ES2377232T3 - Análisis fluorescente - Google Patents

Abstract

Un método para llevar a cabo un análisis para una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis, este método comprende: (a) llevar a cabo una reacción en una solución entre una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis y un compuesto marcador fluorescente, la muestra y el compuesto marcador siendo combinadas en el momento t0; (b) excitar la fluorescencia en el compuesto marcador, en donde la naturaleza del marcador y la naturaleza de la excitación son tales que la mencionada fluorescencia tiene lugar a una longitud de onda en la que dicha fluorescencia es alterada por la reacción del compuesto marcador con la sustancia no fluorescente; (c) detectar, en múltiples puntos temporales la fluorescencia resultante mientras progresa la reacción; (d) calcular de la fluorescencia detectada los valores de F0 siendo la fluorescencia en el momento t0 y F∞ siendo la fluorescencia en el momento t∞ cuando toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con l compuesto marcador, por ajuste de curva de la fluorescencia detectada y extrapolar la curva al momenti t0 y al t∞. (e) calcular de los valores de F0 y F∞ el cambio en la fluorescencia atribuible a la reacción en el paso (a) ; y (f) determinar de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado la concentración de la sustancia no fluorescente presente en la muestra en t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente.

Description

Analisis de fluorescencia

[0001] La presente invención se refiere a métodos para realizar un análisis para una sustancia no-fluorescente en una muestra, y además se refiere al aparato para la realización de análisis de acuerdo a tales métodos.

[0002] La Patente Europea número EP 0.772.779 describe el análisis de proteínas glicosiladas por extinción de fluorescencia. El estado de la técnica como se ejemplifica en este documento describe el análisis de hemoglobina glicosilada usando la extinción de la fluorescencia producida cuando la mencionada hemoglobina glicosilada se enlaza a un conjugado producido por el enlace químico de fluorofóros a grupos de ácido borónico. Esta extinción dependiente de la concentración es después comparada con una medición de la hemoglobina total hecha por medios fotométricos convencionales, que está establecida en el estado de la técnica.

[0003] Sin embargo durante el método del estado de la técnica hay un nivel no específico inevitable de extinción de fluorescencia que no es causado por el enlace del mencionado conjugado a la hemoglobina glicosilada sino por un efecto de filtro inherente. Este efecto de filtro inherente es causado por la molécula de hemoglobina de por sí absorbiendo tanto la radiación excitante como la luz fluorescente emitida causada por superposición espectral del espectro de absorción de la hemoglobina con la excitación de fluorescencia y el espectro de emisión. Esta extinción de fluorescencia de fondo debe ser compensada en el cálculo para permitir la cuantificación de la extinción específica que es atribuida solamente a la concentración de hemoglobina glicosilada y por la tanto a su parte. Los inventores de la EP 0.772.779 consiguieron esto determinando la densidad óptica de la solución de la reacción a una longitud de onda adecuada (por ejemplo 405 nm o 415 nm) y restando un elemento a prorrata de la extinción de fluorescencia total dependiendo de su medición de densidad óptica.

[0004] En el método revelado en la EP 0.772.779 la concentración total de hemoglobina se mide usando métodos fotométricos convencionales como la absorbancia a 405 nm o 415 nm. Para que ese método funcione como se describe en la misma el usuario debe hacer dos mediciones independientes en instrumentos separados: un fotómetro para medir la densidad óptica total y un fluorímetro para medir la extinción de fluorescencia. Para que las pruebas tengan alguna utilidad comercial, por ejemplo en el tratamiento de la diabetes, cualquier instrumento diseñado y fabricado específicamente para la prueba debe por consiguiente tener una funcionalidad dual de tanto fluorímetro como fotómetro. Esto es costoso, más complejo e indeseable.

[0005] La extinción de la fluorescencia por la hemoglobina como se describe en la EP 0.772.779 tiene dos componentes. El primero, una caída instantánea inicial en la fluorescencia asociada con el espécimen de hemoglobina actuando como un filtro de densidad neutro en la excitación de la fluorescencia y en las longitudes de onda de emisión; y el segundo una extinción dependiente del tiempo de la señal de fluorescencia asociada con el curso temporal del enlace químico de la hemoglobina glicosilada con el reactivo conjugado fluorescente.

[0006] La presente invención pretende superar los problemas del método del estado de la técnica, como se ha descrito anteriormente y se detalla más adelante, con la esperanza de desarrollar un método de análisis significativamente mejorado, así como diseñar instrumentos automáticamente para conseguir los resultados deseados. Como un resultado de este estudio cuidadoso. Los presentes inventores han comprobado que siguiendo el curso temporal de alteración de la fluorescencia mientras la reacción del análisis progresa, la alteración de la fluorescencia de fondo, es decir, una disminución o aumento instantáneo no dependiente de la química de la reacción, puede ser determinada separadamente de la extinción de la fluorescencia dependiente del tiempo atribuida al enlace químico del compuesto objetivo con el reactivo fluorescente. Por lo anterior han descubierto también que una alteración en la fluorescencia detectada, en particular un efecto de extinción, cuando una sustancia es añadida al reactivo fluorescente puede ser usada para calcular la concentración de esa sustancia que no es fluorescente por sí misma.

[0007] De acuerdo a un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para llevar a cabo un análisis para una sustancia no fluorescente en una muestra, este método comprende:

(a)

llevar a cabo una reacción en una solución entre una sustancia no fluorescente en una muestra del análisis y un compuesto marcador fluorescente, la muestra y el compuesto marcador siendo combinados en el momento para;

(b)

excitar la fluorescencia en el compuesto marcador, en donde la naturaleza del marcador y la naturaleza de la excitación son tales que la mencionada fluorescencia tiene lugar a una longitud de onda a la que la mencionada fluorescencia es alterada por la reacción del compuesto marcador con la sustancia no fluorescente;

(c)

detectar, en múltiples puntos temporales, la fluorescencia resultante mientras progresa la reacción;

(d)

calcular de la fluorescencia detectada los valores de F0 siendo la fluorescencia en el momento t0 y Fr siendo la fluorescencia en el momento tr que es el punto en el que toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con el compuesto marcador, o la reacción ha alcanzado el equilibrio, por ajuste de la curva de la fluorescencia detectada y extrapolando la curva al momento t0 y tr;

(f) determinar de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado la concentración de sustancia no fluorescente presente en la muestra en el t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente.

[0008] Como se usa en la presente, cuando se hace referencia a una sustancia a ser ensayada (el analito) el término no fluorescente no significa que la sustancia es totalmente no fluorescente. En cambio significa que tienen un espectro de excitación y/o emisión diferente al del compuesto marcador fluorescente en las longitudes de onda de excitación y emisión relevantes.

