ES2387841T3 - Interacciones proteína-proteína para realización de perfiles farmacológicos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para efectuar la retirada de un compuesto de ensayo con propiedades no deseables,comprendiendo dicho procedimiento el análisis de dicho compuesto de ensayo que tiene propiedades no deseablescontra un panel de ensayos de complementación de fragmentos proteicos a base de células, comprendiendo dichopanel dos o más ensayos de complementación de fragmentos proteicos de alto contenido.

Description

Interacciones proteína-proteína para realización de perfiles farmacológicos

Antecedentes de la invención

El documento US 2004/063088 desvela procedimientos para analizar el efecto de un agente biológicamente activo 5 en rutas celulares para establecer conjuntos de datos de biomapas, que comprenden el uso de ELISA basados en células en un panel de combinaciones de ensayo.

El concepto de fármacos selectivos ha dominado el descubrimiento y desarrollo de nuevos agentes terapéuticos durante el último siglo. Una molécula puede ser un agente terapéutico potencialmente útil si se puede demostrar que efectúa de forma selectiva un cambio en la fisiología celular actuando de una manera deseada en una diana dentro

10 de la rutas bioquímicas que subyacen a los procesos de interés. Sin embargo, incluso un compuesto químico extremadamente selectivo que se una a una diana terapéutica puede tener efectos completamente inesperados o “fuera de ruta” cuando se pone en contacto con una célula viva. Tale efectos pueden dar como resultado fallos preclínicos y clínicos caros. Para los fines de la presente invención, los inventores definen actividad “fuera de ruta” como cualquier actividad de un compuesto en una ruta distinta de la diana pretendida del compuesto.

15 La identificación de mecanismos de acción de fármacos y sus actividades fuera de ruta no puede conseguirse con ensayos enzimáticos debido a que no es factible preparar un ensayo para cada una de las decenas de miles de proteínas que representan el medio biológico. Para evaluar el modo de acción de un fármaco dentro de las complejas rutas bioquímicas que componen una célula viva, se necesita un medio para explorar las rutas directamente. Por lo tanto, los inventores buscaron una estrategia general para realización de perfiles

20 farmacológicos. En particular los inventores buscaron determinar si podrían usarse medidas cuantitativas de interacciones proteína-proteína para realizar los perfiles de la actividad farmacológica a gran escala.

Los antecedentes para la presente invención son como siguen. La unión de agonistas a receptores induce una cascada de acontecimientos intracelulares mediada por otras moléculas de señalización. Conceptualmente tales cascadas de señalización implican la asociación y disociación reguladas de proteínas dentro de complejos

25 macromoleculares. Además, el ensamblaje y desensamblaje de complejos proteína-proteína se produce de forma dinámica tras la adición de un agonista, antagonista o inhibidor de una ruta. Finalmente, el ensamblaje y desensamblaje de complejos proteína-proteína específicos se produce en localizaciones subcelulares particulares tales como la membrana celular, citoplasma, núcleo, mitocondria u otros compartimentos dentro de la célula.

La mayoría de los perfiles farmacológicos basados en células hasta la fecha se han realizado con micromatrices de

30 ADN (microplacas génicas o chips génicos). Las micromatrices de ADN han originado el campo de la toxicogenómica, que implica el uso de poblaciones complejas de ARNm para entender la toxicidad. Las células, o animales completos, se tratan con fármacos; se aísla ARN mensajero de la célula o tejido; y se comparan los patrones de expresión génica del ARNm en ausencia y presencia de un fármaco. Tal realización de perfiles transcripcionales puede revelar diferencias entre compuestos, cuando los compuestos afectan a la actividad

35 transcripcional en última instancia de una o más rutas. La identificación de rutas específicas que se estimulan o reprimen en respuesta a condiciones o tratamientos específicos es una forma útil de comenzar a desentrañar los mecanismos celulares de enfermedad y respuesta a fármaco. Sin embargo, los cambios en el nivel de moléculas de ARNm individuales no siempre se correlacionarán directamente con el nivel de actividad de la proteína correspondiente en un punto temporal sencillo. Además, muchas proteínas experimentan numerosas modificaciones

40 post-traduccionales e interacciones proteicas, que pueden afectar a las funciones y actividades de las proteínas dentro de un tejido o célula. Por lo tanto, simplemente identificar todas las especies de ARNm presentes y los niveles a los que están presentes en un momento particular, puede no producir la imagen completa de un fármaco particular. Finalmente, un fármaco diana puede afectar a la transcripción de docenas de genes, haciendo la interpretación de los resultados de experimentos de microplacas génicas una tarea ardua.

45 La regulación de respuestas celulares está mediada por un cierto número “umbral” de interacciones moleculares que con el tiempo alcanzan el núcleo celular e inducen que el aparato génico de la célula sintetice proteínas de nueva expresión en respuesta a los estímulos iniciales. Los ensayos de gen indicador acoplan la actividad biológica de una diana con la expresión de una enzima fácilmente detectada o indicador proteico, permitiendo controlar los acontecimientos celulares asociados con la transducción de señales y expresión génica. Basándose en la fusión de

50 elementos de control transcripcionales con una diversidad de genes indicadores, estos sistemas “indican” los efectos de una cascada de acontecimientos de señalización en la expresión génica dentro de las células. Pueden insertarse repeticiones sintéticas de un elemento de respuesta particular corriente arriba del gen indicador para regular su expresión en respuesta a moléculas de señalización generadas por activación de una ruta específica en una célula viva. Se ha demostrado que tales ensayos son útiles en exploración primaria y secundaria de bibliotecas químicas y

55 candidatos a fármaco por sus efectos biológicos y se han usado paneles de ensayos indicadores de transcripción para realizar el perfil de la actividad farmacológica (Bionaut, Inc.). Aunque los ensayos indicadores de transcripción tienen la capacidad de proporcionar información sobre la respuesta de una ruta para agentes químicos, tales ensayos solamente miden la consecuencia de la activación o inhibición de la ruta, y no el sitio de acción del compuesto.

Las medidas directas de acontecimientos específicos dentro de la ruta de señalización eliminarían los problemas asociados con la interpretación de los perfiles de transcripción. A diferencia de los ensayos indicadores de transcripción, la información obtenida por control de una interacción proteína-proteína refleja el efecto de un fármaco en una rama particular o nodo de una ruta de señalización celular, no su punto final. Por ejemplo, la estimulación de una ruta por un agonista podría conducir a un aumento de la asociación de una proteína intracelular (tal como una quinasa) con un compañero de unión afín (tal como un sustrato). La estimulación da como resultado la fosforilación de sustrato por la quinasa. El efecto farmacológico podría por lo tanto ensayarse cuantificando la fosforilación de sustrato o la cantidad o localización del complejo quinasa/sustrato en ausencia y presencia del agonista. En este ejemplo el complejo quinasa/sustrato actúa como un centinela de la actividad de la ruta. Un fármaco que actúe al comienzo de la ruta (tal como un antagonista de receptor) o que actúe en otra diana corriente abajo del receptor podría alterar la cantidad o localización o estado de modificación del complejo quinasa/sustrato dentro de la célula. Por lo tanto, la evaluación del complejo quinasa/sustrato en ausencia o presencia de un compuesto químico revelaría si el compuesto químico actúa o no en esa ruta. Idealmente tales cambios se medirían en células intactas. Es decir, se tratarían células de interés con el compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo definido y el centinela de ruta o la interacción se evaluarían en la célula intacta (viva o fijada).

Los ensayos de alto contenido son particularmente prometedores puesto que son capaces de diferenciar acontecimientos que se producen en el nivel subcelular. Las rutas se organizan con frecuencia en gran medida en el espacio subcelular, con receptores de membrana que reciben señales en la membrana plasmática y transmiten esas señales al núcleo celular, dando como resultado la activación o represión de transcripción génica. Con ensayos de alto contenido, las señales de fluorescencia en la membrana, citosol, núcleo y otros compartimentos subcelulares puede diferenciarse. Tales ensayos pueden realizarse por microscopía automática permitiendo la producción de cientos de placas microwell por día, haciendo el enfoque práctico en una escala de moderada a grande.

Con la excepción del trabajo de los inventores citado posteriormente y en las referencias del presente documento (Michnick y col.) la técnica anterior no menciona el uso de interacciones proteína-proteína para realización de perfiles farmacológicos. Además la técnica anterior no menciona el uso de ensayos de alto contenido para realización de perfiles farmacológicos y la retirada del candidato.

Están disponibles varios procedimientos para la cuantificación de interacciones proteína-proteína. Para los fines de la presente invención los inventores se han centrado en procedimientos que permiten la cuantificación y/o localización de complejos proteína-proteína en células vivas reconociendo a la vez que procedimientos adicionales, tales como polarización de fluorescencia, son adecuados para la medición de acontecimientos de unión. Los procedimientos basados en células disponibles implican ensayos fluorescentes o bioluminiscentes de interacciones proteína-proteína e incluyen transferencias de energía por resonancia (FRET o BRET), complementación de subunidad enzimática y ensayos de complementación proteína-fragmento (PCA). Se entenderá por un experto en la materia que la presente invención no se limita a la metodología de ensayo exacta que se selecciona, al procedimiento de detección o a instrumentación particular. La presente invención enseña que las interacciones proteína-proteína pueden usarse para realización de perfiles farmacológicos independientemente de la tecnología o instrumentación particular aplicados siempre que la tecnología sea suficientemente sensible y robusta para los fines del ensayo.

Los ensayos de interacción proteína-proteína basados en células fluorescentes más extendidos se basan en el fenómeno de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) o transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (FRET). En un ensayo de FRET los genes de dos indicadores fluorescentes diferentes, capaces de experimentar FRET se fusionaron de forma separada con genes codificantes de interés, y las proteínas de fusión se co-expresan en células vivas. Cuando se forma un complejo proteico entre las proteínas de interés, los fluoróforos se acercan si las dos proteínas poseen emisión y excitación solapantes, emisión de fotones por un primer fluoróforo “donador”, da como resultado la absorción eficaz de los fotones emitidos por el segundo fluoróforo “aceptor”. El par de FRET fluoresce con una combinación única de longitudes de onda de excitación y emisión que pueden distinguirse de las de cada fluoróforo por sí sólo en células vivas. Como ejemplos específicos, se ha usado una diversidad de mutantes GFP en ensayos de FRET, incluyendo proteínas fluorescentes cian, citrina, verde potenciada y azul potenciada. Con BRET se usa una proteína luminiscente, por ejemplo la enzima luciferasa de Renilla (RLuc), como un donador y una proteína verde fluorescente (GFP) se usa como una molécula aceptora. Tras la adición de un compuesto que actúa como el sustrato para Rluc, la señal de FRET se mide comparando la cantidad de luz azul emitida por Rluc con la cantidad de luz verde emitida por GFP. La relación de verde y azul aumenta a medida que las dos proteínas se acercan. Se están desarrollando nuevos procedimientos para permitir la deconvolución de FRET de calado y de autofluorescencia. Además, la microscopía de captura de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) elimina muchos de los artefactos asociados con la cuantificación de intensidad de FRET simple.

Se han construido diversos ensayos basándose en la actividad de beta-galactosidasa de tipo silvestre o en el fenómeno de complementación alfa u omega. Beta-gal es una enzima multimérica que forma tetrámeros y complejos octoméricos de hasta 1 millón de Dalton. Las subunidades de Beta-gal experimentan auto-oligomerización que conduce a actividad. Este fenómeno de origen natural se ha usado para desarrollar una diversidad de ensayos homogéneos in vitro que son el objeto de más de 30 patentes. La complementación alfa u omega de beta-gal que se presentó por primera vez en 1965, se ha usado para desarrollar ensayos para la detección de interacciones

anticuerpo-antígeno, fármaco-proteína, proteína-proteína y otras biomoleculares. La actividad de fondo debido a la auto-oligomerización se ha superado en parte por el desarrollo de subunidades mutantes de baja afinidad con una capacidad reducida o insignificante para complementar de forma natural, lo que permite diversos ensayos incluyendo por ejemplo la detección de actividad dependiente de ligando del receptor EGF en células vivas.

PCA representa un procedimiento particularmente útil para mediciones de la asociación, disociación o localización de complejos proteína-proteína dentro de la célula. PCA permite la determinación y cuantificación de la cantidad y localización subcelular de complejos proteína-proteína en células vivas. Con PCA, las proteínas se expresan como fusiones con fragmentos polipeptídicos obtenidos por ingeniería genética, en los que los fragmentos polipeptídicos en sí mismos (a) no son restos fluorescentes o luminiscentes; (b) no son de origen natural; y (c) se generan por fragmentación de un indicador. Michnick y col. (documento US 6.270.964) enseñaron que cualquier proteína indicadora de interés puede usarse para PCA, incluyendo cualquiera de los indicadores descritos anteriormente. Por lo tanto, los indicadores adecuados para PCA incluyen, pero sin limitación cualquiera de varias enzimas y proteínas fluorescentes, luminiscentes o fosforescentes. Se prefieren proteínas monoméricas pequeñas para PCA, incluyendo enzimas monoméricas y proteínas fluorescentes monoméricas, dando como resultado fragmentos pequeños (�150 aminoácidos). Puesto que puede fragmentarse cualquier proteína indicadora usando los principios establecidos por Michnick y col., pueden adaptarse ensayos a las demandas particulares del tipo celular, diana, proceso de señalización e instrumentación de elección. Finalmente, la capacidad de elegir entre una amplia serie de fragmentos indicadores permite la construcción de señales fluorescentes, luminiscentes, fosforescentes o detectables de otro modo; y la selección de formatos de ensayo de alto contenido o alto rendimiento, permitiendo diversos ensayos incluyendo por ejemplo la detección de activación dependiente de ligando del receptor de eritropoyetina en células vivas.

Se han usado ensayos fluorescentes de interacciones proteína-proteína de forma individual para detectar efectos farmacológicos en las dianas individuales, incluyendo receptores y otras dianas intracelulares. Por ejemplo, los inventores han usado PCA para construir ensayos de exploración de alto rendimiento fluorescentes basados en

células basándose en el complejo NFkappaB (p65/p50) (Yu y col.). Sin embargo, la técnica anterior no menciona el uso de paneles de tales ensayos para realización de perfiles farmacológicos.

En el proceso de realización de la presente invención los inventores ensayaron tres hipótesis. La primera hipótesis fue que los ensayos de alto contenido, y en particular mediciones dinámicas cuantitativas de complejos proteínaproteína específicos dentro de rutas específicas permitirían una evaluación de la activación e inhibición de esas rutas por un compuesto químico o agente. La segunda hipótesis fue que podrían producirse dos tipos acontecimientos dinámicos en respuesta a la activación de ruta: un aumento o reducción de la cantidad de un complejo específico y/o la translocación de un complejo proteína-proteína particular de un compartimento subcelular a otro. La tercera hipótesis fue que la cuantificación y localización de un número y diversidad de complejos proteicos distintos dentro de las células vivas permitirían la realización de un perfil farmacológico a una escala global, en toda la célula.

Al realizar la presente invención, se usaron ensayos basados en células para controlar la asociación y disociación dinámica de proteínas en ausencia o presencia de compuestos químicos. Aunque cualquiera de los procedimientos fluorescentes o luminiscentes anteriormente mencionados es adecuado para su uso junto con la presente invención, los inventores eligieron usar una estrategia de ensayo de complementación de fragmento-proteína (PCA). Los inventores crearon paneles de ensayos fluorescentes cuantitativos para interacciones proteína-proteína distintas en células vivas y ensayaron las actividades de más de 100 fármacos conocidos frente a los paneles de ensayo. Los inventores demuestran que el patrón de respuestas o “perfiles farmacológicos” detectados por los cambios de intensidad y/o localización física del par de centinelas está relacionado con el mecanismo de acción, especificidad y efectos fuera de ruta del fármaco que se ensaya.

Objetos y ventajas de la invención

Es objeto de la presente invención permitir la retirada de candidatos farmacológicos con efectos tóxicos o no deseables.

Está relacionado con ello el establecimiento de perfiles de seguridad pre-clínicos para nuevos candidatos farmacológicos, para mejorar la eficacia del descubrimiento de fármacos identificando efectos adversos, tóxicos u otros fuera de ruta antes de ensayos clínicos para mejorar la seguridad de fármacos de primera categoría identificando efectos adversos, tóxicos u otros fuera de ruta antes de los ensayos clínicos, para proporcionar procedimientos adecuados para el desarrollo de “fármacos de diseño” con propiedades para pre-determinadas para permitir la identificación de nuevas indicaciones terapéuticas para fármacos conocidos, para permitir la identificación de las rutas bioquímicas que subyacen en la toxicidad farmacológica, o para permitir la identificación de las rutas bioquímicas que subyacen en la eficacia farmacológica para una amplia serie de enfermedades.

La presente invención tiene la ventaja de ser ampliamente aplicable a cualquier ruta, gen, biblioteca génica, clase de diana farmacológica, proteína indicadora, modo de detección, producto sintético o natural, entidad química, formato de ensayo, instrumentación automática o tipo celular de interés.

