ES2395982A1

ES2395982A1 - Suplemento alimenticio, método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante y preparado alimenticio y usos correspondientes.

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Publication number: ES2395982A1
Application number: ES201131164A
Authority: ES
Inventors: Francisco Javier Polo Pozo; Carmen RODRÍGUEZ CANEL; Alejandro Bach Ariza; Anna ARIS GIRALT
Original assignee: APC Europe SA
Current assignee: APC Europe SA
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2013-02-18
Anticipated expiration: 2031-07-08
Also published as: US9394356B2; PL2730175T3; WO2013004865A2; DK2730175T3; EP2730175A2; US9676838B2; WO2013004865A8; PT2730175T; ES2395982B1; MX2013013847A; WO2013004865A3; US20160183554A1; CA2838550A1; EP2730175B1; US20140171360A1; BR112013033372A2

Abstract

Suplemento alimenticio, método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante y preparado alimenticio y usos correspondientes. Suplemento alimenticio que comprende proteínas hidrolizadas con un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno {al}-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres. Las proteínas hidrolizadas son proteínas animales, preferentemente hemoglobina. Se suministra oralmente, incluido en un preparado alimenticio, en forma líquida, concentrada o deshidratada. El suplemento es la base para un método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante en el que se añade en la dieta del rumiante un suplemento con proteínas hidrolizadas de acuerdo con la invención.

Description

Suplemento alimenticio, método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante y preparado alimenticio y usos correspondientes

Campo de la invención

La invención se refiere a un suplemento alimenticio y a un método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante. La invención también se refiere a un preparado alimenticio y a unos usos del suplemento de acuerdo con la invención.

Estado de la técnica

Se considera beneficioso maximizar la síntesis de proteínas microbianas en el rumen porque el perfil de aminoácidos de las proteínas microbianas es muy parecido al perfil de aminoácidos requerido por el animal huésped, comparado con la mayoría de las proteínas usadas como alimento (NRC, 2001). Los microorganismos del rumen alcanzan sus requerimientos de nitrógeno para la síntesis de proteínas a partir de una mezcla de amoníaco, aminoácidos libres y péptidos. Una gran proporción de la dieta digerible de un rumiante es convertida a los productos finales a través de una fermentación microbiana, básicamente ácidos grasos volátiles (VFA), y la mayoría de la proteína es trasformada en proteína microbiana.

Dado que el perfil de aminoácidos de las bacterias es usualmente de mejor calidad que las proteínas usadas como alimento, el objetivo en la nutrición de los rumiantes es maximizar el crecimiento bacteriano para fomentar la síntesis de proteínas microbianas. El crecimiento bacteriano debe ser sostenido con carbohidratos y fuentes de nitrógeno. Se ha demostrado que el crecimiento bacteriano se incrementa con la adición de aminoácidos y/o péptidos, tanto en el caso de bacterias celulolíticas como amilolíticas (Maeng and Baldwin, 1976; Argyle and Baldwin, 1989; Kernick, 1991). También se ha descrito que la digestión de las fibras se incrementa con la adición de aminoácidos (Griswold et al., 1996; Carro and Miller, 1999) y de proteínas (Cruz Soto et al., 1994) a bacterias puramente celulolíticas. Por su parte, Atasoglu et al. (2001) demostraron, con cultivos puros de bacterias celulolíticas, que la incorporación de nitrógeno en forma de amoníaco en nitrógeno de célula microbiana decrece cuando la proporción de aminoácidos se incrementa en el medio, sugiriendo que las bacterias celulolíticas también emplean los aminoácidos, caso de estar disponibles. Resultados similares se han descrito cuando se incrementan las concentraciones de péptidos, si bien Atasoglu et al. (2001) describen que hay una preferencia de las bacterias celulolíticas a incorporar en su nitrógeno celular el nitrógeno procedente de los aminoácidos frente al nitrógeno procedente de péptidos. Sin embargo, en las concentraciones típicas de péptidos y de aminoácidos en el rumen, aproximadamente el 80% del nitrógeno celular se deriva de nitrógeno amoniacal. La adición de aminoácidos de cadena ramificada que fermentarán como ácidos grasos volátiles de cadena ramificada, y de adición de péptidos en el fluido del rumen incrementa la digestión de las fibras, la producción de la proteína microbiana y las eficiencias de crecimiento (Russell and Sniffen, 1984; Thomsen, 1985.

