ES2372239A1

ES2372239A1 - Método para producir celulas troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método.

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Publication number: ES2372239A1
Application number: ES201030673A
Authority: ES
Inventors: Luis Rafael Ramos Pascua; Andrés Saldaña Díaz; Marta López Laguna; Javier Iglesias Muñoz; José Antonio Rodríguez-Altonaga Martínez; José Manuel Gonzalo Órden
Original assignee: Universidad de Leon
Current assignee: Universidad de Leon
Priority date: 2010-05-05
Filing date: 2010-05-05
Publication date: 2012-01-17
Anticipated expiration: 2030-05-05
Also published as: ES2372239B2

Abstract

Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método.La presente invención describe un método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenido de mamíferos que comprende las fases de obtención de la muestra de tejido adiposo, purificación y fragmentación de la misma; aislamiento de las células troncales mesenquimales; cultivo y expansión in vitro; caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tejido adiposo, óseo o cartilaginoso. La muestra de tejido adiposo se mantiene a temperatura ambiente antes de ser sometida a digestión enzimática, manteniendo la mezcla en reposo y evitando el filtrado. Las células obtenidas, y en particular, las de fenotipo osteogénico pueden utilizarse para regeneración ósea.

Description

Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método.

Objeto de la invención

Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método. Dicho método comprende las fases de obtención de la muestra de tejido adiposo, purificación y fragmentación de la misma; aislamiento de las células troncales mesenquimales; cultivo y expansión in vitro; y caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tejido adiposo, óseo o cartilaginoso. La muestra de tejido adiposo se mantiene a temperatura ambiente antes de ser sometida a digestión enzimática, manteniendo la mezcla en reposo y evitando el filtrado. Las células obtenidas, y en particular, las de fenotipo osteogénico pueden utilizarse para regeneración ósea.

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Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un método para producir células troncales mesenquimales (ADMSCs) derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método, para su posible utilización en reparación ósea.

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Estado de la técnica anterior a la invención

El sistema óseo presenta una gran capacidad regenerativa que, sin embargo, es limitada. Las estrategias terapéuticas actuales en relación con la reparación ósea, cuando es necesaria ante defectos esqueléticos de diferente naturaleza, se refieren al empleo de injertos y sustitutivos óseos, que muestran propiedades particulares y, derivadas de ellas, ventajas e inconvenientes para su uso. La terapia celular y las técnicas de ingeniería tisular se han desarrollado en los últimos años como alternativa a algunas de las limitaciones de aquellos procedimientos. En este contexto, la terapia con células troncales de naturaleza mesenquimal está adquiriendo cada vez más importancia en el tratamiento de diferentes patologías óseas.

Desde que Phemister, en 1947, utilizara la inyección de células troncales mesenquimales de médula ósea
(BMMSCs) en pacientes con pseudoartrosis (Phemister MD. Treatment of ununited fractures by onlay bone grafts without screw or tie fixation and without breaking down of the fibrous unión. J Bone Joint Surg, 1947;29:946-60) y, en las décadas posteriores, Burwell definiera la capacidad regenerativa de la médula ósea de la cresta ilíaca (Burwell RG. Studies in the transplantation of bone. VII. The fresh composite homograft-autograft of cancellous bone; an analysis of factors leading to osteogenesis in marrow transplants and in marrow-containing bone grafts. J Bone Joint Surg 1964;46B:110-40), el implante de células mesenquimales para el tratamiento de diferentes tipos de lesiones óseas ha ido adquiriendo cada vez más importancia. Se han ensayado con éxito como tratamiento percutáneo de necrosis óseas y en fracturas; y se continúa investigando para utilizarlas en la reparación de defectos óseos mayores con técnicas de ingeniería tisular. Estas técnicas comprenden la utilización combinada de grandes poblaciones celulares, andamiajes que actúen como vector para las células y factores de crecimiento.