Sumario de la invención

La presente invención busca satisfacer las necesidades anteriormente mencionadas de descubrimiento farmacéutico. La presente invención enseña que pueden usarse ensayos basados en células para identificar el mecanismo de acción, selectividad y efectos adversos o fuera de ruta de agentes farmacológicamente activos. La presente invención proporciona una estrategia general para llevar a cabo análisis farmacológico y realización de perfiles farmacológicos con ensayos basados en células, en particular ensayos de interacción proteína-proteína. Además, la presente invención proporciona una amplia serie de procedimientos útiles y composiciones para cumplir estos objetivos.

Las respuestas celulares están mediadas por una compleja red de proteínas que residen dentro de los compartimentos subcelulares. La proliferación celular, muerte celular (apoptosis), quimiotaxis, metástasis, etc., se controlan todas al nivel de las proteínas que participan en interacciones proteína-proteína. El objeto de la presente invención es una metodología que permita el análisis cuantitativo de los efectos de compuestos químicos en las redes bioquímicas. La presente invención permite un análisis de los efectos de cualquier compuesto químico independientemente de la clase de fármaco o la clase de diana.

La nueva metodología de la presente invención permite: (1) Visualización directa de la arquitectura molecular de respuestas celulares específicas al nivel de las interacciones proteína-proteína discretas que permiten dicha arquitectura celular; (2) Análisis directo y cuantitativo de efectos farmacológicos en redes de señalización celular de una manera nunca antes posible; y (3) La creación de perfiles farmacológicos cuantitativos y predictivos de compuestos candidatos y fármacos independientemente de su mecanismo de acción.

Una realización preferida de la invención usa un gen o genes que codifican proteínas específicas de interés; preferentemente como ADNc de longitud completa caracterizados. La metodología no se limita, sin embargo, a clones de longitud completa puesto que también pueden emplearse ADNc parciales o dominios proteicos. Los ADNc, marcados con un indicador o fragmento de indicador que permiten la medición de una interacción proteínaproteína se insertan en un vector de expresión adecuado y las proteínas de fusión se expresan en una célula de interés. Sin embargo, pueden usarse genes celulares endógenos marcando el genoma con indicadores o fragmentos de indicadores, por ejemplo por recombinación no homóloga. En el último caso, las proteínas nativas se expresan junto con los marcadores indicadores seleccionados permitiendo la detección de complejos proteínaproteína nativos.

El procedimiento requiere un procedimiento para medir interacciones proteína-proteína y/o un procedimiento de ensayo de alto contenido equivalente para un centinela de ruta. En una realización preferida, se miden interacciones proteicas dentro de una célula. Tales procedimientos pueden incluir pero sin limitación, FRET, BRET, procedimientos de dos híbridos o tres híbridos, procedimientos de complementación de subunidad enzimática y complementación proteína-fragmento (PCA). En realizaciones alternativas, las interacciones se miden en secciones tisulares, lisados celulares o extractos celulares o extractos biológicos. En los últimos casos, puede emplearse una amplia diversidad de procedimientos analíticos para la medición de complejos proteína-proteína, por ejemplo, inmunohistoquímica, transferencia de western, inmunoprecipitación seguida de electroforesis en gel bidimensional; espectroscopia de masas; unión de ligando; puntos cuánticos u otras sondas; u otros procedimientos bioquímicos para cuantificar los complejos proteína-proteína específicos. Tales procedimientos se conocen bien por los expertos en la materia. Debería enfatizarse que no es necesario aplicar una tecnología sencilla a la medición de las diferentes interacciones proteína-proteína. Puede combinarse cualquier variedad o tipo de ensayos cuantitativos para su uso con la presente invención.

Son realizaciones preferidas para la presente invención los procedimientos de complementación de fragmentos enzimáticos y complementación de fragmentos proteicos. Estos procedimientos permiten la cuantificación y localización subcelular de complejos proteína-proteína en células vivas.

Con la complementación de fragmentos enzimáticos, las proteínas se expresan como fusiones con subunidades enzimáticas tales como las subunidades de origen natural o mutantes alfa/beta de beta-galactosidasa. Con PCA, las proteínas se expresan como fusiones con fragmentos polipeptídicos sintéticos, en los que los fragmentos polipeptídicos en sí mismos (a) no son restos fluorescentes o luminiscentes; (b) no son de origen natural; y (c) se generan por fragmentación de un indicador. Michnick y col. (documento US 6.270.964) enseñaron que cualquier proteína indicadora de interés puede usarse en PCA, incluyendo cualquiera de los indicadores descritos anteriormente. Por lo tanto, los indicadores adecuados para PCA incluyen, pero sin limitación, cualquiera de varias enzimas y proteínas fluorescentes, luminiscentes o fosforescentes. Se prefieren proteínas monoméricas pequeñas para PCA incluyendo enzimas monoméricas y proteínas fluorescentes monoméricas, lo que da como resultado fragmentos pequeños ( 150 aminoácidos). Puesto que cualquier proteína indicadora puede fragmentarse usando los principios establecidos por Michnick y col., pueden adaptarse ensayos a las necesidades particulares del tipo celular, diana, procedimiento de señalización e instrumentalización de elección. Finalmente, la capacidad de elegir entre una amplia serie de fragmentos indicadores permite la construcción de señales fluorescentes, luminiscentes, fosforescentes o detectables de otro modo; y la selección de formatos de ensayo de alto contenido o alto rendimiento.

Como se ha mostrado anteriormente, los fragmentos polipeptídicos obtenidos por ingeniería genética para PCA no son individualmente fluorescentes o luminiscentes. Esta característica de PCA lo distingue de otras invenciones que implican marcaje de proteínas con moléculas fluorescentes o luminóforos, tales como el documento US 6.518.021 (Thastrup y col.) en los que las proteínas se marcan con GFP u otros luminóforos. Un fragmento de PCA no es un luminóforo y no permite el control de la redistribución de una proteína individual. Por el contrario, lo que se mide con PCA es la de formación de un complejo entre dos proteínas.

La presente invención no se limita al tipo de célula, fluido biológico o extracto seleccionado para el análisis. El tipo celular puede ser una célula de mamífero, célula humana, bacteria, levadura, hongo o cualquier otro tipo celular de interés. La célula también puede ser una línea celular, o una célula primaria, tal como un hepatocito. La célula puede ser un componente de un tejido intacto o animal, o en el cuerpo completo, tal como en un explante o xenotransplante; o puede aislarse de un fluido u órgano biológico. Por ejemplo, la presente invención puede usarse en bacterias para identificar agentes antibacterianos que bloquean rutas clave; en células fúngicas para identificar agentes antifúngicos que bloquean rutas clave, la presente invención puede usarse en células de mamífero o humanas para identificar agentes que bloquean rutas relacionadas con enfermedad y no tienen efectos adversos o fuera de ruta. La presente invención puede usarse junto con descubrimiento de fármacos para cualquier enfermedad de interés incluyendo cáncer, diabetes, enfermedad cardiovascular, inflamación, enfermedades neurodegenerativas y otras enfermedades crónicas o agudas que aquejan al ser humano.

La presente invención puede usarse en células vivas o tejidos en cualquier medio, contexto o sistema. Esto incluye células en cultivo, órganos en cultivo, y en organismos vivos. Por ejemplo, la presente invención puede usarse en organismos modelo tales como Drosófila o pez cebra. La presente invención también puede usarse en ratones desnudos, por ejemplo, células humanas que expresan proteínas marcadas, tales como con “PCA dentro”, pueden tratarse como xenotransplantes en ratones desnudos y administrarse un fármaco u otro compuesto al ratón. Las células pueden después volver a extraerse del implante o pueden tomarse imágenes del ratón completo usando sistemas de captura de imágenes de animal vivo tales como los proporcionados por Xenogen (Alameda, California). Además, la presente invención puede usarse en animales transgénicos en los que las fusiones de proteínas que representan las interacciones proteína-proteína para analizar residen en el genoma del animal transgénico.

Puede analizarse cualquier tipo de compuesto químico con los procedimientos proporcionados en el presente documento. Tales compuestos incluyen moléculas sintéticas, productos naturales, bibliotecas combinatorias, fármacos conocidos o potenciales, ligandos, anticuerpos, péptidos, ARN pequeños de interferencia (ARNpi), o cualquier otro agente químico cuya actividad se desee ensayar. Puede usarse aciertos de exploración de campañas exploración de biblioteca combinatoria u otras de exploración de alto rendimiento junto con la presente invención. La invención puede usarse para identificar los compuestos con propiedades más deseables en comparación con los compuestos con propiedades menos deseables. Por lo tanto la presente invención es adecuada para su uso en optimización y/o retirada de compuestos candidatos con atributos inesperados, indeseables o tóxicos.

La realización preferida es un formato de ensayo de alto contenido. En el caso de un aumento o reducción de la cantidad de un complejo proteína-proteína en respuesta a un agente químico, puede cuantificarse la señal fluorescente o luminiscente en bruto. En el caso de un desplazamiento en la localización subcelular de un complejo proteína-proteína en respuesta a fármaco, se toman imágenes de células individuales y se detecta la señal que surge del complejo proteína-proteína y su localización subcelular. Se proporcionan en el presente documento múltiples ejemplos de estos acontecimientos. Algunos procedimientos e indicadores estarán mejor adaptados a diferentes situaciones. Con PCA, una selección de indicadores permite la cuantificación y localización de complejos proteína-proteína. Los indicadores particulares pueden ser más o menos óptimos para diferentes tipos celulares y para diferentes complejos proteína-proteína.

Un experto en la materia se dará cuenta que, en muchos casos, la cantidad de un complejo proteína-proteína aumentará o se reducirá como consecuencia de un aumento o reducción de las cantidades de las proteínas individuales en el complejo. De forma similar, la localización subcelular de un complejo proteína-proteína puede cambiar como consecuencia de un desplazamiento de la localización subcelular de las proteínas individuales en el complejo. En tales casos, el complejo o los componentes individuales del complejo pueden evaluarse y los resultados serán equivalentes. Pueden construirse ensayos de alto contenido para centinelas de ruta individual (proteínas) marcando las proteínas con un fluoróforo o un luminóforo, tal como un proteína verde fluorescente (GFP) que está ligada operativamente con la proteína de interés; o por procedimientos de auto-marcaje más nuevos que incluyen marcadores SNAP y marcadores Halo (Invitrogen, BioRad); o aplicando procedimientos de immunofluorescencia, que se conocen bien por los expertos en la materia de biología celular, usando anticuerpos específicos de proteína o específicos de modificación proporcionados por Cell Signaling Technologies, Becton Dickinson, y muchos otros proveedores. Tales procedimientos y reactivos pueden usarse junto con las interacciones proteína-proteína proporcionadas en el presente documento. En particular, pueden usarse proteínas individuales, incluyendo las enumeradas en las Tablas 1-2, para construir ensayos de alto contenido para realización de perfiles farmacológicos de acuerdo con la presente invención.

También se proporcionan en el presente documento estrategias y procedimientos para detectar los efectos de compuestos de ensayo en rutas modulables en células. La estrategia de modulación de ruta puede aplicarse a realización de perfiles farmacológicos junto con cualquier tipo celular y con cualquier parámetro medible o formato

de ensayo. Mientras que los compuestos de ensayo pueden no tener efecto significativo en condiciones basales, sus efectos pueden detectarse tratando una célula con el compuesto de ensayo y después con un modulador de ruta. Esta estrategia mejora la sensibilidad de la invención. Por ejemplo, en algunos casos un compuesto de ensayo puede no tener efectos en condiciones basales, pero puede tener un efecto pronunciado en condiciones en las que una ruta se activa o suprime. Se muestran ejemplos de la estrategia de modulación de ruta en el presente documento para rutas GPCR (+isoproterenol), rutas de citocinas (+TNF) y rutas de respuesta a daño de ADN (+camptotecina). Puede activarse o suprimirse cualquier variedad de rutas celulares por moduladores conocidos, que pueden usarse para mejorar la sensibilidad de los perfiles farmacológicos.

Los procedimientos y ensayos proporcionados en el presente documento pueden realizarse en formatos de multipocillos, en placas de microtitulación, en formatos de puntos múltiples, o en matrices, permitiendo flexibilidad en el formato del ensayo y miniaturización. Las selecciones de formatos de ensayo y modos de detección se determinan por la biología del proceso y las funciones de las proteínas dentro del complejo que se analiza. Debería observarse que en cualquiera de los casos las composiciones que son el objeto de la presente invención pueden leerse con cualquier instrumento que sea adecuado para detección de la señal que se genera por el indicador seleccionado. Las señales luminiscentes, fluorescentes o bioluminiscentes se detectan fácilmente y se cuantifican con uno cualquiera de una diversidad de sistemas de instrumentación de alto rendimiento y/o automáticos incluyendo lectores de placa multipocillo de fluorescencia, separadores de célula activados por fluorescencia (FACS) y sistemas de captura de imágenes basados en células automáticos que proporcionan resolución especial de la señal. Se ha desarrollado una diversidad de sistemas de instrumentación para automatizar HCS incluyendo los sistemas de microscopía automática y de captura de imágenes de fluorescencia automáticos desarrollados por Cellomics, Amersham, TTP, Q3DM (Beckman Coulter), Evotec, Universal Imaging (Molecular Devices) y Zeiss. También se ha usado la recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueado (FRAP) y microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo para estudiar la movilidad de proteínas en células vivas. La presente invención también puede usarse junto con los procedimientos descritos en los documentos US 5.989.835 y US 6.544.790.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el objetivo de la presente invención. Las redes bioquímicas que controlan el comportamiento celular se representan como un diagrama de circuito. Los fármacos y compuestos químicos tienen efectos tanto conocidos (pretendidos) como desconocidos (no pretendidos) dentro de las células. Las interacciones proteínaproteína, o complejos, representan elementos binarios dentro de las redes bioquímicas que pueden explorarse para identificar efectos conocidos o desconocidos de fármacos y compuestos candidatos. La Figura 2 proporciona ejemplos de proteínas intracelulares que forman complejos proteína-proteína. Prácticamente cada proteína en la célula forma complejos con una o más otras proteínas u otras macromoléculas, y ejerce su actividad en el contexto de estos complejos macromoleculares. Los ejemplos de proteínas que forman complejos, para las que pueden construirse ensayos, incluyen receptores (de membrana, citosólicos o nucleares), canales iónicos, proteínas adaptadoras, quinasas, fosfatasas, proteasas, proteínas de unión a nucleótidos y factores de intercambio de nucleótidos, enzimas biosintéticas o catabólicas, chaperonas, factores de intercambio y proteínas de transporte, la maquinaria apoptótica, citoesquelética y de ciclo celular, armazones y proteínas estructurales, el citoesqueleto y otros elementos estructurales y factores de transcripción. La Figura 3 muestra las redes intercelulares relacionadas con el concepto para efectos farmacológicos y para perfiles farmacológicos. (A) Las redes de señalización bioquímica están comprendidas por módulos o grupos de interacciones proteína-proteína relacionadas funcionalmente. Se representan tres módulos teóricos como diagramas de esferas y barras (Módulos A, B y C).las esferas representan interacciones proteicas que están conectadas entre módulos por líneas. La transmisión de señal entre Módulo A y Módulo B se produce mediante el complejo sombreado en azul. Cada proteína en un complejo constituye un ensayo potencial para controlar la actividad farmacológica corriente arriba. Los tono de rojo y verde representan ensayos seleccionados para explorar la respuesta del módulo a fármacos A-C. Los complejos proteicos que se reducen en respuesta a un tratamiento farmacológico particular se sombrean en rojo y los que aumentan la respuesta a un tratamiento farmacológico particular se sombrean en verde. (B) Una matriz que representa los patrones cuantitativos resultantes de inhibición (tonos relativos de rojo) y activación (tonos relativos de verde) para diversos fármacos (en el eje x) frente a ensayos individuales (en el eje y). Los fármacos en la categoría A (DA) tienen un efecto inhibidor en el módulo A que se transmite al módulo B. Por lo tanto los cuatro ensayos que representan módulo A así como los que representan el módulo B, redujeron la actividad. Los fármacos en la categoría B (DB) tienen un efecto inhibidor en los ensayos de módulo B solamente, mientras que los fármacos de la categoría C (DC) tienen un efecto estimulador en los ensayos de módulo C solamente. La Figura 4 representa las etapas básicas en la realización de perfiles farmacológicos. La Figura 5 muestra un sistema de alto rendimiento para realización de perfiles farmacológicos. El procedimiento completo puede automatizarse en formatos de placas de microtitulación o matrices.

Los fármacos pueden analizarse en diferentes puntos temporales después de su adición a células, para obtener estudio de las dinámicas de acción farmacológicas. Las imágenes se convierten a resultados numéricos y los datos numéricos pueden almacenarse en una base de datos relacional y analizarse por cualquier variedad de rutinas gráficas, numéricas o estadísticas.

