ES2369883T3

ES2369883T3 - Péptidos con actividad apoptótica.

Info

Publication number: ES2369883T3
Application number: ES02805332T
Authority: ES
Inventors: Mark Andre Freyberg; Peter Friedl; Dirk Kaiser
Original assignee: Cytotools AG
Current assignee: Cytotools AG
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2022-12-18
Also published as: ES2583032T3; US7892556B2; EP2332964B1; US9017693B2; US20050222020A1; WO2003054009A2; ATE517117T1; AU2002366739A8; EP2332964A1; AU2002366739A1; EP1458748B1; US20110178000A1; JP2005526013A; JP4384494B2; WO2003054009A3; DE10163130B4; DE10163130A1; EP1458748A2

Abstract

Medicamento para el tratamiento de la arteriosclerosis, que comprende al menos una sustancia de actividad apoptótica o una sal farmacéuticamente aceptable de la sustancia de actividad apoptótica y un soporte farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque la sustancia de actividad apoptótica comprende al menos una porción peptídica con una de las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID nºs 1 a 11 y es de actividad anti-apoptótica, y la sustancia de actividad apoptótica es un péptido que presenta una longitud de cadena de < 100 aminoácidos.

Description

Péptidos con actividad apoptótica.

La presente invención se refiere a péptidos con actividad apoptótica, así como a su uso para la preparación de medicamentos.

La apoptosis es un programa de suicidio genéticamente codificado, el cual es inducido en células eucarióticas bajo determinadas condiciones fisiológicas o patológicas.

Se comentan estados patológicos en los cuales la apoptosis tiene efectos negativos y para cuyo tratamiento debe ser inhibida la apoptosis.

Un ejemplo de una enfermedad de este tipo es la ateriosclerosis. En particular, por parte de los inventores pudo demostrarse ya con anterioridad que, precisamente en la zona de las placas ateroscleróticas se manifiestan células apoptóticas (en particular: células endoteliales, células de la musculatura lisa), y que esta manifestación es reforzada por relaciones de flujo perturbadas, es decir, es dependiente del flujo (Freyberg et al., BBRC, 286, 141-149, 2001). Además, los inventores pudieron demostrar que sustancias que inhiben la unión de TSP-1 a lAP y/o av�3 pueden también inhibir ampliamente la apoptosis dependiente del flujo.

Existe, por lo tanto, una alta demanda de sustancias que influyan sobre la apoptosis de forma negativa. En particular, sería favorable poder inhibir la apoptosis dependiente del flujo y ligada de forma causal a la aterosclerosis. Además, existe una elevada demanda de formulaciones farmacéuticas que contengan este tipo de sustancias y que pueden emplearse para el tratamiento de afecciones en las que esté indicada la inhibición de la apoptosis, en particular para el tratamiento de la arteriosclerosis. En este caso, estas sustancias deben ser de un peso molecular lo más bajo posible y/o péptidos pequeños, con el fin de garantizar una buena disponibilidad.

Por lo tanto, era misión de la presente invención proporcionar sustancias de actividad apoptótica, preferiblemente péptidos. En particular, otra misión de la presente invención era proporcionar sustancias, preferiblemente péptidos, que puedan inhibir una apoptosis de las células endoteliales, dependiente del flujo e inducida por TSP-1. Otra misión de la presente invención era proporcionar preparados farmacéuticos con los cuales se puedan tratar enfermedades en las que esté indicada la inhibición de la apoptosis.

Estos y otros problemas, no mencionados explícitamente, pero que resultan sin más de la reseña que antecede, son resueltos por los ejemplos de realización de la presente invención, definidos en las reivindicaciones.

En particular, este problema se resuelve al proporcionar medicamentos para el tratamiento de la arteriosclerosis según la reivindicación 1, que comprenden péptidos con una de las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID NOs 1 a 11.

Bajo un ejemplo de realización preferido de la presente invención se trata en este caso de sustancias inhibidoras de la apoptosis que comprenden secuencias de aminoácidos de la fórmula general (1):

R-A1-Y-V-V-M,

en donde A1 representa A, D, E, G, M, N, T, W o Y, o sales farmacéuticamente aceptables de estas sustancias.

