ES2399267T3 - Suministro selectivo de moléculas al interior de las células o marcación de células en zonas enfermas de tejidos usando un péptido transmembrana sensible a su entorno - Google Patents
Suministro selectivo de moléculas al interior de las células o marcación de células en zonas enfermas de tejidos usando un péptido transmembrana sensible a su entorno Download PDFInfo
- Publication number
- ES2399267T3 ES2399267T3 ES06718899T ES06718899T ES2399267T3 ES 2399267 T3 ES2399267 T3 ES 2399267T3 ES 06718899 T ES06718899 T ES 06718899T ES 06718899 T ES06718899 T ES 06718899T ES 2399267 T3 ES2399267 T3 ES 2399267T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- functional group
- polypeptide
- composition
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 137
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 36
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 36
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 claims description 40
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 19
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 4
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 3
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 claims 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims 1
- 101710107427 Extracellular metalloprotease Proteins 0.000 claims 1
- 101710200557 Extracellular small neutral protease Proteins 0.000 claims 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 claims 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 claims 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 claims 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 abstract 1
- 108700018214 pHLIP Proteins 0.000 description 40
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 15
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 8
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 8
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 8
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 7
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- -1 dithionite ion Chemical class 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 6
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 6
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- GQWYWHOHRVVHAP-UHFFFAOYSA-N jasplakinolide Natural products C1C(=O)OC(C)CC(C)C=C(C)CC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N(C)C(CC=2C3=CC=CC=C3NC=2Br)C(=O)NC1C1=CC=C(O)C=C1 GQWYWHOHRVVHAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- GQWYWHOHRVVHAP-DHKPLNAMSA-N jaspamide Chemical compound C1([C@@H]2NC(=O)[C@@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3Br)N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)C/C(C)=C/[C@H](C)C[C@@H](OC(=O)C2)C)=CC=C(O)C=C1 GQWYWHOHRVVHAP-DHKPLNAMSA-N 0.000 description 3
- 108010052440 jasplakinolide Proteins 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 2
- 241000948470 Amanita phalloides Species 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 108010082845 Bacteriorhodopsins Proteins 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007950 acidosis Effects 0.000 description 2
- 208000026545 acidosis disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-VYOBOKEXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-VYOBOKEXSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- BMUXFZXYGDXKJY-UHFFFAOYSA-N 4-azido-2-hydroxybenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1O BMUXFZXYGDXKJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGHBXJSNZCFXNK-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-7-nitrobenzofurazan Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C2=NON=C12 IGHBXJSNZCFXNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910004878 Na2S2O4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010087367 P-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100039032 Phosphatidylcholine translocator ABCB4 Human genes 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004705 ethylthio group Chemical group C(C)S* 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229930186692 jaspamide Natural products 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 229930193708 latrunculin Natural products 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- CNXAVQHYRALFDY-VIPNGKGCSA-N misakinolide a Chemical compound C1[C@H](OC)C[C@H](C)O[C@H]1CC[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](OC)C[C@H](CC=C2)O[C@@H]2C[C@@H](O)C/C=C(C)/C(=O)O[C@H]([C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)CC[C@@H]2O[C@@H](C)C[C@H](C2)OC)[C@@H](C)[C@H](O)C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](OC)C[C@H](CC=C2)O[C@@H]2C[C@@H](O)C/C=C(C)/C(=O)O1 CNXAVQHYRALFDY-VIPNGKGCSA-N 0.000 description 1
- KOMVIEGHPLWKNT-UHFFFAOYSA-N misakinolide-A Natural products C1C(OC)CC(C)OC1CCC(C)C(O)C(C)C1C(C)C(O)CC(O)C(C)C(OC)CC(CC=C2)OC2CC(O)CC=C(C)C(=O)O1 KOMVIEGHPLWKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- ODTZGFFHYPHJNS-UHFFFAOYSA-N n-(4-benzoylphenyl)-2-iodoacetamide Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 ODTZGFFHYPHJNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- QHGUCRYDKWKLMG-UHFFFAOYSA-N octopamine Chemical compound NCC(O)C1=CC=C(O)C=C1 QHGUCRYDKWKLMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001576 octopamine Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- RJVBVECTCMRNFG-ANKJNSLFSA-N swinholide a Chemical compound C1[C@H](OC)C[C@H](C)O[C@H]1CC[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](OC)C[C@H](CC=C2)O[C@@H]2C[C@@H](O)C/C=C(\C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)CC[C@@H]2O[C@@H](C)C[C@H](C2)OC)[C@@H](C)[C@H](O)C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](OC)C[C@H](CC=C2)O[C@@H]2C[C@@H](O)C/C=C(\C)/C=C/C(=O)O1 RJVBVECTCMRNFG-ANKJNSLFSA-N 0.000 description 1
- GDACDJNQZCXLNU-UHFFFAOYSA-N swinholide-A Natural products C1C(OC)CC(C)OC1CCC(C)C(O)C(C)C1C(C)C(O)CC(O)C(C)C(OC)CC(CC=C2)OC2CC(O)CC=C(C)C=CC(=O)O1 GDACDJNQZCXLNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/215—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Halobacteriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Una composición que comprende: un polipéptido con una secuencia predominantemente hidrófoba lo suficientemente larga para abarcar una bicapalipídica de membrana en forma de hélice transmembranal, y secuencias que flanquean dicha secuencia hidrófoba demodo que el péptido es soluble en disoluciones acuosas y se inserta espontáneamente a través de una membranacelular en un pH de 7,4 o menor, moviéndose una de las regiones de secuencia flanqueadora a través de la membranacelular y quedando otra región de secuencia flanqueadora expuesta al ambiente acuoso, fuera de la célula, enque dichas secuencias flanqueadoras comprenden una FSin en el extremo C de dicho polipéptido y una FSout en elextremo N de dicho polipéptido; y uno o más grupos funcionales unidos a dicho extremo C o dicho extremo N dedicho polipéptido, caracterizada por que el polipéptido comprende la secuencia Sec.1: AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTCG.
Description
Suministro selectivo de moléculas al interior de las células o marcación de células en zonas enfermas de tejidos usando un péptido transmembrana sensible a su entorno.
- 1.
- Campo del invento
El presente invento tiene relación con el campo de la bioquímica de proteínas, la biofísica de membranas, el suministro específico de fármacos, la regulación génica, la obtención de imágenes y el diagnóstico de tejidos enfermos. Más particularmente, el invento se refiere al uso de un polipéptido transmembranal para dirigir a células y tejidos con ambiente ácido.
- 2.
- Descripción de la técnica previa
Los compuestos terapéuticos y diagnósticos deben suministrarse al tejido enfermo y acumularse en él en concentraciones adecuadas para los fines terapéuticos o diagnósticos. El suministro específico de compuestos terapéuticos y diagnósticos a un tejido enfermo mejora significativamente la eficacia del tratamiento o la exactitud diagnóstica y reduce drásticamente los efectos secundarios. La hipoxia y la acidosis son marcadores fisiológicos de muchos procesos morbosos, tales como tumores, lesiones ateroscleróticas, isquemias, accidentes cerebrovasculares, inflamaciones y traumas (Stubbs et al., 2000, Mol. Med. Today 6, 15; Helmlinger et al., 2002, Clin. Cancer Res. 8, 1284; Izumi et al., 2003, Cancer Treat. Reviews 29, 541; Leake, 1997, Atherosclerosis 129, 149; Avkiran, 2003, J. Card. Surg. 18, 3). El suministro de moléculas, selectivo en cuanto al pH, al tejido enfermo es otro objeto del presente invento.
En la mayoría de los casos, los compuestos terapéuticos y diagnósticos se deben translocar a una célula a través de la membrana celular con objeto de alcanzar sus dianas. También es necesario que muchos reactivos para la investigación de procesos celulares y la regulación génica se transloquen a células. La membrana plasmática, que está principalmente compuesta de fosfolípidos y proteínas, es una barrera natural para la libre difusión de moléculas a través de ella.
Las funciones transmembranales son mediadas por proteínas de membrana. La plegadura y la inserción de grandes dominios de proteínas de membrana en las membranas requieren normalmente la participación activa de máquinas de translocación complejas (van den Berg et al., 2004, Nature 427, 36; Osborne et al., 2005, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21, 529; White y von Heijne, 2005, Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 378), mientras que la inserción y la plegadura de secuencias proteicas cortas (< 50-60 restos) pueden tener lugar espontáneamente (von Heijne, 1994, FEBS Lett. 346, 69; Whitley et al., 1994, EMBO J. 13, 4653; Wimley y White, 2000, Biochemistry 39, 4432; Popot y Engelman, 1990, Biochemistry 29, 4031), liberándose energía y translocándose un extremo del polipéptido a la célula. En un trabajo reciente, se ha mostrado que ciertos casos de aparente inserción espontánea requieren una proteína de membrana, YidC [para una revisión, véase Dalbey y Kuhn, 2004, J. Cell. Biol. 166: 769).
