ES2391213T3 - Oligonucle�tidos modificados para discriminaci�n de desapareamiento - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido modificado que comprende al menos una base de la base de pirimidina 5-sustituida y al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida, en el cual dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una fórmula que consiste en: en la que al menos un base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida está que consiste en en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O- (alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2- C12), arilo, heterociclilo, halógeno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos,

Description

Oligonucle�tidos modificados para discriminaci�n de desapareamiento.

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional N�mero de serie 60/186.046, presentada el 1 de marzo de 2000 y la solicitud n�mero de serie 09/724.959, presentada el 28 de noviembre de 2000.

Indicaci�n de los derechos de invenci�n realizada bajoinvestigaci�n y desarrollo patrocinados federalmente

No aplicable

Antecedentes de la invenci�n

La presente solicitud se enmarca en el campo de la biolog�a molecular relacionada con el uso de oligonucle�tidos como sondas y cebadores en ensayos en fase l�quida, s�lida y mixta. La solicitud se refiere adem�s al uso de bases de �cidos nucleicos modificadas y oligonucle�tidos modificados para mejorar las propiedades de hibridaci�n y las capacidades discriminatorias de oligonucle�tidos que se emplean en matrices y como sondas y cebadores.

Muchas t�cnicas actualmente en uso en la biolog�a molecular emplean oligonucle�tidos como sondas y/o cebadores. A menudo resulta ventajoso, en la pr�ctica de estas tecnolog�as, podere distinguir entre dos o m�s secuencias que est�n relacionadas pero que se diferencian en uno o m�s nucle�tidos. Por ejemplo, muchas mutaciones de importancia cl�nica se diferencian s�lo en un �nico nucle�tido de a la secuencia de tipo salvaje. Los polimorfismos en los genomas de mam�fero a menudo tambi�n se caracterizan por diferencias en la secuencia de uno o unos pocos nucle�tidos. La capacidad para realizar tal distinci�n se conoce como discriminaci�n de desapareamientos. En t�rminos pr�cticos, la discriminaci�n de desapareamientos describe la propiedad mediante la cual un oligonucle�tido de secuencia definida, a una rigurosidad concreta, se hibrida con gran fuerza (una manifestaci�n de ello es que los h�bridos tienen un alto punto de fusi�n) con una secuencia diana con la que es complementaria a lo largo de su longitud completa (un h�brido perfecto o un apareamiento perfecto), pero se hibrida, de una manera detectable, de forma m�s d�bil con una secuencia diana que no es complementaria con la secuencia del oligonucle�tido en uno o unos pocos nucle�tidos (un desapareamiento). Las diferencias en la fuerza de hibridaci�n son tales que puede seleccionarse una rigurosidad concreta en la que un apareamiento perfecto es detectable como un h�brido y un desapareamiento no puede formar un h�brido.

En un d�plex de �cido nucleico, cada par de bases contribuye a la estabilidad. Por tanto, cuanto m�s corto sea el d�plex, mayor ser� la contribuci�n relativa de cada par de bases individual a la estabilidad del d�plex. Como resultado, la diferencia en la estabilidad entre un apareamiento perfecto y un desapareamiento ser� mayor para oligonucle�tidos m�s cortos. Sin embargo, los oligonucle�tidos cortos se hibridan de forma d�bil, incluso con una secuencia perfectamente complementaria, y por tanto deben hibridarse bajo condiciones de rigurosidad reducida. Por tanto, el poder discriminatorio potencial de oligonucle�tidos cortos no puede obtenerse con facilidad excepto bajo condiciones de baja rigurosidad.

En la t�cnica se necesitan nuevos procedimientos para la discriminaci�n de desapareamientos, en particular desapareamientos de un �nico nucle�tido, bajo condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, a las elevadas temperaturas caracter�sticas de la mayor�a de las reacciones de amplificaci�n de �cidos nucleicos. De forma sorprendente, la presente invenci�n proporciona dichos procedimientos, junto con nuevos reactivos y composiciones que pueden utilizarse en los procedimientos.

Sumario de la invenci�n

La presente invenci�n proporciona una serie de oligonucle�tidos modificados como se menciona en la reivindicaci�n 1, que se ha descubierto que poseen unas propiedades y una utilidad excepcionales en una diversidad de ensayos. Por consiguiente, la presente invenci�n tambi�n proporciona procedimientos para utilizar los oligonucle�tidos modificados descritos en la presente.

En un aspecto, la presente invenci�n proporciona oligonucle�tidos modificados que tienen al menos dos bases seleccionadas de base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida y 3-sustituida como se menciona en la reivindicaci�n 1. En realizaciones preferidas, los oligonucle�tidos que tienen bases modificadas comprender�n adem�s otros restos, tales como marcadores detectables, extintores de fluorescencia y de quimioluminiscencia y/o ligantes del surco menor y/u otros tipos de bases modificadas o an�logos de bases.

En otro aspecto, la presente invenci�n proporciona oligonucle�tidos modificados que tienen al menos una base de pirimidina 5-sustituida y al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida como se menciona en la reivindicaci�n 1. En realizaciones preferidas, estos oligonucle�tidos modificados comprender�n adem�s otros restos (como anteriormente) tales como marcadores extintores de fluorescencia y quimioluminiscencia y/o ligantes de surco menor detectables.

En otro aspecto, la presente invenci�n proporciona procedimientos para distinguir polinucle�tidos que tienen secuencias relacionadas.

En otro aspecto m�s, la presente invenci�n proporciona procedimientos para detectar la presencia de una secuencia diana en un polinucle�tido.

En otros aspectos m�s, la presente invenci�n proporciona procedimientos para la extensi�n de cebadores, y procedimientos para determinar la secuencia de nucle�tidos de un polinucle�tido.

En aspectos relacionados m�s, la presente invenci�n proporciona procedimientos para estudiar la expresi�n g�nica en una c�lula, y procedimientos para identificar una mutaci�n o un polimorfismo en una secuencia diana de un gen de inter�s.

En otro aspecto m�s, la presente invenci�n proporciona una serie de bases modificadas que son �tiles para preparar oligonucle�tidos modificados para los procedimientos descritos en la presente y otros procedimientos y ensayos convencionales.

En otro aspecto m�s, la presente invenci�n proporciona matrices de oligonucle�tidos modificados en las que los miembros de la matriz tienen unas Tm diferente aproximadamente en 1-2 �C, y unas longitudes diferentes aproximadamente en 1-2 bases entre ellos. Tambi�n se proporcionan procedimientos para determinar las secuencias de los miembros de la matriz.

Breve descripci�n de la invenci�n

Las figuras 1A y 1B proporcionan las estructuras de varias bases modificadas y sus abreviaturas. La l�nea ondulada se utiliza para indicar la posici�n de un resto az�car unido (sin proteger, protegido, activado y similares). La figura 2 es una gr�fica que ilustra el equilibrio de la Tm de sondas de 8 meros ricas en GC y ricas en AT con diferentes combinaciones de MGB, PPPA y PU. La figura 3 es un gr�fica que ilustra una ventaja lograda mediante el uso de PPPA y PPG en sondas oligonucleot�dicas modificadas con MGB. Como puede observarse en la figura, las bases modificadas permiten acortar la sonda que muestre una mayor discriminaci�n de desapareamientos en una PCR atiempo real. � es PPPA y Ĝ es PPG. Sonda FAM modificada con MGB = SEQ ID NO:1; complemento de la sonda FAM modificada con MGB = SEQ ID NO:2; complemento de la sonda FAM modificada con MGB que contiene PPPA y PPG = SEQ ID NO:3; sonda FAM modificada con MGB que contiene PPPA y PPG = SEQ ID NO:4. La figura 4 ilustra un ensayo Invader™ en que pueden utilizarse los oligonucle�tidos modificados de la invenci�n. La figura 5 ilustra la comparaci�n de la actuaci�n de la sonda de Invader™ con diferentes n�meros de PPG.

Descripci�n de la invenci�n

Abreviaturas y definiciones

Las abreviaturas para una serie de bases modificadas descritas en la presente se proporcionan como sigue (las estructuras de estas bases se muestran en las figuras 1A y 1B): 6-amino-3-prop-1-inil-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin4-ona, PPPG; 6-amino-3-(3-hidroxiprop-1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, HOPPPG; 6-amino-3-(3aminoprop-1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, NH2PPPG; 4-amino-3-(prop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina, PPPA; 4-amino-3-(3-hidroxiprop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina, HOPPPA; 4-amino-3-(3-aminoprop-1-inil)pirazolo[3,4d]pirimidina, NH2PPPA; 3-prop-1-inilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamino, (NH2)2PPPA; 2-(4,6-diaminopirazolo[3,4d]pirimidin-3-il)etin-1-ol, (NH2)2PPPAOH; 3-(2-aminoetinil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamina, (NH2)2PPPANH2; 5prop-1-inil-1,3-dihidropirimidin-2,4-diona, PU; 5-(3-hidroxiprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidin-2,4-diona, HOPU; 6-amino5-prop-1-inil-3-dihidropirimidin-2-ona, PC; 6-amino-5-(3-hidroxiprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidin-2-ona, HOPC; y 6amino-5-(3-aminoprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidin-2-ona, NH2PC; 5-[4-amino-3-(3-metoxiprop-1-inil)pirazol[3,4d]pirimidinil]-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol, CH3OPPPA; 6-amino-1-[4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-3-(3metoxiprop-1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, CH3OPPPG; 5-(4-hidroxibut-1-inil)-1,3-dihidropirimidin-2,4diona, HOBuU; 6-amino-5-(4-hidroxibut-1-inil)-3-hidropirimidin-2-ona, HOBuC; 4-(4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidin-3il)but-3-in-1-ol, HOBuPPA; 6-amino-3-(4-hidroxibut-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ol, HOBuPPG; 4-(4,6diaminopirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)but-3-in-1-ol, (NH2)2BuPPAOH.

A menos que se indique lo contrario, los siguientes t�rminos empleados en la memoria y en las reivindicaciones tienen los significados que aparecen a continuaci�n.

El t�rmino “alquilo” se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente saturado lineal, ramificado o c�clico o una

combinaci�n de radicales hidrocarbonados monovalentes saturados c�clicos y lineales o ramificados, que tienen el n�mero de �tomos indicado en el prefijo. Por ejemplo, alquilo(C1-C8) pretende incluir metilo, etilo, n-propilo, 2-propilo, terc-butilo, pentilo, ciclopentilo, ciclopropilmetilo y similares. Para cada una de las definiciones de la presente (por ejemplo, alquilo, alquenilo, alcoxi, aralquiloxi), cuando no se incluye un prefijo para indicar el n�mero de �tomos de carbono de la cadena principal en una porci�n alqu�lica, el radical o su porci�n tendr� ocho o menos �tomos de carbono de la cadena principal.

El t�rmino “alquileno” significa un radical hidrocarbonado divalente saturado lineal o un radical hidrocarbonado

divalente saturado ramificado, que tienen el n�mero de �tomos indicado en el prefijo. Por ejemplo, alquileno(C1-C6) pretende incluir metileno, etileno, propileno, 2-metilpropileno, pentileno y similares.

El t�rmino “alquenilo” significa un radical hidrocarbonado monovalente lineal o un radical hidrocarbonado

monovalente ramificado, que tienen el n�mero de �tomos indicado en el prefijo y que contiene al menos un doble enlace. Por ejemplo, alquenilo(C2-C6) pretende incluir etenilo, propenilo y similares.

El t�rmino “alquinilo” significa un radical hidrocarbonado monovalente lineal o un radical hidrocarbonado

monovalente ramificado que contiene al menos un triple enlace, y que tienen el n�mero de �tomos indicado en el prefijo. Por ejemplo, alquinilo(C2-C6) pretende incluir etinilo, propinilo y similares.

Los t�rminos “alcoxi”, “alquilamino” y “alquiltio” (o tioalcoxi) se emplean con su sentido convencional, y se refieren a los grupos alquilo unidos al resto de la mol�cula a trav�s de un �tomo de ox�geno, un grupo amino o un �tomo de azufre, respectivamente. De forma similar, el t�rmino dialquilamino se refiere a un grupo amino que tiene dos grupos alquilo unidos que pueden ser iguales o diferentes.

El t�rmino “arilo” significa un radical hidrocarbonado arom�tico monoc�clico o b�ciclico monovalente de 6 a 10

�tomos del anillo que no est� sustituido o est� sustituido independientemente con uno a cuatro sustituyentes, preferiblemente uno, dos o tres sustituyentes seleccionados de alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, hal�geno, nitro, ciano, hidroxi, alcoxi, amino, acilamino, monoalquilamino, dialquilamino, haloalquilo, haloalcoxi, heteroalquilo, COR (en el que R es hidr�geno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, fenilo o fenilalquilo), -(CR’R’’)n-COOR (en el que n es un n�mero entero de 0 a 5, R’ y R’’ son independientemente hidr�geno o alquilo, y R es hidr�geno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, fenilo o fenilalquilo), o -(CR’R’’)n-CONRaRb (en el que n es un n�mero entero de 0 a 5, R’ y R’’ son independientemente hidr�geno o alquilo, y Ra y Rb son independientemente hidr�geno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, fenilo o fenilalquilo). De forma m�s espec�fica, el t�rmino arilo incluye, pero no se limita a fenilo, bifenilo, 1-naftilo y 2-naftilo, y sus formas sustituidas. De manera similar, el t�rmino “heteroarilo” se refiere a los grupos arilo en los que uno o m�s hetero�tomos o grupos funcionales de hetero�tomos han reemplazado a un carbono del anillo pero manteniendo las propiedades arom�ticas, por ejemplo piridilo, quinolinilo, quinazolinilo, tienilo y similares. Para ser m�s breves, el t�rmino arilo, cuando se emplea en combinaci�n con otros radicales (por ejemplo, ariloxi, arilalquilo), pretende incluir grupos arilo y grupos heteroarilo seg�n se describi� anteriormente.

El t�rmino “arilalquilo” se refiere a un radical -RaRb, en el que Ra es un grupo alquileno (que tiene el n�mero indicado de �tomos de carbono, o si no se especifica tiene seis o menos �tomos de carbono en la cadena principal), y Rb es un grupo arilo como se define en la presente. Los ejemplos de grupos arilalquilo incluyen bencilo, feniletilo, 3-(3clorofenil)-2-metilfenilo y similares.

De manera similar, el t�rmino “arilalquenilo” significa un radical -RaRb, en el que Ra es un grupo alquenileno, y Rb es un grupo arilo como se define en la presente, por ejemplo, 3-fenil-2-propenilo y similares.

Un “arilheteroalquilo” significa un radical -RaRb, en el que Ra es un grupo heteroalquileno (que tiene el n�mero indicado de �tomos de carbono), y Rb es un grupo arilo como se define en la presente, por ejemplo, 2-hidroxi-2feniletilo, 2-hidroxi-1-hidrometil-2-feniletilo y similares.

El t�rmino “ariloxi” se refiere a un radical -OR, en el que R es un grupo arilo, por ejemplo, fenoxi, naftiloxi y similares.

El prefijo “halo” y el t�rmino “hal�geno”, cuando se emplean para describir un sustituyente, se refieren a -F, -Cl, -Br e -I.

El t�rmino “heteroalquilo” se refiere a un radical alquilo como se define en la presente, con uno, dos o tres

sustituyentes seleccionados independientemente de ciano, -ORa, -NRbRc, y -S(O)nRd (en el que n es un n�mero entero de 0 a 2), entendiendo que el punto de uni�n del radical heteroalquilo es a trav�s de un �tom de carbono del radical heteroalquilo. Rb es hidr�geno, alquilo, arilo o arilalquilo. Rc es hidr�geno, alquilo, arilo, arilalquilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, carboxamido, mono- o dialquilcarbamo�lo o alquilsulfonilo. Rd es hidr�geno (con la condici�n de que n sea 0), alquilo, arilo, arilalquilo, amino, monoalquilamino, dialquilamino o hidroxialquilo. Los ejemplos representativos incluyen, por ejemplo, 2-hidroxietilo, 2,3-dihidroxipropilo, 2-metoxietilo, benciloximetilo, 2cianoetilo y 2-metilsulfoniletilo. Para cada uno de los anteriores, Ra, Rb, Rc y Rd pueden estar tambi�n sustituidos con NH2, fl�or, alquilamino, dialquilamino, OH o alcoxi. Adem�s, el prefijo que indica el n�mero de �tomos de carbono (por ejemplo, C1-C10) se refiere al n�mero total de �tomos de carbono en la porci�n del grupo heteroalquilo excluyendo las porciones de ciano, -ORa, -NRbRc, o -S(O)nRd.

El t�rmino “heterociclilo” se refiere a un radical c�clico no arom�tico saturado o insaturado de 3 a 8 �tomos del anillo en el que uno o dos �tomos del anillo son hetero�tomos seleccionados de O, NR (en el que R es independientemente hidr�geno o alquilo), o S(O)n (en el que n es un n�mero entero de 0 a 2), siendo el resto de los �tomos del anillo C, en el que uno o dos �tomos de C pueden estar opcionalmente reemplazados por un grupo carbonilo. El anillo heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido independientemente con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados de alquilo, hal�geno, nitro, ciano, hidroxi, alcoxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, haloalquilo, haloalcoxi, -COR (en el que R es hidr�geno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, fenilo o fenilalquilo), (CR’R’’)n-COOR (en el que n es un n�mero entero de 0 a 5, R’ y R’’ son independientemente hidr�geno o alquilo, y R es hidr�geno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, fenilo o fenilalquilo), o -(CR’R’’)n-CONRaRb (en el que n es un n�mero entero de 0 a 5, R’ y R’’ son independientemente hidr�geno o alquilo, y Ra y Rb son independientemente hidr�geno, alquilo, fenilo o fenilalquilo). De forma m�s espec�fica, el t�rmino heterociclilo incluye, pero no se limita a tetrahidropiranilo, piperidino, N-metilpiperidin-3-ilo, piperazino, N-metilpirrolidin-3-ilo, 3-pirrolidino, 2-pirrolidon-1-ilo, morfolino, tiomorfolino, tiomorfolino-1-�xido, tiomorfolino-1,1-di�xido, pirrolidinilo y sus derivados. El prefijo que indica el n�mero de �tomos de carbono (por ejemplo, C3-C10) se refiere al n�mero total de �tomos de carbono en la porci�n del grupo heterociclilo excluyendo el n�mero de hetero�tomos.

Los t�rminos “heterociclilalquilo”, “heterociclilalquenilo”, “heterociclilalquinilo” se refieren a radicales -RaRb, en el que Ra es un grupo alquileno, alquenileno o alquinileno, respectivamente, y Rb es un grupo heterociclilo como se define en la presente, por ejemplo, tetrahidropiran-2-ilmetilo, 4-metilpiperazin-1-iletilo, 3-piperidinilmetilo y similares.

El t�rmino “heteroalquileno” significa un radical hidrocarbonado divalente saturado lineal de uno a seis carbonos, o un radical hidrocarbonado saturado ramificado de tres a seis �tomos de carbono con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de -ORa, -NRbRc, y -S(O)nRd (en el que n es un n�mero entero de 0 a 2), en los que Ra, Rb, Rc y Rd son como se define en la presente para un radical heteroalquilo. Los ejemplos incluyen 2hidroxietan-1,2-diilo, 2-hidroxipropan-1,3-diilo y similares.

Cada uno de los anteriores t�rminos (por ejemplo, “alquilo”, “heteroalquilo” y “arilo”) pretenden incluir las formas sustituidas y no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan a continuaci�n.

Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo los grupos que a menudo se denominan alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, heterocicloalquilo y heterocicloalquenilo) pueden ser una diversidad de grupos seleccionados de -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R", -SR’, -hal�geno, -SiR’R"R"’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’,-CONR’R", -OC(O)NR’R", -NR"C(O)R’, -NR’-C(O)NR"R"’, -NR"C(O)2R’, -NH-C(NH2)=NH, -NR’C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R", -CN y -NO2 en un n�mero que var�a de cero a cuatro, preferiblemente cero, uno, dos o tres sustituyentes. R’, R’’ y R’’’ se refieren cada uno independientemente a hidr�geno, alquilo- y heteroalquilo(C1-C8) no sustituidos, arilo no sustituido, arilo sustituido con 1-3 hal�genos, grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi no sustituidos, o grupos aril(alquilo C1-C4). Cuando R’ y R’’ est�n unidos al mismo �tomo de nitr�geno, pueden combinarse con el �tomo de nitr�geno para formar un anillo de 5, 6 � 7 miembros. Por ejemplo, -NR’R’’ pretende incluir 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir del anterior an�lisis de los sustituyentes, los expertos en la t�cnica comprender�n que el t�rmino “alquilo”, en su sentido m�s amplio, pretende incluir grupos,

tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 y similares). Preferiblemente, los grupos alquilo tendr�n 0-3 sustituyentes, m�s preferiblemente 0, 1 � 2 sustituyentes, a menos que se indique lo contrario.

De manera similar, los sustituyentes para los grupos arilo son variados y se seleccionan de -hal�geno, -OR’, OC(O)R’, -NR’R", -SR’, -R’, -CN, -NO2, -CO2R’, -CONR’R", -C(O)R’, -OC(O)NR’R", -NR"C(O)R’, -NR"C(O)2R’, ,-NR’-C(O)NR"R"’, -NHC(NH2)=NH, -NR’C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R", -N3, -CH(Ph)2, perfluoro(alcoxi C1-C4), y perfluoro(alquilo C1-C4), en un n�mero que var�a de cero al n�mero total de valencias

abiertas sobre el sistema de anillos arom�tico; y en el que R’, R’’ y R’’’ se seleccionan independientemente de

hidr�geno, alquilo- y heteroalquilo(C1-C8), arilo y heteroarilo no sustituidos, (arilo no sustituido)-(alquilo C1-C4), y (arilo no sustituido)-oxi(alquilo C1-C4).

Dos de los sustituyentes sobre �tomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar opcionalmente reemplazados por un sustituyente de f�rmula -T-C(O)-(CH2)q-U-, en la que T y U son independientemente -NH-, -O-, -CH2- o un enlace sencillo, y q es un n�mero entero de 0 a 2. Como alternativa, dos de los sustituyentes sobre �tomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar opcionalmente reemplazados por un sustituyente de f�rmula -A-(CH2)r-B-, en la que A y B son independientemente -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR’- o un enlace sencillo, y r es un n�mero entero de 1 a 3. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo formado de esta manera puede estar opcionalmente reemplazado por un doble enlace. Como alternativa, dos de los sustituyentes sobre �tomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar opcionalmente reemplazados por un sustituyente de f�rmula -(CH2)s-X-(CH2)t-, en la que s y t son independientemente n�meros enteros de 0 a 3, y X es -O-, -NR’, -S-, -S(O)2-, o -S(O)2NR’-. El sustituyente R’ en -NR’- y -S(O)2NR’- se selecciona de hidr�geno o alquilo(C1-C6) no sustituido.

Ciertos compuestos u oligonucle�tidos de la presente invenci�n pueden existir en forma salina. Estas sales incluyen sales de adici�n de bases, tales como sales de sodio, potasio, calcio, amonio, amino org�nico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos o los oligonucle�tidos modificados de la presente invenci�n contienen funcionalidades relativamente b�sicas, pueden obtenerse sales de adici�n de �cidos poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del �cido deseado, en forma pura o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adici�n de �cidos aceptables incluyen las derivadas de �cidos inorg�nicos, tales como �cido clorh�drico, bromh�drico, n�trico, carb�nico, monobicarb�nico, fosf�rico, monobifosf�rico, dibifosf�rico, sulf�rico, monobisulf�rico, yodh�drico o fosforoso, y similares, as� como las sales derivadas de �cidos org�nicos, tales como el �cido ac�tico, propi�nico, isobut�rico, maleico, mal�nico, l�ctico, benzoico, succ�nico, sub�rico, fum�rico, mand�lico, ft�lico, bencensulf�nico, p-tolilsulf�nico, c�trico, tart�rico, metansulf�nico y similares. Tambi�n se incluyen sales de amino�cidos, tales como arginato y similares, y sales de �cidos org�nicos, tales como �cido glucur�nico o galactur�nico y similares (v�ase, por ejemplo, Berge, S.M., et al, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Ciertos compuestos espec�ficos de la presente invenci�n contienen funcionalidades b�sicas y �cidas que permiten convertir los compuestos en sales de adici�n de bases o de �cidos.

Las formas neutras de los compuestos pueden regenerarse poniendo en contacto la sal con una base o con un �cido y aislando el compuesto de origen de la manera convencional. La forma original del compuesto se diferencia de las diversas formas salinas en ciertas propiedades f�sicas, tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo dem�s las sales son equivalentes a la forma original del compuesto para los fines de la presente invenci�n.

Ciertos compuestos de la presente invenci�n pueden existir en formas no solvatadas, as� como en formas solvadas, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y se pretende incluirlas en el alcance de la presente invenci�n. Ciertos compuestos de la presente invenci�n pueden existir en m�ltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas f�sicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invenci�n y se pretende que est�n dentro del alcance de la presente invenci�n.

Ciertos compuestos de la presente invenci�n poseen �tomos de carbono asim�tricos (centros �pticos) o dobles enlaces; se pretende que todos los racematos, los diastere�meros, los is�meros geom�tricos y los is�meros individuales est�n incluidos en el alcance de la presente invenci�n. Los procedimientos para la determinaci�n de la estereoqu�mica y para la separaci�n de los is�meros son muy conocidos en la t�cnica (v�ase el an�lisis en el cap�tulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4� edici�n J. March, John Wiley and Sons, Nueva York, 1992).

Los compuestos de la presente invenci�n tambi�n pueden contener proporciones no naturales de is�topos at�micos en uno o m�s �tomos que constituyen dichos compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden estar radiomarcados con is�topos radiativos, tales como por ejemplo tritio (3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). Todas las variaciones isot�picas de los compuestos de la presente invenci�n, tanto radiactivas o no (por ejemplo, 2H), pretenden estar incluidas en el alcance de la presente invenci�n.

Un “grupo protector” o “su forma protegida” se refiere a un agrupamiento de �tomos que, cuando se une a un grupo

reactivo en una mol�cula, enmascara, reduce o evita esa reactividad. Pueden encontrarse ejemplos de grupos protectores en T.W. Greene y P.G. Futs, Protective Groups in Organic Chemistry, (Wiley, 2� ed. 1991); Beaucage e Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311 (1992); y Harrison y Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, vol. 1-8 (John Wiley and Sons. 1971-1996). Los grupos protectores de amino representativos incluyen formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo (CBZ), terc-butoxicarbonilo (Boc), trimetilsililo (TMS), 2trimetilsililetansulfonilo (SES), grupos tritrilo y tritilo sustituido, aliloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), nitroveratriloxicarbonilo (NVOC) y similares. Los grupos protectores de hidroxi representativos incluyen aquellos en que el grupo hidroxi est� acilado o alquilado, tal como bencil y tritil �teres, as� como alquil �teres, tetrahidropiranil �teres, trialquilsilil �teres y alil �teres.

“Opcional” u “opcionalmente” en las anteriores definiciones significa que el acontecimiento o la circunstancia descrita

posteriormente puede haber ocurrido, pero no necesariamente, y que la descripci�n incluye los casos en que el acontecimiento o la circunstancia ocurre y los casos en que no ocurre. Por ejemplo, un grupo heterociclo opcionalmente mono- o disustituido con un grupo alquilo significa que el alquilo puede estar presente, pero no necesariamente, y la descripci�n incluye situaciones en que el grupo heterociclo est� mono- o disustituido con un grupo alquilo, y situaciones en que el grupo heterociclo no est� sustituido con un grupo alquilo.

La pr�ctica de la presente invenci�n emplear�, a menos que se indique lo contrario, t�cnicas convencionales en la qu�mica org�nica, la bioqu�mica, la s�ntesis y modificaci�n de oligonucle�tidos, la qu�mica de bioconjugados, la hibridaci�n de �cidos nucleicos, la biolog�a molecular, la microbiolog�a, la gen�tica, el ADN recombinante y los campos relacionados, tal como se incluyen en la t�cnica. Estas t�cnicas se explican a fondo en la bibliograf�a. V�ase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch y Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982); Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2� edici�n, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Gait (ed.), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1984); Eckstein (ed.), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991).

Generalidades

Los oligonucle�tidos son pol�meros cortos de nucle�tidos, con una longitud en general menor de 200 nucle�tidos,

preferiblemente menor de 150 nucle�tidos, m�s preferiblemente menor de 100 nucle�tidos, m�s preferiblemente menor de 50 nucle�tidos, y lo m�s preferiblemente menor de 21 nucle�tidos. En la t�cnica se considera que los polinucle�tidos, en general, comprenden pol�meros m�s largos de nucle�tidos que los oligonucle�tidos, aunque existe un solapamiento, reconocido en la t�cnica, entre el l�mite superior de la longitud de los oligonucle�tidos y el

l�mite inferior de la longitud de los polinucle�tidos. Con respecto a la presente invenci�n, “oligonucle�tido” se refiere

a un �cido nucleico, que comprende normalmente un marcador detectable, que se emplea como sonda o como cebador, mientras que polinucle�tido se refiere a un �cido nucleico que contiene una secuencia diana. Por

consiguiente, para los objetivos de la presente invenci�n, los t�rminos “oligonucle�tido” y “polinucle�tido” no deben

considerarse limitantes con respecto a la longitud del pol�mero.

La presente invenci�n proporciona oligonucle�tidos modificados que tienen nuevas y sorprendentes propiedades de mayor discriminaci�n de desapareamientos, comparados con oligonucle�tidos sin modificar. Los oligonucle�tidos modificados de la invenci�n se emplean como sondas, y en los que se detecta su hibridaci�n con una secuencia diana, o como cebadores, y en los que se sigue su hibridaci�n con una secuencia diana mediante la s�ntesis de polinucle�tidos iniciada desde el extremo 3’-terminal del oligonucle�tido modificado, y se detecta el producto sintetizado (es decir, el producto de la extensi�n).