Para los fines de la presente invención, se utiliza el código internacional usual de una letra para aminoácidos, A representa, por lo tanto, alanina (Ala), C representa cisteína (Cys), D representa ácido aspártico (Asp), E representa ácido glutámico (Glu), F representa fenilalanina (Phe), G representa glicina (Gly), L representa leucina (Leu), M representa metionina (Met), N representa asparagina (Asn), P representa prolina (Pro), R representa arginina (Arg), S representa serina (Ser), T representa treonina (Thr), V representa valina (Val), W representa triptófano (Trp) e Y representa tirosina (Tyr). Los L-aminoácidos se simbolizan en este caso por mayúsculas y los D-aminoácidos se simbolizan por el empleo de minúsculas.

Bajo un punto de vista particularmente preferido, la presente invención se refiere, por lo tanto, a sustancias inhibidoras de la apoptosis, preferiblemente péptidos, que comprenden una de las secuencias de péptidos mostradas bajo SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 11, o sus correspondientes sales farmacéuticamente aceptables.

Además, la presente invención se refiere al uso de las sustancias de acuerdo con la invención, preferiblemente proteínas o péptidos que comprenden al menos una de las secuencias de aminoácidos representada en las SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 11, para la preparación de medicamentos para el tratamiento de la arteriosclerosis.

Sorprendentemente, por parte de los autores de la invención se demostró que péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula (1) inhiben en una medida extremadamente intensa la apoptosis. En particular, estos péptidos son extraordinariamente adecuados para inhibir la apoptosis de células endoteliales, dependiente del flujo e inducida por TSP-1. Sin embargo, se presume que estos péptidos están en condiciones de inhibir la apoptosis en otras células.

Como ejemplos de realización de la presente invención muy particularmente preferidos, se proporcionan los siguientes péptidos/secuencias de péptidos:

1.: R-A-Y-V-V-M (SEQ ID NO 1)

2.: R-W-Y-V-V-M (SEQ ID NO 2)

3.: R-Y-Y-V-V-M (SEQ ID NO 3)

4.: R-E-Y-V-V-M (SEQ ID NO 4)

5.: K-R-A-Y-V-V-M-W-K-K (SEQ ID NO 5)

6.: K-R-E-Y-V-V-M-W-K-K (SEQ ID NO 6)

7.: R-G-Y-V-V-M (SEQ ID NO 7)

8.: R-M-Y-V-V-M (SEQ ID NO 8)

9.: R-T-Y-V-V-M (SEQ ID NO 9)

10.: R-N-Y-V-V-M (SEQ ID NO 10)

11.: R-D-Y-V-V-M (SEQ ID NO 11)

Para los fines de la presente invención, por el término “péptido” se entiende una sustancia que se compone de una cadena de 2 o más aminoácidos unidos a través de enlaces péptido. En particular, péptidos de acción apoptótica de acuerdo con la invención presentan una longitud de cadena de < 100 aminoácidos, preferiblemente < 75, de manera particularmente preferida de < 50, de manera muy particularmente preferida de < 25 y de la forma más preferida de < 15 aminoácidos.

Por lo tanto, para los fines de acuerdo con la invención, se prefieren particularmente péptidos que comprenden una de las SEQ ID NOs 1-11 y que en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal comprenden en cada caso 1 a 3 aminoácidos adicionales.

Para los fines de la presente invención, por “actividad apoptótica” se entiende que la adición de la correspondiente sustancia en el sistema de ensayo mostrado en los Ejemplos 5 y 6 genera un índice de inhibición positivo o negativo. En particular, para ello se cultivan células endoteliales, de manera particularmente preferida HUVEC, en un medio que contiene 1 μg de TSP-1 por cada ml. Los valores en porcentaje de la apoptosis de este testigo positivo sirven entonces, como se muestra en los Ejemplos, para el cálculo del índice de inhibición para las sustancias que se emplean como inhibidores potenciales junto con el inductor TSP-1 en investigaciones paralelas. Un testigo negativo indica la ausencia de demás inductores.

Un índice de inhibición positivo indica en este caso que la sustancia correspondiente inhibe la apoptosis. Un índice de inhibición negativo indica en este caso que la sustancia utilizada induce la apoptosis, es decir, intensifica la apoptosis inducida por TSP-1.

No obstante, los péptidos nativos presentan, a menudo, una escasa estabilidad metabólica frente a las peptidasas y una biodisponibilidad relativamente mala.