En los últimos años se han descrito nuevos orígenes tisulares a partir de los que poder aislar células troncales mesenquimales con un potencial similar al de la médula ósea. Es el caso de la placenta, el cordón umbilical o el tejido adiposo, siendo éste la alternativa más interesante dada su abundancia y accesibilidad, en contraste con la limitada cantidad de tejido medular que se puede obtener y con la dificultad y morbilidad asociadas a su extracción. Por otra parte, parecen no existir diferencias significativas entre las ADMSCs y las BMMSCs en cuanto a rendimiento de células adherentes, cinética de crecimiento, senescencia celular y capacidad de diferenciación; existiendo incluso investigaciones recientes que afirman que a partir del tejido adiposo se obtiene un mayor número de células madre mesenquimales y con mayor capacidad proliferativa que las que se aíslan de la médula ósea. Algunas publicaciones en relación con la utilización de células de origen adiposo son:

- Zuk P A, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte D A, Huang J I, Mizuno H, Alfonso Z C, Fraser J K, Benhaim P, Hedrick M H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell, 2002, 13:4279-4295.

- Fraser J K, Wulur I, Alfonso Z, Hedrick M H. Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends Biotechnol 2006; (24) :150-4;

_ Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klüter K, Bieback K. Comparative Analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 2006; 24:1294-301.

- Zuk P A, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell J W, Katz A J, Benhaim P, Lorenz H P, Hedrick M H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001; 7:211-
28.

En la misma línea, se ha demostrado que las ADMSCs son capaces de adquirir fenotipos de hueso, cartílago, grasa o miocardio, además de piel y neuronas, dependiendo del microambiente que se cree mediante la adición in vitro de determinados factores de crecimiento y proteínas.

Aunque las técnicas de obtención y diferenciación osteoblástica de las ADMSCs han sido bastante estudiadas en los últimos años, la mayoría de los estudios in vitro utilizan células procedentes de lipoaspirados humanos (Dragoo J L, Choi J Y, Lieberman J R, Huang J, Zuk P A, Zhang J, Hedrick M H, Benhaim P. Bone induction by BMP-2 transduced stem cells derived from human fat. J Orthop Res 2003;21:622-9), en tanto que los estudios in vivo lo hacen con animales de experimentación pequeños, fundamentalmente roedores y lagomorfos (Wu L, Wu Y, Lin Y, Jing W, Nie X, Qiao J, Liu L, Tang W, Tian W. Osteogenic differentiation of adipose derived stem cells promoted by overexpression of osterix. Mol Cell Biochem 2 007;301:83-92; Peptan I A, Hong L, Mao J J. Comparison of osteogenic potentials of visceral and subcutaneous adipose-derived cells of rabbits. Plast Reconstr Surg, 2006;117:1462-
70).

Son conocidos también algunos estudios relacionados con la necesidad de trabajar con modelos animales de mayor tamaño, más próximos al humano por razones de peso, estructura y capacidad de regeneración ósea (Cancedda R, Giannoni P, Mastrogiacomo M. A tissue engineering approach to bone repair in large animal models and in clinical practice. Biomaterials 2 0 07;28:4240-50; Reichert J C, Saifzadeh S, Wullschleger M E, Epari D R, Schütz M A, Duda G N, Schell H, van Griensven M, Redi H, Hutmacher D W. The challenge of establishing preclinical models for segmental bone defect research. Biomaterials 2009;30:2149-63).

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Descripción de la invención

En vista de las circunstancias descritas anteriormente, el objeto de la presente invención es un método para producir células troncales mesenquimales (ADMSCs) derivadas de tejido adiposo para su posible utilización en reparación ósea. El método comprende las fases de obtención del tejido adiposo, purificación y fragmentación, aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células troncales de tejido adiposo a otras de tipo adiposo, condrogénicas o osteogénicas que podrían usarse en estudios preclinicos utilizando como modelo experimental mamíferos como por ejemplo ovejas, con las que los estudios realizados hasta la fecha han sido escasos.

Es objeto de la presente invención que las poblaciones celulares aisladas mediante el método descrito, bajo condiciones de cultivo específicas, sean capaces de mostrar características específicas de las células óseas (mineralización de la matriz extracelular), cartilaginosas (morfología condrocítica y síntesis de proteoglicanos ácidos) y adiposas (acumulación intracelular de lípidos), lo que la Sociedad Internacional de Investigación con Células Madre (ISSCR) considera fundamental para que las células troncales mesenquimales sean consideradas como tales.