El incremento de las masa microbiana en el rumen mejora el rendimiento de producción de leche (NRC, 2001). Como ya se ha indicado anteriormente, es una práctica habitual en la industria láctea de suministrar suplementos de aminoácidos, péptidos o levadura para incrementar la producción de leche de las vacas. De entre los diferentes péptidos empleados, la triptona (que es péptido obtenido a partir de la hidrólisis de caseína mediante el enzima tripsina) es considerada como el estándar de referencia para la adición de nitrógeno para bacterias en condiciones de laboratorio.

La mayoría de las proteínas animales y vegetales pueden ser hidrolizadas bien por métodos enzimáticos o por métodos ácidos. Los métodos enzimáticos suelen ser los métodos preferidos ya que no quedan residuos ácidos y los aminoácidos mantienen su forma L.

El uso de hemoglobina secada por atomización (spray dried hemoglobin SDH) y de harina de sangre en la industria láctea es bien conocido como una fuente de proteínas que no son hidrolizadas en el rumen y llegan intactas al intestino delgado, donde pueden ser digeridas por la microflora intestinal, para el mantenimiento del tracto intestinal. Sin embargo, no son empleados como fuente de proteínas para incrementar la masa bacteriana en el rumen.

Sumario de la invención

La invención tiene por objeto un suplemento alimenticio caracterizado porque comprende proteínas hidrolizadas que tienen un alto grado de hidrólisis. Preferentemente las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres.

Efectivamente, como se verá a continuación, en los estudios in vitro, según el procedimiento de Tilley Terry, realizados con contenidos de rumen se ha encontrado que, sorprendentemente, sólo cuando se añadía hemoglobina altamente hidrolizada al medio de rumen había una estimulación especial mayor en el crecimiento de tanto bacterias Grampositivas como Gram-negativas. Usando hemoglobina hidrolizada sólo hasta un grado medio o hemoglobina completa sin hidrolizar o triptona o levadura no se conseguía un efecto similar en el crecimiento bacterial del rumen. La justificación de esta mejora no es claramente conocida. Posiblemente el hecho de suministrar proteína altamente

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hidrolizada implique suministrar un perfil de aminoácidos, de péptidos y/o de oligopéptidos mucho más variados y más ajustados a las necesidades de la masa bacteriana del rumen que en el caso de suministro de aminoácidos o peptonas específicos (como en el caso del suministro de triptona o de los escasos aminoácidos libres que son sintetizados industrialmente a precios asequibles para estas aplicaciones.

Preferentemente las proteínas hidrolizadas son proteínas animales, preferentemente proteínas de sangre, y muy preferentemente de hemoglobina.

La invención también tiene por objeto un preparado alimenticio para animales, preferentemente para rumiantes, caracterizado porque comprende un suplemento de acuerdo con la invención.

La invención tiene asimismo por objeto un método para incrementar la masa bacteriana en el rumen o panza de un rumiante caracterizado porque comprende la etapa de añadir proteínas altamente hidrolizadas en la dieta del rumiante. Preferentemente as proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres.

Preferentemente las proteínas hidrolizadas son suministradas como suplemento en la dieta de animales, preferentemente de animales rumiantes. Ventajosamente se suministra una cantidad de dicho suplemento equivalente a entre un 0% y un 25% de la ración alimenticia del animal, preferentemente dicha cantidad equivale a entre un 1% y un 10% de la ración alimenticia del animal. El suplemento se puede incluir ventajosamente en el pienso de los animales, es decir, es para consumo oral. Se puede administrar de forma líquida, concentrada o deshidratada. En el caso de que se suministren deshidratadas, la deshidratación es preferentemente por atomización, si bien también se puede hacer ventajosamente por liofilización, mediante secador flash o mediante secador de disco.

