secuencia en el GenBank utilizando mutagénesis dirigida al sitio con los oligonucleótidos mostrados en la Fig. 8A y el kit de mutagénesis in vitro del Fagémido Mutágeno de BioRad (BioRad, Cat. #170-3581). Este método confía en la incorporación de residuos de uracilo en la cadena origen y su remoción posterior en la cadena mutagenizada (T.A. Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 [1985] 488-492). Debido a que las mutaciones puntuales en la posición bamboleante no alteran a la secuencia nativa de aminoácidos de la proteína codificada, no se corrigieron las siete mutaciones anteriores. Después de la electroforesis, se confirma un producto amplificado de 1,8 kb por medio de coloración con bromuro de etidio.

Se subclona el producto de 1,8 kb dentro del vector pCR2 para formar HSA/TA mut #16, que se verifica por medio de la secuenciación del ADN para contener a la secuencia completa prepro-HSA II. Se subclona HSA/TA mut #16 dentro de Bluescript SK como un fragmento SpeI, HindIII, para producir HSA/SK #17 (Fig. 5).

(A): Para preparar una construcción que conduce a HSA, se digiere HSA/SK#17 con MstII y HindIII para remover la secuencia de nucleótidos que codifica al aminoácido del terminal 3' (Leu_{609}); y se introduce un nucleótido que codifica al enlazador L_{2} como se definió anteriormente en el terminal 3' de HSA/SK#17 linealizado por medio de los oligonucleótidos fosforilados #28 y #29 (Fig. 8B) y el apareamiento y ligamiento de estos fragmentos dentro de los sitios MstII/HindIII del HSA/SK#17 linealizado, para producir pEK7 que codifica a prepro-HSA II fusionado a L_{2} (Fig. 8B). Se chequea una minipreparación de ADN por medio de una digestión con BamHI y por medio de una secuenciación.

(B): Para preparar una construcción que conduce a IgE, se amplifica HSA/SK#17 que codifica a prepro-HSA II por medio de una PCR con los oligonucleótidos #26 y #27 (Figs. 5, 8). El oligonucleótido #26 remueve la secuencia prepro de HSA, y añade un oligonucleótido que codifica a L_{1} en el extremo 5' de HSA. El oligonucleótido #27 termina en un sitio único NcoI de ocurrencia natural alrededor del nucleótido en la posición 800 de la secuencia de codificación de HSA. La amplificación por medio de la PCR se lleva a cabo de acuerdo al procedimiento en el Ejemplo 1(A). Un fragmento de aproximadamente 800 pb aislado por medio de electroforesis en gel y Qia se subclona en un vector pCR2, para proveer al clon HSA Nco/TA #13, cuya secuencia se verifica por medio de la secuenciación del ADN. El fragmento NotI a NcoI de este clon se subclona dentro del corte del ADN de HSA/SK #17 en NcoI y NotI, produciendo HSA/SK #5 (Fig. 5) que codifica a L_{1} enlazado al terminal 5' del ADNc que codifica a HSA II.

(C): Para la expresión de HSA solo, se emplea la construcción HSA/SK #17 preparada anteriormente.

Ejemplo 3 Construcción de la fusión HSA-IgER/SK #22 que codifica a prepro-HSA + Enlazador + IgE^{R}

Se digieren pEK7 (que contiene al ADNc de prepro-HSA II + oligonucleótido para L_{2}) y pEK1 (que contiene IgE^{R}) con BamHI y SalI. El fragmento obtenido de 1,8 kb de pEK7 se fosfata y luego se lo liga al fragmento de 550 kb obtenido de pEK1. Se preparó una minipreparación positiva, #23, pero se contaminó con otro plásmido desconocido que evitó la recuperación de la banda de HSA-IgE^{R}. Por lo tanto, el fragmento de 2,4 kb de SpeI a SalI que contiene la fusión HSA-IgE^{R} y el fragmento de 2,9 kb que contiene el ADN del vector fueron purificados a partir e la minipreparación #23 y ligados entre sí, resultando en el clon HSA - IgE/SK #49 (Fig. 9) [se encontró que los sitios del vector se perdieron de cualquiera de los extremos de la región subclonada, y por lo tanto, se subclonó el fragmento de 2,4 kb de SpeI a SalI de HSA-IgE/SK #49 dentro de SpeI más SalI - corte de Bluescript SK, resultando en HSA-IgE/SK #22 (no mostrado en las Figuras)].

