ES2372071B1 - Procedimiento para alterar el patron de desarrollo y aumentar el crecimiento de las plantas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para alterar el patrón de desarrollo y aumentar el crecimiento en plantas.#El procedimiento consiste en hacer crecer plantas en una atmósfera en la que estén presentes volátiles emitidos por un microorganismo, sin que exista contacto físico entre el microorganismos y la planta, sólo que la planta entre en contacto con los volátiles emitidos por el microorganismo. Se basa en el descubrimiento de que los volátiles emitidos por bacterias Gram positivas o negativas, levaduras y hongos microscópicos promueven un incremento del crecimiento de las plantas en general, con aumento de longitud, el número de hojas y/o el número de ramas de la planta, así como un incremento de la biomasa.

Description

Procedimiento para alterarelpatrónde desarrolloyaumentarel crecimiento en plantas.

Campo técnico

La invención se refiere a un procedimiento para incrementar el crecimiento de plantas, provocando un aumento de su biomasa,surobustezyel númerode floresyramificaciones respectoalas plantas crecidasen condiciones normales. Este procedimiento además permite inducir la floración.

Antecedentes de la invención

Las plantas perciben estímulos bióticos reconociendo multitud de diferentes compuestos señalizadores que se originan en los organismos con los que interactúan. Algunas de estas sustancias representan patrones moleculares asociados a patógenos, que generalmente actúan como desencadenantes de reacciones de defensa. Se perciben a bajas concentracionesy comprendendiversas estructuras, incluidas las de hidratos de carbono, proteínas, glicoproteínas, péptidos, lípidosyesteroles(Hahlbrock et al. 2003: Nonself recognition, transcriptional reprogramming, and secondary metabolite accumulation during plant/pathogen interactions, Proc Natl. Acad. Sci USA 100 (supl 2), 1456914576).

Los microorganismos también sintetizanyemiten muchos compuestosvolátiles con masas moleculares menores que 300 Da, polaridad baja, y una elevada presión de vapor (Schöller et al. 2002: Volatile metabolites from actinomycetes,J.Agric.FoodChem.50,2615-2621;Schultzand Dickschat2007: Bacterialvolátiles:thesmellofsmall organisms, Nat. Prod. Rep. 24, 814-842; Splivallo et al. 2007a: Discrimination of truffle fruiting body versus mycelial aromas by stir bar sorptive extraction, Phytochemistry 68, 2584-2598). El contacto con microorganismos o agentes desencadenantes de reacciones de defensa de plantas no sólo afecta a dichas reacciones de defensa, sino que, muy a menudo, conducenauna disminuciónenlafotosíntesis,yauna transicióndel estadodefuente(enelqueseproducen compuestos orgánicos asimilables) al de sumidero (en el que se importan dichos compuestos asimilables de tejidos en los que están almacenados) (como revisión, véase Berger et al. 2007: Plant physiology meets phytopathology: plant primary metabolism and plant-pathogen interactions, J. Exp. Bot. 58, 4019-4026). Una indicación del estado de sumidero en hojas infectadas es la regulación al alza de la invertasa de la pared celular, que da como resultado la reducción de la exportación de sacarosa de la hoja infectada a otras partes de la planta. En algunos casos, la enzima sacarolítica sacarosa sintasa (SuSy) se regula al alza tras el contacto con microorganismos, lo que puede servir para repartir sacarosaala deposición callosaypromoverla biosíntesisde polisacáridosde pared celular en los sitiosdeinfección (Essmann et al. 2008: Leaf carbohydrate metabolism during defense, Plant Signaling&Behvior3, 885-887). El contacto con patógenos también puede dar como resultado la regulación a la baja de genes implicados en el metabolismo del almidón (Cartieaux et al. 2008: Simultaneous interaction of Arabidopsis thaliana with Bradyrhizobium sp. Strain ORS278 and Pseudomonas syringae pv.Tomato DC3000 leads to complex transcriptome changes, Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 244-259;Fabro et al. 2008: Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation,PlantPhysiol.146, 1421-1439),loquepuedefacilitarladisponibilidad parael patógenode azúcares simples en los sitiosdeinfección. Estos homopolisacáridos ramificadosson sintetizados por la almidón/glucógeno sintasa utilizando ADPglucosa (ADPG) como molécula donadora de azúcar.

El almidónyel glucógeno sonlos principales hidratosde carbonode almacenamientoen plantasybacterias, respectivamente, estando su metabolismo estrechamente conectado con el de los aminoácidos por mecanismos todavía poco comprendidos. En Escherichia coli,la privación de aminoácidos desencadena la respuesta a condiciones estrictas, un cambio fisiológico pleiotrópico que hace pasar la célula de un modo relacionado con el crecimiento a un modo de mantenimiento/supervivencia/biosíntesis. En condiciones de limitada provisión de nutrientes (aminoácidos) se para la división celular,ytienelugar una disminución en la demanda en proteínas dependientes deATPy en la síntesis y degradación de ácidos nucleicos. El exceso de ATP se desvía entonces desde el metabolismo de ácidos nucleicos/proteínas hacia la biosíntesis de glucógeno si está presente en el medio un exceso de fuentes de carbono (Eydallin et al., 2007b: Genome-wide screening of genes affecting glycogen metabolism in Escherichia coli K-12, FEBS Lett 581, 2947-2953; Montero et al. 2009: Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular proceses, Biochem. J. 424, 129-141). El signo característico de esta respuesta fisiológica pleiotrópica es la acumulación de la alarmona guanosina 5’-difosfato 3’-difosfato (ppGpp), un nucleótido que se une a la RNApolimerasa bacteriana para potenciar la expresión de genes (incluidos los implicados en el metabolismo delglucógeno) expresadosal comienzodelafase estacionaria.LosnivelesdeppGppestáncontroladosporRelA(unappGpp sintasa) ySpoT (una enzima bifuncionalque muestraactividadesdeppGpp sintasae hidrolasa) (Potrykusand Cashel 2008:(p) ppGpp: still magical?, Annu. Rev. Microbiol. 62, 35-51). Los mutantes de E. coli que tienendañada la función relA, ylas células que sobreexpresan spoT muestran un fenotipo deficiente en glucógeno (Monteroet al. 2009: Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, andis highly interconnected witha widevarietyof cellular processes, Biochem.J. 424, 129-141).Por el contrario, los mutantes de E. coli que tienen dañada la síntesis de aminoácidos tales como la cisteína muestran un fenotipo de glucógeno en exceso como resultado de la respuesta estricta (Eydallin et al., 2007b: Genome-wide screening of genes affecting glycogen metabolism in Escherichia coli K-12, FEBS Lett 581, 2947-2953). Estos mutantes muestranun fenotipode glucógeno normal cuandose cultivanen medio suplementado con cisteína,loque apuntaala existenciade conexiones estrechas entre los metabolismos del azufre,el nitrógenoyel carbono.

Estudios recientes han demostrado que las plantas poseen un sistema regulador mediado por ppGpp similar al que se da en las bacterias, lo cual se ha demostrado que juega un papel crucial en aspectos tales como la fertilidad de las plantas. El ppGpp se acumula en el cloroplasto de hojas estresadas a través de la regulación de la expresión de homólogos de RelA/SpoT (RSH) (Takahashi et al. 2004, Identification of the bacterial alarmone guanosine 5’diphosphate 3’-diphosphate (ppGpp) in plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 4320-4324).

Al contrarioqueenlas bacterias,dondeladegradacióndelglucógenotienelugaratravésdelaruta fosforolítica,la degradación del almidón en las plantas es principalmente hidrolítica, jugando papeles importantes en la degradación del almidónde endospermosycerealesdehojaslas α-amilasasylas β-amilasas, respectivamente (Scheidig et al. 2002: Downregulationofa chloroplast-targeted β-amylase leadstoa starch-excess phenotypeinleaves, PlantJ.30, 581-591; Fulton et al. 2008: β-amylase4, a noncatalytic protein required for starch breakdown, acts usptream of three active βamylases in Arabidopsis chloroplasts, Plant Cell 20, 1040-1058). Desde la demostración inicial de que ADPG sirve como molécula precursora para la biosíntesis tanto del glucógeno de las bacterias como del almidón de las plantas, ha estado bastante extendida la consideración de que la ADPG pirofosforilasa (AGP) es la única enzima que cataliza la producción de ADPG. La evidencia genética de que la biosíntesis de glucógeno bacteriano ocurre solamente por la ruta deAGP (GlgC) se ha obtenido con mutantes glgC. Sin embargo, recientes estudios han demostrado que estos mutantes acumulan cantidades sustancialesde glucógenoy un contenido normalde ADPG. Además, se han aportado evidenciasque demuestranlaexistenciadediversas fuentes importantes, diferentesde GlgC,de ADPGligadasala biosíntesis del glucógeno endiferentes especies bacterianas.

Generalmente, la biosíntesis de almidón en hojas se ha considerado que tiene lugar exclusivamente en el cloroplasto,yestá segregada delproceso biosintético de sacarosa que tiene lugar en el citosol (Fig. 1A). De acuerdo con esta visión clásica, se consideraal almidónel producto finalde una ruta unidireccional enla queAGP catalizaexclusivamente la síntesis de ADPG,yfunciona como la principal etapa reguladora del proceso biosintético del almidón (Neuhaus et al. 2005: No need to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch in leaves,Trends Plant Sci. 10, 154-156; Streb et al. 2009: The debate on the pathway of starch synthesis: a closer look at low-starch mutants lacking plastidial phosphoglucomutase supports the chloroplast-localised pathway, Plant Physiol. 151, 17691772). Sin embargo, recientes evidencias han indicado la existencia de una ruta adicional en la que se produce de novo en el citosol, mediante SuSy, ADPG ligado a la biosíntesis del almidón. La enzima sacarolítica SuSy es el principal determinante de la fuerza de sumidero que controla intensamente la canalización de la sacarosa entrante hacia almidónypolisacáridosdela pared celular (Amor et al. 1995:Amembrane-associated formof sucrose synthase and its potential role in synthesis of cellulose and callose in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9353-9357). Cataliza la conversión reversible de sacarosay un nucleósido difosfato en las correspondientes glucosayfructosa nucleósido difosfato. Aunque UDP es el sustrato nucleósido difosfato preferido para que SuSy produzca UDPG, ADP también actúa como una molécula aceptora efectiva para producir ADPG.

Según esta visión alternativa,tantolas rutas biosintéticasdela sacarosa comoladel almidón están estrechamente interconectadas mediante la actividad productora de ADPG de SuSy (Muñoz et al., 2006: New enzymes, new pathways and an alternative view on starch biosynthesis in both photosynthetic and heterotrophic tissues of plants, Plant Cell Physiol. 46, 1366-1376; Baroja-Fernández et al., 2009: Enhancing sucrose synthase activity in transgenic potato (Solanum tuberosum L.) tubers results in increased levels of starch, ADPglucose and UDPglucose and total yield, PlantCellPhysiol.50,1651-1662),ymediantela accióndeun translocadordeADPGtodavíasinidentificar localizado en las membranas de la envuelta de los cloroplastos. La visión “alternativa” de la biosíntesis de almidón en las hojas ilustrada en la Fig. IB asume también que tanto laAGP como la fosfoglucomutasa plastidial juegan un papel importante en la retirada de unidades de glucosa derivadas de la degradación del almidón.

Lamayorpartedelos estudiossobrelas interaccionesplanta-microorganismosehanllevadoacaboen condiciones de contacto físico entrela planta hospedadoray elmicroorganismo. Sin embargo, se sabe poco sobre cómo pueden afectar las emisionesdevolátiles microbianosala fisiologíadelaplanta en ausenciade contacto físico.Sí se conoce, sin embargo, que microorganismos tales como Pseudomonas spp., Streptomyces spp., Botrytis cinerea ydistintas trufas producen etileno (Splivallo et al. 2007b:Trafilevolátiles inhibitgrowthand induceand oxidativeburstin Arabidopsis thaliana,NewPhytologist175,417-424),una hormonagaseosadeplantasquejuegaimportantespapelesen múltiples aspectosdel crecimientoydesarrollodelas plantas, incluidosla germinaciónde semillas, alargamientodel hipocótilo, iniciaciónde las pilosidades radiculares,la senescenciade hojasyflores,la maduraciónde los frutos,la acumulación de almidón, etc. Sólo recientemente Splivallo et al. (Splivallo et al. 2009:Trafiles regulate plant root morphogenesis via theproductionofauxinandethylene,PlantPhysiol.150,2018-2029) aportaronevidenciasdequeel etilenoproducido por las trufas induce alteraciones en el desarrollo de plantas de Arabidopsis, que presumiblemente van acompañadas por importantes cambios en el metabolismo.

En lo que se refiere a las bacterias, los escasos trabajos en los que se describe el efecto de volátiles microbianos sobre elcrecimiento de plantas giran en torno a un número limitado de cepas especializadas de rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR: plant growth promoting rhizobacteria).Sedenomina rizobacteriasa ciertas bacterias simbiontesqueexistenenel sueloyque colonizanlas raícesdelas plantas.La mayor partedelas cepascuyo cultivo da lugar a un efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas cultivadas en su presencia, sin necesidad de contacto físico, pertenecen al género Bacillus o un género estrechamente relacionado con éste, Paenibacillus, al cual pertenecen bacterias que en el pasado fueron clasificadas como pertenecientes al género Bacillus. Así, por ejemplo, se ha demostradoquevolátiles emitidospor rizobacteriasde cepas pertenecientesalas especies Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus cepacia promueven el crecimiento de plantas de Arabidopsis,facilitando la toma de nutrientes,la fotosíntesisyla respuestade defensa,ydisminuyendola sensibilidadala glucosaylosnivelesde ácido abscísico (Ryu et al. 2003: Bacterial volátiles promote growth in Arabidopsis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 49274932; Ryu et al. 2004: Bacterial volátiles induce systemic resistance in Arabidopsis, Plant Phylio 134, 1017-1026; Vespermannet al. 2007: Rhizobacterial volátiles affect the growth of fungi and Arabidopsis thaliana, Appl. Environ. Microbiol. 73, 5639-5641, Xie et al. 2009: Sustained growth promotion in Arabidopsis with long-term exposure to the beneficial soil bacterium Bacillus subtilis (GB03), Plant Signal. Behav. 10, 948-953). En concreto, Ryu et al.(Ryu et al. 2003: Bacterial volátiles promote growth in Arabidopsis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932) describen un incremento del crecimiento de plántulas de Arabidopsis thaliana desencadenadopor losvolátiles orgánicos liberados por cepas específicas de PGPR, concretamente Bacillus subtilis GB03y Bacillus amyloliquefaciens IN937a, comentando ademásque sus datos demuestranquela liberaciónde compuestosvolátilesorgánicosnoesel mecanismo común de estimulación del crecimiento de todas las rizobacterias. Al ser cultivadas en el medio rico en aminoácidos agar con tripticasa de soja, ambas bacterias liberan3-hidroxi-2-butanona (acetoína)y2,3-butanediol, compuestos no emitidos por las otras PGPR ensayadas cuyos volátiles no afectaban al crecimiento de Arabidopsis, pero que también son liberadospor otras cepas bacterianasparalasqueseha detectado capacidadde incrementarla germinacióny el crecimiento de plantas tales como Brassica oleracea sinexistir contacto físico entre plantaybacteria, comoesel caso de la cepa de Bacillus subtilis WG6-14 objeto de la solicitud de patente US 2008/0152684 Al. Sin embargo, existen muchas bacterias liberadorasde estas sustancias (algunas pertenecientesalgénero Bacillus)queno promuevenelcrecimiento de la planta. Además de las citadas cepas del género Bacillus GB03e IN937a,Ryu et al. sólo mencionan que el efecto de incremento del crecimiento por la liberación de volátiles se detectara para otra de las bacterias ensayadas, Enterobacter cloacae JM22, aunquenose muestra ningún datoque corrobore este últimoresultadonise hace ninguna mención sobreelperfildevolátiles emitidopor esta últimabacteria.Además,un artículo posteriordel mismogrupo investigador (Ryu et al. 2004: Bacterial volátiles induce systemic resistance in Arabidopsis, Plant Phylio 134, 10171026) muestra marcadas diferencias entre la elevada capacidad de los volátiles emitidos por las dos cepas de Bacillus para proteger las plantas de Arabidopisis thaliana del efecto del patógeno Erwinia carotovora yel escaso efecto protector de los volátiles emitidos por Enterobacter cloacae JM22.

Sehan descrito también otrascepasdelosgéneros Bacillus o Paenibacillusque emitenvolátilescapacesde promover el crecimiento de distintas plantas pero, en estos casos, el efecto parece estar ligado principalmente a la capacidad de controlarel crecimientode patógenosque están afectandoala planta.Talesel caso,por ejemplo,del baciloKyuW63 descrito en la patente japonesa JP10033064, cuyos volátiles son capaces de controlar la patopoyesis debida a la presencia de hongos del género Cercospora en hojas de pepino,facilitando con ello el crecimiento de la planta. La descripción sugierequeel efecto podríasersimilar utilizando otras bacterias filamentosas, siempreycuandoel cultivo se produzca en un medio rico en azúcares tal como el agar PDA, medio que no se define con más detalle; tampoco se danpruebasque demuestrenla influenciadelmediosugeridoola aplicabilidaddelmétodoparacualquierotrabacteria filamentosa.

