ES2388669T3 - Aplicación como medicamentos de los dreivados de colest-4-en-3-ona, composiciones farmacéuticas que los contienen y nuevos derivados - Google Patents

Abstract

Un compuesto que responde a la fórmula I **Fórmula**en la cual X representa un grupo >= N-OH, R representa un grupo elegido entre A representa un átomo de hidrógeno o junto con B un enlace carbono-carbono, B representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o junto con A un enlace carbono-carbono, C representa un átomo de hidrógeno o junto con D un enlace carbono-carbono, D representa un átomo de hidrógeno o junto con C un enlace carbono-carbono, E representa un átomo de hidrógeno o junto con F un enlace carbono-carbono, F representa un átomo de hidrógeno o junto con E un enlace carbono-carbono, o una de sus sales de adición con los ácidos farmacéuticamente aceptables, para su utilización en un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, es decir, como medicamento.

Description

Aplicaci6n como medicamentos de los derivados de colest-4-en-3-ona, composiciones farmaceuticas que los contienen y nuevos derivados.

La presente invenci6n se refiere a la aplicaci6n como medicamentos de los derivados de colest-4-en-3-ona, en particular, como neuroprotectores por ejemplo en las patologias y los traumatismos vinculados a la degeneraci6n o a la muerte de las motoneuronas, a las composiciones farmaceuticas que les contienen, a nuevos derivados y su procedimiento de preparaci6n.

Los procesos neurodegenerativos se caracterizan por la disfunci6n y la muerte de las neuronas que implica la perdida de las funciones neurol6gicas mediadas por el cerebro (sistema nervioso central, SNC), la medula espinal y el sistema nervioso periferico (SNP). Pueden resultar, entre otras cosas, de situaciones patol6gicas agrupadas bajo el termino de enfermedades o afecciones neurodegenerativos, de traumatismo, o de exposici6n a toxinas.

Las patologias mas importantes que se caracterizan por un proceso degenerativo son:

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enfermedades cr6nicas neurodegenerativas, hereditarias o esporadicas, en particular, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotr6fica, las amiotrofias espinales, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la esclerosis multiple, la adrenoleucodistrofia, la epilepsia, las demencias, la esquizofrenia y los sindromes neurol6gicos asociados al SIDA;

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las lesiones neuronales vinculadas al envejecimiento;

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las neuropatias perifericas hereditarias o lesionales, tales como las enfermedades de Fabry, de Charcot-Marie-Tooth, de Krabbe, las leucodistrofias, las neuropatias diabeticas y aquellas inducidas por los tratamientos anti-cancerigenos;

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los traumatismos del cerebro, de los nervios perifericos o de la medula espinal;

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las isquemias del cerebro o de la medula espinal a raiz de un accidente cerebro-vascular, o inducidas por una falta de riego sanguineo;

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las degeneraciones, hereditarias, lesionales o vinculadas al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la visi6n, tal como las degeneraciones maculares, las retinitas pigmentarias, o las degeneraciones del nervio 6ptico inducidas por los glaucomas;

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las degeneraciones, hereditarias, traumaticas o vinculadas al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la audici6n que implica una disminuci6n o una perdida de la audici6n.

Una parte de las vias de senalizaci6n afectadas en estas patologias son comunes a un gran numero de enfermedades neurodegenerativas. La enfermedad de Alzheimer es la demencia mas frecuente. Evidencia una atrofia del cerebro, una perdida neuronal predominante en el asta de Ammon y afecta tambien a las neuronas colinergicas. Otras patologias, tal como las atrofias lobares (enfermedad de Pick, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob), la demencia con cuerpo de Lewy, las demencias vasculares, la enfermedad de Parkinson se asocian a una muerte neuronal importante en el origen de los sintomas de estas demencias.

No existe actualmente un tratamiento eficaz para frenar las degeneraciones neuronales. Una aproximaci6n terapeutica para proteger las neuronas de la muerte es la aportaci6n de proteinas neurotr6ficas.

Estas proteinas, tales como BDNF (brain-derived neurotrophic factor), CNTF (ciliary neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor), GDNF (glia-derived neurotrophic factor) se sintetizan durante el desarrollo embrionario o despues de una lesi6n en el adulto. Estos factores de crecimiento favorecen la supervivencia, la maduraci6n y la diferenciaci6n de las celulas neuronales. Ademas, inhiben los mecanismos apopt6ticos, activan multiples vias de supervivencia y protegen un gran numero de poblaciones neuronales. Su utilizaci6n se propone en la mayoria de las degeneraciones neuronales.

Compuestos que activarian la expresi6n de factores neurotr6ficos o que imitaria la acci6n de estos factores tienen un potencial terapeutico para el tratamiento de los sindromes neurodegenerativos.

En particular, la aportaci6n de moleculas neurotr6ficas para el tratamiento de las degeneraciones neuronales contempla tres objetivos:

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compensar una carencia potencial en factores neurotr6ficos vinculada a un defecto de aportaci6n por las dianas perifericas o centrales de las neuronas y/o un desorden del transporte retr6grado de estos factores;

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intervenir de manera no especifica sobre las vias bioquimicas implicadas en la cascada degenerativa;

-

favorecer los fen6menos compensadores naturales de crecimiento dendritico y de arborizaci6n de las

terminaciones nerviosas.

Estos compuestos presentarian por lo tanto un efecto beneficioso en un gran numero de patologias en particular en las patologias que se refieren a los sistemas nerviosos perifericos y centrales.

Por otra parte, en el marco indicado mas arriba, las motoneuronas son neuronas, en particular, presentes en la medula espinal y en el tronco cerebral. Su degeneraci6n o su muerte puede conducir a una debilidad progresiva de los musculos de los miembros, luego a una atrofia y eventualmente a una espasticidad (es decir, una contracci6n permanente) del musculo.

Las patologias mas importantes que resultan de la degeneraci6n y de la muerte de las motoneuronas espinales y/o bulbares son la esclerosis lateral amiotr6fica, tambien conocida bajo el nombre de enfermedad de Charcot o tambien enfermedad de Lou Gehrig, y las amiotrofias espinales infantiles, tambien conocidas bajo los nombres de enfermedad de Werdnig-Hoffmann o enfermedad de Kugelberg-Welander.

Ademas se observa una degeneraci6n de las motoneuronas en los casos de traumatismos con aplastamiento y/o secci6n de la medula espinal o de los nervios motrices perifericos.

Mas generalmente, se habla de amiotrofias espinales para las enfermedades donde se implica la degeneraci6n o la muerte de las motoneuronas de la medula espinal.

La esclerosis lateral amiotr6fica (SLA o ALS para Amyotrophic Lateral Sclerosis) es una enfermedad neurodegenerativa asociada a distintos tipos de inclusiones tales como los cuerpos de Lewy y caracterizada por una degeneraci6n de las motoneuronas espinales y corticales cuyo desenlace fatal a veces se asocia a una demencia frontal. Durante el desarrollo de la ALS, los fen6menos degenerativos se producen no s6lo en el cerebro sino tambien en la medula espinal y en consecuencia en el musculo, por defecto de inervaci6n.

Se buscan siempre compuestos activos para luchar contra las afecciones mencionadas mas arriba.

La solicitud de patente europea nO 0442350 describe la utilizaci6n de estigmasta-4-en-3-ona o estigmasta-4-22-dien3-ona para el tratamiento de los tumores.