La secuencia de la unión de la HSA y el enlazador con el ADN del receptor de IgE y la secuencia de los extremos de la fusión con el vector de ADN fueron como se esperaba en HSA-IgE/SK #22 como se verificó por medio del análisis de la secuencia de ADN.

Ejemplo 4 Construcción de la fusión IgE-HSA/SK #1 que codifica a IgE^{R} + prepro-HSA II

Se digieren HSA/SK #5e IgE^{R}/TA #1 con SstI y NheI. Se purifica el fragmento de 600 pb de IgE/TA #1 por medio de electroforesis en gel y se lo liga dentro del corte y HSA/SK #5 tratado con fosfatasa, produciendo el clon IgE-HSNSK #1 (Fig. 10).

Ejemplo 5 Construcción de la fusión R-H-R/SK #50 que codifica a pre - IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IgE^{R}

El sitio único PstI para la región HSA de IgE^{R}-HSA/SK #1 y HSA-IgE^{R}/SK 349 se utiliza para unir a IgE^{R} y prepro - HSA II a través del oligonucleótido para L_{2}. Se digieren HSA/IgE^{R}/SK #49 y Bluescript SK con PstI y SalI. Un fragmento de 1,2 kb que contiene a la porción 3' de HSA II, al enlazador y a la secuencia de IgE^{R} se ligan dentro de PstI más SalI - corte del ADN de Bluescript, resultando en HSA-IgE^{R} Pst SaI/SK #37 (Fig. 11), que se digiere con PstI y KpnI, y se prepara el fragmento de 1,2 kb.

Se digiere el ADN de IgE^{R}-HSA/SK #1 con PstI y KpnI, y se aísla un fragmento de 4,8 kb que contiene al vector, a IgE^{R}, al enlazador y la mitad 5' de HSA, se lo trata con fosfatasa, y se lo liga al fragmento de 1,2 kb de HSA-IgE^{R} Pst SaI/SK #37. Se obtiene la construcción dimérica resultante R-H-R/SK #50 (Fig. 11).

Ejemplo 6 Polipéptidos monoméricos de fusión HSA II - L_{2} - IgE^{R} por medio de transfección y cultivo de Pichia pastoris

Se prepara el plásmido MB#2 que codifica a HSA II - L_{2} -IgE^{R} cortando el plásmido HSA/SK #49 con EcoRI y aislando el fragmento de 2,4 kb que codifica a la proteína de fusión.

El fragmento se liga dentro del sitio único de EcoRI del vector de expresión de Pichia pastoris pHIL-D2 (Invitrogen), después de la digestión del plásmido pHIL-D2 con EcoRI y el tratamiento con fosfatasa alcalina. El plásmido MB#2 resultante se linealiza por medio de digestión con NotI y se transforma dentro de células his4 GS 115 como se describe en el "Manual de Invitrogen". Se seleccionan His + los transformantes para el crecimiento sobre metanol. Las cepas que exhiben crecimiento lento sobre metanol se cultivan en medio mínimo de glicerol como se especifica en el "Manual de Invitrogen" para la fase estacionaria, transferida por medio de centrifugación a un medio en metanol de complejo amortiguado y crecimiento durante 4 días. El sobrenadante de las células es luego analizado por medio de ELISA por la presencia de HSA y por la habilidad de enlazamiento de IgE. La habilidad de enlazamiento de IgE del producto obtenido secretado por P. pastoris era equivalente en base molar a la concentración de HSA y completamente activo biológicamente.