Previamente se había comunicado que un polipéptido derivado de la hélice C de la bacteriorrodopsina, que consiste en la secuencia transmembranal y dos secuencias flanqueadoras, es soluble en disolución acuosa y se inserta espontáneamente a través de las bicapas lipídicas, formando una hélice alfa estable en un pH bajo (Engelman y Hunt, 1998, Patente de EE.UU. nº 5.739.273; Hunt et al., 1997, Biochemistry 36, 15.177). El péptido no presenta ningún elemento de estructura secundaria helicoidal en disolución ni en la membrana en un pH neutro. Puesto que el péptido se inserta en vesículas lipídicas puras, puede que no necesite YidC. La translocación de moléculas, selectiva en cuanto al pH, a través de la membrana celular es otro objeto del presente invento.
El presente invento proporciona un polipéptido de inserción en pH bajo [pHLIP (del inglés, pH Low Insertion Peptide)], con una secuencia predominantemente hidrófoba lo suficientemente larga para abarcar una bicapa lipídica de membrana en forma de hélice transmembranal, y secuencias que flanquean dicha secuencia hidrófoba de modo que el polipéptido es soluble en disoluciones acuosas y se inserta espontáneamente a través de una membrana de un modo dependiente del pH, moviéndose una de las regiones FS (FSin) a través de la membrana hasta el citoplasma y quedando la otra (FSout) fuera de la célula, expuesta al ambiente acuoso, en que dichas secuencias flanqueadoras comprenden una FSin en el extremo C de dicho polipéptido y una FSout en el extremo N de dicho polipéptido; y uno o más grupos funcionales fijados a dicho extremo C o dicho extremo N de dicho polipéptido, caracterizado por que el polipéptido comprende la Sec1:
AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTCG.
El invento también proporciona un método para suministrar in vitro un grupo funcional a través de una membrana celular en un pH extracelular ácido, empleando una composición que comprende el polipéptido pHLIP, en que un grupo funcional está fijado al extremo C del polipéptido.
También se proporciona un método para suministrar in vitro un grupo funcional a superficies celulares en un pH extracelular ácido, empleando una composición que comprende el polipéptido pHLIP, en que un grupo funcional está fijado al extremo N del polipéptido.
En un pH extracelular bajo, el pHLIP puede translocar ciertos grupos funcionales conjugados con la parte FSin del polipéptido a través de la membrana. Si los grupos funcionales están unidos al pHLIP mediante interacciones que son lábiles en el ambiente del citoplasma, tales como enlaces disulfuro, el grupo funcional puede ser liberado en el citoplasma. Los ejemplos de moléculas que pueden ser translocadas y liberadas incluyen faloidina, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs; del inglés, peptide nucleic acids) y el colorante dansilo.
El pHLIP puede anclar un grupo funcional, conjugado con la parte FSout del polipéptido, a una membrana celular en un pH bajo, situándolo en la superficie externa de una célula. La situación en la superficie externa puede ser útil, por ejemplo, para estimular actividades de receptor, para formar una imagen de la situación de la célula marcada, o para suministrar moléculas tóxicas tales como la toxina diftérica para matar selectivamente células en regiones de bajo pH.
El pHLIP representa una nueva tecnología para un suministro rápido, selectivo y eficaz de grupos funcionales a células in vitro e in vivo.
Éstas y otras características del presente invento se describirán ahora con mayor detalle, con referencia a los dibujos adjuntos.
La FIGURA 1 es un diagrama esquemático del suministro de un grupo funcional a una célula mediante pHLIP (a) o del anclaje de un grupo funcional a la superficie de una célula diana mediante pHLIP (b).
Las FIGURAS 2a y 2b son gráficos de tiempo frente a intensidad de fluorescencia, en que en (a) se añadió ditionito sódico a pHLIP con NBD sobre FSout, insertados en vesículas unilaminares grandes (LUVs; del inglés, large unilamellar vesicles) de POPC, y en (b) se añadieron LUVs de POPC que contenían dentro ion ditionito al NBD-péptido en un pH de 8,0, disminuyendo luego la inserción del péptido en liposomas desencadenada por el pH, lo que ilustra el proceso de marcación de células en un pH bajo.
La FIGURA 3a muestra la estructura química covalente del colorante dansilo y la FIGURA 3b muestra imágenes de fluorescencia de células HeLa incubadas (durante 15 minutos) con una construcción escindible de pHLIP-S-Sdansilo (7 μM) en pHs de 5,5, 6,5, 7,0 y 7,4, y lavadas con tampón de PBS en un pH de 7,4, en que el enlace S-S es con FSin, y el colorante es liberado en las células de un modo dependiente del pH.
La FIGURA 4a muestra la estructura química covalente de la faloidina y la FIGURA 4b muestra imágenes de fluorescencia de células HeLa incubadas (durante 15 minutos) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (4 μM) en un pH de 7,4 (izquierda) y 6,5 (derecha), en que la faloidina está unida a FSin y es liberada en el citoplasma tras la inserción y la subsiguiente reducción del enlace disulfuro.
Las FIGURAS 5a-5d son gráficos de fluorescencia frente a cuentas de células no tratadas y células tratadas en suspensión (durante 1 hora) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (6 μM) en diferentes pHs y temperaturas, mostrando la marcación de células de un modo dependiente del pH que no es inhibida por una baja temperatura (4 °C).
La FIGURA 6a muestra imágenes confocales de fluorescencia y campo claro de células de adenocarcinoma de mama JC incubadas (durante 1 hora) con una construcción no escindible de pHLIP-faloidina-TRITC que tenía la faloidina-TRITC sobre FSin, en concentración 1 μM, en un pH de 6,5 (derecha), y la FIGURA 6b es de imágenes de fluorescencia de células de adenocarcinoma de mama JC incubadas con la misma construcción no escindible de pHLIP-faloidina-TRITC en un pH de 6,5 y con diferentes aumentos (40x y 100x).
Las FIGURAS 7a-7c son imágenes de células Hela, células de cáncer de mama JC y células de cáncer de próstata TRAMP-C1 con filamentos de actina fluorescentes, que demuestran el transporte de faloidina-TRITC y su liberación en el citoplasma.
La FIGURA 8a es un gráfico de barras sobre la concentración de péptido frente a la viabilidad celular y la FIGURA 8b son gráficos de barras sobre la concentración de péptido para tratamiento de células frente a la fluorescencia de agentes que no atraviesan la membrana: SYTOX-Orange para tinción nuclear (0,5 μM) (columnas claras) y faloidina-TRITC (2 μM) (columnas oscuras), incubados en dos pHs diferentes con células tratadas con péptido; las células no tratadas se consideran el 100%, lo que muestra que el péptido presenta una citotoxicidad mínima.
La FIGURA 9 muestra imágenes fluorescentes de cuerpo completo de hembras de ratón desnudo atímico que portan tumores con un tamaño de 3 mm, 4 horas (a) y 24 horas (b) después de la inyección de 100 μl de Cy5.5 solo y Cy5.5 unido covalentemente al resto de Cys del extremo N del pHLIP, en concentración 50 μM, lo que muestra que el péptido se localiza en el tumor.
La FIGURA 10 muestra imágenes fluorescentes de cuerpo completo de hembras de ratón desnudo atímico que portan tumores de 3 mm, 24 horas después de la inyección de 100 μl de Cy5.5-pHLIP en concentración 50 μM (1 mg/kg).
La FIGURA 11a muestra imágenes, por contraste de fase, de células HeLa incubadas (durante 1 hora) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (1 μM) antes y después del tratamiento con una disolución de disociación en diferentes pHs, y la FIGURA 11b muestra imágenes de fluorescencia de núcleos teñidos con DAPI 0,5 μM y las correspondientes imágenes, por contraste de fase, de las células HeLa multinucleadas 48 horas después de una incubación (1 hora) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (1 μM).
La FIGURA 12 muestra imágenes, de fluorescencia y contraste de fase, de las mismas células HeLa incubadas (durante 1 hora) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (2 μM), tomadas antes (izquierda) y 5 minutos después de la adicción de una disolución de disociación (derecha).
La FIGURA 13 muestra imágenes, de fluorescencia y contraste de fase, de células HeLa tratadas con una construcción escindible de pHLIP-S-S-PNA-TAMRA en una concentración 1 μM, con el S-S sobre FSin, en unos pHs de 7,4 y 6,5, que muestran el suministro del PNA a las células.
La FIGURA 14 muestra imágenes, de fluorescencia y contraste de fase (aumento de 100x), de células HeLa tratadas con la construcción escindible de pHLIP-S-S-PNA-TAMRA (1 μM) en unos pHs de 7,4 y 6,5.
