ES2389078T3 - Tratamiento de infecciones virales - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de SEQ ID No. 2 o una de sus truncaciones, en donde uno o varios de los residuos de leucina (L) de SEQ ID No. 2 están reemplazados por triptófano (W), arginina (R) o lisina (K); en donde el polipéptido o una de sus truncaciones comprende 14-18 aminoácidos; y en donde el polipéptido tiene actividad antiviral

Description

Tratamiento de infecciones virales

La presente invenci6n se refiere a polipeptidos y a acidos nucleicos que los codifican con actividad antiviral. La invenci6n tambien proporciona el uso de tales polipeptidos o acidos nucleicos como medicamentos.

5 Los agentes antivirales pueden dirigirse a uno de seis estadios del ciclo de replicaci6n viral, siendo estos: 1. uni6n del virus con la celula; 2. penetraci6n (o fusi6n de la membrana viral con la membrana celular); 3. ningun recubrimiento del virus; 4. replicaci6n de los acidos nucleicos virales; 5. maduraci6n de partfculas de virus de progenie; y 6. liberaci6n del virus de progenie en fluidos extracelulares.

De estos seis estadios, la replicaci6n (estadio 4 anterior) es el objeto, que es influenciado de la forma mas efectiva

10 por terapias antivirales convencionales. Sin embargo, la uni6n del virus con la celula es, sin duda, un objetivo mas atractivo, dado que el agente no necesita pasar a la celula huesped. Sin embargo, sigue siendo un area en la que se han desarrollado pocas terapias exitosas.

Por ello, un objeto de la presente invenci6n consiste en proporcionar agentes terapeuticos que modulen la uni6n viral con las celulas.

15 Las lipoprotefnas (LPs) son complejos macromoleculares globulares presentes en suero y otros fluidos extracelulares, que consisten en lfpidos y protefnas y estan implicadas en el transporte de lfpidos alrededor del organismo. Fueron categorizadas de acuerdo con su densidad, siendo las clases principales la lipoprotefna de alta densidad (HDL), lipoprotefna de baja densidad (LDL) y lipoprotefna de muy baja densidad (VLDL). Sus protefnas se mencionan como apolipoprotefnas, y se ha descrito una cantidad de ellas, incluyendo apolipoprotefnas A, B, C, D, E,

20 F, G, H y J. Ademas, se han documentado varios subtipos de apolipoprotefnas A, B y C.

Se han descrito diversas interacciones que ligan las LPs con virus. Estas principalmente implican la uni6n de los virus con lipoprotefnas, lo cual da como resultado una menor inefectividad viral o, por el contrario, provee un metodo de transporte para que el virus ingrese en las celulas. Adicionalmente, diversos virus hacen uso de receptores celulares para LPs (por ejemplo, el receptor de LDL) como un medio de entrar en las celulas, a pesar de que estos 25 receptores tambien pueden ser liberados por celulas como agentes antivirales end6genos (por ejemplo, una forma soluble del receptor de VLDL es liberada en medio de cultivo por celulas HeLa e inhibe la infecci6n por rinovirus humano). Por otra parte, tambien se inform6 de la uni6n directa entre ciertas apolipoprotefnas y protefnas virales. Por ejemplo: a. la protefna nuclear de virus de hepatitis C se une con la apolipoprotefna All; b. el antfgeno de superficie del virus de hepatitis B se une con la apolipoprotefna H; y c. la protefna gp32 del virus de

30 inmunodeficiencia de simio (SlV) y la protefna gp41 del virus de inmunodeficiencia humana (HlV) se une con la apolipoprotefna A1.

El trabajo realizado en el laboratorio del inventor mostr6 que la presencia de virus herpes simplex latente de tipo 1 (HSV1) en el cerebro y la posici6n de un alelo particular de un gen especffico -el alelo APOE-e4 del gen APOE- aumenta el riesgo de desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (AD). Tomados con el hallazgo adicional de que los 35 portadores de APOE-e4 sufran mas probablemente de herpes en la boca (que son lesiones halladas despues de la reactivaci6n de HSV1 en el sistema nervioso periferico), estos resultados sugirieron que es mas probable que los portadores de APOE-e4 padezcan de un dano por infecciones de HSV1 y sugieren que puede haber interacciones entre la apolipoprotefna E y ciertos virus (a pesar de que estas interacciones no necesariamente incluyen efectos antivirales). Un posible modo de interacci6n entre HSV1 y apoE se refiere a los hallazgos independientes de que los

40 dos utilizan moleculas de proteoglucano de sulfato de heparano celular (HSPG) como su sitio inicial de uni6n con celulas, antes de la posterior uni6n con receptores secundarios que aumenta la posibilidad de que se produzca esa competencia en estos sitios de HSPG entre HSV1 y apoE con LPs, lo cual podrfa afectar la entrada viral.

Se mostr6 que la apolipoprotefna E tiene efectos sobre el sistema inmune (aparentemente, sin relaci6n con su papel en el metabolismo de los lfpidos) incluyendo la supresi6n de la proliferaci6n de linfocitos T. Se han examinado las 45 interacciones entre una cantidad de peptidos derivados de los residuos 130-169 de apoE con linfocitos (Clay et al., Biochemistry, 34: 11142-11151 (1995)). Se pronostica que la regi6n que consiste en residuos apoB 141-149 es particularmente importante. Se han descrito similares interacciones de tales peptidos en lfneas celulares neuronales.

El documento WO 94/04177 revela que la administraci6n de partfculas que contienen peptidos helicoidales lipfdicos y anfipaticos permite la clearance de toxinas producida por microorganismos y puede incrementar la efectividad de

50 farmacos antibacterianos por medio de un efecto sobre las membranas bacterianas. Sin embargo, no se sugiere que este peptido derivado de apoA que contiene partfculas se pueda usar como medicamentos antivirales. Tampoco queda claro si la administraci6n de los peptidos en partfculas que es un componente clave del desarrollo revelado (si las partfculas se forman antes de la administraci6n o de forma end6gena) darfa como resultado la utilizaci6n efectiva de cualquier acci6n antiviral de cualquier componente de la partfcula.

55 Se mostr6 que un peptido helicoidal anfipatico derivado de apoA (descrito por Ananatharamiah en Meth. Enz., 128: 627-647 (1986)) previene la fusi6n de membranas virales con membranas celulares y, por otra parte, previene la fusi6n de membranas de celulas infectadas (Srinivas et al. J. Cellular Biochem., 45: 224-237 (1991)). El peptido tambien era efectivo en la prevenci6n de la fusi6n tanto para HSV1 como para HlV (Owens et al., J Clin. lnvest., 86: 1142-1150 (1990)). Sin embargo, el peptido no tuvo ningun efecto sobre la uni6n de HSV1 al menos con las celulas (Srinivas et al. supra).

Azuma et al. informaron que los derivados peptfdicos de apoB tienen una fuerte acci6n antibacteriana, comparable con la de la gentamicina (Peptides, 21: 327-330 (2000)). ApoB 133-162 fue el mas efectivo, donde apoE 134-155 tenfa un efecto menor.

Owens et al. (1990, J. Clin lnvest Vol 86(4) p1142-1150) revela que la apolipoprotefna A-1 y sus analogos peptfdicos helicoidales anfipaticos inhiben la formaci6n del sincicio inducido por HlV. ltzhakl et al. (1998, Nature Medicine Vol 4(12) p1344) trata interacciones entre Apo E y virus. Corder et al. (1998, Nature Medicine Vol 4(10) p1182-1184) revela que los sujetos infectados con HlV con el alelo E4 para ApoE tienen demencia en exceso y neuropatfa periferica.

A la luz de la investigaci6n descrita con anterioridad, el inventor realiz6 experimentos para evaluar si los peptidos derivados de ApoE (que son capaces de formar helices) tienen una actividad antiviral o no. Hall6 que una repetici6n en tandem de un fragmento peptfdico de ApoE, apoE141-149 (es decir, 2x LRKLRKRLL -SEQ lD No. 1), tenfa de hecho una acci6n antiviral. Si bien el inventor no desea estar ligado a ninguna hip6tesis, cree que este fragmento evita la uni6n de partfculas virales a las celulas, dando como resultado una reducci6n de la infectividad de los virus medida por medio de una tecnica de ensayo de reducci6n de placas. El Ejemplo 1 ilustra c6mo el peptido es efectivo contra virus tales como HSV1, HSV2 y HlV. Conforme a ello, este peptido puede ser efectivo cuando se aplica a virus directamente o cuando se aplica a virus en presencia de celulas y, por ello, el peptido se puede usar para inactivar partfculas sin virus hasta que alcancen sus celulas objeto.

A la luz de los datos generados para una repetici6n en tandem de apoE141-149 (es decir, 2x LRKLRKRLL-SEQ lD No. 1), los inventores decidieron investigar otros fragmentos de apolipoprotefnas respecto de la actividad antiviral.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invenci6n, se proporciona un polipeptido de SEQ lD No. 2 o una de sus truncaciones, en donde uno o varios de los residuos de leucina (L) de SEQ lD No. 2 estan reemplazados por tript6fano (W), arginina (R) o lisina (K); en donde el polipeptido o una de sus truncaciones comprende 14-18 aminoacidos; y en donde el polipeptido tiene actividad antiviral.

Por "una repetici6n en tandem de apoE141-149 de SEQ lD No. 2" se entiende el peptido con la secuencia de aminoacidos: LRKLRKRLLLRKLRKRLL. La repetici6n en tandem se menciona en la presente como apoE141-149dp o apoE141-149r. Aeste peptido tambien se le asigna el c6digo GlN 1 o GlN1p (en donde p significa protecci6n N terminal (por ejemplo, por un grupo acetilo) y protecci6n C terminal (por ejemplo, por un grupo amida)).

Por "una de sus truncaciones" se entiende que el 18mero de la SEQ lD No. 2 se reduce en tamano por medio de eliminaci6n de aminoacidos. La reducci6n de aminoacidos se puede ser por medio de eliminaci6n de residuos del C

o N terminal del peptido o puede ser por medio de supresi6n de uno o varios aminoacidos de dentro del nucleo del peptido (es decir, aminoacidos 2-17 de SEQ lD No. 2).