Para la presente invención se definen las células troncales mesenquimales como células estromales no hematopoyéticas que muestran las siguientes propiedades: son adherentes en cultivo; expresan los antígenos CD73, CD90 y CD105 en ausencia de antígenos hematopoyéticos, como CD34, CD45, marcadores de monocitos, macrofagos y linfocitos B; y son capaces de diferenciarse in vitro hacia osteoblastos, adipocitos y condrocitos bajo condiciones standard de cultivo. Adicionalmente, muestran la posibilidad de autorrenovarse, de desarrollarse en múltiples líneas celulares y de proliferar sin límite.

Se ha realizado un método para la producción de células troncales mesenquimales de tejido adiposo (ADMSCs) de ovejas de raza Asaaf con el fin de obtener células diferenciadas aptas para su aplicación en técnicas de ingeniería tisular en investigación preclínica. Sobre los rendimientos celulares obtenidos tras el procesamiento de las muestras adiposas, se estudiaron las siguientes variables: temperatura de preservación, concentración enzimática, agitación y filtración de la digestión final. También se estudió el comportamiento de estas células en cultivo y la tasa de expansión de las mismas, así como su capacidad para dar lugar a células maduras de diferentes estirpes celulares (grasa, hueso y cartílago).

En relación con la temperatura de preservación de las muestras de tejido adiposo de las que obtener células diferenciadas, hasta su procesamiento, generalmente se asume que el frío ralentiza el metabolismo celular y que, en consecuencia, retrasa la muerte celular tras la toma de los tejidos. Matsumoto y cols., de hecho, así lo corroboraron comparando los rendimientos celulares obtenidos a partir de lipoaspirados humanos preservados a 4ºC, - 80ºC y temperatura ambiente durante periodos de tiempo que fueron desde 1 hora hasta 1 mes (Matsumoto D, Shigeura T, Sato K, Inoue K, Suga H, Kato H, Aoi N, Murase S, Gonda K, Yoshimura K. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg 2007;120 (6) :1510-7). Sin embargo, en la presente invención, se obtuvieron mayores rendimientos celulares tras la digestión de las muestras preservadas a temperatura ambiente que cuando se hizo en condiciones de hipotermia, dejando transcurrir un tiempo no superior a 8 horas desde la toma del tejido del animal hasta su procesamiento. Se considera temperatura ambiente una temperatura de 15º o superior, siendo la temperatura preferente entre 18ºC y 22ºC. Al contrario que en el estudio de Matsumoto y cols., las muestras fueron extraídas mediante resección quirúrgica y no por liposucción. Se ha comprobado igualmente que la preservación en frío de los fragmentos grasos puede llevar al endurecimiento de los mismos, dificultando la posterior digestión enzimática y afectando así al rendimiento celular alcanzado, traduciéndose esto en un menor rendimiento
celular.

Con respecto a la digestión del tejido adiposo, aunque las condiciones generales para el aislamiento de ADMSCs empleadas en la mayoría de las publicaciones derivan del protocolo original desarrollado por Zuk y cols, en 2001 (Zuk P A, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell J W, Katz A J, Benhaim P, Lorenz H P, Hedrick M H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001; 7:211-28), se introdujeron algunas variaciones. Así, por ejemplo, se ha considerado que la agitación de la muestra durante la digestión y el filtrado de la solución obtenida son procedimientos contraproducentes a la hora de tratar de obtener mayores rendimientos celulares, y por tanto, se evitaron para la realización de la invención.

La presente invención describe un método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenido de mamíferos que comprende las fases de:

a) obtención de la muestra de tejido adiposo, purificación y fragmentación de la misma;

b) aislamiento de las células troncales mesenquimales;

c) cultivo y expansión in vitro;

d) caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tejido adiposo, óseo o cartilaginoso; caracterizado porque la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente y no en condiciones de hipotermia, sometiendo posteriormente la muestra a digestión enzimática con colagenasa y manteniendo la mezcla en reposo.

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En una realización preferente, la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente igual o superior a 15ºC, más preferentemente entre 18ºC-22ºC, ambos inclusive.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente caracterizado porque la digestión enzimática de la muestra es con colagenasa tipo I, preferentemente con una concentración de 2 mg/ml.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenido de mamíferos descrito anteriormente caracterizado porque el mamífero es no humano. En una realización más preferente el mamífero de la invención es una oveja.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente donde la muestra de tejido adiposo se obtiene en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.