Se ha comunicado previamente que un polipéptido procedente de la hélice C de la bacteriorrodopsina, consistente en la secuencia transmembranal y dos secuencias flanqueadoras, es soluble en disolución acuosa y se inserta espontáneamente a través de bicapas lipídicas para formar una hélice alfa estable en un pH bajo (Engelman y Hunt, 1998, Patente de EE.UU. nº 5.739.273; Hunt et al., 1997, Biochemistry 36, 15.177). La inserción es conducida por la protonación de restos de Asp situados en la parte transmembranal del polipéptido.
El presente invento presenta ese polipéptido, pHLIP, de secuencia: AAEQNPIYWARYADWLFT TPLLLLDLALLVDA-DEGTCG (SEC 1), con una secuencia predominantemente hidrófoba lo suficientemente larga para abarcar una bicapa lipídica de membrana en forma de hélice transmembranal y que comprende uno o más grupos disociables que proporcionan y translocan selectivamente in vitro e in vivo compuestos a células con ambiente extracelular bajo, como se muestra en la FIGURA 1. La Figura 1 es un diagrama esquemático del suministro de un grupo funcional a una célula (a) o del anclaje de un grupo funcional a la célula diana (b). En un pH fisiológico, el producto de conjugación de péptido-grupo funcional interacciona débilmente con una membrana. En un pH bajo, el péptido forma una hélice transmembranal con un extremo insertado en el citoplasma. La escisión del enlace entre el péptido y el grupo funcional libera éste dentro de la célula.
Para identificar la topología de la inserción del pHLIP, se utilizó un ensayo establecido que se basa en la aplicación del ion ditionito (S2O4-2), que no atraviesa membranas, que puede modificar químicamente el fluoróforo NBD y sofocar su fluorescencia (Chattopadhyay, 1990, Chem. Phys. Lipids 53, 1).
Se insertó pHLIP marcado, en liposomas de POPC. La topología del pHLIP en una bicapa lipídica fue determinada utilizando la reacción de sofocación de NBD-ditionito. Se determinó a 530 nm la señal de fluorescencia del NBD unido al extremo N del péptido, usando una excitación a 470 nm. La posición máxima del espectro de fluorescencia de NBD del péptido marcado e insertado en liposomas fue 530 nm, lo que indica que el fluoróforo NBD está rodeado por un ambiente polar (con una constante dieléctrica de ~ 70, por comparación, la posición máxima del espectro de NBD-PE, donde el NBD está situado a nivel del grupo fosfato, es 522 nm). La adición del ion ditionito condujo a la sofocación completa de la fluorescencia del NBD (Figura 2a). Una segunda población de liposomas con ditionito encerrado dentro de ellas fue mezclada en un pH neutro con el péptido marcado, y luego se redujo el pH para desencadenar la inserción del péptido. No se detectó cambio alguno en la señal de fluorescencia (Figura 2b), lo que mostraba que el ditionito encerrado en los liposomas no reaccionaba con el NBD, y mostraba que el extremo N del péptido está situado fuera del liposoma y que el péptido no provoca la fuga de ditionito por la membrana. En la Figura 2a, se añadió ditionito sódico al NBD-péptido insertado en LUVs de POPC. En la Figura 2b, se añadieron LUVs de POPC que contenían dentro ion ditionito al NBD-péptido en un pH de 8,0; la disminución posterior del pH desencadenó la inserción del péptido en los liposomas. Se usó Triton para la rotura de los liposomas. La concentración del péptido utilizado en los experimentos fue 7 μM. Se observó sofocación del NBD después de la rotura de la membrana mediante Triton. Estos datos demuestran que, en un pH bajo, el extremo N está situado fuera y, en consecuencia, el extremo C está situado dentro de los liposomas de POPC.
Se examinó pHLIP conjugado con colorante dansilo por medio de un enlace disulfuro (Figura 3a), en cuanto al suministro del colorante a células HeLa vivas en diferentes pHs (Figura 3b). Las células fueron incubadas, durante 15 minutos en un pH de 5,5, 6,5, 7,0 ó 7,4, con el péptido fluorescentemente marcado y fueron luego lavadas en un pH de 7,4 para eliminar todo péptido reversiblemente unido. La incorporación de dansilo fue significativamente mayor en un pH bajo. Las incorporaciones relativas fueron 18%, 48%, 78% y 100% en los pHs de 7,4, 7,0, 6,5 y 5,5, respectivamente. El dansilo solo no penetra en las células.
Translocación de una molécula y liberación de la misma dentro de una célula en un pH bajo
Para examinar la capacidad del pHLIP para translocar péptidos a través de la membrana celular, se escogió un péptido cíclico soluble en agua, la faloidina, procedente del hongo Amanita phalloides. La faloidina se une íntimamente a filamentos de actina en una concentración nanomolar e inhibe fuertemente su despolimerización (Weiland et al., 1977, Curr. Probl. Clin. Biochem. 7, 11; Wehland et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5613), pero no afecta normalmente a las células ya que es demasiado polar para atravesar una membrana. Se utiliza comúnmente faloidina fluorescente para marcar filamentos de actina en células permeabilizadas. Los filamentos de actina teñidos con faloidina fluorescente presentan un patrón filamentoso fácilmente reconocible que no puede ser confundido con la tinción de las otras estructuras, orgánulos o membranas celulares. Por lo tanto, el suministro de faloidina fluorescente a células vivas mediante pHLIP puede ser fácilmente verificado por microscopía de fluorescencia. Se conjugó faloidina fluorescentemente marcada (faloidina-TRITC), por medio de un enlace S-S, con el extremo C de pHLIP usando un agente entrecruzante bifuncional. Las células fueron incubadas con una construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC en diferentes pHs y fueron posteriormente lavadas con una disolución de medio para cultivo celular, pH de 7,4. Se esperaba que la penetración del extremo C en el ambiente reductor del citoplasma escindiera el enlace S-S y liberara faloidina-TRITC. En un pH bajo, se observó una tinción fluorescente brillante de filamentos de actina, mientras que, en un pH fisiológico, se observó cierta tinción fluorescente de membranas pero no del citoesqueleto (Figura 4). El tratamiento de las células con faloidina-TRITC o agente entrecruzante-faloidina-TRITC en presencia o ausencia de péptido no produjo tinción fluorescente de filamentos de actina en pHs de 6,07,4. La fluorescencia era muy débil después de una incubación en un pH de 7,4 y se localizaba en la membrana plasmática. Después de una incubación en un pH de 6,5, se observó una intensa fluorescencia de filamentos de actina.
Se usó la técnica FACS para cuantificar la translocación de la faloidina fluorescente, dependiente del pH, por el péptido a través de las membranas de células HeLa en suspensión. Como se muestra en la Figura 5, la translocación de la faloidina fluorescente depende del pH y no implica endocitosis. Se muestra la citofluorometría de células Hela tratadas (durante 1 hora) con la construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (6 μM) en un pH de 7,4 y T = 37 °C (b), pH de 6,5 y T = 37 °C (c) y pH de 6,5 y T = 4 °C (d). Se muestran las células no tratadas (a). Las células tratadas con pHLIP-S-S-faloidina-TRITC en un pH de 7,4 presentaban un nivel muy bajo de fluorescencia. Sin embargo, en un pH bajo se observó una población de células muy fluorescentes. La eficacia del suministro a 4 °C fue la misma que a 37 °C, lo que muestra que no está implicada la endocitosis en el mecanismo de incorporación.
Las células tratadas con pHLIP-S-S-faloidina-TRITC presentaban un nivel muy bajo de fluorescencia a causa de una fijación muy limitada a la membrana en un pH de 7,4. Sin embargo, en un pH bajo se observó una población de células muy fluorescentes (Figura 5c). La eficacia del suministro de faloidina-TRITC a células por pHLIP a baja temperatura fue la misma que a 37 °C (Figura 5d), lo que proporciona evidencia adicional de que el mecanismo de translocación no es la endocitosis. La aparición de poblaciones discretas de células fluorescentes podría reflejar una diferencia en el suministro de faloidina-TRITC, desde una variación de la capacidad reductora citoplásmica de las células en diferentes fases del ciclo celular (Conour, 2004, Physiol. Genomics 18, 196) hasta la eliminación con el péptido durante el lavado celular en un pH de 7,4, ya que la inserción del péptido es reversible. La liberación de faloidina-TRITC dentro de la célula depende de la concentración de glutatión, de la que se sabe que varía significativamente durante el ciclo celular, alcanzando un máximo en G2/M y un mínimo en G1 (Conour, 2004, Physiol. Genomics 18, 196). Puesto que el tiempo de incubación (1 hora) es mucho menor que el tiempo del ciclo de las células HeLa (18 horas), las células que pudieran estar en G2/M podrían incorporar más faloidina que las demás. Se han evitado incubaciones prolongadas de células con péptido-faloidina para minimizar la exposición de las células a un pH bajo, especialmente a temperatura baja.