[0009] Un uso principalmente pretendido de la presente invención es en el análisis de la hemoglobina glicosilada en sangre. De hecho, la génesis de la presente invención reside en mejorar un proceso para este análisis, y en particular analizar la cantidad o proporción de hemoglobina glicosilada (es decir, hemoglobina a la que la glucosa se ha vuelta enlazada no enzimáticamente) dentro de una muestra. Por esta razón la siguiente descripción describirá a menudo la invención respecto a esto, aunque la presente invención es igualmente aplicable para el análisis de muchas sustancias diferentes – en particular sustancias donde las características de absorción de los contenidos de la muestra son propensas a interferir con las características fluorescentes de un fluoróforo apropiado.

[0010] El primer aspecto de la presente invención requiere un compuesto marcador que es específico para la sustancia a ser analizada y la fluorescencia de la cual está apropiadamente alterada (posiblemente aumentada, pero más habitualmente disminuida) por el enlace del marcador con la sustancia.

[0011] El compuesto marcador habitualmente comprenderá un fluoróforo y un grupo de enlace adaptado para enlazar selectivamente con la sustancia. La selección de un fluoróforo apropiado y combinación de grupo de enlace para una sustancia objetivo particular puede ser hecha en base a prueba experimental o a las características conocidas de los fluoróforos y grupos de enlace existentes en relación a la sustancia a ser analizada. Una variedad de fluoróforos se menciona en la EP 772.779, el contenido de la cual está incorporado en la presente por referencia. Para una proteína glicosilada como la hemoglobina glicosilada un marcador adecuado podría incluir un grupo de ácido borónico enlazado por un grupo conector con un derivado de la fluoresceína. El ácido borónico enlaza en grupo cis-diol de una proteína glicosilada pero no es específico de la proteína. Se prefiere que el método se adapte específicamente para la detección de hemoglobina glicosilada y un marcador adecuado para esto podría tener la fórmula:

[0012] El algoritmo de calibración usado en la sección (f) puede ser de la forma y = mx + c, donde m y c son las constantes de calibración de intersección y pendiente y x = (F0 -F∞)/F0. La sustancia no fluorescente objetivo puede ser una subespecie (por ejemplo, hemoglobina glicosilada) de una sustancia principal (por ejemplo, la hemoglobina total en todas las formas), y las subespecies serán reactivas selectivamente con el compuesto marcador en comparación con la sustancia principal. En tal cado puede ser deseable conocer la concentración total de la sustancia principal (incluyendo las subespecies) presente en la muestra en el t0 antes de reaccionarla con el compuesto marcador fluorescente. Esto se puede determinar de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado de la forma y = m’x + c’; donde m’ y c’ son las constantes de calibración de intersección y pendiente y x = Log (FEn blanco/F0).

[0013] El cálculo de los valores de F0 y F∞ en el paso (d) incluye preferiblemente trazar los datos de fluorescencia detectados en el paso (c) contra el tiempo, y aplicar una curva de mejor ajuste a los puntos trazados. El trazado puede ser físico o incluso manual, pero a menudo se consigue automáticamente y matemáticamente ajustando la función matemática de una curva de mejor ajuste a los datos y extrapolando esa función al momento t0 y t∞ sin la generación de un gráfico como tal. El ajuste de la curva se puede conseguir por cualquier método matemático adecuado, y dos particularmente apropiados se describen más tarde en la especificación. Usando estos regímenes los datos registrados se usan para minimizar la varianza y después la curva es extrapolada para proporcionar valores para F0y F∞.

[0014] En un sistema instrumental completamente automatizado, donde la sangre es añadida al reactivo y mezclada por el instrumental, la extinción inicial puede ser posiblemente determinada dentro de los 5 primeros segundos más o menos tras la adición y el mezclado de la sangre. Sin embargo, en un sistema no automatizado, la monitorización de la reacción de enlace inicial es además retrasada debido al tiempo limitado requerido por un operario físicamente para añadir el espécimen de sangre a la cubeta de reacción que contiene el reactivo, mezclar y devolver la cubeta de la reacción al fluorímetro. Por lo tanto, el nivel de fluorescencia real en el t0, inmediatamente tras la adición del espécimen de sangre, no puede ser medido directamente en el sistema manual o en el automático. Para superar esto, el nivel de fluorescencia F0 en el momento t0, es decir, inmediatamente tras la adición y mezclado de la muestra pero antes de que tenga lugar la reacción, se determina por extrapolación hacia atrás de una curva ajustada a los datos de fluorescencia en el curso del tiempo, en base a la tasa de la ecuación de la reacción de enlace químico. Además, por extrapolación hacia delante de este ajuste de curva más allá del periodo de recogida de datos, el nivel de fluorescencia F∞ en el momento t∞ se determina también el punto final de la reacción. Determinando los niveles de fluorescencia en el t0 y el t∞ de esta manera ha demostrado que produce resultados precisos y fiables.

[0015] El periodo de tiempo sobre el cual la fluorescencia de la reacción se mide puede ser cualquiera adecuado para lo que se hace el análisis. Un periodo largo da mayor precisión pero un proceso de análisis más lento, mientras que un periodo corto es conveniente, pero puede llevar a resultados menos precisos ya que la cantidad de datos de los que extrapolar se vuelve más dispersa. La duración adecuada del periodo de medición dependerá de la sustancia que está siendo analizada y el perfil temporal de su reacción con el marcador fluorescente. Respecto al enlace del boronato de la hemoglobina con los grupos cis diol, un periodo de medición de alrededor de 3 minutos es habitualmente apropiado.

[0016] Se prefiere que antes de que la muestra sea combinada con el compuesto marcador en el paso (a), el compuesto marcador sólo (que está habitualmente en la forma de una solución de reactivo) sea excitado por radiación electromagnética incidente de una longitud de onda adecuada λn (es decir, la misma a la que la excitación tiene lugar durante la reacción con la muestra) y la fluorescencia inicial resultante (FEn blanco) en la frecuencia de emisión es detectada en la ausencia de la sustancia no fluorescente. Esto en combinación con el valor de F0 puede ser usado para calcular la alteración inicial en la fluorescencia, que a su vez puede ser usada para calcular la densidad óptica de fluorescencia (FOD) usando la ecuación:

FOD = Log [FEn blanco/F0] (Ecuación 1)

[0017] Esta función logarítmica de la alteración de fondo inicial (habitualmente un efecto de la extinción) está diseñado como la FOD. Se ha descubierto que la FOD es directamente proporcional a la densidad óptica de la solución de la reacción a una longitud de onda dada. En el ejemplo donde el análisis se refiere a la hemoglobina, es proporcional a la densidad óptica medida a 415 nm (Ver Figura 3). Como la densidad óptica, a 415 nm, es a su vez proporcional a la concentración total de hemoglobina, la medición de la extinción de la fluorescencia de fondo puede por lo tanto ser usada para determinar la concentración total de hemoglobina. Esta determinación de la extinción de la fluorescencia de fondo de la hemoglobina total puede por lo tanto ser usada para reemplazar la determinación de la densidad óptica, hecha de otra forma por un aparato fotométrico separado.