El inventor realiz6 exhaustivos experimentos para evaluar la actividad antiviral de peptidos de apolipoprotefnas y sus derivados. Los peptidos y derivados de ApoE eran un foco particular. Para sorpresa de los inventores, ellos hallaron que la mayorfa de los peptidos ensayados no tenfan o tenfan un bajo efecto antiviral. Las excepciones sorprendentes eran peptidos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n. Los ejemplos 2 -7 ilustran la eficacia de los peptidos de acuerdo con la invenci6n en comparaci6n con una repetici6n en tandem de apoE141-149 y otros peptidos derivados de apolipoprotefnas.

El inventor identific6 que el tript6fano (W), la arginina (R) o la lisina (K) pueden ser sustituidos por leucina en repeticiones en tandem de apoE141-149 y que estos peptidos tienen una sorprendente actividad antiviral. El inventor apreci6 que estos aminoacidos tenfan cadenas laterales que comprendfan al menos 4 carbonos y tambien que contenfan un atomo de nitr6geno. Conforme a ello, el aminoacido usado para reemplazar la leucina es tript6fano (W), arginina (R) o lisina (K) o sus derivados en el peptido de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n.

El inventor hall6 que los peptidos en los que al menos un L fue sustituido con un W tienen una actividad antiviral particular. Por ende, lo mas preferible es que los peptidos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n comprendan un polipeptido, su derivado o analogo que comprenden una repetici6n en tandem de apoE141-149 de SBQ lD No 2 o una de sus truncaciones, caracterizado porque al menos un residuo de leucina (L) de SEQ lD No. 2 esta reemplazado por un tript6fano (W).

Durante el trabajo de desarrollo, el inventor observ6 que se puede esperar que las sustituciones W aumenten la probabilidad de que el peptido forme una helice alfa y se pregunt6 si esto podrfa explicar la eficacia antiviral de los compuestos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n. Sin embargo, no cree que esto explique la sorprendente eficacia de los peptidos de acuerdo con la invenci6n. Esto se debe a que se espera que una cantidad de sustituciones alternativas incremente la formaci6n de una helice alfa (por ejemplo, ver la Tabla 1 para el calculo de la probabilidad de diversos peptidos L-sustituidos que forman una helice alfa). Sin embargo, la probabilidad de

formaci6n de una helice (tabla 1) no se correlaciona con la actividad antiviral de peptidos de acuerdo con la presente invenci6n (ver el Ejemplo 5).

Tabla 1. Proporci6n predicha de moleculas de diversos peptidos que forman la helice alfa en tamp6n acuoso 0,15 M de NaCl a 37 °C (%) (usando el software de predicci6n de estructuras secundarias AGADlR asequible de http://www.emblheidelberg.de/ Services/serrano/agadir/agadir-start.html)

Sustituci6n de aminoacidos

Secuencia de peptido % de helice

E, Glu

ERKERKREEERKERKREE 6,24

A, Ala

ARKARKRAAARKARKRAA 1,85

D, Asp

DRKDRKRDDDRKDRKRDD 1,59

W, Trp

WRKWRKRWWWRKWRKRWW 1,47

M, Met

MRKMRKRMMMRKMRKRMM 1,01

Y, Tyr

YRKYRKRYYYRKYRKRYY 0,8

F, Phe

FRKFRKRFFFRKFRKRFF 0,79

l, lle

lRKlRKRlllRKlRKRll 0,6

Q, Gln

QRKQRKRQQQRKQRKRQQ 0,55

Sin intercambio

0,51

Los inventores tambien observaron:

1.

El aumento de la sustituci6n W es muy pequeno (0,51% de moleculas de GlN 1p formaran una helice, que se incrementa marginalmente hasta 1,47% del peptido sustituido con W); y

2.

Una cantidad de otras sustituciones se pronosticarfan para incrementar la proporci6n de moleculas que forman una helice alfa en cualquier momento. Por ejemplo, la sustituci6n L por E o A aumenta la probabilidad de formaci6n una helice alfa mas alla de una sustituci6n W (al 6,24% y 1,87%, respectivamente). Sin embargo, ambas sustituciones de hecho eliminan la actividad antiviral (por ejemplo, ver el peptido GlN39 en el Ejemplo 3 o el Ejemplo 5).

En consecuencia, no hay correlaci6n entre la probabilidad de formar una helice alfa y la potencia de la actividad antiviral para peptidos 'L-sustituidos' de acuerdo con la invenci6n.

La eficacia de peptidos de acuerdo con la invenci6n es la mas sorprendente porque la sustituci6n L (leucina) con aminoacidos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n hara menos anfipatico al peptido. (La Tabla 2 ilustra el orden aceptado de hidrofobicidad de aminoacidos). Un experto en la tecnica puede sospechar en realidad que hacer mas anfipatico a un peptido le conferirfa un caracter antiviral. En consecuencia, de forma inesperada, las sustituciones de acuerdo con la invenci6n de SEQ lD No. 2 daran como resultado un aumento significativo en su actividad antiviral.

Tabla 2

Hidrofobicidad de aminoacidos

Phe > Leu = He > Tyr = Trp > Val > Met > Pro > Cys > Ala > Gly > Thr > Ser > Lys > GIn > Asn > His > Glu > Asp > Arg

Tal como se tratara con mayor detalle a continuaci6n, la SEQ lD No. 2 puede ser manipulada de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n con una cantidad de diferentes sustituciones y supresiones para preparar peptidos con actividad antiviral. Sin embargo, se prefiere que el polipeptido de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n tenga al menos dos sustituciones W, R o K y, con mayor preferencia, tres o mas sustituciones W, R o K.

Ademas de una o varias sustituciones L con W, R o K, se prefiere que al menos otro aminoacido (con preferencia, al menos otro residuo de leucina) se reemplace con asparagina (N), tirosina (Y), cistefna (C), metionina (M), fenilalanina (F), isoleucina (l), glutamina (Q) o histidina (H). Se prefiere en particular que tal sustituci6n sea Y o C.

El polipeptido sustituido puede comprender 18 aminoacidos (o sus derivados) y corresponde asf a la longitud total de la SEQ lD No. 2. Sin embargo, los inventores hallaron sorprendentemente que los peptidos truncados en base a SEQ lD No. 2 tambien tienen una eficacia como agentes antivirales. Conforme a ello, los peptidos preferidos o sus derivados pueden tener menos de 18 aminoacidos. Por ejemplo, algunos peptidos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n pueden tener una longitud de 17, 16, 15, 14, aminoacidos.

Los peptidos y sus derivados de acuerdo con la presente invenci6n tienen con preferencia una eficacia para inhibir el crecimiento viral de modo que su valor de lC50 sea de 30 IM o menos. Se prefiere que el valor de lC50 sea de 20 IM

o menos y, con mayor preferencia, que el valor delC50 sea de 10 IM o menos.

Los peptidos preferidos tienen valores de lC50 similares entre las especies virales. Por ejemplo, los peptidos preferidos tienen valores de lC50 similares para inhibir el crecimiento HSV1, HSV2 y HlV.

Se apreciara que los aminoacidos modificados puedan ser sustituidos en la repetici6n en tandem de apoE141-149 con una cantidad de variantes de aminoacidos que pueden ser conocidas por los expertos en la tecnica. Estos peptidos aun tendran una actividad antiviral siempre que la modificaci6n no altere de forma significativa sus caracterfsticas qufmicas. Por ejemplo, los hidr6genos en las aminas de la cadena lateral de R o K se pueden reemplazar con grupos metileno (-NH2 - -NH(Me) o -N(Me)2).

Los peptidos preferidos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n tienen la secuencia de aminoacidos:

(a)

WRKWRKRWWWRKWRKRWW (SEQ lD No. 3). Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total con todas las leucinas sustituidas por residuos de tript6fano. Este peptido se designa GlN 7 cuando se menciona en la presente.

(b)

WRKWRKRWRKWRKR (SEQ lD No. 4). Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total con todas las leucinas sustituidas por residuos de tript6fano y truncadas por excisi6n de aminoacidos 9, 10, 17 y

18. Este peptido se designa GlN 32 cuando se menciona en la presente.

(c)

WRKWRKRWWLRKLRKRLL (SEQ lD No. 5). Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total con un subgrupo de leucinas sustituidas por residuos de tript6fano. Este peptido se designa GlN 34 cuando se menciona en la presente.

(d)

WRKWRKRWWRKWRKRWW (SEQ lD No. 52). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 3 con el residuo W en la posici6n 9 suprimida. Este peptido se designa MU 58 cuando se menciona en la presente.

(e)

WRKWRKRWRKWRKRW (SEQ lD No. 53). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 3 con los residuos W en la posici6n 9, 10 y 18 suprimidas. Este peptido se designa MU 59 cuando se menciona en la presente.

(f)

WRKWRKRWWFRKWRKRWW (SEQ lD No. 54). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 3 con el residuo W en la posici6n 10 sustituida con F. Este peptido se designa MU 60 cuando se menciona en la presente.

(g)

WRKWRKRWFFRKWRKRFF (SEQ lD No. 55). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 3 con los residuos W en las posiciones 9, 10, 17 y 18 sustituidas con residuos F. Este peptido se designa MU 61 cuando se menciona en la presente.

(h)

WRKCRKRCWWRKCRKRCW (SEQ lD No. 56). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 3 con los residuos W en las posiciones 4, 8, 13 y 17 sustituidas con residuos C. Este peptido se designa MU 68 cuando se menciona en la presente.

(i)

LRKLRKRLLWRKWRKRWW (SEQ lD No. 57). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 2 con los residuos L en las posiciones 10, 13, 17 y 18 sustituidas con residuos W. Este peptido se designa MU 111 cuando se menciona en la presente.

(j)

LRKLRKRLLLRKLRKRWW (SEQ lD No. 58). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 2 con los residuos L en las posiciones 17 y 18 sustituidas con residuos W. Este peptido se designa MU 112 cuando se menciona en la presente.

(k)

LRKLRKRLLWRKWRKRLL (SEQ lD No. 59). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 2 con los residuos L en las posiciones 10 y 13 sustituidas con residuos W. Este peptido se designa MU 113 cuando se menciona en la presente.

(l)

WRKWRKRLLLRKLRKRLL (SEQ lD No. 60). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 2 con los residuos L en las posiciones 1 y 4 sustituidas con residuos W. Este peptido se designa MU 114 cuando se menciona en la presente.

(m)

WRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEQ lD No. 61). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 2 con el residuo L en la posici6n 1 sustituidas con residuos W. Este peptido se designa MU 115 cuando se menciona en la presente.