En una realización preferente, la muestra de tejido adiposo se obtiene de la cola del mamífero no humano en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia. En una realización más preferente, la muestra de tejido adiposo anteriormente descrita se obtiene de la cola de la oveja en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.

Tras el aislamiento de la población de ADMSCs presentes en el tejido graso, se estableció un cultivo primario, con una densidad de siembra que puede oscilar desde las 3,5 x 10^{3} células/cm^{2}, hasta las 1 x 10^{6} células/cm^{2}, y se utilizó un tamaño de la superficie plástica sobre la que la siembra se lleva a cabo, que puede oscilar entre 2 y 225 cm^{2}. En la realización concreta objeto de descripción se optó por una densidad de siembra de 3 x 10^{4} células/cm^{2} en pocillos de 2 cm^{2}, lo que asegura el cultivo primario y permite obtener tasas de expansión medias de 4 veces el número original de células y 20 veces tras el subcultivo celular a una densidad de 5 x 10^{3} células/cm^{2}. Así, se consigue gran cantidad de células en pases tempranos y se evitan subcultivos prolongados de las poblaciones celulares, que se desaconsejan por la posibilidad de la transformación de las células. Por otra parte, densidades inferiores a 3 x 10^{4} células/cm^{2} podrían ser demasiado bajas como para que los cultivos llegaran al estado de preconfluencia en un tiempo menor a 15 días, lo cual podría llevar a la pérdida del cultivo.

Mediante el método de aislamiento, cultivo y diferenciación descrito se consiguieron obtener, a partir del tejido adiposo de mamíferos como por ejemplo ovejas, células troncales mesenquimales que se caracterizaron por su capacidad de adhesión a superficies plásticas adquiriendo una morfología fusiforme, que proliferaron de manera significativa y fueron capaces de diferenciarse hacia diferentes estirpes celulares de origen mesodérmico que podrían utilizarse en modelos de investigación preclínica.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente donde las muestras de tejido adiposo digerido se centrifugan a 2000 rpm y, tras desechar el sobrenadante, la fracción del estroma vascular (SVF) es resuspendida en medio de cultivo de ADMSCs del tipo DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 1% de Penicilina/Estreptomicina, un 1% de Glutamina y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente, donde las suspensiones celulares obtenidas tras la fase de aislamiento se siembran en pocillos de 2 cm^{2} a una densidad de 30.000 células/cm^{2}, e incubadas a 37ºC y 5% de CO_{2} en atmósfera húmeda, sometiéndose después los cultivos a un lavado con PBS para eliminar el componente eritrocítario, quedando en los pocillos únicamente las células capaces de adherirse a ellos (ADMSCs); cambiando cada 2-3 días el medio de cultivo y, tripzinizando cultivos una vez alcanzado el estado de preconfluencia.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo adipocitico, mediante su cultivo en medio adipogénico del tipo DMEM, 10% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 1 \muM dexametasona, 0,5 mM IBMX, 10 \muM insulina y 200 \muM indometacina.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo condrogénico mediante su cultivo en medio condrogénico del tipo DMEM, 1% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 50 \mug/ml ácido ascórbico, 6,25 \mug/ml insulina y 10 ng/ml TGF \beta1.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo osteogénico mediante su cultivo en medio osteogénico del tipo DMEM, 5% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 10 \muM dexametasona, 150 mM ácido L-ascórbico y 10 mM \beta-glicerolfosfato, completando la inducción con la adición al medio de 10 ng/ml de proteína morfogenética 2 (BMP2).

En otro aspecto la invención se relaciona con las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenidas según el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente.

