ES2368943T3 - Uso de esterasas para separar materiales plásticos. - Google Patents

Abstract

Detergente o producto de limpieza, caracterizado porque lleva para-nitrobencilesterasas (PNB-esterasas).

Description

Uso de esterasas para separar materiales plásticos.

La presente invención se refiere a detergentes o productos de limpieza que contienen para-nitrobencilesterasas (pNB-esterasas) y a su uso en el acabado de fibras, sobre todo de tipo sintético, a los correspondientes procesos de limpieza y purificación, así como a otras posibles aplicaciones técnicas. Especialmente se refiere al uso de pNBesterasas como protección contra el “pilling” (formación de bolitas) o para disminuir o evitar su aparición, sobre todo en tejidos, en particular de fibras sintéticas, concretamente de fibras de poliéster, así como al uso de pNB-esterasas para separar materiales plásticos, en particular compuestos de poliéster.

Las esterasas constituyen en general un grupo de enzimas hidrolíticos con una gran variedad natural de substratos y tipos de reacción. La especificidad del substrato y la activación enzimática difiere respecto a las lipasas. De éstas es sabido que se activan mediante la interfase lípido/agua antes de hidrolizar substratos insolubles en agua con ácidos grasos de cadena larga. Según Arpigny (Arpigny, Jäger, 1999 Biochem. J. 343, p. 177-183) hay que distinguir tres clases de esterasas (EC 3.1.1): las auténticas lipasas (EC 3.1.1.3), las carboxilesterasas (EC 3.1.1.1) y varios tipos de fosfolipasas. De todos modos las funciones fisiológicas de muchas esterasas, como p.ej. las para-nitrobencilesterasas (pNB-esterasas), no se han aclarado hasta la fecha. Los enzimas esterolíticos se caracterizan usualmente por poseer regiones conservadas que comprenden la tríada catalítica y también por su capacidad de catalizar un amplio espectro de reacciones. En unas condiciones de reacción definidas cada hidrolasa tiene para un determinado substrato una preferencia estérica específica que puede designarse como su huella dactilar característica. Las esterasas pueden usarse para hidrolizar enzimáticamente ésteres de ácidos carboxílicos a sus correspondientes ácidos carboxílicos y alcoholes. También pueden emplearse para transesterificaciones y síntesis de ésteres. Su capacidad de actuación en sistemas tanto acuosos como no acuosos hace que las esterasas sean herramientas valiosas para la síntesis orgánica. En este caso las esterasas tienen especial interés en la síntesis de productos enantioméricamente puros.

Como condición previa para el uso comercial de las esterasas es deseable disponer de más información acerca de las propiedades biocatalíticas de las esterasas que catalizan la conversión de compuestos orgánicos.

Como “pilling” se entiende la extracción por fricción de fibrillas delgadas de tejidos o géneros de punto, las cuales se enrollan formando bolitas (borra, nódulos) y luego solo quedan unidas a la superficie del tejido o malla mediante unas pocas fibras sueltas. Cuando son de fibras sintéticas, estas pequeñas bolitas están firmemente adheridas a la superficie del tejido. Por lo tanto se buscan soluciones que por una parte reduzcan los nódulos ya desarrollados (desaglomeración) y por otra protejan las fibras contra su formación, a fin de evitar que aparezcan las antiestéticas bolitas.

Es conocido el uso de celulasas para el acabado “anti-pilling” del algodón y de otras fibras o tejidos naturales. Sin embargo las celulasas son poco adecuadas para tratar la formación de nódulos o bolitas de fibras sintéticas, como por ejemplo las de poliéster o las acrílicas.

Por consiguiente la presente invención tenía por objeto encontrar nuevas vías que fueran apropiadas para contrarrestar el “pilling”, especialmente de fibras de poliéster o acrílicas, y/o para cortar o descomponer las estructuras de tipo nodular en formación. Otro objetivo era proporcionar nuevas esterasas, sobre todo para su uso en detergentes y/o productos de limpieza.

Estos objetivos se logran mediante el uso de pNB-esterasas para el acabado de fibras, sobre todo de tipo sintético, particularmente para el acabado “anti-pilling” en detergentes y productos de limpieza, así como en agentes de acabado de tejidos, sobre todo en productos para su tratamiento previo y/o posterior que contengan pNB-esterasas, en procesos adecuados de acabado, limpieza y purificación, y mediante el uso de pNB-esterasas en detergentes y productos de limpieza, así como en otras posibles aplicaciones técnicas. La presente invención se refiere especialmente al uso de pNB-esterasas como protección contra el “pilling” (formación de bolitas) o para disminuir o evitar su aparición, sobre todo en tejidos, en particular los de fibras sintéticas, concretamente de fibras de poliéster, así como al uso de pNB-esterasas para separar materiales plásticos, en particular compuestos de poliéster.

Cuando se evita el “pilling” o se reducen las bolitas formadas sobre las fibras, especialmente en los tejidos, la prenda se hace más confortable, debido ante todo a una mayor suavidad, y conserva por más tiempo su buen aspecto.

Además se ofrecen detergentes y productos de limpieza apropiados y procesos idóneos de limpieza y purificación, así como posibilidades de empleo para este tipo de esterasas.

