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ES2370638B1 - Dendrimeros como vehiculos no virales para terapia genica - Google Patents

Dendrimeros como vehiculos no virales para terapia genica Download PDF

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ES2370638B1
ES2370638B1 ES201030322A ES201030322A ES2370638B1 ES 2370638 B1 ES2370638 B1 ES 2370638B1 ES 201030322 A ES201030322 A ES 201030322A ES 201030322 A ES201030322 A ES 201030322A ES 2370638 B1 ES2370638 B1 ES 2370638B1
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Sonia Merino Guijarro
Joaquín Calixto García Martínez
Julian Rodriguez Lopez
Ester Vázquez Fernández-Pacheco
Maria Antonia Herrero Chamorro
Ana Campo Rodrigo
Ivan RIVILLA DE LA CRUZ
Francisco Carlos Perez Martinez
Francisco Javier Guerra Navarro
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Abstract

Dendrímeros como vehículos no virales para terapia génica.#La presente invención se refiere a nuevos compuestos de fórmula general (I) y (II) para su uso en terapia génica como vehículos no virales y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos compuestos de fórmula general (I) y (III).

Description

Dendrímeros como vehículos no virales para terapia génica.
La presenteinvenciónse refierea nuevos compuestosde fórmulageneral(I),y(II) parasu usoen terapia génica comovehículosno viralesy su usoparala elaboracióndeun medicamento. Ademásse describeel procedimientode síntesisde dichos compuestosde fórmula general(I)y(II).
Estado de la técnica anterior
El uso de vectores no virales en terapia génica es especialmente relevante, ya que la FDAha suspendido, sine die, los ensayos clínicos usando virus(adenovirus, adenoasociados, etc) debidoa que generan reacciones inmunesque han causadola muertede algunos pacientesque participabanen dichos ensayos.Losvectoresvíricosposeenvarios inconvenientes, tales como, inseguridad en su manejo, toxicidad, provocación de una respuesta inmune que disminuye suefectividadofaltade especificidad celular.Juntoaello,estos sistemassonrápidamente eliminadosdela circulación, limitandoel procesode transfecciónaórganosde primer paso (pulmones,hígadoybazo).
También hay que tener en cuenta que procesos de recombinación pueden originar un virus replicante aunque el peligro es remoto.No obstante, los problemas que plantean los virus comovectores en terapia génica son seriosy los ensayos clínicos de terapia génica en por ejemplo Estados Unidos, han sido interrumpidos recientemente por la FDAdebidoala muertedevarios pacientesporfallo multiorgánico.Estetipodegraves problemashanllevadoala búsquedaydesarrollode alternativasal usode los virus comovectoresde materialgénico.
Losvectores no virales poseen una seriedeventajas con respectoalos análogos víricos:a)facilidad enla preparación (incluso a escala multigramo) y modificación, b) mayor flexibilidad con respecto al tamaño del ADN a transfectar, c) son generalmente seguros in vivo yd) no provocan una respuesta inmune específicaypor tanto pueden ser administrados repetidamente.
Dentrodelosvectoresno virales,los dendrímeros representanunade estas alternativas,yaque presentanun tamaño nanométrico, una estructura globular, una baja polidispersidady una alta densidad funcionalenla superficie con un pequeño volumen molecular.
Descripción de la invención
La presenteinvenciónse refierea nuevos compuestosde fórmulageneral(I),y(II) parasu usoen terapia génica comovehículos no viralesysu uso parala elaboraciónde un medicamentoo kitsde transfección. Además se describe el procedimientode síntesisde dichos compuestosde fórmula general(I)y(II).
Por lo tanto un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I):
o una sal, prodroga o solvato del mismo;
donde:
Wse selecciona del grupo formado por cualquier polímero o dendrímero derivado de polifenilenvinileno, polifenilenetilideno o híbrido de ambos, cualquier compuesto orgánico conjugado que combine dobles enlaces, triples enlaces o una composición de ambos en su estructura, cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores, cualquier compuesto orgánico conjugado que alterne en su estructura dobles enlaces, triples enlaces o una combinación de ambos con anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas como la citosina, uracilo, adenina, timinay guanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractoresde las anteriores, cualquier compuesto orgánico no conjugado que contenga anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas como la citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitución congrupos electrodadoreso electroatractoresdelas anterioreso cualquier combinacióndelos mismos,
X1,X2yX3 son igualeso diferentesyse seleccionan entre cualquier heteroátomo,
Yse seleccionade entre un grupo alquilo saturadoo insaturado(C2-C12)o cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, arilo o heteroarilo,
R1yR2 son igualeso diferentes unidosaun grupo amino primario, secundarioo terciarioy seseleccionande entre hidrógeno, alquilo saturadoo insaturado(C1-C12),
n representael númerode ramificacionesy es un número entero seleccionado entre1y10.
Una realización preferida se refiere a compuesto de fórmula general (II):
o una sal, prodroga o solvato del mismo;
donde:
Wse selecciona del grupo formado por cualquier polímero o dendrímero derivado de polifenilenvinileno, polifenilenetilideno o híbrido de ambos, cualquier compuesto orgánico conjugado que combine dobles enlaces, triples enlaces o una composición de ambos en su estructura, cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores, cualquier compuesto orgánico conjugado que alterne en su estructura dobles enlaces, triples enlaces o una combinación de ambos con anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas como la citosina, uracilo, adenina, timinay guanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractoresde las anteriores, cualquier compuesto orgánico no conjugado que contenga anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas como la citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitución congrupos electrodadoreso electroatractoresdelas anterioreso cualquier combinacióndelos mismos.
X1,X2yX3 son igualeso diferentesy se seleccionan entre cualquier heteroátomo,
Yse seleccionade entre un grupo alquilo saturadoo insaturado(C2-C12)o cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, arilo o heteroarilo,
R1yR2 son igualeso diferentes unidosaun grupo amino primario, secundarioo terciarioy se seleccionande entre hidrógeno, alquilo saturadoo insaturado(C1-C12), cicloalquilo,
n representael númerode ramificacionesy es un número entero seleccionado entre1y10.
En otra realización preferida, los compuestos de fórmula general (I)ó (II) pueden estar en forma de saly unidos electrostáticamente a trifluoroacetato, anión cloruro, DNA, RNA, siRNA, miRNA, antagomir cualquier fármaco, anticuerpo, sonda, (radiactiva o no) para el diagnóstico de enfermedades mediante técnicas de imagen (Resonancia Magnética Nuclear,Tomografía por emisiónde fotón simpleoTomografía por emisiónde positrones) o cualquier combinación de los mismos.