Mecanismo de la translocación de moléculas a través de la membrana mediante pHLIP
Para demostrar que el propio péptido no entra en la célula, se explotó el hecho (previamente comunicado por Hunt et al., 1997, Biochemistry 36, 15.177) de que un aumento del pH conduce a la inversión de la inserción y a la liberación del péptido desde las bicapas lipídicas. Se conjugó faloidina-TRITC con el extremo C del péptido por medio de un enlace covalente no escindible, se incubó con células en un pH de 6,5 y se lavó con tampón de PBS con el mismo pH (Figura 6a, izquierda, incubación durante 1 hora con la construcción no escindible de pHLIP-faloidina-TRITC, 1 μM, en un pH de 6,5, derecha). La Figura 6b es de imágenes de fluorescencia de células de adenocarcinoma de mama JC incubadas en un pH de 6,5 con la construcción no escindible de pHLIP-faloidina-TRITC, con diferentes aumentos (40x y 100x), que demuestran la falta de tinción de los filamentos de actina; sin embargo, hubo tinción de la membrana plasmática. Las células fueron luego lavadas con el tampón en un pH de 7,4, lo que dio lugar a la separación del péptido junto con faloidina-TRITC, y sólo se observaron cantidades mínimas de fluorescencia (Figura 6a). Se repitieron estos procedimientos con el péptido conjugado con rojo Texas y rodamina (datos no mostrados), con resultados similares. Los experimentos demuestran de nuevo que el mecanismo de translocación no implica la vía endocítica ya que el pHLIP permanece fijado a la membrana celular en un pH bajo y puede ser separado por lavado en un pH neutro.
También se examinó el suministro de faloidina unida a pHLIP mediante un enlace S-S, a diferentes líneas celulares: células Hela humanas, células de cáncer de próstata TRAMP-C1 de ratón y células de cáncer de mama JC de ratón. En cada caso, en que se incubaron las células durante 1 hora con la construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (0,5 - 1 μM) en un pH de 6,5 y luego se realizó un lavado con PBS en un pH de 7,4, se observó la tinción característica de los filamentos de actina en un pH < 7,0 (Figura 7). Esto demostró que la translocación de moléculas mediante pHLIP no depende de la presencia de receptores en tipos particulares de células.
Prueba de citotoxicidad y de fugas en la membrana
Se investigó la citotoxicidad del péptido y su capacidad para provocar fugas en la membrana. En las Figuras 8a y 8b se muestran las pruebas de toxicidad celular y de fugas en la membrana. La incubación de células HeLa con el péptido en concentraciones de hasta 16 μM durante 24 horas bajo condiciones fisiológicas no afecta a la viabilidad celular (Figura 8a). Se examinaron las fugas en la membrana mediante la incubación de células HeLa con el péptido en diferentes concentraciones (hasta 10 μM) en pHs de 7,4 y 6,5 durante 1 hora, seguida de la adición de agentes que no penetran en las células: faloidina-TRITC y SYTOX-Orange para tinción nuclear. No se observó incremento alguno en la incorporación de faloidina-TRITC ni SYTOX-Orange a las células tratadas con el péptido en pHs de 6,5 y 7,4 (Figura 8b). La incorporación de faloidina-TRITC o SYTOX-Orange fue 10 veces menor que la incorporación a células tratadas con Triton, que se usa para la permeabilización de membranas celulares. De este modo, como en el caso de los liposomas, el péptido no provocó la formación de poros.
Se llevó a cabo un estudio preliminar sobre toxicidad. Se administraron 100 μl de péptido en concentración 150 μM, en forma de una sola inyección en la vena caudal, a 4 hembras de ratón C3D2F1 y 4 machos de ratón C57/B1. La concentración final fue 4 mg/kg. Un veterinario observó a los ratones el día después de la inyección y durante las 6 semanas siguientes. En ningún ratón se observaron cambios fisiológicos ni de comportamiento.
La acumulación del pHLIP en un tumor in vivo
Para estudiar la distribución de pHLIP in vivo, se inyectó colorante fluorescente Cy5.5 del infrarrojo cercano, covalentemente unido al pHLIP, a ratones que portaban un tumor y se llevó a cabo la obtención de imágenes de fluorescencia de cuerpo completo. Se originó el tumor MDA-MB-231 humano mediante la inyección de células tumorales (2x107 células/ijada/0,2 ml) en la ijada derecha de hembras adultas de ratón atímico desnudo. Cuando el tumor alcanzó un tamaño de 3 mm de diámetro, se administraron 100 μl de Cy5.5 solo o Cy5.5 covalentemente unido al pHLIP, en una concentración 50 μM, en forma de una sola inyección en la vena caudal. Se llevó a cabo la obtención de imágenes inmediatamente, después de 1, 2 y 4 horas, y al día siguiente después de 24 horas (Figuras 9 y 10). El colorante y el péptido-colorante se acumularon en el hígado y el riñón, los órganos que normalmente absorben rápidamente cualquier compuesto. Las relaciones de (hígado + riñón)/tumor fueron 5,9 y 3,6 en los ratones a los que se inyectó colorante solo y pHLIP-colorante: acumulación para ratones. Las imágenes muestran claramente que el péptido-colorante se acumulaba en el tumor en una concentración que es suficiente para que se lleve a cabo la obtención de imágenes (Figura 10). La acumulación de pHLIP-Cy5.5 en el tumor era 1,6 veces mayor que la acumulación de colorante solo. Las relaciones de (hígado + riñón)/tumor fueron 1,6 y 2,6 para pHLIP-Cy5.5 y Cy5.5 solo, respectivamente. Esto sugiere que el contraste del tumor era mucho mejor con el péptido.
MÉTODOS
Se preparó pHLIP mediante síntesis peptídica en fase sólida usando la química estándar de Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonilo) y se purificó mediante cromatografía en fase inversa (en una columna C18) en el W.M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory de la Universidad de Yale. En una preparación típica de la forma soluble del péptido, se disolvió el polvo liofilizado en una disolución que contenía urea 6 M y se transfirió la disolución al tampón de trabajo usando una columna G-10 para exclusión por tamaños mediante centrifugación. La concentración del péptido fue determinada por absorbancia (£280 = 13.940 M-1cm-1) y fue confirmada mediante un análisis cuantitativo de aminoácidos. El péptido fue marcado por su único resto de cisteína C-terminal con dansilo, rojo Texas o Rodamina mediante incubación con didansilo (Sigma), rojo Texas-maleimida (Molecular Probes) o tetrametilrodamina-maleimida (Molecular Probes) en Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, urea 6 M, pH de 8,0, en la oscuridad a 4 °C durante 24 horas. Los péptidos conjugados fueron purificados en una columna G-10 para exclusión por tamaños y fueron transferidos a tampón de PBS, pH de 7,4. La concentración del péptido marcado fue determinada por absorbancia (dansilo: £340 = 4.300 M-1cm-1; rojo Texas: £582 = 112.000 M-1cm-1; rodamina: £542 = 65.000 M-1cm-1).
Se conjugó pHLIP con faloidina-rodamina (faloidina-TRITC; Sigma) usando agentes fotoentrecruzantes bifuncionales: S-[2-(4-azidosalicilamido)etiltio]-2-tiopiridina (AET; Molecular Probes) o benzofenona-4-yodoacetamida (Molecular Probes). El primer agente entrecruzante (AET) forma un enlace S-S con el extremo C del péptido y se une a faloidina-TRITC bajo irradiación UV (pHLIP-S-S-faloidina-TRITC). El segundo agente entrecruzante se usó para la síntesis de la construcción no escindible (pHLIP-faloidina-TRITC). Se incubó pHLIP con el agente entrecruzante en PBS a 4 °C, en la oscuridad, durante 24 horas. Se eliminó el agente entrecruzante en exceso usando una columna G-10 para exclusión por tamaños mediante centrifugación. Se añadió faloidina-TRITC en un exceso 5x molar al pHLIP-agente entrecruzante y se irradió a 340 nm durante 30 minutos. La faloidina-TRITC sin reaccionar se eliminó usando una columna G-10 para exclusión por tamaños. La concentración de rodamina fue determinada por absorción a 542 nm (£542 = 65.000 M-1cm-1). Separadamente, se conjugó faloidina-TRITC con AET sin péptido. La conjugación de faloidina-TRITC con agente entrecruzante o pHLIP no afectó a su capacidad para unirse a actina F (datos no mostrados).
El ácido nucleico peptídico TAMRA-o-o-CATAGTATAAGT-o-Cys-NH2 con Cys y colorante fluorescente, TAMRA, fue sintetizado por Applied Biosystems, Massachusetts, EE.UU. Este PNA se dirige al mRNA de MDM2 (Shiraishi y Nielsen, 2004, Nucleic Acids Res. 32, 4893). Se incubó el PNA-TAMRA con pHLIP en un exceso molar del cuádruple durante 24 horas en PBS, pH de 7,4, a 4 °C. La construcción de pHLIP-S-S-PNA-TAMRA fue purificada en una columna G-10. La concentración se determinó midiendo la absorción a 546 nm (£542 = 65.000 M-1cm-1).