(n)

WRKWRKFFFRKWRKRWW (SEQ lD No. 62). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 3 con los residuos W en las posiciones 8, 9 y 10 sustituidas con residuos F y el residuo R en la posici6n 7 suprimida. Este peptido se designa MU 116 cuando se menciona en la presente.

(o)

WRKWRKRWWFRKFRKRFF (SEQ lD No. 63). Este peptido corresponde al SEQ lD No. 3 con los residuos W en las posiciones 10, 13, 17 y 18 sustituidas con residuos F. Este peptido se designa MU 117 cuando se menciona en la presente.

(p)

RRKRRKRRRRRKRRKRRR (SEQ lD No. 64). Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total con todas las leucinas sustituidas por residuos de arginina (R). Este peptido se designa MU 16 cuando se menciona en la presente.

(q)

KRKKRKRKKKRKKRKRKK (SEQ lD No. 65). Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total con todas las leucinas sustituidas por residuos de lisina (K). Este peptido se designa MU 18 cuando se menciona en la presente.

El inventor tambien apreci6 que los peptidos se puedan emplear de acuerdo con la invenci6n que comprenden mas de s6lo una simple repetici6n en tandem dimerica de ApoE141-149 o una de sus truncaciones. Por ejemplo, los peptidos que comprenden un trfmero o un numero mayor de repeticiones se pueden emplear con agentes antivirales.

En otra forma de realizaci6n de la invenci6n, se pueden sintetizar peptidos antivirales que comprenden un peptido tal como se defini6 con anterioridad a los que se han anadido otros aminoacidos. Por ejemplo, uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden anadir a los terminales C o N de un peptido derivado de SEQ lD No. 2. De modo alternativo, el peptido puede comprender una repetici6n en tandem de un peptido que es mayor que los nueve aminoacidos de la SEQ lD No. 1. Estos peptidos pueden tener aminoacidos anadidos al N terminal, C terminal y/o entre los aminoacidos 9 y 10 de la SEQ lD No. 2. Se prefiere mas que el aminoacido se anada al C terminal y tambien entre los aminoacidos 9 y 10 de la SEQ lD No. 2. Se apreciara que estos peptidos se puedan modificar luego tal como se describi6 con anterioridad para los peptidos derivados de la SEQ lD No. 2. A modo de ejemplo, WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR (SEQ lD No. 66) representa otro peptido preferido de acuerdo con la presente invenci6n. Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total de ApoE141-150 (es decir, una repetici6n en tandem de LRKLRKRLLR) con todas las leucinas sustituidas por residuos de tript6fano. Este peptido se designa como MU 83 cuando se menciona en la presente.

Durante el desarrollo de derivados de repeticiones en tandem de apoE141-149 de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n, se apreci6 que las truncaciones de la SEQ lD No. 2 y sus variantes tambien tenfan una sorprenden actividad antiviral. Ellas incluyen:

LRKLRKRLLLRKLRK (SEQ lD No. 7). Este peptido corresponde a una forma truncada de la repetici6n en tandem de longitud total con residuos 16, 17 y 18 suprimidos. Este peptido tiene la ventaja de que el peptido es mas corto que GlN 1 y, en consecuencia, es mas econ6mica su fabricaci6n. Este peptido se designa GlN 4 cuando se menciona en la presente.

LRKLRKRLRKLRKR (SEQ lD No. 8). Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total truncada por excisi6n de los aminoacidos 9, 10,17 y 18. Este peptido se designa GlN 8 cuando se menciona en la presente.

LRKLRKLRKLRKLRKLRK (SBQ lD No. 9). Este peptido corresponde a una variaci6n de la repetici6n en tandem de longitud total que comprende una repetici6n del motivo LRK. Este peptido se designa GlN 9 cuando se menciona en la presente.

Por otra parte, se hall6 que YRKYRKRYYYRKYRKRYY (SEQ lD No. 6) es efectivo como un agente antiviral. Este peptido corresponde a la repetici6n en tandem de longitud total de apoE141-149 con todas las leucinas sustituidas por residuos de tirosina. Este peptido se designa GlN 41 cuando se menciona en la presente.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invenci6n, se proporciona un polipeptido, de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n o un peptido de la SEQ lD No. 6, 7, 8 6 9 para usar como un medicamento.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invenci6n, se proporciona el uso de un polipeptido, de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n o un peptido de SEQ lD No. 6, 7, 8 6 9 para la preparaci6n de un medicamento para tratar infecciones virales.

Debido a su mayor actividad biol6gica, los polipeptidos de acuerdo con los primeros tres aspectos de la invenci6n son de utilidad como agentes antivirales.

Los polipeptidos de acuerdo con el primer, el segundo y el tercer aspecto de la invenci6n se pueden usar en el tratamiento de una cantidad de infecciones virales. El virus puede ser cualquier virus y en particular un virus envuelto. Los virus preferidos son poxvirus, iridovirus, togavirus o torovirus. Un virus de mayor preferencia es un filovirus, arenavirus, buniavirus o rabdovirus. Un virus de mayor preferencia aun es un paramixovirus o un ortomixovirus. Se preve que el virus pueda incluir preferentemente un hepadnavirus, coronavirus, flavivirus o retrovirus. Con preferencia, el virus incluye un herpesvirus o un lentivirus. En formas de realizaci6n preferidas, el virus puede ser virus de inmunodeficiencia humana (HlV), virus herpes simplex humano de tipo 2 (HSV2) o virus herpes simplex humano de tipo 1 (HSV1).

Los polipeptidos de acuerdo con el primer, el segundo y el tercer aspecto de la invenci6n se pueden usar para tratar infecciones virales como una monoterapia (es decir, uso del compuesto solo) o en combinaci6n con otros compuestos o tratamientos usados en la terapia antiviral (por ejemplo, aciclovir, gangcilovir, ribavirina, interfer6n, medicamentos anti-HlV incluyendo inhibidores de nucle6sidos, nucle6tidos o no micle6sidos de transcriptasa inversa, inhibidores de proteasa e inhibidores de fusi6n).

Los polipeptidos se pueden usar como un profilactico (para evitar el desarrollo de una infecci6n viral) o se pueden usar para tratar infecciones existentes.

Los polipeptidos de la invenci6n representan productos que pueden ser expresados ventajosamente por celulas biol6gicas.

Asf, la presente invenci6n tambien proporciona, en un quinto aspecto, una secuencia de acidos nucleicos que codifican un polipeptido de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n.

Los acidos nucleicos que codifican apoE141-149 tiene la secuencia de ADN cttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt (SEQ lD. No. 10), mientras que GlN tiene la secuencia cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt (SEQ lD. No. 11).

Los acidos nucleicos preferidos de acuerdo con el quinto aspecto de la invenci6n que codifican los peptidos identificados en la presente como GlN 4, 7, 8, 9, 32, 34 y 41 tienen las siguientes secuencias respectivas:

cttcgtaaao ttcgtaaact tcgtaaactt cgtaaacttc gtaaacttcg taaa (SEQ lD No.16);

tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggtgg cgtaaatggc gtaaacgttg gtgg (SEQ lD No.12);

cttcgtaaao ttcgtaaacg tcttcgtaaa cttcgtaaac gt (SEQ lD No. 17);

cttcgtaaac ttcgtaaact tcgtaaactt cgtaaacttc gtaaacttcg taaa (SBQ lD No.18);

tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggcgtaaa tggcgtaaac gt (SBQ lD No.13);

tggcgtaaat ggcgtaaacg ttggtggctt cgtaaacttc gtaaacgtct tctt, (SEQ lD No. 14); y

tatcgtaaat atcgtaaacg ttattattat cgtaaatatc gtaaacgtta ttat (SEQ lD No. 15).

Un experto en la tecnica apreciara que la secuencia de acidos nucleicos de otros peptidos preferidos de acuerdo con la presente invenci6n se pueda generar de manera simple.

Se apreciara que, debido a la redundancia en el c6digo genetico, una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con el quinto aspecto de la invenci6n pueda variar del gen ApoE natural, proporcionando un cod6n que codifica un polipeptido, de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n.

Se apreciara que los polipeptidos de acuerdo con la invenci6n representen favorables agentes para administrar por medio de tecnicas que implican una expresi6n celular de secuencias de acidos nucleicos que codifican tales moleculas. Estos metodos de expresi6n celular son particularmente apropiados para uso medico en donde se requieren los efectos terapeuticos de los polipeptidos durante un perfodo prolongado.

Asf, de acuerdo con un sexto aspecto de la presente invenci6n, se proporciona una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con el quinto aspecto de la invenci6n para usar como un medicamento.

El acido nucleico puede ser preferentemente una secuencia de acidos nucleicos aislados o purificados. La secuencia de acidos nucleicos puede ser preferentemente una secuencia de ADN.

La secuencia de acidos nucleicos tambien puede comprender elementos capaces de controlar y/o mejorar su expresi6n. La molecula de acidos nucleicos puede estar contenida dentro de un vector apropiado para formar un vector recombinante. El vector puede ser, por ejemplo, un plasmido, c6smico o fago. Estos vectores recombinantes son muy utiles en los sistemas de suministro de la invenci6n para transformar celulas con la molecula de acido nucleico.

Los vectores recombinantes tambien pueden incluir otros elementos funcionales. Por ejemplo, vectores recombinantes se pueden disenar de modo que el vector se replique de forma aut6noma en la celula. En este caso, los elementos que inducen la replicaci6n de acidos nucleicos se pueden requerir en el vector recombinante. De modo alternativo, el vector recombinante se puede disenar de modo tal que el vector y la molecula de acido nucleico recombinante se integre en el genoma de una celula. En este caso, se desean secuencias de acidos nucleicos que favorecen la integraci6n dirigida (por ejemplo, por recombinaci6n hom6loga). Los vectores recombinantes tambien pueden tener ADN que codifica genes que se pueden usar como marcadores seleccionables en el proceso de clonaci6n.

El vector recombinante tambien puede comprender un promotor o regulador para controlar la expresi6n del gen segun se requiera.