La preservación de las muestras a temperatura ambiente favoreció la liberación de ADMSCs de las muestras grasas, frente a la preservación de las mismas a 4ºC como se viene haciendo de forma generalizada. La digestión a una concentración enzimática de 2 mg/ml resultó ser la concentración de colagenasa óptima. Sin embargo, la agitación de las muestras durante la digestión y el filtrado de las suspensiones resultantes disminuyeron considerablemente los rendimientos celulares alcanzados. Las poblaciones celulares aisladas con el método establecido se multiplicaron rápidamente en cultivo y fueron capaces de diferenciarse hacia células de fenotipo adipocítico, osteoblástico y condrocítico.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1. Secuencia de la extracción de tejido adiposo de la cola de la oveja y depósito en un recipiente estéril en una solución de suero fisiológico con antibiótico y antifúngicos (A-D); y de la digestión mecánica (E-G) y enzimática (H) de la muestra. En el tubo de centrifugado se identifican 3 estratos, de arriba abajo: el componente graso, la solución de digestión y la fracción del estroma vascular, que contiene las ADMSCs (H).

Figura 2. En la fila superior, ADMSCs en cultivo (A); células de fenotipo adipocítico (B); y células de diferenciación condrogénica en matriz de fibrina teñidas con Azul Alción (C). En la fila inferior, células de diferenciación osteogénica (D) y fases de mineralización progresiva de la matriz extracelular en cultivo osteogénico con tinción Alizarin Red (E).

Figura 3. Izquierda, representación gráfica del número de células aisladas de las muestras de tejido graso preservadas a temperatura ambiente y a 4ºC. Derecha, según distintas concentraciones de colagenasa en el aislamiento celular.

Figura 4. Izquierda, representación gráfica del número de células aisladas de las muestras de tejido graso sometidas y no a agitación. Derecha, según que se filtraran o no tras la digestión.

Figura 5. Crecimiento de las ADMSCs en cultivo.

Figura 6. Tasa de expansión de las ADMSCs en cultivo.

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Modos de realización de la invención

La presente invención se ilustra adicionalmente con el siguiente ejemplo, el cual no pretende ser limitativo de su alcance.

Se realizó un estudio experimental utilizando 40 ovejas sanas de raza Asaaf, con un rango de peso comprendido entre 50 y 70 kg y un rango de edad entre 4 y 6 años, sin otro criterio de exclusión. Se obtuvieron las muestras de tejido adiposo; se procesaron, aislaron y expandieron las ADMSCs; y, finalmente, se realizó un estudio de multipotencialidad de las células mediante inducción adipogénica, condrogénica y osteogénica (tabla 2).

TABLA 2

1

En la fase de aislamiento de las ADMSCs se evaluó el rendimiento celular en función de la concentración de colagenasa tipo I, la temperatura de preservación, la agitación y la filtración de las muestras.

Los resultados de los rendimientos celulares se presentan como mediana, para disminuir la dispersión de los datos, al ser una muestra pequeña. Para determinar la normalidad se utilizó la prueba de Shapiro-Wilks y Kolmogorov-Smirnov, aceptándose el supuesto de normalidad si p \leq 0,05 y demostrándose una distribución no normal. Por ello y debido al tamaño muestral de los grupos (n=5) se utilizaron pruebas no paramétricas U de Mann-Whitney y P Wilcoxom para la comparación de las medias de los rendimientos celulares en los diferentes grupos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 17.0.

Obtención de muestras de tejido adiposo

Las muestras de tejido adiposo fueron obtenidas de la cola de la oveja en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia. Con el animal en decúbito lateral sobre la mesa quirúrgica se realizó una incisión cutánea longitudinal paramedial a nivel de la cola de aproximadamente 6 cm de longitud. Expuesto el tejido celular subcutáneo se procedió a la extracción de 10-20 gramos de grasa, fragmentándose para facilitar su posterior procesamiento. Las muestras fueron recogidas en recipientes estériles (en una solución de suero fisiológico, antibióticos y antifúngicos, en la que permanecieron al menos 6 horas para asegurar la descontaminación del tejido) y transportadas inmediatamente al laboratorio de cultivos celulares. (Figura 1A-D).