Según otra realización preferidaX1,X2yX3 son igualeso diferentesy seseleccionan entre nitrógenou oxígeno.
En otra realización preferida, tanto para el compuesto de fórmula general (I), como para el de fórmula general (II), Xse selecciona sin sentido limitativo entre:
Según otra realización preferida, los radicalesR1aR2 puedenser igualeso diferentesy se seleccionan independientemente entre H, cualquier amina sustituida o no sustituida, aminoácidos básicos como por ejemplo la lisina o la arginina, derivados del colesterol a partir del cloroformiato de colesterilo, ácido fólico, ácido láctico, dexametasona, azúcares comoporejemploysin sentido limitativo,la lactosa ola mañosaa partirdesu derivadode tosilo, agentes lisosomotrópicos como por ejemplo la cloroquina, heterociclos nitrogenados como la uridina, la piperidina o la piperazina, cadenas hidrofílicas derivadas de poli-etilenglicol, cualquier diacrilato y las siguientes estructuras:
Enuna realizaciónpreferida,dichoscompuestosdefórmulageneral(I)o(II)se seleccionan,perosinlimitarse,del grupo que comprende:
El término “alquilo” se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas, que tienen de 2 a 12 átomos de carbono. Por ejemplo, pero sin limitarse a, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo etc. Además el término alquilo también se refiere a cadenas alifáticas lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas de 2 a 12 átomos de carbono, que pueden estar sustituidas por grupos funcionales como por ejemplo el hidroxilo, carboxilo, carbonilo, amina, amida o que puede contener en su estructura cualquier heteroátomo seleccionado entre nitrógeno, oxígeno y azufre.
El término “cicloalquilo”se refiereaun radical estable monocíclicoobicíclicode3a8miembros,queestá saturado
o parcialmentesaturado,yquesólo consisteen átomosde carbonoe hidrógeno.Comopor ejemplo,perosin limitarse, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano o cicloheptano. Además el término cicloalquilo también se refiere a un radical estable monocíclicoo bicíclicode3 a8miembros, que está saturadoo parcialmente saturado,yque sólo consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que pueden estar sustituidas por grupos funcionales como por ejemplo el hidroxilo, carboxilo, carbonilo, amina, amida o que puede contener en su estructura cualquier heteroátomo seleccionado entre nitrógeno, oxígenoyazufre.
El término “sales, solvatos, prodrogafarmacéuticamente aceptables” se refierea cualquier sal, éster,solvatofarmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, cuando se administra a un receptor es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciará quelas salesfarmacéuticamenteno aceptables tambiénestán dentrodel alcancedelainvenciónyaque éstaspueden ser útiles en la preparación de salesfarmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, prodrogasy derivados puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica.
Porejemplo, salesfarmacéuticamente aceptablesde compuestosprevistosenel presente documento, se sintetizan mediante métodos químicos convencionales a partir de un compuesto original que contiene un resto básico ó ácido. Generalmente, tales sales se preparan,por ejemplo, haciendo reaccionar las formasde ácidoo base librede los compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mande-lato, metanosulfonatoyp-toluenosulfonato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminioy litio,y sales de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N,N-dialquilenetanolamina, glucaminaysalesde aminoácidos básicos.
Los derivadoso prodrogasparticularmentefavoritos son aquellosque aumentanla biodisponibilidaddelos compuestos de esta invención cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba mas fácilmente por la sangre), o que potencia la liberación del compuesto original en un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con relación a la especie original.
Cualquier compuesto que es un prodroga de un compuesto de fórmula (I) está dentro del alcance de la invención. El termino “prodroga”o “profármaco”se usaensu sentidomás amplioyabarca aquellosderivadosquese convierten envivo en los compuestosdelainvención.Tales derivados seránevidentes para aquellosexpertos enla técnica,e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la moléculaysin limitación, los siguientes derivados de los compuestos presentes esteres, esteres de aminoácido, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos,yamidas.
Los compuestosde fórmula(I)y(II)pueden estarenforma cristalina como compuestos libreso comosolvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcancedela presenteinvención. Los métodosdesolvatación se conocen generalmente dentro de la técnica. Los solvatos adecuados son solvatosfarmacéuticamente aceptables. En una realización particular, el solvato es un hidrato.
Un segundo aspecto fundamental de la presente invención se refiere a un procedimiento para la elaboración de un compuesto de fórmula general (I) que comprende las siguientes etapas:
donde:
Wse selecciona del grupo formado por cualquier polímero o dendrímero derivado de polifenilenvinileno, polifenilenetilideno o híbrido de ambos, cualquier compuesto orgánico conjugado que combine dobles enlaces, triples enlaces o una composición de ambos en su estructura, cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores, cualquier compuesto orgánico conjugado que alterne en su estructura dobles enlaces, triples enlaces o una combinación de ambos con anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas como la citosina, uracilo, adenina, timinay guanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractoresde las anteriores, cualquier compuesto orgánico no conjugado que contenga anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas como la citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadoreso electroatractoresdelas anterioreso cualquier combinación de los mismos.
Ase selecciona entreX1,X2yX3,
X1,X2yX3 son igualeso diferentesy se seleccionan entre cualquier heteroátomo,
Yse seleccionade entre un grupo alquilo saturadoo insaturado(C2-C12)o cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, arilo o heteroarilo,
R1yR2 son igualeso diferentes unidosaun grupo amino primario, secundarioo terciarioy se seleccionande entre hidrógeno, alquilo saturadoo insaturado(C1-C12),y
n representael númerode ramificacionesy es un número entero seleccionado entre1y10.
Otro aspecto fundamental de la presente invención se refiere a un procedimiento para la elaboración de un compuesto de fórmula general (II) que comprende las mismas etapas para la elaboración del compuesto de fórmula general
(I) partiendo de este último compuesto.
En otro aspecto,la presenteinvención se refierealusode un compuestode fórmula(I)ó(II) paralafabricaciónde un medicamento.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del medicamento mencionado anteriormente para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades del sistema nervioso como son las enfermedades neurodegenerativas, accidentes cerebrovasculares, enfermedades que cursen con la aparición de tumores, enfermedades producidaspor infecciones víricas.