Una secuencia diana se refiere a una secuencia de nucle�tidos que comprende un sitio de hibridaci�n para una sonda o un cebador. Las secuencias diana pueden encontrarse en cualquier �cido nucleico incluyendo, pero sin limitarse a ADN gen�mico, ADNc, ARN y cualquier producto amplificado a partir de los mismos, y pueden comprender una secuencia g�nica de tipo salvaje, una secuencia g�nica mutante, una secuencia no codificadora, una secuencia reguladora, etc. Una secuencia diana tendr� una longitud en general menor de 100 nucle�tidos, preferiblemente menor de 50 nucle�tidos, y lo m�s preferiblemente menor de 21 nucle�tidos.

Descripci�n de las realizaciones

La presente divulgaci�n proporciona una serie de oligonucle�tidos modificados que pueden dividirse, en general, en tres grupos.

El primer grupo de oligonucle�tidos modificados de la divulgaci�n son los que tienen al menos dos bases modificadas que reemplazan a las bases naturales. En la presente, las bases modificadas ser�n pirazolo[3,4d]pirimidinas no sustituidas o 3-sustituidas. En algunas realizaciones de la invenci�n, sin embargo, las bases modificadas ser�n seleccionadas de manera que al menos una de las base sea una primidina 5-sustituida y al menos una de las bases sea una pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas o 3-sustituidas como se define en la reivindicaci�n 1. Preferiblemente, este grupo de oligonucle�tidos modificados tendr� grupos unidos adicionales (por ejemplo, ligantes del surco menor, grupos indicadores, extintores, etc.) que, durante los ensayos, ayudan a detectar las secuencias diana.

El segundo grupo de oligonucle�tidos modificados de la divulgaci�n son los que tienen al menos una base modificada pero tambi�n un ligante del surco menor unido, un grupo indicador, un extintor o similares.

El tercer grupo de oligonucle�tidos modificados de la divulgaci�n son los que comprenden una o m�s de las nuevas bases modificadas descritas a continuaci�n. Al igual que en el primer grupo, este grupo de oligonucle�tidos modificados preferiblemente tendr� unidos grupos seleccionados, por ejemplo, de ligantes del surco menor, grupos indicadores o extintores. Cualesquiera realizaciones que no se encuentran dentro del alcance de la invenci�n son proporcionadas solo con fines comparativos.

Oligonucle�tidos modificados

En un aspecto, la presente divulgaci�n proporciona oligonucle�tidos modificados que comprenden al menos dos bases seleccionadas del grupo que consiste en bases de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida y 3-sustituida.

Las bases de pirazolo[3,4-d]pirimidina son aquellas bases en que un anillo pirazol est� condensado con un anillo pirimidina en la siguiente orientaci�n espec�fica

: en la que la l�nea ondulada indica el punto de uni�n entre la base y un az�car formador de olig�mero unido o un amino�cido implicado en la formaci�n de �cidos nucleicos pept�dicos. Adem�s, los grupos X1 y X2 son independientemente H, OH o NH2, de forma que las bases de pirazolo[3,4-d]pirimidina se acercan a la construcci�n de las bases de purina naturales, guanosina, adenina e inosina, as� como a los derivados de estas bases relacionados. En este grupo de realizaciones, una “base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida” se refiere a las bases de f�rmula general Ia, mientras que la expresi�n “base de pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida” se refiere a las bases que tienen la f�rmula Ib, en la que R1 se define como se describe a continuaci�n.

En la f�rmula Ib, los s�mbolos X1 y X2 representan independientemente H, OH, NH2 o su forma protegida. El s�mbolo

R1 representa un miembro seleccionado de heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), 10 O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo

C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12),

aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y sus formas protegidas. Los

grupos heteroalquilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo preferidos son los que terminan (distalmente al sistema de

anillos de pirazolo[3,4-d]pirimidina) en un grupo de hetero�tomo (por ejemplo, OH, NH2, SH y similares). Por 15 ejemplo, los grupos heteroalquilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo preferidos incluyen 3-amino-1-propilo, 4-hidroxi

1-butilo, 3-amino-1-propin-1-ilo, 3-hidroxi-1-propin-1-ilo, 4-hidroxi-3-hidroximetil-1-butin-1-ilo y 4-hidroxi-1-butin-1-ilo,

as� como sus hom�logos superiores. Otros grupos R1 preferidos incluyen los que terminan en un grupo arilo o

heteroc�clico (por ejemplo, heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12),

aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), y aril(alquinilo C2-C12)). Los grupos arilo y heteroc�clicos preferidos son 20 fenilo, tienilo, tiazolilo, imidazolilo, furanilo, oxazolilo, piridinilo, pirrolilo, indolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo y

benzoxazolilo sustituidos o no sustituidos.

En realizaciones de la divulgaci�n, la base de pirazolo[3,4-d]pirimidina se selecciona de:

A�n m�s preferiblemente, las bases modificadas se seleccionan de Ic, Id o Ie, en las que cada R1 es un grupo propinilo, hidroxipropinilo, aminopropinilo, aminobutinilo, hidroxibutinilo, o un grupo fenilo, tienilo, tiazolilo, imidazolilo,

25 furanilo, oxazolilo, piridinilo, pirrolilo, indolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo o benzoxazolilo sustituidos o no sustituidos, unido directamente al sistema de anillos de pirazolo[3,4-d]pirimidina, o unido al sistema de anillos a trav�s de uno a cuatro grupos conectores de carbono que pueden estar saturados (por ejemplo, etileno, propileno, butileno) o insaturados (por ejemplo, acetilenilo, propinileno, butinileno, propenileno, butenileno).

Los oligonucle�tidos modificados de la presente invenci�n tienen un esqueleto como, por ejemplo, el que se

30 encuentra en los oligonucle�tidos naturales o en los �cidos nucleicos pept�dicos (por ejemplo, bases heteroc�clicas unidas a az�cares formadores de olig�mero o amino�cidos formadores de �cidos nucleicos pept�dicos). Los expertos en la t�cnica conocen otros esqueletos oligom�ricos (denominados en lo sucesivo esqueletos “modificados”

o que comprenden modificaciones en el esqueleto). Para los objetivos de esta invenci�n, un oligonucle�tido modificado es cualquier pol�mero oligom�rico, incluyendo el esqueleto de fosfato natural y los esqueletos no

35 naturales, que contenga bases naturales y/o modificadas y que mantenga la capacidad para hibridarse de modo espec�fico con un �cido nucleico complementario para formar un d�plex estable.

En realizaciones preferidas, los oligonucle�tidos modificados de la invenci�n tienen un esqueleto de restos az�car o glicos�dicos, preferiblemente 2-desoxirribofuran�sidos, en el que todos los enlaces internucleot�dicos son enlaces fosfodi�ster naturales. Sin embargo, en una realizaci�n alternativa, los grupos 2-desoxi--D-ribofuranosa est�n 40 reemplazados por otros az�cares, por ejemplo -D-ribofuranosa. Adem�s, la -D-ribofuranosa puede estar presente, en la que el 2-OH del resto ribosa se alquila con un grupo alquilo C1-6 (2-(O-(alquil C1-6))ribosa) o con un grupo alquenilo C2-6 (2-(O-(alquenil C2-6))ribosa), o est� reemplazado por un grupo fl�or (2-fluororribosa). Los az�cares

formadores de olig�mero relacionados �tiles en la presente invenci�n son los que est�n “bloqueados”, es decir,

contienen un puente metileno entre C-4’ y un �tomo de ox�geno en C-2’. Tambi�n pueden utilizarse otros restos az�car compatibles con la hibridaci�n del oligonucle�tido y son conocidos por los expertos en la t�cnica incluyendo, pero sin limitarse a -D-arabinofuran�sidos, -2’-desoxirribofuran�sidos o 2’,3’-didesoxi-3’-aminorribofuran�sidos. Los oligonucle�tidos que contienen -D-arabinofuran�sidos pueden prepararse como se describe en la patente de EEUU n� 5.177.196. Los oligonucle�tidos que contienen 2’,3’-didesoxi-3’-aminorribofuran�sidos se describen en Chen et al. (1995), Nucleic Acids Res., 23:2661-2668. Se han descrito procedimientos sint�ticos para los �cidos nucleicos bloqueados (Singh et al., Chem. Comm., 455-456 (1998); Wengel J., Acc. Chem. Res., 32:301-310 (1998)) y oligonucle�tidos que contienen 2’-hal�geno-2’-desoxirribofuran�sidos (Palissa et al., Z. Chem., 27:216 (1987)). El esqueleto de fosfato de los oligonucle�tidos modificados descritos en la presente tambi�n puede modificarse de modo que los oligonucle�tidos contengan enlaces fosforotioato y/o metilfosfonatos y/o fosforoamidatos (Chen et al., Nucl. Acids Res., 23:2662-2668 (1995)). Las combinaciones de enlaces en el oligonucle�tido tambi�n est� dentro del alcance de la presente invenci�n. Otras modificaciones en el esqueleto son conocidas por los expertos en la t�cnica.

En otro grupo de realizaciones, las bases modificadas descritas en la presente se incorporan en PNA y quimeras de ADN/PNA para equilibrar las Tm y proporcionar oligonucle�tidos modificados que tengan una mayor discriminaci�n de desapareamientos. Diversas formas modificadas de ADN y de an�logos de ADN se han utilizado en los intentos para solucionar algunas de las desventajas del uso de mol�culas de ADN como sondas y cebadores. Entre estos se encuentran los �cidos nucleicos pept�dicos (PNA, tambi�n denominados �cidos nucleicos de poliamida) (Nielsen et al. (1991), Science, 254:1497-1500). Los PNA contienen unidades de bases heteroc�clicas, al igual que en el ADN y en el ARN, que est�n unidas a trav�s de un esqueleto de poliamida, en lugar del esqueleto de az�car-fosfato caracter�stico del ADN y del ARN. Los PNA son capaces de hibridarse con secuencias diana de ADN y ARN complementarias y, de hecho, se hibridan con m�s fuerza que una correspondiente sonda de �cido nucleico. La s�ntesis de olig�meros de PNA y de mon�meros reactivos utilizados en la s�ntesis de olig�meros de PNA se ha descrito en las patentes de EEUU n� 5.539.082, 5.714.331, 5.773.571, 5.736.336 y 5.766.855. Otras estrategias para la s�ntesis de PNA y de quimeras de ADN/PNA y de mon�meros para la s�ntesis de PNA se han resumido (Uhlmann et al. (1998), Angew. Chem. Int. Ed., 37:2796-2823). Por consiguiente, el uso de cualquier combinaci�n de bases normales, bases de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituidas (por ejemplo, PPG y PPA), pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3sustituidas, purina modificada, pirimidina modificada, pirimidinas 5-sustituidas, bases universales o un ligante del surco menor para equilibrar las Tm de un PNA o una quimera de ADN/PNA se encuentra dentro del alcance de esta invenci�n. En la t�cnica se conoce una diversidad de bases universales. Otras bases universales se han descrito en fechas recientes y tambi�n son �tiles en la presente invenci�n (v�ase, Seela, et al., XIV International Round Table: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications, 10-14 de septiembre, 2000, San Francisco, California, p. 40). Los procedimientos sint�ticos necesarios para la s�ntesis de unidades monom�ricas de bases modificadas necesarias para la s�ntesis de PNA y de quimeras de ADN/PNA est�n disponibles en la t�cnica (v�anse los procedimientos de esta solicitud, y Uhlmann et al., Angew. Chem. Int. Ed., 37:2796-2823 (1998).

De forma similar, la presente invenci�n demuestra que una combinaci�n de bases normales, bases de pirazolo[3,4d]pirimidina no sustituidas (por ejemplo, PPG y PPA), pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituidas, purina modificada, pirimidina modificada, pirimidinas 5-sustituidas, bases universales o un ligante del surco menor puede utilizarse para equilibrar las Tm de cualquier pol�mero oligonucleot�dico o quimera de oligopol�mero/ADN.

Para los usos descritos en la presente, los oligonucle�tidos modificados tendr�n preferiblemente de 4 a 70 bases, m�s preferiblemente de 4 a 25 bases. En algunas realizaciones, los oligonucle�tidos modificados tendr�n 15 o menos, o m�s preferiblemente 10 o menos bases. Adem�s, los oligonucle�tidos modificados tendr�n, en algunas realizaciones, 3, 4, 5, 6, 7, 8 � 9 o m�s bases modificadas (pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas o 3-sustituidas). Para cada una de las realizaciones en las que est�n presentes m�ltiples bases de pirazolo[3,4-d]pirimidina 3sustituidas, las bases modificadas pueden ser iguales o diferentes entre s�.

Adem�s de los componentes de bases modificadas, los oligonucle�tidos modificados de la presente invenci�n comprender�n, en algunas realizaciones, otros grupos colgantes, tales por ejemplo intercalantes, grupos lip�filos, ligantes del surco menor, grupos indicadores, agentes quelantes, extintores y agentes reticulantes unidos a una o

m�s de las bases nucleot�dicas localizadas internamente, al extremo 3’, al extremo 5’, a ambos extremos, o pueden

tener estos grupos colgantes unidos internamente y a uno o a ambos extremos. Los procedimientos para unir intercalantes, grupos lip�filos, ligantes del surco menor, grupos indicadores, agentes quelantes, extintores y agentes reticulantes a oligonucle�tidos se han descrito, por ejemplo, en las patentes de EEUU n� 5.512.667 y 5.419.966, la publicaci�n PCT WO 96/32496 y la solicitud de EEUU n� de serie 09/457.616. Los oligonucle�tidos de la invenci�n

tambi�n tienen un “resto de cola” de peso molecular relativamente bajo unido al extremo 3’ o al extremo 5’, o a

ambos extremos. Un ejemplo de una mol�cula de cola puede ser un fosfato, un �ster de fosfato, un grupo alquilo, un grupo aminoalquilo, o un grupo lip�filo. El resto de cola tambi�n puede conectar los intercalantes, los grupos lip�filos, los ligantes del surco menor, los grupos indicadores, los agentes quelantes y las funcionalidades reticulantes a los oligonucle�tidos de la invenci�n.

La naturaleza de los restos de cola y los procedimientos para obtener oligonucle�tidos con diversos restos de cola tambi�n se describen en las patentes de EEUU n� 5.512.667 y 5.419.966, citadas anteriormente.

Ligantes del surco menor

En un grupo de realizaciones, los oligonucle�tidos modificados tambi�n tendr�n unido de forma covalente un ligante del surco menor (“minor groove binder”, MGB). En la bibliograf�a se han descrito una diversidad de ligantes del surco menor adecuados. V�ase, por ejemplo, Kutyavin, et al., patente de EEUU n� 5.801.155; Wemmer, D.E. y Dervan P.B., Current Opinon in Structural Biology, 7:355-361 (1997); Walker, W.L., Kopka, J.L. y Goodsell, D.S., Biopolymers, 44:323-334 (1997); Zimmer, C. y Wahnert, U., Prog. Biophys. Molec. Bio., 47:31-112 (1986); y Reddy, B.S.P., Dondhi, S.M., y Lown, J. W., Pharmacol. Therap., 84:1-111 (1999).

Los procedimientos adecuados para unir MGB (as� como grupos indicadores, tales como fluor�foros y extintores descritos a continuaci�n) a trav�s de conectores a oligonucle�tidos se describen, por ejemplo, en las patentes de EEUU n� 5.512.677; 5.419.966; 5.696.251; 5.585.481; 5.942.610; y 5.736.626.

Los MGB pueden unirse a cualquiera o a ambos extremos del oligonucle�tido. Adem�s, o como alternativa, uno o m�s MGB pueden unirse en el interior del oligonucle�tido, dependiendo de la longitud del oligonucle�tido. En general, la conjugaci�n de un MGB con cualquiera de los extremos del oligonucle�tido proporcionar� el mayor grado de estabilidad del h�brido, puesto que el fundido de un d�plex oligonucleot�dico comienza en los extremos terminales. No obstante, si ambos extremos de un d�plex formado por un oligonucle�tido son relativamente estables, por ejemplo, debido a un alto contenido en G+C, la uni�n de un MGB en el interior de un oligonucle�tido (por ejemplo, cerca de una secuencia rica en A+T) tambi�n puede potenciar la estabilidad. El uso previsto del conjugado de MGB-oligonucle�tido tambi�n puede crear limitaciones a la localizaci�n del MGB conjugado. Por ejemplo, si un oligonucle�tido se dise�a para ser empleado como cebador, el grupo 3’-hidroxi debe estar libre y debe ser capaz de ser alargado por una enzima polimerizante. Como alternativa, un ensayo que requiera un

oligonucle�tido que posea un extremo 5’ marcado requerir� la uni�n interna o en el extremo 3’ de un MGB.

La localizaci�n de un MGB dentro de un conjugado de MGB-oligonucle�tido modificado tambi�n puede afectar a las propiedades discriminatorias de dicho conjugado. Una regi�n desapareada dentro de un d�plex producir� cambios en la forma del surco menor en la vecindad de la base o bases desapareadas. Puestos que los MGB encajan mejor dentro del surco menor de un d�plex de ADN perfectamente apareado, los desapareamientos que producen cambios en la forma del surco menor reducir�n la fuerza de uni�n de un MGB a una regi�n que contenga un desapareamiento. Por tanto, la capacidad de un MGB para estabilizar dicho h�brido disminuir�, aumentando con ello la capacidad de un conjugado de MGB-oligonucle�tido para discriminar un desapareamiento de un d�plex perfectamente apareado. Por otra parte, si un desapareamiento se encuentra fuera de la regi�n complementaria con un conjugado de MGB-oligonucle�tido, se espera que la capacidad discriminatoria de los oligonucle�tidos no conjugados y conjugados con MGB de igual longitud sea aproximadamente la misma. Puesto que la capacidad de una sonda oligonucleot�dica para discriminar desapareamientos de una sola base depende de su longitud, unos oligonucle�tidos m�s cortos ser�n m�s eficaces para discriminar desapareamientos. La principal ventaja de utilizar conjugados de MGB-oligonucle�tido en este contexto se basa en el hecho de que pueden utilizarse oligonucle�tidos mucho m�s cortos, comparados con los que se utilizan en la t�cnica anterior (es decir, 20-meros o m�s cortos), que tienen mayor poder discriminatorio, debido al pronunciado efecto estabilizante de la conjugaci�n del MGB.

Los ligantes del surco menor preferidos se seleccionan de las siguientes f�rmulas:

El sub�ndice m es un n�mero entero de 2 a 5; el sub�ndice r es un n�mero entero de 2 a 10; y cada Ra y Rb son independientemente un grupo conector con el oligonucle�tido modificado, H, -ORc, -NRcRd, -COORc o -CONRcRd , en los que cada Rc y Rd se seleccionan de H, heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), alquilo(C1-C12), alquenilo(C2-C12), alquinilo(C2-C12), aril(alquilo C1-C12), y arilo.

Los ligantes del surco menor particularmente preferidos incluyen el tr�mero de 3-carbamoil-1,2-dihidro-(3H)pirrolo[3,2-e]indol-7-carboxilato (CDPl3), el pent�mero de N-metilpirrol-4-carbox-2-amida (MPC5) y otros ligantes del surco menor que muestran una mayor discriminaci�n de desapareamientos. Otros restos MGB que pueden utilizarse en la pr�ctica de la presente invenci�n se divulgan en la patente de EEUU n� 5.801.155, de propiedad del solicitante. En ciertas realizaciones, los MGB pueden tener unidos grupos potenciadores de la solubilidad en agua (por ejemplo, az�cares o amino�cidos).

Grupos indicadores

En otro grupo de realizaciones, el oligonucle�tido modificado tambi�n comprender� al menos un grupo indicador unido de modo covalente. Los grupos indicadores pueden unirse utilizando procedimientos y grupos conectores descritos anteriormente para los MGB. Los grupos indicadores adecuados para los presentes oligonucle�tidos modificados incluyen esferas, nanopart�culas (Taton, T.A. et al., Science, 289:1757-1760 (2000)), quimioluminiscentes, is�topos, enzimas y fluor�foros. Preferiblemente, el grupo indicador es un fluor�foro (v�ase, Haugland, R.P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, 6� edici�n, Molecular Probes, Eugene, OR, 1996). Los fluor�foros adecuados incluyen los tintes de resorrufina, los tintes de cumarina, los tintes de rodamina, los tintes de cianina, los tintes de BODIPY y los pirenos.

5 Extintores

Los procedimientos de detecci�n desarrollados en fechas recientes emplean el proceso de la transferencia de energ�a de resonancia de fluorescencia (FRET) para la detecci�n de la hibridicaci�n de las sondas, en lugar de la detecci�n directa de la intensidad de fluorescencia. En este tipo de ensayo, se produce una FRET entre un fluor�foro donante (indicador) y una mol�cula aceptora (extintor) cuando el espectro de absorci�n de la mol�cula extintora se 10 solapa con el espectro de emisi�n del fluor�foro donante, y las dos mol�culas est�n muy cercanas. La energ�a del estado excitado del fluor�foro donante se transfiere al aceptor vecino mediante interacci�n de dipolos inducida por dipolos de resonancia, que da como resultado la extinci�n de la fluorescencia del donante. Si la mol�cula aceptora es un fluor�foro, su fluorescencia a veces puede aumentar. La eficacia de la transferencia de energ�a entre las mol�culas de donante y aceptora es muy dependiente de la distancia entre las mol�culas. Las ecuaciones que 15 describen esta relaci�n son conocidas. La distancia de Forster (R0) se describe como la distancia entre las mol�culas de donante y aceptora a la que la transferencia de energ�a es 50% eficaz. Tambi�n se conocen otros mecanismos de extinci�n de la fluorescencia, tales como la extinci�n de transferencia de carga y colisional. En la t�cnica se encuentra una gran cantidad de directrices para seleccionar parejas de extintor y fluor�foro, y su uni�n a oligonucle�tidos (Haugland, R.P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, 6�

20 edici�n, Molecular Probes, Eugene, OR, 1996; patentes de EEUU n� 3.996.345 y 4.351.760 y similares).

Los extintores preferidos se describen en el documento U.S. n� de serie 09/457.616, de propiedad del solicitante (presentado el 8 de diciembre, 1999).

Fluor�foros y extintores

En ciertas realizaciones de la presente invenci�n, se emplean oligonucle�tidos que comprenden marcadores

25 fluorescentes (fluor�foros) y/o agentes extintores de la fluorescencia. En una realizaci�n preferida, un oligonucle�tido contiene un fluor�foro y un agente extintor. Los marcadores fluorescentes incluyen, pero no se limitan a fluoresce�nas, rodaminas, cianinas, ficoeritrinas y otros fluor�foros descritos en la presente. Otros fluor�foros adecuados son conocidos por los expertos en la t�cnica. Tal como se indic� anteriormente, los agentes extintores o extintores pueden absorber la energ�a emitida por un fluor�foro para reducir la cantidad de fluorescencia emitida (es

30 decir, para extinguir la emisi�n del marcador fluorescente). Diferentes fluor�foros son extinguidos por diferentes agentes extintores. En general, las propiedades espectrales de una pareja concreta de fluor�foro/agente extintor son de tal forma que una o m�s longitudes de onda de absorci�n del extintor se solapan con una o m�s de las longitudes de onda de emisi�n del fluor�foro. Una pareja de fluor�foro/agente extintor preferida puede ser seleccionada por los expertos en la t�cnica mediante la comparaci�n entre las longitudes de onda de emisi�n y de excitaci�n seg�n las

35 propiedades indicadas anteriormente.

Para su uso en los ensayos de amplificaci�n realizados a temperaturas elevadas, tales como una reacci�n en cadena de polimerasa u otros procedimientos que emplean enzimas termoestables, el marcador es preferiblemente estable a temperaturas elevadas. Para los ensayos que impliquen polimerizaci�n, el marcador no debe interferir con

la actividad de la enzima polimerizante. Adem�s, el marcador estar� presente en el extremo 5’ y/o 3’ del

40 oligonucle�tido y/o tambi�n puede estar presente de modo interno en una posici�n que no interfiera. Por consiguiente, puede unirse un marcador a cualquiera de las bases, az�cares o restos fosfato del oligonucle�tido, o a cualquier grupo conector que, en s� mismo, est� unido a estos restos.

Aunque la invenci�n se ha descrito en t�rminos de las diversas bases y otros componentes opcionales, la estructura global de los oligonucle�tidos modificados tambi�n puede expresarse en una formula para indicar una construcci�n

45 deseada.

Por tanto, en un grupo de realizaciones, los oligonucle�tidos modificados tienen la f�rmula:

en la que R2 y R3 representan los terminales del oligonucle�tido modificado; el sub�ndice n es un n�mero entero de 4 a 70, m�s preferiblemente de 4 a 25, y a�n m�s preferiblemente de 4 a 10; cada B es un miembro seleccionado independientemente de adenina, timina, citosina, guanina, uracilo, una pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida, y una

50 pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida; y cada M se selecciona de un az�car formador de olig�mero y un amino�cido formador de �cidos nucleicos pept�dicos, con la condici�n de que al menos dos de los B se seleccionan de pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas y pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituidas como se menciona en la

reivindicaci�n 1. En ciertas realizaciones espec�ficas, R 2 y R3 representan los extremos 5’ -y 3’-terminales de un oligonucle�tido modificado, en la que M es un az�car formador de olig�mero (por ejemplo, 2-desoxi--Dribofuranosa, -D-ribofuranosa, -D-arabinofuran�sidos, -2’-desoxirribofuran�sidos, 2’,3’-didesoxi-3’aminorribofuran�sidos y az�cares bloqueados). Para aquellas realizaciones en que los oligonucle�tidos modificados tienen unidos ligantes del surco menor, grupos indicadores, etc., cada uno de los grupos R2 y R3 pretende incluir grupos funcionales adecuados para la uni�n de grupos indicadores y los otros componentes funcionales (MGB, fluor�foro, extintor y similares). Estos grupos funcionales incluyen, por ejemplo, grupos hidroxi, grupos amino, grupos �cido carbox�lico o �ster, grupos �ster o �cido fosf�rico, fosf�nico o fosf�nico, grupos �ster y �cido sulf�nico, y similares. En otras realizaciones, los MGB, los grupos indicadores y similares est�n unidos a cualquiera de los grupos de bases interiores/del esqueleto utilizando la metodolog�a convencional.

En un aspecto relacionado, la presente divulgaci�n proporciona oligonucle�tidos modificados que comprenden al menos una base de pirimidina 5-sustituida y al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3sustituida. La base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida �tiles en este aspecto de la invenci�n son esencialmente las que se han descrito en las patentes de los Estados Unidos n�meros 5.645.985 y 5.484.908.

En realizaciones preferidas de la invenci�n, la base de pirimidina 5-sustituida tiene la f�rmula:

y la base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida tiene la f�rmula:

en la que en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 se selecciona independientemente de H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de R1 y R4 se seleccionado independientemente de H, heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y sus formas protegidas, con la caracter�stica adicional de que R1 tambi�n puede ser H

En realizaciones particularmente preferidas, la nase de pirimidina 5-sustituida se selecciona a partir de:

en las que R4 se selecciona preferiblemente a partir de propinilo, hidroxipropinilo, aminopropinilo, hidroxibutinilo, o un grupo fenilo, tienilo, tiazolilo, imidazolilo, furanilo, oxazolilo, piridinilo, pirrolilo, indolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo o benzoxazolilo, unido directamente alanillo de pirimidina o unido al anillo por uno a cuatro grupos conectores de carbono que pueden estar saturados (por ejemplo, etileno, propileno, butileno) o insaturados (por ejemplo, acetilenilo, propinileno, butinileno, propenileno, butenileno).

En otras realizaciones la base de pirazolo[3,4-d]pirimidina se selecciona de las bases preferidas proporcionadas anteriormente (Ic, Id e Ie). Adem�s, las bases adecuadas tambi�n est�n representadas en la figura 1.

Al igual que el anterior aspecto de la invenci�n, en el que los oligonucle�tidos modificados comprenden al menos dos pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas o 3-sustituidas, este aspecto de la invenci�n puede comprender, de modo similar, otros grupos, tales como MGB y grupos indicadores (por ejemplo, fluor�foros, extintores y similares),

as� como grupos conectores adecuados para la uni�n de estos componentes adicionales. Tambi�n se prefieren las realizaciones en que el oligonucle�tido modificado se representa con la f�rmula:

en la que R2 representa un primer extremo del oligonucle�tido modificado; R3 representa un segundo extremo del oligonucle�tido modificado; el sub�ndice n es un n�mero entero de 4 a 70; cada B se selecciona independientemente de adenina, timina, citosina, guanina, uracilo, una pirimidina 5-sustituida, una pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida, y una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida (con la condici�n de que al menos una base es una pirimidina 5-sustituida y al menos una base es una pirazolo[3,4-d]pirimidina como se menciona en la reivindicaci�n 1); y cada M es un az�car formador de olig�mero y un amino�cido formador de �cidos nucleicos pept�dicos.

En otro aspecto m�s de la divulgaci�n, se proporcionan oligonucle�tidos modificados que comprenden un ligante del surco menor unido, y en los que tan pocas como una de las bases est� reemplazada por una base modificada. De manera sorprendente, la combinaci�n de MGB y una �nica base modificada (u opcionalmente m�ltiples bases modificadas) conduce a un oligonucle�tido modificado que tiene propiedades particularmente �tiles para la discriminaci�n de desapareamientos, as� como extensiones de cebadores y otras utilidades descritas a continuaci�n. Este grupo de oligonucle�tidos modificados preferiblemente comprende de 4 a 70 bases, y un ligante del surco menor unido, en el que al menos una de las bases est� reemplazada por una base modificada seleccionada del grupo que consiste en pirimidinas 5-sustituidas y pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas o 3-sustituidas.

En este aspecto de la divulgaci�n, los ligantes del surco menor, las pirimidinas 5-sustituidas y las pirazolo[3,4d]pirimidinas no sustituidas o 3-sustituidas pueden ser fundamentalmente cualquiera de los componentes descritos anteriormente.

En un grupo de realizaciones de la divulgaci�n, el oligonucle�tido modificado tiene al menos una pirimidina 5sustituida, que tiene preferiblemente la f�rmula:

en la que X3 se selecciona a partir de H, NH2, OH y SH, y R4 se selecciona a partir de heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y sus formas protegidas. En este grupo de realizaciones grupo arilo y heterociclilo preferidos (incluyendo los componentes de otros grupos, por ejemplo, arilaquilo) se seleccionan a partir de versiones sustituidas y no sustituidas de fenilo, tolilo, piridilo, tiazolilo, imidazolilo, furanilo, oxazolilo, tienilo, pirrolilo, benzimidazolilo, benzoxazolilo, benztiazolilo, indolilo, triazinilo, pirimidinilo y naftilo. Los sustituyentes adecuados para estos grupos arilo y heterociclilo son los proporcionados en las definiciones generales anteriores.