Selección de parámetros óptimos para el aislamiento de ADMSCs

Las muestras de tejido graso fueron sometidas a sucesivos lavados con suero salino tamponado con fosfato (PBS-Sigma-) estéril para eliminar el componente sanguíneo en la medida de lo posible. Posteriormente, el tejido graso fue troceado en fragmentos de 0,5 cm^{2} aproximadamente (Figura 1E-G) y sometidas a digestión enzimática con colagenasa tipo I (Sigma) en DMEM (PAA Laboratorios GMBH) a 37ºC y a distintas concentraciones (0,5 mg/ml; 1 mg/ml; y 2 mg/ml), (obteniéndose una media de 121 \pm 129 células por cada miligramo de tejido digerido). Cuando el tejido estuvo totalmente digerido las muestras fueron centrifugadas a 2000 rpm (720 g) durante 10 minutos (Figura 1H) - y, tras desechar el sobrenadante, la fracción del estroma vascular (SVF) fue resuspendida en medio de cultivo de ADMSCs, consistente en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (SbF-Linus-), 1% de Penicilina/Estreptomicina (PAA Lab.), un 1% de Glutamina (PAA Lab) y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico (Sigma). Para evaluar la viabilidad de las suspensiones celulares obtenidas se utilizó el método Azul Tripán. Las condiciones óptimas para el aislamiento de ADMSCs se estudiaron analizando las variables reseñadas y especificadas en la tabla 1.

TABLA 1

3

Cultivo primario y expansión de ADMSCs

Tras la selección de los parámetros óptimos para el aislamiento de las ADMSCs se estudiaron los rendimientos obtenidos tras el procesamiento de 20 muestras de tejido adiposo ovino con la intención de obtener cantidades celulares suficientes para su posible aplicación en técnicas de ingeniería tisular. Las suspensiones celulares obtenidas fueron sembradas en pocillos de 2 cm^{2} a una densidad de 30.000 células/cm^{2}, constituyendo el cultivo primario (0P), e incubadas a 37ºC y 5% de CO_{2} en atmósfera húmeda. Transcurridas 48 horas, los cultivos fueron sometidos a un lavado con PBS para eliminar el componente eritrocitario, quedando en los pocillos únicamente las células capaces de adherirse a ellos (ADMSCs). Cada 2-3 días se cambió el medio de cultivo y, cuando los cultivos alcanzaron el estado de preconfluencia, fueron tripsinizados (Tripsina-EDTA- PAA Lab.) y estimada la viabilidad celular mediante el método Azul Tripán. Para posteriores estudios los cultivos secundarios (1P y 2P) se sembraron a una densidad de 5.000 células/cm^{2}.

Para estudiar el comportamiento de las células en cultivo se establecieron curvas de crecimiento en placas de 24 pocillos, que se tripsinizaron por duplicado cada 48 horas, evaluándose el número de células mediante el método Azul Tripán. Para estudiar la tasa de expansión se cultivaron las células en frascos de 25 cm^{2} hasta el estado de preconfluencia, momento en el que se tripsinizaron y evaluó el número de células mediante el método Azul Tripán.

Multipotencialidad de ADMSCs

Para el estudio de la multipotencialidad de las poblaciones celulares aisladas se procedió a la inducción adipogénica, condrogénica y osteogénica de las células mediante su cultivo en medios específicos y la posterior caracterización mediante tinciones básicas (Figura 2).

Inducción adipogénica. Para la diferenciación de las ADMSCs hacia células de fenotipo adipocítico, éstas se cultivaron en medio adipogénico (DMEM, 10% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina -PAA Lab.-, 1 \muM dexametasona -Sigma-, 0,5 mM IBMX -Sigma-, 10 \muM insulina -Sigma- y 200 \muM indometacina -Sigma-) y, posteriormente, se realizó la tinción Oil Red O (Sigma) para evidenciar la formación intracelular de vacuolas con contenido lipídico (marcador característico de adipocitos) -tabla 2-,

Inducción condrogénica. Para inducir la diferenciación condrogénica de ADMSCs, las células fueron cultivadas en medio condrogénico (DMEM, 1% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 50 \mug/ml ácido ascórbico, 6,25 \mug/ml insulina y 10 ng/ml TGF \beta1 -Sigma-) durante 21 días. Se probaron diversas estrategias de cultivo: en monocapa, en pellet y en matriz de fibrina. Para el cultivo en monocapa las células fueron sembradas sobre superficies plásticas y cultivadas con medio condrogénico. Para el cultivo en pellet, 1 x 10^{6} células fueron centrifugadas y cultivadas adicionando el medio condrogénico sin provocar la resuspensión del pellet. Para el cultivo en matriz de fibrina, 1 x 10^{6} células fueron sembradas en 100 \mul de fibrina elaborada a partir de plasma ovino, como se describió en el apartado correspondiente. La caracterización de la diferenciación condrogénica se realizó mediante la observación al microscopio de la morfología celular y mediante tinción con Azul Alcián, que tiñe de azul los proteoglicanos típicos de la matriz cartilaginosa (tabla 2).