La Figura 6A es un esquema publicado de rutas de GPCR. Los receptores acoplados a proteína G y sus interactores corriente abajo forman complejos proteína-proteína que pueden explorarse en células intactas. La Figura 6B muestra ejemplos de complejos proteicos en rutas de GPCR en células humanas intactas como se evalúa por PCA. La señal de fluorescencia refleja la cantidad y localización subcelular de cada complejo proteína-proteína (verde); los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Refiérase a las Tablas 1-3 y el protocolo experimental para detalles del ensayo mostrado aquí. Tales ensayos pueden usarse en la realización de perfiles farmacológicos. La Figura 7A es un esquema publicado de interacciones en las rutas de ubiquitina-proteasoma y ciclo celular. Tales rutas pueden explorarse con interacciones proteína-proteína. La Figura 7B muestra ejemplos de complejos proteicos en la ruta de ubiquitilación, sumoilación y/o proteasoma. Se muestran interacciones directas de proteínas con ubiquitina o SUMO, así como interacciones de ligasas de E3 y SUMO con sustratos como se evalúa por PCA. Tales ensayos pueden usarse para detectar los efectos de compuestos químicos en estas rutas y pueden construirse para muchas otras proteínas. La Figura 7C muestra que el inhibidor de proteasoma, ALLN, provoca la acumulación de complejos proteínaproteína que se sabe que están controlados por el proteasoma; este efecto de ALLN es por lo tanto un efecto esperado o “en ruta” del agente. Los agentes que inhiben, activan o potencian estas rutas pueden identificarse con estos ensayos. La Figura 8A es un esquema publicado de interacciones en rutas de señalización, incluyendo interacciones de diversas quinasas con otras proteínas. La Figura 8B muestra ejemplos de interacciones entre quinasas y otras proteínas en células intactas como se evalúa por PCA. Tales ensayos pueden construirse para muchas otras quinasas y proteínas de señalización y pueden usarse para detectar los efectos de compuestos químicos nuevos o conocidos en estas rutas. La Figura 8C muestra efectos esperados de inhibidores de quinasa “corriente arriba” o complejos “corriente abajo”. Wortmanina y Ly294002 son inhibidores de PI3K (fosfatidilinositol-3-quinasa) que está corriente arriba de PDK1 y AKT1. AKT1 es un sustrato de PDK1 y forma un complejo con PDK1. El tratamiento celular con inhibidores de PI3K da como resultado pérdida de PDK1/AKT1 en la membrana celular y una relocalización del complejo al citosol, como se muestra en las imágenes. Se producen cambios en un periodo de minutos desde la adición del fármaco; se tomaron imágenes a los 90 minutos. Las expresiones “corriente arriba” y “corriente abajo” se usan habitualmente para referirse a cascadas de señalización, en las que se producen acontecimientos en una secuencia temporal, precediendo un acontecimiento “corriente arriba” a un acontecimiento “corriente abajo”. La Figura 8D muestra los efectos de dos inhibidores de quinasa no selectivos diferentes, indirrubina-3’monoxima y BAY11-7082, en complejos Ras/Raf-1 en células HEK293. El número de complejos se reduce en un periodo de minutos desde el tratamiento farmacológico; las imágenes se tomaron a los 30 minutos. La Figura 9A es un esquema publicado de interacciones seleccionadas de chaperonas y co-chaperonas entre sí y con proteínas cliente. La Figura 9B muestra que el tratamiento de células con los inhibidores de HSP conocidos, geldanamicina o 17alilamino-geldanamicina (17-AAG) provoca una pérdida de complejos cliente-proteína. Aktl es una proteína cliente para HSP90. Se muestran efectos para Akt1/p27. Tales ensayos pueden usarse para evaluar los efectos de compuestos nuevos o conocidos en estas dianas y rutas. La Figura 10A es un esquema publicado de interacciones que implican receptores de hormonas nucleares. El agonista, rosiglitazona, induce la formación de complejos entre su receptor, PPARgamma, y un coactivador nuclear, en este caso RXRalfa. La Figura 10B muestra ejemplos de varias interacciones que implican receptores de hormonas nucleares. Como en los otros ejemplos mostrados en el presente documento, se construyeron ensayos usando PCA. Tales interacciones proteína-proteína pueden usarse para evaluar los efectos de compuestos conocidos o nuevos en estas rutas. La Figura 11A muestra un esquema publicado de interacciones en la ruta mitocondrial de la apoptosis. Las microfotografías muestran la interacción real de Bad/Bcl-xL en la mitocondria; la señal de PCA (verde) se colocaliza con una tinción mitocondrial (rojo) lo que demuestra que los complejos proteicos se localizan correctamente en la mitocondria. La Figura 11B muestra los efectos dinámicos de estaurosporina, un agente inductor de apoptosis, en cuatro interacciones proteicas diferentes. Las microfotografías de fluorescencia muestran la localización e intensidad de los complejos y los histogramas muestran la cuantificación de la señal basada en análisis de imagen cuantitativa. Tales interacciones proteína-proteína pueden usarse para evaluar los efectos de compuestos nuevos o conocidos en estas rutas. La Figura 12 (A-D) muestra imágenes de diferentes interacciones proteína-proteína con efectos farmacológicos representativos. Los detalles de las proteínas y fármacos usados están en la Tabla 1 y Tabla 4, respectivamente. Se muestran imágenes de fluorescencia de Hoechst (azul) e YFP (verde) (objetivo 40X). Para cada columna, el panel del lado izquierdo muestra el control (vehículo solamente) y nombra el complejo en texto blanco, y el panel del lado derecho muestra el efecto de fármaco/tiempo. Antes de la terminación del ensayo, los ensayos marcados “+CPT” se estimularon con camptotecina 500 nM durante 960 minutos, el ensayo marcado con “+ISO” se estimuló con isoproterenol 2 micromolar durante 30 minutos, y el ensayo marcado con “+TNFalfa” se estimuló con TNFalfa humano 50 ng/ml durante 20 minutos. El ensayo p50:p65 se muestra sin las imágenes de Hoechst nucleares para permitir la visualización de efectos farmacológicos en la localización subcelular del complejo. El uso de camptotecina, isoproterenol y TNFalfa para inducir rutas

particulares es un ejemplo de la estrategia de modulación de ruta proporcionada en la presente invención. La Figura 13A muestra ejemplos de efectos farmacológicos cuantitativos en interacciones proteína-proteína. Se ensayaron 17 fármacos diferentes frente a cuatro interacciones proteína-proteína distintas en múltiples puntos temporales. Se muestran microfotografías representativas, que muestran localización subcelular de complejos proteína-proteína fluorescentes, a la izquierda. Los histogramas revelan los resultados cuantitativos de los efectos farmacológicos vistos en las imágenes que están marcadas con asteriscos. La Figura 13B muestra ejemplos de efectos farmacológicos en interacciones proteína-proteína. Se ensayaron 17 fármacos diferentes frente a cuatro interacciones proteína-proteína distintas en múltiples puntos temporales. Se muestran microfotografías representativas, que muestra la localización subcelular de complejos proteínaproteína fluorescentes, a la izquierda. Los histogramas muestran los resultados cuantitativos de los efectos farmacológicos (con asterisco). La Figura 14A ilustra la estrategia de modulación de ruta para realización de perfiles farmacológicos. Las células se tratan con un compuesto de ensayo seguido un modulador de ruta de cualquier tipo o composición química. Con esta estrategia, pueden detectarse compuestos de ensayo o bloquean los efectos del modulador en las rutas celulares. La Figura 14B muestra la utilidad de la estrategia de modulación de ruta para realización de perfiles farmacológicos. Se usó camptotecina para inducir daño de ADN, que conduce a la activación de las rutas de respuesta a daño de ADN, como se muestra para Chk1/Cdc25C. Pueden identificarse después agentes que potencian o bloquean los efectos de camptotecina, como se muestra en la matriz. Puede tomarse una estrategia de ensayo similar con cualquier ruta celular y con cualquier modulador de ruta. La Figura 15A muestra activación de una ruta de GPCR por su agonista conocido e inhibición por antagonista. El isoproterenol indujo la formación de complejos entre el receptor beta-adrenérgico (un GPCR) y betaarrestina. El pretratamiento con propanolol bloqueó el efecto de isoproterenol. Por lo tanto, en ausencia de isoproterenol, pueden detectarse activadores de ruta; mientras que en presencia de isoproterenol pueden detectarse antagonistas o inhibidores de ruta. Puede aplicarse una estrategia similar a cualquier receptor celular incluyendo GPCR, receptores de membrana y receptores nucleares. La Figura 15B un efecto “fuera de ruta” no pretendido o no deseable de un compuesto candidato en una ruta de GPCR. El compuesto era un inhibidor de quinasa patentado, selectivo y potente con actividad antiproliferativa, que se pretendía para el tratamiento de cáncer y no se pretendía o esperaba que tuviera actividad en rutas de GPCR. El efecto del agente se observó en presencia de isoproterenol, lo que ejemplifica la utilidad de la estrategia de modulación de rutas. Puesto que el agente no se une directamente con el GPCR, este efecto no pretendido podría ser el resultado de inhibición de una GRK (quinasa receptora de proteína G) u otra proteína reguladora en esta ruta. Puesto que los GPCR regulan la función cardiovascular, esta actividad “fuera de ruta” es indeseable y este resultado de ensayo permitió la retirada de este compuesto. Otros compuestos candidatos dentro de la misma serie química no mostraron esta actividad y pudieron por lo tanto investigarse. La Figura 16A muestra que puede detectarse toxicidad basada en mecanismo en ensayos basados en células. Los efectos pronunciados de una sustancia tóxica conocida, cloruro de cadmio (10 micromolar) en cuatro interacciones proteicas diferentes en células humanas se muestran en las imágenes e histogramas. Se toman imágenes 8 horas después del tratamiento celular con cloruro de cadmio. Figura 16B con el uso de ensayos para interacciones proteicas, el perfil de actividad de cualquier agente nuevo puede compararse con el perfil de una sustancia tóxica conocida, tal como cloruro de cadmio, para determinar si el nuevo agente tiene actividad celular similar a la de la sustancia tóxica. En el ejemplo mostrado, se procesaron cuatro ensayos diferentes en paralelo. El verde indica un aumento del parámetro del ensayo y el rojo indica una reducción. En los perfiles mostrados, dos compuestos patentados (candidato 101 y 102) tuvieron perfiles similares a los del cadmio y se documento posteriormente que producían toxicidad hepática en roedores. Otros compuestos candidatos de esta serie no compartían este perfil tóxico. Figura 17A las actividades de 107 fármacos conocidos diferentes se evaluaron frente a un panel de 53 interacciones proteicas diferentes, ensayándose cada interacción en uno o más puntos temporales en células HEK293 con PCA. El resultado de cada ensayo se codificó como sin efecto (negro), señal de ensayo aumentada (verde) o señal de ensayo reducida (rojo). En la matriz resultante, los fármacos están en el eje x y los ensayos están en el eje y. Cada fármaco dio una identificación farmacológica característica (perfil). Los resultados numéricos del ensayo de cada combinación de ensayo/tiempo/pretratamiento se agruparon como se describe en el protocolo experimental, para evaluar similitudes y diferencias entre fármacos basándose en sus perfiles de actividad. Figura 17B las agrupaciones de fármacos del eje x de la Figura 17A se muestran en el presente documento con nombres de fármacos unidos al dendrograma. Los fármacos conocidos se agruparon basándose en sus actividades de rutas similares, validando que la estrategia captura fielmente las actividades en ruta a gran escala. También se observaron diferencias en la selectividad (actividad fuera de ruta) entre compuestos cercanamente relacionados, lo que remarca la capacidad de la estrategia para capturar actividades fuera de ruta de una amplia serie de compuestos químicos y dianas. La Figura 18 es una matriz que muestra los perfiles de candidatos farmacológicos, que representan varias clases diana de fármacos diferentes, en un panel de ensayos de diferentes interacciones proteicas. La codificación por colores fue como en la Figura 16A. Los fármacos que eran no selectivos pudieron distinguirse fácilmente de los que eran más selectivos en el panel de ensayo. Dos compuestos que demostraron ser hepatotóxicos mostraron actividad extensiva fuera de ruta que sugería una falta general de selectividad en células humanas. Por lo tanto, pueden usarse ensayos de interacciones proteicas por etapas durante la

optimización del candidato para desarrollar candidatos que sean “más limpios” (más selectivos) en células humanas. En el ejemplo mostrado, cada candidato farmacológico se ensayó a una concentración que era 3x su CI50 celular; también pueden usarse curvas de respuesta a dosis para comparar potencias a lo largo de cualquier panel de ensayo.

Descripción detallada de la invención

Identificación de efectos en ruta y fuera de ruta de los fármacos (realización de perfiles farmacológicos)

Todos los fármacos ejercen sus efectos actuando en proteínas dentro de células vivas. El procedimiento típico de descubrimiento de fármacos implica seleccionar una diana proteica y establecer un ensayo in vitro para esa diana de interés. La fase de selección de diana de descubrimiento se sigue de identificación, exploración o desarrollo de un compuesto químico que ejerza el efecto deseado en esa diana. Esto se consigue por exploración de alto rendimiento de un compuesto químico u otra biblioteca de compuestos; por cristalización de la diana y procedimientos in silico o húmedos para diseñar un compuesto que se ajusta a un sitio de unión en una diana; o por una combinación de estos y procedimientos similares. Independientemente del procedimiento usado, siempre hay una diana, actividad o efecto conocido del compuesto. Sin embargo, en casi todos los casos, los fármacos y candidatos a fármaco ejercen efectos desconocidos cuando entra en contacto con células vivas. Tales efectos desconocidos son resultado de la falta de especificidad de la molécula en el contexto de las miles de proteínas que componen el medio bioquímico de la célula viva. En algunos casos, estos efectos desconocidos pueden dar como resultado consecuencias biológicas adversas

o toxicidad que no se ve hasta que el fármaco no se administra a cientos o miles de pacientes.

El desafío central de la industria farmacéutica es desarrollar fármacos que sean tanto seguros como eficaces en el hombre. El equilibrio entre seguridad y eficacia es habitualmente difícil de conseguir como se demuestra por el 75 % de tasa de fracaso de los fármacos en pruebas clínicas. Con frecuencia, un fármaco es completamente seguro pero tiene eficacia insuficiente en una condición particular para proporcionar cualquier beneficio apreciable a la población de pacientes para la que se pretende. En otros casos, un fármaco es eficaz pero tiene efectos adversos a largo plazo que no son evidentes hasta que se ha estudiado un gran número de pacientes durante largos periodos de tiempo. Las toxicidades agudas y crónicas pueden conducir a retirada de un fármaco del mercado, y existen numerosos ejemplos tales que incluyen troglitazona (Rezulin) y otros fármacos. Por lo tanto, la industria farmacéutica emplea investigación sustancial y dinero de desarrollo en un intento de entender la selectividad y potenciales efectos adversos de los fármacos, antes de los ensayos clínicos. Sin embargo, los procedimientos actuales para realizar los perfiles de selectividad de los fármacos son extremadamente limitados. Por lo tanto los inventores buscan un procedimiento para permitir la rápida identificación de efectos en ruta y fuera de ruta de los fármacos a una escala genómica.

Ejemplos de proteínas intracelulares que forman complejos

Se cree que cada proteína de la célula entra en contacto con numerosas otras proteínas. Además se cree que existen muchas rutas en la célula, que representan colecciones organizadas de proteínas que actúan en concierto para responder a condiciones o para ejercer un fenotipo celular particular. La Figura 2 proporciona ejemplos de las clases de proteínas que participan en interacciones proteína-proteína. Algunas de estas interacciones intracelulares proteína-proteína son constitutivas, es decir, no responden a estímulos externos, condiciones ambientales u otros moduladores. Por “responder” los inventores entienden que una interacción proteína-proteína particular aumenta, disminuye o experimenta un cambio en distribución subcelular o patrón en respuesta a una perturbación. Sin embargo, muchas, si no la mayoría, de las interacciones están moduladas en ciertas condiciones en células vivas. Por ejemplo, ciertas interacciones proteína-proteína se inducen por unión de un agonista, hormona o factor de crecimiento con un receptor que induce una cascada de señalización o por una molécula pequeña que activa una proteína intracelular o enzima. Otras interacciones pueden inhibirse, por ejemplo mediante unión de un antagonista o un anticuerpo con un receptor bloqueando de este modo una cascada de señalización; por un ARNpi, que silencia un gen que codifica una proteína que es crítica para una ruta; o por un fármaco que inhibe una proteína particular dentro de una ruta. Estos ejemplos pretenden ilustrar la amplitud de la invención y no son limitantes para la práctica de la invención.

Procedimiento para realización de perfiles farmacológicos

Se muestra una visión de conjunto del procedimiento de análisis farmacológico en la Figura 4.

La Etapa 1 implica seleccionar los compuestos químicos, candidatos farmacológicos o fármacos cuyo perfil va a realizarse.