[0018] Puede no ser necesario determinar el FEn blanco antes de cada análisis, ya que este valor puede ser un valor estándar o constante dependiendo de la cubeta de reacción y del reactivo del compuesto de marcador usado.

[0019] De acuerdo a un segundo aspecto de la presente invención también se proporciona un método para determinar la concentración de una sustancia no fluorescente, comprendiendo excitar un reactivo fluorescente que concuerde con la excitación y un espectro de emisión que se superpone al espectro de absorción de la sustancia no fluorescente; detectar la fluorescencia resultante; añadir la sustancia no fluorescente al reactivo fluorescente concordante de tal forma que la sustancia reacciona con el reactivo fluorescente para alterar la fluorescencia a lo largo del tiempo; detectar un intervalo de los valores de fluorescencia durante un periodo de tiempo comenzando al menos 5 segundos después de la adición; usar el intervalo de valores de fluorescencia medidos para extrapolar un valor para la fluorescencia directamente tras la adición de la sustancia en el momento t; y calcular la concentración de la sustancia no fluorescente de la diferencia entre la fluorescencia detectada antes y después de la adición de la sustancia no fluorescente.

[0020] Es bien conocido el calcular la concentración de una sustancia en solución usando mediciones de densidad ópticas en comparación con los estándares establecidos. Sin embargo el segundo aspecto de la presente invención permite a una concentración ser derivada experimentalmente sin el uso de un fotómetro.

[0021] El método del segundo aspecto de la invención puede ser usado donde no hay reacción entre la sustancia no fluorescente y el reactivo, que puede ser similar al compuesto marcador descrito anteriormente. Sin embargo, preferiblemente hay una reacción dependiente del tiempo que altera (ya sea que aumente o disminuya) la fluorescencia detectada. Monitorizando esto y trazando un gráfico (ya sea realmente o teóricamente) como se describe respecto al primer aspecto, el valor del efecto de alteración inicial puede ser estimado precisamente por extrapolación de los datos medidos.

[0022] Cuando se mide la concentración de una sustancia que no reacciona con el marcador para cambiar la fluorescencia, no hay necesidad de extrapolar ya que la medición de la fluorescencia tomada algún tiempo después de la adición de la muestra será la misma que la inmediatamente después de eso. Pero cuando la muestra y el reactivo reaccionan, la extrapolación de retroceso a t0 puede ser usada para superar la incapacidad de medir el valor de F0 directamente.

[0023] Como los varios aspectos de la presente invención describen medios para hacer una determinación precisa de la cantidad o de la concentración de la sustancia presente o de la cantidad de una subespecie de esa sustancia (como el nivel de hemoglobina glicosilada dentro de la hemoglobina total) que está presente para el análisis de los datos de fluorescencia solos, el diseño y la construcción de cualquier instrumento asociado se simplifica mucho, con costes sustancialmente reducidos como una consecuencia. En particular, se pueden usar aparatos más simples no incluyendo un espectofotómetro para dar mejores resultados.

[0024] De acuerdo a un tercer aspecto de la presente invención se proporciona además un aparato para el análisis de una sustancia en una muestra y usar un compuesto marcador fluorescente, este aparato comprende:

(a)

un recipiente de reacción adaptado para contener una cantidad de compuesto marcador fluorescente y una muestra de análisis, el compuesto marcador junto con la sustancia en la muestra experimentan una reacción comenzando en el momento t0 y finalizando en el momento t∞ cuando toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con el compuesto marcador que altera las características fluorescentes del compuesto marcador;

(b)

una fuente de radiación electromagnética que tiene una longitud de onda λn para excitar la fluorescencia en el compuesto marcador;

(c)

medios de detección para medir la fluorescencia resultante en múltiples puntos temporales mientras la reacción progresa; y

(d)

un procesador adaptado: (1) para calcular de la fluorescencia medida los valores de F0 siendo la fluorescencia en el momento t0 y F∞ siendo la fluorescencia en el momento t∞ cuando toda la sustancia ha reaccionado con el compuesto marcador; (2) para calcular cualquier cambio en la fluorescencia atribuible a la reacción entre la sustancia y el compuesto marcador; y (3) para determinar de los valores calculados la cantidad de sustancia no fluorescente y/o una subespecie de la misma presente en la muestra en t0.

[0025] Los medios de detección, en el paso (c), pueden también ser adaptados para detectar la fluorescencia inicial FEn blanco y el procesador, en el paso (d) puede ser adaptado para calcular cualquier cambio de fondo en la fluorescencia no atribuible a la reacción con el compuesto marcador.

[0026] Para que los aspectos de la presente invención tengan un beneficio, al menos un elemento constituyente de la muestra – sea la sustancia que se va a cuantificar, una sustancia relacionada que necesita cuantificación en contraste con la sustancia deseada, o un contaminante – debe tener un espectro de absorción que se superponga en algún grado con el espectro de excitación y de emisión del marcador / reactivo fluorescente. Por lo tanto la longitud de inda de la radiación excitante y la naturaleza del marcador fluorescente deben concordar entre sí y ser seleccionadas en base a la naturaleza del análisis a ser realizado, que a su vez incluye las características de la sustancia a ser cuantificada y otras sustancias propensas a ser encontradas en la muestra.

[0027] Muchas modificaciones de los métodos y los aparatos de la presente invención descrita en la presente serán aparentes para el experto y estas modificaciones caen dentro del ámbito de la presente invención. Sin embargo para que estos principios puedan ser entendidos mejor, pero a modo de ejemplo solamente, la presente invención será descrita ahora en detalle en referencia a ciertos ejemplos y donde sea apropiado a los dibujos acompañantes en los que:

La Figura 1 es un gráfico que recoge la relación entre la densidad óptica (OD) a 415 nm y la cantidad de hemoglobina añadida; La Figura 2 es un plano del curso temporal de la señal de fluorescencia durante una reacción de enlace de hemoglobina / ácido eosina-borónico; La Figura 3 es un gráfico mostrando la relación entre la OD a 415 nm y la FOD derivada de la extinción de la fluorescencia de fondo; La Figura 4 es un gráfico mostrando las diferencias espectrales entre los diferentes tipos de hemoglobinas; La Figura 5 es un gráfico mostrando el espectro de absorción de la bilirrubina; La Figura 6 es un plano gráfico de los datos de fluorescencia contra el tiempo para la muestra 1 en el Ejemplo 1; La Figura 7 es un plano de la concentración de hemoglobina glicosilada contra la extinción específica para el Ejemplo 1; y La Figura 8 es un plano de la concentración total de hemoglobina contra la Densidad Optica de Fluorescencia (FOD) para el Ejemplo 1.