Inducción osteogénica. Para inducir células osteogénicas, las ADMSCs fueron cultivadas en medio osteogénico (DMEM, 5% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 10 \muM dexametasona, 150 mM ácido L-ascórbico -Biomedia- y 10 mM \beta-glicerolfosfato -Sigma-), completando la inducción con la adición al medio durante las primeras 48 horas de 10 ng/ml de proteína morfogenética 2 (BMP2) -Sigma-. Tras 7, 14 y 21 días de inducción se realizó una tinción con Alizarin Red (Sigma), que tiñe de rojo la matriz mineralizada (marcador característico de diferenciación osteogénica) -tabla 2-.

Puesta a punto del método de aislamiento de ADMSCs

Los datos de los rendimientos celulares realizados en los 4 grupos se exponen en las figuras 3 y 4. En el primer grupo, las muestras digeridas con concentraciones de colagenasas tipo I de 2 mg/ml demostraron un mayor rendimiento celular en comparación con los otros dos grupos, con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) -Figura 3-. En el segundo grupo, donde se comparaba la temperatura de preservación (Tª ambiente, 4ºC), se observó un mayor rendimiento celular a temperatura ambiente, no existiendo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p>0,05) -Figura 3-. En el tercer y cuarto grupo, donde se evaluaba el rendimiento celular en función de la agitación y la filtración de las muestras, respectivamente, se observaron diferencias estadísticamente significativas en los grupos donde ni se agitó ni se filtró la muestra (p<0,05) -Figura 4-.

Aislamiento y Expansión de ADMSCs

El rendimiento celular tras el procesamiento de 20 muestras con el método de preservación y digestión que estimamos como óptimo deparó una media de 172 \pm 132 células/mg de tejido digerido.

En relación con la densidad de siembra del cultivo primario para obtener cultivos celulares viables, cuando aquélla fue baja los cultivos celulares no siempre consiguieron alcanzar el estado de preconfluencia. Cuando la densidad de siembra fue de 30.000 células/cm^{2} se aseguró el cultivo primario en todos los casos, alcanzando éstos el estado de preconfluencia al cabo de 9 días de media, con células de morfología fusiforme (Figura 2A).

La realización de subcultivos a partir de densidades iniciales de siembra de 5.000 células/cm^{2} dio lugar a patrones de crecimiento similares (Figura 5). Las células entraban rápidamente en fase exponencial de crecimiento, salvo en cultivo primario, en el que permanecían más tiempo en fase de latencia, alcanzando la fase estacionaria al cabo de 8-10 días. Posteriormente se observó un repunte en el crecimiento celular debido a que las células se retrajeron en grumos y nuevas células ocuparon la superficie plástica libre, aunque en pocos días la mayoría de las células se soltaron y murieron.

La tasa media de expansión de las células en cultivo tras la realización del cultivo primario fue de 4 veces el número original de células a los 9 días. En subcultivos posteriores se observaron tasas de expansión de 20 veces el número de células sembradas en tan solo 8 días (Figura 6).

Multipotencialidad de ADMSCs

Las poblaciones celulares mantuvieron su capacidad de diferenciación hacia diferentes estirpes celulares tras la expansión in vitro.

Adipogénesis: Al cabo de 3 días de inducción adipogénica se observó un cambio en la morfología de las células en cultivo, que pasaron de mostrar una morfología fusiforme con finas prolongaciones a una morfología más estrellada. Tras 7 días de cultivo en medio adipogénico la tinción Oil Red O puso en evidencia la formación de vacuolas lipídicas en el interior de las células (Figura 2B).