La Etapa 2 implica seleccionar las interacciones proteína-proteína para ensayar. Estas pueden ser proteínas de interacción nuevas o conocidas. Las proteínas de interacción pueden identificarse, o seleccionarse, racionalmente, por ejemplo, mediante el conocimiento previo de una ruta o un par de proteínas de interacción, o de forma empírica. Por ejemplo, las proteínas de interacción pueden identificarse por uno o más procedimientos que incluyen exploración de cebo contra biblioteca o mapeo de interacción por pares (gen a gen). Además, puede construirse simplemente un número ilimitado de ensayos de interacción proteína-proteína de forma aleatoria y ensayarse de forma empírica con respecto a su sensibilidad a cualquier variedad de fármacos o compuestos químicos y los

resultados pueden combinarse en un perfil farmacológico. Prácticamente no existe límite de los tipos, números o identidades de las interacciones proteína-proteína que pueden usarse en la realización de perfiles farmacológicos. Probablemente hay cientos de miles de interacciones proteína-proteína que se producen en células de mamífero. Sin embargo, algunas serán constitutivas; y otras serán redundantes. Una interacción constitutiva, que no responde a fármacos, agonistas u otros compuestos perturbadores, no será útil en la realización de perfiles farmacológicos. Afortunadamente, puede determinarse empíricamente si una interacción proteína-proteína específica es útil en la realización de perfiles, simplemente construyendo un ensayo para la interacción, usando uno de los muchos tipos de ensayo analizados en el presente documento, y ensayándolo con respecto a sensibilidad frente a una serie de fármacos u otros compuestos. Una interacción redundante es una que proporciona información que no es diferente de la información proporcionada por una interacción diferente. Puesto que las interacciones entre proteínas se mapean gradualmente con el tiempo será posible construir un panel de ensayos completamente predictivos basándose en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Un panel tal permitirá ensayar cualquier compuesto para determinar su espectro completo de actividades contra todas las rutas en la célula viva y determinar cualquier actividad fuera de ruta que sugiera consecuencias adversas.

La Etapa 3 de la realización de perfiles farmacológicos implica construir los ensayos para dos o más interacciones proteína-proteína. Los procedimientos adecuados para construir tales ensayos están muy extendidos y se han descrito en detalle en los antecedentes de la invención; tales procedimientos, que incluyen procedimientos de dos híbridos y FRET así como procedimientos de captura inmune, están bien documentados en la bibliografía y puede simplemente adaptarse para la presente invención si los pares de proteínas de interacción se seleccionan de forma apropiada y el procedimiento es suficientemente sensible para detectar y cuantificar cambios de la intensidad de señal o localización debido a los compuesto químicos o fármacos de interés.

En el caso de ensayos de complementación de fragmento, los ensayos se construyen de acuerdo con el siguiente esquema. Para estudiar la red de señalización, cada uno de los miembros de un par proteína-proteína seleccionado se clona como una fusión génica en fase (3’ ó 5’) con fragmentos indicadores que codifican una molécula indicadora de PCA en un vector apropiado de modo que tras la transfección en una línea celular apropiada la proteína codificada que se expresa posteriormente en la célula porta un fragmento proteico (polipéptido) en el extremo amino

o carboxilo terminal de la proteína codificada en el ADNc original seleccionado. Pueden construirse ensayos usando transfecciones transitorias o líneas celulares estables o infección, tal como con retrovirus o adenovirus diseñados para expresar las proteínas de interés y para permitir detección de las interacciones de interés.

La Etapa 4 de la realización de perfiles farmacológicos, cada compuesto químico o fármaco se ensaya contra cada interacción proteína-proteína en momentos y a concentraciones farmacológicas específicas. Cada resultado farmacológico se compara con valores de control (sin tratamiento). (Pueden procesarse controles positivos y negativos para cada ensayo, en cada punto temporal y condición de estímulo). En la Etapa 5, los resultados de los ensayos se combinan para establecer un perfil farmacológico para cada compuesto. Los resultados pueden presentarse de diversas maneras. En los ejemplos proporcionados en el presente documento los inventores han usado una presentación de matriz y/o un histograma para representar los perfiles farmacológicos. En el caso de una matriz, los resultados de cada exploración pueden representarse en una matriz codificada por colores en la que el rojo indica una reducción de la intensidad de señal o localización mientras que el verde indica un aumento. Pueden usarse diferentes tonos de rojo y verde para representar la intensidad del cambio. De esta manera la presentación es similar a la de un experimento de micromatriz.

Puede usarse software adecuado para análisis de rutas para crear mapas de rutas, en los que los resultados del compuesto farmacológico se traducen en un diagrama que muestra acontecimientos corriente arriba y corriente abajo y que liga fármacos a esos acontecimientos. Se comercializa software de análisis de ruta adecuado por Ingenuity Systems, GeneGo, y muchos otros distribuidores.

Protocolo experimental

Para aplicar la presente invención a gran escala, los inventores construyeron numerosos ensayos para rutas que controlan procesos celulares clave, incluyendo apoptosis, el ciclo celular, respuesta a daño de ADN, señalización de GPCR, interacciones de chaperonas moleculares, regulación citoesquelética, degradación proteosómica, mitogénesis, inflamación y rutas de receptores de hormonas nucleares. Se seleccionaron complejos proteínaproteína para representar interacciones a diferentes niveles jerárquicos dentro de rutas bien caracterizadas. Se proporcionan ejemplos de rutas exploradas, y ejemplos de ensayos para diversas dianas, en las Figuras 7-15 de la presente invención junto con ejemplos de efectos esperados (“en ruta”) e inesperados de los fármacos, sustancias tóxicas y compuestos candidatos. Los inventores abarcaron una amplia serie de rutas, proteínas, fármacos y clases de diana para destacar la universalidad del enfoque.

Se encuentran más adelante detalles de proteínas particulares que se exploraron en las Tablas 1-3. Es importante observar que la invención puede usarse con cualquier interacción proteica siempre que pueda construirse un ensayo dinámico para esa interacción. Además, pueden aplicarse elementos particulares de la invención, incluyendo la estrategia de modulación de ruta para ensayos basados en células de los inventores, a cualquier parámetro de medición de un complejo proteico o incluso una proteína individual en una célula.

Para evaluar los efectos farmacológicos en redes de transducción de señal humanas, los inventores analizaron los efectos farmacológicos con ensayos de alto contenido en una línea celular humana (células HEK293) los ensayos permiten la exploración de la actividad de nodos de señalización específicos en diferentes condiciones y puede controlarse la actividad a niveles temporales y espaciales dentro de una red de rutas. Para aplicar esta estrategia a gran escala, los inventores construyeron numerosos ensayos para rutas que controlan procesos celulares clave, incluyendo apoptosis, el ciclo celular, respuesta a daño de ADN, señalización de GPCR, interacciones de chaperonas moleculares, regulación citoesquelética, degradación proteosómica, mitogénesis, inflamación y rutas de receptores de hormonas nucleares. Analizando la respuesta de diversos nodos de señalización que representan múltiples clases de diana y rutas, los inventores pudieron precisar actividad y selectividad farmacológica en ruta y fuera de ruta, toxicidad general y basada en mecanismo y relaciones farmacológicas.

Las exploraciones de PCA emplean fragmentos complementarios (F[1] y F[2]) de una proteína indicadora que se plegará en una forma activa solamente si se fusiona con dos proteínas que interaccionan. Se seleccionaron complejos proteína-proteína (Tabla 1) para representar interacciones conocidas que se producen a diferentes niveles jerárquicos dentro de rutas bien caracterizadas. Para los ejemplos, los inventores organizaron ensayos basados en fragmentos de un mutante intensamente fluorescente de YFP (Remy y Michnick, 2001; Remy y Michnick, 2004; Remy y col., 2004), que madura rápidamente (9 minutos (Nagai y col., 2002)), lo que permite la visualización, cuantificación y localización de complejos formados entre proteínas de longitud completa expresadas a niveles bajos en células humanas. El objetivo de la minimización de la expresión fue minimizar las perturbaciones potenciales de las rutas endógenas por la proteínas exógenas (Yu, 2003).

Síntesis de fragmentos y preparación de construcciones

Se generaron fragmentos indicadores para PCA por síntesis de oligonucleótidos (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). En primer lugar, se sintetizaron oligonucleótidos que codifican fragmentos polipeptídicos YFP[1] e YFP[2] (correspondientes a los aminoácidos 1-158 y 159-239 de YFP). A continuación, se usó mutagénesis por PCR para generar los fragmentos mutantes IFP[1] e IFP[2]. El fragmento de IFP[1] corresponde a YFP[1]-(F46L, F64L, M153T) y el fragmento IFP[2] corresponde a YFP[2]-(V163A, S175G). Se ha mostrado que estas mutaciones aumentan la intensidad de fluorescencia de la proteína YFP intacta (Nagai y col., 2002). Los fragmentos YFP[1], YFP[2], IFP[1] e IFP[2] se amplificaron por PCR para incorporar sitios de restricción y una secuencia de engarce, descrita posteriormente, en configuraciones que permitirían la fusión de un gen de interés con el extremo 5’- ó 3’- de cada fragmento indicador. Los casetes de fragmentos de engarce-indicador se subclonaron en un vector de expresión de mamíferos (pcDNA3.1Z, Invitrogen) que se había modificado para incorporar el origen de replicación (oriP) del virus de Epstein Barr (EBV). El oriP permite replicación episómica de estos vectores modificados en líneas celulares que expresan el gen EBNA1, tales como células HEK293E (293-EBNA, Invitrogen). Adicionalmente, estos vectores aún conservan el origen SV40, que permite la expresión episómica en líneas celulares que expresan el antígeno T grande de SV40 (por ejemplo, HEK293T, Jurkat o COS). La integridad de los fragmentos indicadores mutados y el nuevo origen de replicación se confirmaron por secuenciación.

Se prepararon construcciones de fusión de PCA para un gran número de proteínas que se sabe que participan en una diversa serie de rutas celulares (Tabla 1). La secuencia codificante completa para cada gen de interés se amplificó por PCR a partir de un ADNc de longitud completa con secuencia modificada. Los productos de PCR resultantes se purificaron en columna (Centricon), se digirieron con enzimas de restricción apropiadas para permitir la clonación direccional y se fusionaron en fase con el extremo 5’ ó 3’ de YFP[1], YFP[2], IFP[1] o IFP[2] a través de un engarce que codifica un péptido de 10 aminoácidos flexible (Gly.Gly.Gly.Gly.Ser)2. El engarce flexible asegura que la orientación/ordenamiento de las fusiones es óptima para poner los fragmentos indicadores en proximidad cercana (Pelletier y col., 1998). Se exploraron recombinantes en las cepas huésped DH5-alfa (Invitrogen, Carlsbad, CA) o XL1 Blue MR (Stratagene, La Jolla, CA) por PCR de colonias, y los clones que contenían insertos del tamaño correcto se sometieron a secuenciación de extremos para confirmar la presencia del gen de interés y fusión en fase con el fragmento indicador apropiado. Se seleccionó un subconjunto de construcciones de fusión para secuenciación de inserto completo por avance de cebadores. Se aislaron ADN usando kits Qiagen MaxiPrep (Qiagen, Chatsworth, CA). Se usó PCR para evaluar la integridad de cada construcción de fusión, combinando el cebador específico de gen apropiado con un cebador específico de indicador para confirmar que estaba presente la fusión génica correcta y del tamaño correcto sin deleciones internas.

Todos los fragmentos de proteínas fluorescentes mencionadas anteriormente son objeto de la Solicitud de Estados Unidos del mismo solicitante número de serie 10/724,178 presentada el 1 de diciembre de 2003.

Transfecciones transitorias

Se mantuvieron células HEK293 en medio MEM alfa (Invitrogen) complementado con FBS 10 % (Gemini Bio-Products), penicilina 1 % y estreptomicina 1 % y se dejaron crecer en un incubador a 37 ºC equilibrado a CO2 5 %. Aproximadamente 24 horas antes de las transfecciones las células se sembraron en placas revestidas con poli-D-Lisina de 96 pocillos (Greiner) usando un sistema de bomba peristáltica Multidrop 384 (Thermo Electron Corp., Waltham, Mass) a una densidad de 7.500 por pocillo. Hasta 100 ng de los vectores de fusión de fragmento YFP o IFP complementarios se co-transfectaron usando Fugene 6 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La lista de los pares de PCA seleccionados explorados en este estudio, e información de fragmento indicador y gen

correspondiente, se enumeran en la Tabla 2. Después de 24 o 48 horas de expresión, las células se exploraron frente a un panel de fármacos como se describe posteriormente.

Tabla 1. Proteínas, genes y ensayos para interacciones proteicas para la presente invención

Nombre de Ensayo

Gen _1 Nº de acceso de Gen _1 Gen _2 Nº de acceso de Gen _2

a tubulina/HDAC6

TUBA2 NM_006001 HDAC6 NM_006044

a tubulina/ HDAC6

TUBA2 HDAC6 NM_006001 NM_006044

a-actina/a-actinina

ACTA1 NM_001100 ACTN1 NM_001102

AKL3L/GUK1

AKL3L NM_016282 GUK1 NM_000858

AKL3L/IPP2

AKL3L NM_016282 PPP1R2 NM_006241

Akt1/Cdc37

AKT1 NM_005163 CDC37 NM_007065

Akt1/GSK31

AKT1 NM_005163 GSK3B NM_002093

Akt1/Cdc37

AKT1 NM_005163 CDC37 NM_007065

Akt1/GSK31

AKT1 NM_005163 GSK3B NM_002093

Akt1/p27

AKT1 NM_005163 CDKN1B NM_004064

Akt1/p70S6K

AKT1 NM_005163 RPS6KB1 NM_003161

Akt1/Smad3

AKT1 NM_005163 MADH3 NM_005902

AMPK/HMGCR

PRKAA1 NM_206907 HMGCR NM_000859

anexina I/FPRL1

ANXA1 NM_000700 FPRL1 NM_001462

ARF1/gamma-COP

ARF1 NM_001658 COPG1 NM_016128

B2AR/1-arrestina2

beta2AR NM_000024 ARRB2 NM_004313

12AR/Gai3

beta2AR NM_000024 GNAl3 NM_006496

Bad/14-3-3a

BAD NM_004322 SFN NM_006142

Bad/Bd-xL

BAD NM_004322 BCL2L1 NM_138578

Bag1/Hsp70L1

BAG1 NM_004323 HSP70L1 NM_005527

Bax/Bid

BAX NM_138761 BID NM_001196

Bcl-xL/Bik

BCL2L1 NM_138578 BIK NM_001197

1-arrestina2/Erk2

ARRB2 NM_004313 MAPK1 NM_002745

1-arrestina2/Ub

ARRB2 NM_004313 UBB NM_021009 (nt 69..296)

1-catenina/CBP

CTNNB1 NM_001904 CREBBP S66385 (nt 1..2313)

1-catenina/Pin1

CTNNB1 NM_001904 PIN1 NM_006221

1-TrCP/1-catenina

BTRC NM_033637 CTNNB1 NM_001904

1-TrCP/ROC1

RBX1 NM_033637 BTRC NM_014248

c-Jun/CBP

JUN NM_002228 CREBBP S66385 (nt 1..2313)

c-Jun/Fos

JUN NM_002228 FOS NM_005252

(continuación)

Nombre de Ensayo

Gen _1 Nº de acceso de Gen _1 Gen _2 Nº de acceso de Gen _2

c-Src/Grk2

CSK NM_004383 ADRBK1 NM_001619

Calcineurina A/Bad

PPP3CA NM_005605 BAD NM_004322

CaM/Calcineurina A

CALM2 NM_001743 PPP3CA NM_005605

CaM/DAPK2

CALM2 NM_001743 DAPK2 NM_014326

CaM/MEF2C

CALM2 NM_001743 MEF2C NM_002397

Caspasa 3/Cdc6

CASP3 NM_004346 CDC6 NM_001254

Caspasa 3/MST4

CASP3 NM_004346 MST4 NM_016542

Caspasa 3/1CAD

CASP3 NM_004346 DFFA NM_004401

CBP/ATF-1

CREBBP S66385 (nt 1..2313) ATF1 NM_005171

CBP/CBP

CREBBP S66385 (nt 1..2313) CREBBP S66385 (nt 1..2313)