[0028] La presente invención puede ser usada para analizar la hemoglobina y en particular la hemoglobina glicosilada en sangre. En dicho método el compuesto marcador fluorescente, que puede ser ácido fluorosceína

borónico o como en este ejemplo un compuesto de ácido eosina-borónico, se introduce en una cubeta y antes de la introducción de un espécimen sanguíneo, se excita en un fluorímetro por radiación EM a una longitud de onda adecuada (510 nm) y la fluorescencia en blanco (FEn blanco) se mide detectando la emisión a 580 nm. Estas longitudes de onda fueron elegidas porque don un movimiento del máximo de excitación de la Eosina Y se consigue un mejor rendimiento del análisis. La longitud de onda de excitación elegida correspondiente a un punto donde el espectro de absorción de muchas especies de hemoglobina diferentes encontradas en la sangre (es decir carboxi-hemoglobina, oxi-, deoxi-, met-, etc.) tiene la variación más pequeña. Igualmente la longitud de onda monitorizada, 580 nm (con un paso de banda de 40 n), se elige para minimizar las diferencias entre la absorción integrada, sobre el paso de banda de emisión, para las varias especies de hemoglobina. La cubeta es retirada del fluorímetro o dejada en su lugar y la muestra de sangre es inmediatamente añadida y mezclada y se detecta y se registra la fluorescencia durante un curso de tiempo. Estos datos se trazan y una curva es ajustada al conjunto de datos. La Figura 2 muestra dicho perfil temporal de la reacción donde la fluorescencia inicial FEn blanco etiquetada 10 es registrada antes de la introducción de la muestra en el t0 (11). Los datos de la fluorescencia experimental reales para la reacción son registrados durante el tiempo (habitualmente en intervalos de 1 segundo) desde la reintroducción de la cubeta en un sistema manual o tras la mezcla en un sistema automático en el punto 13 hasta que ha transcurrido un periodo adecuado. Por extrapolación hacia atrás, se determina el nivel de fluorescencia F0 (ver punto marcado como 14) en el t0 (11), es decir el punto cuando la muestra fue añadida pero no tuvo lugar reacción con el marcador. Por extrapolación hacia adelante (que no se muestra porque el final de los datos de la medición están fuera del gráfico en la Figura 2) se determina de forma similar el nivel de fluorescencia F∞ (15.) en el punto final de la reacción t∞.

[0029] Dos de muchas rutinas de ajuste de curva potenciales han mostrado ser efectivas en la estimación extrapolada de F0 y F∞ y la posterior derivación de la FOD y la extinción específica.

[0030] En la primera se hace una estimación Ft-estimada en base a la fluorescencia medida Ft-real en cada uno de los puntos de medición de un segundo a lo largo del análisis de 3 minutos, usando una rutina de ajuste de curvas basada en la ecuación de tasa general siguiente (Ecuación 2).

Ft = F0 + (F∞ -F0) x (1-e-t/θ) Ecuación 2

donde, Ft = Fluorescencia en el momento t segundos F0 = Fluorescencia en el momento cero F∞ = Fluorescencia en el momento infinito (es decir al final de la reacción) e = 2,7813 (base logarítmica natural) θ = constante de tasa con F0, F∞, y θ siendo determinados iterativamente minimizando la suma de las diferencias al cuadrado entre el valor ajustado y el medido a cada punto temporal de un segundo, es decir, Σ (Ft-real –Ft-estimado)2 es minimizado por la rutina de ajuste.

[0031] El segundo enfoque usa la ecuación de tasa para una reacción química de segundo orden en lugar de la ecuación de tasa general (Ecuación 2) usada anteriormente, por la que:

A + B →C

V0 = k[A][B]

donde, V0 es la tasa de reacción, k = constante de tasa

[0032] La constante de tasa k , se define por

k = A. e-E/(RT)

donde, E = constante, A = energía de activación, R = constante de gas y T = temperatura absoluta

[0033] V0 se usa para calcular la intensidad de fluorescencia para cada segundo, las concentraciones de los reactivos modificados y V0 después se recalculan para el siguiente punto temporal. Un procedimiento iterativo

minimiza la suma de las varianzas al cuadrado entre el valor estimado y el valor medido ajustando los valores para E, A y R como en el ejemplo anterior.

[0034] Sin embargo, debe tenerse en cuenta que al menos respecto a la cuantificación de la hemoglobina la presente invención se refiere a los principios de estimar la caída de la fluorescencia inicial causada por la extinción de la fluorescencia debido al efecto filtro inherente de la hemoglobina, y después posiblemente usar esto para estimar la concentración de la sustancia o en realidad cualquier material de la extinción en la muestra. El modelo matemático de los datos se puede conseguir por otros métodos de ajuste de curvas que pueden ser igualmente aceptables en la práctica.

[0035] El parámetro FOD, densidad óptica de fluorescencia, se determina por la siguiente expresión:

FOD = Log [FEn blanco/F0] (Ecuación 1)

[0036] Se ha descubierto que la FOD está linealmente relacionada con la concentración total de hemoglobina. Se ha demostrado que la concentración de hemoglobina es proporcional a la densidad óptica de una muestra de sangre y 415 nm y la Figura 3 muestran que la FOS es directamente proporcional a la OD de la muestra. La alteración inicial, que cuando se analizan muestras de sangre para la hemoglobina es una caída (o extinción), cuando se calcula como una función logarítmica (FOD), se correlaciona con la medición de hemoglobina por fotometría de absorción en otras longitudes de onda.

[0037] Además de los beneficios comentados anteriormente, la presente invención también tiene otras consecuencias benéficas importantes particularmente en el análisis de sangre para la presencia de cuantos de hemoglobina glicosilada. La hemoglobina en los glóbulos rojos existe en una variedad de estados dependiendo del estado de oxigenación de la sangre del donante y su condición fisiológica. La deoxihemoglobina, la oxihemoglobina, la carboxihemoglobina, la sulfhidrilo hemoglobina y la met-hemoglobina son algunos de los tipos, o modificaciones químicas de la hemoglobina que pueden estar presentes en las muestras de sangre en cantidades diversas dependiendo de su edad y fuente. Cada tipo de hemoglobina se caracteriza por un espectro de absorción único cuando se somete a la luz de longitudes de ondas diversas (ver Figura 4 para una comparación de la oxihemoglobina y la deoxihemoglobina). Las muestras de sangre procesadas y almacenadas acumulan en particular una proporción significativa de met-hemoglobina donde el ión férrico está oxidado, cambiando su espectro de absorción y explicando su coloración rojal marrón profunda.

[0038] El estado de la técnica como se ejemplifica por la EP 0.772.779 no aprecia o contrarresta la influencia del estado de la molécula de hemoglobina con su espectro de absorción asociado, o su capacidad para extinguir la fluorescencia tanto en virtud de su absorción intrínseca como en virtud de su superposición espectral con el conjugado fluorescente. En cambio espera que una medición de la hemoglobina a 405 o 415 nm prediga precisamente la caída por extinción inicial causada por la presencia de hemoglobina en la muestra. Esto sólo es verdad para muestras de hemoglobina que tienen un espectro idéntico ya que la caída por extinción inicial es causada por los máximos de absorción de la hemoglobina secundarios que corresponden con las longitudes de onda de excitación y emisión λn del fluoróforo usado. Son los máximos de absorción secundarios los que muestran más variabilidad entre los estados de la hemoglobina.