HORITA, KIYOSHI et al ("Anti-arrhythmia constituent in Herba Leonuri" NATURAL MEDICINES, 56(5), 212-214, 2002), describe la actividad antiarritmica de la estigmasta-4-en-3-ona (beta-sitosterona) y la utilizaci6n medica de los extractos de Herba lenuri que lo contiene.

YANG, Y. et al ("Anti-emetic principles of Pogostemon cablin" PHYTOMEDICINE, 6(2), 89-93, 1999) describe el efecto antiemetico de la estigmasta-4-en-3-ona y la utilizaci6n de hierbas medicas chinas que la contienen.

KOLAK, UFUK et al ("Cardioactive diterpenoids from the roots of Salvia amplexicaulis" PLANTA MEDICA, 67(8), 761763, 2001) describe el efecto vasodepresivo de la estigmasta-4-en-3-ona y la utilizaci6n medica de las raices de Salvia amplexicaulis que la contiene.

SUZUKI K et al ("The cholesterol metabolite cholest-4-en-3-one and its 3-oxo derivates suppress body weight gain, body fat accumulation and suerum lipid concentration en mice" BIOORGANIC y MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 8 (16), 2133-2138,1998) describe el efecto anti-obesidad de los derivados del colesten-3-ona que responden a la f6rmula I).

KANEKO, EMI et al ("Induction of Intestinal ATP-binding Cassette Transporters by a Phytosterol-derived Liver X Receptor Agonist" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 278(38), 36091-36098, 2003) describe el efecto agonista de los receptores LXRs de ergosta-1,4,6,22-tetra-en-3-ona y su posible utilizaci6n terapeutica para la modulaci6n del metabolismo del colesterol.

LIN, WEI-YU et al ("Anti-platelet aggregation and chemical constituents from the rhizome of Gynura japonica" PLANTA MEDICA, 69(8), 757-764, 2003) describe la actividad anti-agregaci6n de las placas de estigmasta-1,2,22trien-3-ona y estigmasta-1,4-dien-3-ona, y la utilizaci6n medica del rizoma de Gynura Japonica que le contiene.

La solicitud de patente Japonesa nO 2.002.030.096 la estigmasta-22-en-3-ona y su oxima se revelan como compuestos intermediarios de sintesis en la preparaci6n de ergostenoles, estando estos ultimos descritos como regeneradores de las proyecciones neuronales con aplicaci6n en la terapia de las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson.

UENSEREN E ("Gamma irradiation of cholestenone oximes" INIS ATOMINDEX, INTERNACIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY, vol. 8, nO 6, 1977, paginas 1-21) revela el compuesto colest-4-en-3-ona y su oxima como compuestos intermediarios en la sintesis de los azasteroides.

Estos documentos del estado de la tecnica anterior no describen una utilizaci6n de compuestos de la invenci6n como medicamentos neuroprotectores.

Ahora bien, la firma solicitante descubri6 que derivados del 4-colesten-3-ona y, en particular, la oxima de colest-4en-3-ona se dotaban de notables propiedades neuroprotectoras, especialmente frente a las motoneuronas, neuronas del sistema nervioso central, de los nervios motrices y perifericos, y en consecuencia eran utiles como medicamentos y que algunos de ellos se dotaban, por otro lado, de notables propiedades inhibidoras del efecto de moduladores alostericos positivos de los receptores GABAA (gamma amino butirico acido de tipo A).

Esta es la raz6n por la que la presente invenci6n tiene por objeto los compuestos que responden a la f6rmula I:

en la cual X representa un grupo = N-OH, R representa un grupo elegido entre:

A representa un atomo de hidr6geno o junto con B un enlace carbono-carbono, B representa un atomo de hidr6geno, un grupo hidroxi o junto con A un enlace carbono-carbono, C representa un atomo de hidr6geno o junto con D un enlace carbono-carbono, D representa un atomo de hidr6geno o junto con C un enlace carbono-carbono,

15 E representa un atomo de hidr6geno o junto con F un enlace carbono-carbono, F representa un atomo de hidr6geno o junto con E un enlace carbono-carbono, asi como sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables, para su utilizaci6n en un metodo de

tratamiento terapeutico del cuerpo humano o animal, es decir, como medicamentos. Las sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables pueden ser, por ejemplo, las sales formadas con 20 los acidos clorhidrico, bromhidrico, nitrico, sulfurico, fosf6rico, acetico, f6rmico, propi6nico, benzoico, maleico,

fumarico, succinico, tartarico, citrico, oxalico, glic6lico, aspartico, alcano sulf6nico tales como los acidos metano-o etano-sulf6nicos, aril-sulf6nicos, tales como los acidos benceno- o paratolueno-sulf6nicos, o carboxilicos. Se retienen mas concretamente los compuestos citados mas arriba para los cuales,

-

X representa un grupo = N-OH, A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D, representan un 25 atomo de hidr6geno, E, F representan un atomo de hidr6geno o juntos un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1,

-

X representa un grupo = N-OH, A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R2 o R3 o R4,

-

X representa un grupo = N-OH, A representa junto con B un doble enlace, C representa junto con D un enlace carbono-carbono, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R1 o R6,

-

X representa un grupo = N-OH, A representa junto con B un enlace doble, C representa junto con D un enlace carbono-carbono, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1,

-

X representa un grupo = N-OH, E representa junto con F un enlace doble, C, D, A, B representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R1,

asi como sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables.

Entre los compuestos de la invenci6n se puede citar ademas:

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la 5 beta hidroxi colestan 3 ona

-

la oxima de colestan-3-ona

asi como sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables.

Se retiene muy particularmente:

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la oxima de colest-4-en-3-ona,

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la oxima de 1,4-colestadien-3-ona

asi como sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables.

Los compuestos objeto de la presente invenci6n poseen muy interesantes propiedades farmacol6gicas. Estan dotados, en particular, de notables propiedades neuroprotectoras, especialmente frente a las motoneuronas.

Estas propiedades se ilustran a continuaci6n en la parte experimental. Justifican la utilizaci6n de los compuestos citados mas arriba descritos asi como de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables como medicamento.

Los medicamentos segun la presente invenci6n encuentran su empleo debido a sus propiedades neuroprotectoras por ejemplo en el tratamiento o en la prevenci6n de las afecciones neurodegenerativas, como, por ejemplo, la enfermedad de Huntington, las enfermedades cr6nicas neurodegenerativas, hereditarias o esporadicas, las lesiones neuronales vinculadas al envejecimiento, las neuropatias perifericas hereditarias o lesionales, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, las neuropatias diabeticas o inducidas por los tratamientos anticancerigenos, los traumatismos del cerebro, los nervios perifericos o de la medula espinal, las isquemias del cerebro o de la medula espinal, las degeneraciones hereditarias, lesionales o vinculados al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la visi6n o las degeneraciones del nervio 6ptico, las degeneraciones hereditarias, traumaticas o vinculadas al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la audici6n, las atrofias lobares y las demencias vasculares, y, en particular, las amiotrofias espinales, la esclerosis lateral amiotr6fica y las patologias debidas a los traumatismos de la medula espinal o de los nervios motrices perifericos.

En el contexto de la invenci6n, el termino "tratamiento" designa el tratamiento preventivo, curativo, paliativo, asi como asumir el tratamiento a pacientes (reducci6n del sufrimiento, mejora de la duraci6n de vida, disminuci6n de la progresi6n de la enfermedad), etc. El tratamiento se puede, por otro lado, realizar en combinaci6n con otros ingredientes o tratamientos, tales como, en particular, otros compuestos activos para tratar las patologias o traumatismos especificados en la presente solicitud.