Tambiénel método para incrementarel crecimientode plantas, basado en composicionesque comprenden un metabolitovolátil producidopor una bacteria,quesereivindicaenla solicitudde patente coreana KR20090066412,alude de forma combinadaala induccióndeprotección contra enfermedadesyel ataquede insectosy ala promocióndel crecimiento de distintas plantas, monocotiledóneasydicotiledóneas. Como ejemplos de posibles metabolitos útiles se citan3-acetil-1-propanol,3-metil-1-butanol, indol, acetato de isoamiloyacetato debutilo.El resumen menciona quelos posibles microorganismosquedanlugaraun metabolito volátilconel efectobuscado comprendenbacterias pertenecientes a los géneros Bacillus o Paenibacillus, siendo una cepa de la especie Paenibacillus polymyxa el microorganismo preferido.

Tal como se ha mencionado previamente, se ha detectado también que los compuestos volátiles emitidos por algunas bacterias tienen otros efectos en lasplantas, ademásdela activación del sistemade defensaylapromocióndel crecimiento. Así, Zhang et al. (Zhang et al. 2008: Soil bacteria augment Arabidopsis photosynthesis by decreasing glucose sensingand abscisicacidlevelsin planta,ThePlantJournal56,264-273), describencómolaexposiciónde plantas de Arabidopsis thaliana a los volátiles emitidos por Bacillus subtilis GB03, cultivado de nuevo en el medio de cultivoagarcon tripticasadesoja,reprimenlasensibilidadalaglucosadelasplantas,provocando simultáneamenteun ligero aumentodela acumulaciónde azúcary un incrementodela fotosíntesis, proceso este último que normalmente se ve inhibido cuando se incrementan los niveles de azúcares solubles acumulados en las plantas. Las plantas que entran en contacto con los volátiles emitidos por B. subtilis GB03 muestran incrementosde50-62% del contenidode azúcares solubles sobrelas plantas controlque, aproximadamente, acumulan2micromolesdehexosapor gramode peso fresco (cf. Fig. 2, Zhang et al. 2008: Soil bacteria augment Arabidopsis photosynthesis by decreasing glucose sensing and abscisic acid levels in planta, The Plant Journal 56, 264-273). El incremento del contenido de azúcares solubles generalmente está asociado con una disminución de los niveles intracelulares de almidón (Caspar et al. (1985): Alterations in growth, photosynthesis and respiration in a starchless mutant of Arabidopsis thaliana (L)deficient in chloroplast phosphoglucomutase, Plant Physiol. 79: 11-17; Jones et al. (1986): Reduced enzyme activity and starch level in an induced mutant of chloroplast phophoglucose isomerase, Plant Physiol.81: 367-371; Lin et al. (1988):A starch deficient mutant of Arabidopsis thaliana with low ADPglucose phosphorylase activity lack one of the subunits of the enzyme, Plant Physiol. 86: 1131-1135; Neuhaus and Stitt (1990): Controlanalysis of phosphosynthatepartioning. Impactofreduced activityofADP-glucosepyrophosphorylaseor plastid phosphoglucomutaseonthe fluxesto starch and sucrose in Arabidopsis thaliana, Planta 182: 445-454; Szydlowski et al. (2009): Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of either class IV or class III starch synthase, Plant Cell 21, 2443-2457). Por lo tanto, es esperable que, en las condiciones empleadas por Zhang et al., las plantas que entran en contacto con los volátiles emitidos por B. subtilis GB03 acumulen poco almidón. El método utilizado por elgrupo de Zhang et al.

sólo permitemedirel contenidode glucosa, fructosa, fructosa-6-fosfatoyglucosa-6-fosfato, aunque noel almidón acumulado, aunquela ausenciadevariacionesenlosnivelesdeexpresiónde genes implicadosenel metabolismode almidón tales comola almidón sintasao enzimasdegradadorasdel almidónreveladaporel análisis transcriptómicode proteínasde cloroplastoen plantasexpuestasalosvolátiles mostradoenlaTabla Suplementaria1 no parece indicar que fuera esperable una elevación de este polisacárido de reserva al ser sometida la planta a los efectos de los volátiles emitidos por B. subtilis GB03. Esta interpretación se ve apoyada por el hecho de que los ensayos referidos a la inhibicióndela longituddel hipocótiloyla germinaciónde semillas indicanquelosvolátilesde B. subtilis GB03 no provocan una respuesta metabólica al tratamiento, puesto no parecen afectar al metabolismo de los azúcares, sino a la sensibilidad a dichos compuestos.

De acuerdo con lo que se sabía hasta ahora, todos estos efectos sobre las plantas no son comunes a los volátiles emitidos por cualquier bacteria. Así, por ejemplo, tal como se comentaba más arriba, los ensayos realizados por Ryu et al (Ryu et al.2003: BacterialvolátilespromotegrowthinArabidopsis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100,4927-4932) demuestran que varias cepas de especies pertenecientes Bacillus, tales como Bacillus pumilus T4 o Bacillus pasteurii C-9, así como bacteriaspertenecientes a otros géneros tales como Pseudomonas fluorescens 89B-61 o Serratia marcescens 90-166,no fueron capacesde incrementarel crecimientode plantasde Arabidopsis thaliana sometidas al efecto de los volátiles emitidos por dichas bacterias, a pesar de haber sido cultivadas igualmente en el mismo medio decultivo,ricoen azúcaresyaminoácidos:elagarcon tripticasadesoja.Otradelasbacterias incluidasenelmismo ensayo, Escherichia coli DH5α, se utilizó en el mismo ensayo como control, por estar reconocida como una cepa que no incrementa el crecimiento de las plantas sometidas a la acción de los volátiles emitidos por ella.

Además, se ha visto también que los volátiles de bacterias tales como Pseudomonas spp., Serratia spp.y Stenotrophomonas spp.,yde algunas especiesde hongos ejercenefectos inhibitorios sobreel crecimientode plantasde Arabidopsis (Splivallo et al. 2007b:Trafilevolátiles inhibitgrowthand induceand oxidativeburstin Arabidopsis thaliana,.NewPhytologist 175, 417-424,Tarkka and Piechulla, 2007: Aromatic weapons: truffles attack plantsby the productionofvolátiles,NewPhytologist 175,381-383).

Debidoalafaltade conocimiento acercadecómolosvolátiles microbianospueden afectaralareprogramacióndel metabolismo celular, en particularal metabolismo primariodehidratosde carbono, enla actualidad no es posible actuarsobreel metabolismodelasplantasparapromoversu crecimientoconvolátiles microbianos,puesnoestánclaros los mecanismos implicados en promover o en inhibir el crecimiento activados por los microorganismos anteriormente citados, ni en las condiciones en las que se activan unos u otros o las posibles diferencias entre microorganismos que dan lugar a uno u otro efecto. Sin embargo, sería interesante conocer estos mecanismos para poder diseñar un procedimientoparaactivarel crecimientoy/ola floracióndelas plantas,e incrementarsu crecimiento, resistencia biológica ymecánica medianteel usodevolátiles microbianosy, preferiblemente, para incrementarla síntesisde almidónen las plantas,por ser éste enla actualidad un producto de gran interés en algunas industrias. La presente invención proporciona una solución a este problema.

Descripción de la invención

La invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que, al crecer plantas en presencia de cualquier tipo de microorganismo(bacterias Gram-positivaoGram-negativas,levadurasuhongos),sinqueexista contacto entrela plantayel microorganismo,losvolátilesemitidosporel microorganismodanlugaraquese produzca una alteración en el patrón de desarrolloy un aumento en el crecimiento, la fertilidad, el peso secoyla acumulación de almidón de las plantas. Además, la exposición a tales volátiles induce a la acumulación de un almidón con características estructurales diferentes a las del almidón acumulado por plantas no expuestas a volátiles, tanto en lo que se refiere a la propia estructura de la molécula del almidón como al tamaño de los gránulos de acumulación. Estos efectos se observan tanto con plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas(Arabidopsis, maíz, cebada, tabaco, patata...),y son independientesdequeel microorganismoseaono patógenoparalaplantaydeque pertenezcaonoaunaespecie que no convive con la planta en condiciones naturales. Estos efectos se observan tanto si las plantas se cultivan in vitro como en tierra, siempre y cuando la planta se cultive en presencia de un cultivo de un microorganismo queemitavolátilesobienen presenciadelosvolátiles microbianos emitidosporel microorganismo.Éstos parecenserlos responsablesdelos efectos observados.Por tanto, aunquenoexista contacto físico entrelaplantayel microorganismo, este último debe estarlo suficientemente próximoala planta, como para que los compuestosvolátiles emitidosporel microorganismosí entren en contacto conla plantaypuedan ejercer su efecto sobreella.

La alteración del patrón de desarrollo de la planta se manifiesta aumentando el número de hojas, el número de ramas,el númerode floresy semillase induciendola floración.

Este efectoseha observado con todotipode microorganismosy, particularmenteenel casodelos estudios realizados en hojas, parece ser la consecuencia de una transición del estatus de fuente al de sumidero. Así, los resultados presentados en la presente solicitud muestran que las emisiones de volátiles de todas las especies microbianas analizadas promovieron un aumentodela biomasa en las plantasy condujeronala acumulaciónde un alto contenido de almidón, en comparación con las plantas control crecidas en las mismas condiciones, salvo por la ausenciadel cultivo del microorganismo. El efecto observado es independiente de la presencia de sacarosa en el medio de cultivo yes fuertemente reprimido por la suplementación con cisteína. El efecto sucede tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas.Estoesasínosóloparavolátiles emitidospor rizobacterias promotorasdel crecimientodelas plantas tales como ciertos aislados de Bacillus subtilis, sino también, sorprendentemente, para los volátiles emitidos para diferentes patógenosvegetales fúngicosybacteriasde especies como E. coli o Pseudomonas spp.,ycontradicen resultados previos encontrados con dichas especiesyalgunas especies de hongos, en las que se había observado el efecto contrario, dando lugar sus volátiles a una inhibición del crecimiento de las plantas cultivadas en su presencia). De esta manera,la presenteinvención demuestraquela capacidadde emitirvolátilesque influyen positivamente sobre la biomasadelas plantasen generalysobresu crecimientoenparticularnose restringealas rizobacterias,siempre que el microorganismo se cultive en el medio adecuado.

El efecto positivo sobre el crecimientoyla acumulación del almidón se observa muy especialmente cuando el microorganismo se cultiva en medio mínimo (entendiendocomo tal un medio que carecedeaminoácidos peroque contienediversas sales,que puedenvariarsegúnla especiede microorganismoylas condicionesde crecimiento,que sonlasque proporcionan elementos esenciales tales como magnesio, nitrógeno, fósforoyazufreparaqueel microorganismopuede sintetizar proteínasyácidos nucleicos) suplementadoconuna fuentede carbonoorgánico (generalmente, un azúcar,tal como glucosao sacarosa).Parecequelautilizaciónde estetipode medioevitaquelos microorganismos generen amonio volátil a partir de aminoácidos u otras fuentes de nitrógeno orgánico presentes en medios ricos en aminoácidos como los utilizadosenlos ensayos en los que otros autores habían observado inhibición del crecimiento porvolátiles microbianos (tales comoel medioLBoel mediodeKornberg),y esta diferencia parece serla causa quedalugaraqueel cultivode plantasen presenciademicroorganismos conlosqueno tienen contactodélugara un aumento del crecimiento, floración, ramificación, fertilidad, robustez, biomasa en generalyde la acumulación de almidón en particular.

Es ésta la primera ocasión en la que se informa de que los volátiles microbianos sean capaces de inducir tanto el crecimiento como la floración, la ramificaciónyla acumulación de almidón, así como la alteración estructural de este polímero en las plantas que crecen bajo su efecto. Así, los autores de la invención parecen haber encontrado las condiciones de cultivo que permiten que cualquier tipo de microorganismo (patógeno o no para la planta) libere una mezcla de volátiles capaz de ejercer un efecto positivo tanto sobre el crecimiento como sobre la floración, la ramificaciónysobrela acumulaciónde almidón.

Los resultados obtenidos por los autores de la invención contradicen, además, algunas ideas previas respecto al medio de cultivo a utilizar para que una bacteria produzca los volátiles adecuados para promover el crecimiento de plantas cultivadas en presencia de dichos volátiles, tal como la idea que parece sugerirse en la patente japonesa JP10033064 de que el cultivo en un medio rico en azúcar pudiera ser suficiente para que algunas bacterias emitieran una mezcladevolátiles capazde inducirel crecimientode plantasyprotegerlas frentea patógenos.Así,los ensayos descritosmás adelanteenlos Ejemplosdela presente solicitud muestranquevolátiles emitidospor bacteriasyotros microorganismos, crecidos en LB con glucosa 50 mM, ejercen un efecto negativo no sólo sobre el crecimiento, sino también sobre la acumulación de almidón en las plantas que entran en contacto con dichos volátiles.

En cuanto al incremento de la cantidad de almidón acumulada, se observa en distintos órganos de la planta: hojas (no sólo cuando están unidas a la planta completa, sino también en hojas desprendidas de la planta, colocadas en presenciadevolátiles emitidospor microorganismosde distintas especies); raíces;tallos; tubérculos(enlosquela cantidad de almidón acumulada, por ejemplo en plantas de patata, es superior a la acumulada en plantas control ...).

El descubrimiento de que los volátiles microbianos inducen la sobreacumulación de almidón en hojas y otros órganos de la planta constituye un mecanismo del que no se había informado previamente, que establece una función adicional para los volátiles como moléculas señalizadoras que median en las interacciones planta-microorganismo y que ayuda en la dilucidación del proceso de inducción del metabolismo de hidratos de carbono en las plantas mediante microorganismos. El incremento en la cantidad de almidón acumulado parece ir acompañado, además, por cambios estructurales en el almidón, tanto en lo que se refiere a la estructura del biopolímero, como a la de los gránulos. Así, se observa, por una parte, que los gránulos de almidón son de tamaño superior al de las plantas control cultivadas en ausencia de volátiles. Es esta una características bastante importante, pues el tamaño del gránulo de almidóntieneunagran importanciaanivelindustrial,porserun determinante importantedelaspropiedadesfísicoquímicas de las suspensión de los gránulos de almidón, de manera la diferencia del tamañoyforma de los gránulos de almidón de especies tales como patata, trigo, maíz, etc., es lo que, en gran medida, determina que estos almidones tengan aplicaciones industriales diferentes. Además, se observa que el almidón acumulado por las plantas que crecen en atmósferas que contienen volátiles microbianos presentan una importante reducción en el contenido relativo de amilosa, con lo que la relación amilosa/amilopectina es inferior a la de las plantas control. Esta modificación en la estructura de la molécula del almidón se ve acompañada por cambios en el grado de polimerización de las cadenas de amilopectina, que es menor en las plantas tratadas con volátiles microbianas. Así, el cultivo de plantas en atmósferas que contienen volátiles emitidos por microorganismos permite obtener plantas que no sólo tienen una producción superior de almidón sino que, además, dan lugar a un almidón cuyas características permiten aplicaciones industriales diferentes a las del almidón sintetizado por las plantas cultivadas en ausencia de volátiles.

Los análisis de transcriptomas de, entre otros, hojas de plantas de patata expuestas a volátiles de origen fúngico (concretamente, producidos por hongos del género Alternaria)han revelado que los cambios en el metabolismo del almidón están acompañadospor cambiosen múltiples procesos biológicosy enlaactividadoexpresiónde distintas enzimas, tales como:

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regulaciónalalzade: sacarosasintasa, inhibidoresdeinvertasas,sintasadealmidóndeclaseIV,enzimara

mificantedel almidón, proteínas implicasen endocitosisytráficodevesículas,el transportadorde glucosa-

6-fosfato del estromaalcitosol,yenzimas implicadas en rutas glucolíticas, respiratoriasyfermentativas;

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regulación a la baja de: invertasa ácida, tiorredoxinas plastidiales, enzimas de degradación del almidón, proteínas implicadas en la conversión de triosas-fosfato plastidiales en glucosa-6-fosfato citosólicas, proteínas implicas en la provisión interna de aminoácidos tales como la nitrito reductasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa plastidial, la cisteína sintasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa plastidial, etc ....

La Fig. 21 ilustra un modelo metabólico sugerido para el proceso desencadenado por los volátiles microbianos, deducidoapartirdelosestudiosrealizadosenhojasdeplantasdepatataquese describenmás adelanteenlosEjemplos dela presente solicitud,que comprendenestudiosdevariación tantoenactividades enzimáticas comoenel transcriptoma, así como análisis medianteRT-PCRde losnivelesdediversos transcritos específicos especialmente relacionados conel metabolismodeN,CyS.

Tal comose discuteenlosEjemplosque aparecenmás adelanteenla presentememoria,laregulaciónalalzade la sacarosa sintasa(SuSy)pareceserunodelosfactores determinantesdelaacumulaciónde almidónenlasplantas sometidas al efecto de los volátiles microbianos. Pero los efectos observados sobre otras enzimas, particularmente la reducción de la cisteína sintasa, la reducción de la nitrito reductasa, la reducción de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa plastidial, la reducción de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa plastidial, la sobre-expresión del translocadorde glucosa-6-fosfatoyla sobreexpresióndel inhibidorde proteasa, soloso combinados entresí, parecen ser capacesdedarlugaral incrementoenel contenidodel almidón,sin necesidaddequese produzcaun incrementoenla actividad sacarosa sintasa.

