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ES2391949T3 - Ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos BTL-II - Google Patents

Ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos BTL-II Download PDF

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ES2391949T3
ES2391949T3 ES03799969T ES03799969T ES2391949T3 ES 2391949 T3 ES2391949 T3 ES 2391949T3 ES 03799969 T ES03799969 T ES 03799969T ES 03799969 T ES03799969 T ES 03799969T ES 2391949 T3 ES2391949 T3 ES 2391949T3
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ES
Spain
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seq
protein
amino acids
proteins
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ES03799969T
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Peter R. Baum
Sabine S. Escobar
Joanne L. Viney
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Immunex Corp
Original Assignee
Immunex Corp
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Abstract

Una proteína BTL-II aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 29 a457 de SEC ID Nº: 4.

Description

Ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos BTL-II.
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/436.185 presentada el 23 de diciembre de 2002 y la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/525.298 presentada el 26 de noviembre de 2003.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a proteínas similares a butirofilina, específicamente proteínas similares a butirofilina de la subfamilia B7, que son conocidas por modular la función de células efectoras inmunitarias tales como, por ejemplo, linfocitos B y/o linfocitos T. También están incluidos los ácidos nucleicos que codifican tales proteínas, procedimientos para producir tales proteínas, anticuerpos que se unen a tales proteínas, composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas o anticuerpos, procedimientos de uso de tales ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos contra tales proteínas.
ANTECEDENTES
La modulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria puede ser una herramienta valiosa en controlar diversos tipos de enfermedades que incluyen enfermedades autoinmunitarias, enfermedades caracterizadas por inflamación y/o respuesta inmunitaria anormal, e infecciones. En el tratamiento de enfermedades caracterizadas por inflamación y/o respuestas inmunitarias anormales, tales como enfermedades inflamatorias del intestino y enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias, se desea la modulación por disminución de una respuesta inmunitaria. En otras situaciones, por ejemplo, cuando se vacuna un paciente para conferir inmunidad a una enfermedad infecciosa, se desea la estimulación de una respuesta inmunitaria. En el ámbito de las vacunas, los adyuvantes que pueden aumentar una respuesta inmunitaria a un antígeno coadministrado pueden ser valiosos en proporcionar protección a largo plazo contra la enfermedad. Particularmente lo que falta en la materia son adyuvantes que puedan estimular una respuesta inmunitaria de la mucosa. Una respuesta inmunitaria de la mucosa, a diferencia de una respuesta inmunitaria sistémica, es valiosa debido a que puede atacar una infección en un punto común de entrada, es decir, en una superficie de la mucosa. La presente invención trata estas necesidades en la materia proporcionando agentes terapéuticos para diagnosticar y tratar enfermedades caracterizadas por inflamación y/o respuestas inmunitarias inapropiadas y/o anormales y agentes terapéuticos que pueden actuar de adyuvantes para estimular una respuesta inmunitaria, particularmente una respuesta inmunitaria de la mucosa.
RESUMEN
La invención engloba proteínas BTL-II aisladas, ácidos nucleicos, anticuerpos, inhibidores y agonistas de BTL-II, y procedimientos para usar estas composiciones.
Se proporciona una proteína BTL-II aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos x-y de SEC ID Nº: 4 en la que x es el aminoácido en la posición 29 de SEC ID Nº: 4 e y el aminoácido en la posición 457 ó 482 de SEC ID Nº: 4. Tal proteína BTL-II puede comprender los aminoácidos 29 a 457; y/o 29 a 482 de SEC ID Nº: 4. La invención proporciona además una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, opcionalmente al menos el 90%, 92%, 94%, 96% o el 98%, idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16, tiene al menos 20, opcionalmente al menos 25 ó 30, aminoácidos de longitud y el polipéptido puede unirse a un receptor de la superficie celular expresado sobre linfocitos B o linfocitos T y/o puede inhibir la proliferación de linfocitos T. Una secuencia de aminoácidos tal tiene al menos 150 aminoácidos de longitud y es al menos el 85%, opcionalmente al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 tiene al menos 150, opcionalmente al menos 200, 250 ó 300, aminoácidos. Además, la secuencia de aminoácidos puede ser al menos el 90%, opcionalmente al menos el 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16, 18 y/o puede comprender los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16 o SEC ID Nº: 18.
Por tanto, la invención engloba una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos el 90%, opcionalmente al menos el 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 tiene al menos 150 aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos es al menos el 85%, opcionalmente al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16, tiene al menos 20 aminoácidos de longitud, y en la que el polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T. La primera secuencia de aminoácidos puede ser idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16;
Aquí se describe una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 30 a 457 de SEC ID Nº: 4, en la que el polipéptido comprende no más o menos de 2 dominios similares a Ig, y en la que el polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T. La secuencia de aminoácidos puede ser al menos el 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 99,5% o el 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 247 de SEC ID Nº: 8 o a los aminoácidos 30 a 243 de SEC ID Nº: 12. La secuencia de aminoácidos puede ser al menos el 90%, opcionalmente al menos el 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 99,5% o el 100%, idéntica a los aminoácidos 30 a 457 de SEC ID Nº: 4.
Aquí se describe una proteína BTL-II de la invención que comprende un primer polipéptido que consiste en una primera secuencia de aminoácidos al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 247 a 452 de SEC ID Nº: 4 o a los aminoácidos 248 a 447 de SEC ID Nº: 6, en la que la primera secuencia de aminoácidos no comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 32 a 232 de SEC ID Nº: 4 o a los aminoácidos 27 a 232 de SEC ID Nº: 6 con una región de identidad de la primera secuencia de aminoácidos alineada con SEC ID Nº: 4 de al menos 25, opcionalmente, al menos 50, 75, 100 ó150, aminoácidos, y en la que la proteína no comprende un segundo polipéptido que consiste en una segunda secuencia de aminoácidos al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 32 a 232 de SEC ID Nº: 4 o a los aminoácidos 27 a 232 de SEC ID Nº: 6 con una región de identidad de la segunda secuencia de aminoácidos alineada con SEC ID Nº: 4 de al menos 25, opcionalmente al menos 50, 75, 100 ó 150, aminoácidos, y en la que el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T.
En el presente documento también se describe una proteína BTL-II aislada que comprende un primer polipéptido que consiste en una primera secuencia de aminoácidos al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 32 a 242 de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12, en la que la región de identidad de la primera secuencia de aminoácidos alineada con SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12 tiene al menos aproximadamente 50, opcionalmente al menos el aproximadamente 75, 100, 150 ó 200, aminoácidos de longitud, en la que el primer polipéptido comprende un segundo polipéptido que consiste en una segunda secuencia de aminoácidos al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 10 a 40 de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12, en la que la región de identidad de la segunda secuencia de aminoácidos alineada con SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12 tiene al menos aproximadamente 20, opcionalmente al menos aproximadamente 25 ó 30, aminoácidos de longitud, y en la que el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T.
En una realización, la invención engloba una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 99,5% o el 100%, idéntica a los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16 o SEC ID Nº: 18 tiene al menos 275, opcionalmente al menos 300, aminoácidos, y en la que el polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T.
Proteínas BTL-II pueden comprender un polipéptido que pueden inhibir la proliferación de linfocitos T que pueden tener como máximo aproximadamente 480 aminoácidos, aproximadamente 380 aminoácidos, aproximadamente 270 aminoácidos, o aproximadamente 160 aminoácidos de longitud.
La invención engloba adicionalmente una proteína BTL-II aislada que comprende un primer polipéptido que consiste en una primera secuencia de aminoácidos al menos el 85%, opcionalmente al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o el 99,5%, idéntica a los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, en la que la región de identidad de la primera secuencia de aminoácidos alineada con SEC ID Nº: 10 tiene al menos aproximadamente 175, opcionalmente aproximadamente 200, 250, 275 ó 300, aminoácidos de longitud, en la que la primera secuencia de aminoácidos no tiene más de aproximadamente 390, opcionalmente no más de aproximadamente 270 ó 170, aminoácidos de longitud, en la que el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T, en la que la primera secuencia de aminoácidos no es al menos el 80% idéntica a los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 con una región de identidad de la primera secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 de al menos aproximadamente 40, 50, 60 ó 75 aminoácidos, y en la que la proteína BTL-II no comprende una segunda secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 con una región de identidad de la segunda secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 de al menos aproximadamente 40, 50, 60 ó 75 aminoácidos. Tal proteína BTL-II puede comprender los aminoácidos 32 a 242 de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12.
En otra realización, la invención comprende una proteína de fusión recombinante de BTL-II que comprende la proteína BTL-II y un polipéptido heterólogo, que puede ser una región Fc de un anticuerpo o una cremallera de leucina. En el presente documento se describe un fragmento inmunogénico de los aminoácidos 29 a 457 de SEC ID Nº: 4 que puede provocar anticuerpos que se unen específicamente al fragmento, que tiene al menos 10 aminoácidos de longitud, y que atraviesa la posición 360 de SEC ID Nº: 4. Se proporcionan fragmentos inmunogénicos de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 18 de al menos 10 aminoácidos de longitud, en los que el fragmento inmunogénico atraviesa la posición 141 a 143 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 y puede provocar anticuerpos que se unen específicamente al fragmento. Alternativamente, los fragmentos inmunogénicos pueden atravesar la posición 142 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 18 o la posición 141 de SEC ID Nº: 16.
En el presente documento se describen proteínas BTL-II murinas. Específicamente, en el presente documento se describe una proteína BTL-II aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos x-y de SEC ID Nº: 6 en la que x es cualquier aminoácido de la posición 1 a 35 de SEC ID Nº: 4 e y es cualquier aminoácido de la posición 450-460 de SEC ID Nº: 6. Una proteína BTL-II tal puede comprender los aminoácidos 32-450, 29 a 456 y/o 29 a 514 de SEC ID Nº: 6.
Otras realizaciones incluyen anticuerpos aislados que se unen específicamente a una proteína BTL-II que consiste en los aminoácidos 1-457 de SEC ID Nº: 4, 1-247 de SEC ID Nº: 8, 1-363 de SEC ID Nº: 10, 1-243 de SEC ID Nº: 12, 1-359 de SEC ID Nº: 14 ó 1-358 de SEC ID Nº: 16, para su uso en promover una respuesta inmunitaria sistémica
o de la mucosa contra un antígeno, en los que el anticuerpo es un antagonista de BTL-II. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos y pueden inhibir la unión de BTL-II a su receptor. En el presente documento se describen ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos y células que pueden producir tales anticuerpos, que pueden ser células de hibridoma o células que han sido manipuladas genéticamente para producir un anticuerpo tal y procedimientos de producción de anticuerpos cultivando tales células que pueden secretar el anticuerpo.
Otras realizaciones incluyen ácidos nucleicos BTL-II. La invención engloba un ácido nucleico BTL-II aislado que comprende un polinucleótido que consiste en los nucleótidos x a y de SEC ID Nº: 3 en la que x es el nucleótido 1 e y es el nucleótido 1371, o que comprende el complemento del polinucleótido. Un ácido nucleico tal comprende los nucleótidos 1 a 1371 de SEC ID Nº: 3. Además, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican fragmentos inmunogénicos, ya que son ácidos nucleicos BTL-II que codifican cualquiera de las proteínas BTL-II reivindicadas en el presente documento.
La invención proporciona además un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos BTL-II descritos anteriormente y una célula huésped que contiene un vector tal. Alternativamente, la invención proporciona una célula huésped genéticamente manipulada para expresar una proteína BTL-II o un fragmento inmunogénico de BTL-II. Tales células huésped pueden ser células de mamífero, que incluyen células CHO. También está englobado por la invención un procedimiento para producir una proteína BTL-II o fragmento inmunogénico, que comprende cultivar tales células huésped en condiciones que permitan la expresión de la proteína BTL-II o fragmento inmunogénico. Este procedimiento puede comprender adicionalmente aislar la proteína BTL-II, fragmento inmunogénico o anticuerpo de las células huésped o el medio. También se contemplan las proteínas BTL-II, fragmentos inmunogénicos o anticuerpos producidos por tales procedimientos. En el presente documento se describen células de mamífero que producen anticuerpos contra BTL-II, que incluyen células de hibridoma o de mieloma y procedimientos para producir anticuerpos cultivando tales células.
La invención también contempla diversos usos terapéuticos empleando las proteínas BTL-II. En una realización, las proteínas BTL-II reivindicadas en el presente documento se usan para reducir la inflamación en el intestino en un paciente que padece una enfermedad inflamatoria del intestino, opcionalmente tanto enfermedad de Crohn como colitis ulcerosa. En otra realización, las proteínas BTL-II reivindicadas en el presente documento se usan para inducir una respuesta inmunitaria, que incluye una respuesta inmunitaria sistémica y/o de la mucosa, contra un antígeno, en la que el agonista de BTL-II es un anticuerpo anti-BTL-II. El antígeno puede administrarse directamente a una superficie de la mucosa o puede administrarse sistémicamente. En el presente documento se describe un procedimiento para diagnosticar una enfermedad inflamatoria del intestino o predecir la aparición de una enfermedad inflamatoria del intestino que comprende ensayar una muestra de tejido del intestino de un paciente para determinar si ARNm o proteína BTL-II se expresa en exceso. El tejido puede ensayarse para la expresión de proteínas BTL-II usando un anticuerpo anti-BTL-II. En otra realización, las proteínas BTL-II reivindicadas en el presente documento se usan para disminuir una respuesta inmunitaria a un antígeno, especialmente un auto-antígeno en un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. El antígeno puede administrarse por una superficie de la mucosa.
En otras realizaciones, las proteínas BTL-II de la invención se usan para inhibir la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas. En una realización, el uso para inhibir la proliferación de linfocitos T comprende poner en contacto los linfocitos T con un polipéptido BTL-II. Los linfocitos T pueden ser linfocitos T humanos y pueden ponerse en contacto con el polipéptido BTL-II in vivo o in vitro. Un anticuerpo agonista que se une a un receptor de BTL-II expresado sobre linfocitos T puede inhibir la proliferación de linfocitos T. En otra realización, la invención incluye un procedimiento para suprimir la producción de citocinas por un linfocito T que comprende poner en contacto el linfocito T con un polipéptido BTL-II. Los linfocitos T pueden ser linfocitos T humanos y pueden ponerse en contacto con el polipéptido BTL-II in vivo. La citocina puede ser, por ejemplo, interferón gamma (IFNy), interleucina 2 (IL2) o interleucina 5 (IL5).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra las estructuras de dominio de miembros seleccionados de la familia de proteínas similares a butirofilina. La mayoría de las proteínas seleccionadas son miembros de la subfamilia B7 tratados más adelante. El nombre de cada proteína se muestra a la izquierda del diagrama que representa su estructura. Los dominios “similares a Ig” son dominios similares a inmunoglobulina como se describen más adelante. Los dominios marcados “7” son regiones de repetición de héptadas como se describen más adelante. Los dominios marcados “TM” son dominios transmembrana. Los recuadros blancos son dominios citoplásmicos no identificados son parte de una familia de dominios específica. Los dominios marcados “B30.2” son dominios B30.2 como se explican más adelante. La proteína BTL-II se representa aquí como que tiene cuatro dominios similares a Ig, pero también existen formas de BTL-II que tienen dos o tres dominios similares a Ig. B7-H3 se representa con cuatro dominios similares a Ig, y también existe en una forma que sólo contiene dos dominios similares a Ig.
La Figura 2 es un diagrama de la estructura del gen BTL-II humano y ARNm. Los recuadros indican exones. Los números debajo de las líneas horizontales indican las posiciones dentro de SEC ID Nº: 3 de los exones. Las líneas horizontales en la parte inferior de la figura denotan la extensión de SEC ID Nº: 3 que codifica el dominio extracelular y los dominios transmembrana y citoplásmicos (“TM/Cito”) y que forman la región sin traducir de 3' (“3' UTR”). Los codones de terminación se denotan por una marca que podría describirse como un rayo de sol o una pequeña explosión.
La Figura 3a es un diagrama de la estructura de una primera categoría de variantes de corte y empalme del ARNm de BTL-II humana. Los símbolos son los mismos que se describen para la Figura 2. Las X grandes sobre los exones 2 y 3 indican que estos exones faltan en esta categoría de variantes de corte y empalme.
La Figura 3b es una secuencia representativa de un miembro de la primera categoría de variantes de corte y empalme (línea inferior) alineada con una parte de SEC ID Nº: 3 (línea superior). No hay desapareamiento distintos del hueco creado por los exones ausentes 2 y 3.
La Figura 4a muestra la estructura de una segunda categoría de variantes de corte y empalme del ARN de BTL-II humana. Los símbolos son los mismos que se describen para la Figura 2. La X grande sobre el exón 3 indica que este exón falta en esta categoría de variantes de corte y empalme.
La Figura 4b muestra una secuencia representativa de un miembro de la segunda categoría de variantes de corte y empalme (línea inferior) alineada con una parte de SEC ID Nº: 3 (línea superior). No hay desapareamientos distintos del hueco creado por el exón ausente 3.
La Figura 5a muestra la estructura de una tercera categoría de variantes de corte y empalme del ARNm de BTL-II humana. Los símbolos son los mismos que se describen para la Figura 3. Las X grandes sobre los exones 2 y 3 indican que estos exones faltan en esta categoría de variantes de corte y empalme. Las estrellas acompañadas por números adyacentes a los recuadros indican las posiciones de polimorfismos de secuencias presentes en esta categoría de variantes de corte y empalme. Las variaciones están presentes en las siguientes posiciones dentro de SEC ID Nº: 3: la variación 2 está en la posición 1050; la variación 3 está en las posiciones 1136 y 1140; la variación 4 está en las posiciones 1178 y 1179; y la variación 5 está en la posición 1212; y la variación 6 está en la posición 1242.
La Figura 5b muestra una secuencia representativa de un miembro de la tercera categoría de variantes de corte y empalme (línea inferior) alineada con una parte de SEC ID Nº: 3 (línea superior). Las bases desapareadas se indican en negrita.
La Figura 6a muestra la estructura de una cuarta categoría de variantes de corte y empalme del ARNm de BTL-II humana. La X grande sobre el exón 3 indica que este exón falta en esta categoría de variantes de corte y empalme. Los polimorfismos de secuencias se indican como en la Figura 5a, y las variaciones 2 a 6 son como en la Figura 5a.
La Figura 6b muestra una secuencia representativa de un miembro de la cuarta categoría de variantes de corte y empalme (línea inferior) alineada con una parte de SEC ID Nº: 3 (línea superior). Las bases desapareadas se indican en negrita.
La Figura 7a muestra la estructura de una quinta categoría de variantes de corte y empalme del ARNm de BTL-II humana. La X grande sobre el exón 3 indica que este exón falta en esta categoría de variantes de corte y empalme. Los polimorfismos de secuencias se indican como en la Figura 5a, y las variaciones 2 a 6 son como en la Figura 5a. La variación 1 es una deleción de los nucleótidos 78 a 80 de SEC ID Nº: 3.
La Figura 7b muestra una secuencia representativa de un miembro de la quinta categoría de variantes de corte y empalme (línea inferior) alineada con una parte de SEC ID Nº: 3 (línea superior). Las bases desapareadas se indican en negrita.
La Figura 8 es un diagrama de la estructura del gen BTL-II murino y ARNm. Los símbolos son como en la Figura 5, excepto que el número se refiere a las posiciones en SEC ID Nº: 5.
La Figura 9a muestra la estructura de una primera categoría de variantes de corte y empalme de el ARNm de BTL-II murina. La X grande sobre el exón 3 indica que este exón falta en esta categoría de variantes de corte y empalme.
La Figura 9b muestra una secuencia representativa de un miembro de la primera categoría de variantes de corte y empalme murinas (línea inferior) alineada con SEC ID Nº: 5 (línea superior). No hay desapareamientos distintos del hueco creado por el exón ausente 3.
La Figura 10 representa la expresión de ARNm de BTL-II en tejido colónico de ratones mdr1a - /- (que llevan la mutación nula mdr1a en una población de referencia de FVB) cuando no presentan síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino (rayas horizontales) o cuando presentan síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino (patrón de damero) con respecto a la expresión de ARNm de BTL-II en tejido colónico de ratones FVB naturales no sintomáticos. Las mediciones se hicieron por hibridación de ADNc fluorescentemente marcado con un chip Affymetrix que contiene un oligonucleótido complementario a ARNm de BTL-II.
La Figura 11 es una gráfica que muestra las concentraciones relativas de ARNm de BTL-II detectado por un ensayo de PCR en tiempo real de tejido de colon de dos ratones naturales diferentes de la cepa de FVB (FVB nº 1 y nº 2; líneas diagonales) y de dos ratones mdr1a -/- que muestran síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino (Mdr1a -/- nº 1 y nº 2; patrones de damero).
La Figura 12a es una gráfica de barras que muestra la proliferación (como se evidencia por la captación de 3H timidina) de linfocitos T humanos purificados cultivados con las siguientes proteínas: anticuerpo anti-CD3£ solo,
; anticuerpo anti-CD3£ y BTL-II:Fc, ; anticuerpo anti-CD3£ y B7RP-1:Fc, ; anticuerpo anti-CD3£,
B7RP-1:Fc y BTL-II:Fc, ; anticuerpo anti-CD3£ y B7-2:Fc, ; y anticuerpo anti-CD3£, B7-2:Fc y BTL-II:Fc,
.
La Figura 12b es idéntica a la Figura 12a, excepto que se usa una escala logarítmica en vez de una lineal.
La Figura 13 es una gráfica de barras que muestra la proliferación de linfocitos T humanos purificados en respuesta a una cantidad constante de anticuerpo anti-CD3£ y una cantidad variable de BTL-II:Fc, como se indica.
La Figura 14 es una gráfica de barras que muestra la proliferación de linfocitos T murinos en respuesta a anticuerpo
anti-CD3£ solo, , anticuerpo anti-CD3£ más BTL-II:Fc, , o anticuerpo anti-CD3£ más una proteína de
control que consiste en una región Fc humana, .
La Figura 15 es una gráfica de barras que muestra la proliferación de linfocitos B murinos en respuesta a proteína
, proteína TALL-1 sola, , un anticuerpo anti-IgM solo,
, TALL-1 más un anticuerpo antino añadida,
IgM, , y TALL-1, anticuerpo anti-IgM y BTL-II:Fc,
.
La Figura 16a muestra la proliferación de linfocitos T humanos purificados en respuesta a diversas combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a.
La Figura 16b muestra la producción relativa de interferón gamma (IFNy) en respuesta a diversas combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a.
La Figura 16c muestra la producción relativa de interleucina 2 (IL2) en respuesta a diversas combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a.
La Figura 16d muestra la producción relativa de interleucina 5 (IL5) en respuesta a diversas combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a.
La Figura 17 es una gráfica de barras que muestra el número total de células muertas en cultivos de linfocitos T purificados cultivados con diversas combinaciones de proteínas, como se indica en la Figura 12a.