Condrogénesis: El cultivo en monocapa no indujo la diferenciación de las ADMSCs hacia células de fenotipo condrocitico, dado que éstas mantuvieron su morfología original y no secretaron proteoglicanos a la matriz extracelular. El cultivo en pellet resultó de difícil manejo, poco estable y reproducible, por lo que fue sustituido por el cultivo tridimensional en matriz de fibrina. En estas condiciones, al cabo de 21 días de cultivo en medio condrogénico, las células comenzaron a mostrar una morfología redondeada, se dispusieron en lagunas dentro de la matriz y la tinción Azul Alcián puso de manifiesto la presencia de proteoglicanos en las zonas de la matriz cercanas a las células diferenciadas (Figura 2C).

Osteogénesis: El cultivo de ADMSCs en medio osteogénico provocó un cambio en el patrón de crecimiento y distribución de las células en cultivo que se tradujo en la formación de nódulos que mostraron signos de mineralización tras la tinción con Alizarin Red (Figura 2D). La mineralización comenzó a ser evidente a los 7 días de inducción y fue más intensa a los 14 y 21 días de cultivo en medio osteogénico (Figura 2E).

Aplicación industrial

La aplicación industrial de esta patente estarla enfocada al campo de la ingeniería tisular. La finalidad sería la obtención de células óseas para implantar posteriormente en aquellas situaciones donde la propia naturaleza no pueda regenerarlo de forma independiente. Serían situaciones de politraumatizados o traumatismos de alta energía, en patología tumoral o fallo de la consolidación ósea, lo que se conoce como pseudoartrosis.

Claims

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1. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenido de mamíferos que comprende las fases de:

a) obtención de la muestra de tejido adiposo, purificación y fragmentación de la misma;

b) aislamiento de las células troncales mesenquimales;

c) cultivo y expansión in vitro;

d) caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tejido adiposo, óseo o cartilaginoso;

caracterizado porque la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente igual o superior a 15ºC, sometiendo la muestra a digestión enzimática con colagenasa y manteniendo la mezcla en reposo.
2. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente entre 18ºC-22ºC.
3. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la digestión enzimática de la muestra es con una concentración de colagenasa tipo I de 2 mg/ml.
4. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado porque el mamífero es no humano.
5. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el mamífero es una oveja.
6. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo de mamífero según reivindicaciones anteriores caracterizado porque la muestra de tejido adiposo se obtiene en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.
7. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones 4 y 5 caracterizado porque la muestra de tejido adiposo se obtiene de la cola del mamífero en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.
8. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado porque las muestras de tejido adiposo digerido se centrifugan a 2000 rpm y, tras desechar el sobrenadante, la fracción del estroma vascular (SVF) es resuspendida en medio de cultivo de ADMSCs del tipo DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 1% de Penicilina/Estreptomicina, un 1% de Glutamina y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico.
9. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las suspensiones celulares obtenidas tras la fase de aislamiento se siembran en pocillos de 2 cm^{2} a una densidad de 30.000 células/cm^{2}, e incubadas a 37ºC y 5% de CO_{2} en atmósfera húmeda, sometiéndose después los cultivos a un lavado con PBS para eliminar el componente eritrocitario, quedando en los pocillos únicamente las células ADMSCs capaces de adherirse a ellos; cambiando cada 2-3 días el medio de cultivo y, tripzinizando cultivos una vez alcanzado el estado de preconfluencia.
10. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado porque las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo adipocitico, mediante su cultivo en medio adipogénico del tipo DMEM, 10% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 1 \muM dexametasona, 0,5 mM IBMX, 10 \muM insulina y 200 \muM indometacina.
11. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo condrogénico mediante su cultivo en medio condrogénico del tipo DMEM, 1% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 50 \mug/ml ácido ascórbico, 6,25 \mug/ml insulina y 10 ng/ml TGF \beta1.
12. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado porque las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo osteogénico mediante su cultivo en medio osteogénico del tipo DMEM, 5% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 10 \muM dexametasona, 150 mM ácido L-ascórbico y 10 mM \beta-glicerolfosfato, completando la inducción con la adición al medio de 10 ng/ml de proteína morfogenética 2 (BMP2).
13. Células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo caracterizadas porque son obtenidas según el método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores.
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