Todos estos hallazgos abrenla puerta para plantearse procedimientos para incrementar el crecimiento de plantas y/o su producción de almidón mediante su cultivo en presencia de microorganismos que producen volátiles, sin existir contacto entre ellos,o medianteel cultivodelas plantas en presenciadelamezcladevolátiles producida porel microorganismo previamente cultivado en un espacio diferente al de crecimiento de la planta. Por tanto, deja abierta la posibilidadde incrementarla productividadde plantas cultivadas,porejemplo,eninvernaderos, cocultivandocon ellas microorganismos emisores de compuestos volátiles; alternativamente, las plantas podrían entrar en contacto con los volátiles porque los mismos se aplicaran directamente a los invernaderos, tras haber sido cultivados los microorganismos en grandes fermentadores, en los medios adecuados (en general, medios mínimos tales como M9, MOPS, Murashige&Skoog (MS) etc.). El hecho de que las hojas acumulen más almidón en presencia de microorganismos queproducenvolátiles, incluso cuando dichas hojas están separadasdela planta, permiteel diseñode un mecanismo alternativo para la obtención de almidón en el que se utilizan hojas desprendidas de plantas, que pueden ser productos de desecho del procesamiento de las mismas. La dilucidación de las enzimas en cuya actividad/expresión se producen cambios que promueven la acumulación del almidón permiten conseguir el incremento en la producción de almidón mediante métodos alternativos, basados en el mismo principio inventivo, en elque los cambios en determinadas enzimas se producen en la planta por el hecho de utilizarse plantas transgénicas que sobreexpresan el gen o genes de interésoenlasqueseexpresaun inhibidordelas mismascuyaactividadsevereducidaporla presenciadelosvolátiles microbianos.

Además, el hecho de que las hojas separadas de la planta completa sean capaces también de producir almidón, cuandose mantienenen presenciade cultivosde microorganismosque producenvolátiles,esmuy importantedesde el puntodevista industrial.En cuestiónde 2-3 días,las hojas son capacesde producir enormes cantidadesde almidón con tan sólo4ingredientes, que podrían considerarse “baratos”: un pocode agua,CO2 natural, luz naturaly volátiles microbianos. Se puede considerar que la hoja actuaría como una biofactoría productora de almidón alimentada por luz solar. Además del interés que el almidón producido podría tener para la industria del almidón, hay que tener en cuenta la ventaja que supone poder utilizar hojas separadas de las plantas completas, pues los restos de podas que normalmente son destruidos (por ejemplo, hojas de patata), podrían ser destinados a la producción de un tipo de almidón de interés industrial.

Por todo ello, la invención se refiere a un método para aumentar el tamaño de una planta, su patrón de desarrollo (incluidas características relacionadas con su fertilidad, la biomasa en generalyel almidón en particular creciendo la misma en presencia de los volátiles emitidos por un microorganismo, microorganismo que puede cultivarse en el mismo espacio que la planta, para que la planta entre en contacto con ellos debido a que el microorganismo libera dichosvolátilesala atmósferaenlaqueestá creciendolaplanta,oquepuedenhabersidorecogidospreviamentey añadirse artificialmenteala atmósferade crecimientodela planta.

Así,unobjetodela presenteinvenciónesun método paraincrementarel crecimientode una plantay/o alterar su patrón de desarrollo, caracterizado por que la planta se cultiva en presencia de un microorganismo que produce compuestosvolátiles, sin queexista contacto entrela plantayel microorganismo,o en presenciade losvolátiles emitidos por el microorganismo, en el que el microorganismo es distinto de los aislados Bacillus subtilis GB03y Bacillus amyloliquefaciens IN937. El aumento del crecimiento de la planta puede manifestarse en un aumento de tamaño (en longitud)dela plantay aumento del tamañode las hojas.En cuantoala alteración del patrónde desarrollo, puede manifestarse como un incremento del número de hojas, incremento del número de ramas, o en efectos más estrechamente relacionados conla fertilidad, comoel incrementodel númerode floresysemillasde plantas angiospermas,y/o la inducción de la floración, o en combinaciones de los efectos anteriores.

Elmicroorganismopuedeseruna bacteria,unalevaduraounhongo pluricelularmicroscópico. Cuandoelmicroorganismoseelige entre bacterias,puedeelegirsedeungénero distintoaBacillus o Paenibacillus, que son los génerosa los que pertenecen las cepas específicas de rizobacterias en las que previamente se había detectado un efecto positivo de sus emisiones de volátiles sobre el crecimiento de la planta al crecer en medios muy ricos.

Debido al efecto observado, concretamente, sobre el incremento dela acumulación de almidón, otro objeto de la invención es un método para incrementar la producción de almidón de una planta, caracterizado por que la planta se cultiva en presencia de un microorganismo que produce compuestos volátiles, sin que exista contacto entre la planta yel microorganismo, o en presencia de los volátiles emitidos por el microorganismo. Se prefiere especialmente que, además, el almidón producido presente modificaciones con respecto a la estructura normal de la planta, que pueden referirse tanto al aumento del tamaño de los gránulos de almidón, como a la estructura de la molécula del almidón ensí, concretamente,en una reduccióndela relación amilosa/amilopectina(que, comosehaexplicadopreviamente, disminuye respectoala halladaenlas plantas control,por producirse una importante reducciónenel contenido relativo de amilosa),yenla disminuciónelgradode polimerizacióndelas cadenasde amilopectina,quees menorenlasplantas tratadas con volátiles microbianos con respecto al observado en las plantas control, tal como se muestra más adelante en los Ejemplos referidos al análisis estructural del almidón obtenido al crecer las plantas en presencia de volátiles microbianos.

Dado que el aumento de almidón, según se demuestra en los Ejemplos de la presente solicitud, se ha observado en distintosórganosdela planta (hojas, tallos, raícesytubérculos), son realizaciones posibles del métodode incremento de la acumulación de almidón, preferiblemente con estructura modificada, aquéllas en las que el incremento de la producción de almidón se produce al menos en un órgano de la planta, preferiblemente seleccionado entre hoja, tallo, raíz, semillaso,enlas plantasquelo presenten,el tubérculo. Como sucede cuandosebuscaun incrementodel crecimiento y/o la alteración del patrón de desarrollo, cuando el objetivo específico es la acumulación de almidón la planta puede una angiosperma, monocotiledónea o dicotiledónea. Se prefieren particularmente las plantas de patata o de maíz. Entre los microorganismos, una posibleopción son los hongosde losgéneros Alternaria o Penicillium, cuya utilidad se demuestra más adelante en los Ejemplos de la presente solicitud.

Aprovechandoel conocimiento adquiridoporlos autores sobrelas modificacionesenel metabolismodelas plantas mediante los cuales los volátiles microbianos provocan el incremento de la acumulación de almidón, una alternativa al método de incremento de acumulación de almidón consiste enprovocar la acumulación directamente mediante el uso de plantas transgénicas, basadas en el mismo principio inventivo, en las que el transgén o transgenes expresado(s) da(n) lugar a la sobreexpresión de alguna de las enzimas reguladas al alza por la exposición a los volátiles o consiste en un inhibidor de la actividad o de la expresión (mediante RNAs de interferencia, por ejemplo) de alguna de las enzimasreguladasalabaja.Así,un aspecto alternativodelainvenciónesun métodopara incrementarla producción de almidón de una planta, caracterizado porque la planta es una planta transgénica en la que está presente al menos un transgén cuya expresión da lugar a un producto seleccionado del grupo de: un inhibidor de proteasas de plantas (tal como,por ejemplo,elque presentael númerode accesoenGenBank DQ16832),la enzima ramificantedelalmidón, un inhibidor de la invertasa ácida (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691928), un RNAantisentido dirigido contra la cisteína sintasa (que puede deducirse, por ejemplo, a partir de la secuencia correspondiente a la cisteína sintasa de la planta de patata, con número de acceso en GenBank AB029512), un RNA antisentido dirigido contra la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa plastidial (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691929), un RNAantisentido dirigido contra la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa plastidial (que puede deducirse, por ejemplo, a partir de la secuencia correspondiente a la glucosa-6fosfato deshidrogenasa de patata, con número de acceso en GenBank X83923) o un RNAantisentido dirigido contra la nitrito reductasa (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691930). Son realizaciones preferidas aquéllas en las que la planta expresa al menos un transgén cuya expresión da lugar a un producto seleccionado de grupo de: inhibidor de proteasas de plantas, un RNAantisentido dirigido contra la cisteína sintasa o un RNAantisentido dirigido contra la nitrito reductasa. En este último caso, las secuencias codificantes del transgén puedenderivarse,porejemplo,delas correspondientealgenomadelapatata,esdecir,eltransgénpuedeserunoque expreseel inhibidorde proteasascuya secuencia codificanteestá representadaporSEQIDNO:67oenelqueelRNA antisentido expresado por el transgén está dirigido contra la cisteína sintasa cuya secuencia codificante está representadaporSEQIDNO:69o contrala nitritoreductasacuya secuencia codificanteestá representadaporSEQIDNO:71. Se prefiere especialmente que la planta exprese más de un transgén de cualquiera de los citados anteriormente y/o aquéllas realizaciones en las que la planta, adicionalmente a uno o más transgenes de uno de los grupos anteriores, posee tambiénal menosun transgénquedalugaralaexpresión ectópicadelaenzima sacarosa sintasa (SuSy)(tal como puede ser un transgén que expresa la enzima de patata, cuyo mRNA tiene el número de acceso en GenBank AJ537575)olaexpresióndel transportadorde glucosa-6-fosfato(tal comoun transgénqueexpreseel transportador de patata, cuya secuencia codificanteypromotor tienenel númerode acceso en GenBankAY163867).

Finalmente, el hecho de que el incremento en el almidón acumulado se observe también en hojas que no forman parte de plantas completas, sino separadas de ellas, cuando la hoja se mantiene junto a un cultivo de un microorganismo, permite contemplar un aspecto más de la invención. El mismo sería un método para la obtención de almidón a partirdehojasdeplantas separadasdelasmismas,que comprendeunaetapaenlaquelashojasse mantieneenpresencia(perosin contactofísico)deuncultivodeun microorganismoodelosvolátiles emitidospor este.Denuevo,se prefierequeel microorganismoseauna bacteria,levadurauhongo microscópicoqueno entreen contactoconlaplanta en condiciones naturales de cultivo. Una posible preferencia son los hongos de los géneros Alternaria o Penicillium, especialmente cuando las hojas son hojas de patata.

Tal como se ha comentado, el método de la invención, en cualquiera de sus aspectos (excepto el que se refiere al uso de plantas transgénicas) requiere que el cultivo de la planta o la colocación de las hojas desprendidas en las que se quiere inducir la acumulación de almidón, se haga de manera que los volátiles emitidos por el microorganismo estén presentes en la atmósfera en la que se cultiva la planta. Cumpliéndose esta condición, el procedimiento dela invenciónpuedellevarseacabodedistintas maneras.Una posibilidadesquelaplantayel microorganismosecultiven simultáneamenteenunmismo recipiente,oquelashojasse introduzcanenun recipienteenelqueseesté produciendo elcultivode microorganismos;enesecaso,parafavorecerquelaplanta entreen contactoconlosvolátiles emitidos por el microorganismo, es preferible que el recipiente sea un recipiente cerrado que, a su vez, contenga el recipiente específico, tal como una Placa Petri, en el que se cultiva el microorganismo, preferiblemente en un medio sólido.El recipiente comúnde cultivodela plantayel microorganismo puede ser uninvernadero enel que, preferiblemente,las condiciones de humedad, temperatura e, incluso, velocidad de circulación del aire, están controladas artificialmente.

Dado que el procedimiento de la invención no requiere contacto entre el microorganismoy la planta, sino que son losvolátiles emitidos porelmicroorganismo, no es necesario queel microorganismoyla planta se cultivenen proximidad,sinoquelaplantaasuvezpuedesercultivadaen presenciadelosvolátilesemitidosporel microorganismo sin necesidad de que éste esté localizado cerca de la planta. Así, es posible cultivar los microorganismos previamente, enellugarycondicionesde cultivoquese elijan, recogiendolosvolátiles emitidos para, posteriormente, hacerque la planta crezcaen presenciade dichosvolátiles,haciendoque estén presentesenlaatmósferaenlaquese cultivala planta.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término “microorganismo”incluye bacterias, levaduras, algasy protozoos, todos ellos generalmente unicelulares, así como hongos microscópicos pluricelulares como los mohos, que pueden ser propagadosymanipulados en un laboratorio.

El microorganismo utilizado puede pertenecer a una especie patógena o no patógena para la planta, que convive

o no con la planta en condiciones naturales. Dicho microorganismo puede ser una bacteria, una levadura o un hongo microscópico. Dentro de ellos, se tiene particular preferencia por los hongos pertenecientes al género Penicillium (por ejemplo Penicilliumchartesii,Penicillium aurantiogriseium)oAlternaria (por ejemplo Alternaria alternata),por las levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae ypor las bacterias pertenecientes a los génerosBacillus (especialmente, Bacillus subtilis y, por ejemplo,Bacillus subtilis 168), Salmonella (por ejemplo, Salmonella enterica LT2), Escherichia (especialmente, Escherichia coli y,muy particularmente,Escherichia coli BW25113), Agrobacterium (especialmente, Agrobacterium tumefaciens y, muy particularmente,Agrobacterium tumefaciens EHA105óGV2260)o Pseudomonas (especialmente, Pseudomonas syringae y,muy particularmente,Pseudomonas syringae 1448A9, 49a/90 óPK2).

Tal como se ha comentado previamente, cuando el microorganismo se elige entre bacterias, puede elegirse de un género distinto a Bacillus o Paenibacillus, que son los géneros a los que pertenecen las cepas específicas de rizobacterias en las que previamente se había detectado un efecto positivo de sus emisiones de volátiles sobre el crecimiento de la planta al crecer en medios muy ricos: ambos géneros pueden excluirse del grupo de bacterias elegibles. En cualquier caso, se ha observado que los volátiles emitidos por bacterias pertenecientes a estos géneros, de cepas distintas de Bacillus subtilis GB03y Bacillus amyloliquefaciens IN937, son capaces de producir el efecto de aumento del crecimientodelas plantascuandolas bacteriasse cultivanenun medioque carecede compuestosorgánicosque poseen grupos amino, particularmente aminoácidos y/o proteínas, tales como medios mínimos suplementados con una fuente de carbono orgánico, produciendo también un incremento en la acumulación de almidón: ninguno de estos efectos eran esperables de los resultados previos obtenidos con volátiles de rizobacterias, que parecían indicar que el efecto sobre el crecimiento era exclusivo de los volátiles emitidos por ciertas cepas. La inducción de la acumulación de almidón,además,nohabíasido descritapreviamentepara mezclasdevolátilesemitidaspor microorganismosy, como se demuestra más adelante en los Ejemplos de la invención, se observa para todos los microorganismos con los que se realizaron experimentos: así, tal como se ha mencionado previamente, se considera que cualquier bacteria, hongo microscópico o levadura puede elegirse para llevar a efecto el aspecto del método de la invención referido específicamente a la acumulación de almidón, ya sea en plantas completas en crecimiento o en hojas desprendidas.

En cualquiera de los aspectos del método de la invención que no se refieren a la utilización específica de plantas transgénicas, se prefiere particularmente que el crecimiento del microorganismo se produzca en un medio que carezca de compuestos orgánicos que incluyan nitrógeno en su fórmula o, al menos, que carezca de compuestos orgánicos que presente grupos amino, tales como aminoácidos y/o proteínas. Se tiene muy especial preferencia por el cultivo en medio mínimo que contenga un compuesto orgánico como fuente de carbono, que puede ser, por ejemplo, sacarosa o glucosa u otros compuestos orgánicos tales como el succinato.

Entre las plantas, se prefieren las angiospermas (tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas), en las que se ha observado aumento del número de ramificaciones y del número de flores con respecto a las plantas control. Este efecto permite también que un aspecto más de la invención sea un método para inducir la floraciónypara aumentar el número de ramificaciones y/o de flores producidas por una planta, en el que el objetivo se consigue cultivandola planta en presenciade un microorganismo que produce compuestosvolátiles, sin queexista contactoentrelaplantay el microorganismo.Cuandoelefectobuscadoesel aumentodelnúmerodeflores,laplantatendráqueser,lógicamente, una planta capaz de producirlas: una angiosperma, tanto monocotiledónea como dicotiledónea.

Lainvención seexplicará ahora con más detalle mediante los EjemplosyFiguras queaparecena continuación.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Rutas sugeridas de síntesis de almidón en hojas de origen.

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Elpanel(A)ilustrael “modelo clásico”,segúnelcualel procesode biosíntesisdelalmidón tienelugarexclusivamente en el cloroplasto, separado del proceso de biosíntesis de sacarosa que tiene lugar en el citosol.

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Elpanel (B) ilustra el “modelo alternativo” en el que tanto la ruta biosintética de la sacarosa como la del almidón están interconectadas por medio de actividad productora de ADPG de SuSy (sacarosa sintasa).

Compuestosimplicados: FBP: fructosa-1,6-bifosfato; F6P: fructosa-6-bifosfato; G6P: glucosa-6-fosfato; G1P: glucosa-1-fosfato; ADPG; ADP-glucosa; UDPG: UDP-glucosa. Actividades enzimáticas: 1, 1’: fructosa-1,6-bifosfato aldolasa; 2, 2’: fructosa-1,6-bifosfatasa; 3: PPi:fructosa-6-fosfato fosfotransferasa; 4, 4’: fosfoglucosa isomerasa; 5, 5’: fosfoglucomutasa;6: UDPG pirofosforilasa;7: sacarosa fosfato sintasa;8: sacarosa-fosfato-fosfatasa;9:AGP; 10:SS (almidón sintasa); 11: almidón fosforilasa; 12, SuSy (sacarosa sintasa).

Fig.2: Condicionesde cultivode plantasde Arabidopsisyefectode losvolátiles microbianos sobre las mismas.