CBP/CREB1

CREBBP S66385 (nt 1..2313) CREB1 NM_134442

CCR5/PKCa

CCR5 NM_000579 PRKCA NM_002737

Cdc2/CiclinaB

CDC2 NM_001786 CCNB1 NM_031966

Cdc25A/Cdc2

CDC25A NM_ 001789 CDC2 NM_001786

Cdc25C/14-3-3C

CDC25C NM_001790 YWHAZ NM_003406

Cdc25C/Cdc2

CDC25C NM_001790 CDC2 NM_001786

Cdc42/Jnk2

CDC42 NM_001791 MAPK9 NM_002752

Cdc42/Pak4

CDC42 NM_001791 PAK4 NM_005884

Cdc42/WASP

CDC42 NM_001791 WASP NM_000377

Cdk2/14-3-30

CDK2 NM_001798 SFN NM_006142

Cdk2/Axina

CDK2 NM_001798 Axin1 NM_009733

Cdk2/Cdc6

CDK2 NM_001798 CDC6 NM_001254

Cdk2/CiclinaE

CDK2 NM_001798 CCNE1 NM_001238

Cdk2/Mcm4

CDK2 NM_001798 MCM4 NM_005914

Cdk4/lCiclina D1

CDK4 NM_000075 CCND1 NM_053056

Cdk4/Rb

CDK4 NM_000075 RB1 NM_000321

Ghk1/Cdc25A

CHEK1 NM_001274 CDC25A NM_001789

Chk1lCdc25C

CHEK1 NM_001274 CDC25C NM_001790

Chk1/Ku70

CHEK1 NM_001274 G22P1 NM_001469

Chk1/p53

CHEK1 NM_001274 TP53 NM_000546

Chk2/Chk2

CHEK2 NM_007194 CHEK2 NM_007194

Chk2/p53

CHEK2 NM_007194 TP53 NM_000546

(continuación)

Nombre de Ensayo

Gen _1 Nº de acceso de Gen _1 Gen _2 Nº de acceso de Gen _2

Crk/RalA

CRK NM_005206 RALA NM_005402

DGKa/c-Src

DGKA NM_001345 CSK NM_004383

Dnmt1/Histona H3A

Dnmt1 NM_010066 H3F3A NM_002107

E2F1/CEBPs

E2F1 NM_005225 CEBPE NM_001805

E6/E6AP

E6 NC_001526 E6AP ------

E6/p53

E6 NC_001526 TP53 NM_000546

EDG2/Gy4

EDG2 NM_001401 GNG4 NM_004485

EGFR/CaM

EGFR NM_00522827 CALM2 NM_001743

EGFR/Grb2

EGFR 005228 GRB2 NM_002086

elF4E/4E-BP2

EIF4E NM_001968 EIF4BP2 NM 004096

elF4E/elF4A

EIF4E NM_001968 EIF4A1 NM 001416

elF4EietF4G

EIF4E NM_001968 EIF4G1 NM 198244

Elk1/SRF

ELK1 NM_005229 SRF NM 003131

ERa/RXRa

ESR1 NM_000125 RXRA NM 002957

ER/SRC-1

ESR1 NM_000125 SRC-1 U40396 (nt 624..1256)

Erk2/Elk1

MAPK1 NM_002745 ELK1 NM_005229

Erk2/Mnk1

MAPK1 NM_002745 MKNK1 NM_003684

Erk2/p27

MAPK1 NM_002745 CDKN1B NM_004064

FAK1/Socs-3

FAK1 NM_005607 Socs3 NM_007707

FXR/RXRa

Nr1h4 NM_009108 RXRA NM_002957

FXR/SRC-1

Nr1h4 NM_009108 SRC-1 U40396 (nt 624..1256)

Fz-4/Ga(o)

FZD4 NM_012193 Gnao1 NM_010308

Fz-4/Grk2

FZD4 NM_012193 ADRBK1 NM_001619

Fz-4/RGS2

FZD4 NM_012193 RGS2 NM_002923

Gai/G11

GNAI1 NM_002069 Gnb1 NM_008142

GLUT4/Sumo-1

GLUT4 NM_001042 SUMO1 NM_003352

Grk2/Ga(o)

ADRBK1 NM_001619 Gnao1 NM_010308

Grk2/Gy2

ADRBK1 NM_001619 GNG2 XM_495987

Grk2/PKCa

ADRBK1 NM_001619 PRKCA NM_002737

Grk2/PKC�

ADRBK1 NM_001619 PRKCZ NM_002744

GRM3/Gy4

GRM3 NM_000840 GNG4 NM_004485

GSK31/PP2A

GSK3B NM_002093 PPP2CA NM_004156

HDAC1/14-3-3c

HDAC1 NM_004964 SFN NM_006142

(continuación)

Nombre de Ensayo

Gen _1 Nº de acceso de Gen _1 Gen _2 Nº de acceso de Gen _2

HDAC1/HDAC1

HDAC1 NM_004964 HDAC1 NM_004964

HDAC1/Stat1

HDAC1 NM_004964 STAT1 NM_007315

Histona H3/HDAC1

H3F3A NM_002107 HDAC1 NM_004964

Histona H3/Histona H3

H3F3A NM_002107 H3F3A NM_002107

H-Ras/Raf1

HRAS NM_005343 RAF1 NM_002880

Hsc70/p53

HSC70 NM_006597 TP53 NM_000546

Hsp901/Akt1

HSPCB NM_007355 AKT1 NM_005163

Hsp901/Bid

HSPCB NM_007355 BID NM_001196

Hsp901/Cdc37

HSPCB NM_007355 CDC37 NM_007065

Hsp901/Chk1

HSPCB NM_007355 CHEK1 NM_001274

Hsp901/Eef2k

HSPCB NM_007355 Eef2k NM_007908

Hsp901/Mek1

HSPCB NM_007355 Map2k1 Z16415

Hsp901/Mek2

HSPCB NM_007355 Map2k2 D14592

Hsp901/Wee1

HSPCB NM_007355 Wee1 NM_009516

ICAD/CAD

DFFA NM_004401 DFFB NM_004402

IkBa/p65

NFKB1A NM_020529 Rela NM_009045

IKK1/IKKy

IKBKB NM_001556 IKBKG NM_003639

IKKy/p27

IKBKG NM_003639 CDKNIB NM_004064

IPP2/RIPK2

PPP1R2 NM_006241 RIPK2 NM_003821

ITGa5/ITG11

ITGA5 NM_002211 ITGB1 NM_002205

Jnk1/c-Jun

MAPK8 NM_002750 JUN NM_002228

JNK2/ATF-2

MAPK9 NM_002752 ATF2 NM_001880

Jnk2/Cdc25C

MAPK9 NM_002752 CDC25C NM_001790

Jnk2/Cdk2

MAPK9 NM_002752 CDK2 NM_001798

Ku70/Ku80

G22P1 NM_001469 XRCC5 NM_021141

Limk2/cofilina1

LIMK2 NM_005569 CFL1 NM_005507

LXR1/RXRa

NR1H2 NM_007121 RXRA NM_002957

Map3k8/Clk1

Map3k8 NM_005204 CLK1 NM_004071

Map3k8/PP1-r1a

Map3k8 NM_005204 PPP1R1A NM_006741

MAPKAPK-2/Eef2k

MAPKAPK2 NM_032960 Eef2k NM_007908

Mdm2/NPM1

MDM2 NM_002392 NPM1 NM_002520

Mdm2/p53

MDM2 NM_002392 TP53 NM_000546

Mek1/Erk2

Map2k1 Z16415 MAPK1 NM_002745

(continuación)

Nombre de Ensayo

Gen _1 Nº de acceso de Gen _1 Gen _2 Nº de acceso de Gen _2

Mek2/Jnk

Map2k2 D14592 MAPK8 NM_002750

Mevalonato

MVK NM_000431 MVK NM_000431

MKK6/p38a

MAP2K6 NM_002758 MAPK14 NM_001315

Mnk1/elF4E

MKNK1 NM_003684 ElF4E NM_001968

Myc/Max

MYC NM_002467 MAX NM_002382

NLK/c-Myb

NLK NM_016231 Myb NM_010848

eNos/CaM

Nos3 NM_008713 CALM2 NM_001743

NURR1/RXRa

NR4A2 NM_006186 RXRA NM_002957

Orc1/Orc2

ORC1L NM_004153 ORC2L NM_006190

p21/Cdc2

CDKN1A NM_000389 CDC2 NM_001786

p21/CiclinaB

CDKN1A NM_000389 CCNB1 NM_031966

p22(phox)/p47(phox)

CYBA NM_000101 NOXO2 NM_000265

p27/CRM1

CDKN1B NM_004064 XPO1 NM_003400

P2Y2r/Ga15

P2RY2 NM_002564 GNA15 NM_002068

P2Y2r/Gy4

P2RY2 NM_002564 GNG4 NM_004485

p38a/Cdc25B

MAPK14 NM_001315 CDC25B NM_021873

p38a/Cdk2

MAPK14 NM_001315 CDK2 NM_001798

p38a/Elk1

MAPK14 NM_001315 ELK1 NM_005229

p38a/MAPKAPK-2

MAPK14 NM_001315 MAPKAPK2 NM_032960

p38a/Max

MAPK14 NM_001315 MAX NM_002382

p38a/Mnk1

MAPK14 NM_001315 MKNK1 NM_003684

p38a1/Rad9

MAPK14 NM_001315 RAD9 NM_004584

p53/p53

TP53 NM_000546 TP53 NM_000546

p65/CBP

Reta NM_009045 CREBBP S66385 (nt 1..2313)

p65/p50

Reta NM_009045 NFKB1 NM_003998

p70S6K/Map3k8

RPS6KB1 NM_003161 Map3k8 NM_005204

p70S6K/RIPK2

RPS6KB1 NM_003161 RIPK2 NM_003821

Pak4/Bad

PAK4 NM_005884 BAD NM_004322

Pak4/Cofilina

PAK4 NM_005884 CFL1 NM _005507

Parvina-beta/ILK

PARVB ------ ILK NM_004517

Pcna/Pol8 (p50)

PCNA NM_002592 POLD2 NM_006230

PCNA/Xrcc1

PCNA NM_002592 Xrcc1 NM_009532

Pdk1/Akt

PDPK1 NM_002613 AKT1 NM_005163

(continuación)

Nombre de Ensayo

Gen _1 Nº de acceso de Gen _1 Gen _2 Nº de acceso de Gen _2

PFK-2/IPP2

PFKFB1 NM_002625 PPP1R2 NM_006241

PIAS1/Mdm2

PIAS1 NM_016166 MDM2 NM_002392

PIASy/p53

PIASy NM_015897 TP53 NM_000546

PIASy/Smad3

PIASy NM_015897 MADH3 NM_005902

Pin1/Cdc25C

PIN1 NM_006221 CDC25C NM_001790

Pin1/c-Jun

PIN1 NM_006221 JUN NM_002228

Pin1/p53

PIN1 NM_006221 TP53 NM_000546

Pin1/p70S6K

PIN1 NM_006221 RPS6KB1 NM_003161

PKCa/p47Nox

PRKCA NM_002737 NOXO1 NM_144603

PPIc1/HDAC1

PPP1CB NM_002709 HDAC1 NM_004964

PP1-r1a/PP-1B

PPP1R1A NM_006741 PPP1CB NM_002709

PP2A/Cdk2

PPP2CA NM_002715 CDK2 NM_001798

PP2A/Mek1

PPP2CA NM_002715 Map2k1 Z16415

PPARy/RXRa

PPARG NM_138712 RXRA NM_002957

2PARy/SRC-1

PPARG NM_138712 SRC-1 U40396 (nt 624..1256)

Pthr1/Ga15

Pthr1 NM_011199 GNA15 NM_002068

PTPa/c-Src

PTPRA NM_080840 CSK NM_004383

PTPa/Grb2

PTPRA NM_080840 GRB2 NM_002086

PXR/RXRa

PXR NM_022002 RXRA NM_002957

PXR/SRC-1

PXR NM_022002 SRC-1 U40396 (nt 624..1256)

Rac1/Pak1

RAC1 NM_006908 PAK1 NM_002576

Rac1/Pak6

RAC1 NM_006908 PAK6 NM_020168

Rad1/Rad17

RAD1 NM_002853 RAD17 NM_133338

Rad9/HDAC1

RAD9 NM_004584 HDAC1 NM_004964

Rad9/Hus1

RAD9 NM_004584 HUS1 NM_004507

Rad9/p53

RAD9 NM_004584 TP53 NM_000546

Raf1/14-3-3s

RAF1 NM_002880 SFN NM_006142

Raf1/Cdc37

RAF1 NM_002880 CDC37 NM_007065

Raf1/Mek1

RAF1 NM_002880 Map2k1 Z16415

Raf1/Mek2

RAF1 NM_002880 Map2k2 D14592

RalB/RalBP1

RALB NM_002881 RALBP1 NM_006788

RARB/RXRa

RARB NM_000965 RXRA NM_002957

Rb/CiclofilinaA

RB1 NM_000321 PPIA NM_021130

(continuación)

Nombre de Ensayo

Gen _1 Nº de acceso de Gen _1 Gen _2 Nº de acceso de Gen _2

RGS2/Gai2

RGS2 NM_002923 GNAI2 NM_002070

SCAP/Insig-1

SCAP NM_012235 INSIG1 NM_ 005542

Smad3/HDAC1

MADH3 NM_005902 HDAC1 NM_004964

Smurf1/Smad1

SMURF1 NM_181349 MADH1 NM_005900

Speedy1/p27

SPDY1 NM_182756 CDKN1B NM_004064

SRF/Sumo-1

SRF NM_003131 SUMO1 NM_003352

SSTR2/G11

SSTR2 NM_001050 Gnb1 NM_008142

Stat1/Stat1

STAT1 NM_007315 STAT1 NM_007315

Stat5a/Stat5b

STAT5A NM_003152 STAT5B NM_012448

STK15/Guk1

STK15 NM_003600 GUK1 NM_000858

Sintaxina:Sinaptabrevina2

STX4A NM_004604 VAMP2 NM_U14232

TFCOUP2/SRC-1

Nr2f2 NM_009697 SRC-1 U40396 (nt 624..1256)

TF-COUP3/TFIIB

Nr2f6 NM_010150 GTF2B NM_001514

THR a/RXRa

THRA NM_003250 RXRA NM_002957

Tlk1/Asf1

TLK1 NM_012290 ASF1 NM_014034

TNFR1/FADD

TNFR1 NM_001065 FADD NM_003824

TNFR1/TNFR1

TNFR1 NM_001065 TNFR1 NM_001065

TRAF2/p65

TRAF2 NM_021138 Rela NM_009045

TRAF2/lkBa

TRAF2 NM_021138 NFKB1A NM_020529

Vav/Cdc42

VAV NM_005428 CDC42 NM _001791

VIPR2/G11

VIPR2 NM_003382 Gnb1 NM_008142

WASP/Grb2

WASP NM_000377 GRB2 NM_002086

Wee1/Cdc2

WEE1 NM_ 009516 CDC2 NM_001786

Xrcc1/Ape1

Xrcc1 NM_009532 JAPE1 NM_001641

Tabla 2. Descripción de algunas de las proteínas usadas en la construcción del ensayo

Gen/Proteína

Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres

ACTA1

actina. alfa 1 Ephb4 HtX, MOK2, Myk1, Tyrol1 PAK4 Quinasa activada por p21(COKN1A)- 4

ACTN1

actinina, alfa 1 Ephb6 PCTK1, isoforma a PCTAIRE 1, PCTGAIRE

ACVR18

EPOR receptor de eritropoyetina PCTK1, isoforma b PCTA1RE1, PCTGAIRE

Acvit1

receptor de activina A. parecido a tipo 11 ESR1 ER. ESR. Era, ESRA. NR3A1 (receptor de estrógenos 1 (alfa)) PCTK2 proteína quinasa PCTAIRE 2

(continuación)

Gen/Proteína

Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres

ADPRT

PARP FADD PDGFRB Receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido beta

AKT1

PKB (proteína quinasa B) FAF1 hFAF 1, CGI-03, HFAFis; factor asociado a FAS- 1 Pdk1 proteína quinasa asociada con muerte 2

AKT2

PKB (proteína quinasa B) FAK1 FAK, PTK2 PDK2 Piruvato deshidrogenasa quinasa, isoenzima 2

APC

poliposis adenomatosa de colón FASTK serina/treonina quinasa activada por Fas PDK4 Piruvato deshidrogenasa quinasa, isoenzima 4

ARAF1

PKS2. A-RAF. RAFA1 FGFR4 receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 4 PDPK1

ARF

FGR SRC2, c-fgr. p55ctnr PED

ARHA

RhoA FKBP proteína de unión a FK506 PHKG2 fosforilasa quinasa, gamma 2

ARRB2

ARB2, ARR2: arrestina, beta 2 FKHRL1 PIk3ca mPI3k p110

ARR82

beta-arrestina-2, beta arr2 FKSGB1 PIK3R1 PI3X p85

AT1

AT1AR. AGTR1 FOS PIM1 oncogén PIM1

Arin

FRB dominio de unión a FKBP de FRAP/TOR murino PIM2 proto-oncogén Pim2 (serina treonina quinasa)

AXL

tirosina quinasa receptora de AXL FRK GTK. RAK: quinasa metilada Pim3

BAO

FRS2 SNT, SNT1. FRS2A, SNT-1. FRS2alfa: diana de factor neurotrófico asociado con suc1 (adaptador de señalización de FGFR) Pkmyt1 quinasa inhibidora de cdc2 específica de tirosina y treonina asociada a membrana