Presentan tambien propiedades inhibidoras del efecto de moduladores alostericos positivos de los receptores GABAA (gamma amino butirico acido de tipo A). Ejemplos de moduladores alostericos positivos son: la alopregnanolona o 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona o 3a, 5a-TH-PROG o la tetrahidroxicorticosterona = 3a, 20dihidroxi-5a-pregnan-20- 5a-TH-DOC, que son neuroesteroides end6genos del sistema nervioso central. Estas propiedades particulares justifican que los compuestos de la invenci6n encuentran tambien su empleo en el tratamiento de distintas situaciones fisiopatol6gicas donde estos neuroesteroides se describieron para desempenar un papel importante, tal como, por ejemplo,

-

el comportamiento sexual

-

la muerte subita del recien nacido, y, en particular,

5

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la sensibilidad dolorosa o los dolores neuropaticos cr6nicos

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la ansiedad o la depresi6n

-

las lesiones traumaticas del sistema nervioso

-

las epilepsias sensibles a los esteroides, los desordenes del sueno o la intoxicaci6n

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el aprendizaje cognoscitivo o los desordenes de la memoria.

Encuentran, en particular, debido a sus propiedades neuroprotectoras frente a las motoneuronas, su empleo especialmente en el tratamiento de las amiotrofias espinales, en particular, de la esclerosis lateral amiotr6fica o de las amiotrofias espinales infantiles, y en el tratamiento de los traumatismos de la medula espinal o de los nervios motrices perifericos tal como se menciona mas arriba.

En general la dosis diaria del compuesto sera la dosis minima para obtener el efecto terapeutico. Esta dosis dependera de los distintos factores citados antes. Las dosis de los compuestos citados mas arriba descritos y por ejemplo de la oxima de colest-4-en-3-ona se incluiran en general entre 0,001 a 100 mg por kilo al dia por hombre.

En caso necesario, la dosis diaria se puede administrar en dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas, tomas al dia o por subdosis multiples administradas por intervalos apropiados durante el dia.

La cantidad elegida dependera de multiples factores, en particular de la via de administraci6n, de la duraci6n de administraci6n, del momento de la administraci6n, de la velocidad de eliminaci6n del compuesto, del o de los distintos productos utilizados en combinaci6n con el compuesto, de la edad, del peso y de la condici6n fisica del paciente, asi como de su historia medica, y de todas las informaciones conocidas en medicina.

La prescripci6n del medico que trata podra comenzar en dosis inferiores a las generalmente utilizadas, luego estas dosis se aumentaran progresivamente con el fin de controlar mejor la aparici6n de posibles efectos secundarios.

La invenci6n tiene tambien por objeto las composiciones farmaceuticas que contienen almenos un compuesto antes citado o una de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables, como principio activo.

En estas composiciones, el principio activo esta presente ventajosamente en dosis fisiol6gicamente eficaces; las composiciones antes citadas contienen, en particular, una dosis neuroprotectora eficaz de al menos un principio activo citado mas arriba.

Como medicamentos, los compuestos que responden a la f6rmula I asi como sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables se pueden incorporar en composiciones farmaceuticas destinadas a la via digestiva o parenteral.

Las composiciones farmaceuticas segun la invenci6n pueden incluir por otro lado al menos otro ingrediente terapeuticamente activo, para una utilizaci6n simultanea, separada o extendida en el tiempo, en particular, durante un tratamiento en un sujeto alcanzado de una patologia o de un traumatismo vinculado a la degeneraci6n o a la muerte de las motoneuronas tal como se definen mas arriba.

Las composiciones farmaceuticas o medicamentos segun la invenci6n incluyen ventajosamente uno o varios excipientes o vehiculos inertes, es decir, farmaceuticamente inactivos y no t6xicos. Se pueden citar por ejemplo soluciones salinas, fisiol6gicas, isot6nicas, tamponadas, etc, compatibles con un uso farmaceutico y conocidas por el experto en la tecnica. Las composiciones pueden contener uno o varios agentes o vehiculos elegidos entre los dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, etc. Agentes o vehiculos utilizables en formulaciones (liquidos y/o inyectables y/o s6lidos) son, en particular, la metilcelulosa, el hidroximetilcelulosa, la carboximetilcelulosa, las ciclodextrinas, el polisorbato 80, el manitol, la gelatina, la lactosa, los aceites vegetales o animales, la acacia, etc. Las composiciones se pueden formular en forma de suspensi6n inyectable, de geles, aceites, comprimidos, supositorios, polvos, capsulas de gelatina, capsulas, etc, eventualmente por medio de forma galenica o de dispositivos que aseguran una liberaci6n prolongada y/o retardada. Para este tipo de formulaci6n, se utilizan ventajosamente un agente tal como la celulosa, carbonatos o almidones.

La administraci6n se puede realizar por cualquier metodo conocido por el experto en la tecnica, preferentemente por via oral o por inyecci6n, tipicamente por via intraperitoneal, intracerebral, intratecal, intravenosa, intra-arterial o intramuscular. Se prefiere la administraci6n por via oral. Se trata de un tratamiento a largo plazo, la via de administraci6n preferida sera sublingual, oral o transcutanea.

Para las inyecciones, los compuestos se condicionan generalmente en forma de suspensiones liquidas, que se pueden inyectar por medio de jeringuillas o de perfusiones, por ejemplo. Se entiende que el caudal y/o la dosis inyectada, o de manera general la dosis que se debe administrar, se pueden adaptar por el experto en la tecnica en funci6n del paciente, de la patologia, del modo de administraci6n, etc. Se entiende que se pueden realizar administraciones repetidas, eventualmente en combinaci6n con otros ingredientes activos o cualquier vehiculo aceptable a nivel farmaceutico (tampones, soluciones salinas, isot6nicas, en presencia de agentes estabilizantes,

etc).

La invenci6n es utilizable en los mamiferos, en particular, en el ser humano.

La presente invenci6n describe tambien un procedimiento de preparaci6n de una composici6n descrita mas arriba, caracterizado porque se mezcla, segun metodos conocidos de por si, el o los principios activos con excipientes aceptables, en particular, farmaceuticamente aceptables.

Los compuestos de f6rmula I tales como se define mas arriba son conocidos o se pueden preparar segun los procedimientos descritos en la literatura. Algunos derivados de f6rmula I son productos nuevos.

Esta es la raz6n por la que la presente solicitud tiene tambien por objeto los nuevos compuestos que responden a la f6rmula I:

en la cual X representa un radical =N-OH y

-

A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1, o

-

A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E, F 15 representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R2 o R4, o

-

A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C representa junto con D un enlace carbono-carbono, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R6, o

-

A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C representa junto con D un enlace carbono-carbono, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1,

20 asi como sus sales de adici6n con los acidos minerales u organicos.

La presente invenci6n describe tambien un procedimiento de preparaci6n de los nuevos compuestos de f6rmula I tales como se define mas arriba asi como sus sales, caracterizado porque hace reaccionar un compuesto de f6rmula II

25 en la cual

-

A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1, o

-

A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R2 o R4, o

30 -A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C representa junto con D un enlace carbono-carbono, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R6, o

-

A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C representa junto con D un enlace carbono-carbono, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1,

con un halogenuro de hidroxilamina como el hidrocloruro de hidroxilamina, para obtener el compuesto de f6rmula I esperada que se aisla y si se desea salifica.