La solución estriba en el uso de para-nitrobencilesterasas (pNB-esterasas), sobre todo de aquellas que se pueden obtener a partir de microorganismos, en concreto de bacterias, preferentemente de bacterias del género Bacillus.

Para usar en los productos de la presente invención y en otras aplicaciones de la misma mencionadas más adelante son especialmente adecuadas las esterasas que, según los métodos citados bajo 2.4 en el apartado de ejemplos, muestran una actividad específica frente al substrato bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol de 0,1 hasta 30, preferiblemente de 0,6 hasta 20, especialmente de 0,7 hasta 15, con mayor preferencia de 0,9 hasta 10, sobre todo de 1 hasta 5, particularmente de 1,1 hasta 4, con mucha mayor preferencia de 1,5 hasta 3 (µmoles de ácido liberado)/ (min·mg de enzima). Estas esterasas han resultado especialmente ventajosas al usarlas en los productos o aplicaciones y métodos de la presente invención.

Son especialmente idóneas las esterasas con secuencias de aminoácidos idénticas a las indicadas en el protocolo de secuencias como SEQ ID NO. 1, 2, 4, 6, 11-14, 20-26, al menos en un 50%, preferiblemente en un 60%, especialmente en un 70%, preferentemente en al menos un 80%, con especial preferencia en al menos un 90%, preferiblemente en un 95% y sobre todo en un 100%, u homólogas de las mismas en al menos un 80%, preferiblemente en al menos un 85%, con especial preferencia en al menos un 90%, preferentemente en al menos un 95% y sobre todo en un 100%.

Se facilitan detergentes y productos de limpieza apropiados y procesos idóneos de limpieza y purificación, así como posibilidades de empleo para este tipo de esterasas. Por último se definen posibles aplicaciones técnicas para las esterasas encontradas.

Para usar en los productos de la presente invención y también en otras aplicaciones de la misma mencionadas más adelante son especialmente adecuadas las esterasas homólogas de la secuencia proteica indicada como SEQ ID NO. 12 en al menos un 50%, al menos un 55%, especialmente en al menos un 60%, preferiblemente en al menos un 65%, con especial preferencia en al menos un 70%, preferentemente en al menos un 75%, muy preferentemente en al menos un 80%, con especial preferencia en al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99%, sobre todo un 100%.

Homologar es comparar una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos con la de genes o proteínas conocidos. Se hace, por ejemplo, por alineamiento. El grado de homología es un porcentaje de identidad como el que puede determinarse, por ejemplo, siguiendo el método indicado por D. J. Lipman y W. R. Pearson en Science 227 (1985),

p. 1435-1441. Este dato puede referirse a toda la proteína o a la región correspondientemente relacionada. Un concepto de homología más amplio, la analogía, se refiere también a las variaciones conservadas, es decir aminoácidos con una actividad química similar a la observada, pues dentro de la proteína suelen desarrollar actividades químicas parecidas. En el caso de los ácidos nucleicos solo se conoce el porcentaje de identidad.

Por homologación pueden deducirse de la secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos las funciones de regiones individuales de la misma, así como la actividad enzimática de todo el enzima en cuestión. Las regiones homólogas de proteínas distintas son aquellas que tienen funciones comparables y pueden reconocerse por identidad o por sustituciones conservadas en la secuencia principal de aminoácidos. Incluyen aminoácidos individuales, regiones muy pequeñas, llamadas cajas, formadas por pocos aminoácidos, hasta regiones de mayor longitud en la secuencia de aminoácidos. Por tanto las funciones de las regiones homólogas también incluyen las funciones parciales más pequeñas entre las ejercidas por la proteína íntegra, como por ejemplo la creación de enlaces individuales de puente de hidrógeno para complejar un substrato o formar un complejo de transición. Otras regiones de la proteína que no intervienen propiamente en la reacción enzimática pueden modificarse de manera cualitativa o cuantitativa. Ello se refiere por ejemplo a la estabilidad del enzima, a la actividad, a las condiciones de reacción o a la especificidad del substrato.

El término esterasa se refiere a un enzima con actividad de esterasa o a una esterasa. Por lo tanto, además de las funciones de los pocos restos de aminoácido que forman parte del centro catalíticamente activo también entran en consideración todas las funciones resultantes del efecto de toda la proteína restante, o de una o más de sus partes, en las regiones con auténtica actividad catalítica. En la presente invención también se consideran como actividad esterolítica aquellas funciones modificadoras o actividades parciales coadyuvantes de una reacción de esterasa. A dichas funciones auxiliares o actividades parciales pertenece por ejemplo la fijación de un substrato, un producto intermedio o final, la activación o inhibición o intervención reguladora de la actividad hidrolítica. También puede tratarse, por ejemplo, de la formación de un elemento estructural alejado del centro activo. La segunda condición para ser una proteína con actividad de esterasa, según la presente invención, es naturalmente que la acción química de los restos propiamente activos, bien sola o por efecto adicional de las partes modificadoras, produzca una hidrólisis de los enlaces éster. Asimismo es posible modificar cualitativa o cuantitativamente las actividades de otras esterasas mediante una o más partes de la proteína según la presente invención, por ejemplo. Esta influencia en otros factores también se considera como actividad de esterasa. También son enzimas activos aquellas esterasas cuya actividad es bloqueada en un momento determinado, por ejemplo mediante un inhibidor. Lo importante es su aptitud esencial para la correspondiente reacción de esterasa.