Mas preferiblemente, los oligonucle�tidos modificados comprenden al menos un grupo de base de pirimidina 5sustituido de la F�rmula IId y IIe, donde el grupo sustituyente R4 se selecciona a partir de un grupo alquilo o grupo alquinilo sustituido o no sustituido. Preferiblemente R4 es un grupo hidroxipropinilo, hidroxibutinilo, aminopropinilo, aminobutinilo o propinilo. Alternativamente, el sustituyente R4 puede ser un grupo 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1-butinilo (descrito m�s en detalle en lo sucesivo).

En otro grupo de realizaciones preferidas de la divulgaci�n, el oligonucle�tido modificado tiene al menos una base modificada que tiene la f�rmula

en la que en la que cada uno de los grupos X1 y X2 se selecciona independientemente de H, OH, NH2 y un grupo

5 amino protegido; y cada uno de R1 y R4 se seleccionado independientemente de H, heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y sus formas protegidas. En este grupo de realizaciones grupo arilo y heterociclilo preferidos

10 (incluyendo los componentes de otros grupos, por ejemplo, arilaquilo, heterocicloalquilo) se seleccionan a partir de versiones sustituidas y no sustituidas de fenilo, tolilo, piridilo, tiazolilo, imidazolilo, furanilo, oxazolilo, tienilo, pirrolilo, benzimidazolilo, benzoxazolilo, benztiazolilo, indolilo, triazinilo, pirimidinilo y naftilo. Los sustituyentes adecuados para estos grupos arilo y heterociclilo son los proporcionados en las definiciones generales anteriores.

En realizaciones particularmente preferidas de la divulgaci�n, los oligonucle�tidos modificados comprenden al 15 menos un mon�mero de f�rmula If:

en la que X1 y X2 son independientemente H, OH o NH 2; R1 es m�s preferiblemente 3-hidroxipropin-1-ilo, propinilo, 3-aminopropin-1-ilo, 4-hidroxi-1-butinilo, , hal�geno o 3,3,3-trifluoropropin-1-ilo. La s�ntesis de algunos de estos mon�meros se ha descrito (Balow et al., Nuc. Acid Res., 26:3350-33357 (1998); Seela et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., I, 479-488 (1999); Ramzaeva et al., Helv. Chim. Acta, 80:1809-1822 (1997)).

20 Preparaci�n de bases modificadas y oligonucle�tidos

Los esquemas de reacci�n 1-6 proporcionan procedimientos ilustrativos para preparar una serie de bases modificadas (pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas y 3-sustituidas, y pirimidinas 5-sustituidas) que son �tiles en la presente invenci�n. El esquema ilustra la preparaci�n de derivados de fosforamidita de las bases modificadas que pueden utilizarse, por ejemplo, en sintetizadores autom�ticos para preparar los oligonucle�tidos modificados de la

25 invenci�n.

El esquema de reacci�n 1 ilustra la preparaci�n de 3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] de la 5-(propin-2-inil4-metilbenzoato)-5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-desoxiuridina (3), comenzando a partir de 5-yodo-2’-desoxiuridina. Los materiales de partida se trataron con 4-metilbenzoato de prop-2-inilo en presencia de Pd(PPh3)4-CuI para producir el derivado de metilbenzoato (1) que entonces se convirti� en el derivado de DMTr 5’-bloqueado (2) y

30 despu�s en la fosforamidita (3).

Esquema de reacci�n 1

Los esquemas de reacci�n 2 y 3 proporcionan un procedimiento para la preparaci�n de las fosforamitidas de la pirazolo[3,4-d]pirimidina. M�s en concreto, estos esquemas ilustran la preparaci�n de 4-metilbenzoato de 3-[4-((1E)1-aza-2-metilprop-1-enil)-1-((2R,5R)-4-{[bis(metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfinooxi}-5-{[bis(4metoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-2-il)pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il]prop-2-ilnilo (13; R1 = -OCOPhCH3) que se sintetiza en dos porciones.

Esquema de reacci�n 2

En la primera porci�n (esquema de reacci�n 2), se sintetiz� el (2R,5R)-5-(4-amino-3-yodopirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2(hidroximetil)oxolan-3-ol (9) comenzando a partir de 1,5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona. El material de partida se trat� con monocloruro de yodo y P2S5 sucesivamente para producir los derivados de yodo (4) y tiona (5), respectivamente. La tiona (5) se convirti� en el derivado de etiltio (6), que se combin� con un derivado de 1-cloro

5 1,2-didesoxi-3,5-di-O-toluoilribofuranosa para producir el nucle�sido bloqueado (7). La reacci�n del compuesto (7) con met�xido de sodio, seguido de hidr�xido de amonio, produjo el derivado de hidroximetilo (8) y el compuesto (9), respectivamente. En la segunda porci�n (esquema de reacci�n 3), se prepar� el 4-metilbenzoato de 2,3-[4-((1E)-1aza-2-metilprop-1-enil)-1-((2R,5R)-4-{[bis(metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfinooxi}-5-{[bis(4- etoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-2-il)pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il]prop-2-ilnilo (13; R1 = -OCOPhCH3) comenzando a

10 partir del compuesto (9). El compuesto (9) se hizo reaccionar con 4-metilbenzoato de prop-2-inilo en presencia de Pd(PPh3)4-CuI para producir el derivado de prop-2-inilo (10, R1 = -OCOPhCH3). El grupo amino en este compuesto se protegi� mediante una reacci�n con N,N-dimetilacetamida dimetil acetal para producir (11) (R1 = -OCOPhCH3). El compuesto (11) (R1 = -OCOPhCH3) se convirti� en el derivado de DMTr (12) (R1 = -OCOPhCH3) y despu�s en la fosforamidita (13) (R1 = -OCOPhCH3).

15 Esquema de reacci�n 3

El esquema de reacci�n 4 ilustra la preparaci�n de N-{3-[1-((2R,5R)-5-{bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4{[bis(metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfinooxi}oxolan-2-il)-6-amino-4-oxo-(5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)]propil}2,2,2-trifluoroacetamida (22).

Esquema de reacci�n 4

En el esquema de reacci�n 4, la 6-amino-4-metoxipirazolo[3,4-d]pirimidina se convirti� en el derivado de yodo (14), que se trat� con 1-cloro-1,2-didesoxi-3,5-di-O-toluoilribofuranosa para producir el nucle�sido (15). El compuesto (15) se trat� con NaOMe/MeOH para hidrolizar los grupos toluo�lo y producir el nucle�sido no bloqueado (16). El

5 tratamiento de (16) con hidr�xido de sodio acuoso produjo (17), que puede convertirse en el derivado de trifluoro-Nprop-2-inilacetamida (18). El compuesto (18) se redujo con hidr�geno y un catalizador de Pd para producir el derivado de trifluoro-N-propilacetamida (19). El grupo 4-amino del compuesto (19) se protegi� mediante un tratamiento con N,N-dimetilformamida dimetil acetal para producir el compuesto (20), que se convirti� en el derivado de DMTr (21) y despu�s en el derivado de fosforamidita (22).

10 Los compuestos de f�rmula 4 (3-[((2R,5R)-5-(6-amino-4-oxo-3-prop-1-inil-(5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidinil))-2-{[bis(4metoxifenil)fenil]metil}oxolan-3-iloxi)-[bis(metiletil)-amino]fosfinooxi]propanitrilo) (PPPG fosforamidita) pueden sintetizarse utilizando algunas de las reacciones en el esquema de reacci�n 4.

F�rmula 4 F�rmula 5

En la conversi�n de (17) a (18), se emplea prop-1-ino en lugar de 2,2,2-trifluoro-N-prop-2-inilacetamida. El grupo 6amino puede protegerse como se describi� para el compuesto (20), y el 5’-hidroxilo puede protegerse con un grupo DMTr como se describi� para el compuesto (21). Por �ltimo, la fosforamidita puede prepararse como se describi�

5 para el compuesto (22), para producir el compuesto de f�rmula 4. De manera similar, los compuestos de f�rmula 5, en la que R6 es -OCOPhCH3 o -NHCOCF3, pueden prepararse utilizando reacciones conocidas en la t�cnica.

El esquema de reacci�n 5 ilustra la preparaci�n de 3-{[5-(4,6-bis{(1E)-1-aza-2-[bis(2-metilpropil)amino]vinil}-3-prop1-inilpirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]-metil}oxolan-3-iloxi][etil(metiletil)amino}fosfino}propannitrilo (26).

10 Esquema de reacci�n 5

El compuesto (26) puede sintetizarse comenzando a partir de (NH2)2PPPA (23) (v�ase, Seela y Driller, Helv. Chim. Acta, 71:757-761(1988)). El compuesto (23) puede convertirse en el derivado de bis(metiletil)amino (24) (Vincent et

al., J. Org. Chem., 64:991-997 (1999)), seguido de una reacci�n primero con DMTrCl para producir (25), que puede convertirse en la fosforamidita (26).

La reacci�n del esquema 6 proporciona la s�ntesis de pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituidas protegidas, en las que el sustituyente es un grupo heteroalquilo.

Esquema de reacci�n 6

El esquema de reacci�n 7 proporciona la s�ntesis de una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida protegida, en la que el sustituyente es un grupo metoxipropinilo. El derivado de 3-yododiamino (23) se hizo reaccionar con Pd(PPh3)4-CuI, trietilamina en DMF anhidro, seguido de metil propargil �ter, para producir el derivado de 3-metoxipropinil-2,4diaminopirazolo[3,4-d]pirimidina (27). Los grupos amino en este compuesto se bloquearon mediante una reacci�n

10 con N,N-dimetilformamida dimetil acetal para producir (28). El nucle�sido bloqueado se hizo reaccionar primero con cloruro de dimetoxitritilo y despu�s con diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo para producir la fosforamidita bloqueada deseada (29).

Esquema de reacci�n 7

Los siguientes esquemas de reacci�n proporcionan procedimientos para la preparaci�n de pirazolo[3,4-d]pirimidinas sustituidas con 3-heterociclo. Los procedimientos generales proporcionados en la presente pueden adaptarse para la preparaci�n de otros sustituyentes heteroc�clicos.

Esquema de reacci�n 8

El esquema de reacci�n 8 proporciona la s�ntesis de una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida protegida, en la que el sustituyente es un grupo furanilo. Se hizo reaccionar malonitrilo con cloruro de 2-furfurilo en presencia de una base, seguido de un tratamiento con sulfuro de dimetilo para producir el derivado de metoxi dinitrilo (30). La reacci�n de

(30) con hidrazina produjo el pirazol sustituido (31) que se hizo reaccionar con formamida para producir 3-(2

5 furil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina (32). La base (32) se trat� con 1-cloro-1,2-didesoxi-3,5-di-O-toluoilribofuranosa para producir el nucle�tiso bloqueado (33). El compuesto (33) se trat� primero con NaOMe/MeOH para hidrolizar los grupos toluo�lo para producir el nucle�sido no bloqueado que se hizo reaccionar con N,N-dimetilformamida dimetil acetal para producir el derivado de nucle�sido protegido (34). Este derivado se hizo reaccionar primero con cloruro de dimetoxitritilo y despu�s con diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo para producir la fosforamidita bloqueada

10 deseada (35).

Esquema de reacci�n 9

El esquema de reacci�n 9 proporciona la s�ntesis de una 2,4-diaminopirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida protegida, en la que el sustituyente es un grupo furanilo. El carbonitrilo (31) se hizo reaccionar con carbonato de guanidinio para producir 3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamina (36). Esta base se trat� con 1-cloro-1,2-didesoxi-3,5-di-O

15 toluoilribofuranosa para producir el nucle�sido bloqueado, que se trat� con NaOMe/MeOH para hidrolizar los grupos toluo�lo y producir el derivado de nucle�sido no bloqueado (37). Este �ltimo compuesto se hizo reaccionar con N,Ndimetilformamida dimetilacetal para producir el derivado de nucle�sido protegido (38). Este derivado se hizo reaccionar primero con cloruro de dimetoxitritilo y despu�s con diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo para producir la fosforamidita bloqueada deseada (39).

Esquema de reacci�n 10

El esquema de reacci�n 10 proporciona una v�a de s�ntesis para una HOBU-fosforamidita hidroxiprotegida. En este esquema, el 3-butin-1-ol se convierte en su �ster p-toluo�lico (40) con cloruro de p-toluo�lo en presencia de piridina. El butinol protegido se combina con 5-yodo-2’-desoxiuridina en presencia de tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) y

5 yoduro de cobre, despu�s se protege (como un DMT �ter) para formar (41), que entonces puede convertirse en su correspondiente derivado de fosforamidita (42). El reactivo (42) puede utilizarse directamente en la preparaci�n de oligonucle�tidos modificados. La eliminaci�n del grupo protegido de p-toluo�lo puede realizarse seg�n procedimientos convencionales.

En cada uno de los anteriores esquemas, los expertos en la t�cnica entender�n que pueden utilizarse otros grupos

10 protectores y/o grupos activantes. Adem�s, diferentes mon�meros que contienen bases no naturales, con diferentes grupos funcionales, pueden requerir diferentes grupos bloqueantes para la s�ntesis satisfactoria de los oligonucle�tidos modificados. Una diversidad de grupos de protecci�n �tiles, su s�ntesis y los procedimientos de desprotecci�n se describen, por ejemplo, en Beaucage e Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311 (1992).

La s�ntesis de oligonucle�tidos y de oligonucle�tidos modificados puede iniciarse a partir de un soporte s�lido que

15 contenga un conector escindible al cual se une la primera base. Los oligonucle�tidos de la invenci�n pueden sintetizarse para que contengan una pirazolo[3,4-d]pirimidina sustituida como primer nucle�tido en el extremo 3’, utilizando una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida apropiada. Como alternativa, una pirimidina 5-sustituida puede unirse inicialmente a un soporte s�lido. El esquema de reacci�n 11 ilustra una estrategia general para la s�ntesis de un derivado de dA CPG de pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida protegida (C). El intermedio (A) puede prepararse

20 utilizando los procedimientos descritos en el esquema de reacci�n 3, mientras que (B) y (C) pueden sintetizarse como se describe en la solicitud de EEUU n� de serie 09/457.616, en tramitaci�n junto con la presente.

Esquema de reacci�n 11

En este aspecto de la divulgaci�n, una diversidad de soportes s�lidos son �tiles, con la condici�n de que el soporte sea compatible con las t�cnicas de oligonucle�tidos autom�ticas, e incluyen vidrio, poliestireno, nailon, pl�stico y similares. Adem�s, la presente invenci�n proporciona, en un aspecto relacionado, un soporte s�lido (por ejemplo, vidrio de tama�o de poro controlado (CPG)) que tenga una base modificada unida, preferiblemente las que tienen las f�rmula Ic, Id, Ie, If, IIb, IIc, IId, IIe. M�s preferiblemente, la base modificada unida es un resto pirazolo[3,4d]pirimidina 3-sustituida o pirimidina 5-sustituida, en la que los sustituyentes se seleccionan de los grupos preferidos descritos anteriormente, y tambi�n incluye las nuevas bases descritas con m�s detalle a continuaci�n.

La presente invenci�n incluye adem�s aquellas composiciones y procedimientos en los que cualquiera de las pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas y/o 3-sustituidas y/o pirimidinas 5-sustituidas se combinan o se usan en combinaci�n con otras bases modificadas conocidas en la t�cnica. Se han descrito otras unidades monom�ricas modificadas (Scheit, NUCLEOTIDE ANALOGS, John Wiley, Nueva York, 1980; Uhlman y Meyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990); Seela y Debelak, Nucl. Acids Res., 28:3224-3232 (2000); Balow et al., Nucl. Acids Res., 26:3350-3357 (1998); Bolli et al., Nucl. Acids Res., 24:4660-4667 (1996).

Matrices de oligonucle�tidos modificados

En otra realizaci�n de la presente invenci�n, los oligonucle�tidos modificados se emplean en procedimientos que utilizan matrices de oligonucle�tidos, tales como la secuenciaci�n mediante hibridaci�n y el an�lisis basado en matrices de la expresi�n g�nica. La presente invenci�n contempla una diversidad de matrices incluyendo, por ejemplo, matrices en chip o plataforma, matrices en esferas, matrices en fase l�quida, matrices de “c�digo postal” y similares. En la secuenciaci�n mediante hibridaci�n, una matriz ordenada de oligonucle�tidos de diferente secuencia conocida se emplea como plataforma para la hibridaci�n con uno o m�s polinucle�tidos, �cidos nucleicos o poblaciones de �cidos nucleicos de ensayo. La determinaci�n de los oligonucle�tidos que se hibridan y el alineamiento de sus secuencias conocidas permite la reconstrucci�n de la secuencia del polinucle�tido de ensayo. Como alternativa, pueden colocarse en matriz oligonucle�tidos que comprenden la secuencia de tipo salvaje y todas las posibles secuencias mutantes para una regi�n dada de un gen de inter�s. La exposici�n de la matriz al ADN o

ARN de un sujeto o especimen biol�gico, bajo condiciones de hibridaci�n, permite la determinaci�n del estado de tipo salvaje o mutante para el gen de inter�s. V�anse, por ejemplo, las patentes de EEUU n� 5.492.806; 5.525.464; 5.556.752; y las publicaciones PCT WO 92/10588 y WO 96/17957. Ambas t�cnicas requieren una discriminaci�n entre las secuencias relacionadas, en especial al nivel de nucle�tidos individuales; por tanto, las mayores 5 propiedades discriminatorias de los oligonucle�tidos modificados de la invenci�n proporcionar�n mejoras en estas t�cnicas. Los materiales para la construcci�n de matrices incluyen, pero no se limitan a nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio, fibras �pticas y otros materiales adecuados para la construcci�n de matrices, tales como son conocidos por los expertos en la t�cnica. La s�ntesis de matrices de oligonucle�tidos se ha descrito en la solicitud U.S. n� de serie 09/364.320, en tramitaci�n junto con la presente, y pueden realizarse modificaciones adecuadas a los

10 procedimientos que aparecen en �sta para preparar las matrices de la presente invenci�n.

Otra aplicaci�n de la presente invenci�n a la tecnolog�a de las matrices es para el estudio de patrones de expresi�n g�nica en una c�lula o tejido concretos. En este caso, los oligonucle�tidos o los polinucle�tidos que se corresponden con diferentes genes se distribuyen en matriz sobre una superficie y, por ejemplo, se incuba una muestra de �cido nucleico procedente de un tipo de c�lula o de tejido concreto con la matriz bajo condiciones de hibridaci�n. La

15 detecci�n de los sitios sobre la matriz en los que se produce la hibridaci�n permite determinar cu�les oligonucle�tidos se han hibridado y, por tanto, cu�les son los genes activos en la c�lula o el tejido concretos a partir de los cuales se deriv� la muestra.

Los procedimientos de matrices tambi�n pueden utilizarse para la identificaci�n de mutaciones o polimorfismos, en los que las secuencias de tipo salvaje y mutantes se colocan en una matriz ordenada sobre una superficie. La 20 hibridaci�n de una muestra de polinucle�tido con la matriz bajo condiciones rigurosas y la determinaci�n de c�ales son los oligonucle�tidos en la matriz que se hibridan con el polinucle�tido permite determinar si el polinucle�tido posee la secuencia de tipo salvaje o la mutante. Puesto que muchas secuencias mutantes de genes con importancia cl�nica se diferencia de sus hom�logos de tipo salvaje s�lo en una o en unas pocas posiciones de nucle�tidos, los mayores poderes discriminatorios de los oligonucle�tidos modificados de la invenci�n proporcionar�n mejoras en la

25 detecci�n de mutaciones.

En todas las aplicaciones mencionadas anteriormente de la tecnolog�a de matrices, las mayores capacidades discriminatorias de los oligonucle�tidos modificados proporcionan mejoras significativas en la sensibilidad y en el poder de resoluci�n.

Una hibridaci�n eficaz, por ejemplo en matrices, requiere que las sondas de captura contengan Tm en un intervalo de

30 temperaturas peque�o. En una realizaci�n de la invenci�n, la Tm del oligonucle�tido de captura para su uso en matrices est� equilibrada, eliminando el problema asociado con las secuencias ricas en GC y en AT, utilizando una combinaci�n de 3’-MGB y bases modificadas (por ejemplo, PPPA y PPPU). La tabla 1 y la figura 2 ilustran el equilibrio de la Tm de sondas ricas en pirimidina con diferentes pares de bases G/C y A/T. Para equilibrar la Tm de las diferentes sondas se utilizaron PPPA, PU y MGB en combinaci�n. Las sondas ricas en purinas y en pirimidinas y

35 las dianas complementarias se muestran en la tabla 1, y las Tm de estas sondas se muestran en la figura 2. Tal como se muestra en la figura 2, la diferencia en Tm entre una sonda rica en GC y una sonda rica en AT puede ser mayor que 50 �C.

Tabla 1. Secuencias de las sondas oligonucleot�dicas y las dianas complementarias

Dianas complementarias

Sondas ricas en Pi/Pu pares de bases SEQ ID NO:

1*

TCGGCGGCGT 1*.MGB-Q-CGCCGCCG 8 G/C 8

2*

ACAGCGGCGT 2*.MGB-Q-CGCCGCTG 7 G/C, 1 A/T 9

3*

ACAGCGACGT 3*.MGB-Q-CGTCGCTG 6 G/C, 2 A/T 10

4*

TCAGTGACGA 4*.MGB-Q-CGTCACTG 5 G/C, 3 A/T 11

5*

TCAGTGACAA 5*.MGB-Q-TGTCACTG 4 G/C, 4 A/T 12

6*

TCAATGACAG 6*.MGB-Q-TGTCATTG 3 G/C, 5 A/T 13

7*

ACAATGATAA 7*.MGB-Q-TATCATTG 2 G/C, 6 A/T 14

8*

CCAATAATAA 8*.MGB-Q-TATTATTG 1 G/C, 7 A/T 15

9*

GTAATAATAA 9*.MGB-Q-TATTATTA 8 A/T 16

40 Como puede observarse en la figura 2, la modificaci�n con PPPA, PU y MGB proporciona un conjunto de sondas con Tm equilibradas.

Una hibridaci�n eficaz, por ejemplo en matrices, requiere que las sondas contengan Tm en un intervalo de temperaturas estrecho. Por tanto, en realizaciones relacionadas, los oligonucle�tidos modificados descritos en la presente pueden comprender cualquier combinaci�n de bases normales, bases de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida (por ejemplo, PPG y PPA), pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituidas, purina modificada, pirimidina

5 modificada, pirimidinas 5-sustituidas, bases universales y un ligante del surco menor para equilibrar la Tm del oligonucle�tido.

La capacidad para predecir y “equilibrar” las Tm de m�ltiples oligonucle�tidos modificados es particularmente �til para el desarrollo de matrices de oligonucle�tidos o para composiciones que tengan una pluralidad de oligonucle�tidos. Adem�s, la capacidad para predecir las Tm de los oligonucle�tidos modificados es �til para 10 establecer condiciones apropiadas para la hibridaci�n, la renaturalizaci�n, las variaciones de cartografiado de las composiciones de bases de las secuencias, la determinaci�n de la complejidad y de la divergencia de la secuencia. Puede desarrollarse un algoritmo de predicci�n de Tm utilizando modelos que asignan contribuciones termodin�micas a la formaci�n de d�plex para todas las pares de bases posibles individuales que sean las vecinas m�s cercanas. Los par�metros termodin�micos para 10 pares de bases independientes que son las vecinas m�s 15 cercanas est�n disponibles en fuentes publicadas para h�bridos de ADN:ARN (v�ase, Sugimoto et al., Biochem., 34:11211-11216 (1995)) y ADNbc (SantaLucia et al., Biochem., 36:10581-10595 (1997)). El uso de los par�metros de los vecinos m�s cercanos para desarrollar programas para calcular la estabilidad de d�plex oligonucleot�dicos en t�rminos de la Tm se ha descrito (v�ase, Schutz y von Ahsen, Biotechniques, 27:1218-1222 (1999); Owczarzy et al., Biopolymers, 44:217-239 (1997); para PNA/ADN, v�ase Geisen et al., Nucl. Acids Res., 26:5004-5006 (1998); Blake

20 et al., Bioinformatics, 15:370-375 (1999); y la patente de EEUU n� 5.556.749.

Los principios b�sicos de la descripci�n termodin�mica y cin�tica de la discriminaci�n de desapareamientos son muy conocidos y se resumen a continuaci�n.

Una interacci�n sonda-diana es una reacci�n en equilibrio que puede describirse como:

A + B

25 en la que A = sonda, B = diana de ADN

A una temperatura de equilibrio T de reacciones directas (asociaci�n) e inversas (disociaci�n) se puede describir una constante de equilibrio K, en la que:

en t�rminos de equilibrio termodin�mico: 30 K = exp(- H� AB/RT + S�AB/R);

= H�AB - TT S�AB;

G�AB = -RTLn(K)

35 en las que S�AB y G�AB son los cambios en la entalp�a, la entrop�a y la energ�a libre para la formaci�n de un d�plex AB.

El d�plex AB tiene N pares de bases (N-1 vecinas m�s cercanas) y la aproximaci�n de la vecina m�s cercana supone:

= = H�i + H�inic)

H�2 +… H�n-1 +

S�AB = S�1 + S�2 +… S�n-1 + S�inic = S�i + S�inic)

G�AB =

G�2 +… G�n-1 + G�inic = G�i + G�inic)

en las que

G�i son los cambioes en la entalp�a, la entrop�a y la energ�a libre para cada incremento de pares de bases que son las vecinas m�s cercanas para la formaci�n de un d�plex AB,

S�inic y G�inic son los par�metros termodin�micos de inicio de la formaci�n de un d�plex AB.

En el caso de la igualdad de concentraci�n total, Csonda = Cdiana, puede generarse una ecuaci�n para la Tm en t�rminos de energ�a libre, entalp�a y entrop�a como se muestra a continuaci�n:

De manera similar a la mostrada anteriormente, pueden desarrollarse relaciones cuando la sonda se hibrida con una diana que contiene un desapareamiento, como se muestra a continuaci�n:

A + B*

10 en la que A = sonda, B* = diana de ADN desapareada

Los par�metros termodin�micos para el d�plex desapareado AB* son: K*,

expresarse como:

15 H� = H�AB - H�AB* = ( H�3 - H�3*) + ( H�4 - H�4*) = H�3 + H�4

S� = S�AB -S�AB* = (S�3 -S�3*) + ( S�4 -S�3 + S�4

G� = G�AB -G�AB* = (G�3 -G�3*) + ( G�4 -G�4*) = G�3 + G�4

20 En una realizaci�n de la invenci�n se dise�an secuencias de sondas para determinar los par�metros termodin�micos de las vecinas m�s cercanas para oligonucle�tidos que contienen purinas normales, pirimidinas y un ligante del surco menor CDPl3 unido al extremo 3’ de un oligonucle�tido. En otra realizaci�n, se determinan los par�metros termodin�micos de las vecinas m�s cercanas para oligonucle�tidos que contienen pirimidinas normales, purinas, un CDPl3 unido al extremo 3’, pero en los que la guanina est� reemplazada por 5-hidropirazolo[3,4

25 d]pirimidin-4-ona. Los par�metros termodin�micos de las vecinas m�s cercanas se emplean en estas dos realizaciones para calcular las Tm de estos tipos de oligonucle�tidos con y sin CDPl3. En el caso en que el CDPl3 se une en la base 1 del extremo 3’, se emplea la nueva f�rmula y algoritmo de prediccion de Tm derivados de:

30 El modelo supone que un MGB unido a un oligonucle�tido tiene un factor entr�pico puro adicional S�MGB. Este valor puede calcularse seg�n el algoritmo: 6 bases (5 vecinas m�s cercanas) del cebador-3’ y son cubiertas por el MGB desde la base de comienzo “1” o “2”. Cada vecina m�s cercana cubierta tiene un valor exclusivo de S�MGB. Se introduce el factor de correcci�n “A” en el caso en que haya una adenosina en las posiciones de las bases 6, 7 u

8. Se introduce el factor estad�stico “n”, adem�s del factor “A”, cuando n = 3 para -AAA-; n = 2 para -AA-, -ANA-; n =

35 1 para -A-; n = 0 para -AN- y -NA- (N es cualquier base distinta de A). Un valor final de S�MGB puede determinarse mediante la ecuaci�n:

S�MGB = S�iMGB + A(opcional) + R*Ln(N)(opcional)

Las tablas 2a y 2b contienen los par�metros termodin�micos de las vecinas m�s cercanas para oligonucle�tidos que

40 contienen PPG s�lo y la contribuci�n entr�pica del MGB, respectivamente. En el �ltimo caso, se incorpora la contribuci�n de la fluoresce�na y de un extintor oscuro en el tratamiento termodin�mico y en general se ha demostrado que es despreciable (el extintor es parte del conector entre el MGB y el oligonucle�tido).

Tablas 2a y 2b. a) Par�metros de las vecinas m�s cercanas para oligonucle�tidos que contienen PPG; b) La contribuci�n entr�pica del CDPl3

a)

N�mero

5’-3’ H� S� G�(65)

1

AA -7850 -22,3 -324

2

AT -8180 -23,0 -411

3

AC -8450 -22,6 -795

4

AG -6560 -17,2 -730

5

TA -7230 -21,8 129

6

TT -7850 -22,3 -324

7

TC -8750 -24,0 -614

8

TG -6900 -18,3 -715

9

CA 7530 -20,3 -652

10

CT -6390 -17,3 -548

11

CC -7860 -20,1 -1071

12

CG -6030 -14,0 -1288

13

GA -10070 -27,4 -795

14

GT -9110 -23,5 -1175

15

GC -13170 -34,0 -1665

16

GG -8080 -20,2 -1258

17

GCinic -48440 -17,6 1116

18

ATinic -1060 -7,1 1341

b)

N�mero

5’-3’ S�

1

AA 3,408

2

AT 3,060

3

AC 1,442

4

AG 0,750

5

TA 2,463

6

TT 3,313

7

TC 2,870

8

TG 0,893

9

CA 0,607

10

CT 2,253

11

CC 0,905

12

CG -0,721

13

GA 1,282

14

GT 2,397

15

GC 2,172

16

GG 1,298

En una realizaci�n preferida, se equilibran las Tm de m�ltiples oligonucle�tidos modificados que contienen el mismo n�mero de bases utilizando un algoritmo para seleccionar los par�metros de las vecinas m�s cercanas a partir de cualquier combinaci�n de bases normales, bases universales, PPA, PPG, PPPA, PPPG, PU, PC, HOPU, HOBuU,

5 HOBuC, (NH2)2PPPA, (NH2)2PPPAOH, (NH2)2BuPPAOH, (NH2)2PPAI, HOBuPPG, ligante del surco menor, fluor�foro, extintor y un quimioluminiscente.