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Paneles (A), (B), (C)y (D):Fotografías que ilustran las condiciones de cultivo de plantas de Arabidopsis en ausencia(AyC)y presencia(ByD)devolátiles microbianos.Paraverel efectode losvolátiles, placas Petrique contenían plantas completamente desarrolladas se introdujeron en cajas de plástico en las que previamente se habían incluido cultivos de E. coli BW25113 crecidos enmedio sólidoM9 suplementado con50mM glucosa (panelB)y Alternaria alternata crecida en medio sólido MS suplementado con 90 mM sacarosa (panel D). Las cajas se sellaron y,a los tiempos de incubación indicados, se recogieron las plantas para realizar los análisis.

Fig.3: Efectodelosvolátilesproducidospor Alternatira alternata sobre el peso fresco (panel A), peso seco (panel B),númerodeflores(panelC),númerodevainas(panelD),longituddelbrote(panelE)ynúmerode ramas(panel F)de Arabidopsis.Las fotografíasdelospanelesGyHilustranel efecto positivodelosvolátiles fúngicos (FVs)en el númerode flores,vainas, longitud del broteynúmerode ramas en plantasexpuestas durante6díasa los FVs. A. alternata fue cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig.4: Condicionesde cultivode plantasde tabacoyefectode losvolátiles microbianos sobreel desarrolloy crecimiento de las plantas:

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PanelA:Fotografíasque ilustranlas condicionesde cultivodeplantasde tabacoen ausencia(-FV)oen presencia (+FV) de volátiles fúngicos (FV) emitidos por un cultivo de Alternaria alternata. Las plantas se cultivaron durante6 días,y se procedióa su comparación.

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PanelesByC: Comparaciónde plantasde tabaco cultivadas en las mismas condiciones, salvola ausencia (-FV)

opresencia (+FV) del cultivo de Alternaria alternata. Se observa que las plantas crecidas en presencia de volátiles fúngicos emitidos por A. alternata son de mayor tamaño, hecho que se aprecia particularmente en las hojas e, incluso, presentan un número mayor de hojas (panel C). Además, se observa que las plantas tratadas con FVs florecen antes.

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PanelD:Fotografíasenlasquese muestran plantasde tabaco completas, incluidaslas raíces, crecidasen ausencia (-FV) o presencia (+FV) del cultivo de Alternaria alternata. Se aprecia que el tamaño de la raíz es mayor en el caso de las plantas crecidas en condiciones +FV. A. alternata fue cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig. 5. Efecto de los volátiles producidos por Salmonella enterica LT2 (panel A), las cepas de Agrobacterium tumefaciens indicadas junto a las fotografías (EHA105 o GV2260) (panel B), o las cepas de Pseudomonas syringae 49a/90yPK2(panelC) sobreel crecimientode Arabidopisis, segúnel mediodecultivodela bacteria: medio mínimo (M9) o LB suplementados con 50 mM glucosa.

Se observa que las plantas de Arabidopsis crecidas en presencia de bacterias crecidas sobre medio LB presentan zonas amarillas (puntosmás claros sobrelas hojas)y menor tamañoy/o aspectode estar enfermas.

Fig. 6: Efecto de los volátiles de especies microbianas en la acumulación de almidón en hojas de Arabidopsis.

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Panel A: contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis cultivadas2 días en medio MS sólido suplementado con sacarosa 90 mM, en presencia o ausencia de: Alternaria alternata,Penicilliumcharlessi,Penicillium aurantiogriseum, Pseudomonas syringae PK2, Pseudomonas syringae 49a/90, Pseudomonas syringae 1448A9, A. tumefaciens GV2260, A. tumefaciens EHA105, E. coli (BW25113), Salmonella enterica (LT2), B. subtilis 168, Saccharomyces cerevisiae NA33.Todoslos microorganismos,exceptoS. cerivisiae,Penicillium aurantiogriseum,y Penicillium charlessi se crecieron en medio sólido M9 suplementado con 50 mM glucosa. P. aurantiogriseum,P.charlessi yA. alternata se crecieron en MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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Panel B: cuantificación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, cultivadas en presencia de distintas bacteriasy hongos según se indica bajo las barras correspondientes, barras que están agrupadas según el medio de cultivo del microorganismo: medio mínimo (M9) sólido suplementado con 90 mM glucosa (barras sin relleno) o LB sólido suplementado con 90 mM glucosa (barras con relleno oscuro). Se observa que el efecto positivo sobre el incremento de almidón sólo tiene lugar cuando los microorganismos crecen en medio mínimo.

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PanelC: contenidode almidónenhojasdeplantasde Arabidopsiscultivadasenlas mismas condicionesdecultivo que en el panel A, en presencia de carbón, un cultivo de A. alternata. A. alternata en presenciade carbón,o un cultivo inicial de Alternaria retirado durantelos3días siguientes,segúnse indicabajolas barras.Seobservala disminución del efecto inductoren presenciade carbónyla desaparicióndel efecto tras3días fueradecontacto conlosvolátiles fúngicos. A. alternata fue cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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Panel D: cuantificación del contenido de almidón en tallos de Arabidopsis crecidas en ausencia (-FV) o en presencia (+FV) de volátiles fúngicos producidos por A. alternata. Se observa un aumento muy fuerte del almidón en los tallos en condiciones +FV. A. alternata fue cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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Panel E: contenidode almidón en raíces de Arabidopsis crecidas en ausencia(∅)oen presencia(+FV)devolátiles fúngicos producidos por A. alternata. Se observa también un fuerte aumento del almidón en las raíces en condiciones +FV. A. alternata fue cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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PanelesFyG: comparación de la biomasa observada en hojas (primera barra de cada pareja, relleno punteado) y en raíces (segunda barra de cada pareja, relleno más oscuro continuo) de Arabidopsis, en ausencia (-FV) o en presencia (+FV) de volátiles fúngicos producidos por A. alternata. El efecto se observa tanto si se determina el peso fresco (panelF)comoel peso seco(panelG). A. alternata fue cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig.7: Efectode losvolátiles fúngicos sobre plantasde maízyArabidopsis cultivadas en tierra.

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PanelA:Fotografíasde plantasdemaíz crecidasen tierra,en ausencia(-FV)o presencia durante6días(+FV) de volátiles fúngicos producidos por hongos Alternaria alternata cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa. Se observa que las plantas crecidas en presencia de volátiles son más robustas. Como se demuestran en elPanelB, acumulan másalmidón.

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Panel B: Contenido de almidón, expresado en micromoles de glucosa por gramo de peso húmedo (FW), de las hojas de plantas de maíz del panel A. Control: plantas crecidas en ausencia de volátiles fúngicos; +Hongo: plantas crecidas en presencia durante6díasde un cultivode A. alternata que emite volátiles fúngicos.

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PanelC:Fotografíasde plantasde Arabidopsis crecidasen tierra,en ausencia(-FV)o presencia(+FV)devolátiles fúngicos producidos por hongos Alternaria alternata cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa. Como se demuestran enelPanelD, acumulan más almidón.

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Panel D: Contenido de almidón, expresado en micromoles de glucosa por gramo de peso húmedo (FW), de las hojas de plantas de Arabidopsis del panel C. -FV: plantas crecidas en ausencia de volátiles fúngicos; +FV: plantas crecidas durante6días en presenciade un cultivode A. alternata que emite volátiles fúngicos.

Fig.8: Examen visualymicroscópicode tejidosde plantas crecidasen ausenciao presenciadevolátiles emitidos por Alternaria alternata cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa:

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PanelesAyB: tinción de yodo de plantas deArabidopsis completas cultivadas en ausencia o en presencia de FVs, respectivamente.

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PanelesCyD: análisis de tinciones de yodo mediante microscopía óptica de cortes transversales de hojas de plantas cultivadas en ausencia o en presenciade FVs, respectivamente. Insertos:Patrónde intensidadde tincióny distribución de material positivo para yodo en células de mesófilo individuales.

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PanelesE,F,G: microscopíade barridoconláser confocaldehojasdeplantasqueexpresan GBSS-GFP,cultivadas en ausencia(E)o presencia(FyG)de FVs.

Barra =5µm enE,F,G; Barra =100 µm enCyD.

Fig. 9: Ubicuidad del efecto de los volátiles microbianos entre las plantas. Gráficos en los que se representa la cantidad de almidón (expresado como micromoles de glucosa por gramo de peso fresco del correspondiente extracto foliar) detectado en plantas de Arabidopsis (A), patata (B), maíz(C), cebada (D)y(E) tabaco cultivadas durante3 días en medio MS sólido, con o sin sacarosa 90 mM, tal como se indica debajo de las barras, en presencia (barras con la leyenda “+FV”) o en ausencia (barras con la leyenda “-FV”) de volátiles emitidos por un cultivo de A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig. 10: Gráficos en los que se representa la cantidad de almidón (expresado como micromoles de glucosa por gramodepeso frescodel correspondienteextractovegetal) acumuladoen tubérculos(panelA)ytallos(panelB)de plantas de patata cultivadas en medio MS sólido sin sacarosa en presencia o en ausencia de FVs emitidos por A. alternata cultivada en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig. 11: Acumulación de almidón en hojas desprendidas de la planta promovida por volátiles fúngicos emitidos por un cultivo de A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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PanelesA,B,C,D: Gráficosenlosquese representalacantidadde almidón(expresado como micromolesde glucosa por gramo de peso fresco del correspondiente extracto foliar) detectado en hojas de Arabidopsis (A), patata (B), maíz(C), cebada(D)mantenidasdurante2 díasen medioMS sólido(conosin sacarosa 90mM,tal comose indica debajo de las barras), en presencia (barras con la leyenda “+FV”) o en ausencia (barras con la leyenda “-FV”) de volátiles emitidos por un cultivo de A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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Panel E:Fotografías que ilustran las condiciones en las que se mantuvieron las hojas de plantas de patata en ausencia (columna con la etiqueta “-FV”) o en presencia (columna con la etiqueta “+FV”) de volátiles microbianos.

Fig. 12: Acumulación de almidón en hojas desprendidas de la planta cultivadas en superficie de papel mojada en MS líquidoo en aguapromovidaporvolátiles fúngicos emitidos por un cultivode A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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Panel A: Gráfico en el que se representa la cantidad de almidón (expresado como micromoles de glucosa por gramo de peso fresco del correspondiente extracto foliar) detectado en hojas de tabaco mantenidas durante 2 días enpapelmojadoenaguaoenMS líquido(conosin sacarosa 90mM,tal comose indicadebajodelas barras),en presencia (barras con la leyenda “+FV”) o en ausencia (barras con la leyenda “-FV”) de volátiles emitidos por un cultivo de A. alternata.

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PanelB:Fotografíasque ilustranlas condicionesenlasquese mantuvieronlashojasdeplantasde tabaco cultivadasensuperficiedepapelmojadaenMSlíquidooenaguaen ausencia(columnaconlaetiqueta“-FV”)oenpresencia (columna con la etiqueta “+FV”) de volátiles microbianos emitidos por A. alternata.

Fig. 13:Abundancia relativa,expresada comofactordevariación,de losnivelesde transcritosde losgenes indicados en abscisas, medidos mediante real time (RT)-PCR cuantitativa, en hojas de plantas de patata cultivadas en presenciadevolátiles fúngicos emitidospor A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.Losfactoresdevariación representadosson relativosalashojas controlde plantas cultivadasen ausenciadeFVs. Las plantas se cultivaron durante3días en presenciade FVsen medioMS sólido suplementado con sacarosa90mM, yse recogieronal finaldel períododeluz.LosnivelesdetranscritosdeSuSy(sacarosa sintasa)ydel translocadorde glucosa-6-P se midieron tanto en presencia (+sac) como en ausencia (-sac) de sacarosa.

Fig. 14: Categorización funcional de los transcritos diferencialmente expresados en hojas de patata cultivadas en MS suplementado (panel A) o no (panel B) con sacarosa 90 mM en presencia de volátiles fúngicos emitidos por A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa. Los transcritos se identificaron usando el array de oligos 60-méros POCI 44K(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/poci). Los transcritos regulados significativamente al alzay alabaja (diferenciade2,5vecesen plantas cultivadas con sacarosa y diferenciade1,9vecesenplantas cultivadas sin sacarosa) comparados con los controles, se clasificaron según su categoría funcional teórica según el software MapMan. Dicha categoríaseindicabajoelejede abscisas.En ordenadasse indicael númerode genesdesregulados en cada grupo categórico. Los genes reguladosal alza aparecen enbarras con relleno más claroylos genes regulados a la baja aparecen en barras con relleno más oscura. Los genes de la categoría “ningún efecto encontrado” no se incluyeron en el gráfico.

Fig.15: AnálisisdeAGPen transferenciastipoWesterndehojasdeplantasde patata,en condicionesno reductoras (sin ditiotreitol10 mM: -DTT)y reductoras (con ditiotreitol10 mM:+ DTT). Las plantas completas se cultivaron durante3díasenmedioMS sólido suplementadocon sacarosa90mMen presencia(“+FV”)oen ausencia(“-FV”) de volátiles emitidos por A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig. 16: Gráficos en los que se demuestra que los cambios en la actividad AGP juegan un papel menor en la acumulaciónde almidón inducidaporvolátilesenhojasde patata:(A)actividadAGP,(B) contenidode almidón,y(C) contenidode ADPG en hojasde plantas tipo silvestre (WT)yAGP62 (plantas antisentidodela subunidad pequeñade la ADPG pirofosforilasa) cultivadasen presencia (“+FV”)yen ausencia (“-FV”)devolátiles emitidospor A. alternata crecido en medioMS sólido suplementado con90mM sacarosa Las plantas completas se cultivaron durante3díasen medio MS sólido suplementado con sacarosa 90 mM.

Fig. 17: Gráficos en los que se representa, en hojas de patata cultivadas en presencia (+FV) o en ausencia (-FV) de volátiles fúngicos emitidos por Alternaria alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa: la actividad de SuSy productora de ADPG (panel A),ylos contenidos intracelulares de almidón (panel B), ADPG (panelC)yUDPG(panelD),todoelloexpresadocon referenciaalosgramosdepesofresco.Seobserva correlación entrela actividadde SuSy(sacarosa sintasa)ylos contenidosde los otros compuestos.

Fig. 18: Análisis de SuSy en transferencias tipo Western en hojas de plantas de patata cultivadas en presencia

(A)yausencia(B) de sacarosa tratadasy no tratadas con FVs emitidos por A. alternata crecido en medioMSsólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig. 19: Gráfico donde se representa el contenido de almidón (expresado como µmoles de glucosa por gramo de peso fresco) medido en plantasde patata cultivadas durante2días en enMS suplementado con sacarosa90mMylas concentraciones indicadasde cisteína, glicina, serinaymetionina en ausencia (-FV)o en presencia (+FV)devolátiles emitidos por A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa.

Fig.20:Losvolátilesfúngicos promueven tantola reduccióndel contenidode amilosa como cambiosenla composición de la amilopectina.

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Panel (A): Porcentaje de amilosa respecto a la amilopectina en hojas de plantas de patata cultivadas en presencia (+FV)yausencia(-FV)devolátiles fúngicos emitidospor A. alternata crecido en medioMSsólido suplementado con 90 mM sacarosa.

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Panel (B): Perfiles de distribución de longitudes de cadena (grado de polimerización: GP) en amilopectina desramificadapurificadaapartirdehojasdeplantasdepatatacultivadasen presenciayausenciadeFVs(barrasnegrasy blancas, respectivamente).

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Panel (C): Diferencia entre las distribuciones de longitudes de cadena de amilopectina desramificada purificada dehojas cultivadasen presenciay en ausenciadevolátiles fúngicos emitidospor A. alternata crecido en medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa, calculado como la diferencia entre el perfil en presencia de FVs menos el perfil en ausencia de FVs.

Fig. 21: Representación esquemática de las principales rutas de metabolismo de hidratos de carbono que se producen duranteel MIVOISAP segúnla visiónalternativadela biosíntesis del almidón.El panelArepresenta las situaciones que es probable que se den cuando las plantas se cultivan en condiciones heterotróficas, mientras que el panel Brepresenta situaciones que es probable que se den cuando las plantas se cultivan en condiciones autotróficas.Los cambiosenlaexpresiónde genesquecodifican enzimas principalesdel metabolismode hidratosde carbonose indican mediantevariacionesenla escalade grisesy enla continuidaddelas líneas (líneas grises discontinuas, incremento; líneas grises continuas, disminución; líneas negras, sin diferencias significativas).

Ejemplos

Los Ejemplos de la presente solicitud incluyen ensayos realizados con los siguientes materialesytécnicas metodológicas:

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Plantas, cultivos microbianos, condicionesde crecimientoyobtenciónde muestras

Este trabajo se llevóa cabo utilizando plantasde Arabidopsis thaliana (cv. Columbia),patata(Solanum tuberosum

L. cv Desirée), tabaco(Nicotiana tabacum), maíz(Zea mays, cv. Hill), cebada(Hordeum vulgare cv. Golden promise) cultivadasenplacasPetrique conteníanmedioMSsólidoconosin sacarosa90mMyla suplementaciónconaminoácidos indicada. Las plantas se hicieron crecer en cámarasde crecimiento con un fotoperíodode16hde luz (300 µmol fotones s−1m−2)ya una temperatura constantede 24ºC.