En el sentido de la presente invención las para-nitrobencil-esterasas son aquellos enzimas capaces de catalizar la hidrólisis del para-nitrofenilacetato. Igualmente se prefieren todos los enzimas designados como para-nitrobencilesterasas en el banco de datos y se incluyen en las para-nitrobencil-esterasas de la presente invención.

Se prefieren especialmente aquellas esterasas que, según los métodos citados bajo 2.4 en el apartado de ejemplos, muestran una actividad específica frente al substrato bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol de 0,1 hasta 30, preferiblemente de 0,6 hasta 20, especialmente de 0,7 hasta 15, con mayor preferencia de 0,9 hasta 10, sobre todo de 1 hasta 5, particularmente de 1,1 hasta 4, con mucha mayor preferencia de 1,5 hasta 3 µmoles de ácido liberado/ min·mg de enzima. Estas esterasas han resultado especialmente útiles al usarlas en los productos o aplicaciones y métodos de la presente invención.

Se prefieren especialmente las esterasas homólogas de la secuencia proteica indicada como SEQ ID NO. 12 en al menos un 50%, al menos un 55%, especialmente en al menos un 60%, preferiblemente en al menos un 65%, con especial preferencia en al menos un 70%, preferentemente en al menos un 75%, muy preferentemente en al menos un 80%, con especial preferencia en al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99%. Se prefiere sobre todo la esterasa según la Seq ID nº 12 o fragmentos de esta esterasa, especialmente aquellos que poseen actividad de esterasa. Estas esterasas presentan en particular una estabilidad sorprendentemente buena a temperaturas y valores de pH elevados. Se encontró que estas esterasas eran estables o activas durante mucho tiempo a valores de pH alcalinos, incluso a una temperatura igual o superior a 60ºC.

Por lo tanto las esterasas de la presente invención son especialmente idóneas para usar a pH alcalino y a temperaturas altas, particularmente en detergentes para lavado en caliente, que suelen dar un pH alcalino, y sobre todo en detergentes de ropa blanca (temperatura de lavado 95ºC).

En el sentido de la presente invención todos los enzimas, proteínas, fragmentos, proteínas de fusión y derivados se incluyen en el término general proteínas, a no ser que deban citarse explícitamente como tales.

Como rendimiento de un enzima se entiende su eficacia en el ámbito técnico considerado, preferiblemente en el marco de un agente expresamente desarrollado. Se basa en la propia actividad enzimática, pero además depende de otros factores relevantes para el correspondiente proceso, como por ejemplo la estabilidad, la unión al substrato, la interacción con el material soporte del substrato o con otros ingredientes, y sobre todo de las sinergias.

En el sentido de la presente solicitud de patente, poder de lavado o poder detergente de un producto de limpieza se refiere al efecto que el producto en cuestión produce en los artículos sucios, por ejemplo en tejidos u objetos con superficies duras. Se evalúa la contribución de cada componente de dicho producto, por ejemplo de cada enzima, al poder de lavado o poder detergente de todo el detergente o producto de limpieza, pues de las características enzimáticas de un enzima no puede deducirse sin más su contribución al poder detergente de un producto. Aquí juegan otros factores como por ejemplo la estabilidad, la unión al substrato, la unión al objeto lavado o las interacciones con otros ingredientes del detergente o del producto de limpieza, sobre todo las sinergias, durante la eliminación de la suciedad.

La presente invención se basa en el conocimiento de que las p-nitrobencilesterasas, en particular aquellos enzimas que se hallan de forma natural en bacterias, sobre todo del género Bacillus, particularmente de las especies Bacillus licheniformis y subtilis, son adecuadas para disminuir o evitar la formación de nódulos (“pilling”) sobre fibras textiles o tejidos.

Los poliésteres son polímeros cuyos eslabones están unidos mediante enlaces éster. Los homopoliésteres pueden dividirse en dos grupos según su estructura química, los tipos de ácido hidroxicarboxílico (poliéster AB) y los tipos de ácido dihidroxidicarboxílico (poliéster AA-BB). Los primeros se obtienen a partir de un solo monómero p.ej. por policondensación de un ácido w-hidroxicarboxílico o polimerización de un éster cíclico (lactona) por apertura del anillo. En cambio los últimos se forman por policondensación de dos monómeros complementarios, p.ej. un diol y un ácido dicarboxílico. Se obtienen poliésteres ramificados y reticulados mediante la policondensación de alcoholes tri-o polifuncionales con ácidos carboxílicos polifuncionales. A los poliésteres también pertenecen genéricamente los policarbonatos (poliésteres del ácido carbónico). Los poliésteres del tipo AB (I) son, entre otros, ácidos poliglicólicos (poliglicólidos, R = CH2), ácidos polilácticos (polilactidas, R = CH-CH3), poli(ácido β -hidroxibutírico) [poli(ácido 3hidroxibutírico, R = CH(CH3)-CH2], poli-ε-caprolactonas [R = (CH2)5] y ácidos polihidroxibenzoicos (R = C6H4).