La molecula de acidos nucleicos puede ser (pero no necesariamente) una que se incorpora en el ADN de celulas del sujeto en tratamiento. Las celulas no diferenciadas pueden ser establemente transformadas, lo que lleva a la producci6n de celulas hija geneticamente modificadas (en cuyo caso, se puede requerir una regulaci6n de la expresi6n en el sujeto, por ejemplo, con factores de trascripci6n o activadores de genes especfficos). De modo alternativo, el sistema de suministro se puede disenar para favorecer la transformaci6n inestable o transitoria de celulas diferenciadas en el sujeto en tratamiento. Cuando este es el caso, la regulaci6n de la expresi6n puede ser menos importante porque la expresi6n de la molecula de ADN se detendra cuando las celulas transformadas mueren o detienen la expresi6n de la protefna (idealmente, cuando se ha logrado el efecto terapeutico requerido).

El sistema de suministro puede proporcionar la molecula de acido nucleico al sujeto sin ser incorporada en un vector. Por ejemplo, la molecula de acido nucleico se puede incorporar dentro de un liposoma o partfcula de virus. De modo alternativo, se puede insertar una molecula de acido nucleico "desnuda" en celulas de un sujeto por medios apropiados, por ejemplo, captaci6n endocftica directa.

La molecula de acido nucleico se puede transferir a las celulas de un sujeto por tratar por transfecci6n, infecci6n, microinyecci6n, fusi6n celular, fusi6n de protoplastos o bombardeo balfstico. Por ejemplo, la transferencia puede ser por transfecci6n balfstica con partfculas de oro revestidas, liposomas que contienen la molecula de acido nucleico, vectores virales (por ejemplo, adenovirus) y medios de suministro de captaci6n directa de acido nucleico (por ejemplo, endocitosis) por aplicaci6n de la molecula de acido nucleico directamente.

Se apreciara que los polipeptidos y acidos nucleicos de acuerdo con la presente invenci6n se puedan usar en una monoterapia (es decir, uso de polipeptidos, agentes, acidos nucleicos o derivados de acuerdo con la invenci6n solos para prevenir y/o tratar una infecci6n viral). De modo alternativo, se pueden usar polipeptidos y acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n como un coadyuvante o en combinaci6n con terapias conocidas.

Los polipeptidos y acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n se pueden combinar en composiciones que tienen una cantidad de diferentes formas, en particular, segun la manera en la que se ha de usar la composici6n. Asf, por ejemplo, la composici6n puede estar en la forma de un polvo, comprimido, capsula, lfquido, unguento, crema, gel, hidrogel, aerosol, spray, micela, parche transdemico, liposoma o cualquier otra forma apropiada que se puede administrar a una persona o animal. Se apreciara que el vehfculo de la composici6n de la invenci6n sea uno que sea bien tolerado por el sujeto al que se administra, y preferentemente se adapta para permitir el suministro de los polipeptidos o acidos nucleicos al tejido objeto.

Las composiciones que comprenden polipeptidos o acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n se pueden usar en una cantidad de formas. Por ejemplo, se puede requerir la administraci6n oral, en cuyo caso el compuesto puede estar contenido dentro de una composici6n que, por ejemplo, se puede ingerir por vfa oral en forma de un comprimido, capsula o lfquido. De modo alternativo, la composici6n se puede administrar por inyecci6n en el torrente sangufneo. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusi6n) o subcutaneas (bolo o infusi6n). Los compuestos se pueden administrar por inhalaci6n (por ejemplo, por vfa intranasal).

Las composiciones se pueden formular para uso t6pico. Por ejemplo, los unguentos se pueden aplicar a la piel, areas en y alrededor de la boca o los genitales para tratar infecciones virales especfficas. La aplicaci6n t6pica en la piel es particularmente util para tratar infecciones virales de la piel o como medio de suministro transdermico a otros tejidos. La administraci6n intravaginal es efectiva para tratar enfermedades de transmisi6n sexual (incluyendo sida).

Los polipeptidos o acidos nucleicos tambien se pueden incorporar dentro de un dispositivo de liberaci6n lenta o retardada. Estos dispositivos pueden insertarse, por ejemplo, sobre o debajo de la piel y el compuesto se puede liberar durante semanas o incluso durante meses. Estos dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se requiera un tratamiento prolongado con un polipeptido, agente, acido nucleico o derivado de acuerdo con la invenci6n y que normalmente requiere una administraci6n frecuente (por ejemplo, al menos inyecci6n diaria).

Se apreciara que la cantidad de un polipeptido o acido nucleico que se requiere se determine por su actividad biol6gica y su biodisponibilidad que, a su vez, depende del modo de administraci6n, las propiedades fisicoqufmicas del polipeptido o acido nucleico empleado y si el polipeptido o acido nucleico se esta usando como una monoterapia

o en una terapia combinada. La frecuencia de administraci6n tambien sera influida por los factores antes mencionados y, en particular, la vida media del polipeptido o acido nucleico dentro del sujeto en tratamiento.

Las dosis 6ptimas para administrar pueden ser determinadas por los expertos en el arte y variaran con el polipeptido

o acido nucleico particular en uso, la potencia de la preparaci6n, el modo de administraci6n y el avance de la condici6n patol6gica. Los factores adicionales que dependen del sujeto particular en tratamiento daran como resultado una necesidad de ajuste de las dosis, incluyendo la edad del sujeto, el peso, el genero, la dieta y el tiempo de administraci6n.

Se apreciara que un experto en la tecnica sea capaz de calcular las dosis requeridas y las concentraciones 6ptimas de los peptidos en un tejido objeto, en base a la farmacocinetica de los peptidos y, en particular, los valores de lC50 dados en los Ejemplos.

En general, se puede usar una dosis diaria de entre 0,01 Ig/kg de peso corporal y 0,5 g/kg de peso corporal de polipeptido o acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n para la prevenci6n y/o el tratamiento de una infecci6n viral, segun lo cual se usa un polipeptido o acido nucleico especffico. Con mayor preferencia, la dosis diaria esta entre 0,01 mg/kg de peso corporal y 200 mg/kg de peso corporal y, con maxima preferencia, de entre aproximadamente 1 mg/kg y 100 mg/kg.

Los procedimientos conocidos, tales como los empleados de forma convencional por la industria farmaceutica (por ejemplo, experimentaci6n in vivo, ensayos clfnicos, etc.), se pueden usar para establecer formulaciones especfficas de polipeptidos o acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n y regfmenes terapeuticos precisos (como dosis diarias de los polipeptidos o acidos nucleicos y la frecuencia de administraci6n).

Las dosis diarias se pueden suministrar como una administraci6n unica (por ejemplo, una inyecci6n diaria unica). De modo alternativo, el polipeptido, el agente, el acido nucleico o el derivado usados pueden requerir la administraci6n de dos o mas veces durante un dfa. Como ejemplo, se pueden administrar polipeptidos o acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n como dos dosis diarias (o mas segun la gravedad de la enfermedad) de entre 25 mg y 7000 mg (es decir, asumiendo un peso corporal de 70 kg). Un paciente que recibe tratamiento puede tomar una primera dosis despues de despertar y luego una segunda dosis por la tarde (dado el caso de un regimen de doble dosis) o a intervalos de 3 6 4 horas. De modo alternativo, se puede usar un dispositivo de liberaci6n lenta para proporcionar dosis 6ptimas a un paciente sin necesidad de administrar dosis repetidas.

Esta invenci6n proporciona una composici6n farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de un polipeptido o acido nucleico de acuerdo con la invenci6n y opcionalmente un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En una forma de realizaci6n, la cantidad del polipeptido o acido nucleico es una cantidad de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 800 mg. En otra forma de realizaci6n, la cantidad del polipeptido o acido nucleico es una cantidad de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg. En otra forma de realizaci6n, la cantidad del polipeptido o acido nucleico es una cantidad de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 250 mg. En otra forma de realizaci6n, la cantidad del polipeptido o acido nucleico es una cantidad de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 60 mg. En otra forma de realizaci6n, la cantidad del polipeptido o acido nucleico es una cantidad de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg.

Esta invenci6n proporciona un proceso para preparar una composici6n farmaceutica que comprende la combinaci6n de una cantidad terapeuticamente efectiva de un polipeptido o acido nucleico de acuerdo con la invenci6n y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Una "cantidad terapeuticamente efectiva" es cualquier cantidad de un polipeptido o acido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n que, cuando se administra a un sujeto, proporciona prevenci6n y/o tratamiento de una infecci6n viral. Un "sujeto" es un vertebrado, mamffero, animal domestico o ser humano.

Un "vehfculo farmaceuticamente aceptable" tal como se menciona en la presente es cualquier vehfculo fisiol6gico conocido por los expertos en la tecnica de utilidad para formular composiciones farmaceuticas.

En una forma de realizaci6n preferida, el vehfculo farmaceutico es un lfquido y la composici6n farmaceutica esta en la forma de una soluci6n. En otra forma de realizaci6n, el vehfculo farmaceuticamente aceptable es un s6lido y la composici6n esta en la forma de un polvo o comprimido. En otra forma de realizaci6n, el vehfculo farmaceutico es un gel y la composici6n esta en la forma de una crema o similares.

Un vehfculo s6lido puede incluir una o varias sustancias que tambien pueden actuar como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensi6n, rellenos, deslizantes, auxiliares de compresi6n, aglutinantes o agentes disgregantes de comprimidos; tambien puede ser un material encapsulante. En polvos, el vehfculo es un s6lido finamente dividido que esta mezclado con el polipeptido activo, agente, acido nucleico o derivado finamente dividido. En comprimidos, el polipeptido activo, agente, acido nucleico o derivado se mezcla con un vehfculo que tiene las propiedades necesarias de compresi6n en proporciones apropiadas y que esta compactado en la forma y el tamano deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferentemente hasta el 99% del polipeptido activo o acido nucleico. Los vehfculos s6lidos apropiados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azucares, lactosa, dextrina, almid6n, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusi6n y resinas de intercambio i6nico.