[0039] Estas diferencias en los tipos de hemoglobina en el análisis son tan significativas que para calibrar el análisis, se deben usar los estándares que tienen la misma composición de tipos de hemoglobina que las muestras desconocidas bajo investigación. Por supuesto, en la práctica, el estado de un perfil de hemoglobina de un individuo es desconocido a la hora de la medición incluso si esa muestra está recién extraída ya sea de una punzada en el dedo o de una venopunción y, por lo tanto, la utilidad del análisis como método de cuidado está comprometida, ya que no pueden tener lugar imprecisiones inaceptables.

[0040] Además, los análisis clínicos de la HbA1c y otras hemoglobinas glicosiladas son a menudo sujetas a un proceso de verificación que implica la distribución de muestras de sangre almacenadas por un laboratorio central y su análisis simultaneo por sistemas diferentes. Si el análisis no se realiza idénticamente entre muestras recientes de pacientes y almacenadas o muestras de sangre manipuladas por laboratorios, tendrá lugar una tendencia inaceptable y el análisis fallará en conseguir los valores correctos.

[0041] Por lo tanto, además de la simplificación de los requisitos de instrumentación y medición, un beneficio adicional de la presente invención es el hecho deque una medición de la medición óptica basada en la extinción de la fluorescencia intrínseca de la muestra (FOD) reduce los errores que pueden ser introducidos en la metodología de prueba por las variaciones en el espectro compuesto de un perfil de hemoglobina de un individuo dado porque los espectros de los varios tipos de hemoglobina a estas longitudes de onda se asemeja más.

[0042] Un beneficio final de la presente invención es la reducción de errores causados por la presencia de muchos factores que interfieren que pueden influenciar las mediciones de absorción a 405 ó 415 nm. Por ejemplo, los pacientes que sufren de enfermedades de hígado que se manifiestan en la ictericia (es decir amarillamiento de la piel y los glóbulos oculares) tienen unos niveles circulantes altos de bilirrubina. La bilirrubina es un subproducto circulante del metabolismo de la hemoglobina y tiene una absorción de superposición significativa con los máximos principales de la hemoglobina (Figura 5). El método del estado de la técnica, que estimaba la extinción de la fluorescencia de fondo de una medición de la densidad óptica de la hemoglobina a sus máximos de absorción principales, puede ser influenciado por altos niveles de circulación de bilirrubina. La presente invención, estimando la

5 hemoglobina total por la extinción de la fluorescencia de fondo a longitudes de onda mayores que 500 nm, elimina esta fuente de error potencial.

Ejemplo 1

[0043] Se introdujo un volumen conocido (2,5 mL) de reactivo que comprendía un regulador (principalmente HEPES) y un compuesto fluorescente (Eosina Boronato) en una cubeta de reacción. Esto fue introducido en un aparato de acuerdo a la presente invención y fue sacada a 510 nm. Las lecturas de fluorescencia en blanco fueron tomadas a intervalos de 1 segundo.

15 [0044] Después, se introdujo un volumen de sangre, cuyo contenido/concentración de hemoglobina total y porcentaje de hemoglobina glicosilada se conoce, en una cubeta en el momento t0 y se mezcló. La florescencia a 510 nm fue después medida cada segundo hasta 3 minutos del tiempo de reacción. El tiempo necesario para llevar a cabo los resultados de la mezcla en la fluorescencia sólo se registraron desde alrededor del 7º segundo en adelante.

[0045] Las lecturas en blanco y de sangre de la señal y referencia de fluorescencia se exponen en la Tabla 1 siguiente.

Tabla 1

Número de Lectura (Segundos)

Datos de Fluorescencia Brutos Señal Referencia Señal de Fluorescencia Menos Fluorescencia de Fondo Señal de Fluorescencia / Referencia de Fluorescencia Ajuste

Espacios en blanco

1

3564362 51585883 3563988 0.069088436

2

3564298 51585628 3563924 0.069087537

(continuación)

Número de Lectura (Segundos)

Datos de Fluorescencia Brutos Señal Referencia Señal de Fluorescencia Menos Fluorescencia de Fondo Señal de Fluorescencia / Referencia de Fluorescencia Ajuste

3

3564874 51585846 3564500 0.069098411

4

3566215 51586743 3565841 0.069123205

5

3565496 51586091 3565122 0.069110141

Sangres

1

0 0 -374 0.0575

2

0 0 -374 0.0575

3

0 0 -374 0.0575

4

0 0 -374 0.0574

5

0 0 -374 0.0574

6

0 0 -374 0.0574

7

2955821 51583592 2955447 0.057294323 0.0573

8

2955062 51582679 2954688 0.057280623 0.0573

9

2953008 51583518 2952634 0.057239873 0.0573

10

2949933 51582543 2949559 0.057181341 0.0572

11

2949493 51583139 2949119 0.057172151 0.0572

12

2946591 51582599 2946217 0.05711649 0.0572

13

2945289 51583468 2944915 0.057090287 0.0571

14

2944638 51583291 2944264 0.057077863 0.0571

15

2943483 51583517 2943109 0.057055222 0.0571

16

2941483 51582296 2941109 0.057017799 0.0571

17

2939910 51584175 2939536 0.056985229 0.0570

18

2938487 51583010 2938113 0.056958929 0.0570

19

2937585 51582202 2937211 0.056942334 0.0570

20

2935457 51583227 2935083 0.056899949 0.0569

21

2934545 51584002 2934171 0.056881415 0.0569

22

2933246 51582555 2932872 0.056857827 0.0569

23

2932307 51583308 2931933 0.056838794 0.0569

24

2930244 51583334 2929870 0.056798771 0.0568

25

2928809 51583527 2928435 0.05677074 0.0568

26

2928925 51582154 2928551 0.0567745 0.0568

27

2927934 51582712 2927560 0.056754674 0.0568

28

2925072 51583693 2924698 0.056698112 0.0567

29

2924539 51582904 2924165 0.056688646 0.0567

30

2924052 51583196 2923678 0.056678884 0.0567

31

2921778 51582587 2921404 0.056635469 0.0567

32

2921581 51583313 2921207 0.056630853 0.0567

Número de Lectura (Segundos)

Datos de Fluorescencia Brutos Señal Referencia Señal de Fluorescencia Menos Fluorescencia de Fondo Señal de Fluorescencia / Referencia de Fluorescencia Ajuste