Por tanto, los compuestos de la presente invención podrían ser utilizados para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades que se seleccionan de la lista que comprende enfermedades del sistema nervioso como son las enfermedades neurodegenerativas (enfermedad de Parkinson, demencia incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Hungtinton, enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple y la esclerosis lateral amiotrófica), accidentes cerebrovasculares (incluyendo la patología derivada de la trombosisy la hemorragia cerebral).También se incluye en este apartado el tratamiento de tumores (especialmentedepróstata,depulmónydemama,sinqueestalistaesté limitaday seaexcluyentedeotrostiposdepatología tumoral).Tambiénse incluye en esta lista las infecciones víricas especialmente(aunque noexcluyente)la causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA) producida por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH).
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I)ó (II) para la elaboración de un kit de transfección de siRNA en cultivos primarios de células nerviosas, glia, células tumoralesyotras células primarias como los hepatocitos (sin ser éstas últimas excluyentes de otros cultivos primarios).
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso delcompuesto de fórmula (I), (II) o (III) en terapia génica como vector no viral.
Enotro aspecto,la presenteinvenciónse refierealusodel compuestode fórmula(I),(II)o(III)parala elaboración de sondas, (radiactivasono)parael diagnósticode enfermedades mediante técnicasdeimagen (Resonancia Magnética Nuclear,Tomografíapor emisiónde fotón simpleoTomografíapor emisiónde positrones).
Parasu aplicaciónenterapia,los compuestosde fórmula(I)y(II),sus isómeros,sales, profármacososolvatos,se encontrarán, preferentemente, enuna formafarmacéuticamente aceptableo sustancialmente pura, es decir, que tiene unniveldepurezafarmacéuticamente aceptableexcluyendolos aditivosfarmacéuticos normales tales como diluyentes yportadores,yno incluyendomaterial considerado tóxicoanivelesde dosificación normales.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus salesfarmacéuticamente aceptables, profármacos y/o solvatos así como las composicionesfarmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación.
Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionadosen formadeuna composición separada parasu administración simultáneaonoaladela composiciónfarmacéutica que comprende un compuestode fórmula(I)ó (II)o un profármaco, solvato, derivadoo una salfarmacéuticamente aceptablede los mismos.
Otra realización preferidadela presenteinvenciónse refiereauna composiciónfarmacéuticaútilpara medicamento paralaprevenciónoel tratamientode enfermedadesquese seleccionandela listaque comprende enfermedadesdel sistema nervioso como sonlas enfermedades neurodegenerativas (enfermedaddeParkinson, demencia incluyendola enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Hungtinton, enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltipley la esclerosis lateral amiotrófica), accidentes cerebrovasculares (incluyendo la patología derivada de la trombosisyla hemorragia cerebral).También se incluye en este apartado el tratamiento de tumores (especialmentede próstata,de pulmónyde mama,sin que esta lista esté limitaday seaexcluyentede otros tiposde patología tumoral).También se incluye en esta lista las infecciones víricas especialmente (aunque no excluyente) la causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana(SIDA) producidaporelVirusdela Inmunodeficiencia Humana (VIH),o,en general,de enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biológicas mostradas por los compuestos descritos en la presenteinvención,en adelante composiciónfarmacéuticadelainvención,que comprendeun compuesto,en cantidad terapéuticamenteefectiva,de fórmula(I)ó(II),omezclasdelosmismos,unasal, profármaco,solvatooestereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvanteovehículofarmacéuticamente aceptable, parala administracióna unpaciente.
Los adyuvantesyvehículosfarmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son losadyuvantesy vehículos conocidosporlostécnicosenla materiayutilizados habitualmenteenla elaboraciónde composiciones terapéuticas.
Enel sentido utilizadoenesta descripción,laexpresión “cantidad terapéuticamente efectiva”se refiereala cantidad del agenteo compuesto capazde desarrollarla acción terapéutica determinadapor sus propiedadesfarmacológicas, calculada para producirel efecto deseadoy, en general,vendrá determinada, entre otras causas, por las características propiasde los compuestos, incluyendola edad, estado del paciente,la severidaddela alteraciónotrastorno,ydela rutayfrecuenciade administración.
En otrarealización particular,dicha composición terapéuticase preparaen formade una forma sólidao suspensión acuosa, en un diluyentefarmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada.
Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplosyfigurasse proporcionana modode ilustración,y nose pretendeque sean limitativosdela presente invención.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1, se refiere al análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a compuesto de fórmula general (I). Los números en (A) corresponden a diferentes ratios N/P (aminas nitrogenadas en compuesto de fórmula general(I)/fosfatos en siRNA): (1) 1:0 (siRNA sólo), (2) 6:1, (3) 12:1, (4)24:1, (5) 48:1, (6) 96:1, (7) 192:1y(8)
384:1. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
Fig.2 se refiereal estudiodela disociacióndesiRNAdelos complejos compuestode fórmula general(I)-siRNA por competencia con heparan sulfato. Los complejos compuesto de fórmula general (I)-siRNA con un ratio N/Pde
12:1 se incubaron durante1 horaa 37ºC con concentraciones crecientesde heparan sulfatoyla disociacióndelos complejos se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa. A. Gel de agarosa mostrando el siRNA liberado por concentraciones crecientes de heparan sulfato. Los diferentes carriles corresponden a la incubación del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA con las siguientes concentraciones de heparan sulfato(µg)/compuesto de fórmula general (I)(µg): (1) 0,78, (2) 1,52; (3) 3,04; (4) 6,08; (5) 12,48; (6) 24,32 y (7) 0:0 (siRNA sólo). El análisis densitométrico de los resultados del experimento de competitividad con heparan sulfato se muestran en (B).
Fig.3 se refiereala determinacióndela estabilidaddel complejo compuestode fórmula general(I)-siRNA en presencia de RNAasas. A. Efecto de diversos tratamientos sobre la estabilidad del siRNA. B. Densitograma de A. Las barras blancas representan la cantidad de siRNA en el pocillo de cargaylas negras la cantidad liberada por heparan sulfato al final del experimento.
Fig.4describeelestudiodelatoxicidadde compuestode fórmulageneral(I)en célulasPC12(A), neuronasgranularesde cerebelo(B)yneuronas corticales(C).Las célulasse trataron con diferentes concentracionesde compuestode fórmula general (I) (5 a 80 µM) durante 24 horas (barras blancas), 48 horas (barras grises) o 72 horas (barras negras). La viabilidad celularseevaluó cuantificandoel porcentajedeLDH liberadaal mediode cultivo.Los datosseexpresan como media(% control) ± SEM, n=12.*p <0,05, comparados con el control.