BAK

BAK1, CDN1, BCL2L7: agente de muerte/ antagonista de BCL2 1: inhibidor de muerte celular 1 G22P1 Ku70 PLCG PLCG1: PLC1, PLC-11, PLC18; PLC-gamma-1

BAX

GAB1 proteína de unión asociada con GRB2- 1 PLK PLK1, STPK13: quinasa de tipo polo

BC033012

GADD45A PPARG Receptor activado por proliferador de peroxisoma gamma

BCL2

Proteína de linfoma de linfocitos B 2 GADD45B detención del crecimiento e inducible por daño de ADN, beta PPP2CA PP2A, subunidad catalítica

(continuación)

Gen/Proteína

Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres

BCLG

regulador de apoptosis BCL-G GADD45G detención del crecimiento e inducible por daño de ADN, gamma gwtuta PPP2R1B

BCL-X

GNAI3 PRKACA proteína quinasa, dependiente de AMPc, catalítica, alfa

beta2AR

receptor beta2adrenérgico, adrb2 GNAS1 proteína de unión a nucleótido guanina (proteína G), polipéptido de actividad estimuladora alfa 1 PRKCA

BID

agonista de muerte de dominio de interacción con BH3 Gnb1 proteína de unión a nucleótido guanina 1, beta PRKCD Proteína quinasa C. delta

BIK

BP4, NBK, BBC1, BIP1; agente de muerte de interacción con BCL2 GNG5 proteína de unión a nucleótido guanina (proteína G), gamma 5 PRKCE

BIM1

GPR34 Prkch proteína quinasa C, eta

BIRC2

API1, MIHB, cIAP1, HIAP2, RNF48 GPRK5 PRKCI proteína quinasa C, iota

BLK

tirosina quinasa linfoide B GPRK6 Prkx proteína quinasa, ligada a X

BMX

tirosina quinasa no receptora BMX Gprk7 receptor acoplado a proteína G 7 PTEN

BRCA1

cáncer de mama 1, aparición temprana GPRK7 receptor acoplado a proteína G 7 PTPN11 proteína tirosina fosfatasa, tipo no receptor 11

BTRC

b-TrCP GR82 PYK2 PTK2, FAK, FADK, FAK1, pp125FAK

BTRC

b-TrCP GRB7 RAC1 familia rho. Proteína de unión a GTP pequeña Rac1

BUB1B

SUBR1, Bub1A, MAO3L; SUB1 gemación desinhibida por benzimidazoles 1 homologo beta (levadura) GS3955 TRB2: homólogo de tribbles 2 RAD1 HRAD1: proteína de punto de control de ciclo celular Hrad1

CAMK1

proteína quinasa dependiente de calmodulina/calcio 1 GSK3B Rad17 proteína de punto de control de ciclo celular (RAD17)

CAMK2G

proteína quinasa dependiente de calmodulina/calcio 1 2G H2AX histona H2AFX: H2AX Rad51 homólogo de RAD51 (homólogo de RecA, E. coli) (S. cerevisiae)

CAMK4

proteína quinasa dependiente de calmodulina/calcio 4 HCK JTK9; quinasa de célula hemopoyética RAD9 RAD9A; homólogo de RAD9 (S. pombe) proteína de control del ciclo celular

Camkk1

proteína quinasa dependiente de calmodulina/calcio 1 HDAC1 histona desacetilasa 1 RAF1

(continuación)

Gen/Proteína

Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres Gen/Proteína Otros nombres

CAMKKB1

HIF1A factor inducible por hipoxia- 1, alfa RALA

CASP9

HRAS ralbp1 proteína de unión a ralA 1

d-CATENIN

delta-catenina HRI factor de titulación regulada por heme 2-alfa quinasa RAP1 RAPGA1;KREV-1, SMGP21, RAP1GAP, KIAA0474; RAP1, proteína activadora de GTPasa 1

CBP

Proteína de unión con elemento de respuesta a AMP cíclico HSPA1L tipo hsp70 RARa receptor de ácido retinoide alfa

c-CBL

HSPB1 HSP27, HSP28, Hsp25. HS.76087; proteína de choque térmico de 27 kD en 1 RATP130CAS

CCNB1

ciclina B1 HSPCB hsp90, beta RB1 retinoblastoma

CCND1

ciclina D1 Hus1 Homólogo de punto de control HUS1 (S. pombe) Rb2, p130

CCND2

ciclina D2 IKBKAP IKAP Reta p65, p65 NFkB

Tabla 3: Descripción de ensayos individuales y modulación de ruta (“estimulación”) cuando se usa

Descripción de PCA

Estimulación Gen de Genbank 01 Orientación de fusión del indicador Gen de Genbank02 Orientación de fusión del indicador

1

14-3-zeta: CDC25C +CPT 500 nM CPT; 16 h BC003623 C NM_001790 C

2

Akt1:p27 NM_005163 N NM_004064 C

3

Akt1:PDPK1 NM_005163 N NM_002613 c

4

BAD:BID NM_004322 N NM_001196 c

5

bARR2: b2AR NM_004313 N NM_000024 c

6

bARR2: b2AR + ISO Isoproterenol 2 !M; 30 min NM_004313 N NM_000024 c

7

Bcl-xL: Bad NM_138578 C M_004322 N

8

Bcl-xL: BIK NM_138578 N NM_001197 N

9

Cdc2:Cdc25A +CPT 500 nM CPT; 16 h NM_001786 N NM_001789 C

10

Cdc2: CDC25C NM_001786 N NM_001790 C

(continuación)

Descripción de PCA

Estimulación Gen de Genbank 01 Orientación de fusión del indicador Gen de Genbank02 Orientación de fusión del indicador

11

Cdc2: CDC25C +CPT 500 nM CPT; 16 h NM_001786 N NM_001790 C

12

Cdc2:Wee1 NM_001786 N NM_009516 N

13

CDC42:PAK4 NM_001791 N NM_005884 C

14

Chk1: CDC25A +CPT 500 nM CPT; 16 h NM_001274 N NM_001789 C

15

Chk1: CDC25C NM_001274 N NM_001790 C

16

Chk1: CDC25C +CPT 500 nM CPT; 16 h NM_001274 N NM_001790 C

17

Cofilina:LIMK2 NM_005507 C NM_005569 N

18

CiclinaB:Cdc2 NM_031966 N NM_001786 C

19

CiclinaD:Cdk4 NM_053056 N NM_001791 C

20

CiclinaE:Cdk2 NM_001238 N NM_001798 N

21

E6:E6AP AJ386069 N NM_130839 (CDS 1729.. 2028) C

22

E6:p53 AJ388069 N NM_000546 N

23

Elk1:MAPK1 NM_005229 C NM_002745 C

24

ESR1:SRC-1 NM_000125 N U40396(CDS 624..1256) N

25

Gai:b2AR NM_006496 C NM_000024 C

26

H-Ras:Raf NM_005343 N NM_002880 C

27

Hsp90: CDC37 NM_007355 C NM_007065 N

28

Hsp90:Eef2k NM_007355 C NM_007908 N

29

Hsp90:MEK1 NM_007355 C Z16415 N

30

MAPK9:ATF2 L31951 N NM_001880 N

31

Mdm2:p53 BC009893 N NM_000546 C

(continuación)

Descripción de PCA

Estimulación Gen de Genbank 01 Orientación de fusión del indicador Gen de Genbank02 Orientación de fusión del indicador

32

MKNK1: MAPK1 NM_003684 C NM_002745 C

33

MAX: MYC NM_002382 C NM_002467 C

34

NtCBP:JUN S66385 (CDS 1..2313) N NM_002228 C

35

NtCBP:p65 S66385 (CDS 1..2313) N NM_009045 N

36

Cdc2: p21 NM_001786 N NM_000389 N

37

P27: UbiquitinaC NM_004064 N NM_021009 (CDS 69..296) N

38

p50:p65 NM_003998 N NM_009045 N

39

p53:Chk1 NM_000546 C NM_001274 N

40

p53:Chk1 +CPT 500 nM CPT; 16 h NM_000546 C NM_001274 N

41

p53:p53 NM_000546 C NM_000546 C

42

p53:p53 +CPT 500 nM CPT; 16 h NM_000546 C NM_000546 C

43

PAK4:Cofilina NM_005884 C NM_005507 C

44

Pin1:CDC25C NM_006221 c NM_001790 c

45

Pin1:JUN NM_006221 c NM_002228 c

46

Pin1:p53 NM_006221 c NM_000546 c

47

PXR:RXRa BC017304 c NM-002957 c

48

RAD9:p38a NM_004584 c NM_001315 N

49

RAD9:p53 NM_004584 c NM_000546 N

50

Raf1:Map2k2 NM_002880 c D14592 N

51

RB1:CDK4 BC040540 c NM_001791 C

52

RXRa:PPARg NM-002957 c NM_138711 C

53

Smad3:HDAC NM_005902 N NM_004964 C

Tabla 4: Fármacos y concentraciones usados en ejemplo de realización de perfil farmacológico

Fármaco

Fuente Concentración Fármaco Fuente Concentración Fármaco Fuente Concentración

(S)-(+)-Camptotecina

Sigma 500 nM GGTI-2133 Calbiochem 5 microM Quetiapina Sequoia 2 microM

17-AAG

Tocris 5 microM Gleevec Novartis 10 microM Raloxifeno LKT Labs, Inc. 500 nM

Acetil ceramida

Sigma 10 microM Gó 6976 Calbiochem 100,00 nM Rapamicina Calbiochem 250 nM

ALLN

Calbiochem 25 microM GSK-3 Inh. II Calbiochem 1 microM Risperidona Sequoia 2 microM

Aminoglutetimida

Microsource 30 microM (GW1929 Alexis 3 microM Rofecoxib Sequoia 10 microM

Angiogenina

Sigma 100 ng/ml H-89 Calbiochem 2 microM Rolipram Calbiochem 25 microM

Angiotensina II

Calbiochem 300 nM HA14-1 Tocris 2 microM Roscovitina Calbiochem 5 microM

Apigenina

Calbiochem 50 microM HDAC Inh. I Calbiochem 10 microM Rosiglitazona LKT Labs, Inc. 15 microM

Óxido Arsénico (lll)

Sigma 5 microM lndirrubin-3'-Monoxima Calbiochem 10 microM Rosuvastatina Sequoia 30 microM

ATRA

Sigma 5 microM Isoproterenol Sigma 2 microM Rotenona Sigma 300 nM

BAY 11-7082

Calbiochem 10 microM Ketoconazol Sigma 30 microM Salbutamol Sigma 2 microM

Bicalutamida

Sequoia 500 nM L-744.832 Sigma 10 microM Sarafotoxina S6b Calbiochem 100 nM

Brefeldina A

Sigma 50 mg/ml Leptomicina B Sigma 10.00 ng/ml SB 203580 Calbiochem 25 microM

Cafeína

Sigma 50 microM Letrozol Sequoia 1,50 microM SC-560 Calbiochem 250 nM

Caliculina A

Calbiochem 2nM Cloruro de litio Sigma 1000 microM Sildenafilo Sequoia 1 microM

Celecoxib

Sequoia 10 microM Lovastatina Calbiochem 30 microM Simvastatina Calbiochem 30 microM

Cerivistatina

Sequoia 30 microM LPA Sigma 5 microM Tadalafilo Sequoia 1 microM

Ciglitazona

Calbiochem 15 microM LY 294002 Calbiochem 25 microM Tamoxifeno Calbiochem 500 nM

Cilostazol

Sigma 2 microM Mevastatina Calbiochem 30 microM Taxol Calbiochem 2,5 microM

Ciprofibrato

sigma 30 microM MG 132 Tocris I microM Talidomida Calbiochem 250 microM

Clembuterol

Sigma 2 microM Milrinona Sigma 200 nM Toremifeno Sequoia 500 nM

(continuación)

Fármaco

Fuente Concentración Fármaco Fuente Concentración Fármaco Fuente Concentración

Clofibrato

Sigma 30 microM Olanzapina Sequoia 2 microM TRAIL Sigma 50,00 ng/ml

Clozapina

Sequoia 2 microM Paroxetina Sequoia 10 microM Tricostatina A Calbiochem 5 microM

DBH

Calbiochem 5 microM Patulina Sigma 10 microM Troglitazona Calbiochem 15 microM

Dexametasona

Sigma 500 nM PD 158780 Calbiochem 1 microM Tirfostina AG 1296 Calbiochem 5 microM

Epotilona A

Calbiochem 100 nM PD 98059 Calbiochem 20 microM Tirfostina AG 1433 Calbiochem 25 microM

Estrógeno

Calbiochem 500 nM PD153035 Calbiochem 200 nM Valdecoxib Sigma 10 microM

Exemestano

Sequoia 1,50 microM Toxina Pertussis Sigma 100 ng/ml Vardenafilo Sequoia 1 microM

Fluvastatina

Calbiochem 30 microM Pifitrina-a Calbiochem 50 microM Wortmanina Calbiochem 500 nM

Fulvestrant

Tocris 500 nM Pioglitazona Calbiochem 15 microM Y-27632 Calbiochem 25 microM

Geldanamicina

Calbiochem 2,5 microM Pravastatina Calbiochem 30 microM Ziprasidona Sequoia 2 microM

Gemfibrozilo

Sigma 30 microM Propanolol Calbiochem 2 microM ZM 336372 Calbiochem 5 microM

Genisteína

Calbiochem 12,5 microM PTPBS Calbiochem 500 nM

Líneas celulares estables

Para varias interacciones, se generaron líneas celulares estables. Para p50/p65 y IkBa/p65, se transfectaron células HEK293 con el vector de fusión YFP [2]-p65 y se seleccionaron líneas celulares estables usando higromicina B 100 !g/ml (Invitrogen). Se transfectaron posteriormente las líneas celulares seleccionadas con YFP [1]-p50 o IKBa-YFP

[1] y se aislaron líneas celulares que expresaban YFP[1]-p50/YFP[2]-p65 y IKBa-YFP [1]/YFP [2]-p65 después de selección de doble antibiótico con higromicina B 50 !g/ml y zeocina 500 !g/ml. Para B2AR/B-arrestina, se transfectaron células HEK293 con el vector de fusión arrestina 1-YFP[1] y se seleccionaron líneas celulares estables usando zeocina 1000 !g/ml. Las líneas celulares seleccionadas se transfectaron posteriormente con el vector de fusión beta2-AR-YFP[2] y las líneas celulares estables que expresaban YFP[1]-beta-arrestina/beta2-AR-YFP[2] se aislaron siguiendo la selección de doble antibiótico con higromicina B 200 !g/ml y zeocina 500 !g/ml. Para Akt1/ PDK1, se co-transfectaron células HEK293 con los vectores de fusión YFP[1]-Akt1 y PDK1-YFP[2] y se seleccionaron líneas celulares estables usando zeocina 1000 !g/ml. Para todas las líneas celulares, las señales de fluorescencia eran estables durante al menos 25 pases (datos no mostrados). Aproximadamente 24 horas antes de los tratamientos farmacológicos, las células se sembraron en placas revestidas con poli-D-lisina de 96 pocillos (Greiner) usando un sistema de bomba peristáltica Multidrop 384 (Thermo Electron Corp., Waltham, Mass).

Estudio farmacológico

Se co-transfectaron células HEK293 (7.500 por pocillo) con 100 ng de los vectores de fusión complementarios usando Fugene 6 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 24 ó 48 horas después de la transfección, las células se exploraron frente a fármacos en pocillos duplicados como se describe posteriormente. Para estudios farmacológicos con p50:p65, betaArr2:beta2AR y Aktl:Pdkl, se sembraron líneas celulares estables 24 horas antes de tratamiento farmacológico.

Se ensayaron 107 fármacos diferentes (los nombres y dosis se enumeran en la Tabla 4) frente a 49 ensayos distintos por duplicado en uno o más puntos temporales. Las concentraciones farmacológicas se seleccionaron a aproximadamente tres veces (3 X) las CI50 celulares publicadas y se ensayaron para asegurar falta de toxicidad en células HEK293. Todas las etapas de manipulación de líquidos se realizaron usando un Biomek FX (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Se incubaron células que expresaban los pares de PCA en medio de cultivo que contenía fármacos durante 30 minutos, 90 minutos y 8 horas o, en el caso de rutas de respuesta a daño de ADN, durante 18 horas. Para ciertas rutas, las células se trataron en primer lugar con fármacos y después se estimularon con agonista, (CPT, TNFalfa o isoproterenol) para inducir la ruta. De esta manera, pudieron identificarse fármacos que bloquean una ruta dependiente de agonista. Después de los tratamientos farmacológicos las células se tiñeron simultáneamente con Hoechst 33342 33 !g/ml (Molecular Probes) y aglutinina de germen de trigo conjugada con TexasRed 15 !g/ml (WGA; Molecular Probes), y se fijaron con formaldehído 2 % (Ted Pella) durante 10 minutos. Las células se aclararon posteriormente con HBSS (Invitrogen) y se mantuvieron en el mismo tampón durante la adquisición de imágenes.