Ejemplo 7 Polipéptido dimérico de fusión IgE^{R} - HSA II - L_{2} - IgE^{R} por medio de transfección y cultivo de células CHO

El plásmido pXMT3-RI\alpha-HSA-RI\alpha (que contiene al polinucleótido de la SEQ. ID. NO. 4 que codifica a pre-IgE^{R} - L_{1} - HSA II - L_{2} - IgE^{R}) se prepara por medio de digestión de R-H-R/SK #50 (ver Ejemplo 5) con EcoRI y aislamiento del fragmento de EcoRI de 3 kb que codifica al polipéptido dimérico de fusión. Este fragmento se liga dentro del sitio único de EcoRI de pXMT3 después de digestión de pXMT3 con EcoRI y tratamiento con fosfatasa
alcalina.

Se transfecta el plásmido dentro de células CHO DUKX B 11. Estas células carecen de un gen funcional que codifica para dhfr (dihidrofolato reductasa) requerido para la síntesis de nucleósidos. Por lo tanto, las células se mantienen en medio Alfa+ (MEDIO ALFA MEM con ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos/Gibco) que contiene suero fetal de ternera al 10% (FCS). Por transfección, las células se lavan dos veces en PBS libre de Ca^{++}-Mg^{++} (CMF-PBS) y se ajusta la concentración de células en 2 x 10^{6} células/ml en CMF-PBS. Se añaden 0,8 ml de la suspensión celular a 15 \mug de plásmido ADN. La transfección se hace por electroporación utilizando un Pulsador Génico de BioRad
(voltaje = 1000 V; capacitor = 25 \muF). Después de la transfección se cultivan las células en 15 ml de medio Alfa+ con FCS al 10% durante 3 días.

El gen que codifica para dhfr localizado sobre el plásmido pXMT3 permite la selección de células recombinantes en un medio agotado en nucleósidos, 3 días después de la transfección de las células se colocan en medio Alfa- (MEDIO ALFA MEM sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos/Gibco) que contiene suero fetal de ternera dializado al 10% (FCSD). Después de 2 semanas de cultivo, se hacen visibles colonias de células recombinantes. Las células se mantienen en medio Alfa- que contiene FCSD al 10% durante 4 pasadas adicionales antes de iniciar la amplificación génica.

En presencia de metrotexato (MTX), dhfr y los genes enlazados a él se amplifican, resultando en una expresión mayor del transgen. Por lo tanto, la selección por células recombinantes en un medio agotado de nucleósido es seguida por el cultivo en presencia de MTX 20 nM en medio Alfa- que contiene FCSD al 10%. La amplificación adicional se logra por medio de un incremento gradual en metotrexato hasta 100 nM y de MTX 500 nM.

La proteína se produce por medio de una reserva de plantas recién nacidas T1/3-500 nM en medio Alfa- que contiene FCS al 10% (GIBCO) con una densidad de 9 x 10^{3}/cm^{2} en botellas rodantes. El primer sobrenadante se recolecta 5 días después de la siembra, seguido por medio de un cambio a Alfa- libre de suero. La segunda cosecha se recoge 3 días después, produciendo un total de 1 litro de sobrenadante para purificación.

Se purifica un segundo lote a partir de 2 litros de sobrenadante derivados de una reserva de T1/3-500 nM adaptada a las condiciones de crecimiento libres de suero. Las células se siembran a razón de 5 x 10^{4} células/ml y se recolecta el sobrenadante 6 días después de la siembra.

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Ejemplo 8 Purificación de proteína de fusión

Los sobrenadantes del cultivo del Ejemplo 7 se purifican por medio de cromatografía de inmunoafinidad sobre anticuerpos monoclonales anti-Fc\epsilonRI inmovilizados (por ejemplo, 5H5-F8; ratón 1gG1), producido y purificado de acuerdo a técnicas estándar:

a) Preparación del soporte cromatográfico

Los anticuerpos monoclonales se acoplan a Sefarosa 4B activada con CNBr (Pharmacia, Uppsala, Suecia) con una densidad de 10 mg de anticuerpos/ml de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El exceso de grupos reactivos son posteriormente bloqueados con etanolamina y se almacena la resina en PBS suplementado con NaN_{3} al 0,02% hasta su uso.