En condiciones preferenciales de empleo del procedimiento descrito mas arriba, -Se solubiliza el producto de partida en un minimo de un disolvente adaptado como la piridina -si otra funci6n cetona esta presente, es bloqueada especificamente por un grupo protector adaptado como

acetales ciclicos, -se utiliza un exceso, por ejemplo 2 equivalentes, de halogenuro de hidroxilamina. -Se opera bajo agitaci6n durante aproximadamente 24 h a temperatura ambiente.

Los compuestos de f6rmula II son derivados conocidos, descritos en la literatura, y son accesibles comercialmente. La invenci6n tiene tambien por objeto la utilizaci6n de un compuesto de f6rmula I

10 en la cual X representa un atomo de oxigeno o un grupo = N-OH, R representa un grupo elegido entre

A representa un atomo de hidr6geno o junto con B un enlace carbono-carbono

B representa un atomo de hidr6geno, un grupo hidroxi o junto con A un enlace carbono-carbono,

15 C representa un atomo de hidr6geno o junto con D un enlace carbono-carbono,

D representa un atomo de hidr6geno o junto con C un enlace carbono-carbono,

E representa un atomo de hidr6geno o junto con F un enlace carbono-carbono,

F representa un atomo de hidr6geno o junto con E un enlace carbono-carbono,

o de una de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables, para la obtenci6n de un

20 medicamento neuroprotector, en particular, destinado al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas tales como, por ejemplo, la enfermedad de Huntington, las enfermedades cr6nicas neurodegenerativas, hereditarias o esporadicas, las lesiones neuronales vinculadas al envejecimiento, las neuropatias perifericas hereditarias o lesionales, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, las neuropatias diabeticas o inducidas por el tratamiento anticancerigeno, los traumatismos del cerebro, los nervios perifericos o de la medula espinal, las isquemias del

25 cerebro o de la medula espinal, las degeneraciones hereditarias, lesionales o vinculadas al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la visi6n o las degeneraciones del nervio 6ptico, las degeneraciones hereditarias, traumaticas o vinculadas al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la audici6n, las atrofias lobares y las demencias vasculares, las enfermedades y traumatismos vinculados a la degeneraci6n de las motoneuronas y mas concretamente a las amiotrofias espinales especialmente infantiles, la esclerosis lateral amiotr6fica, la esclerosis en placas y los traumatismos de la medula espinal o los nervios motrices perifericos.

La invenci6n tiene especialmente por objeto la utilizaci6n de un compuesto de f6rmula I descrita mas arriba para la obtenci6n de un medicamento neuroprotector, en particular, destinado al tratamiento de patologias o traumatismos vinculados a la degeneraci6n o a la muerte de las neuronas, en mamiferos (en general de los pacientes) alcanzados de tales patologias o traumatismos.

La invenci6n tiene mas concretamente por objeto la utilizaci6n de un compuesto de f6rmula I para la obtenci6n de un medicamento destinado al tratamiento de las amiotrofias espinales infantiles y las esclerosis laterales amiotr6ficas.

La invenci6n describe tambien la utilizaci6n de un compuesto de f6rmula I descrita mas arriba para la obtenci6n de un medicamento destinado al tratamiento de las patologias donde la sobreactivaci6n de los receptores GABAA, (por ejemplo a causa de la presencia de neuroesteroides tal como la alopregnanolona y/o la tetrahidroxicorticosterona), puede tener un efecto danino tal como las epilepsias sensibles a los esteroides, la intoxicaci6n alcoh6lica, el aprendizaje cognitivo, la sensibilidad dolorosa o los desordenes del sueno. Este sobreactivaci6n de los receptores GABAA, se puede caracterizar por efectos inhibidores o efectos excitadores.

El empleo de estos medicamentos comprende habitualmente la administraci6n a estos mamiferos una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de f6rmula I y, en particular, de oxima de colest-4-en-3-ona, en particular para aumentar la supervivencia de las neuronas o favorecer el crecimiento axonal.

La invenci6n tiene por objeto, igualmente, la disponibilidad de nuevos derivados del 4-colesten-3-ona como otros derivados del 4-colesten-3-ona que las que pueden haber sido descrito en el estado de la tecnica. Por lo tanto, se excluyen los descritos en la literatura.

Las condiciones preferenciales mas arriba descritas de empleo de los medicamentos de f6rmula I se aplican tambien a los otros objetos de la invenci6n contemplados mas arriba, en particular, a las composiciones, nuevos derivados,

utilizaciones e inversamente.

Los ejemplos que siguen ilustran la presente solicitud.

Ejemplo�

Se prepar6 una suspensi6n que respondia a la f6rmula

Oxima de colest-4-en-3-ona

20 mg por ml

Excipiente:

Emulsi6n aceitosa

Ejemplo�

Se prepararon capsulas de gelatina que respondian a la f6rmula Oxima de colest-4-en-3-ona 250 mg Excipiente: cantidad suficiente para una capsula de gelatina terminada a 750 mg Ejemplo�:�Oxima de 1,4-colestadien-3-ona (R = R1) En un matraz de fondo redondo de 100 ml, se solubilizan 5 g de 1,4-colestadien-3-ona (13 mmoles) en 50 ml de

piridina, luego se anaden 5 g de hidrocloruro de hidroxilamina. La agitaci6n se mantiene durante 24 h a temperatura ambiente, y se evapora el disolvente bajo presi6n reducida. Se anade agua, luego el acetato de etilo con el fin de efectuar una extracci6n. La fase organica se lava con una soluci6n acuosa acidificada (HCl a 1%). El acetato de etilo se evapora bajo presi6n reducida. Se obtiene un polvo blanco con un rendimiento superior al 50%.

Analisis: -Cromatografia Liquida/Espectrometria de Masa (Electrospray®) -Condiciones de la cromatografia liquida de alto rendimiento:

Columna: Macherey-Nagel - Nucleosil® 300-6 C4 -150 x 4,6 mm Gradiente: agua (+ 0,05% TFA)/acetonitrilo (+ 0,05% acido trifluoroacetico) t = 0 min: 60% acetonitrilo, 40% H2O

t = 6 min: 100% acetonitrilo, 0% H2O

luego se permanece 5 min a 100% de acetonitrilo Tiempo de retenci6n: 5 min 60 segundos Pico detectado en espectrometria de masa: {M + H}+ = 398

Ejemplo�:� Oxima de 4,24-colestadien-3-ona (R = R2) En un matraz de fondo redondo de 10 ml, se solubilizan 100 mg de 4,24-colestadien-3-ona (0,26 mmoles) en 5 ml de piridina, luego se anaden 100 mg de hidrocloruro de hidroxilamina. La agitaci6n se mantiene durante 24 h a temperatura ambiente, y se evapora el disolvente bajo presi6n reducida. Se anade agua, luego acetato de etilo con el fin de efectuar una extracci6n. Luego se lava la fase organica con una soluci6n acuosa acidificada (HCl a 1%). El acetato de etilo se evapora bajo presi6n reducida. Se obtiene un polvo blanco con un rendimiento superior al 50%. Analisis: -Cromatografia Liquida/Espectrometria de Masa (Electrospray®)

Pico detectado en espectrometria de masa: {M+H}+ = 398 Ejemplo�:� Oxima de 4,22-cholesiadien-3-ona (R = R4) En un matraz de fondo redondo de 10 ml, se solubilizan 10 mg de 4,22-colestadien-3-ona (0,026 mmoles) en 5 ml de

piridina, luego se anaden 100 mg de hidrocloruro de hidroxilamina. La agitaci6n se mantiene durante 24 h a temperatura ambiente, y se evapora el disolvente bajo presi6n reducida. Ser anade agua, luego acetato de etilo con el fin de efectuar una extracci6n. Luego se lava la fase organica con una soluci6n acuosa acidificada (HCl a 1%). El acetato de etilo se evapora bajo presi6n reducida. Se obtiene un polvo blanco con un rendimiento superior al 50%.