Análisis de imágenes de fluorescencia

Se adquirieron imágenes celulares con una cámara de fluorescencia automática Discovery-1 (Molecular Devices, Inc.) equipada con un brazo robótico (CRS Catalyst Express; Thermo Electron Corp., Waltham, Mass). Se usaron los siguientes conjuntos de filtros para obtener imágenes de 4 poblaciones no solapantes de células por pocillo: filtro de excitación 480 +/-40 nm, filtro de emisión 535 +/-50 mm (YFP); filtro de excitación 360 +/-40 nm, filtro de emisión 465 +/-30 nm (Hoechst); filtro de excitación 560 +/-50 nm, filtro de emisión 650 +/- 40 nm (Texas Red; estudio farmacológico). Se adquirieron cuatro exploraciones para cada pocillo representando cada exploración 150-300 células. Se usó un tiempo de exposición constante para cada longitud de onda para adquirir todas las imágenes para un ensayo dado.

Se analizaron imágenes sin procesar en formato TIFF de escala de grises de 16 bits usando módulos de la biblioteca ImageJ API (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, MD). En primer lugar, se normalizaron imágenes de cada canal de fluorescencia (Hoechst, YFP y Texas Red; el último sólo para el estudio farmacológico) usando el algoritmo de esfera rodante incorporado ImageJ. (Sternberg, 1983). Puesto que cada PCA genera señal en un compartimiento u orgánulo subcelular específico, y el tratamiento con un fármaco puede efectuar un cambio en la localización del complejo o intensidad de señal, se requirieron diferentes algoritmos para cuantificar de forma precisa señales fluorescentes localizadas en la membrana, núcleo o citosol. Cada ensayo se categorizó de acuerdo con la localización subcelular de la señal fluorescente y se cuantificaron cambios en la intensidad de señal a lo largo de cada población de muestra usando uno de cuatro algoritmos de análisis de imagen automáticos.

Algoritmo 1: Se cuantificaron cambios de la fluorescencia media por toda la célula completa después de la generación de máscaras basadas en imágenes de YFP (señal de PCA), Texas red (WGA; tinción de membrana) o Hoechst (tinción nuclear) con autoumbral. Se usó un histograma obtenido de la imagen de YFP sin umbral (YI) para definir el fondo global (la media del pico de intensidad más baja). La superposición de las tres máscaras definió partículas individuales (que se aproximan a las células). Se tomaron muestras de píxeles positivos dentro de la YI para calcular la intensidad de píxel media para todas las partículas positivas dentro de una exploración (media de partículas positivas, PPM).

Algoritmo 2: Para medir cambios de la fluorescencia restringida al núcleo, se tomaron muestras de todos los píxeles por encima de un valor de selección definido por el usuario que quedaron dentro de la máscara nuclear de la YI para determinar la fluorescencia nuclear media y fluorescencia nuclear total (normalizada a área de Hoechst) dando como resultado Suma de Nuc o Nuc media.

Algoritmo 3: Para medir cambios poblacionales de la fluorescencia total, se tomaron muestras de todos los píxeles por encima de un valor de selección definido por el usuario de la YI para determinar la fluorescencia total media y fluorescencia total (normalizada a área de Hoechst) dando como resultado suma de volumen o medio de volumen.

Algoritmo 4: Para medir cambios de la fluorescencia en la membrana, se usó una máscara basada en la imagen de Texas Red con umbral (WGA) para tomar muestras de píxeles dentro de la región de membrana. Se tomaron muestras de píxeles asociados a membrana por encima de un valor de selección establecido manualmente para determinar la fluorescencia de membrana media.

Para todos los algoritmos, los datos se corrigieron con respecto a fondo global antes de calcular los valores medios. Para cada ensayo se generaron conjuntos de ensayo de las imágenes. Cada conjunto incluyó imágenes de células tratadas con vehículo solamente (control) e imágenes de células tratadas con un compuesto de identificación (modulador conocido del ensayo). La fluorescencia en las imágenes se cuantificó con cada algoritmo, y los resultados se compararon con puntuaciones manuales de las imágenes para identificar el algoritmo más adecuado para cuantificar diferencias entre la muestra tratada y el control.

El efecto de cada tratamiento en cada ensayo se comparó con el resultado para el control de vehículo (PBS para isoproterenol y propranolol; DMSO para todos los otros fármacos). Para datos generados por el algoritmo 1, se agrupó la PPM para cada punto de datos (par de PCA/estímulo/fármaco) de al menos 8 exploraciones. Se aplicó un filtro externo para excluir las partículas que quedaban fuera del intervalo del grupo (media ± 3DT) antes de calcular la PPM para la muestra completa. Para los algoritmos 2 -4, la suma de Nuc, suma de volumen o suma de Mem para cada muestra representa la media de al menos 8 exploraciones para fármacos después de aplicación de un filtro 2DT para excluir exploraciones con artefactos fluorescentes. Se repitieron los resultados del estudio farmacológico en al menos tres experimentos separados para fármacos “distintivos” y mostraron concordancia entre los experimentos repetidos.

Matrices y agrupamiento

En las matrices, cada fila representa un fármaco único y cada columna representa un ensayo único en un punto temporal particular en ausencia o presencia de un modulador de ruta tal como TNFalfa, CPT o isoprotenerol. Cada punto de datos se formó tomando el logaritmo de la relación de la muestra y el control. Cada fila y columna tiene el mismo peso. El algoritmo de agrupamiento jerárquico de Ward (Ward, 1963) y métrica de distancia euclídea (http//www.r-project.org/) se usaron para agrupar los tratamientos. Para fines de presentación, cada punto de datos dentro de la matriz se codifica por colores para ilustrar diferencias relativas dentro de un ensayo. Se presenta un aumento en relación con el valor de control en verde y se presenta una reducción en rojo. Cada color se divide adicionalmente en dos niveles: nivel 1 (2x. CV) o nivel 2 (1,5 x CV). El nivel uno se presenta como el tono más claro y el nivel 2 como el tono más oscuro.

Resultados

Alcance de la invención

Los inventores han mostrado que la presente invención proporciona un procedimiento universal para realización de perfiles farmacológicos y descubrimiento de fármacos, que puede aplicarse a cualquier compuesto de ensayo, fármaco, sustancia tóxica, diana farmacológica, ruta o célula de interés. Se muestran numerosos ejemplos en las Figuras 6-16 de una amplia serie de proteínas y rutas.

La invención permite la identificación de efectos en ruta y fuera de ruta de fármacos y posibilita la mejora de candidatos farmacológicos a través de optimización de candidatos y retirada selectiva. La invención puede aplicarse por etapas para evaluar las propiedades de candidatos farmacológicos, modificar esas propiedades y volver a ensayar los candidatos modificados. Con este enfoque, son posibles estudios de actividad-estructura celular en los que las estructuras de compuestos químicos se ligan a resultados de ensayo particulares y perfiles farmacológicos, lo que permite la identificación de constituyentes químicos deseados y no deseados. De esta manera, la invención es un ejemplo de genómica química, puesto que permite la detección de efectos químicos a una escala genómica en un sistema biológico. La invención puede usarse con ensayos basados en células o in vitro, aunque los ensayos basados en células, como se usa en el presente documento, requieren menos manipulación.

Efectos en ruta y fuera de ruta de fármacos, sustancias tóxicas y compuestos candidatos

La Figura 6(A-B) muestra ejemplos de interacciones en rutas de GPCR. La Figura 7(A-C) muestra ejemplos de interacciones en las rutas de ubiquitina/sumo/proteasoma y efectos farmacológicos en esas rutas. La Figura 8 (A-D) muestra ejemplos de interacciones en rutas de señalización de quinasa y efectos farmacológicos en esas rutas. La Figura 9 (A-B) muestra ejemplos de interacciones en rutas de proteínas de choque térmico, y efectos farmacológicos en esas rutas. La Figura 10 (A-B) muestra ejemplos de interacciones en rutas del receptor de hormonas nucleares, y efectos farmacológicos en esas rutas. La Figura 11 (A-B) muestra ejemplos de interacciones en rutas apoptóticas y efectos farmacológicos en esas rutas. La Figura 12 muestra ejemplos adicionales de efectos farmacológicos (en ausencia o presencia de moduladores de ruta) en diversas rutas. La Figura 13 (A-B) muestra perfiles farmacológicos representados como histogramas. La Figura 14 ilustra la estrategia de modulación de ruta con resultados para rutas de respuesta a daño de ADN. La Figura 15 (A-B) ilustra la estrategia de modulación de ruta con resultados para una ruta de GPCR. Estos ejemplos se seleccionaron para representar clases diana de fármacos conocidos; estos ejemplos, y las interacciones enumeradas en la Tabla 1, se proporciona para ilustrar la amplitud de la invención, y no se pretende que limiten el alcance o uso de la invención. La invención puede aplicarse a cualquier proteína en cualquier ruta. Se analizan posteriormente ejemplos de interacciones proteicas y efectos farmacológicos.

Con esta estrategia, pueden verse efectos farmacológicos en un periodo de minutos u horas de tratamiento farmacológico, lo que permite la determinación de efectos tanto a corto plazo como a largo plazo. La Figura 12 (A-D) muestra imágenes representativas para 17 complejos proteicos conocidos que se modulan por mecanismos conocidos, incluyendo modificaciones post-traduccionales, degradación o estabilización de proteínas o translocación de proteínas. Cada fármaco mostrado provocó un aumento, reducción o un desplazamiento de la localización subcelular de la señal para un complejo particular en un momento particular del tratamiento en comparación con el control de vehículo apropiado. Las imágenes de diversos complejos muestran las localizaciones predominantemente de membrana, nucleares y citoplasmáticas de los complejos respectivos, destacando la naturaleza de alto contenido de estos ensayos y la capacidad para resolver localización subcelular de señales con microscopía automática.

Por ejemplo, muchas quinasas interaccionan con chaperonas tales como Hsp90 y Cdc37 (Perdew y col, 1997; Stancato y col, 1993, Arlander y col, 2003). Se mostraron imágenes de tales interacciones en la Figura 12 (A). Los inhibidores farmacológicos de HSP (geldanamicina o 17-alilamino-geldanamicina [17-AAG]) provocaron la pérdida de numerosos complejos que implicaban proteínas cliente. Por ejemplo, Akt1:Hsp90beta, Akt1:p27, Cdc37:Aktl y Akt1:Pdk1 fueron todas sensibles a geldanamicina y 17AAG como lo fueron H-Ras:Raf-1, Chkl:Cdc25C, Cdc2:Cdc25C; Cdc2:Weel; y Chk1:p53. Los ejemplos de los efectos de geldanamicina y 17AAG en los complejos de Aktl se muestran en la Figura 12 (A) y en la Figura 9B. Por lo tanto las asociaciones físicas y funcionales entre dianas, así como efectos farmacológicos específicos en las dianas, pueden determinarse tratando células vivas con fármacos y controlando los complejos proteicos dentro de rutas de interés.

En otro ejemplo, el receptor beta 2 adrenérgico (beta2AR) interacciona con beta-arrestina (beta-ARR2) después de fosforilación inducida por ligando del receptor por quinasas de GPCR (GRK) (Lin y col, 2002). En ausencia de agonista, no hubo complejos betaArr2:beta2AR visibles (Figura 15 panel izquierdo). El tratamiento de células con el agonista adrenérgico, isoprotenerol, provocó la formación de numerosos complejos betaArr2:beta2AR en un periodo de minutos (Figura 15 panel derecho). La microfotografía de fluorescencia en la Figura 15 muestra un patrón citoplásmico puntuado que es coherente con el curso temporal de unión de arrestina con el receptor y posterior internalización mediante depresiones revestidas de clatrina (Zhang y col, 1996). El pretratamiento de células con el agonista inverso, propranolol, evitó la interacción inducida por isoproterenol e internalización de betaArr2:beta2AR como se predeciría (Zhang y col, 1996). Estos resultados destacan la capacidad de este enfoque para detectar efectos temporales de agonistas y antagonistas directamente en sus dianas conocidas. Puesto que muchos GPCR se acoplan a beta-arrestina, estas y cualquier otra interacción corriente abajo puede explorarse con esta estrategia.

Una característica clave de la invención es la capacidad para distinguir efectos de diferentes fármacos a diferentes niveles de jerarquía de la ruta, como se ilustra en los siguientes ejemplos. En células en proliferación, fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) recluta Pdk y Akt a la membrana celular (Anderson y col, 1998). Wortmanina y LY294002 son inhibidores conocidos de PI3K (Vlahos y col, 1994), que evita la síntesis de receptores de membrana de fosfoinositida (PIP3) para Akt, evitando de este modo la translocación de Akt a la membrana en la que se fosforila y se activa por quinasa dependiente de fosfatidilinositol 3 (Pdkl). Los inventores estudiaron los efectos de fármacos en rutas que implican Akt evaluando el complejo entre Aktl y quinasa dependiente de fosfatidilinositol 3 (Pdkl) y entre Aktl y el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, p27 (CDKN1B; Kipl), que desempeña un papel en la regulación del ciclo celular. En pocillos de control, los complejos Akt1:Pdk1 se localizaron predominantemente en la membrana celular (Figura 8C) mientras que los complejos Aktl:p27 se concentraron en el núcleo celular (Figura 9B). Wortmanina y LY294002 provocaron una rápida relocalización de Ak1t:Pdk1 de la membrana al citoplasma y una reducción de los complejos Akt1:Pdk1 totales (Figura 8C) pero no tuvieron efecto significativo en Aktl:p27 (no mostrado). Sin embargo, ambos complejos fueron sensibles a geldanamicina y 17-AAG. Estos resultados sugieren que el grupo de complejos Akt1:p27 en el núcleo es insensible a fármacos que actúan en una etapa temprana de señalización de Akt. Las localizaciones y respuestas definidas de Akt1:Pdk1 y Aktl:p27 ilustran que cada ensayo informa sobre la biología de un complejo Akt particular en lugar del grupo celular total de Akt, una característica crucial para detectar efectos únicos de fármacos en procesos y compartimentos celulares definidos. Los inhibidores de quinasa con efectos corriente arriba pueden detectarse explorando interacciones corriente abajo. Esto se muestra en la Figura 12D, en la que LY294002 indujo complejos p53:p53 en presencia de CPT y en la Figura 8D, en la que dos inhibidores de quinasa no específicos diferentes redujeron los complejos H-Ras1:Raf-1. Estos resultados validan ambos la utilidad de la estrategia de realización de perfil de red que se presenta en diagrama en la Figura 3 y muestran que pueden detectarse efectos en ruta así como fuera de ruta con la invención.

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan una clase de proteínas diana para fármacos principal, como lo son los receptores de factor de crecimiento/citocinas, y receptores de hormonas nucleares. Los receptores de hormonas nucleares modulan los efectos de esteroides tales como estrógeno y testosterona, los efectos de retinoides y de agentes sintéticos tales como las tiazolidinedionas y fibratos. Los agonistas de receptores de hormonas nucleares se comercializan para una diversidad de indicaciones incluyendo el tratamiento de enfermedad metabólica, diabetes e hiperlipidemia. La Figura 10A ilustra algunas de las interacciones en estas rutas y los efectos de un agonista conocido, rosiglitazona (comercializado como Avandia) en su diana receptora, PPARgamma. Tales ensayos pueden usarse para explorar cualquier variedad de receptores conocidos o huérfanos y para determinar si los compuestos de ensayo activan o inhiben estas interacciones. Además, pueden usarse agonistas conocidos tales como rosiglitazona junto con la estrategia de modulación de ruta presentada en diagrama en la Figura 14A para identificar agentes que bloquean estas rutas activadas.

Además de las rutas mediadas por chaperona, GPCR, hormona nuclear y quinasa analizadas anteriormente, la Figura 12 muestra ejemplos de complejos implicados en procesos mediados por GTPasa dinámicos, el citoesqueleto, el ciclo celular, apoptosis, rutas de respuesta a daño de ADN e interacciones del receptor de hormonas nucleares. Se describen en el presente documento efectos representativos de fármacos en estas rutas como se detectan por estos complejos indicadores.