Fig.5 describe el estudio dela transfeccióny toxicidad de compuesto de fórmula general (I) en células PC12. Cuantificación de la transfección del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNAfluorescente en células PC12 (A, C) y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B, D) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentraciones de compuesto de fórmula general (I)y100 nM de siRNAfluorescente. Los tratamientos duraron 24 horas(A,B)o48 horas(C,D).Los datosseexpresan comomedia(%control) ± SEM,de unmínimode3experimentos diferentes. *p <0,05, comparados con el control.
Fig.6 describe el estudio de la transfecciónytoxicidad de compuesto de fórmula general (I) en células LnCaP. Cuantificación de la transfección del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNAfluorescente en células LnCaP (A, C) y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B, D) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentracionesde compuestode fórmula general(I)y100nMdesiRNAfluorescente.Se estudiaronlos efectostras tratamientos de 48 horas (A, B) o 72 horas (C, D). Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de3 experimentos diferentes. *p <0,05, comparados con el control.
Fig.7describeel estudiodelatransfecciónytoxicidadde compuestode fórmula general(I)en células granulares de cerebelo. Cuantificación de la transfección del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA fluorescente, tras 48 horas de tratamiento, en neuronas granulares de cerebelo(A)y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentraciones de compuesto de fórmula general (I) y100 nM de siRNAfluorescente. Estudio microscópico de las neuronas granulares de cerebelo transfectadas con el complejo formado mediante4 µMcompuestodefórmula general(I)y100nMsiRNAfluorescente(C).Los datosse expresan como media (% control) ± SEM,de un mínimode3 experimentos diferentes.*p <0,05, comparados con el control.
Fig.8 describe la transfeccióny toxicidad de compuesto de fórmula general (I) en neuronas corticales de rata. Cuantificación de la transfección del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA fluorescente en neuronas corticalesde rata(A,C)ydela toxicidadproducidaporel complejo (porcentajede células marcadas con yodurode propidio) en este mismo tipo celular(B,D)mediante su estudiopor citometríade flujo. Los complejos se formaron con distintas concentracionesde compuestode fórmula general(I)y100nMde siRNAfluorescente.Se estudiaronlos efectostras tratamientosde48horas(A,B)o72horas(C,D).Losdatosseexpresancomomedia(%control) ± SEM, de un mínimode3 experimentos diferentes.*p <0,05, comparados con el control.
Fig. 9 describe el estudio del efecto del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA contra GAPDH o SCRAMBLE (Control)enlaexpresióngénicadeGAPDHen célulasPC12 mediante real-timePCR.La cuantificación del RNAm de GAPDHy β-actina(control endógeno)se realizóen células transfectadas durante48 horas(A)o72 horas (B). Los datos se expresan como media (% control) ± SEM,de un mínimode3 experimentos diferentes. *p <0,05, comparados con el control.
Fig. 10 describe el estudio de la transfección durante 48 horas del complejo compuesto de fórmula general (I)siRNAcontra COFILINA1 o SCRAMBLE (Control) en neuronas granularesde cerebelode rata.A, mediante real-timePCR(A)se cuantificóelRNAmde COFILINA1y β-actina (control endógeno).B, análisis porWestern blotde laexpresión proteicade COFILINA1yGAPDH (control endógeno). Los datos seexpresan como media(% control) ± SEM,de un mínimode3 experimentos diferentes.*p <0,05, comparados con el control.
Fig. 11 describe el estudio de la transfección durante 48 horas del complejo compuesto de fórmula general (I)siRNAcontra COFILINA1 o SCRAMBLE (Control)en neuronas corticalesde rata.A, mediante real-timePCR(A) se cuantificó el RNAm de COFILINA1y β-actina (control endógeno).B, análisisporWestern blotdelaexpresión proteicade COFILINA1yGAPDH (control endógeno).Los datosseexpresan como media(% control) ± SEM, de un mínimode3 experimentos diferentes.*p <0,05, comparados con el control.
Ejemplos de realización de la invención
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención. Sin embargo, estos ejemplos no son limitativos. Tienen carácter informativoyen ningún caso limitantede las metodologías empleadas, las cuales pueden ser alteradas conel fin de alcanzar unos resultados similares.
En esta memoria descriptiva los símbolosy convenciones usadas en estos procedimientos, esquemasyejemplos son consistentes con los usados en el Sistema Internacionalyla bibliografía científica contemporánea, por ejemplo, el Journal of Medicinal Chemistry. Salvo que se indique otra cosa, todos los materiales de partida se obtuvieron de proveedores comercialesy se usaron sin purificación adicional. Específicamente, se pueden usar las siguientes abreviaturasenlos ejemplosy alolargode todala memoria descriptiva:g(gramos);mg(miligramos);Kg (kilogramos); mL (mililitros); µL(microlitros);mmol (milimoles);P.f.(puntodefusión);Hz (hertzio);MHz(megahertzio);δ (desplazamiento químico); ppm (partes por millón);s (singlete);d(doblete);t (triplete);q(cuartete);c (quintuplete);m (multiplete);J(constantede acoplamiento); RMN (resonancia magnética nuclear);EM (espectrometríade masas);ES (electrospray); m/z (Relación masa/carga); Anal. (Análisis Elemental); Rto (Rendimiento); TEA (trietilamina); CH2Cl2 (diclorometano); CDCl3 (cloroformo deuterado); DMSO(dimetilsulfóxido); i.p. (administración parental).Todas las temperaturas se expresan en ºC (grados Celsius).
Ejemplo1
PC12
Las células PC12 de rata (glándula adrenal; feocromocitoma) se cultivaron en medio de cultivo RPMI suplementado con10%de suerode caballo inactivado con calor,5%de suero fetalbovino (FBS),2mMde glutamina,100U/ml de penicilinay100 µg/ml de estreptomicina, en CO2 al 5% a 37ºC, según el manual del banco de origen de la línea celularypublicaciones anteriores(J Neurochem. 2007. 103:1396-1407).