Como alternativa, las Tm de m�ltiples oligonucle�tidos modificados se equilibran sustancialmente para que contengan el mismo n�mero de bases m�s o menos 1 � 2 bases, con un intervalo de Tm de aproximadamente �C.

10 En algunos casos, se emplean bases modificadas que aumentan la estabilidad del d�plex, adem�s de las bases modificadas que disminuyen la estabilidad del d�plex. Las bases modificadas que disminuyen la estabilidad del d�plex son muy conocidas, por ejemplo, 7-desazaadenina y 7-desazaguanina.

Uso de los oligonucle�tidos modificados

Los oligonucle�tidos modificados de la presente invenci�n proporcionan numerosas ventajas frente a los

15 oligonucle�tidos no modificados, incluyendo una mejor discriminaci�n de desapareamientos. Los oligonucle�tidos modificados de la invenci�n son particularmente �tiles como sondas, y se detecta su hibridaci�n con una secuencia diana, o como cebadores, y se sigue su hibridaci�n a una secuencia diana mediante la s�ntesis del polinucle�tido iniciada desde el extremo 3’-terminal del oligonucle�tido modificado, y se detecta el producto sintetizado (es decir, el producto de la extensi�n).

20 Los oligonucle�tidos modificados de la presente invenci�n son �tiles en otras t�cnicas en que est� implicada la hibridaci�n de un oligonucle�tido a otro �cido nucleico. �stas incluyen, pero no se limitan a las t�cnicas en que la hibridaci�n de un oligonucle�tido a un �cido nucleico diana es el objetivo final; las t�cnicas en que la hibridaci�n de uno o m�s oligonucle�tidos a un �cido nucleico diana es anterior a una o m�s etapas de alargamiento mediadas por polimerasa, que emplean el oligonucle�tido como cebador y el �cido nucleico diana como molde; las t�cnicas en que

25 la hibridaci�n de un oligonucle�tido a un �cido nucleico diana se emplea para bloquear la extensi�n de otro cebador; las t�cnicas en que la hibridaci�n de un oligonucle�tido a un �cido nucleico diana es seguida por la hidr�lisis del oligonucle�tido para liberar un marcador unido; y las t�cnicas en que dos o m�s oligonucle�tidos se hibridan con un �cido nucleico diana y se miden las interacciones entre los m�ltiples oligonucle�tidos. Las condiciones para la hibridaci�n de oligonucle�tidos y los factores que influyen en el grado y la especificidad de la hibridaci�n, tales como

30 la temperatura, la fuerza i�nica y la composici�n del disolvente, son muy conocidos por los expertos en la t�cnica. V�ase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel, et al., supra; M.A. Innis et al. (eds.), PCR Protocols, Academic Press, San Diego, 1990; B.D. Hames et al. (eds.), Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985; y van Ness et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19:5143-5151.

La hibridaci�n de sondas y/o cebadores a secuencias diana se realiza seg�n propiedades de apareamiento de

35 bases muy conocidas y reconocidas en la t�cnica, de forma que las bases de adenina se aparean con timina o uracilo, y las bases de guanina se aparean con citosina. La propiedad de un nucle�tido que le permite aparearse con bases de un segundo nucle�tido se llama complementariedad. Por tanto, la adenina es complementaria con la timina y con el uracilo, y viceversa; de manera similar, la guanina es complementaria con la citosina, y viceversa. Un oligonucle�tido que es complementario a lo largo de toda su longitud con una secuencia diana se dice que es

40 perfectamente complementario, que est� perfectamente apareado, o que es totalmente complementario con la secuencia diana, y viceversa. Un oligonucle�tido y su secuencia diana pueden tener secuencias relacionadas, en las que la mayor�a de las bases en las dos secuencias son complementarias, pero una o m�s bases no son complementarias, o est�n desapareadas. En este caso, se dice que las secuencias son sustancialmente complementarias entre s�. Si las secuencias de un oligonucle�tido y de una secuencia diana son de tal forma que

45 son complementarias en todas las posiciones de los nucle�tidos excepto una, el oligonucle�tido y la secuencia diana tienen un �nico desapareamiento de nucle�tido entre s�.

Los nucle�tidos de pirazolo[3,4-d]pirimidina modificada de la invenci�n conservan la especificidad de apareamiento de bases de sus an�logos naturales; los an�logos de PPPG son complementarios con la citosina, mientras que los an�logos de PPPA son complementarios con la timina y con el uracilo. Los an�logos de PPPG y PPPA no s�lo

tienen una menor tendencia al denominado apareamiento “bamboleante” con bases no complementarias,

comparados con la guanina y la adenina, sino que los grupos 3-sustituidos aumentan la afinidad de uni�n de los d�plex. De manera similar, las pirimidinas modificadas se hibridan de modo espec�fico con sus hom�logos naturales.

Las condiciones para la hibridaci�n son muy conocidas por los expertos en la t�cnica, y pueden variarse dentro de unos l�mites relativamente amplios. La rigurosidad de la hibridaci�n se refiere al grado en que las condiciones de hibridaci�n no favorecen la formaci�n de h�bridos que contienen nucle�tidos desapareados, estimulando con ellos la formaci�n de h�bridos perfectamente apareados o de h�bridos que contienen menos desapareamientos; una mayor rigurosidad se correlaciona con una menor tolerancia por h�bridos desapareados. Los factores que afectan a la rigurosidad de la hibridaci�n incluyen, pero no se limitan a la temperatura, el pH, la fuerza i�nica, la concentraci�n de disolventes org�nicos, tales como formamida y dimetilsulf�xido, y de caotropos. Tal como es bien sabido por los expertos en la t�cnica, la rigurosidad de la hibridaci�n aumenta con una mayor temperatura, una menor fuerza i�nica y una menor concentraci�n de disolventes. V�ase, por ejemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra; M.A. Innis et al. (eds.), PCR Protocols, Academic Press, San Diego, 1990; B.D. Hames et al. (eds.), Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985; y van Ness et al., (1991) Nucleic Acids Res., 19:51435151.

Por tanto, en la formaci�n de h�bridos (d�plex) entre un oligonucle�tido y su secuencia diana, el oligonucle�tido se incuba en disoluci�n, junto con un polinucle�tido que contiene la secuencia diana, bajo condiciones de temperatura, fuerza i�nica, pH, etc., que son favorables para la hibridaci�n, es decir, bajo condiciones de hibridaci�n. Las condiciones de hibridaci�n se eligen, en algunas circunstancias, para que se favorezca la hibridaci�n entre dos �cidos nucleicos que tengan secuencias perfectamente apareadas, comparadas con una pareja de �cidos nucleicos que tengan uno o m�s desapareamientos en la secuencia que se hibrida. En otras circunstancias se eligen las condiciones de hibridaci�n para permitir una hibridaci�n entre secuencias desapareadas, favoreciendo la hibridaci�n entre los �cidos nucleicos que tengan menos desapareamientos.

El grado de hibridaci�n de un oligonucle�tido con una secuencia diana, tambi�n conocido como fuerza de hibridaci�n, se determina mediante procedimientos que son muy conocidos en la t�cnica. Un procedimiento preferidos es determinar la Tm del d�plex h�brido. Esto se logra, como se describi� anteriormente, sometiendo al d�plex en disoluci�n a una temperatura gradualmente en aumento y controlando la desnaturalizaci�n del d�plex, por ejemplo, mediante la absorbancia de la luz ultravioleta, que aumenta seg�n se desapilan las pares de bases, que se produce durante la desnaturalizaci�n. La Tm se define en general como el punto medio de temperatura de la transici�n en la absorbancia de ultravioleta que se produce durante la desnaturalizaci�n. Como alternativa, si se conocen las Tm, puede elegirse una temperatura de hibridaci�n (a una fuerza i�nica, pH y concentraci�n de disolvente fijados) que est� por debajo de la Tm del d�plex deseado y por encima de la Tm de un d�plex no deseado. En este caso, la determinaci�n del grado de hibridaci�n se logra sencillamente ensayando la presencia de la sonda hibridada.

Si una sonda comprende un marcador detectable, los ensayos para la sonda que se va a hibridar normalmente se dise�an para que detecten la presencia de un marcador en un material de d�plex. Esto puede lograrse, por ejemplo, seleccionando de modo espec�fico el material de d�plex, destruyendo de modo espec�fico el material monocatenario,

o utilizando alguna combinaci�n de estos procedimientos. Por ejemplo, las mezclas de la reacci�n de hibridaci�n pueden someterse a condiciones de alta rigurosidad y/o a nucleasas espec�ficas de cadena sencilla; o los d�plex pueden purificarse mediante t�cnicas de afinidad espec�ficas para �cidos nucleicos bicatenarios, en oposici�n a monocatenarios. En una realizaci�n preferida de la invenci�n, los d�plex se detectan por la liberaci�n de un marcador de la sonda bajo condiciones en que el marcador se libera s�lo cuando la sonda est� en un d�plex. Otra realizaci�n requiere la separaci�n del marcador y extintores cuando se hibrida con la diana.

Los marcadores detectables adecuados para su uso con sondas de �cidos nucleicos son muy conocidos por los expertos en la t�cnica e incluyen, pero no se limitan a is�topos radiactivos, crom�foros, fluor�foros, agentes quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes, marcadores magn�ticos, microesferas, metales coloidales (Taton et al., Science 289:1757-1760 (2000)), marcadores inmunol�gicos, ligandos y marcadores enzim�ticos. Los marcadores adecuados tambi�n incluyen marcadores de masa y los que se emplean en la deducci�n de bancos de qu�mica combinatoria, por ejemplo, marcadores que pueden ser reconocidos mediante una cromatograf�a l�quida de alta resoluci�n (HPLC), cromatograf�a de gases, espectrometr�a de masas, fibras de formaci�n de im�genes �pticas, resonancia de plasm�n de superficie, espectroscop�a de correlaci�n, nanotecnolog�a (Guetence et al., J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 739:139-150 (2000)) y similares.

Los procedimientos para marcar oligonucle�tidos son muy conocidos por los expertos en la t�cnica e incluyen, por ejemplo, procedimientos qu�micos y enzim�ticos. Como ejemplo, los procedimientos para la incorporaci�n de grupos qu�micos reactivos en nucle�tidos, en sitios espec�ficos, son muy conocidos por los expertos en la t�cnica. Los oligonucle�tidos que contiene un grupo qu�mico reactivo, localizado en un sitio espec�fico, pueden combinarse con un marcador unido a un grupo reactivo complementario (por ejemplo, un oligonucle�tido que contenga un grupo reactivo nucle�filo puede hacerse reaccionar con un marcador unido a un grupo reactivo electr�filo) para acoplar un marcador con una sonda mediante una t�cnica qu�mica. Los ejemplos de marcadores y de procedimientos para unir un marcador a un oligonucle�tido se describen, por ejemplo, en la patente de EEUU n� 5.824.796; la patente de EEUU n� 5.210.015; Kessler (ed.), Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules, Springer-Verlag, Berlin, 1992; Kricka (ed.), Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, 1992; Howard (ed.), Methods in Nonradioactive Detection, Appleton y Lange, Norwalk, 1993. Puede lograrse un marcaje qu�mico no espec�fico de un oligonucle�tido combinando el oligonucle�tido con un compuesto qu�mico que reaccione, por ejemplo, con un grupo funcional concreto de una base nucleot�dica, y al mismo tiempo o despu�s hacer reaccionar el oligonucle�tido con un marcador. V�ase, por ejemplo, Draper et al. (1980), Biochemistry, 19:1774-1781. La incorporaci�n enzim�tica de un marcador en un oligonucle�tido puede lograrse realizando una modificaci�n enzim�tica o una polimerizaci�n de un oligonucle�tido utilizando precursores marcados, o a�adiendo el marcador de modo enzim�tico a un oligonucle�tido ya existente. V�ase, por ejemplo, la patente de EEUU n� 5.449.767. Los ejemplos de enzimas modificadoras incluyen, pero no se limitan a ADN polimerasas, transcriptasas inversas, ARN polimerasas, etc. Los ejemplos de enzimas que son capaces de a�adir un marcador a un oligonucle�tido ya existente incluyen, pero no se limitan a quinasas, transferasas terminales, ligasas, glicosilasas, etc.

Si un oligonucle�tido es capaz de actuar como un cebador, el grado de hibridaci�n del oligonucle�tido tambi�n puede determinarse midiendo los niveles del producto de la extensi�n del cebador. En este caso, el cebador puede marcarse, o uno o m�s de los precursores para la polimerizaci�n (normalmente los nucle�sidos trifosfato) pueden marcarse. El producto de la extensi�n puede detectarse, por ejemplo, por el tama�o (por ejemplo, mediante una electroforesis en gel), mediante procedimientos de afinidad, o mediante cualquier otra t�cnica conocida por los expertos en la t�cnica.

Los ensayos de extensi�n de cebadores (“minisecuenciaci�n”, “an�lisis de bits gen�ticos”) se emplean habitualmente para la tipificaci�n de SNP y tienen el potencial de poderse utilizar en otras aplicaciones de genotipificaci�n y selecci�n de mutaciones (Pastinen T. et al., Genome Res., 10:1031-42 (2000)). En ciertas realizaciones, las bases modificadas y los ligantes del surco menor mejoran los ensayos de extensi�n de cebadores de varias formas. La mayor estabilidad del d�plex proporcionada por MGB, o la pirimidina 5-sustituida o la pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida, permite realizar las extensiones a temperaturas elevadas. Esto resulta ventajoso porque se eliminan las estructuras secundarias problem�ticas en las mol�culas diana a temperaturas elevadas. Adem�s, la hibridaci�n de la diana al cebador es m�s r�pida a mayor temperatura. En estas reacciones pueden utilizarse polimerasas termoestables, tales como Taq polimerasa y ADN polimerasa de Bst.

Adem�s, los MGB y las bases modificadas mejoran la especificidad de los ensayos eliminando una clase de se�ales de falsos positivos. Las secuencias de cebadores que forman estructuras en horquilla u homod�meros son propensas a una extensi�n independiente del molde (el extremo 5’ del cebador act�a como molde), dando una se�al de falso positivo. Los MGB y las bases modificadas sobre “moldes” inhiben la extensi�n por ADN polimerasas. Por tanto, los MGB en el extremo 5’, o las bases modificadas en el extremo 5’ o en mitad de un cebador puede evitar la

extensi�n (falsos positivos) a partir de horquillas de cebadores o d�meros de cebadores. Por �ltimo, PPG puede emplearse para eliminar las estructuras no can�nicas formadas por oligonucle�tidos ricos en G, permitiendo ensayos de extensi�n de cebadores en estas secuencias.

Otros ensayos en los que los presentes oligonucle�tidos modificados son particularmente �tiles se describen en la solicitud n� de serie 09/054.862, en tramitaci�n junto con la presente.

Otros ensayos de amplificaci�n en los que los nucle�tidos modificados son �tiles incluyen los ensayos de amplificaci�n basados en la ruptura invasiva de sondas oligonucleot�dicas por endonucleasas de ADN solapado (Lyamichev et al., Nature Biotechnol., 17:292-296 (1999); y Olson, et al., High-Throughput Gene Expression Monitoring with the Invader� Assay, Poster, Society for Biomolecular Screening Conference, Vancouver, Columbia Brit�nica, Canad�, 2000); los ensayos de tipo de replicaci�n de secuencia autosostenida (Mueller et al., Histochem. Cell Biol., 108:431-437 (1997)) y similares. De manera sorprendente, las bases no naturales pueden sustituirse en las sondas invasoras y en las sondas gen�micas de un ensayo basado en cleavasas. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a pirazolo[3,4-d]pirimidinas, pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituidas y pirimidinas 5-sustituidas. Los esqueletos no naturales tambi�n se incluyen, tales como los mon�meros utilizados en �cidos nucleicos pept�dicos, �cidos nucleicos bloqueados, etc. Adem�s, los oligonucle�tidos modificados pueden tener unidos ligantes del surco menor, fluor�foros, extintores y similares. Los expertos en la t�cnica apreciar�n que tambi�n pueden utilizarse quimeras para permitir la actividad enzim�tica y la actuaci�n �ptimas.

En la presente invenci�n, de modo inesperado se descubrieron marcadas mejoras en los sistemas basados en cleavasas, cuando las bases modificadas sustituyeron a las bases normales en las sondas invasoras y en las sondas gen�micas. Por tanto, el uso de bases modificadas, tales como hidroxipropilPPA (HOPPPA), (NH2)2PPPAOH y 3-yododiaminoPPA permite disminuir la longitud de las sondas invasoras y las sondas gen�micas, mientras que se proporciona una mejor actuaci�n del ensayo. En otra realizaci�n, las bases no naturales tambi�n se incorporan en la sonda m�dulo.

En vista de lo anterior, la presente invenci�n proporciona en un aspecto un procedimiento para distinguir polinucle�tidos con secuencias relacionadas, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

poner en contacto un oligonucle�tido modificado que tiene una secuencia definida que comprende al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida y al menos una pirimidina 5-sustituida como se define en la reivindicaci�n 1 en lugar de una base de purina o de pirimidina, con al menos dos polinucle�tidos, en el que uno de los polinucle�tidos tiene una secuencia diana que es perfectamente complementaria con el oligonucle�tido modificado y al menos uno de los otros polinucle�tidos tiene una secuencia diana con al menos una base desapareada; y

(b)

determinar el grado de hibridaci�n entre el oligonucle�tido modificado y cada uno de los polinucle�tidos.

Preferiblemente, al menos uno de los otros polinucle�tidos tiene una secuencia diana con una o dos bases desapareadas, m�s preferiblemente s�lo una base desapareada.

Como se indic� anteriormente, una secuencia diana se refiere a una secuencia de nucle�tidos que comprende un sitio de hibridaci�n para una sonda o un cebador. Las secuencias diana pueden encontrarse en cualquier �cido nucleico, incluyendo, pero sin limitarse a ADN gen�mico, ADNc, ARN y cualquier producto amplificado de los mismos, y pueden comprender una secuencia g�nica de tipo salvaje, una secuencia de un gen mutante, una secuencia no codificadora, una secuencia reguladora, etc. Una secuencia diana en general tendr� una longitud menor que 100 nucle�tidos, preferiblemente menor que 50 nucle�tidos, y lo m�s preferiblemente menor que 21 nucle�tidos.

Los oligonucle�tidos modificados utilizados en este aspecto de la invenci�n son fundamentalmente sondas modificadas, y los polinucle�tidos pueden distinguirse determinando cu�les son los polinucle�tidos que se hibridan con la sonda modificada. Las sondas modificadas pueden marcarse con cualquier marcador detectable, o la sonda puede tener la capacidad de ser marcada antes o despu�s de la hibridaci�n, por ejemplo porque contenga un grupo reactivo capaz de asociarse con un marcador o porque sea capaz de hibridarse con una sonda marcada secundaria, antes o despu�s de la hibridaci�n a la diana. Las condiciones para la hibridaci�n de sondas de �cidos nucleicos son muy conocidas por los expertos en la t�cnica. V�ase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra; Innis et al., supra; Hames et al., supra; y van Ness et al., supra.

La hibridaci�n puede ensayarse (es decir, los �cidos nucleicos hibridados pueden identificarse) distinguiendo la sonda hibridada de la sonda libre mediante uno de varios procedimientos muy conocidos por los expertos en lat�cnica. �stos incluyen, pero no se limitan a la union de un �cido nucleico diana a un soporte s�lido, directa o indirectamente (mediante hibridaci�n con una segunda sonda unida a un soporte, o mediante la interacci�n entre ligandos unidos a un soporte y conjugados con una sonda), seguido de la hibridaci�n directa o indirecta con la sonda, y lavando para eliminar la sonda no hibridada; la determinaci�n de la resistencia a nucleasas; la determinaci�n de la densidad de flotaci�n; los procedimientos de afinidad espec�ficos para d�plex de �cidos nucleicos (por ejemplo, cromatograf�a de hidroxiapatito); las interacciones entres m�ltiples sondas hibridadas con el mismo �cido nucleico diana, etc. V�ase, por ejemplo, Falkow et al., patente de EEUU n� 4.358.535; Urdea et al., patentes de EEUU n� 4.868.105 y 5.124.246; Freifelder, Physical Biochemistry, 2� edici�n, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1982; Sambrook, et al., supra; Ausubel et al., supra; Hames et al., supra; y otras referencias relacionadas. La capacidad estabilizante de d�plex de los conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB hace posible la hibridaci�n bajo condiciones m�s rigurosas, en las que puede minimizarse la aparici�n de una estructura secundaria potencialmente oclusora en el �cido nucleico diana. Por consiguiente, estos oligonucle�tidos modificados con MGB son particularmente preferidos en este aspecto de la invenci�n.

En un aspecto relacionado, la presente invenci�n proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia diana en un polinucle�tido, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

incubar un polinucle�tido que se va a ensayar para la presencia de la secuencia diana con un oligonucle�tido modificado que tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria con la secuencia diana bajo condiciones de hibridaci�n; e

(b)

identificar los �cidos nucleicos hibridados;

en el que el oligonucle�tido modificado comprende al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida en lugar de un resto purina y al menos una pirimidina 5-sustituida en lugar de un resto purina como se menciona en la reivindicaci�n 1.

Preferiblemente, el oligonucle�tido modificado es una sonda marcada y tiene al menos dos bases de pirazolo[3,4d]pirimidina 3-sustituida. En este grupo de realizaciones, una sonda marcada se hibrida con una diana y/o un producto de la extensi�n de una diana, y se realiza un cambio en el estado f�sico del marcador como consecuencia de la hibridaci�n. Tal como se emplea en la presente, una “sonda” es una mol�cula de �cido nucleico que es capaz de hibridarse con una secuencia diana en una segunda mol�cula de �cido nucleico. Como ejemplo, un ensayo de este tipo, el ensayo de la sonda hidrolizable, aprovecha el hecho de que muchas enzimas polimerizantes, tales como ADN polimerasas, poseen actividades exonucleol�ticas 5’-3’ intr�nsecas. Por consiguiente, si una sonda se hibrida con una secuencia que puede actuar como molde para la polimerizaci�n (por ejemplo, si una sonda se hibrida con una regi�n del ADN localizada entre dos cebadores de la amplificaci�n, durante el desarrollo de una reacci�n de amplificaci�n), una enzima polimerizante que ha iniciado la polimerizaci�n en un cebador de la amplificaci�n cadena arriba es capaz de digerir la sonda de modo exonucleol�tico. Cualquier marcador unido a dicha sonda se liberar� si la sonda se hibrida con su diana y si la amplificaci�n se est� produciendo a trav�s de la regi�n con la que se hibrida la sonda. El marcador liberado se separa de la sonda marcada y se detecta mediante procedimientos muy conocidos por los expertos en la t�cnica, dependiendo de la naturaleza del marcador. Por ejemplo, los fragmentos marcados de modo radiactivo pueden separarse mediante una cromatograf�a en capa fina y detectarse mediante una autorradiograf�a, mientras que los fragmentos marcados con fluorescencia pueden detectarse mediante irradiaci�n a las longitudes de onda de excitaci�n apropiadas, realiz�ndose la observaci�n a las longitudes de onda de emisi�n apropiadas. V�ase, por ejemplo, la patente de EEUU n� 5.210.015.

En una variaci�n de esta t�cnica, una sonda contiene un marcador fluorescente y un agente extintor que extingue la emisi�n de fluorescencia del marcador fluorescente. En este caso, el marcador fluorescente no es detectable hasta que su relaci�n espacial con el agente extintor haya sido alterada, por ejemplo, mediante la liberaci�n exonucleol�tica del marcador fluorescente de la sonda. As�, antes de la hibridaci�n con su secuencia diana, la sonda marcada de modo dual con un fluor�foro y un extintor no emite fluorescencia. Despu�s de la hibridaci�n de la sonda marcada con un fluor�foro y un extintor con su diana, se transforma en un sustrato para la actividad exonucleol�tica de una enzima polimerizante que ha iniciado la polimerizaci�n en un cebador cadena arriba. La degradaci�n exonucleol�tica de la sonda libera al marcador fluorescente de la sonda y, por tanto, de la vecindad del agente extintor, permitiendo la detecci�n de una se�al fluorescente tras la irradiaci�n a las longitudes de onda de excitaci�n apropiadas. Este procedimiento tiene la ventaja de que el marcador liberado no tiene que separarse de la sonda intacta. Las estrategias con m�ltiplex emplean m�ltiples sondas, cada una de las cuales es complementaria con una secuencia diana diferente y porta un marcador distinguible, permitiendo el ensayo de varias secuencias diana de modo simult�neo.

El uso de conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB en este procedimiento y en procedimientos relacionados permite aplicar a estos ensayos una mayor velocidad, sensibilidad y poder discriminatorio. En particular, la mayor capacidad de los conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB para permitir la discriminaci�n entre un h�brido perfecto y un h�brido que contenga una �nica base desapareada facilitar� el uso de ensayos de sondas hidrolizables para la identificaci�n de polimorfismos de un �nico nucle�tido y similares. Los expertos en la t�cnica apreciar�n que las composiciones y los procedimientos, tales como los de la invenci�n, que sean capaces de discriminar desapareamientos de un �nico nucle�tido tambi�n ser�n capaces de discriminar entre s� secuencias que tengan 2, 3, 4, 5 o incluso 6 desapareamientos.

En otro aspecto relacionado, la presente invenci�n proporciona un procedimiento para la extensi�n de cebadores, comprendiendo dicho procedimiento la incubaci�n de un polinucle�tido que contiene una secuencia diana con uno o m�s cebadores oligonucleot�dicos complementarios con la secuencia diana, en presencia de una enzima polimerizante y de sustratos de nucle�tidos bajo condiciones favorables para la polimerizaci�n; en el que al menos uno de los cebadores oligonucleot�dicos contiene una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida o pirimidina 5sustituida en lugar de una base de purina o de pirimidina como se menciona en las reivindicaciones.

Los procedimientos de amplificaci�n son aquellos en los que se generan muchas copias de una secuencia de �cido nucleico diana, normalmente de una manera exponencial, mediante polimerizaci�n secuencial y/o reacciones de acoplamiento. Adem�s de las reacciones de amplificaci�n m�s tradicionales analizadas a continuaci�n, la presente invenci�n es �til en amplificaciones que implican uniones de tres v�as (v�ase el documento WO 99/37085), amplificaci�n de se�ales (v�ase, Capaldi, et al., Nuc. Acids Res., 28:E21 (2000)), polimerasas de T7, transcriptasa inversa, ARNasa H, RT-PCR, c�rculos rodantes, cleavasa y similares.

Muchas reacciones de amplificaci�n, tal como la PCR, utilizan reacciones de polimerizaci�n dependientes de cebadores reiterativos. Un cebador es un �cido nucleico que es capaz de hibridarse con un segundo �cido nucleico molde y que, cuando est� hibridado, es capaz de ser extendido por una enzima polimerizante (en presencia de sustratos de nucle�tidos), utilizando el segundo �cido nucleico como molde. Las enzimas polimerizantes incluyen, pero no se limitan a ADN y ARN polimerasas y transcriptasas inversas, etc. Las condiciones favorables para la polimerizaci�n por diferentes enzimas polimerizantes son muy conocidas por los expertos en la t�cnica. V�ase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel, et al., supra; Innis et al., supra. En general, para ser extendible por una

enzima polimerizante, un cebador debe tener un extremo 3’ desbloqueado, preferiblemente un grupo 3’ hidroxilo

libre. El producto de una reacci�n de amplificaci�n es un cebador extendido, en el que el cebador ha sido extendido por una enzima polimerizante.

Por tanto, en una realizaci�n de la invenci�n, los procedimientos y las composiciones descritos y reivindicados en la presente son �tiles en reacciones de amplificaci�n mejoradas, tales como PCR. V�ase, por ejemplo, las patentes de EEUU n� 4.683.202; 4.683.195 y 4.800.159; Mullis y Faloona, supra; y Saiki et al., supra. La etapa de polimerizacion de la PCR es catalizada con m�s frecuencia por una enzima polimerizante termoestable, tal como una ADN polimerasa aislada a partir de una bacteria term�fila, debido a la elevada temperatura requerida para la etapa de desnaturalizaci�n de la PCR. Tal como se analiz� anteriormente, uno de los problemas existentes hasta la fecha asociados con la pr�ctica de la PCR es la necesidad de cebadores oligonucleot�dicos relativamente largos, que tengan la suficiente estabilidad del h�brido para actuar como cebadores a las temperaturas elevadas en que se realiza la PCR. Los oligonucle�tidos modificados y, en especial, los conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB son �tiles como cebadores en reacciones de amplificaci�n, tales como la PCR, puesto que las bases modificadas y los MGB aumentan la estabilidad del h�brido, extendiendo con ello significativamente el l�mite inferior de la longitud del cebador �til. Adem�s, los conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB son �tiles enprotocolos de PCR especializados, en los que resulta deseable un longitud reducida del cebador. �stos incluyen, pero no se limitan a la presentaci�n diferencial, en la que la longitud �ptima del cebador es menor que 10 nucle�tidos, las t�cnicas de amplificaci�n aleatoria de polimorfismos en el ADN (RAPD), y los an�lisis de polimorfismos de longitud de amplificaci�n (Liang et al., supra; Williams et al., supra).