Analisis: -Cromatografia Liquida/Espectrometria de Masa (Electrospray®)

Pico detectado en espectrometria de masa: {M+H}+ = 398 Ejemplo�:� Oxima de 4-estigmasta-en-3-ona (R = R3) En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se solubilizan 100 mg de 4-estigmasta-en-3-ona (0,24 mmoles) en 10 ml

de piridina, luego se anaden 100 mg de hidrocloruro de hidroxilamina. La agitaci6n se mantiene durante 24 h a temperatura ambiente, y se evapora el disolvente bajo presi6n reducida. Se anade agua, luego acetato de etilo con el fin de efectuar una extracci6n. Luego se lava la fase organica con una soluci6n acuosa acidificada (HCl a 1%). El acetato de etilo se evapora bajo presi6n reducida. Se obtiene un polvo blanco con un rendimiento superior al 50%.

Analisis: -Cromatografia Liquidado/Espectrometria de Masa (Electrospray®)

Pico detectado en espectrometria de masa: {M+H}+ = 428 Ejemplo�:� Oxima de 4,6,22-Ergosta-trien-3-ona (R = R6) En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se solubilizan 100 mg de 4,6,22-Ergosta-trien-3-ona (0,25 mmoles) en 10

ml de piridina, luego se anaden 100 mg de hidrocloruro de hidroxilamina. La agitaci6n se mantiene durante 24 h a temperatura ambiente, y se evapora el disolvente bajo presi6n reducida. Se anade agua, luego acetato de etilo con el fin de efectuar una extracci6n. Luego se lava la fase organica con una soluci6n acuosa acidificada (HCl a 1%). El acetato de etilo se evapora bajo presi6n reducida. Se obtiene un polvo blanco con un rendimiento superior al 50%.

Analisis: -Cromatografia Liquida/Espectrometria de Masa (Electrospray®)

Pico detectado en espectrometria de masa: {M+H}+ = 410 Ejemplo�:� Oxima de 1,4,6-Colesta-trien-3-ona (R = R1) En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se solubilizan 100 mg de 1,4,6-Colesta-trien-3-ona (0,26 mmoles) en 10 ml

de piridina, luego se anaden 100 mg de hidrocloruro de hidroxilamina. La agitaci6n se mantiene durante 24 h a temperatura ambiente, y se evapora el disolvente bajo presi6n reducida. Se anade agua, luego acetato de etilo con el fin de efectuar una extracci6n, luego se lava la fase organica con una soluci6n acuosa acidificada (HCl a 1%). El

acetato de etilo se evapora bajo presi6n reducida. Se obtiene un polvo blanco con un rendimiento superior al 50%. Analisis: -Cromatografia Liquida/Espectrometria de Masa (Electrospray®) Pico detectado en espectrometria de masa: {M+H}+ = 396

ESTUDIO�ARRARCOOOIIC�

Se ensayaron los siguientes compuestos de f6rmula 1:

Oxima de colest-4-en-3-ona descrita en Gamma irradiation of colestenone oximes. Uenseren, Envare. Cekmece Nucl. Res. Train. Cent., Estambul, Turk. Avail. INIS. Report (1976), (CNAEM-R157), 21 pp. From: INIS Atomindex 1977, 8(6), Abstr. No. 295540.

Compuesto del ejemplo 3

Oxima de colestan-3-ona disponible comercialmente en Sigma-Aldrich

Colest-4,24-dien-3-ona descrita en Chemical synthesis of colest-5,7,24-trieno-3beta-ol and demostration of its conversion to cholesterol in the rat. Scallen, Terence J. Univ. of Minnesota, Minneapolis, Biochemical and Biophysical Research Communications (1965), 21(2), 149-55.

4,22-colest-dien-3-ona. Descrita en 3-Keto-L4-steroids from 3-hydroxy-ene-4 (or ene-5)-steroids. Yamanaka, Toru; Imai, Takashi. (Takasago Perfumery Co., Ltd., Japan). JP 52116456 19770929 Showa. Application: JP 76-32979 19760325. CAN 88:136852 AN 1978:136852

Compuesto del ejemplo 4

Compuesto del ejemplo 5

Compuesto del ejemplo 6

5-beta-hidroxi-colestan-3-ona disponible comercialmente en Sigma-Aldrich

5-alfa-hidroxi-colestan-3-ona disponible comercialmente en Sigma-Aldrich

5-alfa-colest-6-en-3-ona disponible comercialmente en Sigma-Aldrich

24-metilcolest-4,6,22-trien-3-ona descrita en Preparation of 3-beta-hydroxy-(24R) -methilcholest-5ene. Khripach, V. A.; Zhabinskii, V. N.; Zhemosek, E. V.; Lakhvich, F. A. (Institute of Bioorganic Chemistry, Academy of Sciences, Belorussian S.S.R., USSR). U.S.S.R. (1990), y SU 1594181 19900923: SU 88-4612746 19881201. CAN 114:102558 AN 1991:102558

Oxima de colest-5-en-3-ona descrita en Gamma irradiation of cholestenone oximes. Uenseren, Envare. Cekmece Nucl. Res. Train. Cent. Estambul, Turck. Avail. INIS. Report (1976), (CNAEM-R157), 21 pp.

Oxima de colest-4,6-dien-3-ona descrita en Azasteroid from cholesta-4,6-dien-3-one. Ahmad, Mohammed S.; Siddiqui, A. H.; Shafiullah; Logani, S. C. Aligarh Muslim Univ., Aligarh, India. Australian Journal of Chemistry (1969), 22 (1), 271-4.

Compuesto del ejemplo 7

Oxima de 5alfa-colest-1-en-3-ona descrita en Poliphosphoric acid-catalyzed Beckmann rearrangement of 3-keto-steroid oximas. Kobayashi, Masaru; Shimizu, Yuzuru; Mitsuhashi, Hiroshi. Fac. Pharm. Sci., Hokkaido Univ., Sapporo, Japan. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (1969), 17 (6), 1255-60.

Compuesto del ejemplo 8

1. Efectos de los compuestos de f6rmula I sobre la supervivencia de las motoneuronas

Para poner en evidencia la acci6n neuroprotectora de los compuestos de f6rmula I, la firma solicitante estudi6 su actividad sobre un modelo in vitro de privaci6n tr6fica de motoneuronas de ratas. Se podra referir utilmente a la 10 solicitud de patente internacional nO 0142784 de la firma solicitante sobre el cultivo de las motoneuronas de medula espinal.