33

2918178 51581710 2917804 0.05656664 0.0566

34

2918348 51581902 2917974 0.056569725 0.0566

35

2916054 51582192 2915680 0.056524934 0.0566

36

2915194 51582289 2914820 0.056508155 0.0566

37

2914844 51582120 2914470 0.056501555 0.0565

38

2914629 51581901 2914255 0.056497627 0.0565

39

2912071 51581619 2911697 0.056448345 0.0565

40

2911685 51581776 2911311 0.056440689 0.0565

41

2909430 51580144 2909056 0.056398757 0.0565

42

2909121 51581358 2908747 0.056391439 0.0564

43

2908666 51581300 2908292 0.056382681 0.0564

44

2906914 51581161 2906540 0.056348867 0.0564

45

2905229 51581336 2904855 0.056316009 0.0564

46

2904469 51581125 2904095 0.056301506 0.0564

47

2903867 51580515 2903493 0.0562905 0.0564

48

2903108 51580361 2902734 0.056275954 0.0563

49

2902382 51580998 2902008 0.056261184 0.0563

50

2900836 51580764 2900462 0.056231466 0.0563

51

2899915 51580441 2899541 0.056213963 0.0563

52

2899699 51580109 2899325 0.056210137 0.0563

53

2899117 51579994 2898743 0.056198979 0.0563

54

2898402 51579715 2898028 0.056185421 0.0562

55

2896664 51580326 2896290 0.05615106 0.0562

56

2897052 51580613 2896678 0.05615827 0.0562

57

2896426 51580073 2896052 0.056146722 0.0562

58

2895070 51580024 2894696 0.056120486 0.0562

59

2894867 51579530 2894493 0.056117088 0.0562

60

2893832 51579129 2893458 0.056097458 0.0562

61

2893835 51578832 2893461 0.056097839 0.0561

62

2893142 51580065 2892768 0.056083062 0.0561

63

2891979 51579300 2891605 0.056061346 0.0561

64

2891624 51580313 2891250 0.056053363 0.0561

65

2889838 51579562 2889464 0.056019553 0.0561

66

2890166 51579307 2889792 0.056026189 0.0561

67

2888871 51579263 2888497 0.05600113 0.0561

68

2888266 51579055 2887892 0.055989626 0.0560

(continuada)

Número de Lectura (Segundos)

Datos de Fluorescencia Brutos Señal Referencia Señal de Fluorescencia Menos Fluorescencia de Fondo Señal de Fluorescencia / Referencia de Fluorescencia Ajuste

69

2887788 51578116 2887414 0.055981378 0.0560

70

2887371 51578675 2886997 0.055972686 0.0560

71

2887694 51578175 2887320 0.055979491 0.0560

72

2887040 51578384 2886666 0.055966585 0.0560

73

2886642 51577925 2886268 0.055959366 0.0560

74

2885106 51577596 2884732 0.055929943 0.0560

75

2884262 51576184 2883888 0.05591511 0.0560

76

2884732 51577237 2884358 0.055923081 0.0560

77

2884096 51577591 2883722 0.055910366 0.0559

78

2883331 51576616 2882957 0.055896591 0.0559

79

2882382 51577518 2882008 0.055877214 0.0559

80

2883826 51577070 2883452 0.055905696 0.0559

81

2882045 51577415 2881671 0.055870792 0.0559

82

2881718 51577408 2881344 0.055864459 0.0559

83

2881424 51577078 2881050 0.055859116 0.0559

84

2881564 51576485 2881190 0.055862473 0.0559

85

2882487 51575751 2882113 0.055881164 0.0559

86

2879464 51575861 2879090 0.055822432 0.0559

87

2879806 51575495 2879432 0.055829459 0.0558

88

2878031 51575609 2877657 0.05579492 0.0558

89

2877710 51576230 2877336 0.055788025 0.0558

90

2876336 51576600 2875962 0.055760985 0.0558

91

2877713 51576006 2877339 0.055788325 0.0558

92

2877616 51576122 2877242 0.055786319 0.0558

93

2877104 51578012 2876730 0.055774348 0.0558

94

2874740 51577685 2874366 0.055728868 0.0558

95

2875728 51576443 2875354 0.055749366 0.0558

96

2874720 51576213 2874346 0.055730071 0.0558

97

2875418 51576641 2875044 0.055743142 0.0558

98

2875735 51576325 2875361 0.055749629 0.0558

99

2875128 51576472 2874754 0.055737701 0.0557

100

2874927 51576492 2874553 0.055733783 0.0557

101

2874846 51576435 2874472 0.055732274 0.0557

102

2873640 51576098 2873266 0.055709255 0.0557

103

2873382 51575645 2873008 0.055704742 0.0557

104

2872954 51576065 2872580 0.05569599 0.0557

(continuada)

(continuación)

Número de Lectura (Segundos)

Datos de Fluorescencia Brutos Señal Referencia Señal de Fluorescencia Menos Fluorescencia de Fondo Señal de Fluorescencia / Referencia de Fluorescencia Ajuste

105

2872727 51575160 2872353 0.055692566 0.0557

106

2871226 51575773 2870852 0.055662801 0.0557

107

2872402 51575375 2872028 0.055686032 0.0557

108

2872774 51576582 2872400 0.055691942 0.0557

109

2870911 51575349 2870537 0.055657151 0.0557

110

2871892 51575295 2871518 0.05567623 0.0557

111

2870390 51575094 2870016 0.055647325 0.0557

112

2870840 51576083 2870466 0.055654983 0.0557

113

2870388 51575798 2870014 0.055646526 0.0556

114

2869947 51574332 2869573 0.055639557 0.0556

115

2870353 51573855 2869979 0.055647944 0.0556

116

2869297 51574060 2868923 0.055627247 0.0556

117

2868911 51573600 2868537 0.055620259 0.0556

118

2868895 51573772 2868521 0.055619763 0.0556

119

2868030 51573821 2867656 0.055602939 0.0556

120

2868701 51574367 2868327 0.05561536 0.0556

121

2866233 51574457 2865859 0.05556741 0.0556

122

2867978 51573835 2867604 0.055601915 0.0556

123

2867313 51573376 2866939 0.055589516 0.0556

124

2867172 51573576 2866798 0.055586566 0.0556

125

2866858 51573178 2866484 0.055580907 0.0556

126

2867058 51573583 2866684 0.055584348 0.0556

127

2867722 51573210 2867348 0.055597625 0.0556

128

2867285 51574328 2866911 0.055587947 0.0556

129

2858225 51574505 2857851 0.055412088 0.0556

130

2867356 51573382 2866982 0.055590343 0.0556

131

2863993 51573955 2863619 0.055524518 0.0555

132

2865453 51573157 2865079 0.055553687 0.0555

133

2865181 51574269 2864807 0.055547215 0.0555

134

2864123 51573728 2863749 0.055527283 0.0555

135

2864932 51572876 2864558 0.055543887 0.0555

136

2863379 51572485 2863005 0.055514195 0.0555

137

2863690 51573048 2863316 0.055519619 0.0555

138

2864278 51572945 2863904 0.055531132 0.0555

139

2864629 51572443 2864255 0.055538478 0.0555

140

2862974 51573092 2862600 0.055505689 0.0555

(continuada)

65 15

Número de Lectura (Segundos)

Datos de Fluorescencia Brutos Señal Referencia Señal de Fluorescencia Menos Fluorescencia de Fondo Señal de Fluorescencia / Referencia de Fluorescencia Ajuste