Ventajosamente el suplemento es suministrado a un animal del grupo formado por vaca, oveja, cabra, caballo, llama, preferentemente a vacas lecheras.

Las proteínas pueden ser animales o vegetales. Preferentemente son proteínas de sangre, y muy preferentemente de hemoglobina.

Ventajosamente las proteínas hidrolizadas son obtenidas a partir de hemoglobina de un origen del grupo formado por porcino, bovino, ovino, equino y aviar.

Otro objeto de la invención es el uso de un suplemento alimenticio de acuerdo con la invención para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante, en particular para incrementar la masa bacteriana Gram-negativa, y/o para incrementar la producción de leche de un animal del grupo formado por vaca, oveja, cabra, caballo, llama, preferentemente vacas lecheras.

Breve descripción de los dibujos

Otras ventajas y características de la invención se aprecian a partir de la siguiente descripción, en la que, sin ningún carácter limitativo, se relatan unos modos preferentes de realización de la invención, haciendo mención de los dibujos que se acompañan. Las figuras muestran:

Fig. 1, pH de fluido de rumen influido por la fuente de nitrógeno aportada.

Fig. 2, abundancia relativa de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas influidas por la fuente de nitrógeno aportada in vitro.

Fig. 3, variación de pHs en cada una de las incubaciones del ejemplo 3.

Fig. 4, contaje bacteriano del ejemplo 3.

Descripción detallada de unas formas de realización de la invención

EJEMPLO 1: Producción de productos de hemoglobina animal hidrolizada

En general, las proteínas hidrolizadas pueden ser obtenidas mediante hidrólisis enzimática, hidrólisis ácida o hidrólisis alcalina.

En el caso de hidrólisis enzimática, preferentemente se realiza mediante enzimas del grupo de las proteasas que, ventajosamente, se añaden en una cantidad de enzima inferior al 25% en peso de la proteína a hidrolizar. Preferentemente la hidrólisis enzimática se hace con un pH comprendido entre 2 y 12.

En el caso de hidrólisis ácida, preferentemente la hidrólisis ácida se hace con un ácido del grupo formado por ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido fosfórico. Ventajosamente se hace a una temperatura superior a los 60ºC.

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En el caso de hidrólisis alcalina, preferentemente la hidrólisis alcalina se hace con un álcali del grupo formado por hidróxido sódico e hidróxido potásico, y ventajosamente se hace a una temperatura superior a los 60ºC.

Para la realización de este ejemplo 1 se usó hemoglobina como la materia prima para ser hidrolizada y la hidrólisis fue enzimática.

5 La hidrólisis de hemoglobina animal puede ser obtenida mediante la liberación de la hemoglobina de las células rojas usando una bomba de presión u otros métodos diferentes como diluyendo con agua, agitando a alta velocidad etc. Después, la hemoglobina puede ser hidrolizada enzimáticamente usando un enzima proteolítico, en condiciones de pH y temperatura controlados. Usando la hidrólisis enzimática, un experto en la materia puede conseguir el grado de hidrólisis deseado. Una vez que se ha conseguido un grado de hidrólisis deseado en la hemoglobina, ésta puede ser

10 suministrada directamente como alimento a los rumiantes, puede ser concentrada y almacenada como tal concentrado,

o puede ser deshidratada por diversos métodos conocidos.