Se diseca la medula espinal de embriones E14 de rata y la parte ventral se disocia por trituraci6n despues de la tripsinizaci6n. Las motoneuronas son separados de las otras celulas espinales por un metodo conocido (Camu et al, 1993, Purification of spinal motoneurons from chicken and rat embryos by immunopanning. En "Immunoselection Strategies for Neural cell culture", Neuroprotocols: A companion to Methods in Neurosciences 2, 191-199; Henderson et al, 1993, Neutrophins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb bud. Nature 363 (6426): 266-70). Las celulas se centrifugan sobre un gradiente de densidad. Las motoneuronas se enriquecen en la fracci6n de las grandes celulas (los menos densos). Las celulas de esta fracci6n se incuban con un anticuerpo anti-p75, un antigeno de superficie presente sobre las motoneuronas. Se anaden algunos anticuerpos secundarios acoplados a bolas magneticas y la mezcla de celulas se pasa a traves de una columna en un iman (Arce et al, 1999). S6lo las motoneuronas se retienen: su pureza es del orden de 90%.

Las motoneuronas se siembran a baja densidad en pocillos de cultivo sobre un substrato de poliornitinalaminina en un medio neurobasal suplementario segun Raoul et al, 1999, Programmed cell death of embryonic motoneurons triggered through the Fas death receptor. J Cell Biol 147 (5): 1049-62. Controles negativos (ausencia de factores tr6ficos) y positivos (en presencia de BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) a 1 ng/ml, GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor) a 1 ng/ml y CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) a 10 ng/ml, comercializados por la sociedad americana PEPROTECH, Inc. y la sociedad Sigma-Aldrich, se incluye en cada serie.

Los compuestos que se deben ensayar se anaden 60 minutos despues de la siembra y se mantienen los cultivos a 37TC bajo un 5% de CO2 durante 3 dias.

Las motoneuronas tienden espontanea a morir en ausencia de factores neurotr6ficas (Pettmann y Henderson, 1998, Neuronal cell death. Neuron 20 (4): 633-47). Despues de 3 dias, la supervivencia es evaluada por una medida de fluorescencia despues de la incubaci6n de las celulas en presencia de calceina que se vuelve fluorescente en las celulas vivas.

Despues de 3 dias en cultivo a 37TC, bajo 5% de CO2 y de humedad saturante, hasta 50% de las motoneuronas sembradas inicialmente sobreviven en el medio suplementario en factores neurotr6ficas, mientras que menos del 15% de las motoneuronas sobreviven en medio basico solo.

La actividad de los compuestos que se deben ensayar fue evaluada por su capacidad para impedir la muerte de las motoneuronas cuando se anaden al medio neurobasal en comparaci6n con la supervivencia de las motoneuronas en medio suplementario con factores neurotr6ficos.

Los compuestos de f6rmula I segun la invenci6n mostraron una actividad a una concentraci6n capaz de permitir una mejor tasa de supervivencia de las motoneuronas en el medio basal. Esta tasa de supervivencia se expresa por una cifra, el ratio. Si el ratio es superior a O, el efecto de los compuestos es positivo sobre la supervivencia de las motoneuronas.

Los resultados obtenidos son los siguientes:

Ratio

1

0,6

0,5

0,25

0,3

0,2

0,3

0,5

Debido a su efecto tr6fico sobre las motoneuronas espinales, los compuestos de f6rmula I segun la invenci6n se muestran, por lo tanto, utiles como medicamento, en particular, en el tratamiento de las amiotrofias, en particular en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotr6fica o de las amiotrofias espinales infantiles, y en el tratamiento de los traumatismos de la medula espinal.

2. Efectos de los compuestos de f6rmula I sobre la neuroprotecci6n

Se practica un axotomia del nervio facial sobre ratones recien nacidos con edad de 2-3 dias. Los animales reciben la oxima de colest-4-en-3-ona 4 horas antes de la secci6n unilateral del nervio luego diariamente durante 5 dias por via subcutanea. Siete dias despues de la secci6n del nervio, se anestesia a los animales, luego se fijan por perfusi6n

intracardiaca de paraformaldehido. El cerebro se extrae entonces, se incluye en parafina. El analisis histol6gico de cortes seriados de 7 Im del nucleo facial, coloreados al cresilo violeta, permite contar el numero de motoneuronas del lado intacto asi como del lado del nervio seccionado (Casanovas et al., Prevention by lamotrigine, MK-801 and N omega-nitro-L-arginine methyl ester of motoneuron cell death after neonatal axotomy, Neuroscience, 1996, 71, 313325).

Los resultados obtenidos son los siguientes:

La supervivencia de las motoneuronas del nucleo facial en ratas recien nacidas axotomizadas y tratada por la oxima de colest-4-en-3-ona se aumenta hasta 40% a una dosis comprendida entre 3 y 100 mg/kg, segun la via de administraci6n, en comparaci6n con el nervio no seccionado.

3. Efectos de los compuestos de f6rmula I sobre la neuroprotecci6n

Se practica un aplastamiento del nervio ciatico sobre ratones adultos segun el metodo descrito por Azzouz et al, Enhancement of mousse sciatic nerve regeneration by the largo chain fatty alcohol,N-hexacosanol, Exp. Neurol., 1996, 138: 189-97). Los animales reciben los compuestos que se deben ensayar el dia del aplastamiento luego cada dia durante 4 semanas y por via subcutanea. Cada semana se anestesia a los animales para realizar un registro electromiografico en el musculo de la pantorrilla despues de estimulo supramaximal del nervio ciatico. Se miden asi la amplitud, la duraci6n y la latencia de los potenciales de acci6n mencionados (CMAP). Cuatro semanas despues del aplastamiento del nervio, los animales se sacrifican por inyecci6n de una dosis mortal de anestesico y se extrae un segmento de nervio lesionado, fijado en glutaraldehido a 4% y se incluye en resina. El analisis histol6gico de cortes seriados, coloreados al azul de toluidina, permite un recuento semiautomatizado de las fibras degeneradas y no degeneradas, asi como una medida del tamano de los axones y del espesor de la envoltura de mielina de las fibras no degeneradas.

Los resultados obtenidos son los siguientes:

La administraci6n de la oxima de colest-4-en-3-ona reduce de 20 a 40% el numero de fibras degeneradas por comparaci6n con los animales no tratados. De manera aun mas espectacular, la regeneraci6n de las fibras nerviosas se estimula mucho por los compuestos que se deben ensayar a partir de la segunda semana despues del aplastamiento, con un efecto maximo observado cuatro semanas despues del aplastamiento. Asi cuatro semanas despues del aplastamiento, la amplitud de los CMAP en los ratones tratados por los compuestos que se deben ensayar a una dosis entre 0,3 y 30 mg/kg/dia, segun la via de administraci6n, se aumentan en 40 a 70% y la velocidad de conducci6n nerviosa mejorada de 30 a 50% por comparaci6n con los ratones no tratados.

4. Efectos de los compuestos de f6rmula I sobre la protecci6n de las neuronas estriatales de la muerte inducida por la sobreexpresi6n de una forma mutada de la huntingtina

Se preparan cultivos primarios de neuronas estriatales tal como se describe en la literatura (Primary striatal neuronal culture, Mao L. et al, Methods mol Med., 2003, 79: 379-86). Las celulas se electroporan segun el procedimiento descrito por Raoul et al, (Motoneuron death triggered by a specific pathway downstream of Fas. potentiation by ALSlinked SOD1 mutations Neuron, 2002, 35: 1067-83) antes de la siembra con un vector o plasmido de expresi6n que contiene un elemento promotor seguido del ADN codificador para una forma truncada del huntingtina que comprende los 480 primeros aminoacidos y 68 CAG (Saudou et al., Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions, Cell, 1998, 95: 55-66). Un segundo vector de expresi6n que contiene el ADN codificador la green f/uorescente protein (GFP) se electropora tambien y sirve de gen reportero. El ADN del plasmido codificador la huntingtina fue preparado por purificaci6n con el cloruro de cesio. El plasmido que contenia la secuencia GFP se prepar6 sobre columnas Qiagen. La integridad de las secuencias de ADN se verifica por secuenciado, transfecci6n y western blotting. Las celulas que sobreviven a la electroporaci6n se siembran a una densidad de 4000 celulas por pocillo de placas de 96 pocillos. El cultivo se hace en el medio Neurobasal (GIBCO) complementado con el piruvato y B-27 (Beckton Dickinson). Las celulas se mantienen en cultivo durante 7 dias sin cambiar el medio.