Los oligonucle�tidos modificados de la presente invenci�n son aplicables a cualquier tipo de ensayo o procedimiento en el que se emplee una PCR o una t�cnica de amplificaci�n relacionada incluyendo, pero sin limitarse a ensayos de sondas hidrolizables, cebado con oligonucle�tidos espec�ficos de alelos (ASO), an�lisis de polimorfismos de longitud de fragmentos, an�lisis de polimorfismos de un �nico nucle�tido (SNP), y an�lisis de microsat�lites, por ejemplo. Estas y otras t�cnicas son �tiles en el cartografiado de genes, en la identificaci�n y la selecci�n de genes relacionados con enfermedades, y en farmacogen�tica, por mencionar s�lo unas pocas aplicaciones.

En otro aspecto relacionado, la presente invenci�n proporciona un procedimiento para determinar la secuencia de nucle�tidos de un polinucle�tido, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

incubar el polinucle�tido con una matriz de oligonucle�tidos modificados bajo condiciones de hibridaci�n; y

(b)

determinar cu�les son los oligonucle�tidos modificados en la matriz con los que se hibrida el polinucle�tido;

en el que el oligonucle�tido modificado comprende al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida en lugar de una base de purina y almenos una piridina 5-sustituida en lugar de un resto purina como se menciona en la reivindicaci�n 1.

En estos procedimientos, una matriz ordenada que comprende una pluralidad de oligonucle�tidos modificados de diferentes secuencia conocidas se emplea como plataforma para la hibridaci�n con uno o m�s polinucle�tidos, �cidos nucleicos o poblaciones de �cidos nucleicos de ensayo. La determinaci�n de los oligonucle�tidos que se hibridan y el alineamiento de sus secuencias conocidas permiten la reconstrucci�n de la secuencia del polinucle�tido de ensayo. V�ase, por ejemplo, las patentes de EEUU n� 5.492.806; 5.525.464; 5.556.752; y las publicaciones PCT WO 92/10588 y WO 96/17957. Los materiales para la construcci�n de las matrices incluyen, pero no se limitan a nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio, fibras �pticas y otros materiales adecuados para la construcci�n de matrices, tales como son conocidos por los expertos en la t�cnica.

Un problema principal con los actuales procedimientos de an�lisis y secuenciaci�n basados en matrices es que los diferentes oligonucle�tidos en una matriz tendr�n una Tm diferente. Por tanto, es dif�cil determinar las condiciones de rigurosidad que proporcionar�n la m�xima sensibilidad, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de distinguir los desapareamiento de una sola base. Esto es una consideraci�n particularmente importante para la mayor�a, sino todas, las aplicaciones de la tecnolog�a de matrices. El uso de oligonucle�tidos modificados y/o de conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB en las t�cnicas an�lisis y secuenciaci�n basadas en matrices proporciona una soluci�n a este problema. De modo sorprendente, la conjugaci�n de un MGB a un oligonucle�tido modificado hace que su Tm sea relativamente independiente de la composici�n de bases. Por tanto, para una poblaci�n de oligonucle�tidos modificados y de conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB de una longitud dada, la Tm para un h�brido perfecto se encuentra dentro de un intervalo de temperatura relativamente estrecho, independientemente de la secuencia. Al mismo tiempo, la Tm para un desapareamiento de un �nico nucle�tido est� muy por debajo de la Tm del apareamiento perfecto. Por tanto, las matrices dise�adas para que todos los oligonucle�tidos modificados tengan la misma longitud y para que est�n opcionalmente presente como sus conjugados de MGB muestran una variaci�n m�nima en las Tm entre los diferentes oligonucle�tidos en la matriz, lo cual permite unas condiciones de hibridaci�n m�s uniformes para la matriz entera. Otra ventaja del uso de oligonucle�tidos modificados y de conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB en estas t�cnicas es que proporcionan mayor sensibilidad mediante el uso de oligonucle�tidos m�s cortos, a temperaturas mayores (y, por tanto, a mayor rigurosidad), mientras que se sigue manteniendo la resoluci�n de un �nico nucle�tido.

Otra aplicaci�n de la presente invenci�n a la tecnolog�a de matrices es para el estudio de patrones de expresi�n g�nica en una c�lula o tejido concretos (v�ase, en general, Eisen, et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, 303:179205 (1999)). En este caso, los oligonucle�tidos modificados o polinucle�tidos que se corresponden con los diferentes genes se disponen en matriz sobre una superficie, y por ejemplo se incuba una muestra de �cido nucleico procedente de un tipo de c�lula o de tejido concreto con la matriz bajo condiciones de hibridaci�n. La detecci�n de los sitios en la matriz en que se produce hibridaci�n permite determinar cu�les son los oligonucle�tidos modificados que se han hibridado y, por tanto, cu�les son los genes activos en la c�lula o el tejido concretos a partir de los cuales se deriv� la muestra.

Los procedimientos de matrices tambi�n pueden utilizarse para la identificaci�n de mutaciones o polimorfismos, en la que las secuencias de tipo salvaje y mutantes se colocan en una matriz ordenada sobre una superficie (v�ase, Hacia, et al., J. Mol. Genet., 36:730-736 (1999)). La hibridaci�n de una muestra de polinucle�tido con la matriz bajo condiciones rigurosas y la determinaci�n de c�ales son los oligonucle�tidos en la matriz que se hibridan con el polinucle�tido permite determinar si el polinucle�tido posee la secuencia de tipo salvaje o la mutante. Las mayores capacidades discriminatorias de los conjugados de oligonucle�tido-MGB son especialmente �tiles en esta aplicaci�n de la tecnolog�a de matrices.

Por consiguiente, la presente invenci�n proporciona un procedimiento para identificar una mutaci�n en una secuencia diana de un gen de inter�s, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

incubar un polinucle�tido que comprende la secuencia diana con una matriz de oligonucle�tidos de diferentes secuencias, en el que las diferentes secuencias incluyen la secuencia diana de tipo salvaje y diferentes secuencias diana mutantes, bajo condiciones de hibridaci�n; y

(b)

determinar cu�les son los oligonucle�tidos en la matriz que se hibridan con el polinucle�tido;

en el que uno o m�s restos purina en una pluralidad de oligonucle�tidos est�n reemplazados por una pirazolo[3,4d]pirimidina 3-sustituida, y una o m�s bases de pirimidina sonsustituida por una base de pirimidina 5-sustituida como se menciona en la reivindicaci�n 1.

En otro aspecto relacionado, la presente invenci�n proporciona un procedimiento para determinar la secuencia de nucle�tidos de una secuencia diana en un polinucle�tido, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

poner en contacto un polinucle�tido que comprende la secuencia diana con al menos dos oligonucle�tidos de secuencia conocida, en el que uno o m�s restos purina est�n reemplazados por una pirazolo[3,4d]pirimidina 3-sustituida y una o m�s bases de pirimidina son sustituidas por una base de pirimidina 5sustituida como se menciona en la reivindicaci�n 1, y en el que uno de los al menos dos oligonucle�tidos tiene una secuencia que es perfectamente complementaria con la secuencia diana y al menos otro de los oligonucle�tidos tiene una secuencia diana relacionada, e incubar cada uno de los oligonucle�tidos con el polinucle�tido bajo condiciones de hibridaci�n; y

(b)

determinar el grado de hibridaci�n entre cada uno de los oligonucle�tidos y el polinucle�tido.

En una realizaci�n, se emplea una colecci�n de todos los posibles oligonucle�tidos n-meros (en el que n es un n�mero entero menor que aproximadamente 10) en un ensayo de sonda hidrolizable para determinar una secuencia de nucle�tidos. Cada oligonucle�tido est� marcado de manera exclusiva (y preferiblemente modificado), y el an�lisis del marcador liberado indica cu�les son los oligonucle�tidos que se han hibridado con la secuencia diana. El alineamiento de las secuencias de los oligonucle�tidos que se han hibridado proporciona la secuencia de nucle�tidos.

Los oligonucle�tidos modificados, y m�s preferiblemente los conjugados de oligonucle�tido-MGB modificados, tambi�n son �tiles en los procedimientos dependientes de cebador para la secuenciaci�n de ADN, tales como el procedimiento de terminaci�n de cadena y sus derivados, descrito por vez primera por Sanger et al., supra. El uso de conjugados de oligonucle�tidos modificados con MGB en la secuenciaci�n de terminaci�n de cadena permite el uso de cebadores m�s cortos con mayor rigurosidad, y permite un grado mayor de discriminaci�n de desapareamientos durante la secuenciaci�n. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a la b�squeda de genes que comparten una regi�n corta de homolog�a (del orden de unos pocos amino�cidos) y la secuenciaci�n en una regi�n en que existe muy poca informaci�n de secuencia disponible. Los conjugados de oligonucle�tido-MGB son �tiles en estas t�cnicas de secuenciaci�n de cebadores cortos.

En otra realizaci�n, la presente invenci�n proporciona un procedimiento para estudiar la expresi�n g�nica en una c�lula, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

incubar una poblaci�n de polinucle�tidos representativa de los genes expresados en la c�lula con una matriz de oligonucle�tidos que comprende una pluralidad de oligonucle�tidos modificados de diferentes secuencias bajo condiciones de hibridaci�n; y

(b)

determinar cu�les son los oligonucle�tidos modificados en la matriz que se hibridan con los polinucle�tidos;

en el que dichos oligonucle�tidos modificados comprenden al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida en lugar de una purina y una o m�s bases de pirimidina son sustituidas por una base de pirimidina 5-sustituida como se menciona en la reivindicaci�n 1.

En un grupo de realizaciones, el procedimiento se lleva a cabo con una pluralidad Pf de genes expresados procedentes de m�ltiples tipos celulares o tejidos. Los genes est�n preferiblemente marcados con diferentes marcadores de detecci�n, despu�s se hibridan con una matriz al mismo tiempo y se controlan mediante el marcador para determinar el patr�n de expresi�n de cada gen.

Adem�s de los ensayos y de los procedimientos de diagn�stico descritos anteriormente, los oligonucle�tidos modificados y las bases modificadas descritas en la presente tendr�n utilidad en las tecnolog�as antisentido. Se sabe que los oligonucle�tidos antisentido inhiben de modo selectivo la expresi�n g�nica y proporcionan una estrategia gen�tica para el tratamiento y la prevenci�n de enfermedades ((Smith et al., Int. J. Oncol., 17:841-850 (2000)). Otros oligonucl�otidos modificados se han utilizado para mejorar la actuaci�n de oligonucle�tidos antisentido (Zhang et al., Nat. Biotechnol., 18:862-867 (2000); Flanagan et al., Nat. Biotechnol., 14:1139-1145 (1996)). Por consiguiente, otra realizaci�n de la presente invenci�n es el uso de pirimidinas 5-sustituidas, de pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas y de pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituidas como mon�meros, por s� solas o en cualquier combinaci�n,

5 en la s�ntesis de olig�meros antisentido. En otra realizaci�n, las bases modificadas descritas en la presente pueden utilizarse como mon�meros en un oligonucle�tido para disminuir la degradaci�n enzim�tica de los olig�meros antisentido.

Nuevas bases modificadas

En otro aspecto, la presente invenci�n proporciona una serie de nuevas bases modificadas para su uso en la

10 preparaci�n de oligonucle�tidos modificados de la invenci�n. Estas bases de la divulgaci�n tienen la f�rmula general:

en la que Z1 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H, F y ORa, en el que Ra es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo(C1-C8) y un grupo protector de hidroxi; Z2 es un miembro 15 seleccionado del grupo de H, alquilo(C1-C8), o se combina opcionalmente con Z1 para formar un anillo de cinco o siete miembros, que tiene de uno a tres hetero�tomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N; Y1 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en OH, un grupo hidroxi protegido, y O-P1, en el que P1 es una fosforamidita o un grupo H-fosfonato; Y2 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en OH, un grupo hidroxi protegido y O-P2, en el que P2 es una fosforamidita, H-fosfonato, monofosfato, difosfato o trifosfato; y B es un

20 nucle�tido modificado seleccionado del grupo que consiste en:

en las que X11 y X12 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, NH2 y un grupo amino protegido; y cada R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), heterociclilo, 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 3

25 metoxiprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 4-amino-1-butinilo y 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1-butinilo, con la condici�n de que R12 sea distinto de 2-piridiletinilo.

En un grupo de realizaciones, B es:

Preferiblemente, X11 es NH2, y X12 es H. M�s preferiblemente, X11 es NH2, X12 es H, Y1 es O-P1, Y2 es hidroxi

30 protegido, Z1 es H, y R12 se selecciona de 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 4-amino-1butinilo, 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1-butinilo, 3-metoxiprop-1-inilo, 2-furanilo, 3-furanilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-pirrolilo, 3pirrolilo, 1,3-isoxazol-4-ilo, 1,3-isoxazol-5-ilo, 1,3-isoxazol-2-ilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, 2-piridilo, 3-piridilo y 4piridilo. En realizaciones particularmente preferidas, Y1 es -O-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] e Y2 es -O(4,4’-dimetoxitritilo).

En otro grupo de realizaciones, B es:

Preferiblemente, X12 es NH2 o H. M�s preferiblemente, X12 es NH2 o H, Y1 es O-P1, Y2 es hidroxi protegido, Z1 es H,

5 y R12 se selecciona de 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1-butinilo, 3-metoxiprop-1inilo, 2-furanilo, 3-furanilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 1,3-isoxazol-4-ilo, 1,3-isoxazol-5-ilo, 1,3-isoxazol2-ilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, 2-piridilo, 3-piridilo y 4-piridilo. En realizaciones particularmente preferidas, Y1 es O-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] e Y2 es - O-(4,4’-dimetoxitritilo).

En otra realizaci�n preferida, los oligonucle�tidos modificados de la invenci�n tienen al menos una base de f�rmula

10 III (incluyendo aquellos en los que los grupos protectores de acetilo han sido retirados, e incluyendo otras formas protegidas y otras formas activadas de los mismoss).

La preparaci�n de los compuestos de f�rmula II (incluyendo los compuestos en los que el grupo 6-amino est� protegido y los grupos hidroxi del az�car est�n protegidos o activados como una fosforamidita) se proporciona en el esquema de reacci�n 6, anterior.

15 En la realizaci�n m�s preferida de la invenci�n, las bases modificadas se seleccionan de las f�rmulas IVa, IVb o IVc.

Estos compuestos son particularmente adecuados para su uso en sintetizadores de oligonucle�tidos autom�ticos, y para preparar ciertos oligonucle�tidos modificados descritos en la presente

Otras bases modificadas que son �tiles en la presente invenci�n incluyen las representadas por las f�rmula Va y Vb: en las que R7 se selecciona de OH, SH o NH2. Estos compuestos pueden sintetizarse mediante los procedimientos descritos en la presente.

En otro grupo de realizaciones B es

Preferiblemente X11 es NH2. M�s preferiblemente X11 es NH2, Y1 es O-P1, Y2 es hidroxi protegido, Z1 es H, y R11 se selecciona de 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 4-amino-1-butinilo 3-(hidroximetil)-4

10 hidroxi-1-butinilo, y 3-metoxiprop-1-inilo. En realizaciones particularmente preferidas Y1 es -O-[(2-cianoetil)-N,Ndiisopropilfosforamidita] e Y2 es - O-(4,4’-dimetoxitritilo).

En otro grupo de realizaciones, B es

Preferiblemente, Y1 es O-P1, Y2 es un hidroxi protegido, Z 1 es H, R11 se selecciona a partir de 3-hidroxiprop-1-inilo,

15 3-aminoprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 4-amino-1-butinilo 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1-butinilo, y 3-metoxiprop-1-inilo. En realizaciones particularmente preferidas Y1 es -O-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] e Y2 es - O-(4,4’dimetoxitritilo).

En un aspecto relacionado, la presente invenci�n proporciona oligonucle�tidos modificados que tienen la f�rmula:

20 en la que cada Z1 se selecciona independientemente de H, F y ORa, en el que Ra es un miembro seleccionado de H, alquilo(C1-C8) y un grupo protector de hidroxi; cada Z2 es H o alquilo(C1-C8), o se combina opcionalmente con Z1 para formar un anillo de cinco o siete miembros; cada Z3 se selecciona de O, S o NH; cada Y se selecciona independientemente de P(O)OH, P(S)OH y P(O)CH3; el sub�ndice n es un n�mero entero de 1 a 98; W1 y W2 se seleccionan cada uno independientemente de H, un monofosfato, un difosfato, un trifosfato y un ligante del surco

25 menor-resto de grupo conector que tiene unido opcionalmente un grupo indicador o un extintor; y cada B se selecciona independientemente del grupo que consiste en adenina, guanina, citosina, uridina y las bases modificadas de f�rmula:

en las que X11 y X12 se seleccionan cada uno independientemente H, NH2 y un grupo amino protegido; y cada R11 se selecciona independientemente de las formas protegidas o no protegidas de 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1inilo, 3-metoxiprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 4-amino-1-butinilo, 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1-butinilo, y cada R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en formas protegidas o no protegidas de 3-hidroxiprop-1inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 3-metoxiprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 4-amino-1-butinilo, 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1butinilo

heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), y heterociclilo, con la condici�n de que R12 sea distinto de 2-piridiletinilo; y con la condici�n adem�s de que al menos uno de los B se selecciona de las bases modificadas, y opcionalmente uno o m�s de los B tiene unido un ligante del surco menor unido-resto de grupo conector, un grupo indicador o una combinaci�n de los mismos.

Las bases modificadas particularmente preferidas son las que se han descrito anteriormente.

Ejemplos

Cualesquiera ejemplos que se encuentran fuera de las reivindicaciones son proporcionado solo confines comparativos.

En el ensayo de sondas hidrolizables, se a�ade una sonda marcada a una reacci�n de PCR. La sonda es complementaria con una regi�n entre los dos cebadores de PCR y est� marcada con dos fluor�foros, uno de los cuales extingue la fluorescencia del otro. La sonda se dise�a para hibridarse con su secuencia diana complementaria sobre una de las hebras del producto de la PCR a la temperatura de extensi�n de hebra o a una temperatura mayor, que se utiliza habitualmente en la PCR (55-57 �C). Las enzimas de polimerizaci�n que normalmente se emplean en la PCR (en particular, la Taq polimerasa) poseen una actividad 5’-exonucleasa intr�nseca. Durante la s�ntesis de nuevas hebras en la etapa de extensi�n de la reacci�n de PCR, esta actividad 5’exonucleasa actuar� sobre las hebras complementarias unidas al molde. Si una sonda, marcada como se describi� anteriormente, se une al molde, la actividad 5’-exonucleasa asociada con la enzima polimerizante liberar� el fluor�foro unido. Una vez liberado, su fluorescencia ya no ser� extinguida y se obtendr� una se�al fluorescente. V�ase, por ejemplo, la patente de EEUU n� 5.210.015; Livak et al. (1995), PCR Meth. App., 4:357-362; y Heid et al. (1996), Genome Res., 6:986-994.

Se realiz� una cromatograf�a en capa fina sobre placas revestidas de aluminio de gel de s�lice 60 F-254 (EM Reagents). Se obtuvo una RMN de 1H a 300 MHz en un espectr�metro Varian VXR-300. Se emplearon experimentos bidimensionales (Cosy) y NOE para ayudar a asignar las resonancias de prot�n. Los an�lisis elementales fueron realizados por Quantitative Technologies Inc. (Boundbrook, NJ).

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la s�ntesis de la 3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] de la 5-(propin-2-inil-4metilbenzoato)-5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-desoxiuridina (3).

5-(prop-2-inil-4-metilbenzoato)-2’-desoxiuridina (1)

A una mezcla de 5-yodo-2’-desoxiuridina (5,0 g, 14,12 mmol), CuI (270 mg, 1,42 mmol), Pd(PPh3)4 (0,82 g, 0,714 mmol) y trietilamina (2,4 ml) en 30 ml de DMF anhidra se le a�adi� 4-metilbenzoato de prop-2-inilo (6,10 g, 35,06 mmol). La mezcla se agit� bajo una atm�sfera de arg�n durante 4 h y luego se evapor� hasta la sequedad. El residuo se tritur� en metanol y se retir� el exceso de 4-metilbenzoato de prop-2-inilo precipitado mediante filtraci�n. El filtrado se evapor� y el residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con metanol al 10% en acetato de etilo. Las fracciones del producto puro se evaporaron hasta la sequedad y el residuo precipit� en acetato de etilo-�ter: 3,14 g (56%) de rendimiento; TLC (metanol al 10% en acetato de etilo), R f = 0,50; RMN de 1H (DMSO-d6) 11,68 (1H, s, uracil N-H), 8,29 (1H, s, 6-H), 7,89 y 7,35 (4H, 2 x d, J = 8,2 Hz, toluoil Hs), 6,10 (1H, t, J = 6,4 Hz, 1’-H), 5,24 (1H, d, J = 4,4 Hz, 3’-OH), 5,15 (2H, s, alquinil-CH2), 5,12 (1H, t, J = 5,2 Hz, 5’-OH), 4,24 (1H, m, 3’-H), 3,79 (1H, q, 4’-H), 3,59 (2H, m, 5’-Hs), 2,39 (3H, s, toluoil-CH3), 2,13 (2H, m, 2’-H).

5-(prop-2-inil-4-metilbenzoato)-5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-desoxiuridina (2)

A una disoluci�n de (1) (3,0 g, 7,50 mmol) en 45 ml de piridina anhidra se le a�adi� cloruro de dimetoxitritilo (3,0 g). La disoluci�n resultante se agit� durante 4 h a temperatura ambiente y luego se verti� sobre 400 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x 300 ml) y el extracto se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor�. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con metanol al 5% en acetato de etilo. Las fracciones del producto puro se reunieron y se evaporaron para producir (2) como una espuma: 4,16 g (79%) de rendimiento.

3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] de la 5-(propin-2-inil-4-metilbenzoato)-5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’desoxiuridina (3)

A una disoluci�n de (2) (4,0 g, 5,70 mmol) en 130 ml de cloruro de metileno anhidro, que conten�a 3,0 ml de N,Ndiisopropiletilamina, se le a�adi� cloro(2-cianoetoxi)-(N,N-diisopropilamino)fosfina (2,22 ml) bajo una atm�sfera de arg�n. La disoluci�n se agit� durante 30 min a temperatura ambiente y despu�s se trat� con 3,0 ml de metanol. La disoluci�n se diluy� con 300 ml de acetato de etilo y se lav� con 300 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La fase acuosa se extrajo con 300 ml de acetato de etilo y las fases org�nicas reunidas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de hexano del 30% al 0% en acetato de etilo (trietilamina al 2%). Las fracciones puras se reunieron y se evaporaron, y el residuo precipit� en acetato de etilo-hexanos: 3,35 g (65%) de rendimiento; TLC (hexano al 20% en acetato de etilo), Rf = 0,82 y 0,71 (diastere�meros); RMN de 31P (DMSO-d6) 147,82 y 147,45.

Ejemplo 2

Fase 1: Preparaci�n de (2R,5R)-5-(4-amino-3-yodopirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (9)

3-yodo-1,5-dihidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona (4)

La s�ntesis de este compuesto ha sido indicada previamente por Taylor et al. (Tetrahedron, 48(37):8089-8100 (1992)) utilizando N-yodosuccinimida. La s�ntesis de los inventores, que emplea monocloruro de yodo como agente yodante, se describe a continuaci�n.

A una disoluci�n de 1,0 l de acetato de sodio 1,2 M se le a�adi� 4-hidroxipirazolo[3,4-d]pirimidina (25 g, 184 mmol), seguido de monocloruro de yodo (46 g, 284 mmol). La mezcla se agit� en un recipiente sellado durante 4 h a 110 �C. La reacci�n completada se enfri� hasta la temperatura ambiente y se trat� con una disoluci�n de 30 g de metabisulfito de sodio en 200 ml de agua. El precipitado blanco formado se filtr� y se enjuag� con agua fr�a. El s�lido entonces se disolvi� en 200 ml de una disoluci�n de hidr�xido de potasio 3,2 M. Se a�adi� monohidrato de hidrazina (5 ml) y la disoluci�n se agit� durante 15 min. La disoluci�n entonces se acidific� hasta aproximadamente pH 7 mediante la adici�n de 50 ml de HCl concentrado, seguido de un ajuste fino del pH con �cido ac�tico. El s�lido que se form� se filtr�, se enjuag� con agua fr�a y se sec�: 551, g (114% de rendimiento). Nota: es dif�cil eliminar el agua residual secando el s�lido al vac�o. El agua residual se retira mediante un proceso de evaporaci�n de piridina en la siguiente etapa.

3-yodo-1,5-dihidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-tiona (5)

El compuesto (4) (21,5 g, 82,1 mmol) se suspendi� en 150 ml de piridina anhidra y la mezcla se evapor� hasta la sequedad. El s�lido se resuspendi� en 170 ml de piridina seca (bajo una atm�sfera de arg�n) y se a�adi� P2S5 (26,8 g). La mezcla se agit� durante 10 min a 65 �C y despu�s durante 2-6 horas a 95 �C. La disoluci�n resultante se enfri� hasta la temperatura ambiente y se desgasific� burbujeando una corriente de arg�n en la disoluci�n (se hace pasar gas de sulfuro hacia una trampa que contiene una disoluci�n de hidr�xido de sodio). La disoluci�n de reacci�n entonces se redujo en volumen hasta que se form� un jarabe espeso. El exceso de P2S5 se descompuso mediante la adici�n de partes al�cuotas de 1 ml de agua hasta que ces� la reacci�n vigorosa, seguido de la adici�n de 500 ml de agua y 10 ml de �cido ac�tico. La mezcla se calent� hasta 70 �C durante 1 h para facilitar la expulsi�n del gas de sulfuro de hidr�geno y despu�s se diluy� con 500 ml de agua y se enfri� en un ba�o de hielo. El s�lido se filtr�, se lav� con agua y se sec�: 19,8 g (87%) de rendimiento.

4-etiltio-3-yodopirazolo[3,4-d]pirimidina (6)

El compuesto (5) (43,5 g, 157 mmol) se agit� en una disoluci�n de hidr�xido de potasio (38,6 g de KOH en 350 ml de agua) durante 30 min. La mezcla se filtr� y el filtrado se acidific� hasta pH 10 mediante la adici�n de �cido ac�tico, y despu�s se diluy� con 350 ml de etanol absoluto. Se a�adi� yodoetano (10 ml) y la disoluci�n se agit� a temperatura ambiente. Se a�adieron m�s partes al�cuotas de 10 ml de yodoetano despu�s de 30 min y de 1,0 h. La reacci�n se complet� despu�s de un total de 90 min. Otros ensayos requieren la posterior adici�n de yodoetano para completar la reacci�n. La disoluci�n de reacci�n se diluy� con 700 ml de agua y 20 ml de �cido ac�tico. La mezcla se enfri� en un ba�o de hielo y el s�lido se filtr�, se enjuag� con agua y se sec�. Este producto bruto se disolvi� en 300 de DMF y se agit� a 90 �C durante 15 min. El material insoluble se retir� mediante filtraci�n y el filtrado se diluy� con 1 l de agua y se enfri� en un ba�o de agua helada. El s�lido se filtr�, se enjuag� con agua y se sec�: 19 g (40%) de rendimiento.

4-metilbenzonato de [(2R,5R)-5-(4-etiltio-3-yodopirazolo[3,4-d]pirimidinil)-3-(4-metilfenilcarboniloxi)oxolan-2-il]metilo

(7)

El compuesto (6) se convirti� en la correspondiente sal pot�sica mediante una reacci�n con 1 equivalente molar de hidr�xido de potasio en agua. La disoluci�n resultante se evapor� hasta la sequedad y el residuo se evapor� en acetonitrilo seco. La sal pot�sica de (6) (29,0 g, 94,73 mmol) se disolvi� en 80 ml de DMF anhidra y despu�s se diluy� con 830 ml de acetonitrilo anhidro. El derivado de cloroaz�car (48 g, 123 mmol) se a�adi� en una porci�n y la mezcla se agit� durante 3 h y despu�s se diluy� con 1,5 l de metanol acuoso al 25%. Se dej� la mezcla en reposo a 5 �C durante la noche. Los cristales se filtraron, se enjuagaron con metanol acuoso al 25% y se secaron: 32,2 g (52%) de rendimiento.

(2R,5R)-2-(hidroximetil)-5-(3-yodo-4-metilpirazolo[3,4-d]pirimidinil)oxolan-3-ol (8)

A una suspensi�n de (7) (10,97 g, 16,66 mmol) en 250 ml de metanol se le a�adieron 22 ml de met�xido de sodio 1 N en metanol. La mezcla se agit� a reflujo y se control� el avance de la reacci�n en cuanto la mezcla se volvi� una disoluci�n transparente. Nota: se observ� la formaci�n de productos secundarios si se contin�a el reflujo despu�s de la conversi�n completa a (5). La reacci�n se extingui� mediante la adici�n de 1,34 ml de �cido ac�tico en cuanto un componente, que se corresponde con el producto deseado, se observ� mediante TLC. La disoluci�n se evapor� y el residuo precipit� en metanol-�ter-hexano. El s�lido se filtr� y se sec�: 6,8 g (104%) de rendimiento del producto bruto (que contiene acetato de sodio).

(2R,5R)-5-(4-amino-3-yodopirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (9)

El compuesto (8) (6,8 g, 17,35 mmol) se agit� en 200 ml de hidr�xido de amonio concentrado (recipiente sellado) a temperatura ambiente durante 36 h. La mezcla se evapor� y el residuo se precipit� en acetonitrilo-�ter. El s�lido se filtr� y se sec�: 5,36 g (82%) de rendimiento. Los datos de RMN y espectrales de este compuesto son id�nticos a

Fase 2: Preparaci�n de 4-metoxibenzoato de 3-{4-((1E)-1-aza-2-metilprop-1-enil)-1-((2R,5R)-5-{[bis(4metoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4-{[bis(metiletil)amino]-(2-cianoetoxi)fosfinooxi}oxolan-2-il)pirazolo[3,4-d]pirimidin-3il]prop-2-ilnilo (13; R1 = -OCOPhCH3)

4-metilbenzoato de 3-{1-((2R,5R)-4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il}prop-2ilnilo} (10; R1 = -OCOPhCH3)

A una mezcla de (9) (2,40 g, 6,37 mmol), CuI (124 mg, 0,648 mmol), Pd(PPh3)4 (380 mg, 0,331 mmol) y trietilamina (1,32 ml) en 12 ml de DMF anhidra se le a�adi� 4-metilbenzoato de prop-2-inilo (1,87 g, 11,85 mmol). La mezcla se agit� bajo una atm�sfera de arg�n durante 12 h y luego se evapor� hasta la sequedad. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con metanol al 5% en acetato de etilo. Las fracciones del producto puro se evaporaron para producir una espuma: 2,29 g (85%) de rendimiento; TLC (metanol al 10% en acetato de etilo), Rf = 0,43; RMN de 1H (DMSO-d6) 8,26 (1H, s, 6-H), 7,92 y 7,37 (4H, 2 x d, J = 8,5 Hz, toluoil-Hs), 6,55 (1H, t, J = 6,3 Hz, 1’-H), 5,29 (2H, s, alquinil-CH2), 5,28 (1H, d, J = 4,7 Hz, 3’-OH), 4,76 (1H, t, J = 5,7 Hz, 5’-OH), 4,41 (1H, m, 3’-H), 3,81 (1H, m, 4’-H), 3,49 y 3,56 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 2,76 y 2,24 (2H, 2 x m, 2’-Hs), 2,39 (3H, s, toluoil- CH3).