La Figura 18 muestra barridos de FACS de células transfectadas con tanto un vector vacío (línea superior) como un vector que contiene ADNc que codifica BTL-II murina (segunda línea), B7RP-1 murina (tercera línea) o CD80 murina (línea inferior). Las células se tiñeron con las siguientes proteínas: (1) la región extracelular de CTLA4 murina fusionada con una región Fc humana de un anticuerpo IgG1 (primera columna); (2) la región extracelular de CD28 murina fusionada con una región Fc humana de un anticuerpo IgG1 (segunda columna); (3) la región extracelular de ICOS murina fusionada con una región Fc humana de un anticuerpo IgG1 (tercera columna); y (4) la región extracelular de PD1 fusionada con una región Fc humana de un anticuerpo IgG1 (cuarta columna). El eje vertical de cada barrido (marcado “recuentos”) representa el número de células y el eje horizontal (marcado “FL2-H”) representa la fluorescencia. La línea horizontal marcada “M1” muestra cuando la “puerta” se puso encima de la máquina de FACS. Las células englobadas en esta puerta se consideran positivas; todas las otras se consideran negativas. Los caracteres pequeños sobre cada barrido de FACS indican un número de muestra individual.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
La SEC ID Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de BTL-II humana de la entrada del Centro nacional para
información biotecnológica (NCBI) con el número de acceso NM_019602. La SEC ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BTL-II humana predicha a partir de la secuencia de ADNc de la entrada de NCBI con el número de acceso NM_019602.
La SEC ID Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos de un ADNc de BTL-II humana de longitud completa de la invención.
La SEC ID Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BTL-II humana de longitud completa codificada por SEC ID Nº: 3. La SEC ID Nº: 5 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de BTL-II murina de longitud completa de la invención. La SEC ID Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BTL-II de longitud completa murina codificada por
SEC ID Nº: 5.
La SEC ID Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de un miembro representativo de la primera categoría de variantes de corte y empalme de BTL-II humana (Figura 3a). La SEC ID Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 7. La SEC ID Nº: 9 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de un miembro representativo de la segunda categoría de
variantes de corte y empalme de BTL-II humana (Figura 4a). La SEC ID Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 9. La SEC ID Nº: 11 es una secuencia de nucleótidos parcial del ADNc de un miembro representativo de la tercera
categoría de variantes de corte y empalme de BTL-II humana (Figura 5a). La SEC ID Nº: 12 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 11. La SEC ID Nº: 13 es una secuencia de nucleótidos parcial del ADNc de un miembro representativo de la cuarta
categoría de variantes de corte y empalme de BTL-II humana (Figura 6a). La SEC ID Nº: 14 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 13. La SEC ID Nº: 15 es una secuencia de nucleótidos parcial del ADNc de un miembro representativo de una quinta
categoría de variantes de corte y empalme de BTL-II humana (Figura 7a). La SEC ID Nº: 16 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 15. La SEC ID Nº: 17 es la secuencia de nucleótidos de un miembro representativo de una primera categoría de
variantes de corte y empalme de BTL-II murina (Figura 9a). La SEC ID Nº: 18 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 17. La SEC ID Nº: 19 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión BTL-II:Fc descrita en el Ejemplo
5. La SEC ID Nº: 20 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión BTL-II:Fc descrita en el Ejemplo 5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención proporciona proteínas BTL-II y ácidos nucleicos que incluyen vectores recombinantes que codifican proteínas BTL-II, anticuerpos anti-BTL-II, que pueden ser agonistas o antagonistas, además de procedimientos para producir dichas proteínas y usos terapéuticos de dichas proteínas. La expresión de BTL-II está limitada a un pequeño número de tipos de tejido. BTL-II se expresa en exceso en el intestino antes de la aparición de síntomas y durante la fase sintomática en un sistema de modelo de enfermedad inflamatoria del intestino murina como se ilustra en el Ejemplo 4. Por tanto, los anticuerpos para BTL-II pueden servir para diagnosticar o para predecir la probabilidad de la aparición de una enfermedad inflamatoria del intestino. Además, la invenciónproporciona varias variantes alélicas de la secuencia de nucleótidos de BTL-II (Figuras 5a a 7a). Éstas pueden usarse en predecir la susceptibilidad a enfermedad inflamatoria del intestino. Además, como una proteína BTL-II soluble puede inhibir la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas (Ejemplos 6-10), las proteínas BTL-II pueden usarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
Además, BTL-II se expresa en parches de Peyer, que son estructuras especializadas conocidas por desempeñar una función en el muestreo inmunitario en el intestino. BTL-II se expresa preferencialmente en células dendríticas CD11c+ (de baja expresión) CD8+ B220+ (también se llaman células dendríticas plasmacitoides) encontradas en parches de Peyer con respecto a otras células encontradas en parches de Peyer, que incluyen otras células dendríticas. Se plantea la hipótesis de que las células dendríticas de parches de Peyer desempeñen una función en inducir tolerancia a superficies de la mucosa debido a su influencia en la diferenciación de linfocitos T. Weiner (2001), Nature Immunology 2(8): 671-71; Weiner (2001), Immunol. Rev. 182: 207-14; Iwasaki y Kelsall (1999), American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 276(5): G1074-78. Por tanto, los anticuerpos anti-BTL-II pueden usarse para identificar células dendríticas CD11c+ (de baja expresión) CD8+ B220+ dentro de parches de Peyer.
Como se explica más adelante, BTL-II está dentro de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina que desempeñan funciones en regular respuestas mediadas por linfocitos T y B. BTL-II puede desempeñar una función en tanto la disminución como la promoción de la inflamación mediada por el sistema inmunitario, especialmente en el intestino. Dada la complejidad del sistema inmunitario, una única proteína de la superficie celular puede, en algunos casos, tanto estimular como disminuir una respuesta inmunitaria por células efectoras inmunitarias, dependiendo de qué receptores sobre las células efectoras estén disponibles para que la molécula interactúe con ellos. Las proteínas B7-1 y B7-2 tratadas más adelante son ejemplos de proteínas reguladoras inmunitarias de la superficie celular con efectos tanto estimulantes como de disminución sobre células efectoras inmunitarias, en este caso, linfocitos T. Por tanto, BTL-II puede desempeñar funciones duales similares in vivo. Sin embargo, el intestino es, globalmente, altamente tolerante a antígenos extraños, como se evidencia por su tolerancia a antígenos alimentarios y microorganismos comensales. Por tanto, es probable que BTL-II desempeñe una función en disminuir respuestas inmunitarias o inflamación in vivo en al menos algunas situaciones. Por tanto, los antagonistas de BTL-II, que pueden incluir anticuerpos, proteínas de unión seleccionadas in vitro o moléculas pequeñas, pueden servir para estimular una respuesta inmunitaria de la mucosa a un antígeno. Además, proteínas BTL-II solubles, o anticuerpos antiidiotípicos funcionalmente equivalentes, pueden disminuir una respuesta inmunitaria en el intestino o en otras superficies de la mucosa en el cuerpo, tal como los pulmones.
Un “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, puede ser un anticuerpo quimérico, puede ser anticuerpo monomérico o monocatenario, dimérico, trimérico, tetramérico o multimérico, y puede ser una proteína recombinante
o una proteína no recombinante. Un “dominio” es parte o toda una proteína que puede distinguirse por motivos de secuencia primarios y/o características estructurales terciarias. Los programas diseñados para localizar dominios de proteínas incluyen, por ejemplo, Pfam (Bateman y col. (1999), Nucleic Acids Res. 27: 260-62; Bateman y col. (1999), Nucleic Acids Res. 28: 263-66), ProDom (Corpet y col. (1999), Nucleic Acids Res. 27: 263-67; Corpet y col. (1999), Nucleic Acids Res. 28: 267-69), Domo (Gracy y Argos (1998), Bioinformatics 14: 164-87) y SMART (Ponting y col. (1999), Nucleic Acids Res. 27: 229-32). La estructura terciaria puede determinarse empíricamente, por ejemplo, por cristalografía de rayos X, o puede predecirse usando software informático diseñado para tales uses. Por ejemplo, a los datos estructurales puede accederse por la página web Entrez de NCBI de la base de datos de modelado molecular (Wang y col. (2000), Nucleic Acids Res. 28(1): 243-45) o por el uso de software tal como DALI (Holm y Sander (1993), J. Mol. Biol. 233: 123-38). Dominios similares a inmunoglobulina (similares a Ig) se distinguen principalmente, por ejemplo, por su estructura terciaria en vez de por homologías de secuencias primarias. Véanse, por ejemplo, Bork y col. (1994), J. Mol. Biol. 242: 309-20; Hunkapiller y Hood (1989), Adv. Immunol. 44: 1-63; Williams y Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405. Sin embargo, los dominios de IgV e IgC contienen un puñado de aminoácidos altamente conservados que se producen en posiciones conservadas dentro de su secuencia de aminoácidos primaria. Véase, por ejemplo, Kabat y col. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest,
U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, publicación NIH nº 913242. La presencia de tales aminoácidos altamente conservados que se producen en el espacio apropiado puede indicar la presencia de un dominio similar a IgC o similar a IgV.
Un ácido nucleico “codifica” una proteína, como se indica en el presente documento, si el ácido nucleico o su complemento comprende los codones que codifican la proteína.
Las células se han “manipulado genéticamente” para expresar una proteína específica cuando secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que permiten la expresión de la proteína se han introducido en las células usando procedimientos de “ingeniería genética” tales como infección vírica, transfección, transformación o electroporación. Véase, por ejemplo, Kaufman y col. (1990), Meth. Enzymol. 185: 487-511. Esto pueden incluir, por ejemplo, la introducción de ácidos nucleicos que codifican la proteína en las células o la introducción de secuencias reguladoras para potenciar la expresión de un gen huésped que codifica la proteína como se describe en la patente de EE.UU. nº
5.272.071 a Chappel. Los procedimientos de “ingeniería genética” engloban numerosos procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, amplificar ácidos nucleicos usando reacción en cadena de la polimerasa, ensamblar moléculas de ADN recombinante clonándolas en Escherichia coli, digestión con enzima de restricción de ácidos nucleicos, ligación de ácidos nucleicos, síntesis in vitro de ácidos nucleicos y transferencia de bases a los extremos de ácidos nucleicos, entre numerosos otros procedimientos que son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Un “polipéptido heterólogo” es cualquier polipéptido que tiene al menos 3 aminoácidos de longitud que no es un polipéptido BTL-II como se indica en el presente documento.
A propósito de comparaciones para determinar la identidad de secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, lo que se indica por una “región de identidad” es la porción del polinucleótido o polipéptido que es apareada, parcialmente o exactamente, con otro polinucleótido o polipéptido por el programa informático GAP (Devereux y col. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95) usando los parámetros establecidos más adelante. Por ejemplo, si un polipéptido de 20 aminoácidos está alineado con una proteína considerablemente más larga, los 10 primeros aminoácidos coinciden exactamente con la proteína más larga, y los 10 últimos aminoácidos no coinciden en absoluto con la proteína más larga, la región de identidad tiene 10 aminoácidos. Si, por otra parte, los primeros y últimos aminoácidos del polipéptido de 20 aminoácidos coinciden con la proteína más larga, y otros ocho apareamientos están aislados entremedias, la región de identidad tiene 20 aminoácidos de longitud. Sin embargo, estiramientos largos en cualquier cadena alineada sin aminoácidos idénticos o conservativamente sustituidos o nucleótidos idénticos de al menos, por ejemplo, 20 aminoácidos o 60 nucleótidos constituyen un punto final de una región de identidad, como se indica en el presente documento.
Los dominios “similares a Ig” son dominios similares a inmunoglobulina y pueden ser dominios tanto similares a IgV como similares a IgC o ser dominios que pueden plegarse en una estructura de inmunoglobulina, pero no pueden clasificarse inequívocamente como tanto similares a IgV como similares a IgC.
Los dominios “similares a IgV” tienen secuencias de aminoácidos que pueden plegarse en un pliegue de inmunoglobulina con las características comunes a dominios de la región variable de inmunoglobulina. Véase Bork y col., arriba; Miller y col. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4377-81; Williams y Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405. Un experto en la materia sabe bien que la presencia de aminoácidos que están altamente conservados en dominios IgV en posiciones conservadas pueden identificar un dominio como similar a IgV.
Los dominios “similares a IgC” tienen secuencias de aminoácidos que pueden plegarse en un pliegue de inmunoglobulina con las características comunes a dominios de la región constante de inmunoglobulina. Véase Bork y col., arriba; Williams y Barclay, arriba. Un experto en la materia sabe bien que la presencia de aminoácidos que están altamente conservados en dominios IgC en posiciones conservadas pueden identificar un dominio como similar a IgC.
“Enfermedades inflamatorias del intestino” incluyen enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, ileitis y cualquier otra enfermedad caracterizada por inflamación crónica del tracto gastrointestinal.
Una proteína comprende “no más o menos de 2 dominios similares a Ig” cuando contiene dos dominios similares a Ig y no contiene toda o alguna porción reconocible de otro dominio similar a Ig. Sin embargo, una proteína tal puede contener otras secuencias de aminoácidos que no son dominios similares a Ig y todavía contienen “no más o menos de 2 dominios similares a Ig.” Por tanto, el término “no más o menos” sólo se refiere a dominios similares a Ig, no a otras secuencias de aminoácidos que puedan ser parte de la proteína.
Cuando se dice que un polipéptido puede “inhibir la proliferación de linfocitos T” o que puede realizar alguna otra función biológica, se indica que una proteína que comprende el polipéptido puede realizar la función y que la adición del polipéptido a al menos algunas proteínas que no pueden realizar la función biológica permite que estas proteínas realicen la función. En algunos casos, un polipéptido que puede realizar la función biológica puede hacerlo así sin ninguna secuencia adicional. En otros casos, un polipéptido puede requerir otras secuencias, por ejemplo, secuencias de oligomerización, para realizar una función biológica. En un escenario, un polipéptido puede realizar eficazmente una función biológica particular cuando está ligado a una región Fc o una cremallera de leucina o a algún otro dominio dimerizante, pero no sin el dominio dimerizante. Como se indica en el presente documento, tal polipéptido puede realizar la función biológica.
Una “proteína” es cualquier polipéptido que comprende al menos 10 aminoácidos, opcionalmente al menos 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 y/o 300 aminoácidos.
“Recombinante”, como se aplica a polipéptidos o proteínas, significa que la producción de la proteína depende de al menos una etapa en la que ácidos nucleicos, que pueden o pueden no codificar la proteína, se introducen en una célula en la que no se encuentran naturalmente.
“Proteínas de fusión recombinantes” son proteínas recombinantes que comprenden parte o toda de al menos dos proteínas que no se encuentran fusionadas juntas en la naturaleza fusionadas en una única cadena de polipéptidos.
Una “mutación silenciosa” en una secuencia de ácidos nucleicos es una que cambia la secuencia del ácido nucleico sin cambiar la secuencia de la proteína codificada por el ácido nucleico.
Una proteína “soluble” es una que carece de un dominio transmembrana o alguna otra secuencia de aminoácidos, tal como una secuencia de anclaje GPI, que normalmente hace que la proteína se incorpore en o se asocie con una membrana. Tales proteínas podrían comprender normalmente toda o parte de la región extracelular de una proteína transmembrana.
Para los fines de la invención, dos proteínas o ácidos nucleicos son “sustancialmente similares” si son al menos el 80%, opcionalmente al menos el 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o el 99,7%, idénticos entre sí en secuencia de aminoácidos o de nucleótidos y mantienen o alteran de un modo deseable una actividad biológica de la proteína sin alterar. La identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos o dos de ácidos nucleicos puede determinarse por inspección visual y cálculo matemático o más preferentemente la comparación se hace comparando la información de secuencias usando un programa informático. Un programa informático a modo de ejemplo es el programa versión 10.0 del paquete Wisconsin de Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI), GAP (Devereux y col. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) la implementación GCG de una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación de aminoácidos ponderados de Gribskov y Burgess ((1986) Nucleic Acids Res. 14: 6745) como se describe en Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, Schwartz y Dayhoff, eds., National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358 (1979) u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalidad de 8 para cada hueco y una penalidad adicional de 2 para cada símbolo en cada hueco para secuencias de aminoácidos, o una penalidad de 50 para cada hueco y una penalidad adicional de 3 para cada símbolo en cada hueco para secuencias de nucleótidos; (3) sin penalidad para huecos del extremo; y (4) sin penalidad máxima para huecos largos. También pueden usarse otros programas usados por aquellos expertos en la materia de comparación de secuencias.
Proteínas similares a butirofilina
Proteínas similares a butirofilina informadas hasta la fecha comparten algunas características estructurales, y muchas están codificadas dentro de o son adyacentes al sitio de histocompatibilidad mayor (MHC). Véase, por ejemplo, Henry y col. (1999), Immunology Today 20(6): 285-88. La butirofilina es una proteína que constituye el 40% de la proteína total asociada al glóbulo graso de leche bovina, y existe un homólogo humano. Ruddy y col. (1997), Genome Research 7: 441-56, que cita Jack y Mather (1990), J. Biol. Chem. 265: 14481-86. La similitud al nivel de secuencias de aminoácidos entre proteínas similares a butirofilina puede ser baja, pero la estructura de dominio está algo conservada. Todos los miembros comprenden un péptido señal del extremo amino seguido de un dominio similar a Ig, que normalmente se informa que es un dominio similar a IgV. En muchos casos, éste va seguido de otro dominio similar a Ig, que normalmente se informa que es un dominio similar a IgC, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. Los dos dominios similares a Ig pueden repetirse inmediatamente tras su primera aparición, como en BTL-II o B7-H3. Esta estructura de dominio se ilustra en la Figura 1. La mayoría de las proteínas representadas en diagrama en la Figura 1 son miembros de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina; sólo tres (BTN2A1 humana, butirofilina humana y glucoproteína de oligodendrocitos de mielina) no son.
Los dominios similares a Ig pueden ser muy divergentes en secuencia y todavía retienen uno de varios patrones de plegamiento conservados, incluyendo todos un núcleo estructural común que comprende cuatro cadenas �. Las regiones constantes y variables de inmunoglobulina tienen una estructura terciaria que se caracteriza por siete a nueve cadenas � antiparalelas que forman una forma similar a barril. Bork y col. (1994), J. Mol. Biol. 242: 309-20. Los dominios de inmunoglobulina similares a IgV e IgC incluyen cada uno un puñado de residuos distintos altamente conservados. Hunkapiller y Hood (1989), Adv. Immunol. 44: 1-63; Miller y col. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4377-81; Williams y Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405. Los residuos conservados son supuestamente importantes para la estructura o función. Tales residuos conservados encuentran en los dominios similares a Ig de BTL-II. Por ejemplo, el primer dominio similar a Ig de la proteína BTL-II humana (SEC ID Nº: 4) contiene tales residuos altamente conservados característicos de dominios similares a IgV en localizaciones apropiadas en, por ejemplo, las posiciones G43, C50, W65, L109, D118, G120, Y122 y C124. Véase la Tabla 3. El tercer dominio similar a Ig también contiene residuos que se corresponden con residuos conservados en dominios similares a IgV. El segundo y cuarto dominios similares a Ig de BTL-II humana contienen residuos que se corresponden con residuos altamente conservados en dominios similares a IgC. Tabla 3.
Los dominios transmembrana y citoplásmico se producen en proteínas similares a butirofilina, independientemente de si o no tienen un segundo dominio similar a Ig. El dominio transmembrana puede o puede no estar seguido de una o más unidades de siete aminoácidos reminiscentes de las repeticiones de héptadas típicas de un motivo de bobina enrollado en hélice Q. Las repeticiones de héptadas también pueden producirse en otras posiciones en una proteína similar a butirofilina. Para una discusión de repeticiones de héptadas véase Miller y col. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4377-81. Los procedimientos para predecir dominios transmembrana son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ikeda y col. (2002), In Silico Biol. 2(1): 19-33; Tusnady y Simon (1998), J. Mol. Biol. 283(2): 489-506. Las proteínas similares a butirofilina pueden tener un dominio citoplásmico. Un dominio citoplásmico tal puede o puede no comprender un dominio B30.2. Se muestran secuencias de diversos dominios B30.2, y funciones putativas de dominios B30.2 se tratan por Henry y col. ((1998), Mol. Biol. Evol. 15(12): 1696-1705. Los dominios B30.2 se encuentran en una variedad de proteínas, y la función del dominio B30.2 es desconocida. Un ligando propuesto del dominio B30.2 es la xantina oxidasa, que interactúa con el dominio citoplásmico de butirofilina. Las mutaciones en los dominios B30.2 de dos proteínas diferentes que contienen B30.2 guardan relación con enfermedades diferentes, aunque no se han establecido las relaciones causales entre las mutaciones y los fenotipos de enfermedad. Henry y col., arriba.
La subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina
BTL-II comparte una estructura de dominio con varias proteínas reguladoras inmunitarias similares a butirofilina que carecen del dominio B30.2 que desempeñan funciones en regular las células efectoras inmunitarias tales como, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B y células mieloides. Esta subfamilia se denomina en el presente documento “la subfamilia B7” de proteínas similares a butirofilina. Como se indica en el presente documento, las características de los miembros de la subfamilia B7 incluyen, sin limitación, las siguientes: (1) tienen uno o más dominios similares a Ig extracelulares; (2) tienen dominios transmembrana y citoplásmico; (3) carecen de un dominio B30.2; (4) se expresan sobre células presentadoras de antígeno; (5) se someten a regulación de la expresión durante una respuesta inmunitaria activada; y (6) modulan una respuesta inmunitaria. Hasta la fecha se ha informado de proteínas B7 solubles no secretadas que carecen de un dominio transmembrana que modulan la respuesta inmunitaria. La mayoría de las proteínas B7 tienen dos dominios extracelulares similares a Ig, pero algunas isoformas de B7-H3 tienen cuatro. Véase la Figura 1. La BTL-II humana puede tener dos a cuatro dominios similares a Ig extracelulares y tiene todas las características de miembros de la familia B7 enumerados anteriormente. Por tanto, los inventores consideran que es un miembro de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina. Todos los otros miembros conocidos de la subfamilia B7 interactúan con receptores sobre células efectoras inmunitarias, tales como linfocitos B y/o linfocitos T, interacción que sirve de señal para modular una respuesta inmunitaria. Por tanto, se predice que BTL-II interactúa con un receptor sobre una célula efectora inmunitaria, tal como un linfocito T, y así modular una respuesta inmunitaria.
Los miembros de la familia B7 desempeñan funciones en modular la actividad de células efectoras inmunitarias, especialmente linfocitos T. Henry y col. (1999), Immunology Today 20(6): 285-88; Sharpe y Freeman (2002), Nat. Rev. Immunol. 2: 116-26. Los mejores ejemplos caracterizados son CD80 y CD86 (también llamadas B7-1 y B7-2, respectivamente), que se expresan sobre células presentadoras de antígeno y pueden promover la activación de linfocitos T cuando interactúan con CD28, que se expresa constitutivamente sobre la superficie de linfocitos T, o inhibir la activación de linfocitos T cuando interactúan con una CTLA-4, que también se expresa sobre la superficie de linfocitos T. La expresión de CTLA-4 no es constitutiva, pero se regula rápidamente por incremento tras la activación de linfocitos T. Véase, por ejemplo, Masteller y col. (2000), J. Immunol. 164: 5319-27; Hehner y col. (2000), J. Biol. Chem. 275(24): 18160-71; Sharpe y Freeman (2002), Nat. Rev. Immunol. 2: 116-26. Además, se ha informado que numerosos residuos de aminoácidos individuales en ambos dominios similares a Ig de CD80 son importantes para unirse a CTLA-4 y CD28. Peach y col. (1995), J. Biol. Chem. 270(36): 21181-87. CD86 se expresa constitutivamente a bajos niveles y se regula rápidamente por incremento después de la activación, mientras que CD80 se expresa induciblemente después de la activación. Sharpe y Freeman (2002), Nature Reviews Immunology
2: 116-26.