Los tratamientos con los compuestos que se deben ensayar se hacen justo despues de la siembra a una concentraci6n final de 1 Im en 0,5% de dimetilsulf6xido (DMSO). Los controles positivos se hacen por adjunci6n de BDNF a 5 ng/ml final. Los controles negativos s6lo reciben 0,5% de DMSO.

La muerte celular es evaluada despues de 7 dias por recuento del numero de celulas vivas que expresan la GFP.

La actividad de los compuestos que se deben ensayar fue evaluada por su capacidad para impedir la muerte de las neuronas estriatales cultivadas en el medio neurobasal en comparaci6n con la supervivencia de las neuronas estriatales en medio suplementario con el BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor).

Los resultados obtenidos son los siguientes:

Ratio

0,3

0,2

0,5

0,3

0,3

A la concentraci6n de 10-6M, los compuestos que se deben ensayar muestran un efecto protector de la muerte celular inducida por la huntingtina mutada hasta 60% en comparaci6n con las celulas tratadas por el BDNF.

Debido a su efecto neuroprotector, los compuestos de f6rmula I segun la invenci6n se muestran, por lo tanto, utiles como medicamentos destinado al tratamiento o a la prevenci6n de las afecciones neurodegenerativas, en particular, en el tratamiento de las amiotrofias espinales, de la esclerosis lateral amiotr6fica, en el tratamiento de los traumatismos de la medula espinal y de los nervios perifericos y en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

5. Efectos de los compuestos de f6rmula I sobre la potencializaci6n de los receptores GABAA por los esteroides

Experiencias electrofisiol6gicas se realizaron in vitro con neuronas de rata (tramos de hipocampo, neuronas sensibles en cultivo), del siguiente modo:

Las experiencias se realizan con hipocampos extraidos sobre ratas de cepas Sprague Dawley de 10 a 21 dias de edad. Los animales se sacrifican por decapitaci6n, y se transfiere rapidamente su cerebro en el ACSF (Artificial Cerebro-Spinal Fluid) sin sodio (composici6n: KCI 2 mM, NaH2PO4 1,2 mM, mgCl2 2 mM., CaCl2 0,5 mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 11 mM, sacarosa 250 mM), mantenida a una temperatura de 4TC y gasificado con carb6geno (mezcla 95% de O2, 5% CO2). Se extrae los hipocampos de cada hemisferio cerebral luego se recortan en rodajas de 300 IM de espesor por un "tejido chopper". Las rodajas se ponen a reposar en el medio ACSF (composici6n: NaCl 126 mM, KCI 2 mM, NaH2PO4 1,2 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 0,5 mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 11mM) a temperatura ambiente, al menos una hora antes del registro. Una rodaja se deposita a continuaci6n con la ayuda de una pipeta sobre un sistema de registro multielectrodo (MEA, MultiChannel Systems™, Germany) y posicionado de tal modo que cubra los 64 electrodos. Para evitar toda modificaci6n de posicionamiento por el flujo de perfusi6n, se posiciona una rejilla lastrada por una "U" en platino sobre la rodaja. Rapidamente el MEA se inserta entonces en el sistema de registro y la camara prefundida con el ACSF gasificada al carb6geno; el medio de la camara se conecta a la tierra. El ACSF prefundido asi como el MEA se mantienen a una temperatura de 37TC. Uno de los 60 electrodos se selecciona como electrodo de estimulaci6n. Se genera una corriente de estimulaci6n bifasica y de una intensidad de 300 IA durante 0,1 ms a partir de este electrodo a raz6n de una estimulaci6n cada 30 segundos. Las respuestas mencionadas se visualizan simultaneamente a nivel de otros 59 electrodos del MEA. Los axones de los colaterales de Schaeffer se estimulan en CA3. En la regi6n CA1, se seleccionan 6 a 12 electrodos para registrar los potenciales de campo que corresponden a la suma de las variaciones de los potenciales postsinapticos de las neuronas situadas en proximidad de cada electrodo. Las moleculas ensayadas se disuelven en el medio ACSF (la concentraci6n final en DMSO es : 0,1%) y se proporcionan sobre la rodaja gracias al sistema de perfusi6n.

Las neuronas sensibles de rata se cultivan 1 a 2 dias y se registran a continuaci6n con la tecnica de patch-clamp tal como se describe en De Roo M. et al (Dehydroepiandrosterone potentiates native ionotropic ATP receptors containing the P2X2 subunit in rat sensory neurones, J Physiol, 2003, 552: 59-71).

Los resultados obtenidos son los siguientes:

Sobre las rodajas de hipocampo, una pequena fracci6n de los potenciales post sinapticos de campo registrados en la regi6n CA1 corresponde a una transmisi6n GABAA excitante: se bloquea por antagonistas clasicos de los receptores GABAA (20 IM bicuculina o 50 IM picrotoxina) y potencializada por moduladores alostericos positivos de los receptores GABAA: benzodiazepina (1-10 IM de Diazepam) y esteroides (10-1000 nM alopregnanolona o tetrahidroxicorticosterona). El efecto potenciador de los esteroides desaparece cuando los receptores GABAA se desensibilizan por la adici6n de una concentraci6n saturante de GABA (10 mM). El efecto excitador del GABA esta vinculado al paso de los iones hidrogenocarbonatos (HCO3) a traves de los receptores GABAA.

En las neuronas sensibles registradas en patch-clamp, se mencionan algunas corrientes abriendo selectivamente a los receptores GABAA de estas neuronas por aplicaci6n rapida de un agonista GABAA-selectiva, la isoguvacina. Las corrientes de cloro asi mencionados se bloquean por la bucuculina y potencializadas por la alopregnanolona.

Los resultados ponen de manifiesto que la oxima de colest-4-en-3-ona (ensayado solo hasta 10 IM) no tiene efecto sobre los receptores GABAA (rodaja de hipocampo o neuronas sensibles). Por el contrario, la oxima de colest-4-en3-ona es capaz de bloquear el efecto de moduladores alostericos positivos (alopregnanolona o tetrahidroxicorticosterona) de los receptores GABAA y esto de manera dosis-dependiente y para concentraciones equivalentes a la de aquellas en que se observan los efectos neurotr6ficas in vitro.

Los compuestos de f6rmula I tienen, por lo tanto, un efecto "protector" en todas las patologias en que la sobreactivaci6n de los receptores GABAA, a causa de la presencia de alopregnanolona y/o de tetrahidroxicorticosterona, puede tener un efecto danino, tanto para efectos inhibidores como sobre efectos

5 excitadores mediados por los receptores GABAA.

Estudio toxicol6gico

La administraci6n en el rat6n, en particular de la oxima de la colest-4-en-3-ona, por las vias orales, subcutaneas, intraperitoneal e intravenosa, a una dosis que llega hasta 300 mg/kg/dia, por tratamiento con administraci6n diaria que puede llegar hasta 28 dias, no mostr6 toxicidad significativa.