4-metilbenzoato de 3-{4-((1E)-1-aza-2-metilprop-1-enil)-1-((2R,5R)-4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]pirazolo[3,4d]pirimidin-3-il}prop-2-inilo (11; R1 = -OCOPhCH3)

El compuesto (10) (1,76 g, 4,16 mmol) se agit� en una disoluci�n de 5,0 ml de N,N-dimetilacetamida, 1,9 ml de N,Ndimetilacetamida dimetil acetal y 2,0 ml de trietilamina anhidra durante 15 h a temperatura ambiente. Los disolventes se evaporaron y el residuo se evapor� dos veces en xilenos, para producir ( 11) como una espuma: TLC (metanol al 10% en acetato de etilo), Rf = 0,29; RMN de 1H (DMSO-d6) 8,51 (1H, s, 6-H), 7,90 y 7,37 (4H, 2 x d, J = 8,3 Hz, protones de toluo�lo), 7,28, 7,14 y 6,74 (13H, d y 2 m, J = 7,1 Hz para el doblete, protones de tritilo), 6,63 (1H, m, 1’-H), 5,32 (1H, d, J = 5,0 Hz, 3’-OH), 5,24 (2H, s, alquinil-CH2), 4,56 (1H, m, 3’-H), 3,93 (1H, m, 4’-H), 3,68 (6H, s, metoxi Hs), 3,32 y 3,11 (6H, 2 x s, N-metilos), 3,09-2,95 (2H, m, 5’-Hs), 2,81 y 2,32 (2H, 2 x m, 2’-Hs), 2,40 (3H, s, =

-

Me), 2,19 (3H, s, toluoil-Me).

4-metilbenzoato de 3-{4-((1E)-1-aza-2-metilprop-1-enil)-1-((2R,5R)-5-{[bis(4-metoxifenil)fenil]metoxi}metil}-4hidroxioxolan-2-il)pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il]prop-2-inilo (12; R1 = -OCOPhCH3)

A una disoluci�n de (11) en 25 ml de piridina anhidra se le a�adi� cloruro de dimetoxitritilo (1,67 g). La disoluci�n resultante se agit� durante 4 h a temperatura ambiente y despu�s se verti� en 250 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La mezcla se extrajo con acetato de etilo y el extracto se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor�. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con metanol al 5% en acetato de etilo. Las fracciones de producto puro se reunieron y se evaporaron para producir (12) como una espuma: 2,06 g (62%) de rendimiento para el proceso en dos etapas.

4-metoxibenzoato de 3-{4-((1E)-1-aza-2-metilprop-1-enil)-1-((2R,5R)-5-{[bis(4-etoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4{[bis(metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfinooxi}oxolan-2-il)pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il]prop-2-inilo (13; R1 = -OCOPhCH3),

o

3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] de 1-[2-desoxi-5-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)- -D-eritro-pentofuranosil]4-[(dimetilamino)prop-1-enil]-3-(prop-2-inil-4-metilbenzoatoe)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (13)

A una disoluci�n de (12) (2,03 g, 2,56 mmol) en 60 ml de cloruro de metileno anhidro, que conten�a 1,33 ml de N,Ndiisopropiletilamina, se le a�adi� cloro(2-cianoetoxi)-(N,N-diisopropilamino)fosfina (1,0 ml) bajo una atm�sfera de arg�n. La disoluci�n se agit� durante 1,0 h a temperatura ambiente y despu�s se trat� con 2,0 ml de metanol. La disoluci�n se diluy� con 250 ml de acetato de etilo y se lav� con 200 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La fase org�nica se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor�. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con trietilamina al 2% en acetato de etilo. Las fracciones puras se reunieron y se evaporaron. La fosforamidita (13) precipit� en �ter-hexanos: 1,82 g (71%) de rendimiento; TLC (metanol al 5% en acetato de etilo), Rf = 0,32; RMN de 31P (DMSO-d6) 147,90 y 147,22.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la preparaci�n de N-{3-[1-((2R,5R)-5-{bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4{[bis(metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfinooxi}oxolan-2-il)-6-amino-4-oxo-(5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)]propil}2,2,2-trifluoroacetamida (22).

3-yodo-4-metoxipirazolo[3,4-d]pirimidin-6-ilamina (14)

Se suspendi� 4-metoxipirazolo[3,4-d]pirimidin-6-ilamina (6,75 g, 40,87 mmol) en una disoluci�n acuosa que conten�a acetato de sodio (6,0 g, 44,09 mmol) y monocloruro de yodo (9,12 g, 56,17 mmol) y se agit� a 100 �C en un recipiente de reacci�n sellado durante 24 h. La mezcla resultante se enfri� hasta la temperatura ambiente y se trat� con una disoluci�n de metabisulfito de sodio (3,6 g, 18,94 mmol) en 24 ml de agua. El s�lido que se form� se filtr�, se enjuag� con agua y se sec�: 6,93 g (58%) de rendimiento; TLC (metanol al 10% en acetato de etilo), R f = 0,57; RMN de 1H (DMSO-d6) 13,08 (1H, s a, prot�n N-1), 10,58 (1H, s, prot�n N-5), 6,60 (2H, s a, 6-amino).

4-metilbenzoato de [(2R,5R)-5-(6-amino-3-yodo-4-metoxipirazolo[3,4-d]pirimidinil)-3-(4-metilfenilcarboniloxi)oxolan-2il]metilo (15)

A una suspensi�n de (14) (6,68 g, 22,95 mmol) en 150 ml de metanol se le a�adieron 8,05 ml de hidr�xido de potasio metan�lico 2,85 M. La mezcla se agit� durante un minuto y luego se diluy� con 100 ml de tolueno y se evapor�. La sal pot�sica s�lida de (1) se sec� al vac�o. La sal pot�sica se suspendi� en 75 ml de DMF anhidra y despu�s se diluy� con 420 ml de acetonitrilo anhidro. Se a�adi� inmediatmente 1-cloro-1,2-didesoxi-3,5-di-Otoluoilribofuranosa (8,95 g, 22,95 mmol) y la mezcla de reacci�n se agit� a temperatura ambiente bajo una atm�sfera de arg�n durante 1 h, y despu�s se filtr�. El filtrado se evapor� y la espuma residual se recristaliz� dos veces en metanol: 6,59 g (45%) de rendimiento; TLC (acetato de etilo/hexano 1:1), Rf = 0,52; RMN de 1H (DMSO-d6) 7,93 y 7,37 (8H, m y d, J = 7,9 Hz para el d, arom�tico), 7,10 (2H, s a, 6-amino), 6,51 (1H, t, J = 6,6 Hz, 1’-H), 5,69 (1H, m, 3’-H), 4,44 (3H, m, 4’-y 5’-Hs), 3,99 (3H, s, 4-metoxi), 3,19 y 2,63 (2H, 2 x m, 2’-Hs), 2,40 y 2,38 (6H, 2 x s, protones de toluoilmetilo).

[(2R, 5R)-5-(6-amino-3-yodo-4-metoxipirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (16)

A una suspensi�n de (15) (32,4 g, 50,40 mmol) en 600 ml de metanol se le a�adieron 12,5 ml de met�xido de sodio 1 M en metanol. La mezcla de reacci�n se agit� a reflujo durante 18 h y despu�s se enfri� en una nevera (-10 �C). Los cristales de (3) que se formaron se filtraron y se enjuagaron con metanol enfr�ado en hielo: 10,95 g de rendimiento. Se a�adi� �cido ac�tico (12,5 ml) al filtrado y el volumen se redujo a aproximadamente 300 ml. Se dej� la disolucion en reposo en la nevera durante la noche y se recogi� otra cosecha de cristales (3,95 g). El filtrado se evapor� hasta la sequendad y el aceite residual se tritur� con �ter. El s�lido que se form� se filtr�, se sec� y se recristaliz� en agua hirviendo: 2,03 g. Rendimiento total = 16,93 g (83%); TLC (metanol al 10% en acetato de etilo, R f = 0,23; RMN de 1H (DMSO-d6) 7,02 (2H, s a, 6-amino), 6,33 (1H, t, J = 6,1 Hz), 5,24 (1H, d, J = 4,4 Hz, 3’-OH), 4,73 (1H, t, J = 5,6 Hz, 5’-OH), 4,36 (1H, m, 3’-H), 3,99 (3H, s, 4-metoxi), 3,75 (1H, m, 4’-H), 3,51-3,32 (2H, m, 5’-Hs), 2,79 y 2,17 (2H, 2 x m, 2’-Hs). Anal. calc. para C11H14IN5O4 � 0,3 H2O: C, 32,02; H, 3,57; N, 16,98. Encontrado: C, 32,13; H, 3,35; N, 16,77.

1-[(2R,5R)-(5-hidroximetil)oxolan-2-il]-6-amino-3-yodo-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona (17)

Una suspensi�n de (16) (16,84 g, 41,36 mmol) en 1,5 l de una disoluci�n de hidr�xido de sodio 1 N se calent� a reflujo. La mezcla se volvi� una disoluci�n homog�nea y se enfri� hasta 25 �C utilizando un ba�o de agua helada. Se a�adi� �cido ac�tico (90 ml) y la disoluci�n se almacen� a 5 �C durante la noche. Los cristales que se formaron se filtraron, se enjuagaron con agua enfriada en hielo y se secaron: 7,47 g de rendimiento de (4). El filtrado se evapor� hasta un volumen de aproximadamente 500 ml y se almacen� a 5 �C durante la noche. Se recogi� una segunda cosecha de cristales (3,75 g). El filtrado se evapor� hasta aproximadamente 200 ml. El acetato de sodio que se form� se retir� mediante filtraci�n y el filtrado se almacen� a 5 �C durante la noche. Se recogi� otra cosecha de cristales (2,25 g). Rendimiento total: 13,47 g (83%); TLC (n-butanol/agua/�cido ac�tico 5:3:2), R f = 0,74; RMN de 1H (DMSO-d6) 6,22 (1H, t, J = 6,3 Hz, 1’-H), 4,33 (1H, m, 3’-H), 3,73 (1H, m, 4’-H), 3,47 y 3,36 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 2,63 y 2,12 (2H, 2 x m, 2’-Hs). Anal. calc. para C10H12IN5O4 � 0,7 H2O: C,,29.60; H, 3,33; N, 17,26. Encontrado: C, 29,81; H, 3,02; N, 17,00.

N-(3-{1-[(2R,5R)-4-(hidroximetil)oxalan-2-il]-6-amino-4-oxo-(5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)}prop-2-inil)-2,2,2trifluoroacetamida (18)

A una mezcla de (17) (6,00 g, 15,26 mmol), CuI (297 mg, 1,56 mmol) y tetrakis[trifenilfosfina]paladio(0) en 30 ml de DMF anhidra se le a�adi� trietilamina anhidra (3,14 ml), seguido de trifluoroacetamida de propargilo (4,29 g, 28,41 mmol). La disoluci�n de reacci�n se agit� bajo una atm�sfera de arg�n durante 40 h. La DMF se retir� mediante evaporaci�n y el aceite residual se trit� en cloroformo. El s�lido de (5) bruto que se form� se filtr�, se enjuag� con cloroformo y se sec�. El s�lido se disolvi� en un volumen m�nimo de DMF, se absorbi� sobre gel de s�lice y se evapor�. La mezcla seca se carg� en una columna de gel de s�lice y se eluy� con metanol al 10% en acetato de etilo. Las fracciones del producto se reunieron y se evaporaron. El residuo precipit� en acetato de etilo/�ter: 4,0 g (63%) de rendimiento; TLC (metanol al 20% en acetato de etilo), Rf = 0,59; RMN de 1H (DMSO-d6) 10,79 (1H, s, N5-H), 10,16 (1H, t, J = 5,2 Hz, trifluoroacetimido N-H), 6,77 (2H, s a, 6-amino), 6,28 (1H, t, J = 6,3 Hz, 1’-H), 5,23 (1H, d, J = 4,1 Hz, 3’-OH), 4,72 (1H, t, J = 5,1 Hz, 5’-KOH), 4,32 (3H, m, -CONH-CH2-y 3’-H), 3,75 (1H, m, 4’-H), 3,50-3,29 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 2,65 y 2,15 (2H, 2 x m, 2’-Hs). Anal. calc. para C15H15F3N6O5 � 0,74 H2O: C, 41,93; H, 3,87; N, 19,56. Encontrado: C, 42,33; H, 3,64; N, 19,13.

N-(3-{1-[(2R,5R)-4-(hidroximetil)oxalan-2-il]-6-amino-4-oxo-(5-hidropirazolo[5-4-d]piriminin-3-il)}propil)-2,2,2trifluoroacetamida (19)

A una disoluci�n de (18) (1,0 g, 2,40 mmol) en 100 ml de metanol que conten�a 0,12 g de hidr�xido de paladio al 20% (preactivado con �cido f�rmico) se le a�adieron 2,0 ml de tamp�n formiato de trietilamonio 4 M (pH 6,5). La mezcla se agit� bajo 241,32 kPa de gas hidr�geno durante 18 h (durante algunos de los ensayos fue necesario a�adir m�s catalizador para la reducci�n completa). La mezcla se filtr� a trav�s de Celite y el filtrado se evapor�. El aceite residual se cristaliz� en agua: 0,79 g (78%) de rendimiento; TLC (metanol al 20% en acetato de etilo), R f = 0,52; RMN de 1H (DMSO-d6) 10,59 (1H, s, N5-H), 9,47 (1H, t a, trifluoroacetimido N-H), 6,64 (2H, s a, 6-amino), 6,27 (1H, t, J = 6,3 Hz, 1’-H), 5,18 (1H, d, J = 4,4 Hz, 3’-OH), 4,75 (1H, t, J = 5,9 Hz, 5’-OH), 4,36 (1H, m, 3’-H), 3,75 (1H, m, 4’-H), 3,48 y 3,61 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 3,22, 2,68 y 1,87 (6H, 3 x m, protones de propilmetileno), 2,68 y 2,12 (2H, 2 x m, 2’-Hs); Anal. calc. para C15H19F3N6O5 � 0,90 H2O: C, 41,27; H, 4,80; N, 19,25. Encontrado: C, 41,57; H, 4,50; N, 19,11.

N-(3-[(1E)-1-aza-2-(dimetilamino)prop-1-enil]-[(2R,5R)-4-(hidroximetil)oxalan-2-il]-6-amino-4-oxo-(5-hidropirazolo[5-4d]piriminin-3-il)}propil)-2,2,2-trifluoroacetamida (20)

A una disoluci�n de (19) (0,80 g, 1,98 mmol) en 5,0 ml de DMF anhidra se le a�adi� N,N-dimetilformamida dimetil acetal (3,1 ml). La disoluci�n se agit� durante 2,0 h bajo una atm�sfera de arg�n y despu�s se evapor�. El residuo se evapor� dos veces en xilenos y despu�s se coloc� al vac�o. El s�lido amorfo (20) que se form� se tritur� con �ter y se recogi�: 773 mg (82%) de rendimiento; TLC (metanol al 20% en acetato de etilo), R f = 0,47; RMN de 1H (DMSOd6) 11,22 (1H, s a, N5-H), 9,47 (1H, t, J = 5,5 Hz, trifluoroacetimido N-H), 8,67 (1H, s, N=CH-N), 6,42 (1H, t, J = 6,5 Hz, 1’-H), 5,22 (1H, d, J = 4,3 Hz, 3’-OH), 4,75 (1H, t, J = 6,1 Hz, 5’-OH), 4,40 (1H, m, 3’-H), 3,77 (1H, m, 4’-H), 3,50 y 3,38 (2H, 2 x s, 5’-Hs), 3,18 y 3,05 (6H, 2 x s, N,N-dimetil Hs), 3,22, 2,72 y 1,89 (6H, 3 x m, propil metilen Hs), 2,72 y 2,15 (2H, 2 x m, 2’-Hs); Anal. calc. para C18H24N7O5 � 0,40 H2O: C, 44,80; H, 5,18; N, 20,32. Encontrado: C, 45,02; H, 4,96; N, 19,94.

N-{3-[1-((2R,5R)-5-{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4-hidroxioxolan-2-il)-6-amino-4-oxo-(5-hidropirazolo[3,4d]pirimidin-3-il)]propil}-2,2,2-trifluoroacetamida (21)

A una disoluci�n de (20) (723 mg, 1,52 mmol) en 9,0 ml de piridina anhidra se le a�adi� cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (0,61 g, 1,80 mmol). La disoluci�n de reacci�n se agit� durante 3,0 h bajo una atm�sfera de arg�n y despu�s se verti� en 100 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La disoluci�n acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 200 ml) y los extractos secados (sulfato de sodio) se evaporaron. El producto bruto se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de disolvente de metanol al 0-5% en acetato de etilo (trietilamina al 2%). Las fracciones del producto se evaporaron produciendo (21) como un s�lido amorfo: 724 mg (61%) de rendimiento; TLC (metanol al 5% en acetato de etilo), Rf = 0,39; RMN de 1H (DMSO-d6) 11,27 (1H, s, N5-H), 9,43 (1H, t, J = 5,3 Hz, trifluoroacetimido N-H), 8,71 (1H, s, N=CH-N), 7,32, 7,17 y 6,76 (13H, 3 x m, arom�tico), 6,45 (1H, t, J = 6,3 Hz, 1’-H), 5,26 (1H, d, J = 5,3 Hz, 3’-OH), 4,45 (1H, m, 3’-H), 3,90 (1H, m, 4’-H), 3,70 (6H, s, OMe Hs), 3,18 y 3,05 (10H, 2 x s, N,N-dimetilo, 5’-Hs y CONH-CH2), 2,62 y 1,65 (4H, 2 x m, metilen Hs), 2,62 y 2,20 (2H, 2 x m, 2’-Hs). Anal. calc. para C39H42F3N7O7 � 0,30 H2O: C, 59,81; H, 5,48; N, 12,52. Encontrado: C, 59,80; H, 5,39; N, 12,63.

N-{3-[1-((2R,5R)-5-{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4-{[bis(metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfinooxi}oxolan-2-il)-6amino-4-oxo-(5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)]propil}-2,2,2-trifluoroacetamida (22)

A una disoluci�n de (21) (700 mg, 0,900 mmol) en 22 ml de cloruro de metileno anhidro, que conten�a 0,47 ml de diisopropiletilamina, se le a�adi� N,N-diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo (0,34 ml, 1,52 mmol). Despu�s de agitar durante 30 min bajo una atm�sfera de arg�n a 25 �C, la disoluci�n se trat� con 3,0 ml de metanol y se diluy� con 200 ml de acetato de etilo. La disoluci�n se lav� con 100 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5% y se sec� sobre sulfato de sodio y se evapor�. El producto bruto se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con trietilamina al 2% en acetato de etilo. Las fracciones del producto se evaporaron, y el residuo precipit� en �ter-hexano: 583 mg (66%) de rendimiento; TLC (acetato de etilo), R f = 0,38; RMN de 31P (DMSO-d6, referencia al �cido fosf�rico al 85%) 145,50 y 144,72.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la preparaci�n de 3-{[5-(4,6-bis{(1E)-1-aza-2-[bis(2-metilpropil)amino]vinil}-3-prop-1inilpirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]-metil}oxolan-3-iloxi][etil(metiletil)amino}fosfino}propannitrilo (26).

5-(4,6-bis{(1E)-1-aza-2-[bis(2-metilpropil)amino]vinil}-3-prop-1-inilpirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2 (hidroximetil)oxolan-3-ol

(24)

El compuesto (23) (1 mmol) puede agitarse durante 5 h a temperatura ambiente con (dimetoximetil)bis(2metilpropil)amina (0,5 ml, 3,37 mmol). La mezcla de reacci�n puede reducirse al vac�o y el compuesto protegido puede purificarse sobre gel de s�lice para producir (24) (Vincent et al.).

5-(4,6-bis{(1E)-1-aza-2-[bis(2-metilpropil)amino]vinil}-3-prop-1-inilpirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-{[bis(4metoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-3-ol (25)

A una disoluci�n de (24) (1,50 mmol) en 9,0 ml de piridina anhidra puede a�adirse cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (0,61 g, 1,80 mmol). La disoluci�n de reacci�n puede agitarse durante 3,0 h bajo una atm�sfera de arg�n y despu�s puede verterse en 100 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La disoluci�n acuosa puede extraerse con acetato de etilo (2 x 200 ml) y los extractos pueden secarse (sulfato de sodio) y evaporarse. El producto bruto puede purificarse mediante una cromatograf�a en gel de s�lice con un gradiente apropiado para producir (25).

3-{[5-(4,6-bis{(1E)-1-aza-2-[bis(2-metilpropil)amino]vinil}-3-prop-1-inilpirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-{[bis(4metoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-3-iloxi][etil(metiletil)amino}fosfino}propannitrilo (26)

A una disoluci�n de (25) (0,900 mmol) en 22 ml de cloruro de metileno anhidro, que conten�a 0,47 ml de diisopropiletilamina, se le puede a�adir N,N-diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo (0,34 ml, 1,52 mmol). La disoluci�n puede agitarse durante 30 min bajo una atm�sfera de arg�n a 25 �C y puede tratarse con 3,0 ml de metanol y diluirse con 200 ml de acetato de etilo. La disoluci�n puede lavarse despu�s con 100 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5% y secarse sobre sulfato de sodio y evaporarse. El producto bruto puede purificarse mediante una cromatograf�a en gel de s�lice con un gradiente apropiado para producir (26).

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra la s�ntesis de 5-[4,6-diamino-3-(2-metoxietinil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil]-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (27).

5-[4,6-diamino-3-(2-metoxietinil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil]-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (27)

A una mezcla de 4,6-diamino-1-(2-desoxi- -D-eritro-pentofuranosil)-3-yodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (4,2 g, 10,71 mmol), CuI (211 mg, 1,10 mmol), Pd(PPh3)4 (635 mg, 0,553 mmol) y trietilamina (2,2 ml) en 20 ml de DMF anhidra se le a�adi� metil propargil �ter (1,82 ml). La mezcla se agit� bajo una atm�sfera de arg�n durante 16 h y luego se evapor� hasta la sequedad. El residuo cristaliz� en metanol: 3,20 g (89%) de rendimiento; TLC (metanol al 30% en acetato de etilo), Rf = 0,63; RMN de 1H (DMSO-d6) 7,44 (2H, d a, amino), 6,32 (1H, t, J = 6,6 Hz, 1’-H), 6,33 (2H, s a, amino), 5,20 (1H, d, J = 4,1 Hz, 3’-OH), 4,75 (1H, t a, 5’-OH), 4,40 (2H, s, metileno), 4,36 (1H, m, 3’-H), 3,76 (1H, m, 4’-H), 3,47 y 3,32 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 3,32 (3H, s, metoxi), 2,68 y 2,14 (2H, 2 x m, 2’-Hs).

S�ntesis de 1-metoxiprop-1-in-5-{6-[(1E)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-4-[(1Z)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]pirazolo[3,4d]pirimidinil}-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (28)

El compuesto (27) (3,1 g, 9,28 mmol) se agit� en una disoluci�n de 30 ml de N,N-dimetilformamida y 15 ml de N,Ndimetilformamida dimetil acetal durante 14 h a 45 �C. Los disolventes se evaporaron y el residuo se evapor� dos veces en xilenos para producir (28) como una espuma que precipit� en acetato de etilo-�ter: 2,8 g (68%) de rendimiento; TLC (metanol al 50% en acetato de etilo), Rf = 0,36.

S�ntesis de 3-[(5-{6-[(1E)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil}-4-[(1Z)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]pirazolo[3,4-d]pirimidinil}-2{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-3-iloxi)-[bis(metiletil)amino]fosfinooxi]propannitrilo (29)

A una disoluci�n de (28) (2,7 g, 6,08 mmol) en 45 ml de piridina anhidra se le a�adi� cloruro de dimetoxitritilo (2,4 g). La disoluci�n resultante se agit� durante 3 h a temperatura ambiente y despu�s se verti� en 200 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La mezcla se extrajo con acetato de etilo y el extracto se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor�. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de metanol al 0-40% en acetato de etilo. Las fracciones del derivado de 5’-O-DMT puras se reunieron y se evaporaron para producir una espuma: 1,0 g (22%) de rendimiento.

A una disoluci�n del derivado de DMT (0,98 g, 1,31 mmol) en 16 ml de cloruro de metileno anhidro, que conten�a 0,70 ml de N,N-diisopropiletilamina, se le a�adi� diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo (0,50 ml) bajo una atm�sfera de arg�n. La disoluci�n se agit� durante 30 min a temperatura ambiente y despu�s se trat� con 1,0 ml de metanol. La disoluci�n se carg� directamente sobre una columna de gel de s�lice y se eluy� con un gradiente de metanol al 0-20% en acetato de etilo (trietilamina al 2%). Las fracciones puras se reunieron y se evaporaron para producir una espuma: 0,25 g (20%) de rendimiento.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la preparaci�n de 3-[(5-{4-[(1Z)-1-aza-2-(metilamino)vinil]-3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil}-2{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]meti}-oxolan-3-iloxi)-[bis(metiletil)amino]fosfinooxi]propannitrilo (35) (v�ase el esquema de reacci�n 8).

(2-furilmetoximetilen)metan-1,1-dicarbonitrilo (30)

A una disoluci�n enfriada en hielo que conten�a cloruro de metileno anhidro (500 ml), trietilamina (100 ml) y malonitrilo (30 g, 454 mmol) se le a�adi� cloruro de 2-furanilo (50 g, 383 mmol) mediante una adici�n gota a gota a lo largo de un periodo de 20 min. Entonces se continu� la agitaci�n durante una hora m�s a temperatura ambiente. La disoluci�n de reacci�n se lav� con 1,5 l de una disoluci�n de HCl 2 N enfriada en hielo y despu�s con 1,5 l de agua. La fase org�nica se evapor� produciendo un aceite.

Una porci�n del producto de aceite (4,6 g, 28,75 mmol) se disolvi� en una disoluci�n que consist�a en 40 ml de dioxano y 4,0 ml de agua. Se a�adi� sulfato de dimetilo (15 ml) y bicarbonato de sodio (15 g), y la disoluci�n de reacci�n se agit� durante 2,5 h a 80 �C. La mezcla entonces se disolvi� en 100 ml de agua y el producto se extrajo con 200 ml de acetato de etilo. La disoluci�n org�nica se lav� con 100 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%, seguido de 100 ml de agua. La disoluci�n se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor� para producir un aceite que solidific� al vac�o: 2,72 g de rendimiento; TLC (acetato de etilo/hexano 1:1), R f = 0,42; RMN de 1H (DMSO-d6) 8,25 (1H, m, arom�tico), 7,63 (1H, m, arom�tico), 6,92 (1H, m, arom�tico), 4,23 (3H, s, metoxi).

2-amino-4-(2-furil)furan-3-carbonitrilo (31)

Se a�adi� hidrazina monohidrato (3,4 ml, 80 mmol) gota a gota a una disoluci�n enfriada en hielo de (30) (2,72 g, 15,63 mmol) en 75 ml de metanol a lo largo de un periodo de 15 min. La disoluci�n entonces se evapor� hasta la sequedad para producir un aceite que solidific� al vac�o. El s�lido se tritur� en �ter, se filtr� y se sec�: 2,2 g (81%) de rendimiento; TLC (acetato de etilo), Rf = 0,81; RMN de 1H (DMSO-d6) 7,77 (1H, s, furanilo), 6,80 (1H, m, furanilo), 6,61 (1H, m, furanilo), 6,41 (2H, s a, amina).

3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina (32)

El compuesto (31) (25,7 g, 148 mmol) se agit� en 250 ml de formamida a 190 �C durante 4 h. La disoluci�n entonces se enfri� hasta la temperatura ambiente, se diluy� con 1,2 l de agua y se enfri� en un ba�o de hielo. El s�lido que se form� se filtr� y se sec�: 22 g (74%) de rendimiento; TLC (metanol al 5% en acetato de etilo), Rf = 0,25.

4-metilbenzoato de [5-(4-amino-3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil)-3-(4-metilfenilcarboniloxi)-2-oxoetil]oxolan-2il]metilo (33)

El compuesto (32) (10 g, 49,7 mmol) se agit� en 200 ml de una disoluci�n de KOH metan�lico 0,29 M durante 5 min. La mezcla se evapor� hasta la sequedad y el residuo entonces se disolvi� en 40 ml de DMF anhidra caliente. La disoluci�n se enfri� hasta la temperatura ambiente y despu�s se diluy� con 230 ml de acetonitrilo anhidro. El derivado de cloroaz�car (23 g, 59,14 mmol) se a�adi� inmediatamente y la mezcla se agit� durante 45 min y despu�s se evapor� hasta la sequedad. El residuo se disolvi� en 800 ml de acetato de etilo y se lav� con agua (2 x 800 ml). La disoluci�n org�nica se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor�. El producto bruto se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de hexano al 30-0% en acetato de etilo. Las fracciones del producto puro se evaporaron y el residuo cristaliz� en metanol caliente: 3,4 g (12%) de rendimiento; TLC (acetato de etilo), Rf = 0,47; RMN de 1H (DMSO-d6) 8,27 (1H, s, 6-H), 7,96 (1H, m, furanilo), 7,95, 7,84, 7,36 y 7,23 (8H, 4 x d, toluo�lo arom�tico), 6,83 (1H, m, furanilo), 6,80 (1H, t, J = 6,3 Hz, 1’-H), 6,70 (1H, m, furanilo), 5,86 (1H, m, 3’-H), 4,64-4,42 (3H, m, 4’-H y 5’-Hs), 3,28 y 2,76 (2H, 2 x m, 2’-Hs), 2,39 y 2,36 (6H, 2 x s, toluoilmetilos).