SH5YSY
La línea celular SH-SY5Y procede de una neuroblastoma clonado artificialmente a partir de un grupo de células que expresaban un fenotipo característico(Cancer Res. 1978. 38: 3751-3757). Esta línea celular es genéticamente femeninaporquela línea originalse establecióen 1970a partirde una biopsiade metástasis óseadeun neuroblastoma quepadecíaunaniñade4años.Las célulasposeenuna anomalíaenel cromosoma1,dondese encuentrauna trisomía 1q. Las células SH-SY5Y se conocen por ser dopamina beta-hidroxilasa activas, acetilcolinérgicas, glutaminérgicasy adenosinérgicas.La célulassepropaganpor mitosisyporextenderneuritasalas áreas periféricas.Se cultivaronen una combinación 1:1de mediode cultivo DMEMymediode cultivo HAM’S-F12, suplementado con 10%de FBS,2 mM de glutamina, 0,5 mg/ml de neomicina, 100 U/ml de penicilinay100 µg/ml de estreptomicina según el manual del banco de origen de la línea celular.
LnCaP
Las células LnCaP(ATCC CRL 1740) son una línea celular bien caracterizadade Carcinomade Próstata humano. Se cultivaron en medio RPMI-1640 con FBS al 10%,2 mM de glutamina,y antibióticos (penicilina 100 UI/mly estreptomicina 100 µg/ml), segúnelmanual del bancode origendela línea celularypublicaciones anteriores(Life Sci. 2009. 85:421 -430).
Cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo de rata
El cultivode neuronas granulares del cerebelo se obtuvieron conformea protocolos descritos previamente(J Neurochem. 2007. 103:1396-407;Brain Res De y Brain Res. 1991. 63:1-12), con pequeñas modificaciones. Brevemente, críasde7díasde edaddela cepa Spragle-Dawleyfueron decapitadas rápidamentey seextrajeron los cerebros cuidadosamente. Separamos el cerebelo asépticamente, quitamos las meningesy se cortó el cerebelo en trozos de unos 0,4 mm.Acontinuación,seexpusoeltejidoa tripsinayDNAsaenun mediode cultivo librede calcioy magnesioy se sembraron en placas de cultivo pretratadas con poli-lisina. Las células se cultivaron en medio BME suplementado con 24,5 mM de potasio,2mM de glutamina, 10% de FBSy50 µg/mlde gentamicina.Alas24 horas, Ara-C(cytosine arabinoside) se añadió al medio para obtener una concentración final de 10 µMpara reducir el crecimiento de astrocitos.Las célulasse utilizaronno antesde7díastraselcultivo,queeseltiempoque necesitanpara terminarde diferenciarse.
Cultivos primarios de neuronas corticales de rata
El cultivo primario de neuronas corticales se realizó de acuerdo a la metodología descrita previamente(Eur J Neurosci. 2001.; 13:1469-78). Los lóbulos corticales frontolaterales se disecaron en fetos de 17 días de ratas hembra de la cepa Spragle-Dawleyy se disociaron mecánicamente en HBSS. Los lóbulos corticales se trituraron pipeteando unas diezveces con una pipetaPasteur. Despuésde centrifugar5minutosa800×g, las células se resuspendieron en medio de cultivo Neurobasal suplementado con B27,2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilinay 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se sembraron en placas de cultivo pretratadas con poli-lisinay se utilizaron no antes de 7 días tras el cultivo, que es el tiempo que necesitan para terminar de diferenciarsey que aparezcan receptoresde glutamato.
Formación de los complejos compuesto de fórmula general (I)-siRNA
Loscomplejos compuestode fórmulageneral (I)-siRNAse formaron mezclando cantidades igualesdevolumende la soluciónque contenía compuestode fórmula general(I)-ydelaque conteníael siRNA(Org Biomol Chem. 2007.5: 1886-1893; Pharm Res. 2009. 26:1181-1191), e incubando la mezcla en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ambas moléculas se disolvieron en agua DEPC (libre de RNAsas).
Experimentos de retardo en gel, exclusión con heparina y efecto protector del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA a la acción de RNAsas
El retardo en gel de agarosa se utilizó para averiguar el ratio N/P(aminas nitrogenadas en compuesto de fórmula general (I)-/fosfatos en siRNA) adecuado para obtener la mayor efectividad de unión posible entre ambas moléculas (Mol Biol Rep. 2009. 36: 1083-1093; Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2008. 147B: 769-777). Se testó la mezclade distintas concentracionesde compuestode fórmula general (I)-yde 250ngde siRNA.La mezcla se corrió durante15 minutosa60V enungeldeagarosaal1,2%con0,017%de bromurode etidio.Losgelesse fotografiaron ylas bandas se cuantificaron con un sistema de análisis de imagen apropiado (Quantity One).
Los experimentos de desplazamiento con heparina se realizaron para evaluar la fuerza de unión entre compuesto de fórmula general (I)yel siRNA. Los complejos se prepararon con un ratio N/P de 12:1, que se consideró óptima para asegurarun acoplamiento completodelsiRNAconel compuestode fórmula general(I).Luego,fueron incubados con 0,78; 1,52; 3,04;6,08; 12,48y24,32 µgde heparan sulfatoa 37ºC durante1hora. Las solucionesse corrieron en un gel de agarosa en las mismas condiciones que el test de ratios compuesto de fórmula general (I)-siRNAantes descrito.
Para los experimentos de evaluación del efecto protector del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA, los complejosconunratioN/Pde12:1se incubaron,envezdecon distintascantidadesdeheparansulfato,con0,25% de RNasaAdurante30 minutosa 37ºC.Acontinuación,las muestrasse incubaron conexcesode heparan sulfatopara aseguraruna liberacióncompletadelsiRNAdel complejo.ElporcentajedesiRNAintactoseanalizópor electroforesis en gelesdeagarosa en lasmismas condiciones que losexperimentos anteriormentedescritos.
Se realizaron un mínimode2experimentos para cada unade las pruebas anteriormente descritas.
Estudios de Citotoxicidad
Pruebas paraevaluarla toxicidaddel compuestode fórmulageneral (I)-se realizaron en distintostipos celulares, determinando la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH)(Pharm Res. 2009. 26: 1181-1191).Para ello, las células fueron sembradas en placasde24 pocillosy seexpusierona soluciones con diferentes concentraciones de compuesto de fórmula general (I)-(5-80 µM) para realizar curvas de toxicidad concentración-dependiente durante24,48o74 horas.Los efectos tóxicosseevaluaron midiendola rupturadela membrana celularyla consiguiente liberación de la LDH al sobrenadante a través del kit CytoTox96® (Promega). Las células se despegaron mecánicamente,selavaron conPBSy fueron centrifugadasa 10.000rpmdurante10 minutos.La absorbanciadel lisadoydel sobrenadante celularsemidióutilizandounespectrofotómetrode microplacasaunalongituddeondade 490 nm.