b) Cromatografía de afinidad

Se aplica cultivo despejado de sobrenadante a una columna de anticuerpo de 5 ml equilibrada en PBS con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se eluye el material absorbido en ácido cítrico 50 mM, NaCl 140 mM, pH 2,70. Se ajustan inmediatamente las fracciones que contienen proteína a un pH de 7,0 (NaOH) seguido por filtración estéril.

c) Cuantificación/caracterización

La concentración del polipéptido dimérico de fusión se determina por medio de absorción a 280 nm en su conformación nativa en ácido (3-[N-morfolino]propano)sulfónico (MOPS) 30 mM, pH 7,0 y en la forma desnaturalizada (clorhidrato de guanidina 6 M). El coeficiente de absorción molar correspondiente se calcula a partir del número de residuos de triptófano, tirosina y cistina utilizando los coeficientes de absorción tabulados de estos aminoácidos en compuestos modelos y corregidos por la diferencia en densidad óptica entre la proteína plegada y la no plegada. La proteína de fusión contiene 17 triptófanos, 40 tirosinas y 21 cistinas que resultan en un coeficiente de extinción teórico de 150840 M^{-1}cm^{-1}. La calidad del material purificado se evalúa por medio de SDS-PAGE estándar y por medio de secuenciación automatizada de degradación de Edman en fase gaseosa del terminal N y por espectrometría de masas. Por SDS-PAGE (Fig. 15) el polipéptido migra con un peso molecular aparente de aproximadamente 140 kDa, reflejando aproximadamente un 28% de glicosilación (PM teórico sin glicosilación: 108.863,61 Da).

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet EP 648499 A [0018]: \bullet US 4683202 A [0049]

\bullet EP 413622 A [0018]: \bullet US 08690216 B [0063]

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Literatura citada en la descripción que no es de patente

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Novartis AG

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(B): CALLE: Schwarzwaldallee 215

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(C): CIUDAD: Basilea

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(E): PAÍS: Suiza

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4058

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(G): TELÉFONO: 61-324 5269

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(H): TELEFAX: 61-322 7532

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDOS DE FUSIÓN

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv): FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): COMPUTADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(v): DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

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: NÚMERO DE LA SOLICITUD; WO PCT/EP97/

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/690216

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 26 de JULIO de 1996

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 257 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 609 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

2

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 978 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): ENTRELAZAMIENTO: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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5

6

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2955 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENTRELAZAMIENTO: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

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9

10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1827 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENTRELAZAMIENTO: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(vi): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(vii): HIPOTÉTICA: NO

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(viii): ANTISENTIDO: NO

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(ix): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

11

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 773 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENTRELAZAMIENTO: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

12

Claims

1. Un polipéptido de fusión o una sal del mismo de la SEQ. ID. NO. 3 o de los residuos Val_{26}-Leu_{978} de la SEQ. ID. NO. 3.

2. Un polinucleótido aislado que es un intermediario en la preparación de un polipéptido o una sal del mismo de la reivindicación 1 que comprende a los residuos Val_{28}-Leu_{978} de la SEQ. ID. NO. 3.

3. Un proceso para la preparación de un polipéptido o una sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a): transformar una célula huésped con un vector que contiene ADN que codifica a un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 1;

(b): expresar al polipéptido en esa célula para producir un polipéptido de fusión como se definió en la reivindicación 1; y

(c): recobrar al polipéptido resultante de la célula huésped, opcionalmente en la forma de una sal del mismo.

4. Un vector que contiene ADN que codifica a un polipéptido o a una sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 1.

5. Un animal transgénico no humano que expresa un polipéptido o una sal el mismo de acuerdo con la reivindicación 1.

6. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso como un medicamento.

7. Una composición farmacéutica que contiene un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

8. El uso de un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos mediados por la IgE o por el receptor de la IgE.