Los vehfculos lfquidos se usan en la preparaci6n de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El polipeptido activo o acido nucleico se puede disolver o suspender en un vehfculo lfquido farmaceuticamente aceptable tales como agua, un disolvente organico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmaceuticamente aceptables. El vehfculo lfquido puede contener otros aditivos farmaceuticos apropiados tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, endulzantes, agentes saborizantes, agentes de suspensi6n, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmorreguladores. Los ejemplos apropiados de vehfculos lfquidos para administraci6n oral y parenteral incluyen agua (que contienen parcialmente aditivos como antes, por ejemplo, derivados celul6sicos, con preferencia, soluci6n de carboximetilcelulosa s6dica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohfdricos y alcoholes polihfdricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionada y aceite de arachfs). Para administraci6n parenteral, el vehfculo tambien puede ser un ester oleoso como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehfculos lfquidos esteriles son de utilidad en composiciones de forma lfquida esteril para administraci6n parenteral. El vehfculo lfquido para composiciones presurizadas puede ser hidrocarburo halogenado u otro propelente farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones farmaceuticas lfquidas que son soluciones o suspensiones esteriles se pueden utilizar, por ejemplo, por inyecci6n intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutanea, intracerebral o intracerebroventricular. El polipeptido o acido nucleico se puede preparar como una composici6n s6lida esteril que se puede disolver o suspender al momento de la administraci6n, usando agua esteril, soluci6n fisiol6gica u otro medio inyectable esteril. Los vehfculos pretenden incluir aglutinantes, agentes de suspensi6n, lubricantes, saborizantes, endulzantes, conservantes, tinturas y revestimientos necesarios e inertes.

Los polipeptidos o acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n se pueden administrar por vfa oral en forma de una soluci6n o suspensi6n esteril que contiene otros solutos o agentes de suspensi6n (por ejemplo, suficiente soluci6n fisiol6gica o glucosa para isotonizar la soluci6n), sales biliares, acacia, gelatina, monooleato de sorbitano, polisorbato 80 (esteres de oleato de sorbitol y sus anhfdridos copolimerizados con 6xido de etileno) y similares.

Los polipeptidos o acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n tambien se pueden administrar de forma oral ya sea en forma de composici6n lfquida o s6lida. Las composiciones apropiadas para administraci6n oral incluyen formas s6lidas, tales como pfldoras, capsulas, granulos, comprimidos y polvos y formas lfquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas de utilidad para la administraci6n parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones esteriles.

La invenci6n se describira tambien, s6lo a modo de ejemplo, con referencia a los siguientes ejemplos y figuras, en los que:

Figura 1 muestra el efecto de apoE141-149dp y apoE263-286 sobre la infectividad de HSV1 (los puntos se derivan del promedio de hasta cuatro valores) tal como se describe en elEjemplo 1;

Figura 2 muestra el efecto de apoE141-149dp o apoE263-286 sobre la infectividad de HSV2 (los puntos se derivan del promedio de hasta cuatro valores) tal como se describe en el Ejemplo 1;

Figura 3 ilustra la inhibici6n de la producci6n de HlV-1 p24, medida por ELlSA, por apoE141-149r y apoE263-286 en celulas U937 agudamente infectadas (los valores son el promedio de tres experimentos) tal como se describe en el Ejemplo l (ApoE141-149dp era significativamente activo contra HlV (ANOVA, p<0,001), mientras que la actividad de apoE263-286 contra HlV no alcanz6 una significancia (ANOVA; 0,06 < p < 0,62));

Figura 4 ilustra el efecto de 4 peptidos (GlN1, 1p, 2 y 3) sobre la inactividad de HSV1 tal como se describe en el Ejemplo 2;

Figura 5 ilustra el efecto de 4 peptidos (GlN 4-7) sobre la infectividad de HSV1 tal como se describe en el Ejemplo 2;

Figura 6 ilustra el efecto de 4 peptidos (GlN 8-11) sobre la infectividad de HSV1 tal como se describe en el Ejemplo 2;

Figura 7 compara e ilustra el efecto de peptidos GlN 7, GlN 32, GlN 34 y GlN 1p sobre la infectividad de HSV1 tal como se describe en el Ejemplo 2;

Figura 8 ilustra la acci6n anti-HlV del peptido GlN7 contra aislado de HlV SF162, cultivado en celulas de glioma NP-2 que sobreexpresa correceptores de CCR5 tal como se describe en el Ejemplo 4;

Figura 9 muestra los datos tfpicos de espectrometrfa en masa durante GlN7 e ilustra que el peptido tenfa una pureza de >95%;

Figura 10 muestra datos de HPLC tfpicos para GlN7 e ilustra que el peptido tenfa una pureza de >95%.

Ejemplo 1

Se realizaron experimentos con ApoE141-149 para establecer si el peptido tenfa o no una eficacia como agente antiviral.

1.1 HSV1

La Figura 1 y la tabla 1 muestran resultados tfpicos para el ensayo de la actividad anti-HSV1. El ensayo implicaba el tratamiento de celulas Vero confluentes en placas de 24 cavidades con medio que contenfa virus y diversas cantidades de peptido durante una hora, seguido de eliminaci6n de su in6culo y adici6n de medio de recubrimiento viscoso, que contenfa 0,2% de carboximetilcelulosa de alta viscosidad. El medio de recubrimiento s6lo permite la infecci6n de aquellas celulas inmediatamente adyacentes a una celula infectada. Despues de 2 dfas de incubaci6n y luego fijaci6n y tinci6n, son visibles pequenos parches de celulas infectadas (o 'placas'), que son contados. Cada uno de ellos corresponde a la infecci6n de una celula individual durante una hora de inoculaci6n. ApoE141-149dp produjo una reducci6n del 40% en la cantidad de placas a una concentraci6n de aproximadamente 20 IM. Observar que el peptido s6lo estaba presente en el sistema experimental durante 1 hora.

Tabla 1: Formaci6n de placasde HSV1 en celulas Vero despues de la inoculaci6n con virus con apoE141-149dp o apoE263-286. Los valores para cavidades no tratadas estan subrayados.

1

2 ApoE 141-149dp 3 4 Promedio ± sd 1 2 ApoE 263-286 3 4 Promedio ± sd

[IM]

0

96 102 123 107 ± 14,2

5

129 106 103 100 110 ± 13,2 113 119 122 126 120 ± 5,5

10

73 87 76 89 81 ± 7,9 116 124 102 114 ± 11,1

20

68 67 63 63 65 ± 2,6 148 112 133 114 127 ± 17,0

30

72 71 56 66 ± 9,0 134 109 114 125 121 ± 11,2

40

64 65 53 68 63 ± 6,6 120 113 125 144 126 ± 11,2

10 1.2 HSV2

La Figura 2 y la tabla 2 muestran resultados tfpicos para el ensayo de la actividad anti-HSV2. El ensayo se llev6 a cabo como para el ensayo de anti-HSV1, excepto en que se usaron celulas Hep-2 mas que celulas Vero. ApoE141149dp produjo una reducci6n del 50% en la cantidad de placas en una concentraci6n de aproximadamente 20 IM. Nuevamente, observar que el peptido s6lo estaba presente en el sistema experimental durante 1 hora.

15 Tabla 2. Formaci6n de placas HSV2 en celulas HEp-2 despues de la inoculaci6n con virus que contenfan apoE141149dp o apoE263-286. Los valores para cavidades no tratadas estan subrayados.

1

2 ApoE 141-149dp 3 4 Promedio ± sd 1 2 ApoE 263-286 3 4 Promedio ± sd

[IM]

0

15 6 137 162 15 2 152 ± 10,7

5

160 134 140 130 141 ± 13,3 135 160 161 152 152 ± 12,0

10

125 113 131 132 125 ± 8,7 157 121 151 134 141 ± 16,1

20

82 72 73 81 77 ± 5,2 118 150 182 134 146 ± 27,3

30

76 77 71 72 74 ± 2,9 118 117 103 159 124 ± 24,2

40

51 59 69 49 57 ± 9,1 132 144 125 124 131 ± 24,2

1.3. HIV

La Figura 3 y la tabla 3 muestran tfpicos resultados para el ensayo de la actividad anti-HlV. El ensayo se llev6 a cabo por incubaci6n de celulas U937 infectadas con HlV en presencia de diversos niveles de peptido durante 7 dfas,

20 seguido de ensayo de niveles de protefna HlV p24 en las celulas, usando una tecnica de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELlSA). ApoE141-149dp produjo una reducci6n del 95% en infectividad a 20 IM. ApoE263-286 produjo una reducci6n del 20% en infectividad a 20 IM que no logr6 una significancia estadfstica.

El efecto sobre HlV aparece en menores concentraciones de peptido, a pesar de que esto se puede deber al peptido que esta en contacto con celulas durante 7 dfas, en oposici6n a s6lo 1 hora en ensayos de reducci6n de placa con

25 herpes virus.

35 Tabla 3: lnhibici6n de la producci6n de HlV-1 p24, medida por ELlSA, por apoE141-149dp y apoE263-286 en celulas U937 agudamente infectadas.

Ej. 1

% de reducci6n en la producci6n de HlV p24 ApoE 141-149dp ApoE 263-286 Ej. 2 Ej. 3 Promedio ± sd Ej. 1 Ej. 2 Ej. 3 Promedio ± sd

[IM]

0

0

0

0

0

0

0

0

0

10

91,66 70,31 89,85 83,94 ± 11,84 31,75 8,50 29,38 23,21 ± 12,79

20

96,87 95,08 93,10 95,02 ± 1,89 7,69 29,71 30,91 22,77 ± 13,07

30

95,94 88,63 87.77 90,78 ± 4,49 37,94 27,83 41,78 35,85 ± 7,21

40

96,80 95,47 95,33 95,87 ± 0,81 23,50 30,08 48,04 38,87 ± 12,70

50

95,73 93,25 95,38 94,79 ± 1,34 33,36 41,45 45,66 40,16 ± 6,25

Los resultados presentes en 1.1 -1.3 ilustran que ApoE141-149dp fue mas eficaz que ApoE263-286.

A la luz de estos resultados, los inventores procedieron a ensayar otros peptidos generados de apolipoprotefnas para investigar si estos peptidos tenfan o no una actividad antiviral (ver el Ejemplo 2).

Ejemplo 2

Dados los conocimientos obtenidos por los inventores segun el trabajo informado en el Ejemplo 1, se realizaron experimentos para evaluar los efectos antivirales de una gran cantidad de peptidos derivados de apolipoprotefnas. Sorprendentemente, los inventores hallaron que s6lo una menor cantidad de los peptidos ensayados tenfa efectos antivirales (ver 2.2). Estos peptidos representan peptidos de acuerdo con la invenci6n.