En el caso concreto del ejemplo 1 el procedimiento seguido fue el siguiente:

Fracción de células rojas (hemoglobina)

Adición de agua

Calentamiento a T > 40ºC

Adición de proteasa bacteriana (> de 0,05% en peso por unidad de volumen)

Hidrólisis a T > 40ºC

Rango de pH: 5,0 – 9,0

Inactivación de la enzima a 80ºC durante 30 min

Secado por atomización

Empaquetado

30 El grado de hidrólisis usando este procedimiento puede variar dependiendo de la temperatura, el pH, la dosis o cantidad de enzima aportada y el tiempo de reacción. De esta manera ha sido posible producir los siguientes productos:

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TABLA 1: Muestras obtenidas de hemoglobina hidrolizada y secada por atomización y comparación con triptona

PARAMETROS: Y010514 11XIP007-4 11XIP007-2 Triptona

Grado de hidrólisis: alto alto medio medio

Grado de hidrólisis (%): 37 36,3 24,5 27,9

N-a-amino (mg/g proteína): 30,75 30,2 22,8 21,6

% aminoácidos libres: 16,3 15,3 9,6 9,1

% Materia seca: 99,3 95,0 93,8 96,7

% Nitrógeno: 14,30 14,04 14,33 13,10

% Cenizas: 11,6 13,6 11,7 4,9

EJEMPLO 2: Incubaciones de Tilley Terry

Muestras de rumen procedentes de tres animales diferentes fueron incubadas durante 12 horas siguiendo el procedimiento de Tilley Terry (1963). El fluido de rumen fresco es diluido con una solución tampón y una solución mineral en una proporción de 10:40 (fluido de rumen:solución tampón-mineral) y se añade la fuente de nitrógeno. Se aplican tres tratamientos diferentes a las muestras de rumen: control negativo (sin adición de la fuente de nitrógeno), 2% de triptona (como control positivo), y hemoglobina altamente hidrolizada y secada por atomización (spray dried high hydrolyzed hemoglobin SDHHH, muestra Y010514 obtenida en el ejemplo 1 anterior) suministrada a un porcentaje (2,1%) que aporta la misma cantidad de nitrógeno que un 2% de triptona. El método ha consistido en incubar el fluido de rumen en frascos de 100 ml en una atmósfera de C02 a 39ºC durante 12 horas.

Después de 12 horas de incubación se obtiene una muestra de líquido para determinar el pH y el crecimiento microbiano. El pH ha sido determinado usando una sonda electrónica.

Determinación del crecimiento microbiano

Dado que no se puede realizar medidas de densidad óptica en fluido de rumen, el crecimiento bacteriano fue estimado usando dos métodos diferentes:

1) Centrifugado y determinación de masa de un pellet microbiano después de completar el periodo de incubación de doce horas,

2) La muestra líquida obtenida de los frascos de incubación fue empleada para extraer ADN, y a continuación se realizaron RT-PCRs (real time polimerase chain reactions) cuantitativos para determinar el total de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

Para la extracción del ADN, las muestras de rumen fueron centrifugadas tras la incubación a 6500 g durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue descartado. El pellet fue dividido en partes iguales de 0,25 g y congelado (-80ºC) hasta el análisis posterior. El ADN microbiano total fue extraído utilizando el método RBB+C que emplea la técnica denominada ”bead beating” en presencia de altas concentraciones de dodecilsulfato de sodio (SDS), sal y EDTA, y realizando la subsiguiente purificación del ADN con columnas QIAamp (QIAGEN) (Yu and Morrisson, 2004).

Se ha realizado el RT-PCR cuantitativo usando placas de 0,2 ml de 96 pocillos y un IQTMSYBR® Green Supermix con el sistema de detección en tiempo real MylQTM de BioRad. Para la cuantificación de bacterias se usaron primers específicos para regiones del gen 16S rRNA, a una concentración final de 0,5 !M. Los ciclos de amplificación PCR se muestran en la Tabla 2. La especificidad del amplicón (pieza de ADN formado como producto de amplificación) se determinó a base del análisis de las curvas de fusión de los productos finales del PCR mediante el incremento de la temperatura a una velocidad de 0,5ºC/30 seg de 55ºC a 95ºC. Las reacciones PCR fueron realizadas por triplicado. Se empleó agua como control negativo y se calculó la expresión como una cuantificación relativa normalizada con el control negativo con 2LCt.