E. coli BW25113, A. tumefaciens EHA105yGV2260, Salmonella enterica LT2,Bacillus subtilis 168(Bacillus Genetic Stock Center,OhioState University,Columbus)y Pseudomonas syringae 1448A9, 49a/90yPK2 se cultivaron en placas Petri que contenían medio mínimo M9 sólido (95 mM Na2HPO4/44 mM KH2PO4/17 mM NaCl/37 mM NH4Cl/0,1 mM CaCl2/2 mM MgSO4, agar bacteriológico al 1,5%) suplementado con glucosa 50 mM. S. cerevisiae NA33 se cultivaron en placas que contenían medio sólido LB (triptona al 1%, NaCl al 1%, extracto de levaduras al 0,5%y agar bacteriológico al 1,5%) suplementado con glucosa 50 mM. Las colonias de Penicillium chartesii y Penicillium aurantiogriseiumo de Alternaria alternata se cultivaron en placas Petri que contenían medio MS sólido suplementado con sacarosa90mM.

Los cultivos microbianos se colocaron en cajas de plástico estérilesy se sellaron. Después de dos días, las placas Petri que contenían plantas completamente desarrolladas se colocaron en cajas que contenían cultivos microbianos, talcomose ilustraenlaFig.2.Lascajassesellaronylashojasserecogierontraslostiemposdeincubación indicados para realizar los análisis bioquímicos y de transcriptomas. A menos que se indique de otra manera, las hojas se recogieron al final de período de luz. Como control negativo, las placas Petri que contenían plantas completamente desarrolladassecultivaronencajasdeplástico selladasjuntoconplacasPetriqueposeíanmedio estérilparaelcultivo de microorganismos.

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Análisisde transferenciastipoWestern

Para producir antisueros policlonales contra Sus4, un cDNAcodificante de Sus4 de longitud completa se clonó en el vector de expresión pET-28b(+) (Novagen) para crear pET-SuSy. Las células BL21(DE3) transformadas con pET-SuSyse hicieron creceren100mlde medioLB líquido hasta una absorbancia a600nmde0,5yluegose añadió isopropil-β-D-tiogalactopiranósido1mM.Pasadas5h, las células se centrifugarona 6.000xgdurante10 min.Las bacterias sedimentadasse resuspendieronen6mlde tampónde uniónHis-bind(Novagen), tratado con ultrasonidos y centrifugadoa 10.000xgdurante10 min.El sobrenadante así obtenido sesometióa cromatografía en His-bind (Novagen). La Sus4 etiquetada con His eluída se desaló rápidamente mediante ultracentrifugación en una Centricon YM-10 (Aicon, Bedford, MA).La proteína purificada se separó electroforéticamente mediantePAGE preparativacon SDS al 12%y se tiñó con Azul de Coomassie. Una banda de proteínas de aproximadamente. 90 kDa se eluyóy se utilizó para producir antisueros policlonales inmunizando conejos.

Para los análisisde inmunotransferencias, lasmuestrasde proteínas se separaron enPAGE con SDSal 10%, se transfirierona filtrosde nitrocelulosa,y se inmunodecoraron utilizando antisueros obtenidos frenteaAGPde maízo SuSyde patata comoanticuerpo primario,y unaIgGde cabra anti-conejo conjugada confosfatasa alcalina (Sigma) como anticuerpo secundario.Enel casode las transferencias tipoWesterndeAGP, las muestras seextrajerony se separaron en SDS-PAGE en condiciones reductoras/no reductoras esencialmente como ha sido descrito porKolbe et al.(Kolbe et al.,2005:Trehalose 6-phosphateregulatesstarchsynthesisvia posttranslationalredoxactivationofADPglucosepyrophosphorylaseProc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11118-11123).

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Ensayos enzimáticos

1gdepolvo congeladodehojase resuspendióa4ºCen5mlde HEPES100mM(pH7,5)yEDTA2mM. Cuando se indicó así, se añadió DTT 5 mM al tampón de extracción. La suspensión se desaló y se ensayaron en ella las actividades enzimáticas.El ensayode las actividadesAGP, SuSy,invertasa ácida,PPasaySS total se realizó tal como ha sido descrito porBaroja-Fernández et al. (Baroja Fernández et al.,2009: Enhancing sucrose synthase activity in transgenic potato(Solanum tuberosum L.) tubers results in increased levels of starch, ADPglucose and UDPglucose and total yield, Plant Cell Physiol. 50: 1651-1662). El ensayo de la β-amilasa se realizó comoha sido descritopor Liu et al. (Liu et al., 2005:Toxicity of arsenate and arsenite on germination, seedling growth and amylolitic activity of wheat, Chemosphere 61: 293-301). La actividad SBE se medió como la disminución en la absorbancia del complejo amilosa-yodo tal comoha sido descrito porVos-Scheperkeuter et al. (Vos-Scheperkeuter et al., 1989: Immunological comparison of the Starch Branching Enzymes for potato tubers and Maize leaves, Plant Phylio. 90: 75-84). La nitrito reductasa se midió siguiendo el método descrito por Rao et al. (Rao et al., 1981: Phytochrome regulation of nitrite reductase-a chloroplast enzyme-in etiolated maize leaves, Plant Cell Physiol, 22: 577-582). La pG6PDH se medió según Hauschild et al. (Hauschild et al., 2003: Differential regulation of glucose-6-phosphate dehydrogenase isozyme activities in potato, Plant Physiol. 133: 47-62). El ensayo de la fructosa-1,6-bifosfatasa citosólica se realizó tal como ha sidodescrito por Lee and Hahn (Lee and Hahn, 2003: Light-regulated differentialexpressionof pea chloroplast and cytosolic fructose-1,6-bisphosphatase, Plant Cell Rep. 21:611-618). Una unidad (U) se define como la cantidad de enzima que catalizalaproducciónde1 µmol de producto por min.

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Determinaciónde ADPG, UDPGy3-fosfoglicerato

Una alícuotade0,5gdel tejidovegetalpulverizado congeladoen nitrógeno líquidose resuspendió en4mlde HClO41,0M,sedejóa4ºC durante2hy secentrifugóa 10.000gdurante5min.El sobrenadantese neutralizó con K2CO35M,se centrifugóa 10.000gyse sometióa análisisde medidadelos nucleótido-azúcarestal comoha sido descrito por Muñoz et al. (Muñoz et al., 2005:Sucrose synthase controlsthe intracellularlevelsofADPglucose linked to transitory starch biosynthesis in source leaves, Plant Cell Physiol. 46: 1366-1376) por HPLC en un sistema obtenido deP.E.Watersand Associates acopladoa una columnaPartisil-10-SAX.El3-fosfogliceratose midió comohasido descrito por Muñoz et al. (Muñoz et al., 2005:Sucrose synthase controlsthe intracellularlevelsofADPglucose linked to transitory starch biosynthesis in source leaves, Plant Cell Physiol. 46: 1366-1376).

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Procedimientos analíticos

El almidón se midió utilizando un kit de ensayo basado en la amiloglucosidasa (BoehringerMannheim, Alemania). El contenido de amilosa del almidón se midió yodométricamente según Hovenkamp-Hermelink et al. (Hovenkamp-Hermelink et al., 1988: Rapid estimation of the amylose/amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato Potato Res. 31: 241-246). El análisis de la distribución de cadenas laterales del almidón aislado se llevó a cabo mediante HPAEC-PAD esencialmente como ha sido descrito por Abel et al. (Abel et al., 1996: Cloning and functional analysisofacDNAencodinganovel139kDa starch synthasefrom potato(Solanum tuberosum L.), Plant

J. 10: 981-991) utilizando unsistema DX-500 (Dionex) acopladoa una columna CarboPacPA10.

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Microarrays

ElRNAtotalseextrajodehojasde patatacongeladas utilizandoel métododelTrizol siguiendoel procedimiento del fabricante (Invitrogen), seguido por la purificación con el kit RNeasy (Qiagen). La amplificación, marcado yanálisis de datos estadísticos relativos al RNA se llevaron a cabo básicamente como ha sido descrito por Adié et al. (Adié et al., 2007: ABAis an essential signal for plant resistance to pathogens affectingJAbiosynthesis and the activation of defenses in Arabidopsis,PlantCell19: 1665-1681).Parala hibridaciónse utilizaron portaobjetosconmicroarrays Agilent POCI4 x44 (015425)que contienen246.000etiquetasde secuenciaexpresadasque corresponden a 46.345 unigenes (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/poci) (Kloosterman et al. 2008: Genes driving potato tuber initiation and growth: identification based on transcriptomal changes using the POCI array, Funct Integr. Genomcs 8: 329340). Las condiciones de mareaje e hibridación fueron las descritas en “The manual two color microarray based gene expression Analysis” (“El manual del análisisdelaexpresiónde genes basado en microarraysde dos colores”)de AgilentTechnologies.Paralashojasdelasplantas tratadasconmicroorganismosydelasplantas controlse hibridaron tres réplicasbiológicas independientes.Las imágenesdelos canalesCy3e Hyper5seequilibraron con respectoalas diferencias enla intensidady se capturaron con un escáner GenePix 4000B (Axon). Los puntos se cuantificaron utilizandoel software GenPix (Axon)y se normalizaron utilizandoel métododeLowess.Se calcularon las mediasde los logaritmosde las relacionesde intensidades para las tres réplicasy sus desviaciones estándarylos datosdeexpresión se analizaron estadísticamente utilizando el paquete informático LIMMA (Smyth and Speed, 2003: Normalization of cDNAmicroarray data, Methods31: 265-273).La caracterización funcionaldelos genes diferencialmenteexpresados se hizo utilizandola herramienta Mapman(http://gabi.rzpd.de/projects/MapMan/).

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PCR cuantitativa enTiempo Real

El RNAtotal se extrajo de las hojas de patata como se hizo para los experimentos de microarrays. El RNAse trató con DNAasa libre de RNAasas (Takara). Se realizó la transcripción inversa de 1,5 µgde RNAutilizando cebadores depoliTyelkitExpandReverseTranscriptase(Roche) siguiendolas instruccionesdelfabricante.La reaccióndeRT-PCR se llevó a cabo utilizando un sistema detector de secuencias 7900HT (Applied Biosystems) con el SYBR Green PCR MasterMix (Applied Biosystems)segúnelprotocolodelfabricante.Cada reacciónsellevóacabopor triplicado con 0,4 µL de la primera cadena de cDNA en un volumen total de 20 µL. La especificidad de la amplificación por PCR se comprobó con una curva de calor de disociación (de 60ºC a 95ºC). Los valores comparativos del umbral se normalizaron con respectoaun control internodeRNA18Sy se compararon para obtenerniveles relativosde expresión. La especificidad de los productos de RT-PCR obtenidos se controló en geles de agarosa al 1,8%. Los cebadores utilizados para lasRT-PCRs se enumerana continuación enlaTabla1:

TABLA1

Cebadoresde PCR cuantitativa enTiempo Real

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Tinciónde yodoylocalización microscópicade gránulosde almidón

Lashojasrecogidasalfinaldelperíododeluzsefijaronpor inmersiónen formaldehídoal3,7%entampónfosfato. Luego se retiraron los pigmentos foliares con etanol al 96%. Las muestras rehidratadas se tiñeron con soluciónde yodo(KI2% (w/v)121% (w/v)) durante30 min, se sumergieron rápidamente en agua desionizadayse fotografiaron. Las hojas parala observación microscópicade almidón se montaron en portaobjetosde microscopioy seexaminaron mediante microscopía confocal utilizando láser de excitación de Ar 488. Las muestras de las que se iban a obtener secciones se sumergieron en medio crioprotector OCT(Tissue-Tec, USA)y se congelarona -50ºC.Se obtuvieron criosecciones de 10 µm de espesor en un criotomo AS620 (Shandon, Inglaterra). Después de descongelarlas, las secciones se tiñeron con soluciónde yodo durante2 mina temperatura ambiente, se montaron en portaobjetosde microscopioy se observaron utilizando un estereomicroscopio Olympus MVX10 (Japón). Las microfotografías se capturaron con una vídeo-cámara DP72 (Olympus, Japón)yel software CellD(Olympus, Japón).

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Microscopía confocal

La localización subcelularde GBSS-GFPse efectuó utilizandoun microscopioconfocalD-EclipseC1(NIKON, Japón) equipado con un láserdeexcitacióndeAr 488 estándar, un filtroBA515/30 parala emisión enverde, un filtro BA650LP parala emisión enrojoyun detectorde luz transmitida para las imágenesde campo brillante.

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Ejemplo1

Los volátiles emitidos por diferentes especies microbianas promueven cambios en el desarrollo de la planta, aumento del crecimientoyla acumulaciónde almidón en hojasde diferentes especiesde plantas

1.1. Efecto sobre el crecimiento

Para comprobar losposibles efectos que los compuestos químicosvolátiles liberados por microorganismos pudieran tener sobre el metabolismo de las plantas, se realizaron en primer lugar ensayos con plantas de Arabidopsis cultivadas en medio MS en presencia o ausencia de cultivos de Escherichia coli BW25113, Agrobacterium tumefaciens EHA105yGV2260, Saccharomyces cerevisiae NA33,Bacillus subtilis 168, Penicillium charlesiio Penicillium aurantiogriseum, Salmonella enterica LT2,Alternaria alternata, Pseudomonas syringae 1448A9, 49a/90óPK2y en ausenciade contactofísico entrela plantayel mediode cultivo.La disposición,en todoslos casos,fue análogaala delas fotografíasdelos panelesByDdelaFig.2, incluyendo controles con placas con mediode cultivoenlasque no se habían sembrado microorganismosde forma análogaala que se presentan en lospanelesAyCdela Fig.2.

Los análisis visuales preliminares revelaron que los volátiles emitidos por estos microorganismos promueven el crecimientodela planta, tal comopuede observarse comparando los cuatro primeros panelesdela Fig.2. Este efecto se confirmó comprobandoelpeso frescoy secodelas plantasde Arabidopsis crecidasen ausenciaoenpresenciade volátiles emitidos por hongos Alternaria alternata, así como otros parámetros relacionados con el desarrollode las plantas tales comoel númerode flores, ramasovainasola alturadel brote.Tal como puede observarseenlaFig.3, todos estosparámetros se vieron incrementados porel efectode losvolátiles, efecto que también se observó sobreel contenido de almidón.

Este efecto no es exclusivo de plantas de Arabidopsis, sino que se observa en otras especies, como en las plantas del tabaco, como puede observarse enla Fig.4, enla que las plantas sometidasal efectodevolátiles emitidospor hongos Alternaria alternata muestran mayor tamañoymayor número dehojas.También las raíces de las plantas de tabaco crecieron más en presencia de volátiles de Alternaria alternata.

En el caso concreto de algunos microorganismos, como E. coli, que esta bacteria promueva el crecimiento de plantas parece contradecir las observaciones hechas por Ryu et al. (Ryu et al. 2003: Bacterialvolátiles promote growth in Arabidopsis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932), quienes mostraron que E. coli DH5α no promueve el crecimiento de plantas de Arabidopsis. Además, estos autores mostraron que los volátiles emitidos por Pseudomonas syringae ejercen un efecto negativo sobre el crecimiento y desarrollo de Arabidopsis. Por ello, se pensó que las variaciones en las condiciones de crecimientoy sistemas de ensayo podrían justificar los diferentes resultados.En concreto, se planteó si los resultados obtenidos en Arabidopsis por otros autores podrían deberse al uso de medios que contenían extractosdelevadura, ricos en aminoácidos, tales como los mediosLBoKornberg, mientras queel crecimiento de microorganismos en medio mínimo podría dar lugar a que no se produjera algún metabolito volátil nocivo para la planta.

Para comprobar esta hipótesis, se repitió el ensayo, utilizandoSalmonella enterica como microorganismo, cultivándolo o en medio mínimo M9 o en medio LB. Los resultados, mostrados en la Fig 5A, muestran que los volátiles producidos por Salmonella enterica crecida en LB hacen que las plantas sepongan amarillasyenfermen, mientras que, si se comparan las plantas de Arabidopsis crecidas en medio mínimo M9 con las plantas control mantenidas en idénticas condiciones, pero sin que se haya sembrado microorganismo alguna en la correspondiente placa Petri, se observa que las plantas crecidas en presencia del microorganismo son mayores y presentan mayor número de hojas.

Similares resultados se obtuvieron con otros patógenos de plantas, tales como Agrobacterium tumefaciens, tanto conla cepa EHA105 como GV2260 (véaselaFig.5B)o Pseudomonas syringae (véase la Fig. 5C): el efecto positivo sobreel crecimiento tienelugar siempreycuandoel patógeno crezcaenun medio mínimo,tal comoM9o MOPS,que presentanensu composición salesinorgánicas como fuentesdeNa,K,Ca,Mg,P,NySyque,salvoel azúcar utilizado como suplemento fuentede carbono (sacarosaoglucosa en los Ejemplosdela presente solicitud)yel propioagar bacteriológico, carecendeotros compuestosorgánicos,enparticularde compuestosque contengan nitrógenoorgánico. Losvolátiles emitidospor microorganismos crecidosen medios tales comoLB,Kornberg o cualquier otro medioque contengaun hidrolizadodelevaduras, proteínas,oque sea ricoen aminoácidos, ejercenun efectonegativo(onotan positivo comoel observado cuandose crecenen medios mínimos) sobreel crecimientoyproducciónde almidónenla planta,de maneraquelas plantasexpuestasa talesvolátiles desarrollanhojasblancasy, finalmente, mueren.Todoello es debido, probablemente,al efecto tóxicodel amonio producidoporla deaminacióndelosaminoácidosexistentesen el medio.

1.2. Efecto sobre la acumulación de almidón

A continuación, se midió el contenido de almidón de las hojas de las plantas de Arabidopsis, que habían sido cultivadas en medio MS en presencia o ausencia de cultivos de S. cerevisiae NA33,B. subtilis 168, Salmonella enterica (LT2), E. coli (BW25113), A. tumefaciens EHA105, A. tumefaciens GV2260, Pseudomonas syringae 1448A9, Pseudomonas syringae 49a/90, Pseudomonas syringae PK2, Penicillium aurantiogriseum,PenicilliumcharlessiyAlternaria alternata.Todos los microorganismos, excepto S. cerivisiae, se crecieron en medio sólido M9 suplementado con glucosa.Todos,a suvez, crecieron en ausenciade contacto físico entrela plantayelmediode cultivo.