Otra molécula reguladora de linfocitos T, denominada en el presente documento B7RP-1, tiene una plétora de nombres, KIAA0653 (Ishikawa y col. (1998), DNA Res. 5: 169-76), B7h (Swallow y col. (1999), Immunity 11: 423-32), GL50 (Ling y col. (2000), J. Immunol. 164: 1653-57), B7RP-1 (Yoshinaga y col. (1999), Nature 402: 827-32), LICOS (Brodie y col. (2000), Curr. Biol. 10: 333-36), B7-H2 (Wang y col. (2000), Blood 96: 2808-13) e ICOSL (Sharpe y Freeman, arriba). B7RP-1 se expresa en tejidos linfoides periféricos, bazo, ganglios linfáticos, pulmón, timo, esplenocitos y linfocitos B. La interacción de B7RP-1 con linfocitos T puede aumentar la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas. B7RP-1 señaliza linfocitos T mediante el receptor ICOS, que se expresa en linfocitos T activados. Yoshinaga y col. (1999), Nature 402: 827-32; Swallow y col. (1999), Immunity 11: 423-32. B7RP-1 se expresa constitutivamente en líneas de linfocitos B sin estimular, y su expresión puede inducirse en monocitos por interferón y. Aicher y col. (2000), J. Immunol. 164: 4689-96. El desarrollo y la función reguladora de linfocitos T reguladores depende de la interacción entre B7RP-1 y su receptor en linfocitos T. Akbari y col. (2002), Nature Medicine 8(9): 1024-32.
Además, tres otras moléculas reguladoras de linfocitos T, PD-L1 (también llamada B7-H1), PD-L2 (también llamada B7-DC) y B7-H4 (también llamada B7S1 y B7x) pueden inhibir la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas. PD-L1 y PD-L2 actúan por su receptor común, PD-1, que se expresa en linfocitos T, linfocitos B y células mieloides. Freeman y col. (2000), J. Exp. Med. 192(7): 1027-34; Dong y col. (1999), Nature Medicine 5(12): 1365-69; Latchman y col. (2001), Nature Immunology 2(3): 261-68; Tamura y col. (2001), Blood 97(6): 1,809-16; y Tseng y col. (2001), J. Exp. Med. 193(7): 839-45. La expresión de PD-L1 y PD-L2 puede inducirse por interferón y, una citocina generalmente pro-inflamatoria. Latchman y col., arriba. B7-H4 se expresa en linfocitos B, macrófagos y células dendríticas y probablemente actúa mediante BTLA, un receptor inhibidor expresado sobre B y linfocitos T. Watanabe y col. (2003), Nature Immunology 4(7): 670-79; Zang y col. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. 100(18): 10388-92; Sica y col. (2003), Immunity 18: 849-61; Prasad y col. (2003), Immunity 18: 863-73; Carreno y Collins (2003), Trends Immunol. 24(10): 524-27.
Otra proteína adicional similar a butirofilina que desempeña una función coestimuladora en estimular linfocitos T es B7-H3. Chapoval y col. (2001), Nature Immunol. 2(3): 269-74. Al igual que los otros miembros de la familia B7, B7-H3 tiene una secuencia señal, dominios similares a Ig extracelulares, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. El gen B7-H3 humano codifica isoformas con dos o cuatro dominios similares a Ig extracelulares. Sun y col. (2002), J. Immunol. 168: 6294-97. La expresión de B7-H3 puede inducirse en células dendríticas por citocinas inflamatorias. B7-H3 puede estimular la proliferación y la respuesta citotóxica de linfocitos T. B7-H3 actúa mediante un receptor de linfocitos T putativo que es distinto de CD28, CTLA-4, ICOS y PD-1. Chapoval y col., arriba.
Proteínas BTL-II
La existencia de proteínas BTL-II humanas y murinas se ha predicho a partir de la secuencia genómica. Stammers y col. (2000), Immunogenetics 51: 373-82. Sin embargo, estos autores no encontraron pruebas de un dominio transmembrana o citoplásmico en proteínas BTL-II humanas o murinas basándose en el análisis del genoma y no hay pruebas de un transcrito que conecte los exones 1-4 (que codifican un péptido señal, dos dominios similares a Ig y una región de repeticiones de héptadas, respectivamente) con los exones 5 y 6 (que codifican otros dos dominios similares a Ig, respectivamente) en experimentos de PCR diseñados para detectar ARNm de BTL-II murina. Stammers y col., arriba. Basándose en estos hallazgos, BTL-II no estaba ubicada en la subfamilia B7 de proteínas inmunomoduladoras de la superficie celular. Las posteriores propuestas de secuencias a bases de datos públicas por estos mismos autores predicen un ARNm de BTL-II humana de 1368 nucleótidos, que incluye los exones 5 y 6, que codifica una proteína de 455 aminoácidos, que carece de un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico (nº de acceso de NCBI NM_019602, que desvela SEC ID Nº: 1 (secuencia de ADNc de BTL-II humana) y SEC ID Nº: 2 (secuencia de la proteína BTL-II humana)).
Las secuencias de ácidos nucleico y de proteínas de BTL-II de la invención se diferencian de estas secuencias en varios respectos. La secuencia de ADNc codifica una proteína que comprende una secuencia señal, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico, a diferencia de la secuencia de la proteína BTL-II previamente informada, que no contiene dominios transmembrana o citoplásmico. Estas características, junto con el patrón de expresión de BTL-II, ubican BTL-II dentro de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina. La Tabla 1 (más adelante) destaca las diferencias entre la proteína BTL-II de la invención y la secuencia previamente informada. Una proteína BTL-II de la invención se muestra en la línea superior (SEC ID Nº: 4), y la proteína BTL-II informada en el nº de acceso de NCBI NM_019602 se muestra en la línea inferior (SEC ID Nº: 2). De esta comparación es evidente que hay tres desapareamientos entre las dos secuencias (en las posiciones 360, 454 y 455) y esa SEC ID Nº: 4 tiene 27 aminoácidos más, que constituyen la secuencia adicional en el dominio extracelular, además de un dominio transmembrana y uno citoplásmico. Estas secuencias son el 99,3% idénticas según el programa GAP usando los parámetros enumerados anteriormente.
Tabla 1 Comparación de secuencias de la proteína predicha BTL-II humana
Además de una similitud global en la estructura de dominio como se ilustra en la Figura 1, las proteínas de la subfamilia B7 tienen similitudes al nivel de secuencia primaria. Por ejemplo, cuando se alinean por pares usando el programa informático GAP, la secuencia de la proteína BTL-II humana (SEC ID Nº: 4) es similar a otros miembros de la subfamilia B7 como se expresa en la Tabla 2 más adelante.
Tabla 2
Identidad en porcentaje con la proteína BTL-II humana
Porcentaje de similitud con la proteína BTL-II humana
PD-L1 humana (nº de acceso de NCBI NP_054862)
19% 28%
PD-L2 humana (nº de acceso de NCBI NP_079515)
19% 29%
CD80 humana (nº de acceso de NCBI P33681)
26% 33%
CD86 humana (nº de acceso de NCBI P42081)
23% 32%
BTL-II murina
62% 68%
Un experto en la materia se dará cuenta de es más probable que los residuos que están conservados en cualquiera 10 de estos alineamientos desempeñen una función esencial en la estructura o función de BTL-II humana que aquellos
que no están conservados.
En la Tabla 3 (más adelante), la secuencia de aminoácidos de BTL-II humana (SEC ID Nº: 4, línea superior) está alineada con la secuencia de aminoácidos de BTL-II murina (SEC ID Nº: 6; línea inferior). Aminoácidos idénticos 5 están unidos por una línea vertical, y aminoácidos similares tienen uno o dos puntos entre ellos. La identidad en porcentaje entre estas secuencias como se determina por GAP (descrito anteriormente) es aproximadamente el 62%, y el porcentaje de similitud es aproximadamente el 68%. Los residuos se encontraron en dominios similares a IgV o IgC o en el llamado “conjunto I” de los miembros de la superfamilia de inmunoglobulina similar a IgV, o sustituciones conservativas de tales residuos se muestran en negrita. Peach y col., arriba; Harpaz y Chothia (1994),
10 J. Mol. Biol. 238: 528-39. Es probable que tales residuos sean estructuralmente importantes y, por tanto, puedan tener efectos funcionales. La aparición de un número sustancial de tales aminoácidos en el espacio apropiado puede identificar una secuencia como similar a IgV o similar a IgC.
Tabla 3
Un experto en la materia apreciará que es menos probable que los residuos no conservados desempeñen una función en la determinación de la estructura terciaria global de una proteína BTL-II que los residuos conservados, ya que la estructura está más conservada en la evolución que la secuencia. Bork y col. (1994), J. Mol. Biol. 242: 309-20. Como se usa en el presente documento, los “residuos no conservados” son aminoácidos dentro de una proteína BTL-II que no se conservan cuando las secuencias de proteína BTL-II humana y murina se comparan como en la Tabla 3. En proteínas BTL-II codificadas por variantes de corte y empalme, tales residuos producirán posiciones numéricas diferentes dentro de la secuencia. Por ejemplo, el residuo no conservado en la posición 397 de SEC ID Nº: 4 es el mismo residuo no conservado observado en la posición 187 de SEC ID Nº: 8. Un experto en la materia apreciará que la estructura de la proteína puede afectar la función de las proteínas. Además, es menos probable que los aminoácidos no conservados desempeñen una función directa en la función de BTL-II. Por ejemplo, los residuos 4, 6, 25, 26, 35, 36, y muchos otros, no son idénticos ni similares. Por tanto, un experto en la materia se daría cuenta de que sería menos probable que la alteración de tales residuos afectara la función de proteínas BTL-II que la alteración de residuos conservados o similares. Además, es menos probable que las sustituciones conservativas afecten la función de proteínas que las sustituciones no conservativas. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos que son sustituciones conservativas, poco probables que afecten la actividad biológica, incluyen los siguientes: Ala por Ser, Val por Ile, Asp por Glu, Thr por Ser, Ala por Gly, Ala por Thr, Ser por Asn, Ala por Val, Ser por Gly, Tyr por Phe, Ala por Pro, Lys por Arg, Asp por Asn, Leu por Ile, Leu por Val, Ala por Glu, Asp por Gly, y estos cambios a la inversa. Véase, por ejemplo, Neurath y col., The Proteins, Academic Press, Nueva York (1979). Además, un intercambio de un aminoácido dentro de un grupo por otro aminoácido dentro del mismo grupo es una sustitución conservativa en la que los grupos son los siguientes: (1) alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, norleucina y fenilalanina; (2) histidina, arginina, lisina, glutamina y asparagina; (3) aspartato y glutamato; (4) serina, treonina, alanina, tirosina, fenilalanina, triptófano y cisteína; (5) glicina, prolina y alanina;
La proteína BTL-II humana comprende varios dominios reconocibles. Primero está una secuencia señal (codificada por el exón 1), que se extiende del residuo 1 de SEC ID Nº: 4 a una segunda posición de aproximadamente el residuo 22 a 29 de SEC ID Nº: 4. A continuación está un dominio similar a Ig (codificado por el exón 2), que se extiende del residuo x al residuo y, en el que x es del residuo 22 a 32 e y es del residuo 138 a 148 de SEC ID Nº: 4. Siguiendo a éste está otro dominio similar a Ig (codificado por el exón 3) que se extiende del residuo v al residuo w, en el que el residuo v es del residuo 138 a 148 y w es del residuo 232 a 242 de SEC ID Nº: 4. A continuación está una región de repetición de héptadas (codificada por el exón 4) del residuo t al residuo u en la que t es de 234 a 239 y u es del residuo 240 a 247 de SEC ID Nº: 4. Otra región similar a Ig se extiende del residuo r al residuo s, en la que r es del residuo 240 a 247 y s es del residuo 354 a 364 de SEC ID Nº: 4. Una cuarta región similar a Ig se extiende del residuo p al residuo q, en la que p es del residuo 355 a 365 y q es del residuo 452 a 462 de SEC ID Nº: 4. Estos seis primeros dominios de BTL-II humana constituyen la región extracelular de BTL-II humana. La secuencia señal puede, pero no necesita, escindirse del resto de la proteína tras la secreción de la proteína. Un dominio transmembrana se extiende del residuo n al residuo o, en el que n es del residuo 454 a 462 y o es del residuo 473 a 481 de SEC ID Nº: 4. Finalmente, un dominio citoplásmico se extiende del residuo k al residuo m, en el que k es del residuo 474 a 481 y m está en aproximadamente el residuo 482 de SEC ID Nº: 4.
La proteína BTL-II murina comprende un conjunto similar de dominios. Primero está una secuencia señal que empieza en el residuo 1 y que termina en una posición de aproximadamente el residuo 20 a aproximadamente el residuo 27 de SEC ID Nº: 6. Segundo está un dominio similar a Ig que se extiende del residuo x a y, en el que x es del residuo 21 a 27 e y es del residuo 138 a 148 de SEC ID Nº: 6. Tercero está otro dominio similar a Ig del residuo v a w, en el que v es de 139 a 148 y w es de 232 a 242 de SEC ID Nº: 6. Una región de repetición de héptadas se extiende del residuo t a u, en la que t es de 233 a 242 y u es de 238 a 248 de SEC ID Nº: 6. Otra región similar a Ig se extiende del residuo r a s, en la que r es de 239 a 248 y s es de 355 a 365 de SEC ID Nº: 6. Una región similar a Ig final se extiende del residuo p a q, en la que p es de 356 a 365 y q es de 447 a 457 de SEC ID Nº: 6. Estos seis primeros dominios constituyen la región extracelular de BTL-II murina. Un dominio transmembrana se extiende del residuo n a o, en la que n es de 448 a 459 y o es de 470 a 478 de SEC ID Nº: 6. Finalmente, un dominio citoplásmico se extiende del residuo k a m, en el que es de 471 a 478 y m está en aproximadamente 514 de SEC ID Nº: 6.
La presente invención engloba versiones solubles secretadas de BTL-II, además de versiones que comprenden un dominio transmembrana que puede expresarse sobre una superficie celular. La invención incluye adicionalmente proteínas BTL-II codificadas por los ácidos nucleicos BTL-II descritos más adelante. Versiones recombinantes de todas estas proteínas pueden usarse para producir anticuerpos, en el cribado y/o como agentes terapéuticos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la invención engloba proteínas BTL-II que comprenden toda o parte de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y/o SEC ID Nº: 16, proteínas BTL-II de la invención incluyen proteínas que se diferencian de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 por inserción, deleción, alteración o sustitución en la secuencia de aminoácidos primaria. Tales secuencias de variante son al menos el 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o el 99,7% idénticas a SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y/o SEC ID Nº: 16 y no contienen huecos internos de más de 10 aminoácidos cuando se alinean usando GAP con las secuencias anteriormente mencionadas. Ejemplos de tales secuencias incluyen las variantes alélicas humanas que se produce naturalmente de BTL-II mostradas en las Figuras 5b, 6b y 7b. Si tales secuencias de variante contienen sustituciones amino cuando se comparan con SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y/o SEC ID Nº: 16, estas sustituciones pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas. Además, las proteínas BTL-II de variante pueden contener no más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ó 25 inserciones, deleciones o sustituciones de un único aminoácido con respecto a SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y/o SEC ID Nº: 16.
Las proteínas BTL-II de la invención incluyen proteínas codificadas por diversas variantes de corte y empalme del ARNm de BTL-II humano y de ratón. Las secuencias de tales proteínas BTL-II humana de variante se muestran en SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 16. La secuencia de una proteína BTL-II de ratón de variante se muestra en SEC ID Nº: 18. Variantes de corte y empalme humanas carecen de tanto el exón 3 solo como carecen de ambos exones 2 y 3, y la variante de corte y empalme murina desvelada carece del exón 3 solo. Véase SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 17; Figuras 3a, 4a, 5a, 6a, 7a y 9a. Por la invención están englobadas las proteínas codificadas por estas secuencias y secuencias sustancialmente similares, en las que un alineamiento de la secuencia de la proteína con al menos uno del grupo que consiste en SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 usando GAP no comprende huecos de más de 10 aminoácidos. Si estas proteínas contienen sustituciones de aminoácidos con respecto a SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16 y/o SEC ID Nº: 18, tales sustituciones son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas. Las proteínas BTL-II de la invención pueden unirse a un receptor sobre la superficie de un linfocito T y pueden inhibir la proliferación y/o la producción de citocinas por linfocitos T.
Además, la invención proporciona proteínas BTL-II codificadas por ácidos nucleicos que atraviesan las uniones de corte y empalme de los exones 1 y 4 (SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 12) o los exones 2 y 4 (SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 18) y proteínas sustancialmente similares que pueden unirse a un receptor expresado sobre la superficie de linfocitos T y/o pueden inhibir la proliferación y/o la producción de citocinas por linfocitos T. Esto incluye específicamente proteínas BTL-II que comprenden un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o el 100% idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o, SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16. La región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o, SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16 tiene preferentemente al menos 20, 23, 25, 27, 30, 35 ó 40 aminoácidos de longitud. Una secuencia de aminoácidos tal puede tener al menos 150 aminoácidos de longitud y puede ser al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o el 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16. La región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 puede tener al menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 ó 300 aminoácidos.
La invención también proporciona proteínas BTL-II que comprenden un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o el 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 457 de SEC ID Nº: 4 que contiene no más o menos de 2 dominios similares a Ig y que puede unirse a un receptor de la superficie celular expresado sobre linfocitos B o linfocitos T. La secuencia de aminoácidos puede ser al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o el 100% idéntica a los aminoácidos 32 a 242 de SEC ID Nº: 8
o a los aminoácidos 32 a 242 de SEC ID Nº: 12.
En el presente documento también se describen proteínas codificadas por ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que es el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o el 100% idéntico a un polinucleótido que consiste en los nucleótidos 34 a 124 de SEC ID Nº: 11, en las que la región de identidad tiene al menos 60, 70, 80, 90 ó 100 nucleótidos de longitud. Proteínas BTL-II maduras codificadas por tales polinucleótidos pueden, pero no necesitan, carecer de una secuencia señal (que está presente en la versión inmadura de la proteína) que está al menos parcialmente codificada por este polinucleótido. Tales proteínas pueden unirse a un linfocito T y/o pueden inhibir la proliferación y/o producción de citocinas por el linfocito T.
Las proteínas BTL-II pueden glucosilarse a grados variables o no glucosilarse. Como una ilustración, una proteína BTL-II de la invención puede comprender uno o más sitios de glucosilación ligados a N o O, además de aquellos ya encontrados en una proteína que comprende SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16 y/o SEC ID Nº: 18. Tal proteína BTL-II puede tener una semivida más larga in vivo que una proteína sin alterar, ya que puede tener más restos de ácido siálico unidos. Las proteínas BTL-II también incluyen proteínas que comprenden uno cualquiera, dos cualesquiera, tres cualesquiera o los cuatro dominios similares a Ig de una BTL-II humana o murina o dominios sustancialmente similares.
Variantes
Los polipéptidos derivados de cualquier proteína BTL-II por cualquier tipo de alteración (por ejemplo, pero no se limitan a, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos; cambios en el estado de glucosilación del polipéptido; replegamiento o isomerización al cambiar su estructura tridimensional o estado de auto-asociación; y cambios a su asociación con otros polipéptidos o moléculas) también son proteínas BTL-II como se indica en el presente documento. Las proteínas BTL-II proporcionadas por la invención incluyen polipéptidos caracterizados por secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a aquellas de las proteínas BTL-II SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y/o SEC ID Nº: 16 que pueden unirse a un receptor expresado sobre la superficie de linfocitos T y/o pueden inhibir la proliferación de y/o la producción de citocinas de un linfocito T. La región de identidad puede empezar en la posición 30 o superior de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16. Un alineamiento de GAP de una proteína de variante tal con al menos una de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y/o SEC ID Nº: 16 puede no tener huecos internos de más de 10 aminoácidos. La porción de la proteína BTL-II que es sustancialmente similar a SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 puede tener al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200 o al menos 250 aminoácidos de longitud. Las modificaciones en tales proteínas pueden proporcionarse naturalmente o manipularse deliberadamente. Por ejemplo, SEC ID Nº: 11 (Figura 6a) es una variante alélica o polimórfica de SEC ID Nº: 9 (Figura 4a) que contiene cambios de bases en un puñado de posiciones que incluye en las posiciones.
La invención proporciona variantes de la proteína BTL-II que contienen alteraciones de un único o de múltiples aminoácidos que pueden ser inserciones, deleciones o sustituciones de un único aminoácido con respecto a la secuencia de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 en la que la proteína variante BTL-II puede inhibir la proliferación de linfocitos T y/o la producción de citocinas. Las alteraciones pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas. Un experto en la materia es guiado en cuanto a qué aminoácidos pueden ser cambiados sin afectar la función, por ejemplo, por un alineamiento de proteínas BTL-II humanas y de ratón mostrado en la Tabla 3. Es más probable que los aminoácidos que son idénticos o similares en BTL-II humana y de ratón sean importantes para la función que aquellos que no lo son. Además, también es probable que los aminoácidos que están altamente conservados en dominios IgV o IgC (mostrados en negrita en la Tabla 3) sean funcionalmente importantes. Tales variantes alélicas o polimórficas pueden ser valiosas como agentes de diagnóstico para determinar una predisposición a enfermedad. Las variantes alélicas humanas con secuencias que varían de SEC ID Nº: 3 se desvelan en las Figuras 5a, 5b, 6a, 6b, 7a y 7b. Por ejemplo, entre personas normales sin síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino puede existir una cierta relación entre el número que tienen genes BTL-II que codifican ADNc con la secuencia de SEC ID Nº: 3 y el número que tienen genes BTL-II que codifican las mutaciones de la variante alélica marcadas 3-6 en las Figuras 5a, 6a y 7a. La relación de la aparición de estos alelos puede alterarse entre pacientes con síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino de forma que una mayor proporción de estas personas tenga los genes BTL-II con las mutaciones de la variante alélica marcadas 3-6 en las Figuras 5a, 6a y 7a. La existencia de diversas variaciones alélicas en un tejido de paciente puede determinarse, por ejemplo, por amplificación por PCR de un segmento de una molécula de ADN o ARN que atraviesa el sitio polimórfico. Como se menciona anteriormente, es más probable que las sustituciones de aminoácidos conservativas, particularmente en sitios no conservados entre secuencias de proteínas BTL-II humanas y de ratón, preserven la función biológica que las sustituciones no conservativas en sitios conservados. Un experto en la materia también apreciará que es probable que las sustituciones que sustancialmente alteran la estructura terciaria de una proteína BTL-II como se predice por programas tales como, por ejemplo, DALI (Holm y Sander (1993), J. Mol. Biol. 233: 123-38), también alteren la función.
Fragmentos
Incluidas entre las proteínas BTL-II están las proteínas que comprenden fragmentos de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 o fragmentos que son al menos el 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o el 99,7% idénticos a estas secuencias. Preferentemente, tales fragmentos pueden unirse a un receptor expresado sobre la superficie de un linfocito T y tienen al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. Preferentemente, tales fragmentos son solubles en disolución acuosa y comprenden parte o toda la región extracelular de una proteína BTL-II. La proteína que comprende un fragmento tal puede secretarse. Por ejemplo, están englobadas por la invención las proteínas BTL-II que comprenden al menos uno de los dominios de las proteínas BTL-II humanas o murinas descritas anteriormente
o una proteína sustancialmente similar, en la que el dominio tiene al menos una de las propiedades biológicas de proteínas BTL-II. Por ejemplo, tales proteínas pueden inhibir la proliferación y/o la producción de citocinas de linfocitos T.