2.1 Materiales y metodos 2.1.1 Cultivo celular

Se mantuvieron celulas de rin6n de mono verde africano (Vero) en medio esencial mfnimo Eagle con sal de Earle (EMEM) y suplementado con 10% de suero fetal de ternero (inactivado con calor), 4 mM de L-glutamina y 1% (v/v) de aminoacidos no esenciales, mas penicilina y estreptomicina (100 Ul/mg y 100 mg/ml, respectivamente) (medio de mantenimiento mencionado como 10% de EMEM). Las celulas se incubaron a 37 °C en una atm6sfera humidificada de aire con 5% de CO2.

Al cosechar, las monocapas se lavaron en soluci6n fisiol6gica tamponada con fosfato (PBS) y se desprendieron por incubaci6n con tripsina en PBS durante 30 min, antes de inactivar la tripsina por adici6n de un volumen igual de 10% de EMEM y centrifugar a 500 g (5 min, 4 °C). Los pellets celulares se resuspendieron en 10% de EMEM, antes del recuento celular y la siembra de placas de 24 cavidades. Para ensayos antivirales, se us6 medio con contenido de s6lo 0,5% de FCS (mencionado como 0,5% de EMEM).

2.1.2 Virus

Se prepararon tres pasajes separados de virus HSV1 infectando celulas Vero y preparando suspensiones semipuras de virus de sobrenadante de cultivo tisular y lisados celulares, antes de congelar alfcuotas de virus a -85 °C. Se evalu6 la infectividad viral llevando a cabo ensayos de placa en diluciones seriales de alfcuotas descongeladas (expresada en pfu/ml).

2.1.3 Peptidos

Se obtuvieron peptidos en forma liofilizada de un proveedor comercial (AltaBioscience, Universidad de Birmingham o Advanced Biomedical) y se produjeron en escala 5 micromolar. Se protegieron N-terminales por adici6n de un grupo acetilo y los C-terminales se protegieron por adici6n de un grupo amida.

Se confirm6 el peso molecular de peptidos por espectrometrfa de masa por desorci6n laser usando un analizador de masa en tiempo de vuelo Finnigan LASERMAT 2000 MALDl o un espectr6metro de masa Scientific Analysis Group MALDl-TOF. La purificaci6n por HPLC de peptidos se realiz6 usando una columna de fase inversa Vidac analytical C-4, usando 0,1% de TFA y 0,1% de TFA / 80% de acetonitrilo como disolventes o para algunos peptidos, una columna en fase inversa ACE C18, usando 0,05% de TFA y 60% de acetonitrilo como disolventes. Los datos de

espectrometrfa de masa tfpicos y trazas de cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) (pureza de >95%) para el peptido GlN 7 (SEQ lD No. 3) se muestran en las Figuras 9 y 10.

Se pesaron pequenas cantidades de peptido en tubos Eppendorf esteriles, antes de la adici6n del 0,5% de EMEM suficiente para producir una soluci6n madre de 1,5 mM, que se congel6 a -20 °C en alfcuotas.

2.1.4 Ensayos de reducci6n de plgas.

Se sembraron celulas Vero a 125.000 celulas por cavidad en 10% de EMEM y se incubaron durante la noche, que result6 en monocapas confluentes. Los peptidos se diluyeron en 0,5% de EMEM para dar 2x de concentraci6n deseada final y se dispusieron alfcuotas de 100 Il en placas de 96 cavidades en una disposici6n para usar en placas de 24 cavidades; tambien se prepararon cavidades de control que contenfa 0,5% de EMEM normal. Se descongelaron las reservas virales (p3) y se diluyeron en 0,5% de EMEM de modo que habfa aproximadamente 100 pfu en 100 Il. Cada placa de 24 cavidades se inocul6 por separado. En primer lugar, se anadieron 100 Il de reserva viral al peptido o medio de control dispuesto en una placa de 96 cavidades. Esto se incub6 a 37 °C durante diez minutos antes de la inoculaci6n. El medio de removi6 de cuatro cavidades de una placa de 24 cavidades que contenfan Vero confluente y 200 Il de in6culo anadido a la cavidad apropiada. Una vez tratadas todas las cavidades, se incub6 la placa de 24 cavidades durante otros 60-80 minutos. Finalmente, se removi6 el in6culo que contenfa el peptido y se anadi6 1 ml de 1% de EMEM que contenfa 1% de carboximetilcelulosa a cada cavidad. Las placas se incubaron durante otras 22 horas o, en algunos experimentos, durante 40 horas, antes de eliminar el recubrimiento y anadir 10% de formaldehfdo en PBS. Despues de otra hora mas de incubaci6n, se elimin6 el fijador, las monocapas se lavaron varias veces con agua corriente y se tineron con carbol fucsina solubilizada en agua. Despues de 30 minutos, se removi6 la tintura y las placas se lavaron varias veces con agua corriente antes de secar al aire. Las placas se contaron usando un Olympus lX70 lnverting Microscope y el efecto antiviral se expres6 como un porcentaje del valor de control para cada concentraci6n de peptido. La lC50 se calcul6 a partir de graficos de efecto de inhibici6n contra la concentraci6n de peptido.

2.1.5 Ensayo de toxicidad

Se sembraron celulas Vero en placas de 96 cavidades a 30.000 celulas por cavidad en 10% de EMEM y se incubaron durante la noche, que dio como resultado monocapas confluentes. Los peptidos GlN se diluyeron en 0,5% de EMEM para dar una concentraci6n deseada final y alfcuotas de 100 Il se dispusieron en placas de 96 cavidades separadas que no contenfan celulas, antes de tomar las placas Vero de 96 cavidades, eliminar 10% de EMEM y anadir peptidos con 0,5% de EMEM. Despues de incubar durante 48 horas, se anadieron 25 Il de 1,5 mg/ml de soluci6n MTT (en 0,5% de EMEM) por cavidad y las placas retornaron a la incubadora durante una hora. Finalmente, el medio se elimin6 de las cavidades y los cristales azules de formazano se solubilizaron por adici6n de 100 Il de dimetilsulf6xido (DMSO). Luego se midi6 la absorbancia de soluciones resultantes a 570 nm y el efecto t6xico se expres6 como un porcentaje del valor de control para cada concentraci6n de peptido. De ser posible, la EC50 se calcul6 a partir de graficos del efecto t6xico contra la concentraci6n de peptido. Afortunadamente, no se hall6 evidencia de toxicidad para la lfnea celular ensayada, usando peptido a 40 IM expuesto a celulas durante 2 dfas.

2.2 Resultados

La Tabla 4 resume los datos obtenidos para 16 peptidos identificados como GlN 1, GlN 1p y GlN 2 -15.

Tabla 4

Peptido

SEQ lD No. lC50 aparente (IM) Secuencia Tamano

GlN 1

2 16,5 LRKLRKRLLLRKLRKRLL 18

GlN 1p

2 10 LRKLRKRLLLRKLRKRLL 18

GlN 2

24 >40 LRKRLLLRKLRKRLL 15

GlN 3

31 Sin actividad RLLLRKLRKRLL 12

GlN 4

7 29,5 LRKLRKRLLLRKLRK 15

GlN 5

25 >40 LRKLRKRLLLRK 12

GlN 6

26 >40 ERKERKREEERKERKREE 18

GlN 7

3 <5 WRKWRKRWWWRKWRKRWW 18

GlN 8

8 13 LRKLRKRLRKLRKR 14

Peptido

SEQ lD No. lC50 aparente (IM) Secuencia Tamano

GlN 9

9 15,5 LRKLRKLRKLRKLRKLRK 18

GlN 10

22 39 RLLRLLRLLRLLRLLRLL 18

GlN 11

20 36,5 QSTEELRVRLASHLRKLRKRLL 22

GlN 12

27 >40 LRKLRKRLLR DADDLQKRLA 20

GlN 13

28 >40 RDADDLQKR RDADDLQKR 20

GlN 14

29 >40 GERLRARMEGERLRARME 18

GlN 15

30 >40 RLRARMEEMRLRARMEEM 18

La Figura 4 ilustra que ApoE141-149dp (rotulado como GlN 1) tenfa buena eficacia para reducir la infectividad de HSV1. Un peptido GlN 1p relacionado (GlN 1 con protecci6n N y C terminal) tenfa una eficacia similar.

Tal como se ilustra en la Tabla 4, los inventores ensayaron una cantidad de otros peptidos relacionados (identificados como GlN 2, GlN 3, GlN 4, GlN 5, GlN 6, GlN 10, GlN 11, GlN 12, GlN 13, GlN 14 y GlN 15) y se hall6 5 que no tenfan o que tenfan baja eficacia para reducir la infectividad viral.

Ademas, el inventor hall6, para su sorpresa, que un subgrupo de peptidos ensayados (que son peptidos de acuerdo con la presente invenci6n) eran efectivos como agentes antivirales.

La Figura 5 ilustra que el peptido designado como GlN 7 tenfa eficacia para reducir la infectividad de HSV-1.

La Figura 6 ilustra que los peptidos designados como GlN 8 y GlN 9 tambien tenfan eficacia para reducir la 10 infectividad de HSV-1.

La Tabla 5 ilustra que una cantidad de peptidos relacionados o similares al peptido ApoE141-149dp (identificado como peptidos GlN 17 -31 en la Tabla 5) no tenfan o tenfa poca eficacia para reducir la infectividad viral. Los inventores disenaron racionalmente estas moleculas esperando que pudieran tener una actividad anti-HSV1 y, en base a los datos presentados en la Tabla 4, un experto en la tecnica podrfa esperar que tales peptidos tuvieran una eficacia

15 similar a los reivindicados de acuerdo con la invenci6n. El hecho de que estos peptidos tuvieran poco efecto tornen sorprendente la utilidad de los peptidos reivindicados.