Los resultados obtenidos muestran que todas las especies microbianas ensayadas emitían compuestosvolátiles que afectabanfavorablementeala acumulaciónde almidón,tal comoseconfirmómedianteanálisisde medida cuantitativa del almidón utilizando un kit de ensayo basado en amiloglucosidasa/hexoquinasa/glucosa-6P deshidrogenasa (Fig. 6A).Talcomosepueden observarenlaFig.6C,este efectosedebealosvolátilesyaque(a)el efecto inductores inferior en presenciade carbón activadoy(b)el efecto desaparece tras3días fuerade contacto conelvolátil.

También se comprobó la diferencia en la acumulación de almidón cuando los microorganismos Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae,Penicilliumcharlesii,E. coli ySalmonella enterica se cultivaron bien en medio mínimoM9,bien medioLB.Tal comopuede comprobarseenlaFig.6B,el efecto “positivo”delos microorganismos sobrela acumulaciónde almidónsólotienelugarcuandoéstosson crecidosenunmediomínimo(M9,MOPSoincuso MS), mientras que el efecto es inferior o nulo cuando los microorganismos crecen en un medio rico con aminoácidos.

Adicionalmente, se comprobó que la acumulación de almidón también se producía en otros órganos de las plantas de Arabidopsis, tales como el tallo o las raíces, cuando las mismas se hacían crecer en presencia de volátiles fúngicos emitidos por hongos Alternaria alternata. Las muestras de la acumulación en estos tejidos pueden observarse en los panelesDyEdelaFig.6.Los panelesFyGmuestranel incrementoenla acumulaciónde biomasa producidaporlos volátiles fúngicos tanto en hojas como en raíces.

El efecto de acumulación de almidón no es exclusivo de plantas de Arabidopsis. Además, el efecto positivo se confirma si las plantas se crecen sobre tierra en lugar de en placas de cultivo in vitro: los ensayos realizados con plantasde maízyArabidopsis crecidasen tierra muestran un aumento del tamañoyvigorde las hojas cuando crecen en presencia de volátiles fúngicos emitidos por hongos Alternaria alternata (Fig. 7Ay 7C), efecto positivo que se refleja también en un aumento enla acumulaciónde almidón (Fig.7By7D).

Para confirmar que lo se estaba midiendo era realmente almidón, los autores de la invención caracterizaron hojas que habíansido teñidaspreviamentecon solucionesdeyodo. Además,sellevóacabo análisisde microscopíadefluorescencia confocaldeplantasqueexpresabanla sintasade almidónunidaal gránulo (GBSS)de Arabidopsis fusionada con la proteína de fluorescencia verde (GFP) (Szydlowski et al., 2009: Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of either class IV or class III starch synthase, Plant Cell 21, 2443-2457) cultivadas en presenciay en ausenciadeFVs(volátiles fúngicos) emitidospor Alternaria alternata.Tal comose muestraenlasFig.8Ay8B, estos análisis revelaron que la tinción con yodo de hojas de plantas cultivas en presencia de FVs fue mucho más oscura que ladelasplantas control.Losanálisisde microscopíaóptica(Fig.8Cy8D)de seccionesdehojas demostraronquela tinción de yodo se localizaba dentro de cloroplastos de células del mesófilo. Además, los análisisde microscopía de barrido con láser confocalde hojas transgénicas queexpresabanel marcadorde gránulosde almidón GBSS-GFPdemostraronquelos gránulosde almidón eran mucho mayores cuandolas plantasse cultivabanen presenciadeFVsque enlas condiciones control(Fig.8E,8Fy8G). Estos análisisdemuestranqueel incrementodel contenidode almidón no es debido al incremento del número de gránulos por plastidio, sino al espectacular incremento de tamaño de los gránulos de almidón.

Se confirmó si la existencia del proceso de acumulación de almidón inducido por volátiles microbianos(microbial volátiles induced starch accumulation process: MIVOISAP) estaba extendida en las plantas midiendo el contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, patata(Solanum tuberosum L.), maíz(Zea mays), tabaco(Nicotiana tabacum)ycebada(Hordeum vulgare)cultivadasen presenciaoen ausenciadeFVsemitidosporAlternaria alternata. Estosexperimentossellevaronacabo utilizandoplantascultivadasenmedioMS sólidoconosin suplementacióncon sacarosa90mM.Tal comose muestraenlaFig.9, estos análisisrevelaron que, independientementedela presencia de sacarosa en el medio de cultivo, el contenido de almidón en las hojas de las cinco especies fue mayor en exceso cuando lasplantas se crecieron en presenciade FVs con respectoala ausenciade FVs. Merece destacarse quelos niveles de almidón en las plantas de patata cultivadas en presencia de FVs (aproximadamente 500-600 µmol glucosa/g de peso fresco) eran comparables a los que se conocen para los tubérculos de patata (Baroja-Fernández et al., 2009: Enhancing sucrose synthase activity in transgenic potato(Solanum tuberosum L.) tubers results in increased levels of starch, ADPglucose and UDPglucose and total yield. Plant Cell Physiol. 50, 1651-1662). Además, tal como se muestraenlaFig.10,la presenciadeFVsestimulael acumulode almidónen tubérculosytallosde patata.Así,los datos globales demostraronqueel MIVOISAP ocurrede forma ubicua entre las plantasy en diferentesórganos.

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Ejemplo2

Los FVs promueven la acumulación de almidón en hojas desprendidas

Para investigar si los volátiles microbianos que promueven la acumulación de almidón en las hojas se perciben en las hojas o en otras partes de la planta, se midió el contenido de almidón en hojas desprendidas de plantas de patata, maíz, tabaco Arabidopsis ycebada cultivadas en medio MS sólido (con o sin sacarosa) en presencia o en ausencia de FVs emitidos por la especie fúngica Alternaria alternata.

Independientemente de la presencia de sacarosa en el medio de cultivo, las hojas tratadas con FV acumularon niveles mucho más altos de almidón que las plantas control (Fig. 11), mostrando así los datos globales que los FVs que promueven la acumulación de almidón se perciben en las hojas. Este efecto se observó no solamente cuando las hojas se cultivaban en medio sólido MS, sino también cuando se mantenían sobre medio MS líquido o sobre agua (Fig. 12). Merece destacarse que las hojas desprendidas de las cinco especies analizadas acumularon más almidón que las hojas unidasala planta completa,loque indicaque(a)el estrés abiótico puede promover, hasta cierto punto,la acumulaciónde almidónenhojasy(b) ejerceun efecto positivoenelMIVOISAP.

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Ejemplo3

Perfil de los transcriptomas de hojas de patata cultivadas en presencia de FVs

Para comprender mejor el fenómeno de acumulación de almidón en hojas promovido por volátiles microbianos, se llevó a cabo el análisis de transcriptomas de alto rendimiento de hojas de plantas de patata cultivadas en medio MS(conosin sacarosa)en presenciay en ausenciadeFVs emitidospor Alternaria alternata utilizando el array de oligos 60-meros POCI 44K (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/poci) (Kloosterman et al. 2008: Genes driving potato tuber initiation and growth: identification based on transcriptomal changes using the POCI array, Funct. Integr. Genomcs 8, 329-340).

Cuando las plantas se cultivaron en MS suplementado con sacarosa, se encontró que 3019 genes estaban desreguladosen presenciadeFVs(másde2,5vecesde diferencia con respectoal control;valorP < 0,05), 1203 de los cuales eran genes clasificados como “sin función asignada”. Entre esta población, 1192 genes estaban regulados al alzay 1827 genes estaban regulados a la baja.

CuandolasplantassecultivaronenMSsin sacarosa,se encontróque2856genes estabandesreguladosenpresencia de FVs, 1109 de los cuales eran genes clasificados como “sin función asignada”. Entre esta población, 1671 genes estaban reguladosal alzay1185 genes estaban reguladosala baja. Los análisisde PCR con transcripción cuantitativa en tiempo real, (RT)-PCR, de algunos de los genes identificados (Fig. 13) validaron los resultados de los análisis del array.

Para determinar los procesos biológicos afectados por los volátiles microbianos, se llevó a cabo un análisis de los genes utilizando la herramienta MapMan (Thimm et al. 2004: MAPMAN:a user-driven toolto displaygenomics data sets onto diagrams of metabolic pathway and other biological processes, Plant J. 37, 914-939) (http://gabi.rzpd.de/ projects/MapMan/).Tal como se refleja enlos gráficos de la Fig. 14, este estudio reveló que los FVs promovieron cambios drásticos en la expresión de genes implicados en múltiples procesos tales como el metabolismo de hidratos de carbono, aminoácidos, azufreylípidos,el estatus redoxdela célula,el desarrollo,la biosíntesisdela pared celular, la fotosíntesis, el metabolismo secundario, la traducción y estabilidad de las proteínas, el tráfico de vesículas, la señalización, la producción de energíay las respuestas al estrés. La Fig. 14 da una visión general de los procesos metabólicos implicados en los cambios, tanto en presencia (panel A), como en ausencia (panel B) de sacarosa.

Debe destacarse que no se observaron cambios en la expresión de numerosos genes que codifican proteínas que se piensa que están implicadas en el metabolismo del almidónyla sacarosa tales como β-glucano/agua diquinasas, adenilato quinasa plastidial, hexoquinasa plastidial, fosfoglucosa isomerasa plastidial, fosfoglucomutasa plastidial, la subunidad catalítica pequeña de laAGP, ADPG pirofosfatasa, almidón sintasa (SS) clasesIyII, transportadores de sacarosa, UDPglucosa (UDPG) pirofosforilasa, fosfoglucosa isomerasa citosólica, fosfoglucomutasa citosólica, sacarosa-fosfato sintasa e invertasa alcalina.

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Ejemplo4

Análisis detallado de funciones ligadas al metabolismo del almidón

Los estudiosde análisisde transcriptomasse complementaronconestudiosde análisisdevariaciónenlaactividad enzimática de distintas enzimas, realizados tal como se ha descrito previamente en el apartado de “Ensayos enzimáticos”.Las enzimas estudiadasylos resultados obtenidos(expresadosen miliunidadespor gramosdepeso fresco)se resumena continuación enlaTabla2:

TABLA2

Actividad enzimática de enzimas del metabolismo del almidón

Estos datos se consideraron en combinación con los datos obtenidos del análisis de transcriptomas, para estudiar con detalle algunas funciones que se vieron afectadas por el tratamiento con FVs, que directa o indirectamente están ligadasal metabolismodel almidón.Enlos siguientesapartadosseexponeel análisis realizadoparacadaunadedichas funciones.

4.1. Los cambiosenla actividadAGPno son determinantesenelMIVOISAPen plantasdepatata

Está ampliamente asumidoquelaAGPesel principalpaso limitanteenla biosíntesisdelalmidón,yla única enzima que cataliza la producción de ADPG ligada a la producción de almidón (Neuhaus et al. 2005:No need to shift the paradigmonthe metabolicpathwaytotransitorystarchinleaves,TrendsPlantSci.10,154-156;Streb et al. 2009: The debate on the pathway of starch synthesis: a closer look at low-starch mutants lacking plastidial phosphoglucomutase supportsthe chloroplast-localisedpathway,PlantPhysiol.151, 1769-1772).Enlashojas,estaenzima heterotetramérica se activa alostéricamente mediante3-fosfogliceratoy se inhibe mediante Pi. Comprende dos tiposde subunidades, homologas pero distintas, la pequeña (APS)yla grande (APL), que está codificada por tres genes diferentes (APL1, APL2yAPL3) (Crevillén et al. 2005: Differential pattern of expression and sugar regulation of Arabidopsis thaliana ADPglucosepyrophosphorylase-encoding genes,J. Biol. Chem. 280, 8143-8140).

Por ello,se estudióla posible influenciadelaactividadAGP(ADP-glucosa pirofosforilasa),ydelos cambiosen sus dos subunidades, sobre el MIVOISAP. Los estudios se realizaron sobre plantas depatata cultivadas en presencia de cultivos de Alternaria alternata de manera análoga a como se ha descrito en Ejemplos anteriores.

Los análisis de transcriptomas revelaron que, de las dos subunidades de laAGP, los niveles de transcritos de la subunidad menor (APS) permanecían inalterados tras el tratamiento con FV. Por el contrario, la expresión de uno de los genes que codifica la subunidad mayor (APL1) estaba regulada al alza (incremento de 14,98 veces), mientras que otrodelos genesquetambién codificalasubunidad mayor,APL3, estabareguladoalabaja (disminuciónde8,8veces) tal como se confirmó además mediante análisisdeRT-PCR cuantitativa (Fig. 13).

Tal comose reflejaenlaTabla2anteriormenteexpuesta,la actividad totaldelaAGPsevio ligeramente alterada porel tratamientoconFVs (incrementode1,5vecesydisminuciónde1,5veces cuandolaactividadAGPsemidió en presenciaoen ausenciade5mM ditiotreitol (DTT), respectivamente). Además,los análisisde transferenciastipo Westernnorevelaronninguna diferenciaaparenteenla cantidaddeAGPentrelashojas tratadasyno tratadasconFVs (Fig. 15).

El tratamiento conFVsdio como resultadoun aumentode aproximadamente35%enlosnivelesde 3-fosfoglicerato intracelular (494,0 ± 36,0 µmol/g FW en ausencia de FVs frente a 674,1 ± 127,5 µmol/g FW en presencia de FVs), lo que indicaríaquelaAGPestá ligeramenteactivada duranteelMIVOISAP.

Como laAGP cataliza la conversión reversible deATPyglucosa-1-P enADPGypirofosfato (PPi), se considera que la pirofosfatasa alcalina (PPasa) juegaun papel crucial en la biosíntesis de almidón, puesto que desplaza la reacción delaAGPdel equilibrio mediantelarápidaretiradadePPi.Sinembargo,los análisisdeRT-PCR cuantitativa(Fig.13) ylos análisis de transcriptomas revelaron que el tratamiento con volátiles fúngicos dio como resultado la regulación a la baja de la PPasa (reducción de 3,72 veces), que fue acompañada de una reducción en la actividad PPasa (véase laTabla 2). Es así concebible que, con el tratamiento con FV, se acumulará PPi en el cloroplasto, impidiendo asíla producciónde ADPG mediada porAGP.

La síntesisdealmidónestáreguladaporlaactivación redox postraduccionaldeAGPmediadapor tiorredoxinas (Ballicora et al. 2000:Activationofthe potato tuberADP-glucosepyrophosphorylaseby thioredoxin,J. Biol. Chem. 275, 1315-1320), que está promovida por la trehalosa-6-fosfato formada en el citosol(Kolbe et al. 2005:Trehalose 6phosphateregulates starch synthesisvia posttranslational redox activationofADP-glucosepyrophosphoryíase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 11118-11123). Merece destacarse que los análisis de RT-PCR cuantitativa (Fig. 13) y los análisis de transcriptomas revelaron que la trehalosa-6-fosfato sintasa y las tiorredoxinas plastidiales se veían fuertementereguladasalabajacuandolasplantassecultivabanen presenciadeFVs(reducciónde7,57y8,31para la tiorredoxina myf, respectivamente,y reducciónde 4,57vecesdela trehalosa-6-fosfato sintasa en presenciade sacarosa; reducciónde 3,71y2,74veces parala tiorredoxina myf, respectivamente,yreducciónde 4,89vecesde trehalosa-6-fosfato sintasa en ausencia de sacarosa).Para ensayar si esta situación afecta al estatus redox de laAGP, se separaronextractosde hojasde patata controlytratadas con FVs mediante SDS-PAGE reductoray no reductora yposteriormentese sometieron a análisis por transferencia tipoWesterndelaAGP.Es importante hacer notarque, cuando losextractosde hoja se separaron en geles no reductores con SDS,laAGP está presente como una mezcla de monómeros activosde50kDydímeros inactivosde100kD formadospor enlaces intermolecularesque implican puentes de cisteína. Estos dímeros se pueden reactivar in vitro incubando extractos con DTT (Hendriks et al. 2003: ADPglucosepyrophosphorylaseisactivatedby posttranslational redox-modificationin responsetolightandtosugars in leaves of Arabidopsis andotherplantspecies,PlantPhysiol.133, 838-849;Kolbe et al. 2005:Trehalose 6-phosphate regulatesstarchsynthesisvia posttranslationalredoxactivationof ADP-glucosepyrophosphorylase,Proc.Natl.Acad. Sci. USA 102, 11118-11123). Tal como se muestra en la Fig. 15, las hojas de patata tratadas con FVs acumulan cantidades mucho mayores de dímeros inactivos de 100 kD que las hojas control en condiciones no reductoras. Estos dímerosde100kDsepudieron convertiren monómerosde50kD cuandolosextractosse obtuvieronysepararonen condiciones no reductoras (incluyendo DTT) (Fig. 15), indicando así los datos globales quelaAGP está en su mayor parte oxidada (inactiva) enlas hojas tratadas con FVs.