Partiendo de los péptidos arriba mostrados, el experto en la materia puede desarrollar, sin una actividad inventiva, toda una serie de compuestos derivados que poseen un modo de acción similar o equiparable y que, entre otros, se denominan también miméticos de péptidos.

En calidad de miméticos de péptidos se designan en este caso, para los fines de la presente invención, compuestos que imitan la estructura de péptidos y que, en calidad de ligandos, están en condiciones de imitar (agonista) o bloquear (antagonista) la actividad biológica en el plano del receptor/enzima. Ante todo, los miméticos de péptidos deben presentar una biodisponibilidad mejorada y una estabilidad metabólica mejorada. El tipo de mimetismo puede

abarcar desde la estructura de partida ligeramente modificada hasta el no péptido puro. Véase, por ejemplo, A. Adang et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 113 (1994), 63-78. En principio, se ofrecen las siguientes posibilidades para el mimetismo/derivatización de una estructura peptídica:

•: Uso de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos

•: Modificacion de la cadena lateral de aminoacidos

•: Variacion/prolongación de la cadena principal del péptido

•: Ciclacion para la estabilizacion de la conformacion

•: Uso de moldes que obligan a una estructura secundaria determinada

•: Uso de una columna vertebral no peptidica, la cual imita con restos/cadenas laterales adecuados la estructura del péptido

Mientras que la estabilidad proteolítica de un péptido puede ser aumentada por la sustitución de L-aminoácidos por D-aminoácidos, la modificación de las cadenas laterales de uno de los aminoácidos conduce a menudo a una mejora de las propiedades de unión de todo el péptido.

En el caso de la modificación de la columna vertebral del péptido tiene lugar, por norma general, un intercambio de un grupo amida por agrupaciones similares a amida (J. Gante, Angew. Chem. 106 (1994), 1780-1802). Mediante estas medidas se puede influir tanto sobre la afinidad de unión como sobre la estabilidad metabólica del péptido nativo.

Mediante la ciclación de un péptido lineal se establece su flexibilidad y, con ello, su conformación global. En la fijación de la conformación biológicamente activa se aumenta la afinidad del péptido por el receptor, dado que la reducción de la entropía en la unión es menor que en la unión de un péptido lineal flexible. Para este fin, cadenas laterales de aminoácidos, que no participan en el reconocimiento del receptor se enlazan entre sí o con la columna vertebral del péptido.

La estructura secundaria del péptido juega un papel decisivo para el reconocimiento molecular del receptor. Junto a la hélice a y la hoja plegada �, los denominados giros en calidad de puntos de infle<i

ón en la cadena peptídica son importantes elementos de conformación. El reemplazo de estas unidades estructurales por un eslabón el cual, tras la incorporación en un péptido, estabiliza una estructura secundaria definida, ha conducido al concepto del mimético de la estructura secundaria.

También la solubilidad en agua de los péptidos puede aumentarse, por ejemplo, mediante la introducción de derivados de S- y C-glicopéptidos. Otras medidas pueden ser, por ejemplo, la PEGilación de los péptidos.

También puede aumentarse la lipofilia de los hexapéptidos, por ejemplo al colgar a la secuencia de péptidos, por ejemplo, fenilalaninas.

La ciclación o bien la modificación N-terminal de péptidos se describe, p. ej., por Borchard, Journal of controlled Release 62 (1999), 231-238 y por Blackwell et al., J. Org. Chem. 10 (2001), 5201-302.

Por lo tanto, resulta claro que el experto en la material, partiendo del conocimiento impartido por la presente invención, puede acceder fácilmente a toda una serie de miméticos de péptidos derivados, los cuales están todos, sin embargo, comprendidos por la presente invención.

Bajo otro punto de vista preferido, la presente invención proporciona, por lo tanto, también miméticos de péptidos que se derivan de las SEQ ID NOs 1-11, así como sustancias que comprenden a este tipo de miméticos de péptidos.

En particular, la presente invención proporciona, bajo otro punto de vista preferido, el uso de miméticos de péptidos que se derivan de las SEQ ID NOs 1-11, y a sustancias que comprenden a este tipo de miméticos de péptidos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la arteriosclerosis.

Sustancias de acuerdo con la invención, que son componentes activos de un preparado farmacéutico son disueltas, en general, en un soporte farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables pueden ser disoluciones tampón tal como tampón fosfato o tampón citrato. Para conservar la actividad de los péptidos pueden añadirse también reactivos que sean farmacéuticamente aceptables y que mantengan, por ejemplo, un medio reductor en el preparado farmacéutico.