La toxicidad de los tratamientos con los complejos compuesto de fórmula general (I)-siRNA, utilizando distintas concentraciones de compuesto de fórmula general (I)-(1-8 µM)en combinación con 100 nM de siRNA, se estudió por citometríadeflujo.Paraello,despuésdelos tratamientos,las célulasseincubaronconyodurodepropidio0,5mg/mlal menos durante1horaa 37ºC en oscuridad.Seguidamente, las células se tripsinizarony se analizaron en un citómetro deflujo(FACSCalibur, Becton-Dickinson, FranklinLakes,NJ,EEUU).Apartirdelaevaluaciónde 10.000 células por condición experimental, se calculó el porcentaje de células con la membrana citoplasmática dañada (yoduro de propidio positivas)(WeberN et al., 2008; Perumal OP et al., 2008).
Estudio del porcentaje de translocación del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA al interior celular
Después de 24-72 horas con las células en presencia de los complejos compuesto de fórmula general (I)-siRNA, utilizando 100 nM de siRNA fluorescente para realizarlos, se recogieron los medios condicionadosylas células se tripsinizarony selavaroncon PBS. Las células totales -vivasy muertas -presentes enla suspensión resultante al juntarel tripsinizado celularyel mediocondicionadose analizaronenun citómetrodeflujo(FACSCalibur, BectonDickinson,FranklinLakes,NJ,EEUU).Apartirdelaevaluaciónde 10.000célulaspor condiciónexperimentalsecalculó el porcentaje de células transfectadas con siRNAfluorescente(J Control Release. 2008. 132:55-64;Biomaterials. 2008. 29:3469-76).
La translocación del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNAtambién se estudió por microscopía con-focal.Para esto, lascélulas se sembraron en cubreobjetosy se trataron del mismo modo que las muestras anteriores. Las células tratadas con siRNAfluorescente, sólo o formando complejos compuesto de fórmula general (I)-siRNA, se visualizarony fotografiaron en un microscopio confocal (Nikon Eclipse TE200) utilizando la longitud de onda adecuada para la excitación del fluoróforo con el que el siRNA esta marcado (Pharm Res. 2009. 26: 577-86). Los resultados sirvieron para determinar el porcentaje de células positivas para la transfección intracelular de siRNA.
Estudio del silenciamiento génico por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (real-time PCR)
ElARN total celularse aisló medianteun método estándar con tiocianatode guanidinio-fenol-cloroformo(TriPure Isolation Reagent, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). El ARN se transformó en cDNAyéste se utilizó para realizarla real-timePCR. Utilizamosla real-timePCRpara estudiarel silenciamientode distintosgenespormediode 100nMde siRNAvehiculizado con distintas concentracionesde compuestode fórmula general(I).Elgen beta-actina se utilizó como gen de referencia para todos los experimentos de real-time PCR. La reacción se realizó utilizando procedimientos estándar para la StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
En cadaexperimento, se calculóla media del ciclo umbral[cycle threshold(CT)]de los triplicadosde cada unode los genes estudiadosydelgen utilizado como referencia, pudiendoasícompararlaexpresión génica traslos diferentes tratamientos(Pharm Res. 2009. 26:577-86.;Cancer Res. 2007. 67:8156-8163).
Evaluación del grado de silenciamiento proteico por Western blot
Losextractos celularesse obtuvieronpor lisadoenTris-HCl50mM,pH7,4,NaCl150mM,EDTA1mM,Tritón X-100al1%, deoxicolato sódicoal1%y SDSal 0,1%e inhibidoresde proteasas (aprotinina5 µg/mly PMSF1 mM). Una vez lisadas las células se centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 15 minutos. La concentración de proteína presente en el sobrenadante, se determinó por el método de Bradford (Pierce; Rockford, IL, EEUU), usando seroalbúmina bovina como estándar. Las muestras conteniendo 40 µgde proteína total se aplicaron en cada pocillo de geles de poliacrilamida al 10-15% según la proteína a estudiar. Los geles se transfirieron por electroforesis a membranas de nitrocelulosa usando un “blotter” semi-seco. Las proteínas unidas a nitrocelulosa se visualizaron con Poinceau, seguidasdebloqueoconTTBS(50mMTris,pH7.5,200mMNaCl,0.1%Tween)con5%deleche desnataday, posteriormente, se incubaron conel anticuerpo primario correspondiente todala nochea 4ºC.Traslavados en TTBS, se aplicóel anticuerpo secundario durante1 horaa temperatura ambiente.La detección se realizó por quimioluminiscencia. La intensidad de las bandas se analizó por niveles de gris con un sistema de análisis de imagen apropiado (Quantity One)(Pharm Res. 2009. 26:1181-1191).
Resultados
Experimentos de retardo en gel, exclusión con heparina y efecto protector del complejo compuesto de fórmula general (I)-siRNA a la acción de RNAsas
Se incuban, durante30 minutosa temperatura ambiente,enunvolumen finalde50 µlenun tubo Eppendorf, 2,5µl de siRNA40 µMpara dar una concentración finalde2µMconteniendo un total de 6,02 x 1011 cargas negativas junto con una concentración del dendrímero compuesto de fórmula general (I)suficiente para dar una relación nitrógeno del dendrímero/fosfatode siRNA(N/P)de6:1y seva incrementandola cantidadde dendrímero manteniendofijala cantidadde siRNAhastallegara unarelaciónP/Nde 384:1 (figura1).Traslaincubación,se sometenlas muestrasa una electroforesisengeldeagarosaal1% durante15 minutosa60V,se incuba con bromurode etidioy se visualiza el siRNA con luz ultravioleta. Como puede observarse en la figura 1, a una relación P/N de 12:1 (concentración de compuesto de fórmula general (I) de 22 µM) todo el siRNA queda fijado por el dendrímeroy no se desplaza en el gel.
Ejemplo2
Síntesis de un compuesto de fórmula general (I)
En todas aquellas reacciones que requerían atmósfera inerte (argón) se emplearon técnicas estándar de Schlenk.
Para las reacciones en atmósfera inerte tanto el tetrahidrofurano (THF) como el diclorometano (CH2Cl2), de grado CHROMASOLV® (Aldrich), fueron purificados previamente utilizando un sistema de purificación de disolventes fabricadopor InnovativeTechnology.La etilendiaminase secóa temperatura ambiente sobre hidruro cálcico durante 2horas, se filtraronyse destilarona presiónreducida(30-40 mmde Hg),almacenándose sobre tamiz molecular(4 A˚).El MeOH se secó sobre óxidode calcio, se filtróyse destiló almacenándose sobre tamiz molecular(4 A˚).El resto de disolventes se utilizó sin purificación previa.