Preparación de liposomas
Se prepararon vesículas unilaminares grandes (LUVs) por sonicación. Se disolvió el fosfolípido POPC (1-palmitoil-2oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina; Avanti Polar Lipids, Inc.) en cloroformo. Después de la eliminación del disolvente usando un rotavapor, la película de fosfolípido fue secada durante la noche y fue luego rehidratada en Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, pH de 8,0, y agitada con formación de remolinos. La suspensión fue sometida a sonicación usando un ultrasonicador Branson de punta de titanio hasta que la disolución se volvió transparente. La distribución de los liposomas se evaluó por dispersión lumínica dinámica. El radio de las vesículas era 72,6 ± 4,6 nm (la polidispersidad fue 13,6 ± 6,7%). Para preparar liposomas con ditionito dentro de ellas, la película de fosfolípido fue rehidratada en tampón de Tris 1 M, pH de 8,0, que contenía ditionito 1 M. El ditionito no atrapado fue eliminado de la disolución de liposomas usando un casete de diálisis con poros con un corte de 10 kDa. La diálisis se llevó a cabo frente a Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, pH de 8,0, durante 4 horas con cambios horarios de disolución.
Detección de la topología peptídica
La adición externa de ditionito (Na2S2O4) a las LUVs sofoca químicamente la fluorescencia del NBD en las hojas externas de las bicapas. El péptido fue marcado por el extremo N con NBD mediante incubación con NBD-Cl (Molecular Probes) en Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, pH de 7,0, en oscuridad a 4 °C durante 24 horas (la relación de péptido:NBD fue 1:20). El péptido conjugado fue purificado en una columna G-10 para exclusión por tamaños. La concentración del péptido marcado fue determinada por absorbancia (£480 = 25.000 M-1cm-1, £336 = 9.800 M-1cm-1). El péptido marcado fue incubado con liposomas en un pH neutro y se desencadenó la inserción mediante la reducción del pH a 4.0. Los espectros de fluorescencia del péptido marcado con NBD en disolución e insertado en la bicapa lipídica fueron registrados en un espectrofluorómetro SLM8000. Se controlaron los cambios en la señal de fluorescencia del NBD a 530 nm (excitación a 470 nm) después de la adición del ditionito y después de la ruptura de los liposomas mediante Triton. En otros experimentos, se añadieron liposomas que contenían ditionito al péptido marcado en disolución en un pH de 8,0, se redujo luego el pH a 4,0, se añadió Triton para romper los liposomas y se añadió más ditionito para la sofocación completa de la fluorescencia del NBD.
En el estudio se utilizaron líneas celulares tanto de cáncer humano como de cáncer de ratón. Las células HeLa fueron proporcionadas por el Cancer Center de la Yale University Medical School. Las células de cáncer de próstata TRAMP-C1 (CRL-2730) y las de adenocarcinoma de mama (CRL-2116) procedían del American Type Culture Collection (ATCC). Las células fueron cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; del inglés, Dulbecco's modified Eagle medium) complementado con suero bovino fetal (FBS; del inglés, fetal bovine serum) al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% y aire al 95%, a 37 °C.
Ensayo de citotoxicidad
Se examinó la citotoxicidad utilizando un ensayo colorimétrico estándar de acuerdo con un protocolo establecido que proporciona Promega, Inc. Se cargaron células HeLa en los pocillos de placas de 96 pocillos (20.000 células por pocillo) y se incubaron durante 24 horas en DMEM complementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% y aire al 95%, a 37 °C. El medio de crecimiento fue luego sustituido por el mismo medio pero que contenía 1% de FBS y cantidades crecientes de pHLIP (0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 μM). Después de 24 horas de incubación, se sustituyó la disolución por DMEM y se añadió un reactivo colorimétrico (Ensayo CellTiter 96 AQueous One Solution) durante 1 hora, lo que fue seguido de la medición de la absorbancia a 490 nm en el dispositivo lector de placas. Todas las muestras se prepararon por triplicado.
Ensayo de fugas en la membrana
Se cargaron células HeLa en placas de 96 pocillos (2.000 células por pocillo) y se incubaron durante 24 horas en DMEM complementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% y aire al 95%, a 37 °C. El medio de crecimiento fue luego sustituido por tampón de PBS que contenía CaCl2 1 mM y MgCl2 1 mM, en un pH de 7,4 o 6,5, y cantidades crecientes del péptido (0,5, 2, 5 y 10 μM). Después de 1 hora, se añadieron faloidina-TRITC en concentración 2 μM y SITOX-Orange (Molecular Probes) en concentración 0,5 μM durante 10 minutos y luego se realizó un lavado con tampón de PBS, pH de 7,4. La fluorescencia de la rodamina fue medida a 580 nm con una excitación a 544 nm, mediante un dispositivo lector de placas. Posteriormente se rompió la membrana celular por adición de Triton-100 al 0,5% y una nueva porción de faloidina-TRITC en concentración 2 μM y SITOX-Orange en concentración 0,5 μM, lo que fue seguido de un lavado con PBS. La señal de fluorescencia fue detectada antes y después del lavado, respectivamente. Todas las muestras se realizaron por triplicado.
Microscopía de fluorescencia
Para los estudios por microscopía de fluorescencia, se cultivaron las células en placas de 35 mm con ventanas de fondo de vidrio de 10 mm revestidas con colágeno. Las células fueron lavadas con tampón de PBS que contenía CaCl2 1 mM y MgCl2 1 mM, con un pH de 5,5, 6,5, 7,0 ó 7,4, y fueron luego incubadas en PBS con el pH experimental en ausencia o presencia de las construcciones de pHLIP-S-S-dansilo, pHLIP-colorante (rojo Texas o rodamina), pHLIP-S-S-faloidina-TRITC, pHLIP-faloidina-TRITC y pHLIP-S-S-PNA-TAMRA en diversas concentraciones (0,1 - 7 μM). Se midió el pH del medio antes y después de la incubación. El tiempo de incubación fue variado de 15 a 60 minutos. Las células cancerosas pueden acidificar el medio (tampón de PBS) en unos pocos minutos si el volumen de incubación es pequeño, lo que crea el problema de mantener constante el pH en 7,4 en el tampón de incubación de PBS. Se prefirió utilizar una baja densidad de células en la cámara, un mayor volumen y una mayor concentración de fosfato (hasta 50 mM en lugar del PBS estándar a 10 mM) y se comprobó rutinariamente el pH antes y después de los experimentos. La incubación fue seguida de la sustitución del tampón de PBS por medio L-15 de Leibovitz exento de fenol (complementado con FBS al 5%, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM) en el pH experimental durante una hora y luego (si no se indica otra cosa) en un pH de 7,4. Para controlar las células multinucleadas, se utilizó el colorante DAPI (Sigma-Aldrich) para tinción nuclear. Se trataron células HeLa con pHLIP-S-S-faloidina-TRITC en PBS con un pH de 6,5 durante 1 hora, lo que fue seguido del cambio de la disolución por DMEM complementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% y aire al 95%, a 37 °C. Después de 48 horas, se añadió DAPI en concentración 0,5 μM, lo que fue seguido de lavado. Se tomaron imágenes fluorescentes usando un microscopio invertido Olympus IX71 de epifluorescencia. Algunas imágenes de las células teñidas con la construcción no escindible de pHLIP-faloidina-TRITC fueron tomadas en un microscopio óptico Zeiss Axioplan 2 con un módulo Zeiss LSM 5 PASCAL para exploración por láser, con excitación de un láser de He/Ne a 543 nm. Las imágenes de la células teñidas con dansilo fueron tomadas en un microscopio confocal BioRad MRC-1024 de dos fotones, con excitación a 740 nm. Cada vez que se llevaron a cabo experimentos de microscopía de fluorescencia y se observó la translocación del cargamento por el pHLIP, se verificó que las células marcadas estaban vivas mediante el uso del marcador SYTOX-Green de células muertas (Molecular Probes).
Citometría de flujo
Se llevaron a cabo mediciones analíticas por citometría de flujo usando un instrumento de separación celular activada por fluorescencia (FACS; del inglés, fluorescence activated cell sorting). Se analizaron diez mil células en cada muestra. Las células se suspendieron en PBS con un pH de 6,5 ó 7,4 en presencia y ausencia de pHLIP-S-Sfaloidina-TRITC (6 μM) a 4 °C o 37 °C durante 1 hora. Luego se lavaron dos veces con tampón de PBS con pH de 7,4, se resuspendieron en PBS con pH de 7,4 y se analizaron en el instrumento de FACS.