La dosificación y posología específicas depende para cada uno de los pacientes de un número de factores, incluida la actividad de los compuestos específicos utilizados, la edad del paciente, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la alimentación, el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción, el compuesto con otros medicamentos y la gravedad de la enfermedad particular, para los que se aplique la terapia. Son calculadas por el médico en función de estos factores.

Medicamentos peptídicos se administran habitualmente por vía parenteral, p. ej. mediante un spray de inhalación, por vía rectal, mediante técnicas de inyección e infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular e intratecal, o exteriormente en formulaciones farmacéuticas que contienen soportes, adyuvantes y vehículos convencionales y farmacéuticamente aceptables. En función del tipo de sustancia identificada, entran en consideración también otras vías de administración, p. ej la oral. En el caso de la cicatrización, los identificados de acuerdo con la invención se administran preferiblemente en forma de pomadas o polvos espolvoreables.

La invención proporciona asimismo composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de una sustancia apoptóticamente activa, preferiblemente de un péptido, proteína o mimético de péptido, en combinación con un soporte farmacéutico convencional. Un soporte farmacéutico es, p. ej., una carga sólida o líquida, un material de encapsulación o un disolvente. Ejemplos de materiales que pueden servir como soportes farmacéuticos son azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidón tal como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; sebo; soportes medicamentosos tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semillas de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; polioles tales como propilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laureato de etilo; agar, agentes tampón tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; disolución salina isotónica; disolución de Ringer, alcohol etílico y disoluciones de tampón fosfato, al igual que también otras sustancias no tóxicas compatibles que se utilizan en formulaciones farmacéuticas. Humectantes, emulsionantes y agentes deslizantes tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, al igual que colorantes, agentes de revestimiento así como agentes de perfume y sustancias conservantes pueden estar asimismo presentes en los preparados, de manera correspondiente a los requisitos del galénico. La cantidad del principio activo que se combina con los materiales de soporte con el fin de producir una dosis individual variará en función del paciente tratado y del método especial de administración.

Sales farmacéuticamente aceptables de las sustancias de acuerdo con la invención, preferiblemente péptidos, proteínas o miméticos de péptidos, pueden prepararse por una vía bien conocida, por ejemplo mediante disolución de los compuestos de acuerdo con la invención en el correspondiente ácido o base diluido, p. ej. ácido clorhídrico o lejía de sosa, y subsiguiente liofilización. Sales de metales se pueden obtener mediante disolución de los compuestos de acuerdo con la invención en disoluciones que contienen el ion correspondiente, y subsiguiente aislamiento del compuesto a través de HPLC o procedimientos de permeación en gel.

Los siguientes Ejemplos explican la invención con mayor detalle:

EJEMPLO 1: Cultivo de células endoteliales humanas procedentes de venas del cordón umbilical (HUVEC)

Disoluciones (estériles): Medio de cultivo: medio basal IF + NCS al 15% (v/v), 5 μg/ml de transferrina, 5 μg/ml de heparina, 0,7 μg/ml de FGF, L-glutamina 2 mM [medio basal IF: mezcla 1:1 a base de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) y F12 de Ham, ambos de Life Technologies, Paisley (Inglaterra)] NCS: suero de terneros neonatales (Sebak, Aidenbach) FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos (preparación propia, purificado a partir de cerebro de cerdo)

Materiales: Recipientes para el cultivo de células, gelatinizados

Realización: El cultivo de HUVEC tiene lugar en recipientes de cultivo revestidos con gelatina a 37ºC, 5% de CO2 y atmósfera saturada con vapor de agua. El medio de cultivo se sustituye cada 2-3 días; en el caso de confluencia, las células se hacen pasar con una tasa de división de 1:3 a 1:5. Las HUVEC crecen fuertemente inhibidas en su contacto y forman céspedes de células monocapa con la típica morfología de empedrado. En el caso de confluencia, los cultivos alcanzan densidades celulares de 4-9 x 104 células/cm2. Para los análisis de la apoptosis se utilizan exclusivamente cultivos de HUVEC de los pasajes 1-4.