2.1. Esquema de síntesis
El compuesto1 es preparado de acuerdo con Synthesis, Characterization, and Optical Response of Dipolar and Non-Dipolar Poly(phenylenevinylene) Dendrimers. J. J. Org. Chem. 2001, 66(17), 5664-5670.
2.2 Síntesis de Compuesto 2
Sobre una disolución que contiene al trialdehído 1 (300 mg, 0.64 mmol) en CH2Cl2 anhidro (50 mL) con tamiz molecular seco, bajo argón, se adicionó gota a gota la etilendiamina (8.6mL, 128 mmol). La reacción se agitó durante 30 minutosy se filtró el tamiz molecular.A la disolución se adicionó,bajo argón, en primer lugar elborohidruro sódico (145 mg, 3.84 mmol)y,a continuación10mLde MeOH anhidro.Se deja reaccionar durantedos horas.Acontinuaciónse eliminael disolventeavacíoy se realizan3ciclosdedisolución-evaporación con unamezcla de tolueno/MeOH en relación 9:1 (10 mL) y una final con 10 mL de MeOH. Seguidamente el sólido blanco resultante es lavadoy centrifugado con3 fracciones de agua de5 mL,y el sólido es disuelto en CHCl3y secado con MgSO4 durante 2 horas. Tras filtrar y eliminar el disolvente a vacío el compuesto se purificó mediante lavado en caliente con THF obteniéndose 351 mg (0.58 mmol) (91%) del compuesto deseado como un sólido de color blanco.
1H-RMN (CD3OD, 500 MHz) δ: 2.73 (t, 6H, J=6Hz, -CH2-NH2), 2.83 (t, 6H, J=6 Hz, -NH-CH2-), 3.79 (s, 6H, -CH2-NH-), 7.21(AdeABq,3H, J = 16.5Hz, 3xCH=), 7.29(BdeABq,3H, J= 16.5 Hz, 3xCH=), 7.37 (A de ABq, 6H, J =7.5Hz, 6xArH), 7.58(BdeABq,6H, J = 7.5 Hz, 6xArH), 7.63 (s, 3H,ArH).
13CRMNyDEPT (CD3OD, 125 MHz) δ:140.27 (C), 139.62 (C), 137, 85 (C), 129.98 (CH), 129.92 (CH), 129.30 (CH), 127.78 (CH), 124.90 (CH),53.82 (-CH2-NH-), 50.59 (-NH-CH2-), 41.09 (-CH2-NH2).
2.3. Síntesis de Compuesto 3
Una disolución del compuesto 2 (0.250 g, 0.416 mmol) en MeOH (20 mL) fue enfriada a 0ºC en un baño de hielo. Una vez alcanzada esta temperatura se adicionó lentamente el acrilato de metilo (3.06 g, 35.53 mmol)y se dejó reaccionara temperatura ambiente durante4días.Acontinuación se eliminóel disolventeyelexcesode acrilato de metiloavacío,el compuestose purificó mediantelavadoen caliente conTHF dandolugara 0.324g(57%)del productobuscado como un sólidode color blanco.
1H-RMN (CDCl3, 500 MHz) δ:2.41 (t, 12H,J=7Hz, -CH2-CO-), 2.49 (t, 6H, J=7 Hz, -CH2-CO-), 2.54 (s, 12H, -N-CH2-CH2-N-), 2.74 (t, 12H, J=7Hz,-N-CH2-), 3.61(s,6H,-CH2-NH-), 3.65(s,18H, -OCH3), 3.67(s,9H,-CH2NH-), 7.14(AdeABq,3H, J = 16.5Hz, 3xCH=), 7.20(BdeABq,3H, J = 16.5Hz, 3xCH=), 7.31(AdeABq,6H, J =
8.5 Hz, 6xArH), 7.50 (B de ABq, 6H, J =8Hz, 6xArH), 7.55 (s, 3H, 3xArH).
13CRMN, DEPTygHSQC (CDCl3, 125 MHz) δ: 173.01 (-CO-), 172.94 (-CO-), 139.16 (C), 138.08 (C), 135.65 (C), 129.05 (3xCH=,6xArH), 127.88 (3xCH=), 126.42 (6xArH),123.72 (3xArH), 58.69 (-CH2-NH-), 52.12 (-NCH2-CH2-N-), 51.93(-N-CH2-CH2-N-), 51.52(CH3), 49.50(-CH2-NH-), 49.63(-N-CH2-), 32.66(-CH2-CO-), 32.52 (-CH2-CO-).
IR ν:1734 cm−1 (-CO2 −).
MALDI-TOF m/e: 1375.43 (M+H)+ y1397.45 (M+Na)+ .
2.4. Síntesis de Compuesto 4: (IR8)
Una disolucióndel compuesto3(324mg, 0.236mmol)en etilendiamina(10mL)fue agitada48 horasa temperatura ambiente.Acontinuación se eliminóel disolventeavacíoy se realizaron3 ciclosde disolución-evaporación con una mezclade tolueno/MeOH en relación 9:1(10mL)yuna final con10mLde MeOH.El compuesto se purificó mediantelavado en caliente con THFyse obtuvieron 384mg (85%) del compuesto4 como un sólido blanco.

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Compuesto de fórmula general(I)
    o una sal, prodroga o solvato del mismo;
    donde:
    Wse seleccionadel grupo formadopor cualquier polímeroo dendrímero derivadode polifenilenvinileno, polifenilenetilidenoo híbridode ambos, cualquier compuestoorgánico conjugadoque combine dobles enlaces, triples enlaces ounacomposicióndeambosensu estructura,cualquier sustitucióncongrupos electrodadoresoelectroatractoresdelas anteriores, cualquier compuesto orgánico conjugado que alterne en su estructura dobles enlaces, triples enlaces o una combinaciónde ambos con anillos aromáticosde fenilo, naftaleno,fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas comola citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores, cualquier compuesto orgánico no conjugado que contenga anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas comolacitosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores o cualquier combinación de los mismos;
    X1,X2yX3 son igualeso diferentesy se seleccionan entre cualquier heteroátomo,
    Y se seleccionade entre un grupo alquilo saturado o insaturado(C2-C12)o cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, arilo o heteroarilo,
    R1yR2 son igualeso diferentes unidosaun grupo amino primario, secundariooterciarioyse seleccionande entre hidrógeno, alquilo saturadooinsaturado(C1-C12), cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, ariloo heteroarilo,
    n representael númerode ramificacionesy es un número entero seleccionado entre1y10.