5-{4-[(1Z)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil}-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (34)

Una suspensi�n de (33) (3,36 g, 6,08 mmol) en 17 ml de una disoluci�n de met�xido de sodio metan�lico 0,12 M se someti� a reflujo durante 30 min. La disoluci�n resultante se enfri� hasta la temperatura ambiente y se neutraliz� mediante la adici�n de 0,12 ml de �cido ac�tico. La disoluci�n se evapor� hasta la sequedad y el producto precipit� en metanol-�ter, y despu�s recristaliz� en agua hirviendo: 1,63 g (85%) de rendimiento del nucle�sido desprotegido.

Todo el producto de nucle�sido anterior se agit� en una disoluci�n que consist�a en 30 ml de DMF anhidra y 15 ml de N,N-dimetilformamida dimetil acetal durante 5 h. La disoluci�n se evapor� hasta la sequedad y el residuo entonces se evapor� dos veces en xilenos para producir una espuma: 1,89 g (99%) de rendimiento; TLC (metanol al 20% en acetato de etilo), Rf = 0,45; RMN de 1H (DMSO-d6) 8,98 y 8,46 (2H, 2 x s, formamidin C-H y 6-H), 7,97 (1H, m, furanilo), 7,81 (1H, m, furanilo), 6,65 (2H, m, 1’-H y furanilo), 5,30 (1H, d, J = 4,5 Hz, 3’-OH), 4,79 (1H, t, J = 5,5

Hz, 5’-OH), 4,51 (1H, m, 3’-H), 3,85 (1H, m, 4’-H), 3,57 y 3,40 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 3,26 y 3,21 (6H, 2 x s, protones N-Me), 2,88 y 2,30 (2H, 2 x m, 2’-Hs).

3-[(5-{4-[(1Z)-1-aza-2-(metilamino)vinil]-3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil}-2-{[bis(4metoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-3-iloxi)-[bis(metiletil)amino]fosfinooxi]propannitrilo (35)

Se a�adi� cloruro de dimetoxitritilo (2,01 g) a una disoluci�n de (34) (1,84 g, 4,95 mmol) disuelto en 30 ml de piridina seca. La disoluci�n de reacci�n se agit� durante 3 h a temperatura ambiente y despu�s se verti� en 200 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. El producto se extrajo con 300 ml de acetato de etilo y la fase org�nica se sec� sobre sulfato de sodio y se evapor�. El residuo se purific� utilizando una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de metanol al 0-5% en acetato de etilo. Las fracciones del producto puro se evaporaron para producir una espuma: 2,26 g (68%) de rendimiento del derivado de 5’-O-DMT.

A una disoluci�n del derivado de DMT (2,18 g, 3,23 mmol) disuelto en 40 ml de cloruro de metileno seco, que conten�a 1,75 ml de N,N-diisopropiletilamina, se le a�adieron 1,25 ml de diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo. La disoluci�n se agit� bajo una atm�sfera de arg�n durante 15 min a temperatura ambiente, y despu�s se trat� con 5 ml de metanol. La disoluci�n resultante se diluy� con 500 ml de acetato de etilo y se lav� con 400 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La disoluci�n org�nica se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor�. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de metanol al 5-10% en acetato de etilo (trietilamina al 2%). Las fracciones de producto puro se evaporaron para producir una espuma: 1,62 g (57%) de rendimiento; RMN de 31P (DMSO-d6) 147,81 y 147,16.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la preparaci�n de 3-[(5-{6-[(1E)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-4-[(1Z)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil}-2-{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-3-iloxi)[bis(metiletil)amino]fosfinooxi]propannitrilo (39, v�ase el esquema de reacci�n 9).

3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamina (36)

Una mezcla de (31) finamente triturado (10,0 g, 57,47 mmol) y carbonato de guanidina (16,6 g, 91,95 mmol) se calent� a 230 �C durante 45 min. La mezcla se enfri� hasta la temperatura ambiente y el s�lido se tritur� en 100 ml de agua hirviendo. El s�lido ((36) puro) se filtr�, se enjuag� con agua y se sec�: 11,1 g (89%) de rendimiento; TLC (metanol al 40% en acetato de etilo), Rf = 0,66; RMN de 1H (DMSO-d6) 12,68 (1H, s a, N-H), 7,86 (1H, m, furanilo), 6,93 (2H, s a, -NH2), 6,85 (1H, d, J = 3,5 Hz, furanilo), 6,65 (1H, m, furanilo), 6,10 (2H, s a, -NH2).

5-(4,6-diamino-3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil)-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (37)

El compuesto (36) (10,5 g, 48,61 mmol) se agit� en 200 ml de una disoluci�n de KOH metan�lico 0,29 M durante 5 min. La mezcla se evapor� hasta la sequedad y el residuo entonces se disolvi� en 105 ml de DMF anhidra caliente. La disoluci�n se enfri� hasta la temperatura ambiente y despu�s se diluy� con 620 ml de acetonitrilo anhidro. El derivado de cloroaz�car (23 g, 59,14 mmol) se a�adi� inmediatamente y la mezcla se agit� durante 40 min y despu�s se filtr�. El filtrado se evapor� hasta la sequedad y el residuo se cromatografi� a trav�s de una columna de gel de s�lice, eluyendo con acetato de etilo. Las fracciones de los nucle�sidos se evaporaron para producir 2,8 g (rendimiento del 10%) del nucle�sido toluoil-protegido como una mezcla de alfa- y beta-an�meros. La mezcla se someti� a reflujo en 40 ml de met�xido de sodio metan�lico 0,19 M durante 45 min. La disoluci�n de reacci�n se coloc� en una nevera durante la noche para producir una cosecha de cristales que se corresponden con el betaan�mero puro ( 37): 690 mg de rendimiento; TLC (metanol al 20% en acetato de etilo), Rf = 0,32; RMN de 1H (DMSOd6) 7,90 (1H, m, furanilo), 6,99 (2H, s a, amino), 6,86 (1H, d, J = 4,1 Hz, furanil), 6,68 (1H, m, furanilo), 6,41 (1H, t, J = 6,6 Hz, 1’-H), 6,26 (2H, s a, amino), 5,21 (1H, d, J = 4,4 Hz, 3’-OH), 4,82 (1H, t, J = 5,8 Hz, 5’-OH), 4,42 (1H, m, 3’-H), 3,79 (1H, m, 4’-H), 3,52 y 3,41 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 2,75 y 2,18 (2H, 2 x m, 2’-Hs).

5-{6-[(1E)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-4-[(1Z)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil}-2(hidroximetiil)oxolan-3-ol (38)

Una disoluci�n de (37) (0,68 g, 2,05 mmol) en 30 ml de DMF anhidra y 15 ml de N,N-dimetilformamida dimetil acetal se agit� a temperatura ambinete durante 24 h. La disoluci�n se evapor� hasta la sequedad y el residuo se evapor� dos veces en xilenos para producir una espuma: 0,90 g (99%) de rendimiento; TLC (metanol al 50% en acetato de etilo), Rf = 0,38; RMN de 1H (DMSO-d6) 8,93 y 8,77 (2H, 2 x s, formamidin C-Hs), 7,94 (1H, m, furanilo), 7,76 (1H, m, furanilo), 6,62 (1H, m, furanilo), 6,60 (1H, t, J = 6,6 Hz, 1’-H), 5,25 (1H, d, J = 4,4 Hz, 3’-OH), 4,84 (1H, t, J = 5,9 Hz, 5’-OH), 4,47 (1H, m, 3’-H), 3,83 (1H, m, 4’-H), 3,56 y 3,41 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 3,25, 3,18, 3,16 y 3,03 (12H, 4 x s, N-metilos), 2,82 y 2,22 (2H, 2 x m, 2’-Hs).

3-[(5-{6-[(1E)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-4-[(1Z)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-3-(2-furil)pirazolo[3,4-d]pirimidinil}-2{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}oxolan-3-iloxi)-[bis(metiletil)amino]fosfinooxi]propannitrilo (39)

Se a�adi� cloruro de dimetoxitritilo (0,85 g) a una disoluci�n de (38) (0,90 g, 2,04 mmol) en 12 ml de piridina seca. La disoluci�n de reacci�n se agit� durante 2 h a temperatura ambiente y despu�s se verti� en 200 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. El producto se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 ml) y los extractos org�nicos reunidos se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron. El residuo se purific� utilizando una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de metanol al 20-30% en acetato de etilo. Las fracciones del producto puro se evaporaron para producir una espuma: 286 mg de rendimiento del derivado de 5’-O-DMT.

A una disoluci�n del derivado de DMT (286 mg, 0,384 mmol) disuelto en 5 ml de cloruro de metileno seco, que conten�a 0,23 ml de N,N-diisopropiletilamina, se le a�adieron 0,17 ml de diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo. La disoluci�n se agit� bajo una atm�sfera de arg�n durante 15 min a temperatura ambiente, y despu�s se trat� con 0,5 ml de metanol. La disoluci�n resultante se diluy� con 100 ml de acetato de etilo y se lav� con 75 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. La disoluci�n org�nica se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y se evapor�. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de metanol al 0-30% en acetato de etilo (trietilamina al 2%). Las fracciones de producto puro se evaporaron para producir una espuma: 230 mg (12%) de rendimiento; RMN de 31P (DMSO-d6) 147,77 y 147,08.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra la preparaci�n de 4-metilbenzoato de 4-[1-(5-{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4{[bis(metiletil)amino]-(2-cianoetoxi)fosfinooxi}oxolan-2-il)-2,4-dioxo-1,3-dihidropirimidin-5-il]but-3-inilo (42, v�ase el esquema de reacci�n 10)

S�ntesis de p-toluato de 3-butin-1-ilo (40)

En un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con un barra de agitaci�n magn�tica y bajo una atm�sfera inerte se disolvi� 3-butin-1-ol (50,3 g, 0,718 mol) con piridina anhidra (200 ml) y la disoluci�n se enfri� en un ba�o de agua helada. A la suspensi�n fr�a se le a�adi�, utilizando un embudo de adici�n, cloruro de p-tolu�lo (136,3 g, 0,86 mol, 1,2 eq.) gota a gota y la mezcla de reacci�n se agit� a temperatura ambiente durante la noche.

A la mezcla se le a�adi� �ter diet�lico (350 ml) y agua (100 ml). La capa org�nica se separ�, y la disoluci�n acuosa se lav� con �ter diet�lico (150 ml). Las fracciones org�nicas se reunieron y se lavaron con HCl al 10% (3 x 100 ml), una disoluci�n de NaHCO3 saturado (2 x 100 ml) y agua (1 x 50 ml). La disoluci�n resultante se sec� sobre Na2SO4 anhidro, se filtr� y el disolvente se elimin� para producir 142 g (rendimiento cuantitativo) de (40) como un s�lido blancuzco. El producto puede recristalizar en hexano o metanol, pero era lo suficientemente puro para llevarlo a la siguiente etapa. RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) (ppm) 7,95 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,24 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 4,41 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,67 (dd, 2H, J1 = 2,6, J2 = 6,8 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,03 (t, 1H, J = 2,4 Hz).

5’-DMT-5-[4-(p-toluiloxi)butinil]-2’-desoxiuridina (41)

Una mezcla de 5-yodo-2’-desoxiuridina (4,0 g, 11,30 mmol), 4-(p-toluiloxi)butino (40) (5,7 g, 30,3 mmol), CuI (222 mg, 1,16 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,67 g, 0,583 mmol) y trietilamina (2,0 ml) se agit� en 30 ml de DMF anhidra bajo una atm�sfera de arg�n durante 16 h. La mezcla se evapor� hasta la sequedad y el aceite residual solidific� tras agitar en 100 ml de �ter. Este s�lido se filtr� y se sec� al vac�o.

Una porci�n del producto bruto (1,5 g) se disolvi� en 20 ml de piridina anhidra y se trat� con cloruro de dimetoxitritilo (1,3 g). La disoluci�n se agit� durante 2,0 h bajo una atm�sfera de arg�n y despu�s se verti� en 150 ml de una disoluci�n de bicarbonato de sodio al 5%. El producto se extrajo con 200 ml de acetato de etilo. El extracto se sec� sobre sulfato de sodio, se filtr� y el disolvente se evapor�. El residuo se purific� mediante una cromatograf�a en gel de s�lice, eluyendo con un gradiente de hexano al 30-0% en acetato de etilo. Las fracciones del producto se evaporaron para producir una espuma: 957 mg de rendimiento; TLC (hexano al 30% en acetato de etilo), R f = 0,37; RMN de 1H (DMSO-d6) 11,66 (1H, s, N-H), 7,9-6,8 (18H, protones arom�ticos), 6,11 (1H, t, J = 6,6 Hz, 1’-H), 5,35 (1H, s a, 3’-OH), 4,29 (1H, m, 3’-H), 4,15 (2H, t, J = 6,8 Hz, butinmetileno), 3,92 (1H, m, 4’-H), 3,71 (6H, s, grupos metoxi), 3,24 y 3,07 (2H, 2 x m, 5’-Hs), 2,64 (2H, t, J = 6,8 Hz, butinmetileno), 2,37 (3H, s, toluilmetilo), 2,23 (2H, m, 2’-Hs).

4-metilbenzoato de 4-[1-(5-{[bis(4-metoxifenil)fenilmetoxi]metil}-4-{[bis(metiletil)amino](2-cianoetoxi)fosfinooxi}oxolan2-il)-2,4-dioxo-1,3-dihidropirimidin-5-il]but-3-inilo (42)

A una disoluci�n del derivado de DMT anterior (0,92 g, 1,28 mmol) en 15 ml de cloruro de metileno anhidro, que conten�a 0,75 ml de N,N-diisopropiletilamina, se le a�adi� diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo (0,56 ml). La disoluci�n se agit� durante 30 min a temperatura ambiente bajo una atm�sfera de arg�n, y despu�s se trat� con 1,0 ml de metanol. La disoluci�n se evapor� hasta un volumen de aproximadamente 5 ml y se carg� directamente en una columna de gel de s�lice y se eluy� con hexano al 40% en acetato de etilo (trietilamina al 2%). Las fracciones puras se reunieron y se evaporaron para producir una espuma: 0,91 mg de ( 42) (78% de rendimiento); RMN de 31P (DMSO-d6) 147,72 y 147,39.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra la mayor capacidad de los oligonucle�tidos modificados para discriminar entre secuencias diana relacionadas.

En este ejemplos, se prepararon oligonucle�tidos modificados que conten�an PPPA, PPG y un ligante del surco

5 menor. Tal como ilustra la figura 3, el uso de un MGB junto con PPPA y PPG aumenta la Tm y permite el dise�o de sondas m�s cortas compatibles con las temperaturas de extensi�n de la PCR. Estos oligonucle�tidos modificados tambi�n producen una mayor discriminaci�n de desapareamientos. En un primer dise�o de una sonda 18-mera de fluoresce�na-ODN-extintor Red 13-MGB para PCR a tiempo real, se observ� una mala discriminaci�n de un desapareamiento de A/T, tal como se muestra en la figura 3A. El redise�o de la sonda contra la hebra opuesta,

10 poniendo el desapareamiento bajo el MGB y sustituyendo PPPA por A y PPG por G como se indica, permite un acortamiento de la sonda hasta un 15-mero. Esta sonda ahora consigue una buena discriminaci�n de desapareamientos, tal como se muestra en la figura 3B.

Se realiz� una investigaci�n termodin�mica de la discriminaci�n de desapareamientos con un conjunto de oligonucle�tidos hibridados con un conjunto de dianas perfectamente apareadas o que conten�an un solo

15 desapareamiento. Las secuencias diana contienen a) A normales, b) PPPA, c) A normales y un 3’-MGB, y d) PPPA y un 3’-MGB, respectivamente. Las secuencias para las sondas y las dianas se muestran a continuaci�n en la tabla 3a y 3b. La determinaci�pn de las Tm y el c�lculo de

Tabla 3a y 3b.

Secuencias de las sondas y de las dianas Tabla 3c. Comparaci�n termodin�mica de la discrimaci�n de desapareamientos en t�rminos de incremento en la energ�a libre a 50 �C, en el que G�50 = R�ln(Kapaream/Kdesaparam)

A. Secuencias de las sondas - Desapareamiento subrayado

N�mero

Desapareamiento Secuencia de la sonda SEQ ID NO:

1

Complemento AAAGTTATGTCTACTTACAGAAA 17

2

A/C AAAGCTATGTCTACTTACAGAAA 18

3

A/C AAAGTCATGTCTACTTACAGAAA 19

4

T/G AAAGTTGTGTCTACTTACAGAAA 20

5

A/C AAAGTTACGTCTACTTACAGAAA 21

6

C/A AAAGTTATATCTACTTACAGAAA 22

7

A/C AAAGTTATGCCTACTTACAGAAA 23

8

T/G AAAGTTATGTTTACTTACAGAAA 24

9

A/C AAAGTTATGTCCACTTACAGAAA 25

10

T/G AAAGTTATGTCTGCTTACAGAAA 26

11

G/T AAAGTTATGTCTATTTACAGAAA 27

12

A/C AAAGTTATGTCTACCTACAGAAA 28

13

A/C AAAGTTATGTCTACTCACAGAAA 29

14

T/G AAAGTTATGTCTACTTGCAGAAA 30

B. Secuencias diana - A’ = PPPA

1

GTAAGTAGACATAAC 31

2

GTA’A’GTA’GA’CA’TA’A’C 32

3

GTAAGTAGACATAAC-MGB 33

4

GTA’A’GTA’GA’CA’TA’A’C-MGB 34

N�mero

Desapareamiento A PPPA MGB MGB+PPPA

2

A/C 2340 2930 2870 5320

3

A/C 2560 3280 4100 6320

4

T/G 1950 1810 4200 5900

5

A/C 3520 3760 3830 4980

6

C/A 5030 5340 4190 5970

7

A/C 3000 3370 4310 5260

8

T/G 3040 3260 3070 4820

9

A/C 3290 3440 3810 5630

10

T/G 1800 1950 2090 3350

11

G/T 3340 3120 3630 5070

12

A/C 2940 3620 2550 4490

13

A/C 2360 3210 1820 3980

14

T/G 1600 2010 2000 2480

5 G�50 se describe en el ejemplo 9. La tabla 3c demuestra claramente una mayor discriminaci�n de desapareamientos cuando PPPA se sustituye por A, y una discriminacion de desapareamientos a�n mayor cuando PPPA se combina con MGB.

La comparaci�n de la discriminaci�n termodin�mica de las pares de bases desapareadas formadas en MGB-ODN que contienen HO-PPPA/HO-PU con PPPA/PU a 37 �C se muestra en la tabla 4. Los ODN que contienen las bases 10 modificadas en combinaci�n con MGB se hibridaron con sus complementos. Los desapareamientos est�n subrayados en las secuencias que aparecen en la tabla 4. Tal como se muestra en esta tabla, la sustituci�n de HO-PPPA y HO-PU, comparado con PPPA y PU, demostr� en general aumentar la discriminaci�n de desapareamientos.

Tabla 4. Comparaci�n de la discriminaci�n termodin�mica de pares de bases desapareadas formadas con HOPPPA o HOPU frente a PPPA y PU en los d�plex 8-meros (+MGB)

Secuencia del d�plex (y SEQ ID NO:)

PPPA/ PU HOPPPA/ HOPU Secuencia del d�plex (y SEQ ID NO:) PPPA/ PU HOPPPA/ HOPU

G

G

G

G

cal/mol

cal/mol

cal/mol

cal/mol

Apar.

CGUCACUG Apar. UAUUAUUG-MGB

-MGB

AATAATAACC (45)

AGCTGTGACT (35)

1

CGUCACUG 4250 4350 10 UAUUAUUG-MGB 4400 5000

-MGB

AATTATAACC (46)

AGCTGTGACT (36)

(Cont.)

2

CGUCACUG -MGB AGCGGTGACT (37) 3450 3540 11 UAUUAUUG-MGB AATGATAACC (47) 3740 3760

3

CGUCACUG -MGB AGCCGTGACT (38) 4860 4530 12 UAUUAUUG-MGB AATCATAACC (48) 6630 6840

4

CGUCACUG -MGB AGCAGAGACT (39) 4870 4850 13 UAWAWG-MGB AATAAAAACC (49) 5090 5730

5

CGUCACUG -MGB AGCAGGGACT (40) 4190 4360 14 UAUUAUUG-MGB AATAAGAACC (50) 5920 6520

6

CGUCACUG -MGB AGCAGCGACT (41) 3930 3940 15 UAUUAUUG-MGB AATAACAACC (51) 4120 4530

7

CGUCACUG -MGB AGCAATGACT (42) 2600 2300

8

CGUCACUG -MGB AGCATTGACT (43) 4360 4210

9

CGUCACUG -MGB AGCACTGACT (44) 4420 4610

G se calcul� a 37 �C

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra los estudios de fundido de UV realizados utilizando los oligonucle�tidos de la presente invenci�n.

Los h�bridos formados entre ODN no modificados o MGB-sondas y sus complementos se fundieron a una velocidad de 0,5 �C/min, sobre un espectrofot�metro Lambda 2S (Perkin-Elmer) con un programador de temperatura de m�ltiples c�lulas autom�tico PTP-6. Los datos de Tm se prepararon utilizando 0,5 x tamp�n SSPE (Sigma, pH 7,4).

Cada ODN (1 uM de cada hebra) se mezcl� con el complemento para producir una proporci�n de 1:1. Antes del fundido, las muestras se desnaturalizaron a 100 �C y despu�s se enfriaron hasta 10 �C a lo largo de un periodo de 10 min. Se calcul� la discriminaci�n de desapareamiento para cada tipo de d�plex en t�rminos de G a 50 �C utilizando la ecuaci�n:

G�50 = R�ln(Kapaream/Kdesaparem).

El t�rmino Kapaream/Kdesaparem puede determinarse utilizando las fracciones relativas de los d�plex y hebras sencillas calculadas a partir de las curvas de fusi�n a 50� C (v�ase, Lohkov, S.G. y Pyshnyi, FEBS Letters, 420:134138 (1997)).

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra la hibridaci�n del ADN a micromatrices de vidrio de oligonucle�tidos preparadas como se describe en la solicitud n� de serie 09/364.320, en tramitaci�n junto con la presente, y adem�s optimizados para sondas de MGB 8-10-meras.

El ADN (oligonucle�tido o amplic�n de PCR) a 1-5 x 10-7 M en 5 x SSPE, Triton X-100 al 0,1%, formamida al 10% se hibrid� con la micromatriz en c�maras de marco sellado (MJ Research) bajo las siguientes condiciones: 5 minutos a 55 �C, enfriamiento lento a 0,1 �C/seg hasta 35 �C, 60 minutos a 55 �C. Los portaobjetos entonces se lavaron con 0,5 x SSPE durante 5 minutos a 45 �C. Los portaobjetos se secaron bajo una corriente de aire y se barrieron utilizando un esc�ner fluorescente Array Works (Applied Precision). El procedimiento de lavado puede repetirse bajo condiciones m�s rigurosas si es necesario.

Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra un ensayo de extensi�n de cebadores de una sola base.

Se reunieron ADN molde monocatenario y un cebador 6-mero (20 M de cada uno), 1 x tamp�n Thermpol (New England Biolabs), cloruro de manganeso 10 mM (USB), y se incubaron durante 5 minutos a 50 �C. Entonces se a�adieron 32P ddATP 5 Ci y 8 unidades de polimerasa de Bst (NEB), obteni�ndose un volumen total de 10 l, y se incub� durante 1 minuto a 50 �C. Despu�s de la inbucaci�n se a�adieron 6 l de disoluci�n de detenci�n (formamida al 65%, EDTA 20 mM) y las reacciones se enfriaron hasta la temperatura ambiente. Las muestras se diluyeron 1:10 en tinte desnaturalizante (formamida al 35%, xilencianol al 0,05%, azul de bromofenol al 0,05%, EDTA 1 mM) y se analizaron partes al�cuotas mediante una electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizante.

El uso de bases modificadas en los ensayos de extensi�n de cebadores para la tipificaci�n de SNP se ilustra en la tabla 5. La extensi�n de cebadores con la polimerasa de Bst (NEB) se evalu� con un cebador sustituido con diferentes bases modificadas y se midi� la cantidad de producto bas�ndose en la radiactividad incorporada utilizando una electroforesis en gel.

Tabla 5.

Comparaci�n de la incorporaci�n de 32P en el producto de la extensi�n de cebadores mediante unaelectroforesis en gel de poliacrilamida utilizando el molde AAC CAC TCT GTC CTA (SEQ ID NO:52)

Cebador

Se�al relativa

TGAGAC

++

UpropGAGAC

+

UpropGpropAGAC

+++

UpropGpropApropGAC

+++++

UpropGpropApropGpropAC

+++++

UpropGpropApropGpropC

+

UpropGpropApropGpropApropCprop

0,5+

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra el uso del algoritmo descrito en la memoria descriptiva para predecir la Tm de los oligonucle�tidos modificados que contienen PGB con y sin un ligante del surco menor (CDPl3).

Utilizando los par�metros termodin�micos en la tablas 2a/2b y la f�rmula de correcci�n para la contribuci�n de los MGB, puede calcularse la Tm de oligonucle�tidos PPG con y sin un MGB con procedimientos algor�tmicos como se describi� anteriormente. Los par�metros termodin�micos de los pares vecinos m�s pr�ximos que no contienen G no cambian cuando los oligonucle�tidos est�n sustituidos con PPG. De forma similar, los par�metros termodin�micos 5 de los pares vecinos m�s pr�ximos no cambian cuando los oligonucle�tidos que contienen MGB est�n sustituidos con PPG. La tabla 6 ilustra la capacidad del algoritmo para predecir la Tm de oligonucle�tidos que contienen PPG solos o en combinaci�n con un ligante del surco menor (CDPl3). En la tabla 6, todos los G est�n sustituidos por PPG.

Tabla 6. Comparaci�n de Tm experimentales con las Tm predichas utilizando los par�metros termodin�micos de los vecinos m�s cercanos para oligonucle�tidos que contienen PPG y oligonucle�tidos que contienen PPG unidos a un 10 MGB

5’-secuencia de la sonda-3’

Estabilidad del d�plex ODN �C Estabilidad del d�plex ODN-MGB �C SEQ ID

Tmexp

Tmcalc Err Tmexp Tmcalc Err NO:

CTGTAAGTAGATATAAC

51,84 53,23 1,39 65,88 66,69 0,81 53

GGCAAGATATATAG

50,21 49,81 -0,40 66,37 65,56 -0,81 54

GTGACGCAGATTCC

61,27 61,06 -0,21 76,97 75,19 -1,78 55

GTAAGTAGACATAAC

52,12 51,78 -0,34 64,64 63,31 -1,33 56

CAGGGAGCTTTGGA

59,9 60,22 0,32 74,39 71,47 -2,92 57

CACTCGTGAAGCTG

60,85 59,49 -1,36 74,04 72,26 -1,78 58

GTAAGTAGGCATAAC

55,74 55,47 -0,27 66,91 66,00 -0,91 59

CCGGATGTAGGATC

57,52 59,05 1,53 69,3 70,03 0,73 60

GATTACCTGGATTT

50,64 50,32 -0,32 62,29 62,33 0,04 61

CCGTCAATGGTCAC

58,66 60,01 1,35 70,13 69,91 -0,22 62

CAGCACGTAGCC

57,31 58,07 0,76 69,29 67,60 -1,69 63

CGGCTACGTGCTGG

65,19 66,01 0,82 76,12 74,79 -1,33 64

CGGCTACATGCTGG

61,14 61,95 0,81 71,56 72,99 1,43 65

CTAAATCTGCCG

50,4 48,09 -2,31 62,08 60,19 -1,89 66

TCTGGATGATGGGCA

61,74 61,95 0,21 71,65 72,13 0,48 67

GTTCATGGGTGTAAT

57,51 57,77 0,26 66,94 68,79 1,85 68

CGGAGGTAGGATCA

59,24 59,46 0,22 69,46 70,93 1,47 69

CCACCCGCCTCAG

60,73 61,14 0,41 71,43 70,74 -0,69 70

CACAGGAGTGGTTGG

63,07 64,40 1,33 72,28 72,92 0,64 71

CGGACCAGTGCGTG

68,1 67,58 -0,52 77,92 76,80 -1,12 72

TCGGACCAGTGCGT

65,04 66,00 0,96 74,94 75,62 0,68 73

AACGGGGTACGATA

57,93 57,11 -0,82 67,79 67,08 -0,71 74

CAGTTGAGATTCTAAGAC

60,06 60,15 0,09 67,15 67,43 0,28 75

AGGGGCGTCTTG

60,78 58,57 -2,21 71,62 72,76 1,14 76

GTAAGTAGGCATAGC

58,34 58,95 0,61 65,95 66,99 1,04 77

TGCCCAGCCCCAG

63,13 63,40 0,27 71,28 71,32 0,04 78

CCAACACTCGTGAA

54,87 56,14 1,27 62,07 63,54 1,47 79

GTAAGTAGACACAGC

59,48 58,41 -1,07 65,79 66,27 0,48 80

TCGGACCAGTGC

58,02 58,55 0,53 65,99 66,35 0,36 81

CGATCACGCTGGC

62,12 62,75 0,63 69,18 71,81 2,63 82

GTCCTGGGGGTGG

65,19 64,54 -0,65 72,78 72,53 -0,25 83

GTAAGTAGGTGTGAC

60,7 59,70 -1,00 66,92 67,00 0,08 84

GGTTGTACGGGTTCACG

68,38 68,81 0,43 74,16 75,38 1,22 85

GGACCAGTGCGTGA

66,84 65,46 -1,38 73,38 71,53 -1,85 86

GTAAGTAGACGCAGC

62,91 62,44 -0,47 68 67,82 -0,18 87

GTAAGTAGGCGCAGC

65,52 65,91 0,39 69,8 70,34 0,54 88

GTAAGTAGGCGCGGC

68,71 68,96 0,25 72,26 72,76 0,50 89

GGTTCCCGAGCG

62,15 61,14 -1,01 65,75 64,22 -1,53 90

La precisi�n del algoritmo de predicci�n es de aproximadamente +/- 1 y +/- 2 para oligonucle�tidos que contienen PPG y oligonucle�tidos-MGB que contienen PPG, respectivamente. Por consiguiente, puede obtenerse una secuencia de inter�s a partir de una fuente, tal como Genbank, y entonces puede ajustarse una ventana de Tm como

5 requisito para un conjunto de sondas o cebadores. Utilizando el anterior algoritmo y la informaci�n acerca de los par�metros de los vecinos m�s cercanos puede calcularse una colecci�n de secuencias de sondas o cebadores con las Tm deseadas.