141

2863867 51572498 2863493 0.055523644 0.0555

142

2863679 51573115 2863305 0.055519334 0.0555

143

2862000 51572406 2861626 0.055487541 0.0555

144

2862424 51573097 2862050 0.055495019 0.0555

145

2861464 51572506 2861090 0.05547704 0.0555

146

2862311 51572555 2861937 0.055493411 0.0555

147

2862304 51571108 2861930 0.055494832 0.0555

148

2862010 51571937 2861636 0.05548824 0.0555

149

2859734 51572024 2859360 0.055444014 0.0555

150

2860693 51571533 2860319 0.055463137 0.0555

151

2860913 51571985 2860539 0.055466917 0.0555

152

2862295 51572314 2861921 0.05549336 0.0555

153

2861267 51571491 2860893 0.055474312 0.0555

154

2861138 51572499 2860764 0.055470727 0.0555

155

2860113 51570936 2859739 0.055452532 0.0555

156

2859600 51571386 2859226 0.055442101 0.0555

157

2860578 51571930 2860204 0.05546048 0.0555

158

2858371 51571186 2857997 0.055418485 0.0554

159

2859688 51570801 2859314 0.055444436 0.0554

160

2860773 51571318 2860399 0.055464919 0.0554

161

2857694 51570305 2857320 0.055406304 0.0554

162

2859769 51570656 2859395 0.055446163 0.0554

163

2859690 51571693 2859316 0.055443516 0.0554

164

2859449 51570510 2859075 0.055440115 0.0554

165

2860192 51570519 2859818 0.055454513 0.0554

166

2858530 51569196 2858156 0.055423707 0.0554

167

2858942 51570525 2858568 0.055430268 0.0554

168

2858447 51570477 2858073 0.055420721 0.0554

169

2857559 51570836 2857185 0.055403116 0.0554

170

2857736 51570526 2857362 0.055406881 0.0554

171

2857315 51569676 2856941 0.055399631 0.0554

172

2857600 51569981 2857226 0.055404829 0.0554

173

2858461 51570608 2858087 0.055420851 0.0554

174

2856840 51570008 2856466 0.055390063 0.0554

175

2857004 51569874 2856630 0.055393387 0.0554

176

2856544 51569621 2856170 0.055384739 0.0554

Número de Lectura (Segundos)

Datos de Fluorescencia brutos Señal Referencia Señal de Fluorescencia Menos Fluorescencia de Fondo Señal de Fluorescencia / Referencia de Fluorescencia Ajuste

177

2856786 51569880 2856412 0.055389154 0.0554

178

2856348 51570223 2855974 0.055380292 0.0554

179

2857336 51569511 2856962 0.055400215 0.0554

180

2857080 51570092 2856706 0.055394627 0.0554

[0046] Además de los datos de fluorescencia brutos, la Tabla 1 también muestra varias operaciones matemáticas llevadas a cabo en esos datos. La primera operación matemática es restar esta fluorescencia de fondo (FBgd) de los datos de fluorescencia bruta, para tanto las lecturas en blanco y de sangre. La señal de fondo de fluorescencia (FBgd) se deriva de una lectura de la solución reguladora, sin la presencia de un reactivo marcador fluorescente y que ha sido previamente medida. Es predominantemente una constante del lector, este fondo es principalmente el cero eléctrico del fluorímetro; ya que los filtros ópticos del fluorímetro han sido optimizados para reducir la “penetración del filtro” del regulador efectivamente a “cero”.

25 [0047] Las tres últimas de las lecturas en blanco se promedian para establecer el FEn blanco.

[0048] Los datos de fluorescencia corregidos son después divididos por la referencia. Si esto se traza contra el tiempo produce una curva como se muestra en la Figura 6. Una curva se ajusta a estos valores usando un algoritmo adecuado como se ha mencionado anteriormente y los valores (como se muestran en la columna de la derecha) son también trazados en el gráfico en la Figura 6. Los valores de F0 y F∞ se pueden derivar de esta muestra por extrapolación hacia atrás y hacia delante de los datos ajustados a t0 y a t∞ respectivamente.

[0049] La Tabla 2 muestra los resultados de una tanda de análisis equivalente en 20 muestras. El análisis de la muestra (muestra 1) mostrado en la Tabla 1 se acompaña con otros 19 que también tenían cantidades de referencia

35 conocidas de Hemoglobina total (Total Hb), concentración de hemoglobina glicosilada ([A1c]) y porcentaje de hemoglobina glicosilada (%A1c).

[0050] La FEn blanco (corregida) es la media de los valores de “Señal de Fluorescencia/Referencia de Fluorescencia” para los espacios en blanco en la Tabla 1.

[0051] Para cada muestra, se calculan la Densidad Óptica de Fluorescencia (FOD) y la Extinción Específica (SQ) de FEn blanco, F0 y F∞ usando las fórmulas siguientes:

FOD = Log [FEn blanco –FBdg)/(F0 –FBdg)] [Ecuación 1B] SQ = (F0 –F∞)/(F0 –FBdg) [Ecuación 3]

[0052] De De FOS y SQ se calculan las concentraciones de hemoglobina total y hemoglobina glicosilada (a1c) respectivamente por.

[Hb Total] = m.FOD + c [Ecuación 4]

[A1c] = m’.SQ + c’ [Ecuación 5]

55 [0053] Las constantes de calibración m, m’, c y c’ se derivan de los datos de la análisis de la curva estándar (línea recta) usando muestras de concentraciones [A1c] y [Hb Total] conocidas. Para los datos de la muestra proporcionado c y c’ son cero ya que los datos han sido restringidos en ambos trazados a ir hacia cero.

[0054] El porcentaje de hemoglobina glicosilada en la muestra es después calculado así:

%A1c = ([A1c] / [Hb])*100% [Ecuación 6]

%A1c = ((m’. SQ + c’) / (m . FOD + c))*100 [Ecuación 7]

[0055] Si el valor de la concentración de Hemoglobina Total es trazado contra la FOD se ha descubierto que son directamente proporcionales y el gráfico puede ser resumido de acuerdo a la ecuación y = mx + c en la que y es la concentración total de Hemoglobina y x es la FOD. m y c pueden ser entonces calculadas para un conjunto particular de parámetros de reacción específicos para dar la curva de calibración estándar. La Figura 8 muestra [Hb Total]

[0056] Igualmente se ha descubierto que la Extinción Especifica (SQ) es directamente proporcional a la concentración de A1c, y el gráfico puede ser resumido de acuerdo a la ecuación y = m’x + c’ en la que y es la concentración de Hemoglobina glicosilada y x es la extinción específica. m' y c’ pueden entonces ser calculadas para un juego particular de condiciones de reacción específicas para dar estándares adicionales. La Figura 7 muestra [a1c] contra SQ para las muestras 1 a 20 con la línea ajustada a la misma siendo resumida por la ecuación y = m’x + c’.