Obtención de imágenes de fluorescencia de cuerpo completo
Se cultivaron células de adenocarcinoma de mama humano MDA-MB-231 (HTB-26, ATCC) en medio L-15 de Leibovitz complementado con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM, en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% y aire al 95% a 37 °C. Se originó el tumor humano MDA-MB-231 mediante la inyección de células tumorales (2x107 células/ijada/0,2 ml) en la ijada derecha de hembras adultas de ratón desnudo atímico. La inyección se llevó a cabo mientras el animal estaba bajo anestesia, usando una mezcla de ketamina (90 mg/kg) y xilazina (9 mg/kg). Se anestesiaron los ratones desnudos y se les inyectó intravenosamente el péptido marcado con el colorante Cy5.5 (1 mg/kg). Como testigo, a un ratón sólo se le inyectó el colorante Cy5.5. Las imágenes de los ratones en diversas posiciones se tomaron a los 10 minutos, 30 minutos y 1, 2, 4 y 24 horas después de la inyección mediante un sistema IVIS de Xenogen (Alameda, California, EE.UU.) para obtención de imágenes.
Estudio de toxicidad
Se inyectó intravenosamente el L-péptido (L-aminoácidos) o el D-péptido (D-aminoácidos), en la concentración máxima (4 mg/kg), a hembras y machos de ratón de 4 semanas de edad y un veterinario los observó durante 6 semanas. En ningún ratón se observaron cambios fisiológicos ni de comportamiento.
EJEMPLO 1
Translocación selectiva de faloidina a través de la membrana celular por pHLIP
Los microtúbulos y los filamentos de actina son polímeros de proteínas del citoesqueleto, críticos para el crecimiento y la división celulares, la motilidad, la señalización y el desarrollo y mantenimiento de la forma celular. La característica más importante del citoesqueleto es su capacidad para reorganizarse rápida y localmente en respuesta a estímulos. Esto se lleva a cabo mediante la dinámica de no equilibrio de la reacción de polimerización de monómeros de actina en filamentos de actina y de dímeros de tubulina a� en microtúbulos. La remodelación de actina microfilamentosa se asocia con la proliferación, motilidad e invasión celulares (Egelman, 1997, Structure 5, 1135; Kodama et al., 2004, J. Cell Biol. 167, 203; Rao y Li, 2004, Curr. Cancer Drug Targets 4, 345) y es un punto determinante crítico de la metástasis cancerosa (Banyard y Zetter, 1998, Cancer Metastasis Rev. 17, 449). Por lo tanto, las moléculas que actúan sobre el citoesqueleto de actina de las células tumorales e inhiben así la división y el movimiento celulares tienen un alto valor terapéutico.
En los últimos años se ha identificado un número creciente de productos naturales que se dirigen al citoesqueleto de actina y alteran su organización. La mayoría de ellos se aislaron de organismos invertebrados marinos, principalmente esponjas. Todos estos fármacos derivados de esponjas marinas son macrólidos poco habituales y pueden ser clasificados en varias familias principales, cada una con sus propias y diferentes estructuras químicas, propiedades bioquímicas y efectos celulares. Entre estos compuestos están las latrunculinas (remedan la actividad de proteínas secuestradoras de monómeros, las timosinas �), swinhólido A y misakinólido A (se unen a monómeros de actina y evitan la formación de filamentos de actina), micalólido B y aplironinas (ambos inhiben la polimerización de la actina) y jasplakinólidos (jaspamidas; estabilizan los filamentos de actina). La faloidina es un péptido bicíclico soluble en agua (Figura 4a) aislado del hongo mortal Amanita phalloides, uno de la clase de las falotoxinas. Ejerce sobre los filamentos de actina la misma acción que los jasplakinólidos: se une fuertemente a los filamentos de actina en concentración nanomolar (Weiland et al., 1977, Curr. Probl. Clin. Biochem. 7, 11; Wehland et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5613) y los estabiliza frente a la despolimerización, reduciendo hasta 30 veces la concentración crítica para la polimerización. Por contraste con el jasplakinólido, que entra fácilmente en las células de mamífero, la faloidina no ha sido desarrollada para uso terapéutico porque no puede penetrar en la membrana celular. El jasplakinólido y otros fármacos antiactina penetran a través de la membrana de todas las células, tanto normales como cancerosas, lo que reduce significativamente su efecto terapéutico.
Se presenta una nueva tecnología de translocación de faloidina, selectiva en cuanto al pH, a través de la membrana celular (Figuras 4, 5 y 7). Se espera que los efectos biológicos de la translocación de faloidina a células vivas sean una inhibición de la contractilidad y la división celulares junto con la formación de células multinucleadas, ya que los núcleos podrían dividirse pero las células tratadas no. En realidad, la translocación de faloidina a células conduce a la inhibición de la dinámica del citoesqueleto y a la consiguiente pérdida de la capacidad de células unidas para contraerse y redondearse en respuesta al tratamiento con una disolución de disociación de EDTA/tripsina (Figura 11a y Figura 12).
En la Figura 11a se ilustran imágenes, por contraste de fase, de células HeLa incubadas (durante 1 hora) con la construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (1 μM) en unos pHs de 6,5 y 7,4, lo que va seguido de lavado con PBS, pH de 7,4, antes (izquierda) y 5 minutos después de la adición de la disolución de disociación (derecha). Las células tratadas con el péptido-faloidina en un pH bajo permanecieron inalteradas, lo que es consistente con la estabilización del citoesqueleto por la faloidina-rodamina suministrada por el pHLIP. La Figura 11b es de imágenes de fluorescencia de núcleos teñidos con DAPI 0,5 μM y se presentan las correspondientes imágenes, por contraste de fase, de las células HeLa multinucleadas. Se observó multinucleación a las 48 horas después del tratamiento de las células con pHLIP-S-S-faloidina-TRITC en concentración 1 μM en un pH de 6,5 durante 1 hora.
La Figura 12 es de imágenes, de fluorescencia y contraste de fase, de las mismas células HeLa tratadas con la construcción escindible de pHLIP-S-S-faloidina-TRITC en concentración 2 μM en un pH de 6,5 durante 1 hora, tomadas antes (izquierda) y 5 minutos después de la adición de la disolución de disociación (derecha). Las células débilmente teñidas se volvieron redondas (flechas) y las células intensamente teñidas permanecieron inalteradas, lo que muestra la estabilización del citoesqueleto por la faloidina-rodamina suministrada por el pHLIP.
Sin embargo, las células no tratadas o las células tratadas con la construcción en un pH normal fueron capaces de redondearse y disociarse de la superficie. Además, se observó la formación de células multinucleadas después de 48 horas de tratamiento con pHLIP-S-S-faloidina-TRITC (Figura 11a). También se ha comunicado la aparición de células multinucleadas (Figura 11b) después del tratamiento de las células con jasplakinólido.
EJEMPLO 2
Translocación selectiva de PNA a través de la membrana celular por pHLIP
Las moléculas sintéticas que se pueden unir con elevada especificidad secuencial a una escogida diana de una secuencia génica son de mayor interés en los contextos médico y biotecnológico. Resultan esperanzadoras para el desarrollo de agentes terapéuticos génicos y dispositivos diagnósticos para análisis genético, y como herramientas moleculares para la manipulación de ácidos nucleicos. El ácido nucleico peptídico (PNA) es un compuesto análogo al ácido nucleico en que la cadena principal de azúcar-fosfato del ácido nucleico natural ha sido sustituida por una cadena principal peptídica sintética normalmente formada a partir de unidades de N-(2-aminoetil)-glicocola, lo que da lugar a una copia aquiral y sin carga (Nielsen et al., 1991, Science 254, 1497). Es químicamente estable y resistente a la escisión hidrolítica (enzimática), y, por lo tanto, no se espera que se degrade dentro de una célula viva. El PNA es capaz del reconocimiento secuencialmente específico de DNA y RNA que obedece el esquema de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, y los complejos híbridos presentan una extraordinaria estabilidad térmica y unos efectos de fuerza iónica únicos. También puede reconocer secuencias homopurínicas dúplex de DNA, a las que se une por invasión de cadenas formando una secuencia triple estable de PNA-DNA-PNA con una cadena de DNA en forma de bucle (Ray y Norden, 2000, FASEB J. 14, 1041). Desde su descubrimiento, el PNA ha atraído una gran atención en la interfase de la química y la biología a causa de sus interesantes propiedades químicas, físicas y biológicas y de su potencial para actuar como un componente activo para aplicaciones diagnósticas y también farmacéuticas. Estudios in vitro indican que el PNA podría inhibir tanto la transcripción como la traducción de genes hacia los cuales ha sido dirigido, lo que sigue siendo esperanzador para su uso en terapia antigenes y antisentido. El suministro de oligonucleótidos y oligodesoxinucleótidos (ODN) sintéticos a células es un importante problema en el desarrollo completo de una tecnología antisentido para el control de la expresión génica en cultivo celular e in vivo. Incluso el suministro, que implica el paso a través de la membrana celular, de PNA, que es mucho menos polar que el DNA y el RNA, es un problema importante.