Los poliésteres del tipo AA-BB (II) puramente alifáticos son policondensados de dioles y ácidos dicarboxílicos alifáticos que, entre otras aplicaciones, se usan como productos con grupos hidroxilo terminales (como polidioles) para preparar poliésteres poliuretánicos [p.ej. politetrametilenadipato, R1 = R2 = (CH2)4]. Cuantitativamente tienen gran importancia industrial los poliésteres del tipo AA-BB formados por dioles alifáticos y ácidos dicarboxílicos aromáticos, sobre todo los polialquilentereftalatos [R2 = C6H4, siendo el polietilentereftalato (PET) R1 = (CH2)2, el polibutilentereftalato (PBT) R1 = (CH2)4 y el poli(1,4-ciclohexandimetilen-tereftalato (PCDT) R1 = CH2-C6H10-CH2] los más representativos. Las propiedades de estos tipos de poliéster se pueden modificar y adaptar ampliamente a distintos campos de aplicación, usando en la policondensación otros ácidos dicarboxílicos aromáticos (p.ej. ácido isoftálico) o mezclas de dioles.

Son poliésteres aromáticos puros los poliarilatos, a los cuales pertenecen los poli(ácido 4-hidroxibenzoico) (fórmula I, R = C6H4), los policondensados de bisfenol A y ácidos ftálicos (fórmula II, R1 = C6H4C(CH3)2C6H4, R2 = C6H4) o también los de bisfenoles y fosgeno).

Además de los poliésteres saturados ya citados también se pueden preparar poliésteres insaturados partiendo de ácidos dicarboxílicos insaturados, los cuales, como resinas de poliéster, concretamente de poliéster insaturado (UP), han adquirido gran importancia técnica.

En la naturaleza también se encuentran poliésteres, como los formados por ácidos hidroxicarboxílicos (por ejemplo: dépsidos y depsipéptidos). El ácido poli(β-hidroxibutírico) sirve como sustancia de reserva en muchas bacterias. Las abejas minadoras producen poliésteres a partir de los ácidos 18-hidroxioctadecanoico y 20-hidroxieicosanoico para revestir sus nidos.

Las pNB-esterasas se caracterizan por proporcionar una protección especialmente buena de las fibras textiles contra la formación de bolitas.

Son para-nitrobencilesterasas (p-nitrobencilesterasas, pNB-esterasas, EST-B) especialmente apropiadas en el sentido de la presente invención enzimas como los descritos en las solicitudes de patente US 5,468,632, US 5,906,930, US 5,945,325, EP 0549264.

También se prefiere especialmente el uso de para-nitrobencilesterasas con una secuencia de aminoácidos que sea idéntica de la indicada en SEQ ID NO. 1, 2, 4, 6, 11-14 o 20-25 al menos en un 50%, preferiblemente en al menos un 60%, especialmente en al menos un 70%, al menos en un 80%, al menos en un 85%, al menos en un 86%, al menos en un 87%, al menos en un 88%, al menos en un 89%, al menos en un 90%, al menos en un 91%, al menos en un 92%, al menos en un 93%, al menos en un 94%, al menos en un 95%, al menos en un 96%, al menos en un 97%, al menos en un 98%, al menos en un 99%, al menos en un 95% o en un 100% y/u homóloga de la misma %, al menos en un 80%, al menos en un 85%, al menos en un 86%, al menos en un 87%, al menos en un 88%, al menos en un 89%, al menos en un 90%, al menos en un 91%, al menos en un 92%, al menos en un 93%, al menos en un 94%, al menos en un 95%, al menos en un 96%, al menos en un 97%, al menos en un 98%, al menos en un 99%, al menos en un 95% o en un 100%.

Se prefieren especialmente aquellas p-nitrobencilesterasas que son idénticas en un 95%, con especial preferencia en un 98%, sobre todo en un 100%, a las secuencias de aminoácidos indicadas (1, 2, 4, 6, 11-14, 20-25).

En este caso se prefieren aquellas esterasas que según los métodos citados bajo 2.4 en el apartado de ejemplos, muestran una actividad específica frente al substrato bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol de 0,1 hasta 30, preferiblemente de 0,6 hasta 20, especialmente de 0,7 hasta 15, con mayor preferencia de 0,9 hasta 10, sobre todo de 1 hasta 5, particularmente de 1,1 hasta 4, con mucha mayor preferencia de 1,5 hasta 3 (µmoles de ácido liberado)/ (min·mg de enzima). Estas esterasas han resultado especialmente ventajosas al usarlas en los productos o aplicaciones y métodos de la presente invención.

Se prefieren especialmente aquellas esterasas que son homólogas de la secuencia proteica indicada como Seq. ID nº 12 en al menos un 50%, %, al menos en un 55%, especialmente en al menos un 60%, preferentemente en al menos un 65%, con especial preferencia en al menos un 70%, preferiblemente en al menos un 75%, sobre todo en un 80%, con especial preferencia en al menos un 85%, al menos en un 90%, al menos en un 95%, al menos en un 99%, sobre todo en un 100%.