10 En el mono, la administraci6n por via oral de dosis crecientes diarias hasta 1500 mg/kg sobre un periodo de 10 dias no revel6 ninguna toxicidad.

Claims (21)

1. REIVINDICaCIONES

   1.-Un compuesto que responde a la f6rmula I

   5 en la cual X representa un grupo = N-OH, R representa un grupo elegido entre

   A representa un atomo de hidr6geno o junto con B un enlace carbono-carbono, B representa un atomo de hidr6geno, un grupo hidroxi o junto con A un enlace carbono-carbono,

   10 C representa un atomo de hidr6geno o junto con D un enlace carbono-carbono, D representa un atomo de hidr6geno o junto con C un enlace carbono-carbono, E representa un atomo de hidr6geno o junto con F un enlace carbono-carbono, F representa un atomo de hidr6geno o junto con E un enlace carbono-carbono,

   o una de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables,

   15 para su utilizaci6n en un metodo de tratamiento terapeutico del cuerpo humano o animal, es decir, como medicamento.
2. 2.-Un compuesto segun la reivindicaci6n 1 para su utilizaci6n segun la reivindicaci6n 1, caracterizado porque en la f6rmula I, A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D, representan un atomo de hidr6geno, E, F representan un atomo de hidr6geno o juntos un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1, es

   20 decir, la oxima de colest-4-en-3-ona o la oxima de 1,4-colestadien-3-ona, o una de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables, para su utilizaci6n como medicamento.
3. 3.-Un compuesto segun la reivindicaci6n 1, para su utilizaci6n segun la reivindicaci6n 1, caracterizado porque en la f6rmula I, A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R2 o R3 o R4, o una de sus sales de adici6n

   25 con los acidos farmaceuticamente aceptables, para su utilizaci6n como medicamento.
4. 4.-Un compuesto segun la reivindicaci6n 1, para su utilizaci6n segun la reivindicaci6n 1, caracterizado porque en la f6rmula I, A representa junto con B un enlace doble, C representa junto con D un enlace carbono-carbono, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R1 o R6, o una de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables, para su utilizaci6n como medicamento.

   5 5.-Un compuesto segun la reivindicaci6n 1, para su utilizaci6n segun la reivindicaci6n 1, caracterizado porque en la f6rmula I A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C representa junto con D un enlace carbonocarbono, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1, o una de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables, para su utilizaci6n como medicamento.
5. 6.-Un compuesto segun la reivindicaci6n 1, para su utilizaci6n segun la reivindicaci6n 1, caracterizado porque en la

   10 f6rmula I E representa junto con F un enlace carbono-carbono, C, D, A, B, representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R1, o una de sus sales de adici6n con los acidos farmaceuticamente aceptables, para su utilizaci6n como medicamento.
6. 7.-Utilizaci6n de un compuesto de f6rmula I

   15 en que X representa un grupo = N-OH o un atomo de oxigeno, y R representa un grupo elegido entre

   A representa un atomo de hidr6geno o junto con B un enlace carbono-carbono, B representa un atomo de hidr6geno, un grupo hidroxi o junto con A un enlace carbono-carbono, C representa un atomo de hidr6geno o junto con D un enlace carbono-carbono,

   20 D representa un atomo de hidr6geno o junto con C un enlace carbono-carbono, E representa un atomo de hidr6geno o junto con F un enlace carbono-carbono, F representa un atomo de hidr6geno o junto con E un enlace carbono-carbono, o una de sus sales de adici6n con

   los acidos farmaceuticamente aceptables, para la obtenci6n de un medicamento destinado a ser utilizado como neuroprotector. 25 8.-Utilizaci6n, segun la reivindicaci6n 7 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.
7. 9.-Utilizaci6n, segun la reivindicaci6n 7 u 8 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa elegida entre la enfermedad de Huntington, enfermedades cr6nicas neurodegenerativas, hereditarias o esporadicas, las lesiones neuronales vinculadas al envejecimiento, las neuropatias perifericas hereditarias o lesionales, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, las neuropatias diabeticas

   o inducidas por los tratamientos anticancerigenos, los traumatismos del cerebro, de los nervios perifericos o de la medula espinal, las isquemias del cerebro o de la medula espinal, las degeneraciones hereditarias, lesionales o vinculadas al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la visi6n o las degeneraciones del nervio 6ptico, las degeneraciones hereditarias, traumaticas o vinculadas al envejecimiento de las neuronas sensoriales de la audici6n, las atrofias lobares y las demencias vasculares, las enfermedades y traumatismos vinculados a la degeneraci6n de las motoneuronas, las amiotrofias espinales, la esclerosis en placas y los traumatismos de la medula espinal o de los nervios motrices perifericos.
8. 10.-Utilizaci6n segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa elegida entre las patologias o traumatismos vinculados a la degeneraci6n o a la muerte de las neuronas, en mamiferos alcanzados de tales patologias o traumatismos.
9. 11.-Utilizaci6n segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de las amiotrofias espinales infantiles.
10. 12.-Utilizaci6n segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de las esclerosis laterales amiotr6ficas.
11. 13.-Utilizaci6n, segun la reivindicaci6n 7 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de la sensibilidad dolorosa o de los dolores neuropaticos cr6nicos.
12. 14.-Utilizaci6n, segun la reivindicaci6n 7 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de las lesiones traumaticas del sistema nervioso.
13. 15.-Utilizaci6n, segun la reivindicaci6n 7 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento de las epilepsias sensibles a los esteroides, los desordenes del sueno o la intoxicaci6n alcoh6lica.
14. 16.- Utilizaci6n, segun la reivindicaci6n 7 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento del aprendizaje cognoscitivo o los desordenes de la memoria.
15. 17.-Utilizaci6n, segun la reivindicaci6n 7 caracterizada porque el medicamento neuroprotector esta destinado al tratamiento del ansiedad o de la depresi6n.
16. 18.-Utilizaci6n segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17caracterizada porque el compuesto de f6rmula I segun la reivindicaci6n 1 es la oxima de colest-4-en-3-ona.
17. 19.-Un compuesto que responde a la f6rmula I

    en la cual X representa un radical =N-OH y -A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1, o -A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C, D representan un atomo de hidr6geno, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R2 o R4, o -A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C representa junto con D un enlace carbonocarbono, E, F representan un atomo de hidr6geno y R tiene el mismo significado que R6, o -A representa junto con B un enlace carbono-carbono, C representa junto con D un enlace carbonocarbono, E representa junto con F un enlace carbono-carbono y R tiene el mismo significado que R1, asi como sus sales de adici6n con los acidos minerales u organicos.
18. 20.-Una composici6n farmaceutica caracterizada porque contiene como principio activo uno al menos de los medicamentos tales como se definen en la reivindicaci6n 1, asi como un excipiente farmaceuticamente aceptable.
19. 21.-Una composici6n farmaceutica caracterizada porque contiene como principio activo uno al menos de los medicamentos tales como se definen en la reivindicaci6n 2 asi como un excipiente farmaceuticamente aceptable.
20. 22.-Una composici6n farmaceutica caracterizada porque contiene como principio activo uno al menos de los medicamentos tales como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, asi como un excipiente farmaceuticamente aceptable.
21. 23.-Una composici6n farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, caracterizada porque el excipiente farmaceuticamente aceptable es al menos un aceite vegetal o animal.