Como alternativa, el algoritmo puede emplearse para seleccionar los par�metros del vecino m�s cercano a partir de una selecci�n de bases modificadas, y para calcular la estabilidad de m�s de una secuencia de la misma longitud

10 para obtener la misma estabilidad termodin�mica predeterminada, utilizando las bases modificadas seleccionadas.

Adem�s, el algoritmo puede utilizarse para seleccionar una o m�s bases modificadas que permitan el dise�o de oligonucle�tidos de la misma longitud de pares de bases y sustancialmente la misma estabilidad (Tm). Estas bases modificadas pueden seleccionarse a partir de una base de datos que contenga los par�metros termodin�micos predeterminados de los vecinos m�s cercanos a partir de una colecci�n de purinas modificadas y/o pirimidinas

15 modificadas. Preferiblemente, la base de datos contiene los par�metros de los vecinos m�s cercanos de pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituidas y/o pirimidinas 5-sustituidas.

Ejemplo 14

Este ejemplo ilustra el uso de oligonucleotidos modificados en un ensayo Invader™.

El ensayo basado en cleavasas mostrado en la figura 4 detecta secuencias de ADN y ARN espec�ficas para romper

20 un complejo formado por la hibridaci�n de dos oligonucle�tidos solapantes a una diana. La enzima rompe la “aleta” que sobresale, que act�a como sonda invasora en la sonda de m�dulo de detecci�n, en que la ruptura libera una se�al de fluorescencia. La primera ruptura se produce s�lo cuando el desapareamiento de una sola base en el invasor es un apareamiento perfecto. No se produce reacci�n con una diana desapareada B. La “aleta” escindida act�a como invasor en el m�dulo de detecci�n, conduciendo a la liberaci�n de fluorescencia en la segunda etapa de

25 ruptura.

Tabla 7a y 7b: Comparaci�n del sistema de amplificaci�n basado en cleavasa con diferentes bases modificadas sustituidas en las sondas gen�micas e invasoras.

Tabla 7a Tabla 7b

n�

Sonda1 Bases modificadas sustituidas en la secuencia de la sonda2 Longitud

1

M�dulo Ninguna 41

2

Invasora T Ninguna 59

3

Invasora M1 Cinco bases A24 32

4

Gen�mica T Ninguna 43

5

Gen�mica M1 Seis bases A14 35

6

Gen�mica M2 Cinco bases A24 31

1 Las sondas no modificadas y las condiciones de ensayo son similares a las descritas en Hall et al., PNAS, 97:8272-8277 (2000). 2 A14 es un hidroxipropinilPPA y A24 es un 3-yododiaminoPPA.

Sonda gen�mica

Proporci�n de se�al final de apareamiento/desapareamiento R RFU3

4

5 4100

5

10 8000

6

7 11900

3 F es la diferencia final en la fluorescencia entre apareamientos y desapareamientos en unidades de fluorescencia relativas.

La tabla 7a muestra una comparaci�n del efecto de diferentes bases modificadas cuando se sustituyen en las

5 sondas invasora y gen�mica. La invasora T tradicional (2) fue sustituida con 3-yododiaminoPPPA para producir la invasora M1, que ahora tiene una longitud de 32 con una Tm a la del 59-mero (2). De manera similar, la sonda gen�mica tradicional (4) fue sustituida con 3-hidroxipropinilPPPA y 3-yododiaminoPPPA para producir (5) y (6), respectivamente. Ambas sondas son sustancialmente m�s cortas que la tradicional (4). Utilizando la invasora M1 (3) en combinaci�n con las sondas gen�micas 4-6 de modo individual produce una mejor actuaci�n (tabla 7b) de ambas

10 sondas gen�micas que contienen las bases modificadas (5 y 6), comparado con la sonda gen�mica tradicional (4). Tal como se muestra, las proporciones de se�al finales de apareamiento/desapareamiento y la fluorescencia final muestran aumentos, comparado con la sonda gen�mica no modificada.

Claims (89)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un oligonucle�tido modificado que comprende al menos una base de la base de pirimidina 5-sustituida y al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida, en el cual dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una f�rmula que consiste en:

   en la que al menos un base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida est� que consiste en

   en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en

   15 heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos,

   20 2.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, que comprende adem�s un ligante del surco menor unido de

   modo covalente. 3.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, que comprende adem�s al menos un grupo indicador unido de modo covalente.
2. 4.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, que comprende adem�s al menos un extintor unido de modo 25 covalente.
3. 5.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 3, en el que dicho grupo indicador es un fluor�foro. 6.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 3, en el que dicho grupo indicador es un fluor�foro, y dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un extintor unido.
4. 7.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, que comprende de 4 a 70 bases.

   30 8.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, que comprende de 4 a 70 bases, y que comprende adem�s un ligante del surco menor unido. 9.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, que comprende de 4 a 70 bases, y que comprende adem�s

   un fluor�foro unido y un extintor. 10.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 2, que comprende de 4 a 70 bases, y que comprende 35 adem�s un fluor�foro unido y un extintor. 11.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, que tiene la f�rmula:

   R2 representa un primer extremo de dicho oligonucle�tido modificado; R3 representa un segundo extremo de dicho oligonucle�tido modificado; el sub�ndice n es un n�mero entero de 4 a 70;

   5 cada B es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en adenina, timina, citosina, guanina, uracilo, una piramidina -5-sustituida, y una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida; y cada M es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un az�car formador de olig�mero y un amino�cido formador de �cidos nucleicos pept�dicos.

   10 12.- Un oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 11, en el que al menos un M es un az�car formador de olig�mero bloqueado
5. 13.- El uso de compuesto para preparr el oligonucle�tido modificado de la reivindicaci�n 1, teiendo el compuesto la f�rmula:

   en la que:

   Z1 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H, F y ORa, en el que Ra es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo(C1-C8) y un grupo protector de hidroxi; Z2 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H y alquilo(C1-C8), u opcionalmente Z2 se

   20 combina con Z1 para formar un anillo de cinco o siete miembros; Y1 es O-P1, en el que P1 es una fosforamidita o un grupo H-fosfonato; Y2 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en OH, y un grupo hidroxi protegido; O-P1 en el que P2 es es un fosforamidita, H-fosfonato, monofosdato, difosfato o trifosfato; y B es un nucle�tido modificado seleccionado del grupo que consiste en:

   en las que

   X11 se seleccionan del grupo que consiste en H, NH2 y un grupo amino protegido; R11 se selecciona a del grupo que consiste en las formas protegidas o desprotegidas de 3-hidroxiprop-1inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 3-metoxiprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-1-butinilo.
6. 14.- El uso de la reivindicaci�n 13, en el cual B es 15.- El uso de la reivindicaci�n 13, en el cual B es
7. 16.- El uso de la reivindicaci�n 14, en el cual X11 es HN2.
8. 17.- El uso de la reivindicaci�n 16, en el cual Y11 es O-P1, Y2 es un hidroxi protegido, Z1 es H, R11 se selecciona del grupo que consiste en 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo y 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-110 butinilo.
9. 18.- El uso de la reivindicaci�n 17, en el que Y1 es -O-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] e Y2 es -O-(4,4’dimetoxitritilo).
10. 19.- El uso de la reivindicaci�n 15, en el que Y1 es O-P1, Y2 es un hidroxi protegido, Z1 es H, R11 se selecciona del grupo que consiste en 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo y 3-(hidroximetil)-4-hidroxi-115 butinilo.
11. 20.- Un compuesto de la reivindicaci�n 19, en el que Y1 es -O-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] e Y2 es -O(4,4’-dimetoxitritilo).
12. 21.- Una matriz de oligonucle�tidos modificados, comprendiendo dicha matriz un soporte s�lido y una pluralidad de oligonucle�tidos unidos, en la que al menos el 50% de los oligonucle�tidos en dicha matriz contienen una 20 pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida y almenos una base de pirimidina 5sustituida, en la cual dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una f�rmula que consiste en:

    25 y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida que consiste en: 5

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos,
13. 22.- Una matriz de oligonucle�tidos modificados de la reivindicaci�n 21, en la que dichos oligonucle�tidos unidos tienen unas Tm diferente aproximadamente en 2 �C entre s�, y unas longitudes de pares de bases diferentes aproximadamente en 2 bases entre s�.
14. 23.- Una matriz de oligonucle�tidos modificados de la reivindicaci�n 21, en la que dichos oligonucle�tidos unidos tienen unas Tm diferentes aproximadamente en 1 �C entre s�, y unas longitudes de pares de bases diferentes aproximadamente en 2 bases entre s�.
15. 24.- Una matriz de oligonucle�tidos modificados de la reivindicaci�n 21, en la que dicha matriz comprende aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 oligonucle�tidos unidos, teniendo cada uno unas Tm diferentes aproximadamente en 2 �C entre s�, y unas longitudes de pares de bases diferentes aproximadamente en 2 bases entre s�.

    25- Una matriz de oligonucle�tidos modificados de la reivindicaci�n 21, en la que dicha matriz comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 oligonucle�tidos unidos, teniendo una porci�n de dichos oligonucle�tidos unidos un ligante del surco menor unido de modo covalente.
16. 26.- Una composici�n que comprende una pluralidad de oligonucle�tidos modificados que tienen al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida y almenos una base de pirimidina 5sustituida que tiene adem�s un fluor�foro unido, en el cual al menos una base de pirimidina 5-sustituida que tiene una f�rmula que consiste en

    y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida consiste en:

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos.
17. 27.- Una composici�n de la reivindicaci�n 23, en la que cada uno de dicha pluralidad de oligonucle�tidos comprende un fluor�foro unido y un extintor unido.
18. 28.- Una composici�n de la reivindicaci�n 26, en la que cada uno de dichos oligonucle�tidos modificados tiene una longitud de 4 a 30 bases, y tiene unas Tm diferentes aproximadamente en 2 �C entre s�.
19. 29.- Una composici�n de la reivindicaci�n 28, en la que dicha pluralidad es de aproximadamente 6 a aproximadamente 100.
20. 30.- Un procedimiento para distinguir polinucle�tidos con secuencias relacionadas, comprendiendo dicho procedimiento:

    (a)

    poner en contacto un oligonucle�tido modificado que tiene una secuencia definida que comprende al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida y al menos una pirimidina 5 sustituida, como se define en la reivindicaci�n 1, en lugar de una base de purina, y una base de pririmidina respectivamente con al menos dos polinucel�tidos, en el que uno de los polinucle�tidos tiene una secuencia diana que es perfectamente complementaria con el oligonucle�tido modificado y al menos uno de los otros polinucle�tidos tiene una secuencia diana con al menos una base desapareada; y

    (b)

    determinar el grado de hibridaci�n entre el oligonucle�tido modificado y cada uno de los polinucle�tidos.

21. 31.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 30, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un grupo indicador.
22. 32.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 31, en el que dicho grupo indicador es un fluor�foro.
23. 33.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 30, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un ligante del surco menor.
24. 34.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 30, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un ligante del surco menor y un fluor�foro.
25. 35.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 30, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un ligante del surco menor, un fluor�foro y un extintor.
26. 36.- Un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia diana en un polinucle�tido, comprendiendo el procedimiento:

    (a)

    incubar un polinucle�tido que se va a ensayar para la presencia de la secuencia diana con un oligonucle�tido modificado que tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria con la secuencia diana bajo condiciones de hibridaci�n; e

    (b)

    identificar los �cidos nucleicos hibridados;

    en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida en lugar de un resto purina y al menos una piridina 5 sustituida en lugar de un resto pirimidina, como se define en la reivindicaci�n 1.
27. 37.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 36, en el que dicha incubaci�n se realiza en presencia de una enzima cleavasa.
28. 38.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 36, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un grupo indicador.
29. 39.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 38, en el que dicho grupo indicador es un fluor�foro.
30. 40.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 39, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un extintor unido.
31. 41.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 36, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un ligante del surco menor unido.
32. 42.- Un procedimiento para la extensi�n de cebadores, comprendiendo el procedimiento incubar un polinucle�tido que contiene una secuencia diana con uno o m�s cebadores oligonucleot�dicos complementarios con la secuencia diana, en presencia de una enzima polimerizante y sustratos de nucle�tidos bajo condiciones favorables para la polimerizaci�n, en el que al menos uno de los cebadores oligonucleot�dicos contiene una base seleccionada a partir del grupo que consiste en una pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida, una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida en lugar de una base de purina y al menos una base que consiste en una base de pirimidina 5-sustituida, como se define en la reivindicaci�n 1, en lugar de una base de pirimidina, en el que dicha al menos una base de pirimidina 5sustituida tiene una una f�rmula que consiste en:

    y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida que consiste en:

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H,

    5 OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2

    10 C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos.
33. 43.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 42, en el que uno de dichos cebadores oligonucleot�dicos se extiende con una sola base.
34. 44.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 42, en el que al menos uno de dichos cebadores oligonucleot�dicos 15 comprende adem�s un ligante del surco menor unido.
35. 45.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 42, en el que dicha incubaci�n es parte de una reacci�n de amplificaci�n.
36. 46.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 45, en el que dicha reacci�n de amplificaci�n es una reacci�n en cadena de polimerasa.

    20 47.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 42, en el que dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s un ligante del surco menor unido de modo covalente.
37. 48.- Un procedimiento para determinar la secuencia de nucle�tidos de un polinucle�tido, comprendiendo el procedimiento:

    (a) incubar el polinucle�tido con una matriz de oligonucle�tidos modificados bajo condiciones de hibridaci�n; y 25 (b) determinar a cual de los oligonucle�tidos modificados en la matriz hibrida el polinucle�tido;

    en el que una pluralidad de los oligonucle�tidos modificados comprende al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3sustituida en lugar de una base de purina y al menos una base de pirimidina 5-sustituida en lugar de una base de pirimidina; en el que dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una f�rmula que consiste en:

    y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida que consiste en:

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en

    5 heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos.

    10 49.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 48, en el que dicha matriz comprende de 10 a 100.000 oligonucle�tidos modificados diferentes
38. 50.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 49, en el que dicha matriz comprende de 10 a 1000 oligonucle�tidos modificados diferentes.

    15 51.- Un procedimiento para determinar la secuencia de nucle�tidos de una secuencia diana en un polinucle�tido, comprendiendo el procedimiento:

    (a) poner en contacto un polinucle�tido que comprende la secuencia diana con al menos dos oligonucle�tidos de secuencia conocida, en el que dos o m�s restos purina de los oligonucle�tidos est�n reemplazados por

    20 al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida y una base de pirimidina 5-sustituida en lugar de una base de pirimidina, en la que dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una f�rmula que consiste en:

    y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida que consiste en:

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que

    35 consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos y en el que uno de dichos al menos dos oligonucle�tidos tiene una secuencia que

    40 es perfectamente complementaria con la secuencia diana y al menos otro de los oligonucle�tido tiene una secuencia diana relacionada, e incubar cada uno de los oligonucle�tidos con el polinucle�tido bajo condiciones de hibridaci�n; y

    (b) determinar el grado de hibridaci�n entre cada uno de los oligonucle�tidos y el polinucle�tido.
39. 52.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 51, en el que al menos uno de dichos oligonucle�tidos modificados 45 comprende adem�s un grupo indicador.
40. 53.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 51, en el que al menos uno de dichos oligonucle�tidos modificados comprende adem�s un ligante del surco menor.
41. 54.- Un procedimiento seg�n la reivindicaci�n 51, en el que al menos uno de dichos oligonucle�tidos modificados comprende adem�s un ligante del surco menor y un grupo indicador.

    5 55.- Un procedimiento para estudiar la expresi�n g�nica en una c�lula, comprendiendo el procedimiento:

    (a) incubar una poblaci�n de polinucle�tidos representativa de los genes expresados en la c�lula con una matriz de oligonucle�tidos que comprende una pluralidad de oligonucle�tidos modificados de diferentes secuencias bajo condiciones de hibridaci�n; y

    (b) determinar cu�les son los oligonucle�tidos modificados en la matriz que se hibridan con los 10 polinucle�tidos;

    en el que dichos oligonucle�tidos modificados comprenden al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida en lugar de una purina y al menos una base de pirimidina 5-sustituida en lugar de una base de pirimidina, en el cual

    15 dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una f�rmula que consiste en:

    y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida que consiste en:

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y

    25 cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas

    30 protegidas de los mismos .
42. 56.- Un procedimiento para identificar una mutaci�n en una secuencia diana de un gen de inter�s, comprendiendo el procedimiento:

    (a) incubar un polinucle�tido que comprende la secuencia diana con una matriz de oligonucle�tidos de

    35 diferentes secuencias, en el que las diferentes secuencias incluyen la secuencia diana de tipo salvaje y diferentes secuencias diana mutantes, bajo condiciones de hibridaci�n; y

    (b) determinar cu�les son los oligonucle�tidos en la matriz que se hibridan con el polinucle�tido;

    en el que dos o m�s restos purina en cada uno de los oligonucle�tidos est�n reemplazados por al menos una pirazolo[3,4-d]pirimidina 3-sustituida y una base de pirimidina es reemplazada con una base de pirimidina 5sustituida, en el que dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una f�rmula que consiste en:

    y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida que consiste en:

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que

    15 consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12),

    20 aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos.
43. 57.- El uso de la reivindicaci�n 13, en el que Y1 e Y2 es un grupo fosforamidita.

    25 58.- El uso de la reivindicaci�n 57, en el queel otro de Y2 e Y2 es un grupo hidroxi protegido.
44. 59.- El uso de la reivindicaci�n 58, en el que el grupo hidroxi protegido es un grupo 4,4’-dimetoxitritiloxi.
45. 60.- El uso de la reivindicaci�n 57, en el que el grupo fosforamidita es -O-(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita
46. 61.- el uso compuesto de la reivindicaci�n 59, en el que el grupo fosforamidita es -O-(2-cianoetil)-N,Ndiisopropilfosforamidita

    30 62.- El uso de la reivindicaci�n 57, en el cual B es 63.- El uso de la reivindicaci�n 62, en el cual el grupo fosforamidita es -O-(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita 64.- El uso de la reivindicaci�n 57, en el que B es
47. 65.- El uso de la reivindicaci�n 64, en el que el grupo fosforamidita es -O-(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita 66.- El uso de la reivindicaci�n 57, en el que B es

    y X11 es un grupo amino protegido 67.- El uso de la reivindicaci�n 66, en el cual el otro de Y1 e Y2 es un grupo hidroxi protegido. 68.- El uso de la reivindicaci�n 67 en el cual el grupo fosforamida es -O-(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita.

    15 69.- El uso de la reivindicaci�n 68 en el cual el otro de Y1 e Y2 es un grupo 4,4’-dimetoxitritilo. 70.- El uso de la reivindicaci�n 67, en el que uno o ambos de los grupos amino protegidos comprenden un grupo protector de an�logo de benzo�lo. 71.-El uso de la reivindicaci�n 57 en el que Z1 es hidr�geno, Y1 es OH e Y2 es OH. 72.-El uso de la reivindicaci�n 57 en el que Z1 y Z2 est�n combinados para formar un anillo de cinco a siete

    20 miembros. 73.- Una composici�n que tiene una pluralidad de oligonucle�tidos, comprendiendo dicha composici�n un primer oligonucle�tido con una primera secuencia que tiene al menos un al menos una pirazolo[3,4d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida en lugar de una purina y al menos una base de pirimidina 5sustituida en lugar de una base de pirimidina y en la que 25 la purina est� reemplazada con una pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida y la pirimidina est� reemplazada con pirimidina 5-sustituida en la que al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una f�rmula que cosiste en:

    y dicha al menos una base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida consiste en:

    en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O-(alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2-C12), arilo, heterociclilo, hal�geno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos y una primera Tm; y un segundo oligonucle�tido con una segunda secuencia y una segunda Tm en la que dicha primera Tm y dicha segunda Tm son iguales.
48. 74.- Una composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual dicha primera Tm es t� dentro de en aproximadamente 5�C de dicha segunda Tm.
49. 75.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual dicho primer oligonucle�tido es t� dentro de aproximadamente �2 bases de dicho segundo oligonucle�tido.
50. 76.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual dicha al menos una base modificada en dicha primera secuencia es un miembro seleccionado en el grupo que consiste en una base unida a un amino�cido, una base de �cido nucleico bloqueado y una base universal.
51. 77.- La composici�n de la reivindicaci�n 77, en la que dicha segunda secuencia tiene al menos una base modificada.
52. 78.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la que dicha al menos una base modificada en dicha segunda secuencia es un miembro seleccionado en el grupo que consiste en una base unida a un amino�cido, una base de �cido nucleico bloqueado y una base universal.
53. 79.- La composici�n de la reivindicaci�n 77, en la que dicha al menos una base modificada en dicha segunda secuencia es un miembro seleccionado en el grupo que consiste en PPA, PPG, PPPA, PPPG, PU, PC, HOPU, HOBuU, HOBuC, (NH2)2PPPA, (NH2)2PPPAOH, (NH2)2BuPPAOH, (NH2)2PPAI y HOBuPPG.
54. 80.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual dicha primera secuencia tiene un MGB unido a la misma.
55. 81.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual dicha segunda secuencia tiene un MGB unido a la misma.
56. 82.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual almenos una base modificada en dicha primera secuencia reduce la estabilidad de dicho primer oligonucle�tido.
57. 83.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual almenos una base modificada en dicha primera secuencia aumenta la estabilidad de dicho primer oligonucle�tido.
58. 84.- La composici�n de la reivindicaci�n 73, en la cual dicho primer oligonucle�tido y dicho segundo oligonucle�tido se distribuyen en matriz sobre una superficie.
59. 85.- La composici�n de la reivindicaci�n 84, en la que dicha matriz comprende un soporte s�lido y una pluralidad de oligonucle�tidos unidos, en la que dicha pluralidad de oligonucle�tidos contiene al menos una base modificada seleccionada en el grupo que consisten en pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituidas, pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3sustituida y pirimidinas 5-sustituidas.
60. 86.- La composici�n de la reivindicaci�n 84, en la que dicha matriz comprende un soporte s�lido y una pluralidad de oligonucle�tidos unidos, en la que dicha pluralidad de oligonucle�tidos contiene al menos una base modificada seleccionada en el grupo que consisten en pirazolo[3,4-d]pirimidinas 3-sustituida y pirimidinas 5-sustituidas.
61. 87.- La composici�n de la reivindicaci�n 84, en la que dicha matriz comprende aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 oligonucle�tidos unidos, teniendo cada uno unas Tm dentro de en aproximadamente 2 �C entre s�, y unas longitudes de pares de bases diferentes en aproximadamente 2 bases entre s�.
62. 88.- Un procedimiento para dise�ar un oligonucle�tido modificado que tiene una Tm estable, comprendiendo dicho procedimiento :

    (a)

    proporcionar un oligonucle�tido con una secuencia conocida que tiene n bases y una Tm conocida; y

    (b)

    dise�ar oligonucle�tidos modificados que tienen al menos una base purina modificada y al menos una base de pirimidina, en la que la purina es reemplazada por una pirazolo[3,4-d]pirimidinas no sustituida o 3sustituida como se define en la reivindicaci�n 1, y la pirimidina es reemplazada por pirimidina 5-sustituida, como se define en la reivindicaci�n 1, usando la contribuci�n termodin�mica dependiente de la secuencia de dicha al menos una base modificada, en la que dicho oligonucle�tido modificado tiene menos n bases y tiene una Tm que es igual que dicha Tm, implementada en un sistema inform�tico.

63. 89.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que la contribuci�n termodin�mica de dicho oligonucle�tido modificado que tiene al menos una base modificada se determina usando los par�metros de los vecinos m�s pr�ximos.
64. 90.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el cual dicho oligonucle�tido es derivado del GenBank.
65. 91.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que dicha al menos una base modificada es un miembro seleccionado en el grupo que consiste en una base unida a un amino�cido, una base de �cido nucleico bloqueado y una base universal.
66. 92.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que dicho oligonucle�tido modificado tiene un ligante del surco menor (MGB) unido al mismo.
67. 93.- El procedimiento de la reivindicaci�n 92, en el que el MGB est� unido al oligonucle�tido modificado por una mol�cula extintor.
68. 94.- El procedimiento de la reivindicaci�n 92, que comprende adem�s:

    determinar:

    i) la contribuci�n termodin�mica dependiente de la secuencia del MGB unido a dicho oligonucle�tido,

    y

    ii) la contribuci�n termodin�mica dependiente de la secuencia de dicho oligonucle�tido; y en el que el

    dise�o del conjugado oligonucle�tido-MGB se realiza con la ayuda de las contribuciones

    termodin�micas determinadas de dicho MGB y dicho oligonucle�tido.
69. 95. El procedimiento de la reivindicaci�n 94, en el que la contribuci�n termodin�mica de dicho MGB unido a dicho oligonucle�tido es determinada comparando la estabilidad de los d�plex de un primer d�plex de dicho oligonucle�tido con la estabilidad de un segundo d�plex de dicho oligonucle�tido con un MGB unido.
70. 96.- El procedimiento de la reivindicaci�n 94, en el que dicha Tm conocida de dicho oligonucle�tido es determinada de manera emp�rica.
71. 97.- El procedimiento de la reivindicaci�n 94, en el que dicha Tm conocida de dicho oligonucle�tido es determinada usando los par�metros de los vecinos m�s pr�ximos.
72. 98.- El procedimiento de la reivindicaci�n 94, en el que dicha secuencia conocida que tiene n bases contribuye a dicha Tm conocida.
73. 99.- El procedimiento de la reivindicaci�n 94, en el que dicha Tm de dicho conjugado oligonucle�tido-MGB es distinta en aproximadamente 5�C de dicha Tm conocida.
74. 100. El procedimiento de la reivindicaci�n 94, que comprende adem�s, repetir la etapa de dise�o para generar una pluralidad de conjugados oligonucle�tido-MGB diferentes, teniendo cada uno una Tm que es igual a dicha Tm conocida.
75. 101.- El procedimiento de la reivindicaci�n 100, en el que cada uno de dicha pluralidad de conjugados 5 oligonucle�tido-MGB diferentes son diferentes en aproximadamente 1-2 bases entre s�.
76. 102.- El procedimiento de la reivindicaci�n 100 en el que dicha pluralidad de conjugados oligonucle�tido-MGB diferentes est�n inmovilizados en un sustrato.
77. 103.- El procedimiento de la reivindicaci�n 100 en el que dicha pluralidad de conjugados oligonucle�tido-MGB diferentes est�n sintetizados en un sustrato.

    10 104.- El procedimiento de la reivindicaci�n 102 en el que dicho sustrato es un miembro seleccionado en el grupo que consiste en un vidrio, poliestireno, nailon, nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio, fibras �pticas y pl�stico.
78. 105.- El procedimiento de la reivindicaci�n 92, en el que dicho MGB tiene una f�rmula seleccionada en el grupo que consiste en:

    15 en las que el sub�ndice m es un n�mero entero de 2 a 5; el sub�ndice r es un n�mero entero de 2 a 10; y cada Ra y Rb son independientemente un grupo conector con dicho oligonucle�tido modificado, H, -ORc, -NRcRd, -COORc o -CONRcRd , en los que cada Rc y Rd se seleccionan de H, heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12),

    20 heteroalquinilo(C2-C12), alquilo(C1-C12), alquenilo(C2-C12), alquinilo(C2-C12), aril(alquilo C1-C12), y arilo.
79. 106. El procedimiento de la reivindicaci�n 92, en el que dicho MGB est� unido al extremo 3’ de dicho oligonucle�tido

    modificado.
80. 107. El procedimiento de la reivindicaci�n 92, en el que dicho MGB est� unido al extremo 5’ de dicho oligonucle�tido 25 modificado.
81. 108. El procedimiento de la reivindicaci�n 92, en el que dicho MGB est� unido a otro distinto del extremo 3’ o el extremo 5’ de dicho oligonucle�tido modificado.
82. 109.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que la dicha al menos una base modificada reduce la estabilidad de dicho oligonucle�tido modificado.

    30 110.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que la dicha al menos una base modificada aumenta la estabilidad de dicho oligonucle�tido modificado.
83. 111.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, que comprende adem�s, repetir la etapa (b) para generar una pluralidad de oligonucle�tidos modificados diferentes, cada uno con una Tm que es igual a dicha Tm conocida.
84. 112.- El procedimiento de la reivindicaci�n 111, en el que dicha pluralidad de oligonucle�tido modificados diferentes 35 que tienen cada uno una Tm que es igual a dicha Tm conocida tiene al menos un oligonucle�tido sin una base modificada.
85. 113.- El procedimiento de la reivindicaci�n 111, en el que dicha pluralidad de oligonucle�tidos modificados diferentes tienen conjugados MGB unidos a los mismos.
86. 114.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que dicha pluralidad de oligonucle�tidos diferentes est�n 40 inmovilizados en un sustrato.
87. 115.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que el dise�o de dicho oligonucle�tido modificado comprende adem�s usar la contribuci�n termodin�mica dependiente de la secuencia de las bases naturales en dicho oligonucle�tido modificado.
88. 116.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que dicho oligonucle�tido y dicho oligonucle�tido modificado tienen propiedades de hibridaci�n similares.
89. 117.- El procedimiento de la reivindicaci�n 88, en el que el oligonucle�tido tiene uno o m�s de un fluor�foro y una mol�cula extintor unidos al mismo.