Otro objeto de la presente invención es el uso de p-nitrobencilesterasas para separar polialquilentereftalatos, en concreto polietilentereftalatos (abreviados PET o PETE).

Las esterasas también pueden emplearse para separar o descomponer plásticos, sobre todo poliésteres y/o plastificantes contenidos en los plásticos. En los plásticos se utilizan frecuentemente ftalatos como plastificantes, a fin de mejorar sus propiedades para la transformación y el uso.

La presente invención se refiere a la separación parcial o total de piezas de moldeo, materiales textiles, revestimientos, uniones adhesivas o espumas de polímeros biológicamente degradables con enzimas. Sobre todo se refiere a la degradación enzimática de poliésteres. El método para descomponer polímeros se puede llevar a cabo de varias maneras:

El polímero se añade a la solución acuosa enzimática. El polímero biológicamente degradable puede añadirse en forma de film, lámina o granulado. Las piezas moldeadas pueden añadirse tal cual o trituradas. Los materiales revestidos o adheridos o los materiales recubiertos o pegados con polímeros biológicamente degradables, como, por ejemplo, papel o cartón y papel o cartón revestido, pueden incorporarse enteros o triturados a la solución enzimática.

Asimismo, la solución acuosa enzimática puede aplicarse o proyectarse por pulverización sobre el revestimiento o pieza moldeada que debe descomponerse.

Según la presente invención el método descrito de descomposición enzimática de polímeros biológica y enzimáticamente degradables y las mezclas elaboradas con los mismos se puede emplear, por ejemplo, para la inclusión de sustancias químicas, principios activos, hormonas, agentes auxiliares, enzimas, microorganismos, semillas vegetales (p.ej. en cápsulas y microcápsulas) y su liberación controlada mediante el uso de enzimas.

Así pues, aplicando el método de la presente invención, p.ej. en plantas procesadoras de basura, el medioambiente se puede librar rápidamente de polímeros biológicamente degradables o de sus mezclas.

Para ello se prefieren especialmente aquellas esterasas que según los métodos citados bajo 2.4 en el apartado de ejemplos, muestran una actividad específica frente al substrato bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol de 0,1 hasta 30, preferiblemente de 0,6 hasta 20, especialmente de 0,7 hasta 15, con mayor preferencia de 0,9 hasta 10, sobre todo de 1 hasta 5, en particular de 1,1 hasta 4, con mucha mayor preferencia de 1,5 hasta 3 (µmoles de ácido liberado)/ (min·mg de enzima). Estas esterasas han resultado especialmente ventajosas al usarlas en los productos o aplicaciones y métodos de la presente invención.

Se prefieren especialmente aquellas esterasas que son homólogas de la secuencia proteica indicada como Seq. ID nº 12 en al menos un 50%, %, al menos en un 55%, especialmente en al menos un 60%, preferentemente en al menos un 65%, con especial preferencia en al menos un 70%, preferiblemente en al menos un 75%, sobre todo en un 80%, con especial preferencia en al menos un 85%, al menos en un 90%, al menos en un 95%, al menos en un 99%, sobre todo en un 100%. También se prefieren especialmente aquellas mutaciones del enzima indicado como SEQ ID NO. 12 que mejoran aún más el efecto según la presente invención.

La secuencia nucleótida de una esterasa de Bacillus subtilis (17A1) utilizable según la presente invención está indicada en el protocolo de secuencias de la presente solicitud como SEQ ID NO. 3. Comprende 1470 pb. La secuencia aminoácida derivada de ésta se indica en SEQ ID NO. 1. Comprende 489 aminoácidos, seguidos de un codón de parada.

La secuencia nucleótida de una esterasa de Bacillus licheniformis (19C5) utilizable según la presente invención está indicada en el protocolo de secuencias de la presente solicitud como SEQ ID NO. 4. Comprende respectivamente 1470 pb. La secuencia aminoácida derivada de la misma se indica en SEQ ID NO. 2. Comprende 489 aminoácidos, seguidos de un codón de parada.

Por sus reconocibles coincidencias y su relación con las otras esterasas señaladas dichas esterasas pueden considerarse como p-nitrobencilesterasas.

Por lo tanto un objeto especial de la presente invención es el uso conforme a la misma de una esterasa con una secuencia aminoácida idéntica a las indicadas en SEQ ID NO. 1, 2, 5 o 6, al menos en un 70%.

Es más preferible el uso de aquellas esterasas cuya secuencia aminoácida es idéntica a las indicadas en SEQ ID NO. 1, 2, 5 o 6, sobre todo 1 o 2, respectivamente en un 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y 100%. Es de esperar que sus propiedades sean crecientemente análogas a las de las esterasas encontradas.

La forma de ejecución más preferida de este objeto de la presente invención es el empleo de una esterasa cuya secuencia aminoácida sea totalmente idéntica a las indicadas en SEQ ID NO. 1, 2, 5 o 6.

En este caso se trata de la nueva esterasa de Bacillus subtilis o licheniformis hallada y disponible por la presente invención.