Se reconocen interacciones de GTPasa con proteínas efectoras como conmutaciones moleculares clave. La Figura 8D y Figura 13A ilustran un complejo efector de quinasa:GTPasa prototípico (H-Ras:Raf1) que era sensible a inhibidores de quinasa no selectivos, incluyendo BAY 11-7082. BAY 11-7082, originalmente identificado como un inhibidor de IKK, también bloqueó la translocación de p50:p65 (NFkappaB) del citoplasma al núcleo en respuesta a TNFalfa, como se esperaría (Figura 12B) (Thevenod y col, 2000). Con respecto a rutas que controlan la morfología del citoesqueleto, LIM quinasa 2 (Limk2) inactiva el factor de despolimerización de actina cofilina (Sumi y col, 1999). Los complejos de cofilina:Limk2 se eliminaron casi completamente por el inhibidor de quinasa indirrubina-3’monoxima (Figura 12C). Las proteínas del ciclo celular que se estudiaron incluyeron Cdc25C, Cdk4, ciclina D1 y p53. El tratamiento con el inhibidor de proteasoma, ALLN, dio como resultado la acumulación gradual de ciclina D1:Cdk4 en el núcleo (Figura 12B y 13B), coherente con la regulación de niveles de ciclina D1 por el proteasoma 26S (Diehl y col, 1997). Isoprotenerol indujo Mnkl:Erk2, un resultado que es coherente con informes previos de actividad MAPK inducida por agonista adrenérgico (Figura 12D) (Daaka y col, 1997; Muhlenbeck y col, 1998). Como se ha mencionado anteriormente, LY294O02 aumentó p53:p53, lo que es coherente con informes de que Akt fosfosrila y activa Mdm2, potenciando la ubiquitinación y degradación de p53 (Ogawara y col, 2002). Finalmente, los complejos de los factores de transcripción activados por ligando, PPARgamma:SRC-1 (Figura 12B) y PPARgamma:RXRalfa. (Figura 10A) aumentaron en respuesta al tratamiento con el agonista de PPARgamma, conocido, rosiglitazona, como se predijo (Nolte y col,) 1998.

Los inventores observaron efectos interesantes de fármacos particulares que son nuevos pero son coherentes con informes publicados de organización de rutas. La proteína citocina TRAIL, que es un ligando de familia TNFalfa (Wiley y col, 1995) aumentó Bcl-xL:Bad (Figura 12B). Además, el inhibidor de proteína quinasa, Gö6976, aumentó los complejos de PAK4 con la proteína citoesquelética cofilina (Figura 12D). En levadura, se activan homólogos de Cdc42 y PAK y se produce un cambio citoesquelético, a medida que las células progresan hasta la fase G2/M del ciclo celular (Richman y col, 1999). Gö6976 es un potente inhibidor de quinasas de punto de control (Chk) (Kohn y col, 2003) y facilita la progresión hasta G2/M. Por lo tanto, la activación mediada por Gö6976 de procesos corriente abajo de Cdc42/PAK, tales como PAK4:cofilina, no es sorprendente. Los inventores también demuestran por primera vez imágenes de un complejo nuclear que contiene un factor de transcripción (c-Jun) y una prolil isomerasa (Pinl). Pinl se une a Jun, después de fosforilarse y activarse por la quinasa JNK (Wulf y col, 2001). Los inventores observaron fuerte inhibición de complejos Pinl:Jun después del tratamiento celular con clofibrato (Figura 12D). Se ha mostrado que el clofibrato, un agonista de PPARalfa, aumenta la asociación de PPARalfa con sus co-reguladores transcripcionales y reduce la actividad transcripcional de c-Jun (Yokoyama y col., 1993) lo que conduce a la sugerencia por los presentes autores de una interacción directa de PPARgamma y c-Jun. Además, se ha demostrado que los agonistas de PPARgamma inhiben la actividad de la ruta JNK (Irukayama-Tomobe y col., 2004), lo que conduciría a una reducción de complejos Pinl:Jun, como observaron los inventores.

En resumen, podrían detectarse efectos farmacológicos tanto esperados como inesperados en una amplia serie de clases diana y procesos celulares en puntos temporales cortos y/o largos controlando complejos proteicos y sus respuestas a tratamiento farmacológico.

Los fármacos relacionados químicamente tuvieron actividades comunes en el panel de ensayos celulares

Los ejemplos presentados anteriormente ilustran que los efectos individuales de fármacos en procesos y rutas celulares pueden determinarse analizando la dinámica espacial y temporal de complejos proteicos. Los inventores extendieron este enfoque a la realización de perfiles farmacológicos de 107 fármacos diferentes (Tabla 4) que se dirigían a 6 áreas terapéuticas (cáncer, inflamación, enfermedad cardiovascular, diabetes, trastornos neurológicos, enfermedades infecciosas) o que actúan como moduladores generales de mecanismos celulares (por ejemplo, transporte de proteínas). Los inventores se centraron en concentraciones de fármacos fisiológicamente relevantes para evitar efectos fuera de diana generalizados observados con frecuencia con dosificación de compuesto por encima de la fisiológica. Los fármacos se ensayaron en múltiples puntos temporales que variaban de 30 minutos a 16 horas para captar efectos temporales tempranos en las rutas celulares. Como ejemplo, algunos compuestos inducen un aumento continuo en las señales de ensayos a lo largo del tiempo mientras que otros provocan un cambio bifásico en la intensidad de señal y otros tratamientos farmacológicos dan como resultado reducciones de la intensidad de señal a lo largo del tiempo.

Los datos cuantitativos para todos los resultados de ensayo/fármaco se presentan en una matriz codificada por colores agrupada tanto para fármacos como para puntos temporales de ensayos individuales (Figura 17A) y se muestra una vista expandida del dendrograma de grupos farmacológicos en la Figura 17B. Notablemente, los fármacos se agruparon principalmente en clases diana de estructura conocida, a pesar del hecho de que los ensayos no se seleccionaron intencionadamente para informar acerca de rutas a las que se dirigen los fármacos. Los resultados sugieren que los efectos farmacológicos compartidos en procesos celulares podrían elucidarse evaluando la dinámica de complejos proteicos dentro de las redes de señalización celular altamente ramificadas. Grupos de fármacos estructuralmente relacionados, con dianas celulares según se ha informado similares o idénticas, generaron grupos funcionales (Fig. 17B). Estos incluyeron los inhibidores de proteasoma ALLN y MG-132; los agonistas de GPCR beta adrenérgicos, isoproterenol, clembuterol y salbutamol; los inhibidores de HSP90, 17-AAG y geldanamicina; y los agonistas de PPARgamma, pioglitazona, rosiglitazona y troglitazona. En estos y otros ejemplos, las similitudes de los perfiles farmacológicos, que condujeron a los grupos observados, se asociaron con características estructurales compartidas dentro de grupos farmacológicos.

Pueden usarse sustancias tóxicas conocidas junto con la presente invención, tanto para estudiar mecanismos que subyacen en la toxicidad como para establecer perfiles farmacológicos relacionados con mecanismos tóxicos específicos. Los compuestos candidatos y otros agentes de ensayo pueden compararse después con las sustancias tóxicas conocidas para determinar si el compuesto de ensayo tiene actividades similares. Por ejemplo, el cloruro de cadmio tiene efectos pronunciados en múltiples rutas, como se muestra en la Figura 16A. Algunas de estas se conocen o se esperan, tales como el efecto del cadmio en NFkappaB (p50:p65) y tanto los efectos inesperados como los esperados del cadmio podrían precisarse en estos ensayos. Los perfiles de compuestos candidatos se compararon con los perfiles de cadmio, como se muestra en la Figura 16B. Dos candidatos químicos patentados tuvieron perfiles que eran similares al del cadmio. Se documentó posteriormente que estos compuestos producían toxicidad hepática en roedores. La realización de perfiles farmacológicos de los candidatos de acuerdo con la presente invención habría identificado esas actividades antes de los estudios animales, ahorrando tiempo y dinero en ensayos preclínicos.

Se desean algunas actividades de fármacos en ciertos contextos, pero estas son indeseables en otros contextos. La invención puede usarse para identificar estas actividades. La Figura 15B muestra que un compuesto candidato patentado, originalmente diseñado como un inhibidor de quinasa para la clínica oncológica, tuvo un efecto potente en el receptor beta adrenérgico. Esta actividad era no deseada a la vista de la indicación pretendida y permitió abandonar este compuesto. Estudios posteriores mostraron que este compuesto era de hecho cardiotóxico, validando de este modo la utilidad de la invención y de las interacciones proteína-proteína proporcionadas en el presente documento y los procedimientos para su uso.

Este resultado también destaca un aspecto importante y estrategia general de la presente invención que los inventores denominan una “estrategia de modulación de ruta” (Figura 14A). Muchas rutas celulares tienen baja actividad en un estado basal o no estimulado, pero pueden activarse con uno o más agonistas o activadores. Si una célula se trata en primer lugar con un compuesto de ensayo y después se trata con un agonista o activador, puede determinarse la capacidad del compuesto de ensayo para bloquear la activación de ruta. Este es el caso para el compuesto candidato estudiado en la Figura 15B, que bloqueó el receptor beta adrenérgico; un efecto que sólo pudo verse en presencia de isoprotenerol. (En ausencia de isoprotenerol, esta ruta está completamente cerrada, como se muestra en la imagen superior izquierda de la Figura 15B). Además, pudieron verse agentes que bloquean la ruta dependiente de TNF tratando con el agente y después estimulando células con TNF (Figura 12).

La estrategia de modulación de ruta se ejemplifica adicionalmente en la Figura 14B, en la que se trataron células con compuestos de ensayo (fármacos) y después con camptotecina. La camptotecina (CPT) induce daño de ADN durante un período de tiempo, e induce diversas interacciones en rutas de respuesta a daño, como se muestra en las imágenes de la Figura 14B. La evaluación de los efectos de diversos compuestos en presencia de CPT permitió la detección de agentes que bloqueaban los efectos de CPT o potenciaban los efectos de CPT. Algunos de estos efectos eran deseados o no deseados dependiendo del contexto. Por ejemplo, están en desarrollo inhibidores de quinasas de punto de control para su uso en la clínica oncológica junto con agentes de daño de ADN. Para tales agentes, se desean efectos sinérgicos con CPT y pueden detectarse con esta estrategia. Taxol y terfenadina activaron muchas de estas rutas, como se muestra en la matriz. Por el contrario, geldanamicina, 17-AAG y Y27632 tuvieron efectos opuestos en varias de estas rutas.

Como se muestra en la Figura 14B, la terfenadina activó varias rutas de respuesta a daño de ADN de una manera similar a la hallada para paclitaxel (taxol) un agente antineoplásico conocido y eficaz. Esto impulsó una evaluación de las actividades antiproliferativas potenciales de terfenadina. Los estudios de terfenadina en una línea celular de carcinoma de próstata mostraron que, de forma coherente con su perfil farmacológico como se determina en el presente documento, tenía una actividad antiproliferativa (datos no mostrados). Por lo tanto, la realización de perfiles farmacológicos de fármacos conocidos de acuerdo con la presente invención puede usarse para identificar rápidamente nuevos usos potenciales, indicaciones y combinaciones de fármacos conocidos para agentes terapéuticos humanos. Esto se consigue realizando perfiles farmacológicos con un fármaco conocido y comparando el perfil resultante con el de otros agentes con propiedades terapéuticas conocidas. Si el agente de ensayo tiene un perfil similar al de un agente con un perfil conocido/deseado entonces el agente de ensayo puede evaluarse en ensayos funcionales para determinar si tiene las mismas funciones que el fármaco comparador.

Mientras que algunas rutas celulares están inactivadas en el estado basal pero pueden activarse tratando células con agonistas de ruta, otras rutas celulares pueden estar activadas en el estado basal pero pueden inactivarse tratando las células con antagonistas o inhibidores. Por ejemplo, Akt está concentrado en la membrana, y Akt1:Pdk1 está activado, en células HEK293 cultivadas en presencia de suero, como se muestra por la señal de membrana robusta para Akt1:Pdk1 en estado basal (Figura 8C panel izquierdo). Por lo tanto, las células que expresan Akt1:Pdk1 podrían tratarse con antagonistas o inhibidores, tales como wortmanina o Ly294002, junto con el agente de ensayo de interés. Si el agente de ensayo es capaz de invertir el efecto del antagonista o inhibidor entonces restauraría la señal de Akt1:Pdk1 al estado de membrana (basal). La invención posibilita por lo tanto el tratamiento de células con un compuesto de ensayo de interés junto con otro agente. El agente adicional (modulador de ruta) puede aplicarse antes, después o simultáneamente con la aplicación del compuesto de ensayo de interés, determinándose el protocolo óptimo de forma empírica para cada ruta y ensayo. Se apreciará por un experto en la materia que la estrategia de modulación de ruta para realización de perfiles farmacológicos es un componente único de la invención que no se limita a la medición de una interacción proteína-proteína sino que puede aplicarse a otras mediciones de actividad de ruta, incluyendo como la cantidad o localización subcelular de cualquier proteína individual o de su estado de modificación post-traduccional.

Un experto en la materia se dará cuenta que la proteína quinasa, Aktl, experimenta el mismo patrón de redistribución subcelular en respuesta a wortmanina o Ly294002 como observaron los inventores para el complejo Akt1:PDK1. Por lo tanto, pueden usarse ensayos capaces de medir la localización y redistribución subcelular de Akt como alternativa a ensayos que miden la localización subcelular y redistribución del complejo Akt1:Pdk1. Están disponibles en el mercado ensayos para la redistribución de Akt de BioImage (Dinamarca) y pueden usarse en realización de perfiles farmacológicos junto con la presente invención. De forma similar, pueden usarse ensayos para la redistribución de la subunidad p65 del complejo NFkappaB junto con la presente invención, como alternativa a la medición del complejo p50:p65, y proporcionará resultados sustancialmente similares. Tales ensayos están disponibles de BioImage, en el que el ensayo se basa en la expresión de una proteína p65 marcada con GFP, o de Cellomics Inc, en el que el ensayo se basa en inmunofluorescencia con un anticuerpo específico de p65. En un ejemplo final, la localización subcelular de beta arrestina se desplaza a los endosomas en respuesta a agonistas y antagonistas beta adrenérgicos; estos ensayos se conocen como ensayos TransFluor (Norak/Molecular Devices) y pueden usarse como una alternativa a la medición del receptor: complejo de arrestina mostrado en la Figura 15A. La presente invención posibilita el uso de paneles de ensayo de alto contenido para realización de perfiles farmacológicos y tales paneles pueden incluir ensayo de alto contenido para la redistribución de proteínas individuales además de ensayos de alto contenido o alto rendimiento para complejos proteicos o interacciones.

La presente invención también aborda varias limitaciones de estrategias de realización de perfiles farmacológicos previamente usadas tales como microplacas génicas. Una característica de la invención es la capacidad para capturar efectos tanto a corto plazo como a largo plazo en múltiples puntos dentro de una ruta. Parte de las dinámicas de ensayo observadas fueron respuestas a actividades celulares funcionales o secundarias, tales como apoptosis o progresión del ciclo celular, particularmente en los puntos temporales más largos (8 horas o 16 horas), mientras que los puntos temporales más cortos informan sobre efectos más inmediatos de los compuestos. Explorando señalización en múltiples puntos temporales, y en múltiples niveles dentro de las jerarquías de ruta, los inventores pueden identificar cambios que implican directamente o cercanos a la diana de interés.

Son necesarios enfoques tales como este para clarificar los papeles funcionales y bioquímicos de proteínas particulares, y para identificar las dianas más prometedores para el desarrollo de agentes terapéuticos humanos. Una exclusión rápida de compuestos con efectos deletéreos potenciales (la denominada estrategia “a prueba de fallos”) es igualmente importante. Además, el entendimiento de la naturaleza bioquímica específica de la actividad fuera de diana permitiría el refinamiento de una estructura química para abordar atributos funcionales deseables o no deseables de una molécula. La estrategia descrita en el presente documento proporciona un medio eficaz para marcar compuestos para exclusión de estudios posteriores, o para redirigir el desarrollo a otras áreas terapéuticas.

Se hace referencia a las siguientes patentes y publicaciones:

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Aunque las muchas formas de la invención desveladas en el presente documento constituyen las realizaciones preferidas en la actualidad, son posibles muchas otras y los detalles adicionales de las realizaciones preferidas y otras realizaciones posibles no deben interpretarse como limitaciones. Se entiende que los términos usados en el presente documento son meramente descriptivos y no limitantes.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para efectuar la retirada de un compuesto de ensayo con propiedades no deseables, comprendiendo dicho procedimiento el análisis de dicho compuesto de ensayo que tiene propiedades no deseables contra un panel de ensayos de complementación de fragmentos proteicos a base de células, comprendiendo dicho

   5 panel dos o más ensayos de complementación de fragmentos proteicos de alto contenido.
2. 2. Un procedimiento para efectuar la retirada de un compuesto de ensayo con propiedades no deseables, comprendiendo dicho procedimiento el análisis de dicho compuesto de ensayo que tiene propiedades no deseables contra un panel de ensayos de complementación de fragmentos proteicos, comprendiendo dicho panel ensayos de alto contenido para dos o más interacciones proteína-proteína.

   10 3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ensayo de complementación de fragmentos proteicos se usa en una célula, fluido biológico o extracto.
3. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la célula es una línea celular, célula en cultivo, componente de un tejido intacto o animal, órgano en cultivo o un organismo vivo no humano.
4. 5. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que la célula es una célula de mamífero, bacteria, levadura, 15 planta u hongo.
5. 6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el organismo vivo no humano o animal es Drosophila, pez cebra

   o ratón.
6. 7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto de ensayo es una molécula

   sintética, producto natural, fármaco conocido o potencial, ligando, anticuerpo, péptido, ARN de interferencia pequeño 20 o biblioteca combinatoria.