[0057] Para este ejemplo los estándares derivados de estas se muestran a continuación en la Tabla 3.15

Tabla 3

[A1c] -vs.-SQ Pendiente = m’

0.1302

[A1c] -vs. -SQ Intercepción = c’

0

[Total Hb] -vs. -FOD Pendiente = m

1.318

[Total Hb] -vs. -FOD Intercepción = c

0

[0058] Estas constantes de calibración son derivadas para un juego particular de criterios de reacción, y estos pueden ser usados para análisis posteriores usando los mismos criterios. Condiciones de reacción diferentes pueden requerir diferentes constantes de calibración para ser derivadas.

[0059] La Tabla 2 muestra los valores calculados de % de Hemoglobina Glicosilada y una comparación con el valor conocido indica la naturaleza precisa del análisis de la presente invención. De hecho la desviación estándar del error en el conjunto de los datos de la muestra es sólo 0,4% A1c, demostrando la precisión de la presente invención.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para llevar a cabo un análisis para una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis, este método comprende:

   5 (a) llevar a cabo una reacción en una solución entre una sustancia no fluorescente en una muestra de análisis y un compuesto marcador fluorescente, la muestra y el compuesto marcador siendo combinadas en el momento t0;

   (b)

   excitar la fluorescencia en el compuesto marcador, en donde la naturaleza del marcador y la naturaleza de la excitación son tales que la mencionada fluorescencia tiene lugar a una longitud de onda en la que dicha fluorescencia es alterada por la reacción del compuesto marcador con la sustancia no fluorescente;

   (c)

   detectar, en múltiples puntos temporales la fluorescencia resultante mientras progresa la reacción;

   (d)

   calcular de la fluorescencia detectada los valores de F0 siendo la fluorescencia en el momento t0 y F∞ siendo la fluorescencia en el momento t∞ cuando toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con l compuesto marcador, por ajuste de curva de la fluorescencia detectada y extrapolar la curva al momento

   15 t0 y al t∞.

   (e)

   calcular de los valores de F0 y F∞ el cambio en la fluorescencia atribuible a la reacción en el paso (a); y

   (f)

   determinar de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado la concentración de la sustancia no fluorescente presente en la muestra en t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente.

2. 2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el antes del paso (a) el compuesto marcador es excitado y la fluorescencia resultante inicial (FEn blanco) se detecta en ausencia de la sustancia no fluorescente.
3. 3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en el que los valores de F0 y FEn blanco se usan para 25 calcular la densidad de fluorescencia óptica (FOD) usando la ecuación:

   FOD = Log [FEn blanco/F0] (Ecuación 1)

4. 4.

   Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el cálculo de los valores F0 y F∞ en el paso (d) incluye ajustar una función matemática de una curva de mejor ajuste a los datos de fluorescencia detectados en el paso (c) y extrapolar esa función al momento t0 y t∞.

5. 5.

   Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el algoritmo de

   calibración usado en la sección (f) es de la forma y = mx + c, donde m y c son las constantes de calibración de35 pendiente e intercepción, y es la concentración de la sustancia no fluorescente en el t0 y x = (F0 -F∞)/F0.
6. 6. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la sustancia no fluorescente es una subespecie de una sustancia principal, y la subespecie es selectivamente reactiva con el compuesto marcador, y en donde la concentración total de la sustancia principal y la subespecie presente en la muestra en el t0 antes de reaccionar con el compuesto marcador fluorescente, se determina de los valores calculados y un algoritmo de calibración adecuado de la forma y = m’x + c’; donde m’ y c’ son las constantes de calibración de pendiente e intercepción, y es la concentración total de la sustancia principal incluyendo la subespecie presente en la muestra en el t0 t x = Log(FEn blanco/F0).

   45 7. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sustancia a ser analizada es una proteína glicosilada, y preferiblemente es hemoglobina glicosilada.

7. 8.

   Un método como se reivindica en la reivindicación 7, en donde el compuesto marcador contiene un grupo de ácido borónico capaz de enlazar selectivamente con el grupo cis-diol de la proteína glicosilada.

8. 9.

   Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto marcador fluorescente tiene una longitud de onda de excitación principal en el intervalo de 200 nm a 800 nm, y preferiblemente de aproximadamente 510 nm.

   55 10. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el marcador fluorescente es seleccionado del grupo consistente de compuestos que contienen residuo de fluoresceína; compuestos de la fórmula F-NH-CS-NH-Ph-B(OH)2 donde Ph es un grupo fenilo y F es un residuo de fluoresceína; y un compuesto de la fórmula I:

9. 11.

   Un método como es reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es una muestra sanguínea, una muestra de plasma, una muestra de suero, o una muestra de orina.

10. 12.

    Aparato para el análisis de una sustancia, en una muestra, que comprende:

    25 (a) un suministro de un compuesto marcador fluorescente;

    (b)

    un recipiente de reacción adaptado para mantener una cantidad del compuesto marcador fluorescente y una muestra de análisis, que juntos experimentan una reacción comenzando en el momento t0 y finalizando en el momento t∞ cuando toda la sustancia no fluorescente ha reaccionado con el compuesto marcador que altera las características de fluorescencia de compuesto marcador;

    (c)

    una fuente de radiación electromagnética que tiene una longitud de onda λn para excitar la fluorescencia en el compuesto marcador;

    (d)

    medios de detección para medir la fluorescencia resultante en múltiples puntos temporales mientras progresa la reacción; y

    (e)

    un procesador adaptado para calcular de la fluorescencia medida los valores de F0 siendo la fluorescencia

    35 en el momento t0, y F∞ siendo la fluorescencia en el momento t∞ cuando toda la sustancia ha reaccionado con el compuesto marcador; para calcular cualquier cambio en la fluorescencia atribuible a la reacción entre la sustancia y el compuesto marcador; y para determinar de esos valores calculados la cantidad y/o concentración de la sustancia no fluorescente y/o una subespecie de la misma presente en la muestra en el momento t0.

11. 13.

    Un aparato como se reivindica en la reivindicación 12, que está adaptado para recibir una muestra derivada sanguínea y para realizar un análisis para determinar la cantidad de hemoglobina glicosilada.

12. 14.

    Un método de determinar la concentración de una sustancia no fluorescente, que comprende excitar un

    45 reactivo fluorescente concordante, el espectro de excitación y de emisión del cual se superpone al espectro de absorción de la sustancia no fluorescente; detectar la fluorescencia resultante; añadir la sustancia no fluorescente al reactivo fluorescente concordante de tal forma que la sustancia reaccione con el reactivo fluorescente para alterar la fluorescencia a lo largo del tiempo; detectar un intervalo de los valores de fluorescencia durante un periodo de tiempo comenzando al menos 5 segundos después de la adición; usar el intervalo de valores de fluorescencia medidos para extrapolar un valor para la fluorescencia directamente tras la adición de la sustancia en el momento t0; y calcular la concentración de la sustancia no fluorescente de la diferencia entre la fluorescencia detectada antes y después de la adición de la sustancia no fluorescente.