Estas esterasas no se conocen en el estado técnico actual. Tal como se indica en los ejemplos se pueden aislar, producir y utilizar. Además se caracterizan porque, cuando se usan en un medio adecuado, su rendimiento se aproxima o incluso aventaja al de los enzimas arraigados para tal fin.

Como punto de partida para el desarrollo de esterasas de uso industrial en detergentes puede servir un enzima natural de origen microbiano, que luego puede optimizarse mediante métodos mutagénicos conocidos, como por ejemplo mutagénesis puntual, fragmentación, deleción, inserción o fusión con otras proteínas o partes de proteínas u otras modificaciones según la aplicación deseada. Estas optimizaciones pueden ser, por ejemplo, adaptaciones a la influencia de la temperatura, a oscilaciones del pH, a condiciones redox y/o a otros factores relevantes para el sector técnico de aplicación. Es deseable, por ejemplo, una mejora de la estabilidad a la oxidación, de la resistencia a los agentes desnaturalizantes o a la descomposición proteolítica, a las temperaturas altas, a medios ácidos o fuertemente alcalinos, una disminución de la actividad inmunogénica o del efecto alérgeno.

Los métodos mutagénicos se basan en una de las correspondientes secuencias nucleótidas, indicadas en SEQ ID NO. 3, 4, 7 u 8, o en secuencias nucleótidas suficientemente similares a ellas. Los correspondientes métodos de biología molecular están descritos en el estado técnico, por ejemplo en manuales como el de Fritsch, Sambrook y Maniatis “Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York, 1989. Una forma de ejecución preferida consiste en usar todas las proteínas enumeradas hasta ahora, las cuales se caracterizan por haberse obtenido mediante derivación adicional.

Como derivados se entienden las proteínas resultantes de modificar adicionalmente las mencionadas proteínas.

Estas modificaciones pueden influir por ejemplo en la estabilidad, en la especificidad del substrato o en la fuerza de unión al mismo, o en la actividad enzimática. También pueden servir para disminuir la capacidad inmunogénica o alérgena de la proteína, aumentando así, por ejemplo, su compatibilidad con la piel.

Estos procesos de derivación pueden ser por ejemplo biológicos, tal vez relacionados con la síntesis proteica del organismo huésped productor. En tal caso cabe destacar los acoplamientos de compuestos de bajo peso molecular, como lípidos u oligosacáridos.

No obstante los procesos de derivación también pueden ser químicos, como es el caso de la transformación química de una cadena lateral o la unión covalente de otro compuesto, por ejemplo macromolecular, a la proteína. Así, por ejemplo, es posible acoplar aminas a grupos carboxilo de un enzima, para variar su punto isoeléctrico. Se pueden fijar, por ejemplo, macromoléculas de tipo proteico a proteínas de la presente invención, mediante compuestos químicos más o menos bifuncionales. Por ejemplo, una proteína de la presente invención se puede dotar de un dominio de fijación mediante un conector. Estos derivados son especialmente adecuados para los detergentes o productos de limpieza. De modo análogo a la patente WO 00/01831 también pueden unirse inhibidores de esterasas mediante conectores, en concreto aminoácidos conectores, a las proteínas de la presente invención. Los acoplamientos con otros compuestos macromoleculares, como por ejemplo polietilenglicol, mejoran otras propiedades de la molécula como la estabilidad o la compatibilidad con la piel.

En un sentido más amplio, también pueden considerarse derivados de las proteínas de la presente invención los preparados de estos enzimas. Según su proceso de obtención, elaboración o preparación una proteína va asociada con diversas sustancias, procedentes por ejemplo del cultivo de los microorganismos productores. Una proteína también puede estar mezclada selectivamente con ciertas sustancias, por ejemplo, para aumentar su estabilidad. Por tanto cualquier preparado de una proteína de la presente invención se incluye en ésta, independientemente del hecho de que en un determinado preparado despliegue o no esta actividad enzimática, pues puede ser conveniente que tenga poca o ninguna actividad durante el almacenamiento y solo ejerza su función estereolítica en el momento del uso, lo cual puede regularse, por ejemplo, mediante sustancias auxiliares adecuadas.

Una forma de ejecución preferida consiste en utilizar todas las proteínas mencionadas hasta ahora, con la característica adicional de estar estabilizadas.

Así se aumenta su estabilidad durante su almacenamiento y/o uso, por ejemplo durante el proceso de lavado, con lo cual se prolonga y refuerza su acción. La estabilidad de las esterasas de la presente invención se puede aumentar, por ejemplo, acoplándolas a polímeros. Para ello es necesario unir las proteínas a tales polímeros, mediante una etapa de acoplamiento químico, antes de utilizarlas en los medios correspondientes.

Se prefieren las estabilizaciones por mutagénesis puntual de la propia molécula, porque no requieren ninguna operación adicional tras la obtención de la proteína. En el estado técnico se conocen algunas mutaciones puntuales adecuadas para ello.

Otras posibilidades son por ejemplo: -la sustitución de determinados restos de aminoácido por prolina, -la introducción de grupos polares o cargados en la superficie de la molécula.