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Tabla 2 Primers y ciclos de amplificación RT-PCR

Gen: Primers Referencia Ciclo RT-PCR

16SrRNA Gram-Negativo: Fw 5’-AYGACGTCAAGTCMTCATGG-3’ Rv 5’-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ (Klausegger et al, 1999) 1 x (95ºC 05:00min) 40 x (95ºC 00:30min, 65ºC 00:30min, 72ºC 00:10min) 1 x (72ºC 00:30 min.)

16SrRNA Gram-Positivo: Fw 5’-GAYGACGTCAARTCMTCATGC-3’ Rv 5’-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ (Klausegger et al, 1999) 1 x (95ºC 05:00min) 40 x (95ºC 00:30min, 65ºC 00:30min, 72ºC 00:10min) 1 x (72ºC 00:30 min.)

Medidas de pH

En todos los casos el fluido del rumen ha mostrado un ligero incremento en su pH después de finalizada la incubación (ver Figura 1). El incremento fue significativamente mayor en el caso SDHHH (hemoglobina altamente hidrolizada y secada por atomización). El incremento de pH indica que los microorganismos fueron capaces de usar las fuentes de nitrógeno aportadas como fuentes de energía, provocando una excreción de amoníaco.

Cuantificación microbiana por RT-PCR

La Figura 2 muestra los resultados de los RT-PCR cuantitativos expresados como 2Ct usando el control negativo como referencia (dado que no es posible realizar una cuantificación absoluta). Se observa que la estimulación en el crecimiento bacteriano es aún más acusado en las bacterias Gram-negativas que en las bacterias Gram-positivas.

Un estudio comparativo ha mostrado que los péptidos son incorporados de una forma más eficaz en la proteína bacteriana. Una hipótesis para explicar porqué el crecimiento de las bacterias Gram-negativas es mayor que el crecimiento de las bacterias Gram-positivas podría basarse en la especial composición de oligopéptidos, péptidos y aminoácidos libres presentes en la fuente de nitrógeno.

Por lo tanto, se puede observar que SDHHH es una fuente de nitrógeno para la síntesis de proteínas microbianas fácilmente disponible. Adicionalmente, SDHHH parece estimular preferentemente el crecimiento de las bacterias Gramnegativas, que son, más deseables que las bacterias Gram-positivas en el rumen.

Ejemplo 3

Se han realizado 4 réplicas de incubaciones de Tilley Terry, cada una de ellas empleando tres muestras diferentes de líquidos de rumen de tres vacas diferentes para determinar la fermentación de rumen y los cambios microbianos, comparados con un control al que no se le ha añadido ninguna fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno aportadas fueron:

-: plasma

-: hemoglobina con una hidrólisis media y secada por atomización (spray dried medium hydrolyzed hemoglobine, SDMHH) (muestra 11XIP007-2 del ejemplo 1)

-: hemoglobina con una alta hidrolización y secado por atomización (SDHHH) (muestra 11XIP007-4 del ejemplo 1)

-: urea al 98%

-: nutriente de soja (SBM)

-: levadura

-: glóbulos rojos secados por atomización (RBC)

Los líquidos de rumen han sido diluidos en una proporción 10:40 y se les ha añadido (incluyendo el control) un 1% de harina de maíz. Todas las fuentes de proteína fueron aportadas en una cantidad tal que aportaban un 2% de nitrógeno.

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Las incubaciones han sido de 16 horas, bajo agitación continua (150 rpm) 5% de CO2 y 39ºC.

El pH se ha medido al inicio y al final de las incubaciones, se ha determinado la concentración de bacterias Gramnegativas y Gram-positivas.

5 En la figura 3 se observa la variación de pHs en cada una de las incubaciones.

En la figura 4 se observa el contaje bacteriano.