Revestimiento de recipientes de cultivo:

Disoluciones (estériles): Disolución de gelatina, al 1% (v/v) en agua milli-Q Suspender 1 g de gelatina (testada en el cultivo celular) en 100 ml de agua milli-Q, disolver mediante autoclave durante 20 min a 121ºC y 2 bar y almacenar a la temperatura ambiente. PBS (MaCl 140 mM, KCl 3 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 1,5 mM) 8 g/l de NaCl 0,2 g/l de KCl 1,44 g/l de Na2HPO4 x 2 H2O 0,2 g/l de KH2PO4 Disolver las sales en un volumen correspondiente de agua milli-Q, someter a autoclave durante 20 min a 121ºC y 2 bar y almacenar a la temperatura ambiente. Se verifica el valor del pH y éste se encuentra entre 7,2 y 7,4. Materiales: Recipientes para el cultivo de células

Realización: Para el cultivo de células que crecen de forma adherente, recipientes de cultivo se revisten con gelatina. El fondo de los recipientes de cultivo se cubre con disolución de gelatina estéril y los recipientes de cultivo de células se dejan durante 15 min a la temperatura ambiente. La disolución de gelatina se filtra con succión, los recipientes de cultivo de células se lavan una vez con PBS y pueden utilizarse de esta manera.

Subcultivo de células adherentes

Disoluciones (estériles): PBS Disolución de tripsina/EDTA Disolver tripsina al 0,05% (v/v) y EDTA al 0,02% (p/v) en PBS y filtrar en condiciones estériles.

Materiales: Recipientes para el cultivo de células, gelatinizados

Realización: Las células se desprenden por disolución de la superficie del cultivo con una disolución de tripsina/EDTA. El medio de cultivo se filtra con succión, el fondo del recipiente de cultivo se lava brevemente con PBS y se cubre con una disolución de tripsina/EDTA (~ 1 ml para un frasco de cultivo de 25 cm2). La disolución de enzimas se filtra de nuevo inmediatamente con succión de modo que quede una delgada película de líquido sobre las células. Las células se dejan durante 1-10 min a la temperatura ambiente y la separación por disolución de las células se vigila bajo el microscopio. La separación por disolución de las células puede ser acelerada mediante un suave golpeo en el borde del recipiente de cultivo. Las células se recogen en medio de cultivo de reciente aportación, eventualmente se recuentan y se siembran en nuevos recipientes de cultivo.

EJEMPLO 2: Determinación de la tasa de apoptosis mediante tinción de células apoptóticas con DAPI

DAPI pertenece al grupo de colorantes de indol y es un colorante DNS selectivo. El colorante es excitado a 340-360 nm, y el máximo de emisión se encuentra en 480 nm. Se emplea para los ensayos de la apoptosis [véase Cohen et al., Immunology Today, 14, Nº 3, 126-130 (1993)].

Valoración morfológica:

Disoluciones: PBS Disolución de formaldehido Formaldehído al 4% (v/v) en PBS Disolución DAPI (Molecular Probes, Leiden, Holanda) 2 μg/ml de DAPI en metanol Materiales: Placa de Petri (35 mm) con células en cultivo Realización: Se filtra con succión el sobrenadante del cultivo de una placa de Petri, el césped de células se fija sobre hielo durante 15 minutos con 1 ml de disolución de formaldehido, se lava dos veces con 2 ml de PBS, se mezcla durante 15 minutos con 0,5 ml de disolución de DAPI, se lava con PBS y se evalúa bajo el microscopio de fluorescencia. Se trabaja con un conjunto de filtros UV y un objetivo de 20 x o 40 x. Se seleccionan 500-1000 células al azar y se recuentan las células con núcleos apoptóticos.

El índice de la apoptosis se calcula según la fórmula siguiente:

Índice de apoptosis [%] = Número de células apoptóticas/número total de células x 100

Citometría de flujo:

Disoluciones: PBS Medio Etanol (p.a.) enfriado con hielo (-20ºC) Tampón DAPI Disolución madre DAPI Disolución de tinción DAPI