Además, englobadas por la invención están las siguientes versiones alteradas de las proteínas BTL-II humanas y murinas o proteínas sustancialmente similares: (1) versiones de la proteína BTL-II humana y murina que carecen del segundo dominio similar a Ig (véase la Figura 1) codificado por el exón 3; (2) versiones de una proteína BTL-II humana o murina que carece del primer y segundo dominios similares a Ig codificados por los exones 2 y 3; (3) versiones que carecen del tercer y cuarto dominios similares a Ig codificados por los exones 5 y 6; (4) versiones que carecen de dos cualesquiera de los cuatro dominios similares a Ig; y (5) versiones que carecen de uno cualquiera de los dominios similares a Ig.
Dentro de la invención también están englobados fragmentos inmunogénicos de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 que pueden provocar anticuerpos que se unen específicamente al fragmento. Tales fragmentos tienen preferentemente al menos 10 aminoácidos de longitud y preferentemente comprenden residuos de aminoácidos contiguos de las secuencias mencionadas anteriormente. Los anticuerpos generados inmunizando animales con tales fragmentos pueden ser útiles para la predicción, diagnóstico y tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino, como se trata en cualquier parte en la presente solicitud. Tales fragmentos pueden atravesar regiones de estas proteínas codificadas por uniones de corte y empalme, que pueden tener la ventaja de generación de anticuerpos específicos para proteínas codificadas por variantes de corte y empalme o la proteína de longitud completa. Alternativamente, un anticuerpo contra una parte de BTL-II que está codificada por el exón 3 sólo detectaría las proteínas BTL-II de longitud completa, no proteínas codificadas por ninguna otra variante de corte y empalme, todas las cuales carecen del exón 3.
Proteínas de fusión recombinantes
La invención engloba adicionalmente proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido BTL-II, que es una de las proteínas BTL-II, variantes o fragmentos descritos anteriormente, y al menos otro resto. El otro resto puede ser un polipéptido heterólogo, es decir, un polipéptido distinto de un polipéptido BTL-II. El otro resto también puede ser un resto de no proteína tal como, por ejemplo, un resto de polietilenglicol (PEG) o un resto citotóxico, citostático, luminiscente y/o radiactivo. Se ha mostrado que la unión de PEG aumenta la semivida in vivo de al menos algunas proteínas. Además, los restos citotóxicos, citostáticos, luminiscentes y/o radiactivos se han fusionado con anticuerpos para fines de diagnóstico o terapéuticos, por ejemplo, para localizar, para inhibir la proliferación de o para destruir células con las que los anticuerpos pueden unirse. Similarmente, los polipéptidos BTL-II fusionados con tales restos pueden usarse para localizar, para inhibir la proliferación de o para destruir células con las que puede unirse BTL-II. Entre tales restos citotóxicos, citostáticos, luminiscentes y/o radiactivos están, por ejemplo, derivados de maitansina (tales como DM1), enterotoxinas (tales como una enterotoxina estafilocócica), isótopos de yodo (tales como yodo-125), isótopos de tecnecio (tales como Tc-99m), fluorocromos de cianina (tales como Cy5.5.18), proteínas inactivadoras de ribosomas (tales como bouganina, gelonina o saporina-S6) y caliqueamicina, una sustancia citotóxica que es parte de un producto comercializado con la marca registrada MYLOTARG™ (Wyeth-Ayerst).
Una variedad de polipéptidos heterólogos pueden fusionarse con un polipéptido BTL-II para una variedad de fines tales como, por ejemplo, para aumentar la semivida in vivo de la proteína, para facilitar la identificación, aislamiento y/o purificación de la proteína, para aumentar la actividad de la proteína y para promover la oligomerización de la proteína. Como algunas proteínas de la subfamilia B7 tales como, por ejemplo, CD80, se unen a sus receptores principalmente en forma oligomérica (dimérica en el caso de CD80; véase Collins y col. (2002), Immunity 17: 20110), la oligomerización puede ser muy importante para preservar la actividad biológica de una proteína soluble.
Muchos polipéptidos heterólogos pueden facilitar la identificación y/o purificación de proteínas de fusión recombinantes de las que son una parte. Ejemplos incluyen poliarginina, polihistidina o HAT™ (Clontech), que es una secuencia que se produce naturalmente de residuos de histidina no adyacentes que poseen una alta afinidad para iones metálicos inmovilizados. Las proteínas que comprenden estos polipéptidos heterólogos pueden purificarse, por ejemplo, por cromatografía de afinidad usando níquel inmovilizado o la resina TALON™ (Clontech), que comprende iones cobalto inmovilizados. Véase, por ejemplo, Knol y col. (1996), J. Biol. Chem. 27(26): 1535815366. Los polipéptidos heterólogos que comprenden poliarginina permiten la eficaz purificación por cromatografía de intercambio iónico. Otros polipéptidos heterólogos útiles incluyen, por ejemplo, los péptidos de identificación antigénicos descritos en la patente de EE.UU. nº 5.011.912 y en Hopp y col. (1988), Bio/Technology 6:1204. Un péptido tal es el péptido FLAG®, que es altamente antigénico y proporciona un epítope reversiblemente unido por un anticuerpo monoclonal específico, que permite el rápido ensayo y la fácil purificación de proteína de fusión recombinante expresada. Un hibridoma murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido FLAG® en presencia de ciertos cationes de metales divalentes como se describe en la patente de EE.UU.
5.011.912. La línea celular de hibridoma 4E11 se ha depositado en la Colección americana de cultivos tipo bajo el nº de acceso HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido FLAG® pueden usarse como reactivos de afinidad para recuperar un reactivo de purificación de polipéptido que comprende el péptido FLAG®. Otras marcas de proteína adecuadas y reactivos de afinidad son: 1) aquellos descritos en el sistema GST-Bind™ (Novagen), que utiliza la afinidad de proteínas de fusión glutatión-S-transferasa para glutatión inmovilizado; 2) aquellos descritos en el kit de purificación por afinidad T7-Tag® (Novagen), que utiliza la afinidad de los 11 aminoácidos del extremo amino de la proteína 10 del gen T7 para un anticuerpo monoclonal; o 3) aquellos descritos en el sistema Strep-tag® (Novagen), que utiliza la afinidad de una forma manipulada de estreptavidina para una marca de proteína. Algunas de las marcas de proteína anteriormente mencionadas, además de otras, se describen en Sassenfeld (1990), TIBTECH 8: 88-93, Brewer y col., en Purification and Analysis of Recombinant Proteins, pág. 239-266, Seetharam y Sharma (eds.), Marcel Dekker, Inc. (1991), y Brewer y Sassenfeld, en Protein Purification Applications, pág. 91-111, Harris y Angal (eds.), Press, Inc., Oxford England (1990). Además, las fusiones de dos o más de las marcas descritas anteriormente tales como, por ejemplo, una fusión de una marca FLAG y una polimarca de histidina, pueden fusionarse con una proteína BTL-II de la invención.
Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden otros polipéptidos heterólogos pueden tener otros tipos de ventajas únicas tales como, por ejemplo, una propensión a formar dímeros, trímeros o multímeros de mayor orden, un aumento de la semivida in vivo y/o un aumento de la actividad biológica. Las técnicas para preparar proteínas de fusión son conocidas y se describen, por ejemplo, en el documento WO 99/31241 y en Cosman y col. ((2001). Immunity 14: 123-133). Como una ilustración, un polipéptido heterólogo que comprende una región Fc de un anticuerpo IgG, o una proteína sustancialmente similar, puede fusionarse con un polipéptido BTL-II o fragmento. Una región Fc de un anticuerpo es un polipéptido que comprende dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo de origen humano o animal o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a éstos. Para la discusión véase Hasemann y Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, en William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, segunda edición, 212-213 (1989). También pueden usarse formas truncadas de las regiones Fc que comprenden la región bisagra que promueve la dimerización. Pueden usarse otras porciones de anticuerpos y otros isotipos de inmunoglobulina. Es probable que las proteínas de fusión recombinantes que comprenden regiones Fc de anticuerpos IgG formen dímeros. Las proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de proteínas derivadas de anticuerpos se han descrito por Ashkenazi y col. ((1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-39), Byrn y col. ((1990), Nature 344: 677-70), Hollenbaugh y Aruffo (en Current Protocols in Immunology, supl. 4, pág. 10.19.1
10.19.11 (1992)), Baum y col. ((1994), EMBO J. 13: 3992-4001) y en la patente de EE.UU. nº 5.457.035 y el documento WO 93/10151. En algunas realizaciones, una región Fc alterada puede tener la ventaja de tener una menor afinidad por receptores de Fc en comparación con una región Fc natural. Esto es una ventaja debido a que pueden reducir la lisis de células con las que se unen tales proteínas de fusión recombinantes por células efectoras inmunitarias. El Ejemplo 5 describe la producción de una proteína de fusión que contiene la región extracelular de BTL-II murina fusionada con una región Fc humana. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica esta proteína y su secuencia de aminoácidos se desvelan en SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20, respectivamente.
Como otra alternativa, las proteínas de fusión recombinantes de la invención pueden comprender un polipéptido heterólogo que comprende una cremallera de leucina. Entre las secuencias de cremalleras de leucina conocidas hay secuencias que promueven la dimerización y secuencias que promueven la trimerización. Véase, por ejemplo, Landschulz y col. (1988), Science 240: 1759-64. Las cremalleras de leucina comprenden una repetición de héptadas repetitivas, frecuentemente con cuatro o cinco residuos de leucina intercalados con otros aminoácidos. El uso y la preparación de cremalleras de leucina son muy conocidos en la técnica.
Alternativamente, un polipéptido heterólogo que forma parte de una proteína de fusión recombinante puede ser uno
o más péptido ligadores, que conectan dos o más polipéptidos BTL-II. Generalmente, un péptido ligador es un estiramiento de aminoácidos que sirve para ligar polipéptidos idénticos, similares o diferentes plurales para formar multímeros y proporciona la flexibilidad o rigidez requerida para la función deseada de las porciones ligadas de la proteína. Normalmente, un ligador de péptidos tiene entre aproximadamente 1 y 30 aminoácidos de longitud. Ejemplos de ligadores de péptidos incluyen, pero no se limitan a, --Gly-Gly--, GGGGS (SEC ID Nº: 1), (GGGGS)n (SEC ID Nº: 2), GKSSGSGSESKS (SEC ID Nº: 3), GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID Nº: 4), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEC ID Nº: 5), GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID Nº: 6), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEC ID Nº: 7), o EGKSSGSGSESKEF (SEC ID Nº: 8). Los restos de enlace se describen, por ejemplo, en Huston,
J.
S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-83 (1988), Whitlow, M., y col., Protein Engineering 6: 989-95 (1993) y Newton, D. L. y col., Biochemistry 35: 545-53 (1996). Otros ligadores de péptidos adecuados son aquellos descritos en las patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233.
Además, una proteína de fusión recombinante puede comprender una proteína BTL-II que carece de su secuencia señal normal y en su lugar tiene una secuencia señal heteróloga que la sustituye. La elección de una secuencia señal depende del tipo de células huésped en las que la proteína recombinante vaya a producirse, y una secuencia señal heteróloga puede sustituir la secuencia señal nativa. Ejemplos de secuencias señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen las siguientes: la secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de EE.UU. nº 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 descrito en Cosman y col. ((1984), Nature 312: 768); el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP nº 0 367 566; el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo I descrito en la patente de EE.UU. nº 4.968.607; y el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo II descrito en la patente EP nº 0 460 846.
Ácidos nucleicos BTL-II
La invención engloba ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas BTL-II, fragmentos o fragmentos inmunogénicos descritos anteriormente, que incluyen variantes, fragmentos, proteínas de fusión recombinantes, proteínas de longitud completa, proteínas solubles y proteínas secretadas. Estos ácidos nucleicos son útiles para, entre otros, producir proteínas recombinantes y detectar la presencia de ácidos nucleicos BTL-II en muestras de tejido, por ejemplo, para usos de diagnóstico. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN genómico o ADNc. El ácido nucleico puede comprender un marco de lectura abierto ininterrumpido que codifica una proteína BTL-II de la invención. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN y ARN en forma tanto monocatenaria como bicatenaria, además de las secuencias complementarias correspondientes. Un “ácido nucleico aislado” es un ácido nucleico que ha sido separado de secuencias genéticas adyacentes presentes en el genoma del organismo del que se aisló el ácido nucleico, en el caso de ácidos nucleicos aislados de las fuentes que se producen naturalmente. En el caso de ácidos nucleicos sintetizados químicamente, tal como oligonucleótidos, o enzimáticamente a partir de un molde, tal como productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o ADNc, se entiende que los ácidos nucleicos resultantes de tales procedimientos son ácidos nucleicos aislados. Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico en forma de un fragmento separado
o como un componente de una construcción de ácido nucleico más larga.
Además, la invención engloba fragmentos de un ácido nucleico que codifica una proteína BTL-II que puede servir (1) como sondas para detectar ácidos nucleicos BTL-II por varios procedimientos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, transferencia Southern y Northern, transferencia puntual, hibridaciones de colonias, etc., (2) como cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar ácidos nucleicos BTL-II, o (3) como un medio para regular la expresión de ácidos nucleicos BTL-II, por ejemplo, por inhibición de la expresión con ácidos nucleicos antisentido (incluyendo ácidos nucleicos peptídicos), ribozimas, moléculas formadoras de triple hélice o ARN o ADN interferentes que codifican cualquiera de estos ARN. Los cebadores de PCR pueden comprender, además de secuencias de ácidos nucleicos de BTL-II, otras secuencias tales como sitios de escisión de enzimas de restricción que facilitan el uso del ácido nucleico amplificado. La PCR se describe en las siguientes referencias: Saiki y col. (1988), Science 239: 487-91; PCR Technology, Erlich, ed., Stockton Press, (1989). Como se explica más adelante, la PCR puede ser útil para detectar la expresión en exceso de ARNm de BTL-II, y pueden tomarse cebadores de PCR de diversas partes del gen y también pueden seleccionarse para distinguir entre diferentes variantes de corte y empalme. Los ARN antisentido (y ADN que los codifican), ADN o nucleótidos sintéticos y su uso para regular la expresión son muy conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Izant y Weintraub (1984), Cell 36(4): 1007-15; Izant y Weintraub (1985), Science 229(4711): 345-52; Harel-Bellan y col. (1988), J. Exp. Med. 168(6): 2309-18; Sarin y col. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(20): 7448-51; Zon (1988), Pharm. Res. 5(9): 53949; Harel-Bellan y col. (1988), J. Immunol. 140(7): 2431-35; Marcus-Sekura y col. (1987), Nucleic Acids Res. 15(14): 5749-63; Gambari (2001), Curr. Pharm. Des. 7(17): 1839-62; y Lemaitre y col. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(3): 648-52. Similarmente, los ARN interferentes (y ADN que los codifican) y su uso para inhibir la expresión de genes seleccionados son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, Fjose y col. (2001), Biotechnol. Ann. Rev. 7: 31-57; Bosher y Labouesse (2000), Nature Cell Biol. 2: E31-E36. Además, las ribozimas o ADNzimas pueden elegirse como diana para escindir ARN específicos y, por tanto, usarse para inhibir la expresión génica como se describe en, por ejemplo, Lewin y Hauswirth (2001), Trends Mol. Med. 7(5): 221-28; Menke y Hobom (1997), Mol. Biotechnol. 8(1): 17-33; Norris y col. (2000), Adv. Exp. Med. Biol. 465: 293-301; Sioud (2001), Curr. Mol. Med. 1(5): 575-88; y Santiago y Khachigian (2001), J. Mol. Med. 79(12): 695-706. Los ácidos nucleicos que pueden regular la expresión de BTL-II pueden usarse en estudios in vivo o in vitro de la función de BTL-II o como agentes terapéuticos, opcionalmente como agentes de terapia génica.
La presente invención también incluye ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones moderadamente rigurosas, y más preferentemente condiciones altamente rigurosas, con ácidos nucleicos que codifican las proteínas BTL-II descritas en el presente documento. Tales ácidos nucleicos incluyen SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 15. Preferentemente, tales ácidos nucleicos codifican proteínas que pueden unirse a un receptor sobre la superficie de linfocitos T y/o pueden inhibir la proliferación de linfocitos T y/o la producción de citocinas. Las técnicas de hibridación son muy conocidas en la técnica y se describen por Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11, (1989)) y Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4 (1995)). Condiciones moderadamente rigurosas incluyen hibridación en aproximadamente 50% de formamida, 6 x SSC a una temperatura de aproximadamente 42 a 55ºC y lavado a aproximadamente 60ºC en 0,5 x SSC, 0,1% de SDS. Condiciones altamente rigurosas se definen como las condiciones de hibridación de antes, pero con lavado a aproximadamente 68ºC en 0,2 x SSC, 0,1% SDS. SSPE (1xSSPE es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM y EDTA 1,26 mM, pH 7,4) puede sustituirse por SSC (1xSSC es NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados, preferentemente al menos dos, se realizan durante 15 minutos después de completarse la hibridación.
Debe entenderse que la temperatura de lavado y la concentración de las sales de lavado pueden ajustarse según sea necesario para lograr un grado de rigurosidad deseado aplicando los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad del dúplex, como se conoce para aquellos expertos en la materia y se describe adicionalmente más adelante (véase, por ejemplo, Sambrook y col., arriba). Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias de los ácidos nucleicos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencias óptima. La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipa que tienen menos de 50 pares de bases de longitud debe ser 5 a 10ºC inferior a la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en la que Tm se determina según las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 2(nº de bases de A + T) + 4(nº de bases de G + C). Para híbridos de más de 18 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 81,5 + 16,6(log10 [Na+]) + 0,41(% de G + C) - (600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación ([Na+] para 1 x SSC = 0,165 M). Cada uno de tal ácido nucleico de hibridación tiene una longitud que es al menos 15 nucleótidos (o al menos 18 nucleótidos, o al menos 20, o al menos 25, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 100). Sambrook y col., arriba.
Los ácidos nucleicos BTL-II incluyen ácidos nucleicos que comprenden los siguientes polinucleótidos: (1) toda o un fragmento de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 15, en los que el fragmento codifica una proteína BTL-II que puede unirse a un receptor expresado sobre la superficie de un linfocito T y/o inhibir la proliferación y/o la producción de citocinas de linfocitos T; (2) secuencias al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o el 99,7% idénticas a SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 15, que tienen al menos 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1200, 1400 ó 1600 nucleótidos de longitud y codifican una proteína BTL-II que pueden unirse a un receptor expresado sobre la superficie de linfocitos T y/o inhibir la proliferación y/o la producción de citocinas de linfocitos T; (3) fragmentos de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 15 o secuencias sustancialmente similares que son útiles para detectar
o amplificar ácidos nucleicos que codifican las proteínas BTL-II de la invención o para regular la expresión de ARNm de BTL-II y/o proteínas; (4) ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que es al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o el 99,7% idéntico a un polinucleótido que consiste en los nucleótidos 30 a 130 de SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 11 o al nucleótido 377-477 de SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 15 o en la que la región de identidad tiene al menos 60, 70, 80, 90 ó 100 nucleótidos de longitud y la proteína codificada por el ácido nucleico pueden inhibir la proliferación y/o la producción de citocinas de linfocitos T; y (5) ácidos nucleicos que comprenden al menos 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ó 75 alteración (alteraciones) con respecto a SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 15, en la que una alteración puede ser una inserción, deleción o sustitución de un único nucleótido.
Anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos BTL-II
Los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas BTL-II de la invención, que incluyen variantes, fragmentos y proteínas de fusión recombinantes, están englobados por la invención. Como se usa en el presente documento, la unión específica de un epítope sobre una proteína BTL-II por otra proteína (tal como un anticuerpo) significa que la proteína específicamente unida puede sustituirse de la molécula de proteína BTL-II con la que está unida por otra proteína que comprende el mismo epítope, pero no por otra proteína que no comprenda este epítope. Se conocen numerosos ensayos de unión competitiva en la técnica. Los epítopes pueden comprender sólo aminoácidos contiguos, pero también pueden comprender aminoácidos no contiguos que se aproximan por el plegamiento terciario de una proteína BTL-II. Los epítopes pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Leinonen y col. (2002), Clin. Chem. 48(12): 2208-16; Kroger y col. (2002), Biosens. Bioelectron. 17(11-12): 937-44; Zhu y col. (2001), Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(4): 921-27. La invención también engloba epítopes de las proteínas BTL-II descritas en el presente documento que son útiles para generar anticuerpos, que se denominan en el presente documento fragmentos inmunogénicos. Los fragmentos inmunogénicos tienen preferentemente al menos 10 aminoácidos de longitud y preferentemente comprenden aminoácidos contiguos de SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16 o SEC ID Nº: 18. Tales epítopes pueden atravesar regiones de proteínas BTL-II codificadas por uniones de corte y empalme, que pueden tener la ventaja de unión específica a proteínas codificadas por variantes de corte y empalme específicas.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales y pueden producirse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet y col. (eds.), Plenum Press, New York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988); Kohler y Milstein (1980) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77: 2197; Kozbor y col. (1984), J. Immunol. 133: 3001-3005 (que describe la técnica de hibridomas de linfocitos B); Cole y col., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96 (1985) (que describe la técnica de hibridomas de EBV); Kupor, Immunology, segunda edición, pág. 162-64, W.H. Freeman y Co., New York (1994). En el presente documento también se contemplan líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas BTL-II de la invención. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse por técnicas convencionales. El hibridoma que produce el mAb de la presente invención puede cultivarse in vitro o in vivo. Además, los anticuerpos anti-BTL-II de la invención pueden producirse en otras células cultivadas que incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, mieloma (por ejemplo, NSO, NSI) o WI38, células de levadura, células de insecto y células bacterianas que incluyen, por ejemplo, Eschericha coli. Tales anticuerpos pueden producirse introduciendo ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos más ácidos nucleicos para permitir la expresión de estos ácidos nucleicos en células huésped deseadas. Los anticuerpos pueden entonces producirse cultivando las células en las que se han introducido estos ácidos nucleicos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas.
Alternativamente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos monocatenarios que comprenden un dominio similar a la región variable de la cadena pesada y ligera y, opcionalmente, también uno o más dominios similares a la región constante (patente de EE.UU. nº 4.946.778; Bird y col. (1988), Science 242: 423-26; Huston y col. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83), anticuerpos diméricos o multivalentes (véase, por ejemplo, Lantto y col. (2002), J. Gen. Virol. 83: 2001-05; Hudson y Souriau (2001), Expert Opin. Biol. Ther. 1(5): 845-55), anticuerpos tetraméricos (véase, por ejemplo, Janeway y col., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, quinta edición, Parte II, Cap. 3, Garland Publishing (2001)), anticuerpos quiméricos (Hudson y Souriau, arriba; Boulianne y col. (1984), Nature 312:643-46; Morrison y col. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-55; Takeda y col. (1985), Nature 314: 452-54; Neuberger y col. (1985), Nature 314: 268-70), anticuerpos completamente humanos producidos en un mamífero transgénico diferente (descrito, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 6.150.584) o por selección in vitro (solicitud de patente de EE.UU. nº 2002/0058033) o anticuerpos humanizados (Morrison y col., arriba; Takeda y col., arriba; Boulianne y col., arriba). Además, los anticuerpos pueden “madurarse” por esquemas de selección in vitro dando un anticuerpo con propiedades alteradas tales como, por ejemplo, una mayor afinidad por el epítope con el que se une. Véase, por ejemplo, Jackson y col. (1995), J. Immunol. 154(7): 3310-19; Pini y Bracci (2000), Curr. Protein Pept. Sci. 1(2): 155-69; Ellmark y col. (2002), Mol. Immunol. 39(5-6): 349; O'Connell y col. (2002), J. Mol.