Se observa que tanto SDHHH como SDMHH producen un efecto positivo en el incremento del pH del rumen, como también ocurre con la levadura, el SDM y el plasma. Sin embargo, sorprendentemente, el SDHHH muestra un efecto superior en el crecimiento de bacterias de rumen tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Este efecto no es

10 observable ni en SDMHH ni en la hemoglobina sin hidrolizar.

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Referencias

Argyle, J. L., and R. L. Baldwin. 1989. Effects of amino acids and peptides on rumen microbial growth yields. J. Dairy Sci. 72:2017.

Atasoglu, C., C. J. Newbold, and R. J. Wallace. 2001. Incorporation of [15N]ammonia by cellulolytic ruminal bacterial Fibrobacter succinogenes BL2, Ruminococcus albus SY3, and Ruminococcus flavefaciens 17. Appl. Environ. Microbiol. 67:2819–2822.

Carro, M. D., and E. L. Miller. 1999. Effect of supplementing a fibre basal diet with different nitrogen forms on ruminal fermentation and microbial growth in an in vitro semi-continuous culture system (RUSITEC). BJN 82:149.

Cruz Soto, R., S. A. Muhammed, C. J. Newbold, C. S. Stewart, and R. J. Wallace. 1994. Influence of peptides, amino acids and urea on microbial activity in the rumen of sheep receiving grass hay on the growth of rumen bacteria in vitro. Anim. Feed Sci. Technol. 49:151–161.

Griswold, K. E., W. H. Hoover, T. K. Miller, and W. V. Thayne. 1996. Effect of form of nitrogen on growth of ruminal microbes in continuous culture. J. Anim. Sci. 74:483.

Klausegger, A., Hell, M., Berger, A., Zinober, K., Baier, S., Jones, N., Sperl, W. & Kofler, B. 1999. Gram type-specific broad-range PCR amplification for rapid detection of 62 pathogenic bacteria. J Clin Microbiol 37, 464–466.

Kernick, B. L. 1991. The effect of form of nitrogen on the efficiency of protein synthesis by rumen bacteria in continuous culture. Ph.D. Dissertation. University of Natal, Pietermaritzburg, South Africa.

Maeng, W. J., and R. L. Baldwin. 1976. Dynamics of fermentation of a purified diet and microbial growth in the rumen. J. Dairy Sci. 59:636.

NRC, 2001 Nutrient Requirements of Dairy Cattle, 7th ed. National Academy Press, Washington, DC.

Russell, J. B., and C. J. Sniffen. 1984. Effect of carbon-4 and carbon-5 volatile fatty acids on growth of mixed rumen bacteria in vitro. J. Dairy Sci. 67:987.

Thomsen, K. V. 1985. The specific nitrogen requirements of rumen microorganisms. Acta Agric. Scand. Suppl. 25:125.

Tilley, J. M. A. and R. A. Terry. 1963. A two stage technique for the in vitro digestion of forage crops. British Grassland society 18:104-111.

Yu, Z. and M. Morrison. 2004. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques 36:808-812.

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Claims

REIVINDICACIONES

1 – Suplemento alimenticio caracterizado porque comprende proteínas hidrolizadas, donde dichas proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres.

2 – Suplemento según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son proteínas animales, preferentemente proteínas de sangre, y muy preferentemente de hemoglobina.

3 – Preparado alimenticio para animales, preferentemente para rumiantes, caracterizado porque comprende un suplemento según una de las reivindicaciones 1 ó 2.

4 - Método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante caracterizado porque comprende la etapa de añadir en la dieta de dicho rumiante proteínas hidrolizadas, donde dichas proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres.

5 – Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son suministradas como suplemento en la dieta de animales, preferentemente de animales rumiantes.

6 – Método según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque se suministra una cantidad de dicho suplemento equivalente a entre un 0% y un 25% de la ración alimenticia del animal, preferentemente dicha cantidad equivale a entre un 1% y un 10% de la ración alimenticia del animal.