Realización: El sobrenadante del cultivo se filtra con succión y las células se tripsinizan sin lavarlas con PBS. La suspensión de células se recoge en un medio, se recuenta, se centrifuga a 800 x g durante 5 minutos, el sedimento se vuelve a suspender en 0,5 ml de IF y se añade gota a gota a 1,5 ml de etanol enfriado con hielo. La suspensión se almacena durante una noche a -20ºC. Después de centrifugación renovada y de re-suspensión del sedimento en 2 ml de PBS sigue una incubación durante media hora a 37ºC, otra centrifugación, re-suspensión del sedimento en 5 ml de disolución DAPI y recuento en el citómetro de flujo a una tasa de recuento de 50-300 episodios por segundo. La representación obtenida muestra un pico alto en células en la fase G1 del ciclo celular, seguido de una fracción de células en la fase S (intensidades de fluorescencia medias) y un último pico de elevadas intensidades de fluorescencia, el cual representa a las células en la fase G2. Células apoptóticas aparecen, condicionado por la cantidad de ADN absoluta decreciente por célula, en un sub-pico G1 [Darzynklewicz Z. et al., Cytometry, 13, 795-808 (1992); Zamai et al., Cytometry, 14, 891-897 (1993)]. Esto muestra la aparición de una apoptosis bajo las condiciones elegidas.

EJEMPLO 3: Inducción de la apoptosis y sistema de ensayo para péptidos o proteínas de actividad apoptótica en células endoteliales cultivadas

Las células se cultivan como se describe en el Ejemplo 1. Después de alcanzar la confluencia completa, las células se emplean para el ensayo. Primero se añade trombospondina 1 (1 μg/ml) a medio de reciente aportación y se compara con la acción de medio de reciente aportación sobre la tasa de apoptosis de HUVEC. La Tabla 1 muestra que la adición de trombospondina conduce a un incremento significativo de la tasa de apoptosis. La apoptosis observada en el caso de adición de medio de reciente aportación es inducida por la trombospondina secretada durante la duración del experimento.

Tabla 1: Inducción de la apoptosis en HUVEC con TSP-1

Medio de cultivo: Tasa de apoptosis (%) después de 24 h

Medio de reciente aportación: 0,9 ± 0,1

Reciente + TSP-1 (1 μg/ml): 3,0 ± 0,4

EJEMPLO 4: Síntesis de péptidos

Los péptidos utilizados fueron sintetizados según las premisas de CytoTools por parte del NMI (Instituto de Ciencias Naturales y Médico de la Universidad de Tübingen, Reutlingen, Alemania).

EJEMPLO 5: Identificación de péptidos hexámeros de actividad apoptótica con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invención

Las células se cultivan como se describe en el Ejemplo 1. Las células se siembran en los respectivos recipientes de cultivo (p. ej. placa de 24 pocillos/0,5 ml por cavidad) y, tras alcanzar la confluencia completa, se emplean para el ensayo. Las células se abastecen con medio nuevo:

(a): Medio de cultivo reciente [tasa base de la apoptosis],

(b): Medio reciente con 1 μg/ml de TSP-1 [sustancia inductora de la apoptosis; control],

(c): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 1, 1 mM

(d): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 2, 1 mM

(e): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 3, 1 mM

(f): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 4, 1 mM

(g): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 7, 1 mM

(h): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 8, 1 mM

(i): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 9, 1 mM

(j): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 10, 1 mM

(k): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 11, 1 mM

(l): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 12, 1 mM

(m): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 13, 1 mM

(n): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 14, 1 mM

(o): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 15, 1 mM

(p): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 16, 1 mM

(q): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 17, 1 mM

(r): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 18, 1 mM

(s): Medio (b) + péptido de SEQ ID NO: 19, 1 mM

Después de 24 h de incubación bajo condiciones de cultivo (Ejemplo 1) se fijan las células, se tiñen con DAPI y se examinan morfológicamente bajo el microscopio de fluorescencia o se examinan por citometría de flujo. Se determinan las células apoptóticas y el número total de células y se calcula el índice de la apoptosis (porcentaje de células apoptóticas). En la Tabla 2 se indican los datos de 3 experimentos independientes con el dato de los valores medios y la desviación estándar. Péptidos de acción inhibidora presentan, de acuerdo con la invención, un índice de inhibición positivo, mientras que péptidos inductores presentan, de acuerdo con la invención, un índice de inhibición negativo.