Biol. 321(1): 49-56; Huls y col. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50: 163-71; Hudson y Souriau, arriba; Adams y Schier (1999), J. Immunol. Methods 231(1-2): 249-60; Schmitz y col. (2000), Placenta 21 Suppl. A: S 106-12. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos tales como, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 o fragmentos Fv monocatenarios (scFv) que pueden unirse específicamente a una proteína BTL-II de la invención también están englobados por lo que se indica en el presente documento como un anticuerpo anti-BTL-II. Véase Kupor, arriba, pág. 109-112 y Janeway y col., arriba, para la discusión de fragmentos de Fab y Fv. La invención también engloba anticuerpos antiidiotípicos que se unen específicamente a anticuerpos que se unen específicamente a proteínas BTL-II y que imitan los efectos de proteínas BTL-II. Tales anticuerpos antiidiotípicos encuentran los mismos usos que las proteínas BTL-II. Los procedimientos para generar anticuerpos antiidiotípicos son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kupor y col., arriba, en 371-72. También se contemplan diversos tipos de anticuerpos biespecíficos recombinantes y no recombinantes que pueden unirse específicamente a una proteína BTL-II de la invención y otro epítope. Diversos tipos de anticuerpos biespecíficos y procedimientos para prepararlos se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.474.893, 6.060.285 y 6.106.833.
Los anticuerpos anti-BTL-II pueden ser anticuerpos antagonistas que bloquean una función biológica de BTL-II, tal como la unión de BTL-II a su receptor, o anticuerpos agonistas que promueven una función biológica de BTL-II o imitan la función de BTL-II. Los anticuerpos agonistas pueden incluir anticuerpos antiidiotípicos agonistas que imitan la función de la proteína BTL-II. Ensayos para la función de BTL-II se describen en el presente documento. Los anticuerpos anti-BTL-II que bloquean una función biológica de BTL-II como se determina en tales ensayos son anticuerpos antagonistas como se indica en el presente documento. Los anticuerpos antagonistas pueden bloquear, por ejemplo, la unión de BTL-II a su receptor. Los anticuerpos anti-BTL-II que, cuando se añaden a tales ensayos, promueven o potencian una función biológica de BTL-II son anticuerpos agonistas como se indica en el presente documento. Un anticuerpo anti-BTL-II antagonista puede usarse, por ejemplo, como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria de la mucosa. Además, un anticuerpo agonista contra un receptor de BTL-II puede usarse para reducir una respuesta inmunitaria de la mucosa para tratar, por ejemplo, una enfermedad que se caracteriza por inflamación inapropiada del intestino, tal como enfermedad de Crohn o enfermedad inflamatoria del intestino.
Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en ensayos para detectar la presencia de las proteínas BTL-II de la invención, tanto in vitro como in vivo. Los anticuerpos también pueden emplearse en la purificación de proteínas BTL-II de la invención por cromatografía de inmunoafinidad.
La invención engloba ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención y procedimientos para producir los anticuerpos introduciendo tales ácidos nucleicos en células y cultivando las células que contienen los ácidos nucleicos.
Agonistas y antagonistas de polipéptidos BTL-II
La invención comprende agonistas y antagonistas de BTL-II y procedimientos para cribar y usar agonistas y antagonistas. Los ensayos para la actividad biológica de BTL-II se describen en el presente documento tal como, por ejemplo, ensayos de proliferación celular, ensayos de secreción de citocinas, ensayos de unión y ensayos genéticos que implican la expresión por exceso o por disminución de proteína BTL-II in vivo o in vitro, o una ausencia completa de la expresión de BTL-II in vivo o in vitro. Las moléculas candidatas pueden añadirse a tales ensayos para determinar sus efectos sobre la actividad biológica de proteínas BTL-II. Los antagonistas de BTL-II pueden bloquear, por ejemplo, la interacción de BTL-II con su receptor, que se expresa preferentemente sobre linfocitos B o linfocitos
T. Los antagonistas incluyen anticuerpos antagonistas, y los agonistas incluyen anticuerpos agonistas. Además, otras moléculas relacionadas con anticuerpos que pueden unirse específicamente a las proteínas BTL-II de la invención, tales como afi-cuerpos (Rönnmark y col. (2002), J. Immunol. Methods 261(1-2): 199-211) y los péptidos biológicamente activos descritos en documento WO 00/24782 que pueden unirse específicamente a las proteínas BTL-II de la invención e inhibir la actividad biológica de proteínas BTL-II, están englobadas por la invención. Además, los antagonistas de BTL-II incluyen los ácidos nucleicos descritos anteriormente que son útiles para modular la expresión de proteína BTL-II y/o ARNm tal como, por ejemplo, ARN interferentes (o ADN que los codifican) o ARN o ADN antisentido.
Los antagonistas incluyen adicionalmente proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas in vitro para unirse a BTL-II o su receptor y que pueden, opcionalmente, interferir con la interacción de BTL-II y su receptor. Alternativamente, tales proteínas pueden ser agonistas de BTL-II que promueven o imitan la función biológica de BTL-II. Las proteínas que se unen a BTL-II o su receptor pueden cribarse para su capacidad para interferir con la interacción de BTL-II con su receptor o, alternativamente, puede diseñarse una selección para obtener tales proteínas directamente.
Las proteínas pueden seleccionarse por varios procedimientos tales como, por ejemplo, expresión en fago o expresión de la superficie de una bacteria. Véase, por ejemplo, Parmley y Smith (1989), Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Luzzago y col. (1995), Biotechnol. Annu. Rev. 1: 149-83; Lu y col. (1995), Biotechnology (NY) 13(4): 366
372. En estos procedimientos, cada miembro de una biblioteca de dominios de unión puede expresarse en partículas de fago o células bacterianas individuales, y la bacteria o fago que se une a una proteína de interés puede seleccionarse bajo condiciones elegidas. Los ácidos nucleicos que codifican los dominios de unión seleccionados pueden obtenerse cultivando el fago o bacteria seleccionado y aislando los ácidos nucleicos a partir de ellos.
Alternativamente, una proteína puede seleccionarse totalmente in vitro. Por ejemplo, cada polipéptido individual en una biblioteca de posibles dominios de unión puede unirse a ácidos nucleicos que la codifican, y pueden seleccionarse aquellos que se unen a la proteína de interés bajo condiciones elegidas. Como los polipéptidos están unidos a ácidos nucleicos que los codifican, se facilitan operaciones posteriores, tales como amplificación, clonación
o secuenciación de ácidos nucleicos que codifican dominios de unión eficaces. Se conocen diversos esquemas para tales selecciones en la técnica, que incluyen partículas de anticuerpo-ribosoma-ARNm, expresión de ribosomas, fusiones de ARN-péptido covalentes o fusiones de ADN-ARN-péptidos covalentes. He y Taussig (1997), Nucleic Acids Res. 25(24): 5132-5134; Hanes y Pluckthun (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4937-4942; Roberts y Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 12297-12302; Lohse y Wright (2001), Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 4(2): 198204; Kurz y col. (2000), Nucleic Acids Res. 28(18): E83; Liu y col. (2000), Methods Enzymol. 318: 268-93; Nemoto y col. (1997), FEBS Lett. 414(2): 405-08; documentos US 6.261.804; WO0032823; y WO0034784. Tales proteínas pueden seleccionarse para ser antagonistas o agonistas.
Ensayos para la actividad biológica de proteínas BTL-II
Pueden usarse diversos ensayos para detectar la actividad biológica de una proteína BTL-II y para identificar componentes de unión de BTL-II. Las proteínas BTL-II, receptor(es) de BTL-II y agonistas y/o antagonistas de cualquiera pueden usarse en tales ensayos.
Ensayos para identificar componentes de unión
Un componente de unión para la proteína BTL-II puede identificarse determinando primero qué tipo de células pueden unirse a una proteína BTL-II soluble. Como los receptores conocidos para miembros de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina se expresan todos sobre linfocitos T, tanto constitutivamente (CD28) como después de la activación (CTLA-4, ICOS, PD-1), los linfocitos T pueden probarse para determinar si BTL-II puede unirse a ellos. Debido al patrón de expresión de BTL-II, los linfocitos T aislados de intestino normal e inflamado puede incluirse en tales pruebas. Además, pueden probarse diversos subconjuntos de linfocitos T, que incluyen linfocitos T de memoria, linfocitos T sin tratamiento previo, linfocitos T Q�, linfocitos T yo y linfocitos T en diversos estados de activación.
Tales experimentos pueden realizarse usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína de fusión recombinante de BTL-II que comprende el dominio extracelular de BTL-II murina más una región Fc de un anticuerpo puede usarse para unirse a las células que se prueban. Puede añadirse un anticuerpo fluorescentemente marcado que pueden unirse a la región Fc en la proteína de fusión recombinante. Después de lavar, las células pueden analizarse usando un dispositivo de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) para determinar si BTL-II puede unirse a las células. Un ensayo tal se describe por Chapoval y col. (2001), Nature Immunol. 2(3): 269-74). Otros procedimientos conocidos en la técnica también pueden ser adecuados para determinar si BTL-II se une a poblaciones de células específicas.
Además, receptores conocidos de miembros de la subfamilia B7 se probarán para determinar si BTL-II se une a cualquiera de estas proteínas. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un dominio extracelular de un receptor de un miembro de la subfamilia B7 (tal como, por ejemplo, CTLA-4, un receptor para B7-1 y B7-2) y una región Fc de un anticuerpo pueden prepararse mediante procedimientos similares a aquellos usados para preparar tales proteínas de fusión de BTL-II. Las células pueden transfectarse con formas de longitud completa de ácidos nucleicos BTL-II que codifican proteínas BTL-II que incluyen dominios transmembrana y citoplásmicos que se expresan sobre la superficie celular. La proteína de fusión receptor:Fc que va a probarse puede añadirse a tales células junto con un anticuerpo fluorescentemente marcado que puede unirse a la región Fc. Después de lavar, las células pueden analizarse por FACS para determinar si la proteína de fusión receptor:Fc se une a la proteína BTL-II expresada sobre las células transfectadas. También puede hacerse el experimento inverso cuando se usa la proteína de fusión BTL-II:Fc soluble y la proteína del receptor de longitud completa se introduce y se expresa por transfección. Tales experimentos pueden revelar las interacciones de unión entre proteínas BTL-II y receptores conocidos de otros miembros de la subfamilia B7.
Si BTL-II se une a al menos una variedad de linfocitos T, pero no se une a un receptor conocido, puede usarse una variedad de procedimientos de clonación de la expresión o de purificación de proteínas conocidos en la técnica para identificar el receptor con el que se une BTL-II. Como un ejemplo puede usarse un procedimiento de clonación de la expresión de ADNc de unión a portaobjetos radiactivos. Brevemente, se identifica una fuente de células con la mayor unión a BTL-II soluble, se aísla ARNm y una biblioteca de ADNc se construye en un vector de expresión de mamífero. Células de mamífero se transfectan con conjuntos de ADNc sobre portaobjetos, y después de una incubación apropiada para permitir la expresión, la proteína de fusión BTL-II:Fc soluble se une a las células. La unión específica a células que llevan receptor se detecta por la siguiente serie de etapas: unión de un reactivo anti-Fc radiactivo a la proteína de BTL-II:Fc unida; aplicación de emulsión en película a los portaobjetos; incubación para permitir la exposición; revelado de la película para depositar granos de plata; y detección de los granos por microscopio. Entonces, el clon que expresa el receptor se aísla del conjunto subdividiendo el conjunto y ensayos de unión a portaobjetos iterativos para identificar el único clon del receptor. Tales procedimientos se describen en McMahon y col. (1991), EMBO J. 10: 2821-32.
Cuando se logra la unión a células puede usarse una variedad de medios, tanto por inmunización de animales como tecnología de expresión en fago, para aislar anticuerpos que se unen a BTL-II y alterar su unión a células. Tales anticuerpos pueden usarse para antagonizar la actividad de BTL-II endógena y, por tanto, pueden usarse en ensayos para determinar los efectos de cantidades reducidas eficaces de BTL-II sobre respuestas inmunitarias y en modelos de enfermedad, tales como los modelos de enfermedad inflamatoria del intestino, por ejemplo, aquellos descritos por Cooper y col. ((1993), Lab. Invest. 69(2): 238-49) y Tokoi y col. ((1996), J. Gastroenterol. 31 (2): 18288).
Ensayos para determinar la función de BTL-II
Se ha mostrado que las proteínas de la subfamilia B7 tienen actividad en ensayos “co-estimulantes” de linfocitos T que implican activar linfocitos T por sus receptores de linfocitos T con dosis variables de “antígeno”. La actividad de las proteínas de la subfamilia B7 es más evidente a estimulación de receptores de linfocitos T “sub-óptima”. Véase, por ejemplo, Latchman y col. (2001), Nature Immunol. 2(3): 261-68. Puede usarse un “antígeno sustituto”, tal como anticuerpo anti-CD3£ unido a placa de cultivo de tejido o antígenos presentados por las moléculas de MHC sobre células presentadoras de antígeno irradiadas. Una proteína BTL-II soluble puede añadirse para determinar su efecto sobre la respuesta de linfocitos T al “antígeno”. Pueden medirse diversos parámetros para determinar si los linfocitos T están siendo estimulados o suprimidos. Puede medirse la proliferación celular, expresión de receptores de la superficie celular y niveles de expresión de moléculas inmunomoduladoras (tales como, por ejemplo, interferón y y/o IL-2) al nivel de proteínas y/o ARNm. Tales procedimientos se usan y se describen en, por ejemplo, Fitch y col. en T Cell Subsets in Infectious and Autoimmune Diseases, John Wiley and Sons, pág. 68-85 (1995); Freeman y col. (2000), J. Exp. Med. 192(7): 1027-34; Swallow y col. (1999), Immunity 11:423-32; Hutloff y col. (1999), Nature 397: 263-66; Yoshinaga y col. (1999), Nature 402: 827-32; Latchman y col., arriba. Dado el patrón de expresión de BTL-II, tales ensayos pueden incluir linfocitos T derivados de tejidos mucosos o los ganglios linfáticos que drenan tales tejidos. Además, pueden examinarse linfocitos T sin tratamiento previo y de memoria, linfocitos T CD4+ y CD8+ y linfocitos T que expresan receptores de linfocitos T distintos de receptores de linfocitos T Q�. A partir de tales experimentos puede revelarse si BTL-II puede alterar respuestas de varios tipos distintos de linfocitos T. Tales experimentos se describen más adelante y muestran que una versión soluble de BTL-II puede inhibir la proliferación celular y suprimir la producción de citocinas, que incluyen interferón gamma (IFNy), interleucina 2 (IL2) e interleucina 5 (IL5). Ejemplos 6-10; Figuras 12-17.
Las variaciones de este tipo de experimento incluyen examinar el efecto de incluir formas solubles de proteínas BTL-II en la respuesta co-estimulante encontrada con otras proteínas de la subfamilia B7 solubles o diversos miembros de la familia de TNF que pueden ser co-estimulantes. Esto ayudará a definir si BTL-II puede alterar la coestimulación observada con otras moléculas. Otras variaciones pueden incluir el uso de células de presentación de antígeno no irradiadas de diversos tipos. Esto ayudará a definir los efectos de la adición de una proteína BTL-III soluble sobre la función de células presentadoras de antígeno. En otra variación adicional, los anticuerpos que bloquean la unión de BTL-II a células (véase anteriormente) también pueden introducirse en tales experimentos de coestimulación para determinar los efectos para prevenir la unión.
En otro tipo de experimento, células presentadoras de antígeno (tales como, por ejemplo, células dendríticas o linfocitos B de parches de Peyer o células epiteliales intestinales (CEI)) que expresan BTL-II puede combinarse con linfocitos T (tales como los diversos tipos enumerados anteriormente), y puede medirse uno o más de los parámetros enumerados anteriormente. Los resultados obtenidos con estas células pueden compararse con resultados obtenidos cuando los ARN o ADN interferentes que los codifican, diseñados para reducir la expresión de BTL-II, se introducen en las células presentadoras de antígeno.
Los linfocitos T reguladores actúan suprimiendo respuestas autoinmunitarias y así ayudan, en parte, induciendo la diferenciación o potenciando la función reguladora de linfocitos T reguladores (T reg) en sistemas de modelos de enfermedad inflamatoria del intestino. Los linfocitos T reg incluyen, por ejemplo, linfocitos Tr1 (Cong y col. (2002), J. Immunol. 169(11): 6112-19; Groux y col. (1997), Nature 389: 737-42), linfocitos Th3, linfocitos T reg CD4+Cd25+ (véase, por ejemplo, Maloy y Powrie (2001), Nature Immunology 2(9): 816-22), linfocitos T reg CD4+RbloCD25+ y linfocitos T reg CD8+ (Allez y col. (2002), Gastroenterology 123: 1516-26), entre otros. Por tanto, la evaluación de los efectos de BTL-II en la proliferación y función de linfocitos T reguladores puede ser necesaria para determinar la función precisa de BTL-II in vivo. Por ejemplo, puede medirse la proliferación específica para antígeno de linfocitos T y/o la producción de citocinas por linfocitos T en presencia de linfocitos Tr1. Tales ensayos se describen en Cong y col., arriba. Pueden usarse formas solubles de BTL-II, anticuerpos bloqueantes o inhibición de la expresión de BTL-II usando ARN interferentes para determinar si BTL-II desempeña una función en la proliferación de linfocitos T reguladores o de linfocitos Tr1, el mantenimiento o la capacidad para suprimir la activación por antígeno de otros linfocitos T.
Un subconjunto de linfocitos T, los linfocitos Th3, producen factor de crecimiento transformante � (TGF �) y participa en la tolerancia oral a los antígenos de la mucosa. Véase, por ejemplo, Fukaura y col. (1996), J. Clin. Invest. 98(1): 70-77; Inobe y col. (1998), Eur. J. Immunol. 28: 2780-90. Tales células pueden generarse a partir de linfocitos T sin tratamiento previo por amplio cultivo con antígeno en presencia de TGF �. Las proteínas BTL-II solubles o anticuerpos bloqueantes pueden usarse para preguntar si BTL-II puede alterar la proliferación o función de estas células mediante procedimientos similares a aquellos descritos anteriormente.
Se determinarán los efectos de administrar proteínas BTL-II solubles o anticuerpos antagonistas en sistemas de linfocitos T modelo usando antígenos simples bien definidos tales como, por ejemplo, albúmina de huevo, o antígenos complejos, que incluyen bacterias o virus. Las respuestas de linfocitos T a tales antígenos (incluyendo proliferación y/o producción de moléculas tales como interferón y o IL-2) pueden medirse en presencia y ausencia de proteínas BTL-II o anticuerpos.
Similarmente pueden probarse efectos en sistemas animales. Un foco inicial será en sistemas particularmente relevantes para la respuesta inmunitaria de la mucosa. Esto incluye sistemas modelo en los que el antígeno se alimenta a animales (véase, por ejemplo, Yamashiro y col. (1994), Acta Paediatr. Jpn. 36: 550-56; Jain y col. (1996), Vaccine 14(13):1291-97; Chen y col. (2002), Immunology 105: 171-80), sistemas de enfermedad inflamatoria del intestino tales como en el modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducido por dextrano-sulfato de sodio (Cooper y col. (1993), Lab. Invest. 69(2): 238-49; Tokoi y col. (1996), J. Gastroenterol. 31(2): 182-88), el modelo de enfermedad consuntiva inducida por linfocitos T CD45RBhi/CD4+ (Morrissey y col. (1993), J. Exp. Med. 178: 237-44) y/o sistemas de asma modelo en los que el antígeno se alimenta o instila a las vías respiratorias para provocar una respuesta inmunitaria tal como el modelo murino de asma inducido por albúmina de huevo (Brusselle y col. (1994), Clin. Exp. Allergy 24(1): 73-80). En particular se medirá la magnitud de la respuesta humoral o mediada por célula y se medirá el tipo de citocinas inmunomoduladoras producidas. Tales experimentos pueden revelar si el aumento o la disminución de BTL-II puede ser beneficioso en disminuir respuestas a antígenos, que incluyen autoantígenos, o en aumentar la respuesta a aloantígenos. Los efectos de las proteínas BTL-II o anticuerpos anti-BTL-II también pueden determinarse en otros modelos de enfermedades inflamatorias.
Los ensayos para la proliferación de linfocitos T o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan y col. eds, Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (pág. 3.1-3.19: In vitro assays for mouse lymphocyte function; Capítulo 7: Estudios inmunológicos en seres humanos); Takai y col. (1986), J. Immunol. 137: 3494-3500; Bertagnolli y col. (1990), J. Immunol. 145: 1706-1712; Bertagnolli, y col. (1992),
J. Immunol. 149: 3778-3783; Bowman y col. (1994), J. Immunol. 152: 1756-1761.
Los ensayos para la producción de citocinas y/o proliferación de células del bazo, células de ganglio linfático o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Kruisbeek y Shevach (1994), Polyclonal T cell stimulation, en Current Protocols in Immunology, Coligan y col. eds. vol 1, pág. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto (1991); y Schreiber, (1994), Measurement of mouse and human interferon gamma in Current Protocols in Immunology, Coligan y col. eds. vol 1, pág. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto (1991).
Los ensayos para la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Bottomly y col., 1991, Measurement of human and murine interleukin 2 and interleukin 4, en Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds. vol 1, pág. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto (1991); deVries y col., (1991), J. Exp. Med. 173: 1205-1211; Moreau y col., (1988), Nature 336:690-692; Greenberger y col., (1983), Proc Natl Acad Sci.USA 80: 2931-2938; Nordan, Measurement of mouse and human interleukin 6, en Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds. vol. 1, pág. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto (1991); Smith y col., (1986), Proc Natl Acad Sci USA 83: 1857-1861; Bennett y col., 1991, Measurement of human interleukin 11, en Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds. vol. 1, pág. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto (1991); Ciarletta y col., Measurement of mouse and human Interleukin 9, en Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds. vol. 1, pág. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto (1991).
Los ensayos para respuestas de clones de linfocitos T a antígenos (que identificarán, entre otros, polipéptidos que afectan las interacciones de APC-linfocitos T, además de los efectos de linfocitos T directos midiendo la proliferación y la producción de citocinas) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 3: In vitro assays for mouse lymphocyte function; Capítulo 6: Cytokines and their cellular receptors; Capítulo 7: Immunologic studies in humans) (1991); Weinberger y col., (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 6091-6095; Takai y col., (1986), J. Immunol. 137:3494-3500; Takai y col., (1988), J. Immunol. 140: 508-512.
Los ensayos para las respuestas de inmunoglobulina y cambio de isotipo por linfocitos B (que identificarán, entre otros, polipéptidos que modulan respuestas de anticuerpos dependientes de linfocitos T y que afectan perfiles de Th1/Th2) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Maliszewski (1990), J. Immunol 144: 3028-3033; y Mond y Brunswick, Assays for B cell function: in vitro antibody production, en Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds. vol 1 pág. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto (1994).
Los ensayos de reacción de linfocitos mixtos (MLR) (que identificarán, entre otros, polipéptidos que generan predominantemente respuestas Th1 y CTL) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan y col., eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai y col., (1986), J. Immunol. 137:3494-3500; Takai y col., (1988), J. Immunol. 140: 508-512; Bertagnolli y col., (1992), J. Immunol. 149: 3778-3783.