Paraevaluar másampliamentela relevanciadelaAGP enel MIVOISAP, se midióla actividadAGP,el contenido de almidónyla ADPG en hojas de plantas de patataAGP62(que tienen la subunidad APS inactivada por elementos antisentido (Müller-Rober et al. 1992: Inhibitionofthe ADPglucosepyrophosphorylasein transgenic potato leadsto sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes, EMBO J. 11, 12291238)) cultivadas en presenciay en ausencia de FVs.Tal como se ilustra en la Fig. 16A, la actividadAGP en hojas AGP62 fue un 30% de la de las hojas tipo silvestre (WT). Al contrario que en las hojas WT, la actividadAGP en plantasAGP62noseincrementóconel tratamientoconFVs. Merecedestacarsequeel tratamientoconFVsdiocomo resultado una potenciación drástica de la acumulación de almidón (Fig. 16B),y un incremento de aprox. 70% en el contenidodeADPG(Fig.16C) enhojasAGP62.Los contenidosde almidónyADPGenhojasAGP62 tratadascon FVs fueron comparables a los observados en hojas WT tratadas con FVs.

Los datos globales indicarían, así, que los cambios en la actividadAGP juegan un papel menor, si es que juegan alguno, en el MIVOISAP en hojas de patata.

4.2. Los volátiles fúngicosregulan fuertementeal alza SuSyyregulanala bajalaexpresióndelainvertasa ácida

Tal como se comentó en el apartado de “Antecedentes de la invención”, generalmente se ha considerado que la biosíntesisde almidón en hojas tienelugarexclusivamente enel cloroplasto,yestá segregada del proceso biosintético de sacarosa que tiene lugar en el citosol, mientras que recientes evidencias prevén la existencia de (una) ruta(s) adicional(es) en la(s) que se produce de novo en el citosol, mediante SuSy, ADPG ligado a la biosíntesis del almidón.

En conexión con estas teorías, merece destacarse que los análisis de transcriptomas de hojas de plantas cultivadas en presenciaoen ausenciadeFVsrevelaronqueeltratamiento conFVsdio como resultado una drástica potenciación delaexpresióndeSus4 (incrementode29,4y31,62veces cuandolasplantassecultivaronen presenciaoen ausencia de sacarosa, respectivamente), una isoformadeSuSyque controlala acumulacióndeADPG,UDPGyalmidóntanto en hojas como en tubérculos de patata (Muñoz et al. 2005: Sucrose synthase controls the intracellular levels of ADPglucose linked to transitory starch biosynthesis in source leaves, Plant Cell Physiol. 46, 1366-1376; Baroja-Fernández et al. 2009: Enhancing sucrose synthase activityin transgenic potato(Solanum tuberosum L.) tubers results in increased levels of starch, ADPglucose and UDPglucose and total yield. Plant CellPhysiol. 50, 1651-1662). De hecho,los análisisdelosniveles intracelularesde almidónyazúcares-nucleótidosenhojasde plantasde patata cultivadasenpresenciay en ausencia de FVs reveló una correlación positiva entre los patrones de actividad de SuSyylos contenidos de almidón,UDPGyADPG(Fig.17).Esta potenciación drásticadelaexpresióndeSuSy medianteeltratamientocon FVsse confirmó adicionalmente mediante análisisde transferenciastipoWestern(Fig.18),RT-PCR cuantitativa(Fig. 13),ymediante análisisdemedidadela actividad enzimática (incrementode10veces: véaselaTabla2).

La invertasa ácida en una enzima sacarolítica cuya actividad está regulada de forma postraduccional por un inhibidor proteínico (Bracho and Whitaker, 1990: Purification and partial characterization of potato(Solanum tuberosum) invertase and its endogenous proteinaceous inhibitor, Plant Physiol. 92, 386-394) en los tubérculos. Estas dos enzimas sacarolíticas compitenporel mismo suministrode sacarosa,actuando como unodelos principales determinantesde la acumulación de almidón el equilibrio entre SuSyy la invertasa ácida (Baroja-Fernández et al. 2009: Enhancing sucrose synthase activity in transgenic potato(Solanum tuberosum L.) tubers results in increased levels of starch, ADPglucose and UDPglucose and total yield, Plant Cell Physiol. 50, 1651-1662). Merece destacarse que los análisis del perfil de RNA revelaron que el tratamiento con FVs dio como resultado una regulación a la baja de la expresión delainvertasa ácida (disminuciónde2,61y2,04vecesen presenciayausenciade sacarosa, respectivamente),y una dramática potenciación de los transcritos que codifican el inhibidor de esta enzima sacarolítica (incremento de 17,78 y18,1veces en presenciayausenciade sacarosa, respectivamente),lo que se confirmó adicionalmente medianteRT-PCR cuantitativa (Fig.13)ymediante análisisde actividad enzimática (véaselaTabla2).

Los datos globales indican que (a) las rutas sacarolíticas mediadas por SuSy e invertasa ácida se regulan coordinadamente en respuestaa señales idénticas,y(b)el equilibrio entre estas rutases un determinante principaldela acumulación de almidón en hojas de patata expuestas a volátiles microbianos. Por la clara correlación existente entre los patronesde actividadde SuSyy los contenidosde almidón, ADPGyUDPG en hojasde plantas tratadasy no tratadas con FVs (Fig. 17), los datos globales indicaban también que los altos niveles de ADPG, UDPGyalmidón producidosenhojasdepatata tratadasconFVsse adscriben,al menosenparte,alapotenciacióndelaactividadde SuSy durante el MIVOISAP en patata.

4.3. Los volátiles fúngicos regulan a la baja rutas principales de provisión interna de aminoácidos

Tal comose mencionópreviamenteenla secciónde“Antecedentesdelainvención”, estudios recienteshan demostrado que las plantas poseen un sistema regulador mediado por ppGpp similar al que se da en las bacterias, lo cual se ha demostradoquejuegaunpapel crucialen aspectostales comola fertilizacióndelas plantas.ElppGppse acumula en el cloroplasto de hojas estresadas a través de la regulación de la expresión de homólogos de RelA/SpoT (RSH).

Merece destacarse que los análisis de RT-PCR cuantitativa (Fig. 13) y los análisis de transcriptomas descritos previamente en los Ejemplos de la presente solicitud revelaron que,independientemente de la presencia de sacarosa, el tratamiento con FVs dio como resultado una regulación a la baja de RSH (disminución de 2,6y 2,42 veces en presenciayausenciade sacarosa, respectivamente).

Es posiblequelas plantas desarrollen respuestas similaresalasexistentesen bacteriasqueregulanlabiosíntesisde glucógeno como consecuencia de la privación y/o provisión de aminoácidos. Consistentemente con esta presunción, los análisisdeRT-PCR cuantitativa(Fig.13),ylos análisisde transcriptomasrevelaronqueeltratamiento conFVs da como resultado una drástica reduccióndelaexpresiónde GAPDHypPGK(disminuciónde 32,68y5,32veces, respectivamente). Además, estos análisis revelaron que el tratamiento con FVs daba como resultado una marcada regulación a la baja de la G6P deshidrogenasa (pG6PDH) plastidial (reducción de 6,17 veces)(véanse también la Fig. 13ylaTabla2), una enzimadela ruta oxidativadelas pentosas fosfato (OPPP)que está implicadaenla producción depoder reductor requeridoparala biosíntesisde aminoácidosenórganos heterotróficosoenhojas duranteelperíodo nocturno.

Además,el tratamiento conFVsdiocomo resultado una marcada reduccióndelaexpresiónde genesque codifican un juego de proteínas plastidiales implicadas en la asimilación de nitrógeno tales como las que codifican el transportadordenitrito,la nitrito reductasa,la glutamato sintasayel translocadorde glutamato/malato (disminuciónde3,88, 9,85,3,86y3,22veces, respectivamente) (véanse tambiénlaFig.13ylaTabla2).

Elprimerpasoenlaconversióndesulfatoenlossulfoaminoácidos cisteínaymetioninaestá catalizadoporlaATP sulfurilasa. Esta enzima plastidial cataliza la conversión reversible deATPysulfato en adenosina-5’-fosfosulfatoy PPi, que es desplazada del equilibrio por la PPasa mediante la rápida retirada de PPi.Tal como se ha discutido más arriba, el tratamiento con FVs da como resultado a la regulación a la baja de la PPasa. Así, es concebible que con el tratamiento con FVs se acumule PPi en el cloroplasto, impidiendo asíla biosíntesis de sulfoaminoácidos inhibiendo laATP sulfurilasa. Merece destacarsequeel tratamiento conFVsda como resultado unaregulaciónalabajadela serina acetiltransferasa plastidial, cisteínasintasaycistationina-gamma-sintasa (reducciónde 3,43, 2,85y2,53veces, respectivamente), todas ellas enzimas que son necesarias parala síntesisde cisteínaymetionina enel cloroplasto.

Por todo ello, se investigó si los defectos en la provisión de cisteína plastidial están directamente implicados enel MIVOISAP, midiendoel contenidode almidón en hojasde patata desprendidas cultivadas en presenciay en ausencia de FVs emitidos por Alternaria alternata,y en presencia de diferentes concentraciones de cisteína. Lo más importante es que estos análisis revelaron que, al contrario de lo que ocurre con otros aminoácidos, el MIVOISAP se veía fuertemente reprimido por la cisteína añadida exógenamente (Fig. 19). Otros aminoácidos, en cambio, no inhibieron el MIVOISAP.

Así, los datos globales indicaban con fuerza que el MIVOISAP es la consecuencia de una respuesta desencadenada por la inadecuada provisión interna de cisteína. Como los sulfoaminoácidos constituyen la principal entrada metabólica de azufre reducido en el metabolismo celular,los autores de la invención barajaron la hipótesis de que el alto contenido de almidón de las hojas tratadas con FVs sea el resultado, al menos en parte, de una respuesta desencadenada porla privación tanto de nitrógeno como de azufre.

Las proteasas juegan un papel principal en el control de la calidad de las proteínas, siendo responsables de la degradaciónde polipéptidos dañadosyaberrantes así como del reciclajede aminoácidos parabiosíntesisde proteínas de novo. La proteolisis también proporciona los aminoácidos necesarios para mantener la homeostasis celular, siendo un proceso que implica una importante porción de los requerimientos de energía para el mantenimiento de la célula. En esa línea, merece destacarse que los análisis de transcritos de la presente invención revelaron que el tratamiento con FVs potenciaba drásticamentelaexpresióndemuchos inhibidoresde proteasas.Así es altamente concebibleque

(a)lafaltadeactividad proteolítica resultantetenga como consecuenciaun defectoenel aporteinternode aminoácidos que desencadene una respuestaque conduzcaala sobreacumulaciónde almidón,y(b)la disminucióndela demanda deATPparaladegradaciónde proteínastenga como consecuenciala disponibilidaddeunexcesode energíaparala biosíntesis de almidón.

4.4. Los volátiles fúngicosregulanal alza las almidón sintasasde clases IIIyIV

Se conocen cinco clases distintas de almidón sintasas (SS) en las plantas: la GBSS, que es responsable de la síntesisde amilosa,ylasSSdeclasesI,II,III,yIV(SSI,SSII, SSIII,ySSIV,respectivamente).Abel et al. (Abel et al., 1996: Cloning and functional analysis of a cDNA encoding a novel 139 kDa starch synthase from potato (Solanum tuberosum L.), Plant J. 10, 981-991) han demostrado que la reducción de SSIII conduce a la síntesis de almidón con modificaciones estructurales en plantas transgénicas de patata. Por otra parte, Roldan et al. (Roldan et al. 2007: The phenotype of soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana suggests a novel functionofelongation enzymesinthe controlofstarch granule formation, PlantJ.49,492-504)han demostradoque la eliminación de SSIV determina que los cloroplastos acumulen sólo un gránulo grande de almidón en Arabidopsis. Además, utilizando diferentes combinaciones de mutaciones de la SS en un fondo mutante para la SSIV, Szydlowski et al (Szydlowski et al 2009: Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of either class IV or class III starch synthase, Plant Cell 21, 2443-2457) han demostrado recientemente que los mutantes dobles de Arabidopsis que carecende las funciones SSIIIySSIV muestras un fenotipo carentede almidón.

Los datos globales (a) indicaron que tanto la SSIII como la SSIV juegan un papel clave en la acumulación de almidón, aunque la SSIV es obligatoria para dar lugar al número regular de gránulos de almidón que se encuentran en plantasdetiposilvestre,y(b)sugeríanquelaSSIVjuegaunpapelimportanteenel procesodeiniciacióndelgránulo de almidón.

Consistentemente con la idea de que SSIIIySSIV son determinantes principales de la acumulación de almidón en hojas de patata, los análisis de transcriptomas revelaron que, independientemente de la presencia de sacarosa en el medio de cultivo, el tratamiento con FVs dio como resultado un gran incremento de la expresión de SSIV (incremento de 7,00 y 4,68 veces en presencia y en ausencia de sacarosa, respectivamente) y un incremento moderado en la expresión de SSIII (incremento de 2,53 veces en presencia de sacarosa), resultados que se confirmaron mediante análisisdeRT-PCR cuantitativa (Fig. 13).No se observaron cambios en losnivelesdeexpresióndelaSSde claseIy

II.Los análisisdeactividad enzimáticarevelaronqueel tratamientoconFVsdaba como resultadoen incrementode3 vecesenlaactividadSStotal(véaselaTabla2).Losdatosglobales indicanasíqueelMIVOISAPsepuede adscribir, al menos en parte,ala potenciacióndela actividadde SSIIIySSIV.

4.5. Los volátilesfúngicospromueven tantolareducción del contenidode amilosa como cambios estructurales en la amilopectina incrementandoel balance entre las actividadesramificanteydesramificante del almidón

El gránulo de almidón está compuesto de dos homopolímeros estructuralmente diferentes: la amilosa, que es esencialmentelineal,yla amilopectina,queesuna macromolécula moderadamente ramificada.El almidóndelashojasde patata contiene un 10-15% de amilosa. Mientras que la amilosa es producida por la GBSS, la amilopectina es sintetizada por las acciones combinadas de la SS solubleyla enzima ramificante del almidón (SBE), de las que la última cataliza la formación de los enlaces α-1,6 en la molécula de almidón. Según el “modelo de recortes” de la formación del gránulo de almidón, la biosíntesis de la amilopectina es también el resultado de “recortes” por parte de las enzimas desramificantes(isoamilasasypululanasasquehidrolizan enlaces α-1,6 dentro de la molécula de almidón) de glucanos altamente ramificados queson sintetizados porlaSS solubleyla SBE.

Enestalínea, merece destacarsequelos análisisdeRT-PCR cuantitativa(Fig.13)ylos análisisde transcriptomas revelaron que el tratamiento con FVs dio como resultado un drástico aumento en la expresión de SBE (incremento de 32,66y2,5vecesen presenciayen ausenciade sacarosa, respectivamente)yun incremento moderadoenlaexpresión tantode pululanasa comode GBSS cuando las plantas se cultivaron en condiciones heterotróficas (incrementode3,4 y2,98veces, respectivamente). Consistentemente,laactividaddelaSBEenhojas tratadasconFVsera marcadamente más elevada que en hojas no tratadas (Tabla 2). Merece destacarse que los cambios en la expresión de estos genes fueron acompañados por unaimportante reducción enel contenido relativode amilosa(Fig. 20A).

ParainvestigarsiloscambiospromovidosporlosFVsenlasactividadesSSySBEdaban como resultado cambios estructuralesenla amilopectina,se sometióa desramificación enzimática amilopectina purificadadehojas tratadasy no tratadas con FVsy se determinó la distribución de longitudes de cadena mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta eficacia con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Estos análisis revelaron que el tratamiento con FVs ejerce un efecto importante sobre la estructura de la amilopectina, puesto que la amilopectinade hojas tratadas con FVs contenía más cadenas con un grado de polimerización (GP) menor que 20 monómeros, que la amilopectina de hojas no tratadas (Fig. 20B, Fig. 20C). Los datos globales indicaron así que los cambios estructurales que ocurren en las moléculas de almidón de plantas tratadas con FVs se pueden adscribir, al menos en parte, a la potenciaciónde las actividadesSSySBE.

4.6. Los volátiles fúngicos regulan fuertemente a la baja las enzimas degradativas del almidón

Utilizando la técnica de los antisentido, Scheidig et al. (Scheidig et al., 2002: Downregulation of a chloroplasttargeted β-amylase leads to a starch-excess phenotype in leaves, Plant J. 30, 581-591) demostraron que la β-amilasa BMY1 de los cloroplastos utilizada como diana ejerce un fuerte control sobre la degradación del almidón en hojas de patata. Consistentemente con ello,los análisis de transcriptomas descritos en la presente solicitud revelaron que el tratamiento con FVs daba como resultado una drástica regulación a la baja de PCT-BMY1 (disminución de 5,89 y3,66vecesenpresenciayen ausenciade sacarosa, respectivamente,quese confirmó adicionalmente medianteRT-PCR cuantitativa (Fig.13)y mediante análisisde actividad enzimática(Tabla2).

Las plantas superiores contienen fosforilasas de almidón tanto citosólicas como plastidiales. Al contrario de lo que ocurre con las β-amilasas plastidiales implicadas en la degradación del almidón, la función precisa in vivo de la isoforma plastidial no es todavía evidente, aunque se ha aceptado en general que puede estar implicada en la degradación del almidón. Zeeman et al. (Zeeman et al. 2004: Plastidial α-glucan phosphorylase is not required for starch degradation in Arabidopsis leaves but has a role in the tolerance of abiotic stress, Plant Physiol. 135, 849858) argumentaronque esta enzima está implicada enla toleranciaal estrés abiótico en Arabidopsis, proporcionando sustratosdel almidónala OPPP paraaliviarelestrés. Merece destacarsequelos análisisdeRT-PCR (Fig.13)ylos análisisde transcriptomasrevelaronqueel tratamiento conFVs daba como resultado una marcadaregulaciónalabaja de la expresión de la fosforilasa del almidón plastidial cuando las plantas se cultivaban en condiciones heterotróficas (disminución de 5,14 veces).