Tabla 5

Peptido

SEQ lD No. lC50 aparente (IM) Secuencia Tamano

GlN 17

33 NA RALVDTLKFVTQAEGAK 17

GlN 18

34 NA PYLDDFQKKWQEEMELYRQKVB 22

GlN 19

35 NA PLGEEMRDRARAHVDALRTHLA 22

GlN 20

36 NA PYSDELRQRLAARLEALKENGG 22

GlN 21

37 NA ARLAEYHAKATEHLSTLSEKAK 22

GlN 22

19 36 DWLKAFYDKVAEKLKEAF 18

GlN 23

38 NA PVLDEFREKLNEELEALKQKMK 22

GlN 24

39 NA VTDYGKDLMEKVKSPELQ 18

GlN 25

40 NA VTDYGKDLMEKVKEWLNS 18

GlN 26

41 NA NFHAMFQPFLEMlHEAQQ 28

GlN 27

42 NA CKNKEKKCCKNKEKKC 18

GlN 28

43 NA LRKEKKRLLLRKEKKRLL 18

GlN 29

21 38,5 HMLDVMQDHFSRASSllDEL 20

Peptido

SEQ lD No. lC50 aparente (IM) Secuencia Tamano

GlN 30

44 NA LQVAERLTRKYNELLKSYQ 19

GlN 31

45 NA KFMETVAEKALQEYRK 16

Ejemplo 3

Otro grupo de experimentos se llev6 a cabo en una cantidad expandida de peptidos para seguir evaluando el efecto de los peptidos de acuerdo con la invenci6n contra HSV-1. La Tabla 6 confirma que los peptidos designados como GlN 1p y GlN 7 tenfan propiedades anti-HSV-1, mientras que los peptidos designados como GlN 32, 34 y 41 tambien tenfan eficacia. La eficacia de estos peptidos indica sorprendentemente que la mayorfa de los peptidos ensayados no tenfan o tenfan poca actividad.

La Figura 7 compara e ilustra el efecto de los peptidos GlN 7, GlN 32, GlN 34 y GlN 1p sobre la infectividad de HSV1.

Tabla 6

C6digo peptidico

SEQ ID No. SEQ ID No. de acido nucleico Secuencia IC50 {IMl

7

SEQ lD No. 3 SEQ lD No. 12 WRKWRKRWWWRKWRKRWW 3,5

34

SEQ lD No. 5 SEQ lD No. 14 WRKWRKRWWLRKLRKRLL 6

32

SEQ lD No. 4 SEQ lD No. 13 WRKWRKRWRKWRKR 10

41

SEQ lD No. 6 SEQ lD No. 15 YRKYRKRYYYRKYRKRYY 16

1p

SEQ lD No. 2 SEQ lD No. 11 LRKLRKRLLLRKLRKRLL 17

actividad baja:

4

SEQ lD No. 7 SEQ lD No. 16 LRKLRKRLLLRKLRK 29,5

22

SEQ lD No. 19 NA DWLKAFYDKVAEKLKEAF 36

11

SEQ lD No. 20 NA QSTEELRVRLASHLRKLRKRLL 36,5

29

SEQ lD No. 21 NA HMLDVMQDHFSRASSllDEL 38,5

10

SEQ lD No. 22 NA RLLRLLRLLRLLRLLRLL 39

44

SEQ lD No. 23 NA LRQLRQRLLLRQLRQRLL 40

2

SEQ lD No. 24 NA LRKRLLLRKLRKRLL >40

5

SEQ lD No. 25 NA LRKLRKRLLLRK >40

6

SEQ lD No.26 NA ERKERKREEERKERKREE >40

actividad baja:

12

SEQ lD No. 27 NA LRKLRKRLLR DADDLQKRLA >40

13

SEQ lD No. 28 NA RDADDLQKR RDADDLQKR >40

14

SEQ lD No. 29 NA GERLRARMEGERLRARME >40

15

SEQ lD No. 30 NA RLRARMEEMRLRARMEEM >40

Sin actividad:

apoE 141-149

SEQ lD No. 1 SEQ lD No. 10 LRKLRKRLL NA

3

SEQ lD No. 31 NA RLLLRKLRKRLL NA

C6digo peptidico

SEQ ID No. SEQ ID No. de acido nucleico Secuencia IC50 {IMl

6

SEQ lD No. 32 NA ERKERKREEERKERKREE NA

17

SEQ lD No. 33 NA RALVDTLKFVTQAEGAK NA

18

SEQ lD No. 34 NA PYLDDFQKKWQEEMELYRQKVE NA

19

SEQ lD No. 35 NA PLGEEMRDRARAHVDALRTHLA NA

20

SEQ lD No. 36 NA PYSDELRQRLAARLEALKENGG NA

21

SEQ lD No. 37 NA ARLAEYHAKATEHLSTLSEKAK NA

23

SEQ lD No. 38 NA PVLDEFREKLNEELEALKQKMK NA

24

SEQ lD No. 39 NA VTDYGKDLMEKVKSPELQ NA

25

SEQ lD No. 40 NA VTDYGKDLMEKVKEWLNS NA

26

SEQ lD No. 41 NA NFHAMFQPFLEMlHEAQQ NA

27

SEQ lD No. 42 NA CKNKEKKCCKNKEKKC NA

28

SEQ lD No. 43 NA LRKEKKRLLLRKEKKRLL NA

30

SEQ lD No. 44 NA LQVAERLTRKYNELLKSYQ NA

31

SEQ lD No. 45 NA KFMETVAEKALQEYRK NA

39

SEQ lD No. 46 NA ARKARKRAAARKARKRAA NA

40

SEQ lD No. 47 NA MRKMRKRMMMRKMRKRMM NA

42

SEQ lD No. 48 NA LRWLRWRLLLRWLRWRLL NA

45

SEQ lD No. 49 NA LWKLWKWLLLWKLWKWLL NA

46

SEQ lD No. 50 NA LYKLYKYLLLYKLYKYLL NA

47

SEQ lD No. 51 NA LQKLQKQLLLQKLQKQLL NA

Ejemplo 4

Se realizaron similares experimentos a los descritos en el Ejemplo 2 para ensayar la eficacia de los peptidos de acuerdo con la invenci6n contra infecci6n por HlV.

La lfnea celular de glioma NP2 que sobreexpresa tanto CD4 como el apropiado correceptor (CCR5 o CXCR4) se

5 mantuvo en DMEM suplementado con 10% de FCS. 2 x 104 celulas se plaquearon por cavidad de una placa de 48 cavidades 24 h antes de la infecci6n y crecimiento a 37 �C. Las celulas luego se lavaron y se incubaron en DMEM/FCS con concentraciones de peptido que iban de 0,1 a 10 micromoles, a 37 �C durante 30 minutos. Luego se anadieron unidades formadoras de 200 focos de reservas de HlV-1 a cada cavidad y las celulas se incubaron a 37

�C durante otras 2 horas. Las celulas luego se lavaron dos veces en PBS y el medio fresco se reemplaz6. Despues

10 de 3 dfas de crecimiento, las celulas se fijaron en metanol frfo:acetona y se tineron in situ para expresi6n de HlV-1 p24 usando anti-p24 monoclonal seguido de un conjugado secundario antirrat6n de beta-galactosidasa. La expresi6n se visualiz6 por tinci6n de X-Gal y se enumeraron los focos infecciosos por microscopio 6ptico.

Se hall6 que los peptidos de acuerdo con la invenci6n tenfan una eficacia similar contra HSV-1 y HlV.

La Figura 8 ilustra la acci6n anti-HlV del peptido GlN 7 contra aislado de HlV SF162, crecido en celulas NP-2 de 15 glioma que sobreexpresan correceptores de CCR5.

Se generaron datos similares para otras cepas de HlV y en otros tipos de celulas huesped. Notablemente, GlN 1p (apoEdp) no tenfa una actividad anti-HlV detectable en una combinaci6n de cepa de HlV y tipo celular contra lo cual se ensay6 este peptido y en las concentraciones usadas aquf (hasta 10 IM). Esto sugerirfa que los peptidos sustituidos W de acuerdo con la presente invenci6n son mas potentes contra HlV que GlN 1p (apoE141-149 dp).

20 Ejemplo 5

Se realizaron otros experimentos para evaluar la eficacia de los peptidos de acuerdo con la presente invenci6n contra HSV1.

5.1 Metodos

Los metodos empleados eran tal como se describi6 en los Ejemplos 1 -4. Los peptidos esperados se prepararon 5 como reservas de 400 IM en soluci6n fisiol6gica tamponada con fosfato (PBS).

5.2 Resultados 5.2.1 Efecto de sustituci6n completa de leucina

Se realizaron experimentos para investigar el efecto de sustituci6n total de residuos L en la repetici6n en tandem de apoE141-149 con un unico aminoacido. La Tabla 7 ilustra que los peptidos de acuerdo con la presente invenci6n tienen

10 eficacia para inhibir el crecimiento de HSV1 (es decir, sustituci6n W, R o K). Los peptidos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n tienen, sorprendentemente, mayor eficacia que la repetici6n en tandam de apoE (GlN 1/MU 10).

Es interesante observar que la sustituci6n con M, Y, F, l, Q, H o N tenfa cierta eficacia (comparable con la repetici6n en tandem de apoE) y como tales otras sustituciones de acuerdo con la invenci6n, pueden comprender estos

15 aminoacidos.

Las sustituciones con E, A, D, S, V, T, G o P dieron como resultado una actividad antiviral suprimida.

A pesar de que los inventores no desean quedar ligados por hip6tesis alguna, observaron que la sustituci6n con aminoacidos con pequenas cadenas laterales tiene a suprimir la actividad antiviral, mientras que los aminoacidos con cadenas laterales mas grandes mantienen los efectos antivirales. Sin embargo, la sustituci6n L con aminoacidos

20 tal como se define por el primer aspecto de la invenci6n confiere una sorprendente actividad antiviral.

Tabla 7

C6digo peptfdico

SEQ lD No. Secuencia lC50 de HSV1 (IM)

MU 1 (GlN 6)

67 ERKERKREEERKERKREE NA

MU 2 (GlN 39)

68 ARKARKRAAARKARKRAA NA

MU 3

69 DRKDRKRDDDRKDRKRDD NA

MU 4 (GlN 7)

3 WRKWRKRWWWRKWRKRWW 3.5

MU 5 (GlN 40)

70 MRKMRKRMMMRKMRKRMM >30

MU 6 (GlN 41)

6 YRKYRKRYYYRKYRKRYY >30

MU 7

71 FRKFRKRFFFRKFRKRFF >30

MU 8

72 lRKlRKRlllRKlRKRll >30

MU 9

73 QRKQRKRQQQRKQRKRQQ >30

MU 10 (GlN 1p)

2. LRKLRKRLLLRKLRKRLL 30

MU 10 (GlN 1)

2. LRKLRKRLLLRKLRKRLL (sin protecci6n N C) 16,5

MU 11

74 NRKNRKRNNNRKNRKRNN 27,5

MU 13

75 SRKSRKRSSSRKSRKRSS NA

MU 14

76 VRKVRKRVVVRKVRKRVV NA

MU 15

77 TRKTRKRTTTRKTRKRTT NA

MU 16

64 RRKRRKRRRRRKRRKRRR 7,5

MU 17

78 GRKGRKRGGGRKGRKRGG NA

MU 18

65 KRKKRKRKKKRKKRKRKK 7,5

MU 19

79 HRKHRKRHHHRKHRKRHH NA

MU 20

80 PRKPRKRPPPRKPRKRPP NA

5.2.2 Ensayo de otros peptidos derivados de apoE

El inventor construy6 una biblioteca expandida de peptidos para evaluar que derivados de peptido apoE pueden tener actividad antiviral.