Los ensayos dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otros, polipéptidos expresados por células dendríticas que activan linfocitos T sin tratamiento previo) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Guery y Adorini (1995), J. Immunol 154: 536-544; Inaba y col. (1991), J Exp Med 173: 549-559; Macatonia y col. (1995), J Immunol 154: 5071-5079; Porgador y Gilboa (1995), J Exp Med 182: 255-260; Nair y col. (1993), J. Virology 67:40624069; Huang y col. (1994), Science 264:961-965; Macatonia y col. (1989), J Exp Med 169:1255-1264; Bhardwaj y col. (1994), J. Clin. Invest. 94:797-807; y Inaba y col. (1990), J Exp Med 172:631-640.
Los ensayos para polipéptidos que influyen en etapas tempranas del compromiso y desarrollo de linfocitos T incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Antica y col. (1994), Blood 84: 111-117; Fine y col., (1994), Cell Immunol 155: 111-122; Galy y col. (1995), Blood 85: 2770-2778; Toki y col. (1991), Proc Natl Acad Sci. USA 88: 7548-7551.
Los ensayos para la actividad de receptor-ligando incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan y col. eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 7.28, Measurement of cellular adhesion under static conditions 7.28.1-7.28.22); Takai y col., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 68646868; Bierer y col., (1988), J. Exp. Med. 168:1145-1156; Rosenstein y col., (1989), J. Exp. Med. 169: 149-160; Stoltenborg y col., (1994), J. Immunol. Methods 175: 59-68; Stitt y col., (1995), Cell 80: 661-670.
Ensayo genético para la función que utiliza animales transgénicos
Se proporcionan animales transgénicos, preferentemente ratones, que tienen múltiples copias de el (los) gen(es) correspondiente(s) a los ácidos nucleicos BTL-II desvelados en el presente documento, preferentemente producidos por transformación de células con construcciones genéticas que se mantienen establemente dentro de las células transformadas y su progenie. También se proporcionan animales transgénicos que tienen regiones de control genético modificadas que aumentan o reducen los niveles de expresión génica, o que cambian los patrones temporales o espaciales de expresión génica (véase la patente europea nº 649 464 B1). Además, se proporcionan organismos en los que el gen BTL-II se ha inactivado parcialmente o completamente mediante inserción de secuencias externas en el gen correspondiente o mediante deleción de todo o parte del gen correspondiente. La inactivación de genes parcial o completa puede llevarse a cabo mediante inserción, preferentemente seguido de escisión imprecisa, de elementos transposables (Plasterk (1992), Bioessays 14(9): 629-633; Zwaal y col. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(16): 7431-7435; Clark y col., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(2): 719-722), o mediante recombinación homóloga, preferentemente detectada por estrategias de selección genética positivas/negativas (Mansour y col. (1988), Nature 336: 348-352; patentes de EE.UU. nº 5.464.764; 5.487.992; 5.627.059; 5.631.153; 5.614.396; 5.616.491; y 5.679.523). Como alternativa, la expresión del gen BTL-II puede inhibirse en un animal transgénico o no transgénico por introducción de un ARN interferente, ARN antisentido o una ribozima, que puede codificarse por ADN introducido en un animal transgénico. Los fenotipos de tales organismos pueden elucidar la(s) función (funciones) in vivo del gen BTL-II. Por ejemplo, un aumento de la propensión (en comparación con animales naturales) en un animal transgénico que no expresa proteína BTL-II para presentar síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino en respuesta a la alimentación de dextrano-sulfato de sodio puede indicar que BTL-II normalmente disminuye la inflamación en el intestino. Alternativamente, los animales transgénicos pueden expresar en exceso BTL-II. Los fenotipos de tales animales transgénicos también pueden dar pistas en cuanto a la función in vivo de proteínas BTL-II.
Usos de las proteínas, anticuerpos, antagonistas y agonistas de la invención
El sistema inmunitario de la mucosa opera dentro de un conjunto de estructuras anatómicas especializadas, las membranas mucosas, y la respuesta inmunitaria que genera tiene propiedades que la distinguen de una respuesta inmunitaria generada en otros compartimentos anatómicos del cuerpo. Las membranas mucosas son precisamente uno de los varios compartimentos anatómicos distintos que también incluyen los ganglios linfáticos periféricos y el bazo, las cavidades del cuerpo, es decir, el peritoneo y la pleura, y la piel, en los que el sistema inmunitario es activo. Las superficies de la mucosa se encuentran en los pulmones, el intestino, los ojos, la nariz, la boca, la garganta, el útero y la vagina. Una superficie de la mucosa es una delgada lámina o capa de tejido flexible que sirve de cubierta o sobre de una estructura corporal, tal como el revestimiento de una cavidad del cuerpo, una partición o septo, o una conexión entre dos estructuras. Como las superficies mucosas son la vía de entrada para la gran mayoría de los agentes infecciosos, un adyuvante que puede promover una respuesta inmunitaria de la mucosa es particularmente deseable. Janeway y col., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5ª edición, parte IV, Cap. 10, Garland Publishing, Nueva York y Londres (2001). Enfermedades infecciosas que normalmente entran por las superficies de la mucosa tales como, por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae frecuentemente generan sólo una débil respuesta inmunitaria de la mucosa. Russell y col. (1999), 42(1): 58-63.
El intestino es único en varias formas. Revistiendo el intestino están varias formas especializadas de tejido linfoide conocido en conjunto como tejido linfoide asociado al intestino (GALT) que incluye: amígdalas y adenoides, que juntos forman el anillo de Waldyer en la parte posterior de la boca; parches de Peyer en el intestino delgado; el apéndice; y folículos linfoides solitarios en el intestino grueso y el recto. La activación de un linfocito por un encuentro con un antígeno extraño en el intestino puede conducir a la preparación de una respuesta inmunitaria adaptativa al antígeno por el sistema inmunitario de la mucosa. El linfocito activado puede entrar en el sistema linfático y, de ahí, a la circulación sanguínea. La circulación sanguínea puede repartir linfocitos activados a los sitios de la mucosa por el cuerpo, que pueden ser reconocidos por los linfocitos por medio de moléculas tales como la adresina mucosa MAdCAM-1, que se expresa en tejido mucoso. Janeway y col., arriba. El tipo de anticuerpo dominante producido por el intestino es IgA que, tras la expresión, se encuentra principalmente en la capa de moco que recubre el epitelio del intestino. Además, varios tipos distintos de linfocitos T se encuentran en el intestino. Janeway y col., arriba.
La introducción de un antígeno extraño en el intestino normalmente conduce a tolerancia inmunológica, pero puede conducir a una respuesta inmunitaria específica. El intestino normalmente recibe y tolera (en un sentido inmunológico) una amplia variedad de antígenos extraños, es decir, alimento y los microorganismos comensales que residen en el intestino. La alimentación de una proteína extraña específica puede conducir a un estado de insensibilidad específica a esa proteína conocida como tolerancia oral de forma que, después de la inyección de la proteína, incluso en presencia de un adyuvante, no produzca respuesta de anticuerpos. Este fenómeno puede implicar al bazo y los ganglios linfáticos, además de al sistema inmunitario de la mucosa. Véase Gutgemann y col. (1998), Immunity 8: 667-73. Sin embargo, patógenos entéricos tales como, por ejemplo, Salmonella, Yersinia, o Entamoeba histolytica pueden provocar una respuesta inmunitaria local, o incluso sistémica. No se entienden completamente los factores que controlan si la introducción de un antígeno extraño en el intestino provoca o no una respuesta inmunitaria. Janeway y col., arriba, en la Parte V, Cap. 14.
Muchas vacunas emplean adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria al antígeno. Un adyuvante refuerza o amplia la especificidad de una respuesta inmunitaria a un antígeno. La respuesta inmunitaria puede incluir un aumento en el título de anticuerpos o un aumento en el número de linfocitos T reactivos con antígeno. Existen en la materia procedimientos para medir tales parámetros. Véase, por ejemplo, Zigterman y col. (1988), J. Immunol. Methods 106(1): 101-07. No se entienden completamente el (los) mecanismo(s) por el (los) que los adyuvantes potencian una respuesta inmunitaria, pero su uso puede ser esencial. Las pocas vacunas existentes pueden provocar una respuesta inmunitaria de la mucosa robusta al antígeno seleccionado.
La invención engloba un agonista de BTL-II para su uso para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno, en el que el agonista de BTL-II se administra junto con el antígeno y el agonista de BTL-II es un anticuerpo. Opcionalmente, el antagonista de la proteína BTL-II y el antígeno pueden administrarse directamente a una superficie de la mucosa, tal como por vía oral, nasalmente, vaginalmente, gástricamente o rectalmente, o por inhalación. Por ejemplo, se ha informado que la administración nasal es más eficaz que la administración vaginal en inducir una respuesta inmunitaria duradera en al menos un caso. Russell (2002), Am. J. Reprod. Immunol. 47(5): 265-68. Alternativamente, el agonista de BTL-II y/o el antígeno pueden inyectarse, por ejemplo, subcutáneamente, intravenosamente, intramuscularmente, intraarterialmente o intraperitonealmente. En algunas realizaciones, un anticuerpo para BTL-II puede inyectarse y un antígeno puede administrarse directamente a una superficie de la mucosa.
Antígenos apropiados para poner en práctica la invención incluyen todo o parte de cualquier agente infeccioso o agente que sea similar a un agente infeccioso. Los agentes infecciosos pueden incluir virus vivos o muertos, bacterias y eucariotas infecciosos tales como amebas, flagelados o helmintos. Un agente que es similar a un agente infeccioso tal puede ser, por ejemplo, un virus que es análogo a un virus que puede infectar el mamífero que se vacuna, pero no puede, por si mismo, infectar el mamífero que se vacuna. Un ejemplo de éste es el virus de la variolovacuna (que puede producir enfermedad en vacas pero no en personas) usado por Jenner para producir una vacuna contra la viruela, un virus similar que produce enfermedad en seres humanos. Janeway y col., arriba, Parte V, Cap. 14. La Tabla 4 indica ejemplos específicos de antígenos que podrían usarse para poner en práctica la invención.
Tabla 4
Categoría de antígeno
Algunos ejemplos específicos de antígenos representativos
Virus
Rotavirus; fiebre aftosa; gripe, que incluye gripe A y B; paragripe; especies de Herpes (Herpes simple, virus de Epstein-Barr, viruela del pollo, seudorrabia, citomegalovirus); rabia; poliomielitis; hepatitis A; hepatitis B; hepatitis C; hepatitis E; sarampión; moquillo; encefalomielitis equina venezolana; virus de la leucemia felina; reovirus; virus respiratorio sincitial; virus respiratorio sincitial bovino; virus de la fiebre de Lassa; virus de tumor de polioma; parvovirus; parvovirus canino; virus del papiloma; encefalitis transmitida por garrapatas; peste bovina; especies de rinovirus humano; especies de enterovirus; virus de Mengo; paramixovirus; virus de la bronquitis infecciosa aviar; HTLV 1; VIH-1; VIH-2; LCMV (virus de la coriomeningitis linfocítica); adenovirus; togavirus (rubéola, fiebre amarilla, fiebre del dengue); coronavirus
Bacterias
Bordetella pertussis; Brucella abortis; Escherichia coli; especies de Salmonella que incluyen Salmonella typhi; estreptococos; especies de Vibrio (V. cholera, V. parahaemolyticus); especies de Shigella; especies de Pseudomonas; especies de Brucella; especies de Mycobacteria (tuberculosis, avium, BCG, lepra); pneumococos; estafilococos; especies de Enterobacter; Rochalimaea henselae; especies de Pasteurella (P. haemolytica, P. multocida); especies de Chlamydia (C. trachomatis, C. psittaci, linfogranuloma venéreo); sífilis (Treponema pallidum); especies de Haemophilus; especies de Mycoplasma; enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi); legionelosis; botulismo (Clostridium botulinum); Corynebacterium diphtheriae; Yersinia entercolitica
Infecciones por Ricketsia
Fiebre exantemática de las Montañas rocosas; tifus; especies de Ehrlichia
Parásitos y protozoos
Malaria (Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae); esquistosomas; tripanosomas; especies de Leishmania; nematodos filariales; tricomoniasis; sarcosporidiosis; especies de Taenia (T. saginata, T. solium); Toxoplasma gondii; triquinelosis (Trichinella spiralis); coccidiosis (especies de Eimeria); helmintos que incluyen especies de Ascarus
Hongos
Cryptococcus neoformans; Candida albicans; Aspergillus fumigatus; coccidioidomicosis
Proteínas recombinantes
Herpes simple; virus de Epstein-Barr; hepatitis B; seudorrabia; flavivirus (dengue, fiebre amarilla); Neisseria gonorrhoeae; malaria: proteína circumsporozoíto, proteína merozoíto; proteína de antígeno de superficie de los tripanosomas; pertussis; alfavirus; adenovirus
Proteínas
Toxoide diftérico; toxoide tetánico; proteína de la membrana externa (OMP) meningocócica; proteína M estreptocócica; hepatitis B; hemaglutinina de la gripe; antígeno de cáncer; antígenos de tumor; toxinas; exotoxinas; neurotoxinas; citocina y receptores de citocina; monocinas y receptor de monocina
Péptidos sintéticos
Malaria; gripe; virus de la fiebre aftosa; hepatitis B; hepatitis C
Polisacáridos
Polisacárido neumocócico; poliribosil-ribitolfosfato (PRP) de Haemophilus influenzae; Neisseria meningitidis; Pseudomonas aeruginosa; Klebsiella pneumoniae
Oligosacárido
Neumocócico
Alternativamente, las proteínas BTL-II solubles pueden usarse para promover la tolerancia a un antígeno que participa en una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. Por ejemplo, la encefalomielitis autoinmunitaria 5 experimental (EAE), una afección similar en muchos respectos a la esclerosis múltiple, puede inducirse en roedores mediante inyección de, por ejemplo, diversos epítopes de proteína básica de la mielina o glucoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG). La EAE inducida por MOG puede mejorarse, en algunos casos, por la alimentación previa de pequeñas porciones de MOG o butirofilina. Stefferl y col. (2000), J. Immunol. 165: 2859-65. Las proteínas BTL-II solubles pueden co-administrarse con un antígeno que se sabe que es elegido como diana en
10 una enfermedad autoinmunitaria para promover tolerancia al antígeno y así mejorar los síntomas de la enfermedad autoinmunitaria. Opcionalmente, el antígeno puede administrarse directamente a una superficie de la mucosa, por ejemplo, nasalmente.
Enfermedades inflamatorias del intestino, que incluyen enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, incluyen inflamación
15 crónica del tracto gastrointestinal, posiblemente debido a una respuesta inmunitaria anormalmente potenciada a antígenos de la flora del intestino normal. Ambas enfermedades tienen probablemente al menos alguna base genética ya que las manifestaciones tienden a agruparse en familias y pueden asociarse a algunos marcadores genéticos. Por ejemplo, los ratones que no expresan el gen de resistencia a múltiples fármacos (mdr1a) desarrollan espontáneamente colitis. Panwala y col. (1998), J. Immunol. 161: 5733-44. La aparición de tanto enfermedad de
20 Crohn como colitis ulcerosa también está probablemente influida por factores medioambientales debido a que el aumento de la manifestación se observa entre poblaciones urbanizadas. Por tanto, tales enfermedades no se producen en ausencia de flora del intestino normal.
La enfermedad de Crohn implica una inflamación anormal de cualquier porción del tubo digestivo desde la boca
25 hasta el ano, aunque en la mayoría de los pacientes la inflamación anormal está confinada a las regiones ileocólica, del intestino delgado y colónica-anorrectal. Normalmente, la inflamación es discontinua. Síntomas comunes incluyen dolor abdominal, anorexia, pérdida de peso, fiebre, diarrea, saciedad y/o dolor con la palpación en el cuadrante inferior derecho del abdomen, estreñimiento, vómitos y molestia y secreción perianal. Otros posibles síntomas incluyen artritis periférica, retraso del crecimiento, episcleritis, estomatitis aftosa, eritema nodoso, piodermia gangrenosa, cálculos renales, dilución urinaria alterada y alcalinización, mal absorción y cálculos biliares, entre otros. Véase, por ejemplo, Strober y col., Medical Immunology, 10ª edición, Sección III, Cap. 35 (2001); Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17ª edición, Sección 3, Cap. 31 (1999). Los macrófagos aislados de pacientes con enfermedad de Crohn producen cantidades elevadas de IL-12, IFNy, TNFQ, y otras citocinas inflamatorias.
La colitis ulcerosa, aunque algunas veces es difícil de distinguir de la enfermedad de Crohn, es distinta de la enfermedad de Crohn en varios respectos. Primero, generalmente está limitada al colon mientras que la enfermedad de Crohn puede producirse en todo el tubo digestivo. Segundo, la colitis ulcerosa implica principalmente la inflamación de sólo las capas superficiales del intestino, a diferencia de la enfermedad de Crohn, en la que la inflamación puede penetrar a través de la pared del intestino u otra localización en el tubo digestivo. Finalmente, la colitis ulcerosa implica normalmente un área continua de inflamación, en vez de los sitios de inflamación discontinuos típicos de la enfermedad de Crohn. Al igual que la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa se encuentra principalmente en áreas urbanas. Por tanto, los factores genéticos desempeñan probablemente una función en la colitis ulcerosa, ya que hay una agregación familiar de casos. Se observan autoanticuerpos en pacientes con colitis ulcerosa más frecuentemente que en pacientes con enfermedad de Crohn. Los autoanticuerpos están frecuentemente dirigidos a componentes de las células epiteliales colónicas. Entre los más comunes están los anticuerpos citoplásmicos antineutrófilos con especificidades para catalasa, Q-enolasa y lactoferrina. En algunos casos, tales anticuerpos reaccionan de forma cruzada con microorganismos colónicos.
Los síntomas de la colitis ulcerosa son variables. Pueden incluir diarrea, tenesmo, calambres abdominales, sangre y moco en las heces, fiebre y sangrado rectal. También puede producirse megacolon tóxico, una afección potencialmente mortal en la que el colon se dilata más allá de aproximadamente 6 centímetros y puede perder su tono muscular y/o perforarse. Otros síntomas que pueden acompañar a la colitis ulcerosa incluyen artritis periférica, espondilitis anquilosante, sacroilitis, uveítis anterior, eritema nodoso, piodermia gangrenosa, episcleritis, hepatitis autoinmune, colangitis esclerosante primaria, cirrosis y crecimiento y desarrollo retardado en niños.
Los anticuerpos o proteínas de unión seleccionados in vitro que se unen específicamente a proteínas BTL-II pueden usarse para diagnosticar o predecir la aparición de enfermedad inflamatoria del intestino. Como se ilustra en el Ejemplo 4 más adelante, BTL-II se expresa en exceso en el intestino antes de la aparición de los síntomas y durante la fase sintomática en un modelo de ratón de enfermedad inflamatoria del intestino. Por tanto, la expresión en exceso de BTL-II puede indicar la existencia de enfermedad inflamatoria del intestino y puede predecir su aparición. Los anticuerpos anti-BTL-II pueden usarse para detectar la expresión en exceso de BTL-II ensayando una muestra de tejido del intestino de un paciente usando un ensayo de ELISA u otros ensayos basados en inmunitarios conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Reen (1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), en Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32: 461-466. La expresión en exceso también puede detectarse por procedimientos basados en ácido nucleico para medir la expresión de ARNm de BTL-II tal como, por ejemplo, transcripción inversa más PCR (RT-PCR), entre otros ensayos de expresión de ARNm conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Murphy y col. (1990), Biochemistry 29(45): 10351-56.
En otra realización, las proteínas BTL-II solubles de la invención pueden usarse para tratar una enfermedad inflamatoria del intestino. Una proteína BTL-II soluble pueden unirse a un receptor específico expresado sobre un linfocito B o un linfocito T, permitiendo así la regulación por disminución de una respuesta inmunitaria. Una regulación por disminución tal puede prevenir, por ejemplo, la activación de un macrófago o un linfocito B por un linfocito T CD4+ o prevenir la activación de un linfocito T por un antígeno. Alternativamente, una regulación por disminución tal puede hacer que un linfocito T se vuelva anérgico cuando se encuentra con un antígeno con el que su receptor de linfocitos T puede unirse específicamente.
Los anticuerpos o las proteínas de unión seleccionados in vitro que se unen específicamente a BTL-II también se usan como reactivos de diagnóstico para identificar pacientes con enfermedad inflamatoria del intestino o en riesgo de desarrollar enfermedad inflamatoria del intestino. Como BTL-II se expresa en exceso antes de la aparición de y durante los síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino en un sistema de modelo de ratón (Ejemplo 4), un nivel anormalmente alto de expresión de BTL-II puede indicar la presencia de una enfermedad inflamatoria en el intestino o un alto riesgo de desarrollar una enfermedad inflamatoria en el intestino.
Además, las proteínas BTL-II solubles pueden ser útiles en situaciones en las que se desea la modulación por disminución de una respuesta inmunitaria, tal como trasplante (Manilay y col., 1998, Curr. Opin. Immunol. 10:532538), enfermedad de injerto frente a huésped, rechazo de injerto, enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, terapia génica (Hackett y col., 2000, Curr. Opin. Mol. Therap. 2: 376-382) y similares. Por ejemplo, una proteína BTL-II soluble puede administrarse antes de, en aproximadamente el mismo momento (o tanto poco antes como poco después) o simultáneamente con la administración de un vector de terapia génica a un mamífero, trasplante, o como sea de otro modo apropiado para la inmunosupresión deseada. También es apropiado para un tratamiento tal un anticuerpo antiidiotípico que imita la función de BTL-II.
Un anticuerpo agonista para BTL-II, una proteína BTL-II soluble o un anticuerpo antiidiotípico pueden administrarse a un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria con el fin de reducir el número de autoanticuerpos detectables para reducir la activación de células efectoras inmunitarias y/o para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. Las enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias incluyen todas las afecciones en las que los propios tejidos del paciente están sometidos a efectos perjudiciales producidos por el sistema inmunitario del paciente. Tales efectos pueden mediarse por autoanticuerpos y/o por la activación de células efectoras inmunitarias, entre otras posibilidades. Aunque las causas de las enfermedades autoinmunitarias y inflamatorias no están normalmente claras, en algunos casos se ha establecido una correlación entre la existencia de diversos tipos de infecciones y diversas enfermedades autoinmunitarias y es un tema recurrente de discusión en la bibliografía científica. Véase, por ejemplo, Corapcioglu y col. (2002), Thyroid 12: 613-17; Sewell y col. (2002), Immunol. Lett. 82: 101-10; Rose (1998), Semin. Immunol. 10(1): 5-13; Matsiota-Bernard (1996), Clin. Exp. Immunol. 104: 228-35; y McMurray y Elbourne (1997), Semin. Artritis Rheum. 26: 690-701.
Un experto en la materia apreciará que los síntomas de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias son extremadamente diversos y pueden depender de qué tejidos sean elegidos como diana por el sistema inmunitario del paciente. Las enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias pueden ser específicas para órgano o sistémicas. Las enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias incluyen, por ejemplo, artritis, enfermedad de Addison, diabetes mellitus dependiente de insulina (diabetes mellitus de tipo I), asma, síndromes de endocrinopatía poliglandular, lupus eritematoso sistémico, hepatitis activa crónica, diversas formas de tiroiditis (incluyendo tiroiditis de Hashimoto, síndromes de tiroiditis transitoria y enfermedad de Graves), adenohipofisitis linfocítica, insuficiencia ovárica prematura, hipoparatiroidismo idiopático, anemia perniciosa, glomerulonefritis, neutropenia autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, esclerosis múltiple, vitíligo, miastenia grave, artritis reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjogren primario, polimiositis, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), psoriasis, artritis psoriásica, dermatitis, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, pénfigo vulgar, fiebre reumática aguda, crioglobulinemia esencial mixta y anemia hemolítica autoinmune caliente, entre muchas otras.