En las Figuras 13 y 14 se muestra una nueva tecnología de translocación de PNA, selectiva en cuanto al pH, a través de la membrana celular. En la Figura 13 se muestra el suministro de PNA a células HeLa por pHLIP. Se muestran imágenes de fluorescencia de células incubadas (durante 30 minutos) con una construcción escindible de pHLIP-S-S-PNA-TAMRA (1 μM) en pHs de 7,4 y 6,5. No se observó translocación de pHLIP-S-S-PNA-TAMRA en un pH de 7,4 ni de PNA-TAMRA en pHs de 7,4 y 6,5 (datos no mostrados). Usando el marcador de células muertas, SYTOX, se confirmó la viabilidad de las células marcadas. Las imágenes de la Figura 14 ilustran el suministro de PNA a células HeLa por pHLIP. Se muestran imágenes de fluorescencia, con un aumento de 100x, de células incubadas con una construcción escindible de pHLIP-S-S-PNA-TAMRA en pHs de 7,4 y 6,5. No se observó translocación de pHLIP-S-S-PNA-TAMRA en un pH de 7,4. Sin embargo, el pHLIP translocó PNA a través de la membrana celular en un pH de 6,5.
La eficacia de la translocación de PNA fluorescentemente marcado, mediante pHLIP, fue elevada en un pH bajo (6,5) y prácticamente cero en un pH normal.
Hay muchas enfermedades que crean un pH extracelular bajo, y, por lo tanto, se espera que el péptido sea funcional. La hipoxia y la acidosis son marcadores fisiológicos de muchos procesos morbosos tales como un cáncer (Stubbs et al., 2000, Mol. Med. Today 6, 15; Helmlinger et al., 2002, Clin. Cancer Res. 8, 1284; Izumi et al. 2003, Cancer Treat. Reviews. 29, 541); un infarto (Graham et al., 2004, J. Exp. Biol. 207, 3189; Yao y Haddad, 2004, Cell Calcium. 36, 247; Yamamoto y Ehara, 2005, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., en prensa); un accidente cerebrovascular (Rehncrona, 1985, Ann. Emerg. Med. 14, 770; Siesjo et al., 1996, Adv. Neurol. 71, 209; Ying et al., 1999, J. Neurochem. 73, 1549); una lesión aterosclerótica (Leake, 1997, Atherosclerosis 129, 149); un trauma (Mikhail, 1999, AACN Clin. Issues 10, 85; Clausen et al., 2005, J. Neurosurg. 103, 597); una inflamación (Kalantar-Zadeh et al., 2004, Semin. Dial. 17, 455); y una infección (Holloway et al., 1995; Exp. Parasitol. 80, 624; Headley, 2003, Am. Fam. Physician. 68, 323).
Claims (19)
- REIVINDICACIONES1. Una composición que comprende:un polipéptido con una secuencia predominantemente hidrófoba lo suficientemente larga para abarcar una bicapa lipídica de membrana en forma de hélice transmembranal, y secuencias que flanquean dicha secuencia hidrófoba de modo que el péptido es soluble en disoluciones acuosas y se inserta espontáneamente a través de una membrana celular en un pH de 7,4 o menor, moviéndose una de las regiones de secuencia flanqueadora a través de la membrana celular y quedando otra región de secuencia flanqueadora expuesta al ambiente acuoso, fuera de la célula, en que dichas secuencias flanqueadoras comprenden una FSin en el extremo C de dicho polipéptido y una FSout en el extremo N de dicho polipéptido; y uno o más grupos funcionales unidos a dicho extremo C o dicho extremo N de dicho polipéptido,caracterizada por que el polipéptido comprende la secuencia Sec.1:AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTCG.
- 2. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 1, en que los aminoácidos de Sec 1 son L-aminoácidos, o unoo más de los aminoácidos especificados en Sec 1 son D-aminoácidos.
-
- 3.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es seleccionado de entre reactivos terapéuticos, diagnósticos, profilácticos, para obtención de imágenes, para regulación génica, para regulación de funciones celulares, apoptóticos y para investigación.
-
- 4.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es un ácido nucleico peptídico o un ácido nucleico.
-
- 5.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es seleccionado de entre: un fármaco, un virus, un polisacárido, un liposoma, y una partícula compuesta de cualquier material.
-
- 6.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es un antígeno, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un elemento citotóxico.
-
- 7.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es escogido de entre faloidina, faloína, falisina, profaloína, falacina, falacidina y falisacina.
-
- 8.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional es una enzima marcadora tal como una peroxidasa, una luciferasa o una fosfatasa alcalina.
-
- 9.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional o cada uno de dichos grupos funcionales está fijado por un enlace escindible o no escindible que comprende una secuencia seleccionada de entre un disulfuro, un péptido con motivo ligante de proteínas, una secuencia de consenso de proteína cinasa, una secuencia de consenso de proteína fosfatasa, una secuencia reactiva con proteasas, una secuencia reactiva con peptidasas, una secuencia reactiva con transferasas, una secuencia reactiva con hidrolasas, una secuencia reactiva con isomerasas, una secuencia reactiva con ligasas, una secuencia reactiva con metaloproteasas extracelulares, una secuencia reactiva con proteasas lisosómicas, una secuencia reactiva con beta-lactamasas, una secuencia reactiva con oxidorreductasas, una secuencia reactiva con esterasas, una secuencia reactiva con glicosidasas y una secuencia reactiva con nucleasas.
-
- 10.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2 para uso como un agente terapéutico, diagnóstico, profiláctico, para obtención de imágenes, para activación de una reacción inmune, para regulación génica o para regulación de funciones celulares, o como una herramienta para investigación.
-
- 11.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2 para uso como un agente para suministrar un grupo funcional, a través de membranas celulares, a células de un tejido enfermo con un ambiente extracelular ácido naturalmente producido o de un tejido con un ambiente extracelular ácido artificialmente provocado con respecto al pH fisiológico normal, en que el grupo funcional está unido al extremo C del polipéptido.
-
- 12.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2 para uso como un agente para suministrar un grupo funcional a superficies celulares de un tejido enfermo con un ambiente extracelular ácido naturalmente producido o de un tejido con un ambiente extracelular ácido artificialmente provocado con respecto al pH fisiológico normal, en que el grupo funcional está unido al extremo N del polipéptido.
-
- 13.
- Un método para suministrar in vitro un grupo funcional a través de una membrana celular en un pH extracelular ácido, caracterizado por el uso de una composición de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo C del polipéptido.
-
- 14.
- Un método para suministrar in vitro un grupo funcional a superficies celulares en un pH extracelular ácido, caracterizado por el uso de una composición de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo N del polipéptido.
-
- 15.
- La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo C del polipéptido,
5 para uso como un agente para suministrar un grupo funcional, a través de membranas celulares, a células de un tejido enfermo con un pH extracelular bajo, que es el resultado de un cáncer, un infarto, una lesión aterosclerótica, un trauma, una inflamación, un accidente cerebrovascular o una infección microbiana o fúngica. - 16. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que el grupo funcional está unido al extremo N del polipéptido, para uso como un agente para suministrar un grupo funcional a las superficies de células de un tejido enfermo con10 un pH extracelular bajo, que es el resultado de un cáncer, un infarto, una lesión aterosclerótica, un trauma, una inflamación, un accidente cerebrovascular o una infección microbiana o fúngica.
- 17. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que dicho polipéptido comprende además un resto de Cys en dicho extremo N.
- 18. La composición de la Reivindicación 1 ó 2, en que dicho polipéptido comprende un colorante fluorescente cova15 lentemente unido a un resto de Cys en dicho extremo N.