7 – Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque dicho suplemento es suministrado a un animal del grupo formado por vaca, oveja, cabra, caballo, llama, preferentemente a vacas lecheras.

8 – Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son proteínas animales, preferentemente proteínas de sangre, y muy preferentemente de hemoglobina.

9 – Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son proteínas vegetales.

10 – Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son obtenidas mediante hidrólisis enzimática.

11 – Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha hidrólisis enzimática se realiza mediante enzimas del grupo de las proteasas.

12 – Método según una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque dicha hidrólisis enzimática se hace con un pH comprendido entre 2 y 12.

13 – Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque en dicha hidrólisis enzimática se añade una cantidad de enzima inferior al 25% en peso de la proteína a hidrolizar.

14 - Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son obtenidas mediante hidrólisis ácida.

15 – Método según la reivindicación 14, caracterizado porque dicha hidrólisis ácida se hace con un ácido del grupo formado por ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido fosfórico.

16 – Método según una de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque dicha hidrólisis ácida se hace a una temperatura superior a los 60ºC.

17 - Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son obtenidas mediante hidrólisis alcalina.

18 – Método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha hidrólisis alcalina se hace con un álcali del grupo formado por hidróxido sódico e hidróxido potásico.

19 – Método según una de las reivindicaciones 17 ó 18 caracterizado porque dicha hidrólisis alcalina se hace a una temperatura superior a los 60ºC.

20 – Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas se añaden al pienso de dichos animales.

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21 – Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque dichas proteínas hidrolizadas son obtenidas a partir de hemoglobina de un origen del grupo formado por porcino, bovino, ovino, equino y aviar.

22 – Uso de un suplemento alimenticio según una de las reivindicaciones 1 ó 2, para incrementar la masa bacteriana en 5 el rumen de un rumiante.

23 – Uso de un suplemento alimenticio según una de las reivindicaciones 1 ó 2, para incrementar la producción de leche de un animal del grupo formado por vaca, oveja, cabra, caballo, llama, preferentemente vacas lecheras.

24 – Uso de un suplemento alimenticio según una de las reivindicaciones 1 ó 2, para incrementar la masa bacteriana Gram-negativa en el rumen de un rumiante.

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INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

21 N.O solicitud: 201131164 22 Fecha de presentaci6n de la solicitud: 08.07.2011 32 Fecha de prioridad:

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

x

WO 9425580 A1 (NIELSEN ET AL.) Pag.1, lin.1-16; pag.3, lin.20-23; pag.3. 1-3

x

US 20030022817 A1 (BERTHELSEN ET AL.) Parrafos 1, 8, 9. 1-3

x

WO 2007064208 A1 (CAMPINA NEDERLAND HOLDING B.V.) , Pag.3, lin.3-8; pag. 4, 1-3

lin.14-19; pag.6, lin. 19-22.

A

Catalogo de la empresa INAGROSA [on line] [Recuperado el ] 1-24

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y http://web.archive.org/web/20100322112017/http://inagrosa.es/menu productos.html

Categoria de los documentos citados x: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgaci6n no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci6n de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentaci6n de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nO:

Fecha de realización del informe 14.05.2012

Examinador J. L6pez Nieto Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

NO de solicitud: 201131164

CLASIFICACION OBJETO DE LA SOLICITUD

A23K1/00 (2006.01) A23K1/04 (2006.01) A23K1/18 (2006.01) A23J3/04 (2006.01) A23J3/12 (2006.01) A23J3/30 (2006.01) A23L1/305 (2006.01)

Documentaci6n minima buscada (sistema de clasificaci6n seguido de los simbolos de clasificaci6n)

A23K, A23J, A23L

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OPINIÓN ESCRITA

NO de solicitud: 201131164

Fecha de Realizaci6n de la Opini6n Escrita: 14.05.2012

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones 4-24 Reivindicaciones 1-3 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 4-24 1-3 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaci6n industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opini6n se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINIÓN ESCRITA