Vectores y células huésped
La presente invención también proporciona vectores que contienen los ácidos nucleicos de la invención, además de células huésped transformadas con tales vectores. Cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención puede estar contenido en un vector, que generalmente incluye un marcador de selección y un origen de replicación, para la propagación en un huésped. Los vectores incluyen adicionalmente secuencias reguladoras de la transcripción o de la traducción adecuadas tales como aquellas derivadas de genes de mamífero, microbianos, víricos o de insecto operativamente ligados al ácido nucleico BTL-II. Ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o potenciadores de la transcripción, sitios de unión a ARNm ribosómico y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos están operativamente ligadas cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con el ADN que codifica la proteína diana. Por tanto, una secuencia de nucleótidos del promotor está operativamente ligado a una secuencia de ácidos nucleicos de BTL-II si la secuencia de nucleótidos del promotor dirige la transcripción de la secuencia de BTL-II.
La selección de vectores adecuados para la clonación de ácidos nucleicos BTL-II que codifica las proteínas BTL-II diana de la presente invención dependerá de la célula huésped en la que se transformará el vector y, si procede, la célula huésped a partir de la cual va a expresarse el polipéptido diana. Las células huésped adecuadas para la expresión de proteínas BTL-II incluyen células procariotas, de levadura, de insecto y eucariotas superiores, cada una de las cuales se trata más adelante.
Las proteínas BTL-II que van a expresarse en tales células huésped también pueden ser proteínas de fusión que incluyen regiones de proteínas heterólogas. Como se ha tratado anteriormente, tales regiones pueden incluirse para permitir, por ejemplo, la secreción, estabilidad mejorada, purificación facilitada, elección de diana u oligomerización de la proteína BTL-II. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal apropiada puede incorporarse en un vector de expresión. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal (líder secretor) puede fusionarse en marco con una secuencia de BTL-II de manera que BTL-II se traduzca como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en la célula huésped prevista puede promover la secreción extracelular de la proteína BTL-II. Un péptido señal heterólogo puede sustituir la secuencia señal nativa. Ejemplos de péptidos señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de EE.UU. nº 4.965.195, la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 descrito en Cosman y col. ((1984), Nature 312: 768); el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP nº 0 367 566; el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo I descrito en la patente de EE.UU. nº 4.968.607; el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo II descrito en la patente EP nº 0 460 846; la secuencia señal de IgK humana (que es METDTLLLWVLLLWVPGSTG); y la secuencia señal de la hormona de crecimiento humana (que es MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA). Preferentemente, la secuencia señal se escindirá de la proteína BTL-II tras la secreción de la proteína BTL-II de la célula. Otras secuencias señal que pueden usarse en la puesta en práctica de la invención incluyen el factor Q de levadura y el líder de melatina de abeja melífera en células de insecto Sf9. Brake (1989), Biotechnology 13: 269-280; Homa y col. (1995), Protein Exp. Purif. 6141-148; Reavy y col. (2000), Protein Exp. Purif. 6: 221-228.
Células huésped adecuadas para la expresión de las proteínas de la invención incluyen células procariotas, de levadura y eucariotas superiores. Huéspedes procariotas adecuados que van a usarse para la expresión de estos polipéptidos incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus y Salmonella, además de miembros de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Para la expresión en células procariotas, por ejemplo, en
E. coli, la molécula de polinucleótido que codifica la proteína BTL-II incluye preferentemente un residuo de metionina del extremo N para facilitar la expresión del polipéptido recombinante. La Met del extremo N puede escindirse opcionalmente del polipéptido expresado.
Vectores de expresión para su uso en huéspedes celulares generalmente comprenden uno o más genes del marcador de selección fenotípico. Tales genes codifican, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requisito auxotrófico. Una amplia variedad de tales vectores están fácilmente disponibles de fuentes comerciales. Ejemplos incluyen vectores pGEM (Promega), vectores pSPORT y vectores pPROEX (InVitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), vectores Bluescript (Stratagene) y vectores pQE (Qiagen).
BTL-II también puede expresarse en células huésped de levadura a partir de géneros que incluyen Saccharomyces, Pichia y Kluveromyces. Huéspedes de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pastoris. Los vectores de levadura contendrán frecuentemente una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2μ, una secuencia autónomamente replicante (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen del marcador de selección. También pueden usarse vectores replicables en tanto levadura como E. coli (llamados vectores lanzadera). Además de las características anteriormente mencionadas de los vectores de levadura, un vector lanzadera también incluirá secuencias para la replicación y selección en E. coli. La secreción directa de los polipéptidos diana expresados en huéspedes de levadura puede llevarse a cabo por la inclusión de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia conductora del factor Q de levadura en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica BTL-II. Brake (1989), Biotechnology 13: 269
280.
Los sistemas de cultivo de células huésped de insecto también pueden usarse para la expresión de proteínas BTL-II. Las proteínas de la invención se expresan preferentemente usando un sistema de expresión de baculovirus como se describe, por ejemplo, en la revisión por Luckow y Summers ((1988), Biotechnology 6: 47).
Las proteínas BTL-II de la invención pueden expresarse en células huésped de mamífero. Ejemplos no limitantes de de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono (Gluzman y col. (1981), Cell 23: 175-182), células de ovario de hámster chino (CHO) (Puck y col. (1958), PNAS USA
60: 1275-1281), CV-1 (Fischer y col. (1970), Int. J. Cancer 5: 21-27) y células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA) (ATCC CCL 2).
La elección de un vector de expresión adecuado para la expresión de proteínas BTL-II de la invención dependerá de la célula huésped de mamífero específica que vaya a usarse. Ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen pcDNA3.1/Hygro+ (Invitrogen), pDC409 (McMahan y col. (1991), EMBO J. 10: 2821-2832) y pSVL (Pharmacia Biotech). Vectores de expresión para su uso en células huésped de mamífero pueden incluir secuencias de control de la transcripción y de la traducción derivadas de genomas víricos. Secuencias promotoras y secuencias potenciadoras comúnmente usadas que pueden usarse para expresar BTL-II incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de citomegalovirus humano (CMV), adenovirus 2, virus del polioma y virus simio 40 (SV40). Los procedimientos para la construcción de vectores de expresión de mamífero se desvelan, por ejemplo, en Okayama y Berg ((1982) Mol. Cell. Biol. 2:161-170), Cosman y col. ((1986) Mol. Immunol. 23:935-941), Cosman y col. ((1984) Nature 312: 768-771), documentos EP-A-0367566 y WO 91/18982.
La modificación de una molécula de ácido nucleico de BTL-II para facilitar la inserción en un vector particular (por ejemplo, modificando sitios de restricción), facilidad de uso en un sistema de expresión o huésped particular (por ejemplo, usando codones huésped preferidos) y similares son conocidos y se contemplan para su uso en la invención. Los procedimientos de ingeniería genética para la producción de proteínas BTL-II incluyen la expresión de moléculas de polinucleótidos en sistemas de expresión sin células, en huéspedes celulares, en tejidos y en modelos animales, según procedimientos conocidos.
Procedimientos terapéuticos
“Tratamiento” de cualquier enfermedad mencionada en el presente documento engloba un alivio de al menos un síntoma de la enfermedad, una reducción en la gravedad de la enfermedad o el retraso o prevención de la progresión de la enfermedad a síntomas más graves que, en algunos casos, pueden acompañar a la enfermedad o a al menos otra enfermedad. Tratamiento no necesita significar que la enfermedad esté totalmente curada. Un agente terapéutico útil sólo necesita reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de síntoma(s) asociados a la enfermedad o su tratamiento, o retrasar la aparición de síntomas más graves o una enfermedad más grave que pueda producirse con alguna frecuencia tras la afección tratada. Por ejemplo, si la enfermedad es una enfermedad inflamatoria del intestino, un agente terapéutico puede reducir el número de sitios distintos de inflamación en el intestino, el grado total del intestino afectado, reducir el dolor y/o hinchazón, reducir síntomas tales como diarrea, estreñimiento o vómitos, y/o prevenir la perforación del intestino. Una afección del paciente puede evaluarse por técnicas convencionales tales como rayos X realizados tras un enema de bario o enteroclisis, endoscopia, colonoscopia y/o una biopsia. Procedimientos adecuados varían según la afección y síntomas del paciente.
La invención engloba una proteína BTL-II para su uso para tratar enfermedad inflamatoria del intestino. La proteína BTL-II de la invención puede usarse antes, después o durante otros tratamientos para el trastorno en cuestión que se usan comúnmente, o pueden usarse sin otros tratamientos. Por ejemplo, la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa se tratan comúnmente con sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico o corticosteroides. Estos tratamientos pueden usarse antes, durante o después de los tratamientos de la invención.
Cualquiera de los agentes terapéuticos anteriormente descritos puede administrarse en forma de una composición, es decir, con uno o más componentes adicionales tales como un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Por ejemplo, una composición puede comprender una proteína BTL-II soluble como se describe en el presente documento más un tampón, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (tal como aquellos que tiene menos de 10 aminoácidos), una proteína, aminoácidos, hidratos de carbono tales como glucosa, sacarosa o dextrinas, agente quelante tal como EDTA, glutatión, y/u otros estabilizadores, excipientes y/o conservantes. La composición puede formularse como un líquido o un liofilizado. Otros ejemplos de componentes que pueden emplearse en formulaciones farmacéuticas se presentan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1980).
Las composiciones que comprenden moléculas terapéuticas descritas anteriormente pueden administrarse por cualquier medio apropiado que incluye, pero no se limita a, administración parenteral, tópica, oral, nasal, vaginal, rectal o pulmonar (por inhalación). Si se inyecta(n), la(s) composición (composiciones) puede(n) administrarse intraarticularmente, intravenosamente, intraarterialmente, intramuscularmente, intraperitonealmente o subcutáneamente por inyección en bolo o infusión continua. Se contempla la administración localizada, es decir, en el sitio de enfermedad, como son administración transdérmica y liberación sostenida de implantes, parches de la piel o supositorios. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, uso de un nebulizador, inhalación en forma de aerosol y similares. La administración por un supositorio insertado en una cavidad del cuerpo puede llevarse a cabo, por ejemplo, insertando una forma sólida de la composición en una cavidad del cuerpo elegida y dejando que se disuelva. En el caso de proteínas BTL-II solubles o agonistas para tratar una enfermedad inflamatoria del intestino, la administración por un supositorio rectal puede ser particularmente apropiada, ya que localiza el agente terapéutico apropiadamente. Otras alternativas incluyen colirios, preparaciones orales tales como píldoras, pastillas para chupar, jarabes y chicle, y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, esprays y pomadas. En la mayoría de los casos, las moléculas terapéuticas que son polipéptidos pueden administrarse tópicamente o mediante inyección o inhalación.
Las moléculas terapéuticas descritas anteriormente pueden administrarse a cualquier dosificación, frecuencia y duración que puede ser eficaz para tratar la afección que está tratándose. La dosificación depende de la naturaleza molecular de la molécula terapéutica y la naturaleza del trastorno que está tratándose. El tratamiento puede continuarse mientras que sea necesario para lograr los resultados deseados. Las moléculas terapéuticas de la invención pueden administrarse como una única dosificación o como una serie de dosificaciones administradas periódicamente, que incluye múltiples veces al día, diariamente, cada dos días, dos veces a semana, tres veces por semana, semanalmente, cada dos semanas, y dosificaciones mensuales, entre otras posibles pautas de dosificación. La periodicidad del tratamiento puede o puede no ser constante durante toda la duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento puede producirse inicialmente a intervalos semanales y después se produce cada dos semanas. Los tratamientos que tienen duraciones de días, semanas, meses o años están englobados por la invención. El tratamiento puede interrumpirse y luego reiniciarse. Pueden administrarse dosis de mantenimiento después de un tratamiento inicial.
La dosificación puede medirse como miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) o como miligramos por metro cuadrado de superficie de la piel (mg/m2) o como una dosis fija, independientemente de la altura o peso. Todas estas son unidades de dosificación estándar en la materia. El área superficial de la piel de una persona se calcula a partir de la altura y el peso usando una fórmula estándar.
La invención se ha descrito con referencia a ejemplos específicos. Estos ejemplos no pretenden limitar de ningún modo la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Aislamiento de ADNc de BTL-II humana
Se aisló ARN de varias fuentes, muestras de tejido de colon humano de pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, la línea de células de cáncer de colon humano Caco-2 (Colección americana de cultivos tipo (ATCC nº HTB-37) y una línea de células epiteliales de colon llamada T84 (ATCC nº CCL-248). El ARN se transcribió de forma inversa y se amplificó por PCR usando cebadores que se diseñaron basándose en la secuencia de ácidos nucleicos desvelada en el nº de acceso de NCBI NM_019602. Esto dio una porción en la dirección 5' de las secuencias de BTL-II de longitud completa (SEC ID Nº: 3) y las secuencias de variantes de corte y empalme desveladas en SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 15. El aislamiento de un ADNc que contiene el extremo 3' del ARNm de BTL-II se llevó a cabo usando 3' RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc), es decir, esencialmente los protocolos de Frohman y col. ((1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(23): 8998-9002). Del análisis de muchas variantes de ADNc de BTL-II por 3' RACE no se revelaron variantes que codificaran proteínas solubles que carecieran de un dominio transmembrana. Como se muestra en las Figuras 5a, 6a y 7a, muchas de las variantes contuvieron polimorfismos de secuencias (o variaciones alélicas) en varios sitios en la secuencia de BTL-II.
Ejemplo 2: Aislamiento de ADNc de BTL-II murina
Se aislaron ADNc de BTL-II murina del siguiente modo. Se aisló ARN de colon e intestino delgado murino usando el kit RNeasy (Qiagen) y se trató con ADNsa I (Ambion), según recomendaciones del fabricante, para eliminar el ADN cromosómico residual. El ARN purificado se transcribió en ADNc usando una mezcla de reacción que contenía ARN aislado en Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, 1 mM de cada dNTP, cebadores de hexámeros al azar 2,5 μM, 1 U/μl de inhibidor de RNAsa y 2,5 U/μl de transcriptasa inversa MuLV (PE Biosystems). La mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a 25ºC, seguido de 30 minutos a 48ºC, seguido de 5 minutos a 95ºC. La amplificación por reacciones de PCR para el gen BTL-II se realizó en un volumen final de 100 μl que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 μM de cada dNTP y 2,5 U de ampliTaq ADN polimerasa (Perkin Elmer) y 25 pmoles de tanto los cebadores en la dirección 5' (5'-TTACTGAGAGAGGGAAACGGGCTGTTTTCTCC) como en la dirección 3' (5'-GGACTTCATTGGTGACTGATGCCATCCAC). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo durante 35 ciclos de 40 segundos a 94ºC, 40 segundos a 55ºC y 40 segundos a 72ºC. Los productos de amplificación se analizaron sobre un 2% de gel de agarosa, se visualizaron por bromuro de etidio y se secuenciaron. Por estimación visual, las variantes de corte y empalme que carecen del exón 3 (Figura 9a) fueron más abundantes que las variantes que contenían los exones 1 a 8 (Figura 8).
Ejemplo 3: Expresión de BTL-II en células y tejidos de diversas fuentes
La expresión de ARNm de BTL-II se midió usando PCR en tiempo real esencialmente según los protocolos de Heid y col. ((1996), Genome Res. 6(10): 986-94) y usando transcripción inversa convencional seguida de PCR (RT-PCR; véase, por ejemplo, Fuqua y col. (1990), Biotechniques 9(2): 206-11). Todos los tipos de células probadas fueron de origen humano, excepto células dendríticas CD11c+ CD8+ B220+ (o plasmacitoides) de parches de Peyer que fueron de ratón. Las células en las que se detectó la expresión de BTL-II fueron las siguientes: linfocitos B humanos, sin estimular o estimulados con Staphylococcus aureus muerto, ligando de CD40 e interleucina 4; células epiteliales bronquiales humanas (células NHBE; véase Lechner y col. (1983), Cancer Res. 43 (12 pt. 1): 5915-21) estimuladas con interferón y; células Calu-3, una línea celular epitelial de pulmón (ATCC nº HTB-55), sin estimular; células T84, una línea celular epitelial de colon humano, sin estimular o estimulada con interferón y; células Caco-2, una línea de células de cáncer de colon humano, sin estimular; células CD11c+ (de baja expresión) CD8+ B220+ de parches de Peyer murinos, que son predominantemente células dendríticas; y leucocitos de sangre periférica murina. La expresión, en una escala absoluta, fue baja en la mayoría de las células probadas. La expresión de ARNm de BTL-II no se detectó en células dendríticas resultantes del tratamiento in vitro de monocitos de sangre periférica humana para inducir diferenciación en un tipo de célula dendrítica. Sin embargo, la expresión de BTL-II se detectó en células dendríticas plasmacitoides CD123+ purificadas de sangre humana purificada de sangre periférica humana. El ARNm de BTL-II estaba altamente enriquecido en el subconjunto CD11c+ (de baja expresión) CD8+ B220+ de células dendríticas murinas de parches de Peyer. La expresión de ARNm de BTL-II se detectó en varios tipos de tejido murino por procedimientos similares que incluyen bazo, ganglio linfático, estómago, ganglios linfáticos mesentéricos, médula ósea, intestino delgado, ciego, pulmón, intestino grueso, parche de Peyer y timo. Los mayores niveles de expresión se detectaron en tejido de intestino delgado, parche de Peyer y ciego.
Ejemplo 4: Expresión de BTL-II en un modelo murino para enfermedad inflamatoria del intestino
Ratones mdr1a -/- pueden ser un sistema modelo para el estudio de enfermedad inflamatoria del intestino crónica. Panwala y col. (1998), J. Immunol. 161: 5733-44. El gen de resistencia a múltiples fármacos murino, mdr1a, codifica una proteína transmembrana de 170 kDa que se expresa en muchos tejidos que incluyen células epiteliales intestinales y células linfoides. Los ratones deficientes en mdr1a son susceptibles a desarrollar inflamación intestinal espontánea grave caracterizada por el crecimiento desregulado de células epiteliales e infiltración masiva de leucocitos en la lámina propia del intestino grueso. El tratamiento de ratones mdr1a -/- con antibióticos orales evita tanto el desarrollo de enfermedad como resuelve la inflamación activa. Células linfoides aisladas de ratones con colitis activa demuestran una reactividad potenciada a antígenos bacterianos intestinales. Aunque mdr1a es expresado tanto por células epiteliales como por leucocitos, el desarrollo de colitis establece una correlación con la falta de expresión de mdr1a en células epiteliales.
Los ratones mdr1a -/- usados estuvieron en una población de referencia genética de FVB. Normalmente, aproximadamente el 20% de un grupo de ratones mdr1a -/- desarrolla espontáneamente colitis a las 18 a 20 semanas de edad, mientras que el resto de los ratones en la colonia mdr1a -/- siguen sanos y no desarrollan colitis. El porcentaje de animales que desarrolla enfermedad depende de la limpieza del animalario.
Inicialmente, se preparó ARN a partir de tejido de intestino y, después de la transcripción inversa que incorpora una marca fluorescente en el ADNc resultante, se usó para hibridarse con una matriz de sondas sobre un chip Affymetrix preparado por encargo que contenía un oligonucleótido diseñado para detectar ARNm de BTL-II basándose en la secuencia publicada por Stammers y col. ((2000), Inmunogenetics 51: 373-82). La expresión en exceso de ARNm de BTL-II se detectó en ratones mdr1a -/- (con respecto a individuos naturales de la cepa FVB) tanto antes de la aparición de síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino como durante los síntomas. Una muestra de tales datos se muestra en la Figura 10. Estos datos muestran que ARNm de BTL-II se expresa a un mayor grado en ratones mdr1a -/- que en ratones FVB naturales. Además, incluso una mayor expresión de ARNm de BTL-II acompaña a la aparición de síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino.
Estos resultados se confirmaron por análisis del mismo ARN usando una técnica de PCR en tiempo real (Heid y col. (1996), Genome Res. 6(10): 986-94). Este análisis mostró la expresión en exceso de ARNm de BTL-II por dos ratones mdr1a -/- sintomáticos con respecto a dos ratones FVB naturales sanos. Estos datos se representan en diagrama en la Figura 11. Los dos ratones parentales se representan por las dos barras marcadas con rayas diagonales a la izquierda de la Figura 11 y los dos mdr1a -/- sintomáticos se representan por las dos barras marcadas con patrones cuadriculados a la derecha de Figura 11. Estos datos indican que hay aproximadamente una diferencia de 2 a 5 veces en la expresión entre los ratones naturales y los ratones mdr1a -/- sintomáticos. Por tanto, mayores niveles de ARNm de BTL-II se expresan en ratones con síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino que en ratones naturales sin síntomas.
Ejemplo 5: Construcción de una proteína de fusión BTL-II:Fc
Una proteína BTL-II soluble que consiste en la región extracelular de BTL-II murina fusionada con una región Fc humana (BTL-II:Fc) se produjo del siguiente modo. Una construcción de ADNc de fusión que codifica BTL-II:Fc se preparó fusionando ácidos nucleicos que codifican la región extracelular de BTL-II murina con ácidos nucleicos que codifican una IgG1 humana (en marco). Para producir la proteína BTL-II:Fc, células de mamífero se transfectaron con la construcción de ADNc de fusión usando el procedimiento de transfección LIPOFECTAMINE™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). Los sobrenadantes que contenían la proteína BTL-II:Fc se recogieron 6-7 días después de la transfección, y la proteína BTL-II:Fc se purificó por cromatografía en columna de proteína A. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína BTL-II:Fc y la secuencia de aminoácidos BTL-II:Fc se encuentran en SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20, respectivamente.
Ejemplo 6: Supresión de la proliferación de linfocitos T humanos por BTL-II:Fc
El siguiente experimento prueba si una forma soluble de BTL-II puede suprimir la proliferación de linfocitos T in vitro en respuesta a un anticuerpo anti-CD3£ monoclonal con o sin otras moléculas coestimulantes.