Otra posibilidad de estabilización frente a temperaturas altas y a la acción de los tensioactivos consiste en sustituir los aminoácidos situados del extremo N-terminal por aquellos que entran en contacto con el resto de la molécula mediante interacciones no covalentes, contribuyendo así a mantener la estructura globular.

Las formas de ejecución preferidas son aquellas en que la molécula está estabilizada de varias maneras. Se puede partir del hecho de que varias mutaciones estabilizadoras tienen un efecto aditivo.

En una forma de ejecución preferida se usan aquellas proteínas mencionadas hasta ahora que se caracterizan por la posibilidad de ser obtenidas de una fuente natural, sobre todo de un microorganismo.

Se puede tratar, por ejemplo, de hongos o bacterias unicelulares, pues en la mayoría de los casos son más fáciles de conseguir y manipular que los organismos pluricelulares o que los cultivos celulares de metazoos, aunque éstos pueden ser una buena opción para formas de ejecución especiales y por tanto no deben excluirse por principio del objeto de la presente invención.

Es posible que los productores naturales generen un enzima según la presente invención, pero en las condiciones antes citadas solo lo expresarán y/o cederán en pequeña medida al medio circundante. Pero esto no excluye que se puedan determinar experimentalmente unas condiciones ambientales apropiadas u otros factores, cuyo efecto favorezca una producción económicamente rentable de la proteína de la presente invención. Un mecanismo regulador de este tipo se puede usar selectivamente para la producción biotecnológica. Si ello tampoco es factible, siempre pueden servir para aislar el gen correspondiente.

Entre ellas se prefieren especialmente las procedentes de bacterias gram-positivas, ya que éstas no poseen ninguna membrana externa y por tanto ceden inmediatamente las proteínas secretadas al medio circundante.

Se prefieren sobre todo las procedentes de bacterias gram-positivas del género Bacillus.

Las esterasas de Bacillus presentan a priori buenas propiedades para diversas aplicaciones técnicas, entre ellas cierta estabilidad a temperatura elevada y a los agentes oxidantes o desnaturalizantes. Además las mayores experiencias en cuanto a producción biotecnológica se han realizado con enzimas microbianos, en lo que respecta por ejemplo a la construcción de vectores de clonación ventajosos, a la selección de células huésped y condiciones de crecimiento o a la evaluación de riesgos, como por ejemplo el poder alergénico. Asimismo, como microorganismos productores de rendimiento especialmente elevado, los bacilos están implantados en los procesos industriales. La experiencia acumulada de que se dispone para la preparación y el uso de estos enzimas también favorece su posterior desarrollo según la presente invención, sobre todo, por ejemplo, en lo referente a su compatibilidad con otros compuestos químicos, como por ejemplo los ingredientes de los detergentes o productos de limpieza.

Entre las especies de Bacillus se prefieren a su vez el Bacillus subtilis o el licheniformis.

De ambas se obtuvieron originalmente las formas de ejecución de los enzimas de la presente invención. Las correspondientes secuencias están indicadas en el protocolo de secuencias. De estas o parecidas cepas se pueden obtener las variantes arriba descritas, sobre todo empleando métodos estándar de biología molecular como por ejemplo PCR y/o métodos de mutagénesis puntual ya conocidos.

Como células huésped para la expresión proteica de esterasas utilizables según la presente invención sirven en principio todos los organismos no humanos, es decir procariotas, eucariotas o cianófitos. Se prefieren las células huésped fáciles de manipular genéticamente por lo que se refiere, por ejemplo, a la transformación con el vector de expresión, a su implantación estable y a la regulación de la expresión, por ejemplo hongos o bacterias unicelulares. Además las células huésped preferidas se caracterizan por su facilidad de manipulación microbiológica y biotecnológica, es decir, por ejemplo, facilidad de cultivo, elevados índices de crecimiento, pequeñas exigencias en cuanto a medios de fermentación y buenos niveles de producción y secreción de proteínas extrañas. Preferentemente se eligen cepas de laboratorio orientadas a la expresión, que pueden adquirirse en el comercio o a través de bancos de cepas que son accesibles. Así, teóricamente, cada proteína de la presente invención puede obtenerse a partir de un gran número de organismos huésped. Dada la gran cantidad de distintos sistemas disponibles según el estado técnico, los sistemas óptimos de expresión deben averiguarse experimentalmente para cada caso. Las bacterias preferidas como células huésped son las de tipo gram-positivo, particularmente las pertenecientes al género Bacillus, muy especialmente de las especies Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

Son ejemplos de eucariotas adecuados los hongos actinomicetos o levaduras de los géneros Saccharomyces o Kluyveromyces, así como sistemas de expresión a base de hongos termófilos. Éstos son especialmente apropiados para la expresión de variantes resistentes a la temperatura. Entre las modificaciones producidas por los sistemas eucarióticos, sobre todo en relación con la síntesis proteica, cabe citar por ejemplo la fijación de compuestos de bajo peso molecular como anclajes de membrana u oligosacáridos. Estas modificaciones con oligosacáridos pueden ser convenientes para disminuir el potencial alérgeno, por ejemplo. También puede ser ventajosa una coexpresión con los enzimas generados de manera natural por dichas células.

Los métodos de preparación de una proteína según la presente invención son objeto independiente de la misma.