Tabla 2: Se sometieron a ensayo los siguientes péptidos:

SEQ ID NO: Secuencia de aminoácidos Índice de la apoptosis [%] Índice de inhibición [%]*

K: Control 3,28 ± 0,55

(1): R-A-Y-V-V-M 0,83 ± 0,24 +75,3 ± 7,5

(2): R-W-Y-V-V-M 1,30 ± 0,26 +61,9 ± 7,7

(3): R-Y-Y-V-V-M 0,85 ± 0,17 +74,7 ± 5,0

(4): R-E-Y-V-V-M 1,04 ± 0,30 +69,0 ± 8,9

(7): R-G-Y-V-V-M 1,83 ± 0,37 +46,4 ± 11,1

(8): R-M-Y-V-V-M 1,84 ± 0,39 +44,2 ± 11,6

(9): R-T-Y-V-V-M 1,86 ± 0,36 +44,5 ± 9,8

(10): R-N-Y-V-V-M 2,06 ± 0,53 +39,5 ± 15,8

(11): R-D-Y-V-V-M 2,12 ± 0,47 +37,3 ± 14,0

(12): M-V-V-Y-F-R 4,40 ± 0,53 -34,1 ± 6,2

(13): R-A-Y-V-V-A 4,98 ± 0,3 -51,8 ± 6,0

(14): R-L-Y-V-V-M 6,41 ± 0,63 -95,4 ± 6,1

(15): R-P-Y-V-V-M 5,67 ± 0,54 -72,8 ± 6,4

(16): R-S-Y-V-V-M 6,86 ± 0,37 -108,4 ± 3,7

(17): R-C-Y-V-V-M 13,97 ± 0,35 -326,5 ± 3,6

(18): m-v-v-y-f-r 14,6 ± 0,75 -345,1 ± 5,1

(19): m-v-v-y-a-r 11,4 ± 0,63 -247,1 ± 5,4

*índice de inhibición positivo = sustancia inhibida; índice de inhibición negativo = sustancia inducida De acuerdo con la invención, el índice de inhibición se calcula como sigue:

-: índice de inhibición [%] = (índice de apoptosis medido · 100/control del índice de apoptosis) -100

EJEMPLO 6: Mejora del efecto de inhibición mediante prolongación de la cadena de aminoácidos

El cultivo de células y los ensayos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 5. Los péptidos utilizados están recogidos en la Tabla 3.

Tabla 3: Resultados con secuencias de péptidos prolongadas

Control: 8,73 ± 0,43

(5): K-R-A-Y-V-V-M-W-K-K 0,37 ± 0,22 +95,8 ±2,6

(6): K-R-E-Y-V-V-M-W-K-K 0,48 ± 0,22 +94,5 ± 2,5

*índice de inhibición positivo = sustancia inhibida; índice de inhibición negativo = sustancia inducida

Lista de Secuencias.

<110>: CytoTools GmbH

<120>: Péptidos con actividad apoptótica

<130>: C 88wo

<160>: 19

<170>: PatentIn version 3.1

<210>: 1

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 1

<210>: 2

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 2

<210>: 3

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 3

<210>: 4

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 4

<210>: 5

<211>: 10

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 5

<210>: 6

<211>: 10

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 6

<210>: 7

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 7

<210>: 8

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 8

<210>: 9

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 9

<400>: 18

<210>: 10

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 10

<210>: 11

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 11

<210>: 12

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 12

<210>: 13

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 13

<210>: 14

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 14

<210>: 15

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 15

<210>: 16

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 16

<210>: 17

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Péptido sintético

<400>: 17

<210>: 18

<211>: 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial a base de D-aminoácidos

<220>

<223>: Péptido sintético

<210>: 19

5: <211> 6

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial a base de D-aminoácidos

<220>

10: <223> Péptido sintético

<400>: 19

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Medicamento para el tratamiento de la arteriosclerosis, que comprende al menos una sustancia de actividad apoptótica o una sal farmacéuticamente aceptable de la sustancia de actividad apoptótica y un soporte farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque la sustancia de actividad apoptótica comprende al menos una

5 porción peptídica con una de las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID nºs 1 a 11 y es de actividad anti-apoptótica, y la sustancia de actividad apoptótica es un péptido que presenta una longitud de cadena de < 100 aminoácidos.
2.- Medicamento según la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia de actividad apoptótica es un péptido 10 que presenta una longitud de cadena de < 50 aminoácidos.
3.- Medicamento según la reivindicación 2, caracterizado porque la sustancia de actividad apoptótica es un péptido que presenta una longitud de cadena de < 25 aminoácidos.