BTL-II:Fc se preparó como se describe en el Ejemplo 5. Una placa de microtitulación con fondo en U de 96 pocillos se recubrió con concentraciones variables de anticuerpo anti-CD3£ con o sin una o varias de otras proteínas. La
Figura 12 indica qué proteínas se usaron en cada muestra del siguiente modo: anticuerpo anti-CD3£ solo, ;
anticuerpo anti-CD3£ y BTL-II:Fc, ; anticuerpo anti-CD3£ y B7RP-1:Fc, ; anticuerpo anti-CD3£, B7RP-1:Fc
y BTL-II:Fc,
; anticuerpo anti-CD3£ y B7-2:Fc, ; anticuerpo anti-CD3£, B7-2:Fc, y BTL-II:Fc, . B7RP1:Fc consiste en la región extracelular de B7RP-1 (también conocida como B7h) fusionada con una región Fc de un anticuerpo, y B7-2:Fc consiste en la región extracelular de B7-2 fusionada con una región Fc de un anticuerpo. Ambas de estas proteínas son miembros de la familia B7 de proteínas conocidos por modular la respuesta de linfocito T a antígenos. Estas proteínas de fusión pueden comprarse de vendedores comerciales tales como, por ejemplo, R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, EE.UU.), o pueden aislarse como se describe en el Ejemplo 5 para la proteína BTL-II:Fc. B7-2 se compró de R&D Systems, y B7RP-1 se preparó esencialmente como se describe en el Ejemplo 5, aunque también está disponible de R&D Systems con el nombre B7-H2/Fc. Los pocillos de la placa de microtitulación se recubrieron añadiendo 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía la concentración de anticuerpo anti-CD3£ indicada en la Figura 12 con o sin una o varias de otras proteínas, que es BTL-II:Fc (10 μg/ml), B7RP1:Fc (10 μg/ml) y/o B7-2:Fc (2 μg/ml). Las placas se incubaron a 4ºC durante la noche y luego se lavaron dos veces con PBS. Los linfocitos T humanos se purificaron de células mononucleares de sangre periférica humana usando un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania), que funciona marcando magnéticamente y agotando los glóbulos sanguíneos periféricos distintos de linfocitos T CD4+, produciendo población relativamente pura de linfocitos T CD4+ intactos. Aproximadamente 1x105 linfocitos T purificados se añadieron a cada pocillo en un volumen de 200 μl de medio de cultivo (RPMI con 10% de suero bovino fetal). Las células se incubaron durante un total de 72 horas. A las 64 horas se añadió 1 μCi de 3Htimidina a cada pocillo. Al final de las 72 horas, la timidina sin incorporar se eliminó usando un recolector de células automático (obtenido de Tomtec, Hamden, Connecticut, EE.UU.), que deposita las células sobre un filtro y lava el medio de cultivo. Los filtros con las células sobre ellos se contaron luego en un contador de centelleo para determinar cuánta radiactividad habían incorporado las células. Los resultados se muestran en las Figuras 12a y 12b, que sólo se diferencian en que la Figura 12a tiene una escala logarítmica y la Figura 12b tiene una escala lineal.
Los resultados indican que BTL-II:Fc puede suprimir la proliferación de linfocitos T inducida por anticuerpo anti-
CD3£. Figura 12a y 12b. En la Figura 12a, muestras que contienen BTL-II más anticuerpo anti-CD3£ ( )
proliferan menos que las muestras que contienen sólo anticuerpo anti-CD3£ ( ) a las mayores concentraciones
de anticuerpo probadas. Además, es evidente que tanto B7-2 ( ) como B7RP-1 ( ) estimulan la proliferación de linfocitos T inducida por anticuerpo anti-CD3£. La concentración de anticuerpo anti-CD3£ requerida para ver un efecto sobre la proliferación de linfocitos T añadiendo B7-2:Fc es inferior a la que se requiere para ver un efecto similar añadiendo B7RP-1:Fc. Además, BTL-II también puede suprimir este aumento de la proliferación de linfocitos
T en respuesta a la adición de B7-2:Fc ( ) y B7RP-1:Fc ( ). El efecto de BTL-II:Fc sobre la proliferación inducida por B7-2:Fc más anticuerpo anti-CD3£ sólo es evidente a la concentración más baja de anticuerpo anti-CD3£ probado, mientras que los efectos de BTL-II:Fc sobre la proliferación inducida por B7RP-1:Fc son más evidentes a las tres mayores concentraciones de anticuerpo anti-CD3£ probadas. Por tanto, los efectos observados dependen de la concentración de anticuerpo anti-CD3£
La Figura 13 muestra que la supresión de la proliferación de linfocitos T humanos por BTL-II:Fc también depende de la concentración de BTL-II:Fc. El experimento se realizó como se ha descrito anteriormente, excepto que la concentración de anticuerpos anti-CD3£ siguió constante a 0,5 μg/ml. La concentración de BTL-II:Fc varió de 0 a 10 μg/ml, como se indica en la Figura 13. Los resultados mostrados en la Figura 13 indican que la supresión de la proliferación de linfocitos T inducida por anti-CD3£ depende de la concentración de BTL-II:Fc.
Ejemplo 7: BTL-II:Fc suprime la proliferación de linfocitos T murinos
Este experimento se hizo para determinar si BTL-II:Fc puede suprimir la proliferación de linfocitos T murinos, además de humanos. Se realizó un ensayo de proliferación de linfocitos T como se ha descrito esencialmente en el Ejemplo 6, excepto que se usaron linfocitos T murinos purificados usando microperlas magnéticas compradas de Miltneyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Alemania) en lugar de linfocitos T humanos. Una proteína que consiste en una región Fc humana, que se produjo en células CHO transfectadas, sirvió de control. Los pocillos se
recubrieron con tanto anticuerpo anti-CD3£ solo ( ) a la concentración indicada en la Figura 14 como con
anticuerpo anti-CD3£ más tanto BTL-II:Fc ( ) a 10 μg/ml como la proteína que consiste en una región Fc
humana ( ) a 10 μg/ml. Los resultados indican que BTL-II:Fc, pero no una proteína que consiste en una región Fc humana sola, pueden suprimir la proliferación de linfocitos T murinos en respuesta a anticuerpo anti-CD3£. Figura
14.
Ejemplo 8: BTL-II:Fc no suprime la proliferación de linfocitos B murinos
El siguiente experimento se diseñó para determinar si BTL-II:Fc humana puede inhibir la proliferación de linfocitos B murinos inducida por TALL-1 y un anticuerpo IgM. El experimento se realizó esencialmente como se describe por Khare y col. ((2000), Proc. Natl. Acad. Sci. 97(7): 3370-75). Brevemente, linfocitos B murinos se purificaron a partir de bazos purificando primero los linfocitos por centrifugación en gradiente de densidad y luego pasando los linfocitos sobre una columna de linfocitos B que elimina monocitos/macrófagos y células CD4+ y CD8+ (Cedarlane, Westbury, NY). Aproximadamente 1 x 105 linfocitos B purificados en MEM más 10% de suero bovino fetal inactivado por calor se incubaron durante 4 días a 37ºC en una placa de microtitulación de 96 pocillos con o sin F(ab')2 de cabra anti-IgM de ratón (2 μg/ml), TALL-1 humana (10 ng/ml) y/o BTL-II:Fc (10 μg/ml). Se añadió 3H-timidina (1 μCi) durante las 8 últimas horas de incubación. Las células se recogieron como se describe en el Ejemplo 6 al final de 4 días y se contaron en un contador de centelleo. Las marcas en la Figura 15 indican las siguientes combinaciones de células y
proteínas: linfocitos B solos, (ésta es la barra más a la izquierda en la gráfica que se muestra en la Figura 15, pero no hay señal detectable); linfocitos B más TALL-1, ; linfocitos B más anticuerpo anti-IgM, ; linfocitos
B más TALL-1 y anticuerpo anti-IgM, ; y linfocitos B más TALL-1, anticuerpo anti-IgM y BTL-II: Fc,
.
Los resultados indican que BTL-II:Fc no tiene efecto sobre la proliferación de linfocitos B inducida por TALL-1 y anticuerpo anti-IgM. Figura 15. Por tanto, parece que BTL-II inhibe la proliferación de linfocitos T, pero no de linfocitos B.
Ejemplo 9: Efectos de BTL-II:Fc sobre la producción de citocinas por linfocitos T
El siguiente experimento tuvo como objetivo determinar si BTL-II:Fc tenía efectos sobre la producción de citocinas por linfocitos T. Los linfocitos T se purificaron y los pocillos de la placa de microtitulación se recubrieron con proteínas como se describe en el Ejemplo 6. Aproximadamente 1 x 105 células se añadieron a cada pocillo en un volumen de 200 μl de medio (RPMI con 10% de suero bovino fetal). Las células se incubaron durante 64 horas a 37ºC. Luego se sacaron 150 μl para determinar la concentración de citocinas, y se añadió 1 μi de 3H-timidina a los 50 μl restantes en cada pocillo. Entonces se dejó que la placa de microtitulación se incubara durante 8 horas adicionales a 37ºC y luego se lavó y se contó como se describe en el Ejemplo 6 para determinar diferencias en la proliferación (mostradas en la Figura 16a). Las marcas para indicar qué proteínas se usaron para recubrir el pocillo son como en las Figuras 12a y 12b (explicadas en el Ejemplo 6). Las concentraciones de interferón gamma (IFNy), interleucina 2 (IL2) e interleucina 5 (IL5) se determinaron usando un sistema de inmunoensayo basado en electroquímica para la detección simultánea de múltiples citocinas comercializado por Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Mariland, EE.UU., que se afilió con IGEN International, Inc.). Los principios y la operación de este tipo de sistema de detección de citocinas se explican, en por ejemplo, Sennikov y col. (2003), J. Immunol. Method 275: 81-88. Las unidades para las cantidades de citocinas se toman de las lecturas generadas por la máquina de MSD. Las concentraciones reales de citocinas en el medio no pueden determinarse a partir de estos datos sin compararse con una curva patrón generada con una proteína de concentración conocida que no acompañó a este experimento particular. Sin embargo, las comparaciones entre lecturas dentro de un único experimento pueden proporcionar cantidades relativas de citocinas presentes en las muestras de control frente a experimentales.
Los resultados se muestran en las Figuras 16a-16d. La Figura 16a indica que BTL-II:Fc inhibió la proliferación en respuesta a anticuerpo anti-CD3£ o anticuerpo anti-CD3£ más B7RP-1:Fc, pero no en respuesta a anticuerpo anti-CD3£ más B7-2:Fc a las concentraciones de anticuerpo anti-CD3£ usadas. Sin embargo, como se observa en el Ejemplo 6 (Figuras 12a y 12b), a menores concentraciones de anticuerpo anti-CD3£, es decir, 0,1 μg/ml, la proliferación celular en respuesta a anticuerpo anti-CD3£ más B7-2:Fc se inhibe por BTL-II:Fc. La producción de IFNy, IL2 e IL5 fue baja en los pocillos recubiertos con anticuerpo anti-CD3£ solo, y la adición de BTL-II:Fc no la disminuyó significativamente adicionalmente. Figuras 16b-16d. El aumento de la producción de IFNy en respuesta a la adición de tanto B7RP-1:Fc como B7-2:Fc a anticuerpo anti-CD3£ se inhibió por BTL-II:Fc. Figura 16b. Además, el aumento de la producción de IL2 y IL5 en respuesta a la adición de B7-2:Fc a anticuerpo anti-CD3£ se inhibió por BTL-II:Fc. Figuras 16c y 16d. A las concentraciones probadas, la adición de B7RP-1:Fc a anticuerpo anti-CD3£ no aumentó apreciablemente la producción de IL2 o IL5. Figuras 16c y 16d. Estos resultados indican que BTL-II:Fc puede inhibir la producción de al menos algunas citocinas en respuesta a una combinación de anticuerpo anti-CD3£ más tanto B7-2:Fc como B7RP-1:Fc.
Ejemplo 10: El tratamiento de linfocitos T con BTL-II:Fc no produce muerte celular masiva
El siguiente experimento se hizo para determinar si la inhibición de proliferación de linfocitos T por BTL-II:Fc implicó
o no muerte celular masiva. Se realizó un ensayo de proliferación de linfocitos T esencialmente como se describe en el Ejemplo 6, excepto que las células no se marcaron con 3H-timidina. Las células se contaron en un hemocitómetro después de 72 horas de cultivo, y la viabilidad celular se determinó por tinción con azul de tripano. Las proteínas usadas para recubrir los pocillos de la placa de microtitulación se indican en la Figura 17 como se explica en el Ejemplo 6 y se muestran en las Figuras 12a y 12b. Se usó el anticuerpo anti-CD3£ a una concentración de 2 μg/ml. Los resultados indican que el número de células muertas en cada pocillo se encuentra dentro de un intervalo entre aproximadamente 0,5 x104 y 0,75 x104 células, independientemente de las proteínas usadas para recubrir los pocillos. Figura 17. Por tanto, las diferencias en la proliferación celular observadas en presencia de BTL-II:Fc no reflejan un efecto tóxico sustancial de BTL-II:Fc.
Ejemplo 11: BTL-II murina no se une a CTLA4, CD28, ICOS o PD-1 murina
El siguiente conjunto de experimentos trata la cuestión de si BTL-II se une a uno de varios componentes de unión conocidos de otras proteínas B7. Por ejemplo, se sabe que B7RP-1 se une a ICOS (Yoshinaga y col. (1999), Nature
402: 827-32), se sabe que CD80 (también llamada B7-1) se une a CTLA4 y CD28, como lo hace CD86 (también llamada B7-2; véase, por ejemplo, Sharpe y Freeman (2002), Nature Reviews Immunology 2: 116-26), y PD-L1 y PD-L2 son conocidas por unirse a PD-1 (Latchman y col. (2001), Nature Immunology 2(3): 261-68).
El experimento se hizo del siguiente modo. Primero se obtuvieron o aislaron proteínas de fusión que comprenden la región extracelular de una proteína conocida por unirse a la proteína B7 más la región Fc de un anticuerpo IgG humano. Las proteínas de fusión que comprenden una región Fc de un anticuerpo humano más la región extracelular de tanto CD28 murina (mCD28-huFC) como PD-1 murina (PD1-huFC) se compraron de R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, EE.UU.). Las otras dos proteínas de unión a B7 (CTLA4-huFC y ICOS-huFC) también están disponibles de R&D Systems, pero se prepararon del siguiente modo. Un ADNc que codifica la región extracelular de CTLA4 murina y otro que codifica la región extracelular de ICOS murina se fusionaron cada uno con ADNc que codifica la región Fc de un anticuerpo IgG humano en un vector apropiado para la expresión en células de mamífero. Cada una de estas construcciones se usó para transfectar células, y las proteínas de fusión se purificaron del medio de cultivo de las células transfectadas por cromatografía de proteína A.
Las versiones de longitud completa de cada uno de los tres ADNc murinos (que codificaban BTL-II, B7RP-1, CD80) se insertaron en un vector apropiado para la expresión. Aproximadamente 10 μg de cada una de estas construcciones, junto con un vector vacío, se usaron por separado para transfectar células 293. Dos días después de la transfección, aproximadamente un millón de células de cada una de las cuatro transfecciones se tiñeron con cada una de las proteínas de fusión descritas anteriormente. La proteína unida se detectó usando un anticuerpo fluorescentemente marcado contra la región Fc de IgG humana. Las células teñidas se analizaron por FACS. Los resultados se muestran en la Figura 18.
Como era de esperar, las células transfectadas con el vector vacío (línea superior de la Figura 18) no se tiñeron con ninguna de las cuatro proteínas de fusión. Las células transfectadas con BTL-II murina (segunda línea de la Figura 18) se comportaron similarmente, que indica que ninguna de las proteínas de fusión se une a BTL-II. Como era de esperar, las células transfectadas con B7RP-1 murina se tiñeron con ICOS-huFC, pero no con ninguna de las otras proteínas de fusión. Como era de esperar, las células transfectadas con CD80 murina se tiñeron con CTLA4-huFC o mCD28-huFC, pero no con ICOS-huFC o PD1-huFC. Estos resultados indican que BTL-II fracasa en unirse a cuatro proteínas, CTLA-4, PD-1, ICOS y CD28, cada una de las cuales se sabe que se une a al menos una proteína en la familia B7.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Immunex Corporation Baum, Peter R.
5 Escobar, Sabine S. Viney, Joanne L.
<120> ÁCIDOS NUCLEICOS, PROTEÍNAS Y ANTICUERPOS BTL-II
10 <130> 3457-WO
<140> a asignar
<141>
15 <150> US 60/436.185
<151>
<150> US 60/525.298
<151> 20
<160> 20
<170> Patentin versión 3.2
25 <210> 1
<211> 1368
<212> ADN
<213> Homo sapiens
30 <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1365)
<400> 1
<210> 2
<211> 455
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 2011
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> CD (1449)
<400> 3
<210> 4
<211> 482
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 2300 5 <212> ADN
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1545)
<400> 5
<210> 6
<211> 514
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 6
<210> 7
<211> 1012 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(819)
<400> 7 <210> 8
<211> 272 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
10 <210> 9
<211> 1336
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(1167)
<210> 10
<211> 388
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 730
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 243
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 1078
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 359
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 1075
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 358
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 1427 5 <212> ADN
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1263)
<400> 17
<210> 18
<211> 420
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 18
<210> 19
<211> 2070 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens y Mus sp.
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(2070)
<400> 19
<210> 20
<211> 689
<212> PRT
<213> Homo sapiens y Mus sp.
<400> 20

Claims (46)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una proteína BTL-II aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 29 a 457 de SEC ID Nº: 4.
  2. 2.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 1 que comprende los aminoácidos 29 a 482 de SEC ID Nº: 4.
  3. 3.
    Una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos un 85% idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14, o SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 tiene al menos 150 aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos es al menos un 85% idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14, o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14 o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16 tiene al menos 20 aminoácidos de longitud, y en la que el polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T.
  4. 4.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 3, en la que la secuencia de aminoácidos es al menos unl 90% idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16.
  5. 5.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 3 ó 4, en la que la secuencia de aminoácidos es al menos un 90% idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 14 o los aminoácidos 126 a 156 de SEC ID Nº: 16.
  6. 6.
    La proteína BTL-II de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que comprende los aminoácidos 30 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14, o SEC ID Nº: 16.
  7. 7.
    Una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16, en la que la región de identidad de la secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16 tiene al menos 275 aminoácidos, y en la que el polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T.
  8. 8.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 7, en la que la secuencia de aminoácidos es al menos un 90% idéntica a los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16.
  9. 9.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 8, en la que la secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16.
  10. 10.
    Una proteína BTL-II aislada que comprende un primer polipéptido que consiste en una primera secuencia de aminoácidos al menos un 85% idéntica a los aminoácidos 32 a 358 de SEC ID Nº: 10, en la que la región de identidad de la primera secuencia de aminoácidos alineada con SEC ID Nº: 10 tiene al menos aproximadamente 175 aminoácidos de longitud, en la que la primera secuencia de aminoácidos no tiene más de aproximadamente 390 aminoácidos de longitud, en la que el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de linfocitos T, en la que la primera secuencia de aminoácidos no es al menos un 80% idéntica a los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 con una región de identidad de la primera secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 de al menos aproximadamente 40 aminoácidos, y en la que la proteína BTL-II no comprende una segunda secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 con una región de identidad de la segunda secuencia de aminoácidos alineada con los aminoácidos 148 a 232 de SEC ID Nº: 4 de al menos aproximadamente 40 aminoácidos.
  11. 11.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 10, en la que la primera secuencia de aminoácidos no tiene más de aproximadamente 270 aminoácidos de longitud.
  12. 12.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 10 ó 11, en la que la primera secuencia de aminoácidos es al menos un 90% idéntica a SEC ID Nº: 10.
  13. 13.
    La proteína BTL-II de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 que comprende los aminoácidos 32 a 242 de SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 12.
  14. 14.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 1, 3, 7, ó 10 que comprende además un polipéptido heterólogo.
  15. 15.
    La proteína BTL-II de la reivindicación 14, en la que el polipéptido heterólogo es una región Fc de un anticuerpo.
  16. 16.
    Un fragmento inmunogénico de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14, o SEC ID Nº: 16,
    en el que el fragmento inmunogénico atraviesa las posiciones 141 a 143 de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 16, en el que el fragmento inmunogénico es capaz de provocar anticuerpos que se unen específicamente al fragmento inmunogénico, y en el que el fragmento inmunogénico tiene al menos 10 aminoácidos de longitud.
  17. 17.
    Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una proteína BTL-II que consiste en los aminoácidos 1 a 457 de SEC ID Nº: 4 para su uso en promover una respuesta sistémica o inmunitaria de la mucosa contra un antígeno, en el que el anticuerpo es un antagonista de BTL-II.
  18. 18.
    Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una proteína BTL-II que consiste en una secuencia de
    aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: aminoácidos 1 a 247 de SEC ID Nº: 8; aminoácidos 1 a 363 de SEC ID Nº: 10; aminoácidos 1 a 243 de SEC ID Nº: 12; aminoácidos 1 a 359 de SEC ID Nº: 14; y aminoácidos 1 a 358 de SEC ID Nº: 16
    para su uso en promover una respuesta sistémica o inmunitaria de la mucosa contra un antígeno, en el que el anticuerpo es un antagonista de BTL-II.
  19. 19.
    El anticuerpo de la reivindicación 17 ó 18, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  20. 20.
    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano.
  21. 21.
    Un ácido nucleico BTL-II aislado que comprende un polinucleótido, o su complemento, que consiste en los nucleótidos 1 a 1371 de SEC ID Nº: 3.
  22. 22.
    Un ácido nucleico BTL-II aislado o su complemento, en el que el ácido nucleico BTL-II codifica la proteína BTL-II
    o un fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
  23. 23.
    Un vector que comprende el ácido nucleico BTL-II de la reivindicación 21 ó 22.
  24. 24.
    Una célula hospedadora que contiene el vector de la reivindicación 23.
  25. 25.
    Un procedimiento para producir una proteína BTL-II o fragmento inmunogénico que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 24 en condiciones que permiten la expresión de la proteína BTL-II o un fragmento inmunogénico.
  26. 26.
    Una célula huésped genéticamente manipulada para expresar la proteína BTL-II o fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
  27. 27.
    La célula hospedadora de la reivindicación 26, en la que la célula hospedadora es una célula de mamífero.
  28. 28.
    La célula hospedadora de la reivindicación 27, en la que la célula hospedadora es una célula CHO.
  29. 29.
    Un procedimiento para producir una proteína BTL-II o un fragmento inmunogénico que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 26 en condiciones que permiten la expresión de la proteína BTL-II o un fragmento inmunogénico.
  30. 30.
    El procedimiento de la reivindicación 25 ó 29 que comprende además aislar la proteína BTL-II de las células hospedadoras o del medio.
  31. 31.
    Una proteína BTL-II de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en terapia.
  32. 32.
    Una proteína BTL-II de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino.
  33. 33.
    La proteína BTL-II para el uso de la reivindicación 32, en la que la enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa.
  34. 34.
    Un antagonista de BTL-II para su uso para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno, en el que el antagonista de BTL-II se administra junto con el antígeno, en el que el antagonista de BTL-II es un anticuerpo antiBTL-II.
  35. 35.
    El antagonista de BTL-II para el uso de la reivindicación 34, en el que la respuesta inmunitaria comprende una
    respuesta inmunitaria de la mucosa contra el antígeno.
  36. 36.
    El antagonista de BTL-II para el uso de la reivindicación 34, en el que el antagonista es el anticuerpo de culaquiera de las reivindicaciones 17 a 20.
  37. 37.
    El antagonista de BTL-II para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en el que el antígeno se administra por superficie de mucosa.
  38. 38.
    Una proteína BTL-II de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso para disminuir una respuesta inmunitaria a un antígeno en un mamífero.
  39. 39.
    Una proteína BTL-II de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso para inhibir la proliferación de linfocitos T.
  40. 40.
    Una proteína BTL-II de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso para inhibir la producción de citocinas por una célula T.
  41. 41.
    La proteína BTL-II para el uso de las reivindicaciones 39 ó 40, en la que la célula T se pone en contacto con la proteína BTL-II in vivo.
  42. 42.
    La proteína BTL-II para el uso de las reivindicaciones 39 ó 40, en la que la célula T se pone en contacto con la proteína BTL-II in vitro.
  43. 43.
    La proteína BTL-II para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, en la que la célula T es una célula T humana.
  44. 44.
    La proteína BTL-II para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, en la que se inhibe la producción de interferón gamma.
  45. 45.
    La proteína BTL-II para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, en la que la producción de IL2 es inhibida por la célula T.
  46. 46.
    La proteína BTL-II para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 45, en la que la producción de IL5 inhibida por la célula T.
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.
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