La Tabla 8 ilustra que una cantidad de peptidos, que se basaban en la SEQ lD No. 2 pero que entran fuera de la

5 definici6n de peptidos de acuerdo con el primer aspecto de la invenci6n, no tenfan o tenfan poca actividad antiviral (por ejemplo, MU 24-46). Es interesante observar que MU 43 y MU 44 corresponden a repeticiones en tandem de los equivalentes murino y bovino a apoE141-149, respectivamente, mientras que MU 46 corresponde a apoE141-149 (SEQ lD No. 1).

Los datos presentados en la Tabla 8 para MU 58 -117 demuestran que cada uno de estos peptidos, que son

10 peptidos de acuerdo con la presente invenci6n, tiene una buena actividad antiviral que es sorprendentemente superior a la de apoE141-149 dp (SEQ lD No. 2).

Tabla 8

C6digo peptfdico

SEQ lD No. Secuencia lC50 de HSV1 (IM)

MU 24

81 LLRKRLKRLLLRKRLKRL 40

MU 38

82 LRRLRRRLLLRRLRRRLL >30

MU 39

83 LKKLKKKLLLKKLKKKLL 30

MU 40

84 LHHLHHHLLLHHLHHHLL NA

MU 41

85 LDDLDDDLLLDDLDDDLL NA

MU 42

86 LEELEEELLLEELEEELL NA

MU 43

87 MRKLRKRLMMRKLRKRLM NA

MU 44

88 LRKLPKRLLLRKLPKRLL >30

MU 45

89 WRKWRKRWW NA

MU 46

1 LRKLRKRLL NA

MU 58

52 WRKWRKRWWRKWRKRWW 4.25

MU 59

53 WRKWRKRWRKWRKRW 9,75

MU 60

54 WRKWRKRWWFRKWRKRWW 4

MU 61

55 WRKWRKRFFWRKWRKRFF 4,75

MU 68

56 WRKCRKRCWWRKCRKRCW 4,25

MU 83

66 WRKWRKRWWRWRKWRKRW WR 2,5

MU 111

57 LRKLRKRLLWRKWRKRWW 12,5

MU 112

58 LRKLRKRLLLRKLRKRWW >20

MU 113

59 LRKLRKRLLWRKWRKRLL 18,5

MU 114

60 WRKWRKRLLLRKLRKRLL 16

MU 115

61 WRKLRKRLLLRKLRKRLL 17,5

MU 116

62 WRKWRKFFFRKWRKRWW 3,3

MU 117

63 WRKWRKRWWFRKFRKRFF 3,3

E�EMPL� 6

Otros experimentos se realizaron para evaluar la eficacia de los peptidos de acuerdo con la presente invenci6n 15 contra HSV2.

6.1 Metodos

Se realizaron ensayos de placa. La metodologfa era la descrita en los Ejemplos previos para los ensayos de placa de HSV1 (incluyendo el uso de celulas Vero) excepto en que se usaron en lugar de ellos aislados clfnicos de HSV2 (proporcionados por Prof. Anthony Hart de l Universidad de Liverpool).

6.2 Resultados

Tambien se ensay6 contra HSV2 una cantidad de peptidos que tenfan eficacia contra HSV1. La Tabla 9 ilustra que los peptidos de acuerdo con la presente invenci6n eran efectivos tanto contra HSV1 como contra HSV2. Esto ilustra que los peptidos tendran un amplio espectro de actividad contra virus.

Tabla 9

C6digo peptfdico

SEQ lD No. Secuencia lC50 de HSV2 (IM)

GlN 34

5 WRKWRKRWWLRKLRKRLL < 3,3

GlN 32

4 WRKWRKRWRKWRKR 6,25

MU 4 (GlN 7)

3 WRKWRKRWWWRKWRKRWW < 3,3

MU 59

53 WRKWRKRWRKWRKRW 10

MU 83

66 WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR < 3,3

MU 111

57 LRKLRKRLLWRKWRKRWW 6,5

MU 112

58 LRKLRKRLLLRKLRKRWW 16

MU 113

59 LRKLRKRLLWRKWRKRLL 11,75

MU 114

60 WRKWRKRLLLRKLRKRLL 9

Ejemplo 7

Se realizaron otros experimentos para ensayar la eficacia de peptidos de acuerdo con la presente invenci6n contra virus de inmunodeficiencia humana (HlV). El efecto de un peptido de acuerdo con la presente invenci6n se ensay6 contra una cepa diferente de HlV a la ensayada en el Ejemplo 4.

7.1 Metodos

Se diluyeron peptidos (preparados tal como se describi6 previamente) en alfcuotas de 50 Il y se mezclaron con celulas T (C8166) a 40.000 celulas por cavidad. A continuaci6n, se anadi6 HlV-1 111B en una multiplicidad de infecci6n (MOl) de 0,01 y la mezcla se incub6 durante 5 dfas a 37 °C. Se evalu6 visualmente la formaci6n de sincicios usando un microscopio de inversi6n y niveles de gp120 virales en sobrenadantes evaluados por un gp120 ELlSA usando GNA para captura de antfgenos. Se lavaron placas de 96 cavidades recubiertas con 50 ul de GNA (Galantus nivalis), luego se trataron con 100 Il de RPMl (10% de suero fetal de ternero) y se dejaron durante una hora. Despues de otro lavado, se anadieron 25 Il de sobrenadantes de muestra de ensayo a las cavidades, junto con diluciones de muestras de control infectadas. Despues de lisis por 3 h de tratamiento con 0,5% de Empigen (detergente usado para lisis de virus) a todas las cavidades y lavado, se anadieron 50 Il de suero humano anti-HlV y las placas se incubaron durante la noche. Despues de seguir lavando, se anadieron 50 Il de una diluci6n 1000x de conjugado de lg peroxidasa anti-humana y las placas se incubaron a 37 °C durante 90 min. Despues de un lavado final, se anadieron 50 Il de sustrato de peroxidasa a cada cavidad y las placas se incubaron durante 10-30 min. La reacci6n se detuvo con 25 Il de H2SO4 2 M y se midi6 A450.

7.2 Resultados

Se realizaron otros ensayos para sustentar los datos presentados en el Ejemplo 4 que ilustran que los peptidos de acuerdo con la presente invenci6n eran efectivos contra HlV, asf como HSV1 y HSV2.

GlN 32 (SEQ lD No. 4) tenfa una lC50 de 7,5 IM para inhibir el crecimiento de HlV-1. La eficacia de elo era similar en HSV1, HSV2 y HlV. Esto confirma que los peptidos de acuerdo con la presente invenci6n tienen amplios efectos antivirales.

Claims (15)

1. REIVINDICACIoNES

   1. Un polipeptido de SEQ lD No. 2 o una de sus truncaciones, en donde uno o varios de los residuos de leucina

   (L) de SEQ lD No. 2 estan reemplazados por tript6fano (W), arginina (R) o lisina (K); en donde el polipeptido o una de sus truncaciones comprende 14-18 aminoacidos; y en donde el polipeptido tiene actividad antiviral.

2. 2.

   El polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en donde el aminoacido usado para reemplazar la leucina es tript6fano (W).

3. 3.

   El polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en donde se realizan al menos dos sustituciones W, R o K.

4. 4.

   El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde, ademas de al menos un residuo de leucina (L), al menos otro aminoacido esta reemplazado por asparagina (N), tirosina (Y), cistefna (C), metionina (M), fenilalanina (F), isoleucina (l), glutamina (G), histidina (H) o esta suprimido.

5. 5.

   El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la secuencia de aminoacidos: WRKWRKRWWWRKWRKRWW (SEQ lD No. 3); WRKWRKRWRKWRKR(SEQ lD No. 4); WRKWRKRWWLRKLRKRLL (SEQ lD No. 5); YRKYRKRYYYRKYRKRYY (SEQ lD No. 6); WRKWRKRWWRKWRKRWW (SEQ lD No. 52); WRKWRKRWRKWRKRW (SEQ lD No. 53); WRKWRKRWWFRKWRKRWW (SEQ lD No. 54); WRKWRKRWFFRKWRKRFF (SEQ lD No. 55); WRKCRKRCWWRKCRKRCW (SEQ lD No. 56); LRKLRKRLLWRKWRKRWW (SEQ lD No. 57); LRKLRKRLLLRKLRKRWW (SEQ lD No. 58); LRKLRKRLLWRKWRKRLL (SEQ lD No. 59); WRKWRKRLLLRKLRKRLL (SEQ lD No. 60); WRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEQ lD No. 61); WRKWRKFFFRKWRKRWW (SEQ lD No. 62); WRKWRKRWWFRKFRKRFF (SEQ lD No. 63); RRKRRKRRRRRKRRKRRR (SEQ lD No. 64); o KRKKRKRKKKRKKRKRKK (SEQ lD No. 65).

6. 6.

   El polipeptido de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en donde se anade un aminoacido entre los aminoacidos 9 y 10 de la SEQ lD No 2.

7. 7.

   El polipeptido de acuerdo con la reivindicaci6n 6 que comprende WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR (SEQ lD No. 66).

8. 8.

   Un polipeptido que comprende YRKYRKRYYYRKYRKRYY (SEQ lD No. 6).

9. 9.

   Un polipeptido que comprende LRKLRKRLLLRKLRK (SEQ lD No. 7).

10. 10.

    Un polipeptido que comprende LRKLRKRLRKLRKR (SEQ lD No. 8).

11. 11.

    Un polipeptido que comprende LRKLRKLRKLRKLRKLRK (SEQ lD No. 9).

12. 12.

    Un polipeptido de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente para usar como un medicamento.

13. 13.

    El uso de un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la fabricaci6n de un medicamento para tratar infecciones virales.

14. 14.

    Una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

15. 15.

    Una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la reivindicaci6n 14 para usar como un medicamento.