  2. 2. Compuestode fórmula general (II) según las reivindicaciones1
    o una sal, prodroga o solvato delmismo;
    donde:
    Wse seleccionadel grupo formadopor cualquier polímeroo dendrímero derivadode polifenilenvinileno, polifenilenetilidenoo híbridode ambos, cualquier compuestoorgánico conjugadoque combine dobles enlaces, triples enlaces ouna composicióndeambosensu estructura,cualquier sustitucióncongrupos electrodadoresoelectroatractoresdelas anteriores, cualquier compuesto orgánico conjugado que alterne en su estructura dobles enlaces, triples enlaces o una combinación de ambos con anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas comola citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitucióncon grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores, cualquier compuesto orgánico no conjugado que contenga anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas comola citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores o cualquier combinación de los mismos;
    X1,X2yX3 son igualeso diferentesy se seleccionan entre cualquier heteroátomo,
    Y se seleccionade entre un grupo alquilo saturado o insaturado(C2-C12)o cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, arilo o heteroarilo,
    R1yR2 son igualeso diferentes unidosaun grupo amino primario, secundarioo terciarioyse seleccionande entre hidrógeno, alquilo saturado o insaturado (C1-C12), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquenilo, arilo o heteroarilo,
    n representael númerode ramificacionesy es un número entero seleccionado entre1y10.
  3. 3.
    Compuestode fórmula general(I)ó(II) según cualquierade las reivindicaciones anteriores, donde pueden estar enformadesalyunidoselectrostáticamenteatrifluoroacetato,anióncloruro,DNA,RNA,siRNA,miRNA,antagomir, cualquier fármaco, anticuerpo, sonda, para el diagnóstico de enfermedades mediante técnicas de imagen o cualquier combinación de los mismos.
  4. 4.
    Compuestode fórmula general(I)o(II)según cualquieradelasreivindicaciones1 a3, dondeX1,X2yX3 son igualeso diferentesy se seleccionan entre nitrógenou oxígeno.
  5. 5.
    Compuestode fórmula general(I)o(II)según cualquieradelasreivindicaciones1 a4, dondeY se selecciona entre:
  6. 6.
    Compuestode fórmula (I),ó(II) según cualquierade las reivindicaciones1 a5, dondeR1aR2 pueden ser igualeso diferentesy se seleccionan independientemente entreH, cualquier amina sustituidao no sustituida, aminoácidos básicos, derivados del colesterol, ácido fólico, ácido láctico, dexametasona, azúcares, agentes lisosomotrópicos, heterociclos nitrogenados, cadenas hidrofílicas derivadas de poli-etilenglicol, cualquier diacrilato, cualquier aminoácido básicoylas siguientes estructuras:
  7. 7.
    Compuestode fórmula general(I),ó(II)según cualquieradelasreivindicaciones1 a6seleccionadodela lista que comprende:
  8. 8. Composiciónfarmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones1,3,45y6junto con unoo másexcipientesfarmacéuticamente aceptables.
  9. 9.
    Composiciónfarmacéutica caracterizada porque comprendeuncompuestode fórmula(II)segúnuna cualquiera de las reivindicaciones2,3,45y6, junto con unoo másexcipientesfarmacéuticamente aceptables.
  10. 10.
    Composición según una cualquiera de las reivindicaciones8y9 caracterizada porque comprende, además, uno o más principios activos.
  11. 11.
    Procedimiento de síntesis de los compuestos de fórmula general (I) caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
    donde:
    Wse seleccionadel grupo formadopor cualquier polímeroo dendrímero derivadode polifenilenvinileno, polifenilenetilidenoo híbridode ambos, cualquier compuestoorgánico conjugadoque combine dobles enlaces, triples enlaces ouna composicióndeambosensu estructura,cualquier sustitucióncongrupos electrodadoresoelectroatractoresdelas anteriores, cualquier compuesto orgánico conjugado que alterne en su estructura dobles enlaces, triples enlaces o una combinación de ambos con anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas comola citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitucióncon grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores, cualquier compuesto orgánico no conjugado que contenga anillos aromáticos de fenilo, naftaleno, fenantreno, antraceno, pirrol, furano, tiofeno, piridina, bases heterocíclicas aromáticas comola citosina, uracilo, adenina, timinayguanina,o cualquier sustitución con grupos electrodadores o electroatractores de las anteriores o cualquier combinación de los mismos;
    Ase selecciona entreX1,X2yX3
    X1,X2yX3 son igualeso diferentesy se seleccionan entre cualquier heteroátomo,
    Y se seleccionade entre un grupo alquilo saturado o insaturado(C2-C12)o cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, arilo o heteroarilo,
    R1yR2 son igualeso diferentes unidosaun grupo amino primario, secundarioo terciarioyse seleccionande entre hidrógeno, alquilo saturadoo insaturado(C1-C12), cicloalquilo(C3-C8), cicloalquenilo, ariloo heteroarilo,y
    n representael númerode ramificacionesy es un número entero seleccionado entre1y10.
  12. 12.
    Procedimiento para la obtención de un compuesto de fórmula general (II), donde se parte del compuesto de fórmula general(I)y serepitentodoslos pasosa-csegúnlareivindicación10.
  13. 13.
    Uso de un compuesto de fórmula general (I) ó (II) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la elaboración de un medicamento.
  14. 14.
    Uso del compuesto de fórmula (I)ó (II) según la reivindicación 13 para la elaboraciónde un medicamento para la prevención y/o tratamiento patologías como enfermedades del sistema nervioso, cualquier enfermedadque curse con la aparición de tumoresylas infecciones viriásicas, incluyendo las causadas por el virus del síndromede inmunodeficiencia humano (SIDA).
  15. 15.
    Uso delcompuestode fórmula(I), (II)o (III) según cualquierade las reivindicaciones1 a6parala elaboración de un kit de transfección de siRNA en cultivos primarios de células nerviosas, glia, células tumoralesycélulas primarias
  16. 16.Usodel compuestode fórmula(I),(II)o(III)según cualquieradelasreivindicaciones1 a6 enterapiagénica como vector no viral.
  17. 17.Usodel compuestode fórmula(I),(II)o(III)según cualquieradelasreivindicaciones1a6parala elaboración de sondas para el diagnóstico de enfermedades mediante técnicas de imagen.
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