Los datos globales indicaron así que el MIVOISAP se puede adscribir, al menos en parte, a la regulación a la baja de isoformas plastidialesdela β-amilasayla fosforilasa del almidón.

4.7. Los volátiles fúngicosregulanal alzagenes implicados enla endocitosisyel tráficode vesículas

Sintetizadosapartirdelfosfatidilinositol(PI) mediantelaPI-3-fosfato(POP)quinasa(PI3K)ymediantelaPI-4fosfato (PI4P) quinasa (PI4K), PI3PyPI4Phan sido implicados endiversas funciones fisiológicas, incluidasla endocitosisenla membrana plasmática,el tráficodevesículas,yla biogénesisy organizacióndevacuolas.La endocitosis es un proceso implicado en la internalización de moléculas desdela membrana plasmáticay el entorno extracelular,yel reciclajede membrana plasmática.El incremento del metabolismodel fosfoinosítidoda como resultadoun incremento en la utilización de azúcares de medio (Im et al., 2007: Increasing plasma membrane phosphatidylinositol(4,5)biphosphate biosíntesis increases phosphoinositide metabolism in Nicotiana tabacum, Plant Cell 19, 16031616), lo que es un fuerte indicio de que la señalización mediada por el fosfoinosítido juega un papel importante en la potenciacióndela absorción, internalizaciónyalmacenamiento envacuolasde los azúcaresextracelulares. Merece destacarse que recientes estudios han proporcionado fuertes evidencias de que una parte importante de la sacarosa incorporada en las células heterotróficas se absorbe mediante los procesos de endocitosis mediada por PI3K y/o PI4K yel tráfico de vesículas previamente a su conversión en almidón (Baroja-Fernándezet al. 2006: An Important Pool of Sucrose Linked to Starch Biosynthesis is taken up by endocitosis in Heterotrophic Cells, Plant Cell Physiol. 47, 447-456). Consistentemente con estas observaciones,los análisisdeRT-PCR(Fig.13)ylos análisisde transcriptomas revelaronquelos genesque codifican PI4KyPI3Ksevenreguladosalalzaporel tratamiento conFVs (incremento de 3,55y3,12veces, respectivamente).ElPI se sintetiza enel citosola partirde G6P en un procesode tres etapas, que implicanala inositol-fosfatosintasa, inositol monofosfatasayPI sintasa.Merece destacarsequelos análisisde RT-PCR (Fig. 13)y los análisis de transcriptomas revelaron que los genes que codifican la inositol-fosfato sintasa yla inositol monofosfatasa seven reguladosal alza porel tratamiento con FVs (incrementode 3,78y 4,62veces, respectivamente).

El citoesqueleto de actina de las plantas es una estructura de soporte dinámica que juega un papel crucial en el movimiento de los orgánulos, el tráfico de vesículas, las corrientes citoplasmáticas, las defensas de la planta frente a patógenos, etc. en respuestaa señales internasy externas. Recientemente se han proporcionadoevidenciasdeque el citoesqueleto de actina también está implicado en la absorción endocítica y el tráfico de sacarosa ligados a la biosíntesis de almidón en células en cultivo de sicomoro (Baroja-Fernández et al. 2006: An Important Pool of Sucrose Linked to Starch Biosynthesis is taken up by endocitosis in Heterotrophic Cells, Plant Cell Physiol. 47, 447-456). Merece destacarse que se ha demostrado que SuSy, una enzima clave en el proceso de biosíntesis del almidón(ver más arriba), se asocia con el citoesqueleto de actina (Dunkan and Huber, 2007: Sucrose synthase oligomerization and F-actin association are regulated by sucrose concentration and phosphorylation, Plant Cell Physiol. 48, 1612-1623), lo cual es un apoyo más a la visión de que el citoesqueleto de actina determina hasta cierto punto el metabolismo del almidón. Losfactores despolimerizantes de la actina son moduladoresde la organización dinámica del citoesqueleto de actina, que modulan la tasa de recambio de los filamentos y la interconexión de las señales celulares con los procesos dependientesde citoesqueleto. Consistentemente conla visióndequela endocitosisy/oeltráficodevesículas mediadosporel citoesqueletopuedenjugarunpapel importanteenelMIVOISAP,los análisisdeRT-PCR(Fig.13)y los análisisde transcriptomasrevelaronquelaexpresióndelfactor despolimerizantedela actinasevereguladaalalza porel tratamiento con FVs(incrementode 3,26veces).

Los datos globales muestranasíque,tal comoseilustra esquemáticamenteenlaFig.21,la absorción endocítica de sacarosayel tráficodevesículas pueden estar implicados enel MIVOISAP, especialmente cuando las plantasse cultivan en presencia de sacarosa.

4.8. Los volátilesfúngicospromuevenlaregulaciónalabajadegenesde fotosíntesis cuandolas plantasse cultivan en condiciones heterotróficas

Una de las alteraciones más llamativas del transcriptoma de las plantas tratadas con FVs cultivadas en presencia de sacarosa implica la represión de genes que codifican proteínas que funcionan en reacciones luminosas de lafotosíntesis. Además, cuando las plantas se cultivan en presencia de sacarosa, también se ven fuertemente reprimidos porel tratamientoconFVs genesque codifican enzimasclavedel ciclode Calvinyla fotorrespiración. Estosincluyen pPGK, pGAPDH, triosa-P-isomerasa, transcetolasa, pentosa-P-epimerasa, ribosa-P-isomerasa, fructosa-bifosfato aldolasa, fructosa-1,6-bifosfatasa, sedoheptulosa-1,7-bifosfatasa, Rubisco, glicolato oxidasa, catalasa, serina hidroximetiltransferasa,e hidroxipiruvato reductasa (reducciónde5,32, 32,68, 3,69, 3,65, 4,79, 6,43, 14,97, 17,99, 11,09, 46,62,9,24,4,01,6,6y7,79veces, respectivamente)(véase tambiénlaFig.13).Además,el tratamientoconFVsde plantas cultivadas con sacarosa dio como resultado la represión del gen que codifica la fotoclorofílido óxido reductasa (reducción de 7,73), que es necesaria para la biosíntesis de clorofila. En estas condiciones es altamente concebible que, tal como se ilustra esquemáticamente en la Fig. 21, gran parte del almidón acumulado por las plantas cultivadas en condiciones heterotróficas se produzca a partir de la degradación metabólica de sacarosa tomada del medio de cultivo (véase más adelante).

4.9. Los FVs promueven con fuerza el metabolismo aeróbico y anaeróbico cuando las plantas se cultivan en condiciones heterotróficas

Simultáneamente con la represión de genes que codificanproteínas que funcionan en reacciones luminosas de la fotosíntesis (véase más arriba),el tratamiento con FVs dio como resultadola regulaciónala bajadelaATP sintasa plastidial cuando las plantas se cultivaron en condiciones heterotróficas (reducción de 9,09 veces). En estas condiciones los FVs promovieron la transcripción de genes que codifican enzimas glicolíticas tales como enolasa, piruvato quinasa, fosfoenolpiruvato(PEP) carboxiquinasayPEP carboxilasa (incrementode4,94,5,48,19,64y6,03veces,respectivamente). Este efecto fue mucho menos pronunciado cuando las plantas se cultivaron en condiciones autotróficas. Comola PEP carboxiquinasayla PEP carboxilasa están implicadas enla conversiónde PEP en oxalacetato, los datos globales indicanquelosFVs promuevenla glicolisisyelflujode carbono haciael ciclodelos ácidos tricarboxílicos (TCA),tal comose esquematizaenlaFig.21, especialmente cuandolas plantasse cultivanen condiciones heterotróficas.Aeste respecto, merece destacarse queel tratamiento con FVs dio como resultado un incremento enlaexpresión de los genes que codifican enzimas del ciclo de los TCA tales como succinato deshidrogenasa e isocitrato deshidrogenasa (incrementode2,8y2,57veces, respectivamente).Algunosgenesimplicados en fermentación,incluidoslos quecodificanlaalcohol deshidrogenasa(ADH),lapiruvato descarboxilasay una aldehído deshidrogenasa,sevieron fuertemente regulados al alza por el tratamiento con FVs, tanto en condiciones heterotrópicas (incremento de 51,43 y9,92vecesparalaADHyla aldehído deshidrogenasa, respectivamente),ycondiciones autotróficas (incrementode 9,92y3,77veces para ADHypiruvato descarboxilasa, respectivamente) (véase tambiénlaTabla2).El incremento en actividaddela rutade fermentación del etanola partir del piruvato permitela reoxidación delNADH producido en glucolisis, permitiendo asíquela planta genereATP independientementedela fosforilación oxidativa. Por ello,la promoción por parte de los FVs de la potenciación de la expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la glucolisis, el ciclo de los TCAyla fermentación es consistente con la noción de que tanto los metabolismos aerobio como anaerobio están regulados al alza durante MIVOISAP para generar energía en condiciones de producción de ATP fotosintético reducido.

Las plantas superiores poseentransportadoresdeATP/ADP tantoenlos plastidios heterotróficos comoenlos autotróficosparatomarATP citosólico intercambiándoloconADP plastidial.Comolos plastidios heterotróficos carecende la maquinaria que produceATP mediante la fotosíntesis, el transportador deATP/ADP es necesario para suministrar energía a procesos anabólicos localizados en el estroma tales como los implicados en la producción de aminoácidos, almidónyácidos grasos.En los cloroplastos seha demostrados que los transportadoresdeATP/ADP son importantes para la importación nocturna deATPypara prevenir daños causados por la fotooxidación (Reinhold et al. 2007: Limitation of nocturnal import ofATP into Arabidopsis chloroplasts leads to photooxidative damage. Plant J. 50, 293304). Merece destacarse que los FVs regulanal alzalaexpresión del transportador plastidialdeATP/ADP cuandolas plantas se cultivan en condiciones heterotróficas (incremento de 3,16 veces), lo que es consistente con la noción de queelATPextraplastidial sostieneengran medida rutas anabólicasque sucedenenel cloroplastode plantas tratadas con FVs cultivadas en condicionesde crecimiento heterotróficas.

4.10. Los volátiles fúngicospromuevenel intercambiode glucosa-6-fosfatoy reprimenel intercambiode triosafosfato entreel cloroplastoyel citosol

La principal proteína de la membrana de la envuelta de los cloroplastos, el translocador de triosa-P/3-fosfoglicerato/P (TPT), es fundamental parala comunicación entre cloroplastoy citosol, puesto queexporta los productos primarios del ciclo de Calvin (es decir, triosa fosfatosy3-fosfoglicerato) fuera del cloroplasto en un intercambio estricto de unidades con respecto al Pi. Las plantas de patata con el TPT inhibido por moléculas antisentido acumulan en sushojas2-3vecesmás almidónymás3-fosfogliceratoquelashojasdetiposilvestre,ytienen reducidoelvigordela planta. Merece destacarse que los análisis deRT-PCR (Fig. 13)ytranscriptomas revelaron que, independientemente dela presenciade sacarosaenel mediode cultivo,el tratamiento conFVsdio como resultadola reduccióndelaexpresióndelTPT (reducciónde3,17y2,25vecesenpresenciay en ausenciade sacarosa, respectivamente).Lashojasde las plantas tratadas conFVs acumularonniveles moderadamente elevadosde 3-fosfoglicerato (véase más arriba), que probablemente se pueden adscribir a la reducción del transporte mediado por TPTde 3-fosfoglicerato del cloroplasto al citosol.

Los plastidiosnoverdesdetejidos heterotróficos dependendelaprovisióndeG6Pdel citosolatravésde sistemade antiportador G6P/Pi.La G6P importada se puede usar parala síntesisde almidónyácidos grados.La G6P también se puede usar para activar la OPPP que, tal como se discutió más arriba, es la fuente principal de poder reductor requerido parala reducciónde nitritoyparala biosíntesisde ácidos grasosydeaminoácidos. Merece destacarse que, aunque la expresión del translocador de G6P/Pi está restringida principalmente a los tejidos heterotróficos, el tratamiento con FVs potenció con fuerza la expresión del translocador G6P/Pi en hojas cuando las plantas se cultivaron en presencia y en ausenciade sacarosa, tal como se confirmó tanto mediante los análisis deRT-PCR (Fig. 13) como mediante los análisisde transcriptomas (incrementode 30,23y22,08veces cuandolas plantasde cultivaronen presenciay en ausencia de sacarosa, respectivamente).

La implicación del translocador G6P/Pi en la importación de G6P citosólica al cloroplasto cuando las plantas se trataronconFVses cuestionable,puestoque,talcomosemostrómásarriba,las enzimas implicadasenel metabolismo plastidial de la G6P están drásticamente reguladas a la baja. Esto y la reducción de la expresión de las proteínas implicadas enla síntesisde G6P enelcitosola partirde productos del ciclode Calvin tales como TPT (véase más arriba), fructosa-1,6-bifosfatasa citosólica (véanselaTabla2ylaFig.13)(reducciónde9,87y3,61vecesen presencia yen ausenciade sacarosa, respectivamente),yfructosa-6-fosfato2quinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa (reducciónde3,39 y2,2vecesenpresenciayen ausenciade sacarosa,respectivamente)(véasetambiénlaFig.13)sugierenque,talcomo se esquematiza en la Fig. 21, en condiciones de tratamiento con FVs, el transportador de G6P/Pi jugaría un papel principalexportando moléculasde G6P del cloroplastoal citosol para posteriormente ser canalizadas haciael ciclode losTCAy/orutasfermentativas,y/oserconvertidasen compuestostalescomo sacarosayPIquees necesarioparalos procesosde endocitosisytráficodevesículas.

4.11. Influenciade los FVs en otrosgenesde interés

Todas las especies microbianas analizadas en este trabajo emitían volátiles que promovían el crecimiento de la planta, lo que indicaría que la maquinaria implicada en la biosíntesis se ve regulada al alza durante MIVOISAP. Consistentemente con estapresunción,el análisisde transcritosdehojasde plantasde patatarevelóqueel tratamiento con FVs daba como resultadola regulaciónal alzadela celulosa sintasayla callosa sintasa (incrementode 9,78y2,1 veces, respectivamente).

MIVOISAP implica cambios en la expresión de multitud de genes que codifican enzimas fundamentales en el metabolismo de hidratos de carbonoy en producción/consumo de energía, lo que sugiere que el MIVOISAP es un proceso altamente coordinadoy regulado. Merece destacarse que los análisis de trascritos descritos en la presente solicitud revelaron que el tratamiento con FVs promovía con fuerza la expresión de SNF4 (incremento de 6,64 veces) (véase también laFig. 13), un activador de la proteína quinasa SnRK1, que es un regulador global del metabolismo del carbono en las plantas. Es así probable que (a) SNF4 ejerza un efecto positivo sobre la acumulación de almidón a travésdelaactivacióndeSnRK1,y(b)SnRK1juegueunpapelregulador duranteelMIVOISAP.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo caracterizado por que la planta se cultiva en presencia de un cultivo de un microorganismo que produce compuestos volátiles, sin que exista contacto entrela plantayel microorganismo,oen presenciadelosvolátiles emitidosporel microorganismo,en el que el microorganismo es distinto de los aislados Bacillus subtilis GB03y Bacillus amyloliquefaciens IN937.
2. 2.Método segúnla reivindicación1, enel queel microorganismo es una bacteria, unalevadurao un hongo pluricelular microscópico.

3. 3.

   Métodosegúnlareivindicación2,enelqueel microorganismoes una bacteria pertenecienteaun género distinto de Bacillus o Paenibacillus.

4. 4.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el crecimiento del microorganismo se produce en un medio que carece de compuestos orgánicos que presenten grupos amino.

5. 5.

   Método según la reivindicación 4, en el que el crecimiento del microorganismo se produce en un medio que carecede aminoácidosy/oproteínas.

6. 6.

   Método según la reivindicación4ó5, en el que el crecimiento del microorganismo se produce en un medio mínimo suplementado con un compuesto orgánico como fuente de carbono.

7. 7.

   Método según la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una bacteria perteneciente a un género del grupo de Bacillus, Escherichia, Salmonella, Agrobacterium o Pseudomonas.

8. 8. Método según la reivindicación 6, en el que el microorganismo es un hongo perteneciente al género Penicillium

   o Alternaria.

9. 9.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta es una angiosperma, monocotiledónea o dicotiledónea.

10. 10.

    Método según la reivindicación 9, en el que la planta se selecciona del grupo de plantas de patata, plantas de maíz, plantas de tabaco, o plantas de la especie Arabidopsis thaliana.

11. 11.

    Método según la reivindicación 10, en el que la planta es una planta de maíz, una planta de tabaco o una planta de la especie Arabidopsis thaliana que se cultiva en presencia de un hongo perteneciente al género Alternaria

    o Penicilliumquesedeja creceren medio mínimo suplementado con unafuentede carbonoorgánico,sinqueexista contacto entrela plantayel microorganismo.

12. 12.

    Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el incremento del crecimiento se manifiestanen aumentodela longituddela plantay/oen aumentodel tamañodelas hojas.

13. 13.

    Métodosegúnuna cualquieradelasreivindicaciones anteriores,enelquela alteracióndelpatrónde crecimiento semanifiestaen incrementodel númerodehojas, incrementodel númeroderamasy/odel númerode flores, frutosy semillas de plantas angiospermas, en la inducción de la floración, o en combinaciones de los anteriores.

14. 14.

    Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta se cultiva en una atmósfera enla que están presentes los compuestosvolátiles emitidos por un microorganismo queha sido cultivado en unlugar diferente al lugar de cultivo de la planta.