NO de solicitud: 201131164

1. Documentos considerados.-

A co ntinuaci6n se r elacionan l os documentos pertenecientes al est ado de l a t ecnica t omados en co nsideraci6n p ara l a realizaci6n de esta opini6n.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

WO 9425580 A1 (NIELSEN et al.) 07.06.2007

D02

US 20030022817 A1 (BERTHELSEN et al.) 30.01.2003

D03

WO 2007064208 A1 (CAMPINA NEDERLAND HOLDING B.V.) 10.11.1994

D04

Catalogo de la empresa INAGROSA [on line] [Recuperado el ] Recuperado de Internet: http://www.inagrosa.es/ y http://web.archive.org/web/20100322112017/http://inagrosa.es/menu productos.html
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La invenci6n se refiere a u n suplemento alimenticio caracterizado porque comprende proteinas hidrolizadas que tienen un grado de hidr6lisis superior al 28% y/o tienen mas de 23 mg de nitr6geno alfa-amino por gramo de proteina y/o tienen mas de un 1 0% de aminoacidos libres (Reivindicaciones 1 y 2 ) S e r efiere t ambien a un preparado al imenticio p ara animales, preferentemente rumiantes, que comprende un suplemento como el indicado anteriormente (Reivindicaci6n 3) La invenci6n comprende tambien un metodo para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante caracterizado porque comprende la etapa de anadir en la dieta de dicho rumiante proteinas hidrolizadas como las referidas anteriormente (Reivindicaciones 4-21) Se r eivindica t ambien el uso de un su plemento al imenticio se gun l as reivindicaciones 1 y 2 p ara incrementar l a m asa bacteriana en el rumen de un rumiante (Reivindicaci6n 22) para incrementar la producci6n de leche de un animal del grupo formado por vaca, cabra, caballo o llama (Reivindicaci6n 23) y para incrementar la masa bacteriana Gram-negativa en el rumen de un rumiante (Reivindicaci6n 24) El documento D01 divulga un hidrolizado de proteinas para utilizar como suplemento en un producto alimentario (pag.1, lin.11-6). El hidrolizado puede presentar un grado de hidr6lisis superior al 35% y puede ser de origen animal, concretamente de proteinas de la sangre (pag.3, lin.20-23) El documento D02 se refiere a un aditivo de uso alimentario que se caracteriza por tener un grado de hidr6lisis de 1-50%. La proteina puede ser de origen animal (parrafos 1, 8, 9) El docu mento D 03 se r efiere a un h idrolizado pr oteico que se puede ut ilizar p ara elaborar su plementos alimenticios o alimentos (pag.6, lin 19-22), su grado de hidr6lisis puede ser del 1-40%, preferentemente superior al 30% (pag.3, lin.3-8) Las proteinas hidrolizadas pueden ser de origen animal, concretamente de sangre (pag. 4, lin.14-19) Por lo tanto, las reivindicaciones 1-3 carecen de novedad y actividad inventiva en el sentido de los Art.6.1 y 8.1 de la Ley de Patentes 11/86 por ser conocidas del estado de la tecnica divulgado por los documentos D01-D03. El documento D04 es el catalogo en Internet de la empresa INAGROSA que contiene un producto llamado AMINOBIOL que es un co ncentrado de aminoacidos libres para ut ilizar co mo ad itivo en al imentaci6n animal. S e indica q ue A MINOBIOL estimula la microflora del rumen, aumenta la cantidad de proteinas en la leche y mejora la producci6n en vacas lecheras. El documento D04 forma parte del estado de la tecnica pr6ximo a la invenci6n, pero no afecta a su novedad o actividad inventiva en el sentido de los Art.6.1 y 8.1 de la Ley de Patentes 11/86. Las reivindicaciones 4-24 cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva en el sentido de los Art.6.1 y 8.1 de la Ley de Patentes 11/86.

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