- 19. La composición de la Reivindicación 18, en que dicho colorante fluorescente comprende Cy5.5.FIGURA 3aFIGURA 3bFIGURA 4aFIGURA 4bFIGURA 5FIGURA 6FIGURA 7FIGURA 8FIGURA 9FIGURA 10FIGURA 11FIGURA 12FIGURA 13FIGURA 14
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64465405P | 2005-01-18 | 2005-01-18 | |
| US644654P | 2005-01-18 | ||
| US75223805P | 2005-12-20 | 2005-12-20 | |
| US752238P | 2005-12-20 | ||
| PCT/US2006/001895 WO2006078816A2 (en) | 2005-01-18 | 2006-01-18 | Selective delivery of molecules into cells or marking of cells in diseased tissue regions using environmentally senstive transmembrane peptide |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2399267T3 true ES2399267T3 (es) | 2013-03-27 |
Family
ID=36692873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06718899T Active ES2399267T3 (es) | 2005-01-18 | 2006-01-18 | Suministro selectivo de moléculas al interior de las células o marcación de células en zonas enfermas de tejidos usando un péptido transmembrana sensible a su entorno |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8076451B2 (es) |
| EP (1) | EP1846014B1 (es) |
| AU (1) | AU2006206428B2 (es) |
| ES (1) | ES2399267T3 (es) |
| WO (1) | WO2006078816A2 (es) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2490672A2 (en) * | 2009-10-22 | 2012-08-29 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Navy | Modular functional peptides for the intracellular delivery of nanoparticles |
| AU2011312776B2 (en) | 2010-07-13 | 2016-09-29 | University Of Rhode Island Board Of Trustees | Environmentally sensitive compositions |
| EP2603201B1 (en) | 2010-08-13 | 2020-03-11 | Rhode Island Board of Governors for Higher Education | Liposome compositions and methods of use thereof |
| WO2012174287A1 (en) * | 2011-06-15 | 2012-12-20 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Luminescent nanoparticle compositions |
| GB201111516D0 (en) * | 2011-07-01 | 2011-08-17 | Univ Birmingham | Coated metal particles |
| US10639327B1 (en) | 2015-11-20 | 2020-05-05 | Washington University | Nano-calcium carbonate |
| WO2018057912A1 (en) | 2016-09-22 | 2018-03-29 | Rhode Island Council On Postsecondary Education | FLUORESCENT COMPOUND COMPRISING A FLUOROPHORE CONJUGATED TO A pH -TRIGGERED POLYPEPTIDE |
| WO2018227132A1 (en) * | 2017-06-09 | 2018-12-13 | Rhode Island Council On Postsecondary Education | Linked and other ph-triggered compounds |
| DE112018006444T5 (de) * | 2017-12-19 | 2020-09-03 | Beijing Zeqin Biomedical Co., Ltd | pH-low-Insertionspeptid und Zusammensetzung davon |
| US10933069B2 (en) | 2018-01-05 | 2021-03-02 | Cybrexa 1, Inc. | Compounds, compositions, and methods for treatment of diseases involving acidic or hypoxic diseased tissues |
| CN109517073A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-26 | 北京泽勤生物医药有限公司 | 一种靶向治疗肿瘤的融合肽及其应用 |
| WO2020159983A1 (en) | 2019-01-28 | 2020-08-06 | Rhode Island Council On Postsecondary Education | Phlip®-mediated intracellular delivery of immuno-stimulatory compounds |
| US11267853B2 (en) | 2019-01-28 | 2022-03-08 | University Of Rhode Island Board Of Trustees | Carbohydrate tethering at cell surfaces to induce immune response |
| WO2020160047A2 (en) | 2019-01-28 | 2020-08-06 | Rhode Island Council On Postsecondary Education | Phlip® peptide-mediated epitope tethering at cell surfaces |
| WO2020160009A1 (en) | 2019-01-28 | 2020-08-06 | Rhode Island Council On Postsecondary Education | Phlip® targeted delivery of potent cytotoxic compounds |
| EP3917382A4 (en) * | 2019-01-31 | 2022-11-16 | Cytoveris Inc. | Method and system for detecting cancerous tissue and tumor margin using raman spectroscopy |
| PH12022550037A1 (en) | 2019-07-10 | 2023-04-12 | Cybrexa 3 Inc | Peptide conjugates of microtubule-targeting agents as therapeutics |
| EP3997093A1 (en) | 2019-07-10 | 2022-05-18 | Cybrexa 2, Inc. | Peptide conjugates of cytotoxins as therapeutics |
| US20240093250A1 (en) | 2021-01-08 | 2024-03-21 | Cybrexa 2, Inc. | Process for preparing a conjugate linking moiety |
| WO2022155172A1 (en) | 2021-01-13 | 2022-07-21 | Cybrexa 3, Inc. | Peptide conjugates of therapeutics |
| WO2022232808A1 (en) | 2021-04-29 | 2022-11-03 | Cybrexa 2, Inc. | Dosing regimens of peptide conjugates of topoisomerase i inhibitors |
| CA3243300A1 (en) * | 2021-11-17 | 2023-05-25 | Cybrexa 4 Inc | Peptide conjugates of peptidic tubulin inhibitors as therapeutics |
| CN115850375B (zh) * | 2022-08-27 | 2025-09-26 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种pH响应性的细胞渗透肽及其用途 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5739273A (en) | 1992-02-12 | 1998-04-14 | Yale University | Transmembrane polypeptide and methods of use |
| SE0201863D0 (en) * | 2002-06-18 | 2002-06-18 | Cepep Ab | Cell penetrating peptides |
| US8084610B2 (en) | 2006-06-07 | 2011-12-27 | James Edward Summerton | Compositions and methods for detecting and treating tumors containing acidic areas |
| US20080124274A1 (en) | 2006-06-07 | 2008-05-29 | James Edward Summerton | Compositions and methods for detecting and treating tumors containing acidic areas |
| US20070231256A1 (en) | 2006-03-30 | 2007-10-04 | Summerton James E | Compositions and methods for detecting and treating tumors containing acidic areas |
-
2006
- 2006-01-18 WO PCT/US2006/001895 patent/WO2006078816A2/en not_active Ceased
- 2006-01-18 AU AU2006206428A patent/AU2006206428B2/en not_active Ceased
- 2006-01-18 EP EP06718899A patent/EP1846014B1/en active Active
- 2006-01-18 ES ES06718899T patent/ES2399267T3/es active Active
-
2007
- 2007-07-16 US US11/778,323 patent/US8076451B2/en active Active
-
2011
- 2011-12-12 US US13/316,742 patent/US8703909B2/en active Active
-
2014
- 2014-04-22 US US14/258,964 patent/US9676823B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20120142042A1 (en) | 2012-06-07 |
| US9676823B2 (en) | 2017-06-13 |
| US8703909B2 (en) | 2014-04-22 |
| AU2006206428A1 (en) | 2006-07-27 |
| WO2006078816A2 (en) | 2006-07-27 |
| US20080233107A1 (en) | 2008-09-25 |
| US8076451B2 (en) | 2011-12-13 |
| AU2006206428B2 (en) | 2009-07-16 |
| US20150191508A1 (en) | 2015-07-09 |
| EP1846014A4 (en) | 2008-08-06 |
| EP1846014A2 (en) | 2007-10-24 |
| EP1846014B1 (en) | 2012-10-24 |
| WO2006078816A3 (en) | 2007-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2399267T3 (es) | Suministro selectivo de moléculas al interior de las células o marcación de células en zonas enfermas de tejidos usando un péptido transmembrana sensible a su entorno | |
| ES2304467T3 (es) | Vehiculo de liberacion de nanoparticulas. | |
| Christie et al. | Design strategies to improve soluble macromolecular delivery constructs | |
| Asokan et al. | Exploitation of intracellular pH gradients in the cellular delivery of macromolecules | |
| ES2520815T3 (es) | Método y complejos portadores para suministrar moléculas a células | |
| Kang et al. | Folic acid-tethered Pep-1 peptide-conjugated liposomal nanocarrier for enhanced intracellular drug delivery to cancer cells: conformational characterization and in vitro cellular uptake evaluation | |
| Kang et al. | A brain tumor-homing tetra-peptide delivers a nano-therapeutic for more effective treatment of a mouse model of glioblastoma | |
| ES2867398T3 (es) | Nanosistemas para el transporte controlado de moléculas activas con fines diagnósticos, pronósticos y terapéuticos | |
| ES2605618T3 (es) | ARN de doble cadena, modificado con lípidos con elevado efecto de interferencia por ARN | |
| CN111787912A (zh) | 用于核酸分子递送的纳米颗粒-水凝胶复合物 | |
| Wang et al. | Incorporation of histone derived recombinant protein for enhanced disassembly of core-membrane structured liposomal nanoparticles for efficient siRNA delivery | |
| Weerakkody et al. | Novel pH-sensitive cyclic peptides | |
| Zhang et al. | Polymersomes of asymmetric bilayer membrane formed by phase-guided assembly | |
| US8889631B2 (en) | Disruptors of early/recycling endosomes | |
| TW201117837A (en) | Oil body carriers, uses in target therapy and/or detection of the same, and fusion proteins comprised therein | |
| AU773842B2 (en) | Conjugate for mediating cell, compartment or membrane-specific transport of active substances | |
| TWI564020B (zh) | Containing pH-responsive peptides | |
| ES2259674T3 (es) | Liposomas de encapsulacion de farmacos anticancerosos y utilizacion de los mismos en el tratamiento de tumores malignos. | |
| KR102180631B1 (ko) | 지질을 이용한 표면 개질을 통해 세포 내 섭취 효율을 향상시킨 나노입자 복합체 및 이의 제조방법 | |
| US7718613B2 (en) | Armed peptides | |
| Singh et al. | Molecular Self-Assembly of Peptides into Supramolecular Nanoarchitectures for Target-Specific Drug Delivery | |
| Neuberg et al. | Design and evaluation of ionizable peptide amphiphiles for siRNA delivery | |
| Xu et al. | Cell Nucleus Penetration by Quantum Dots Induced by Nuclear Staining Organic Fluorophore and UV‐Irradiation | |
| Demirsoy et al. | Self-Assembled peptide nanofiber-based nanopharmaceutics for the treatment of viral infections | |
| CN120988139A (zh) | 一种gH625-H2A组蛋白及其染色质和应用 |