Por tanto se reivindica cualquier método de preparación de una proteína arriba descrita de la presente invención, o de un fragmento proteico, proteína de fusión o derivado de la misma, mediante el uso de un ácido nucleico arriba descrito según la presente invención y/o de un vector arriba descrito según la presente invención y/o de una de las células arriba descritas según la presente invención.

Como ejemplo pueden citarse aquellos procedimientos químicos de síntesis que desde el punto de vista económico son especialmente ventajosos para fragmentos más cortos.

En cambio, por otra parte, se prefieren todos los métodos preparativos de biología molecular, microbiológicos o biotecnológicos, establecidos en el estado técnico y ya mencionados arriba en algunos aspectos. De acuerdo con ello, usando métodos de biología molecular de por sí conocidos pueden sintetizarse oligonucleótidos y oligopéptidos -hasta completar genes y proteínas -correspondientes a las secuencias de ADN y aminoácidos arriba señaladas, las cuales pueden tomarse, por ejemplo, del protocolo de secuencias, preferentemente de las correspondientes a SEQ ID NO. 1, 2, 5 e incluso 6.

Los detergentes o productos de limpieza caracterizados por contener una proteína de la presente invención como la descrita arriba son objeto independiente de la presente invención.

Todos los tipos de detergentes o productos de limpieza, especialmente mezclas, recetas, soluciones, etc., cuyas posibilidades de aplicación mejoren con la adición de una de las proteínas de la presente invención arriba descritas se incluyen en el alcance de la protección de la presente invención. Según el sector de aplicación puede tratarse por ejemplo de mezclas sólidas, por ejemplo polvos con proteínas liofilizadas o encapsuladas, o de productos líquidos o en forma de gel. Las recetas preferidas contienen por ejemplo sustancias tampón, estabilizantes y/o complementos reactivos con las esterasas y/u otros ingredientes sinérgicos con las esterasas.

Este objeto de la presente invención comprende todos los tipos imaginables de detergentes, tanto los concentrados como los productos que se usan sin diluir, a escala comercial, en lavadoras o en el lavado y limpieza manual. Como ejemplo cabe mencionar los productos de limpieza para tejidos, moquetas o fibras naturales, que según la presente invención reciben el nombre de detergentes. También, por ejemplo, los productos lavavajillas o los detergentes o limpiadores manuales para superficies duras como metal, vidrio, porcelana, cerámica, baldosas, piedra, superficies pintadas, plásticos, madera o cuero, los cuales según la presente invención reciben el nombre de detergentes. Cualquier detergente o producto de limpieza constituye una forma de ejecución de la presente invención, siempre que esté enriquecido con una proteína de la presente invención o un fragmento proteico, proteína de fusión o derivado según la presente invención.

Las formas de ejecución de la presente invención comprenden todas las formas de suministro de los detergentes o productos de limpieza convenientes o establecidas en el estado técnico, entre ellas, por ejemplo, productos sólidos, en polvo, líquidos, geles o pastas, dado el caso también en varias fases, comprimidos o no; incluyendo asimismo, por ejemplo, exudados, granulados, tabletas o saquitos, envasados en recipientes grandes o en porciones.

En una forma de ejecución preferida los detergentes o productos de limpieza de la presente invención contienen las proteínas de la presente invención arriba descritas o utilizables según la presente invención en una cantidad comprendida entre 0,0001 µg y 480 mg, preferiblemente entre 0,005 µg y 420 mg, con especial preferencia entre 0,02 µg y 360 mg, sobre todo entre 0,05 µg y 240 mg por gramo de producto.

Además de una proteína de la presente invención un detergente o producto de limpieza según la presente invención contiene, si es preciso, otros ingredientes como estabilizadores enzimáticos, tensioactivos, p.ej. no iónicos, aniónicos y/o anfóteros, y/o blanqueadores y/o potenciadores, así como otros componentes usuales que se detallan a continuación.

Entre los ingredientes habituales de los detergentes o productos de limpieza también se cuentan en general los enzimas de acción detergente o limpiadora.

Por lo tanto los detergentes o productos de limpieza que además de una proteína de la presente invención arriba descrita se caracterizan por un contenido adicional de enzimas son formas de ejecución preferida de la presente invención. Entre estas enzimas adicionales cabe citar otras esterasas, proteasas amilasas, celulasas, hemicelulasas como por ejemplo β-glucanasas, óxidorreductasas como por ejemplo lacasas, cutinasas y/o lipasas, pero también esterasas y todos los demás enzimas descritos en el estado técnico para este sector de aplicación.

Los enzimas como proteasas, amilasas, lipasas o celulasas se emplean desde hace décadas como componentes activos en detergentes o productos de limpieza. Su respectiva contribución al rendimiento del detergente o producto de limpieza en cuestión es, en el caso de las proteasas, la capacidad de descomponer impurezas que contengan proteínas; en el caso de las amilasas la descomposición de impurezas que contengan almidones y en el caso de las lipasas la disociación de las grasas. Además de por su capacidad de eliminar la suciedad, es decir por su poder detergente o limpiador primario, las celulasas se utilizan preferiblemente en detergentes, sobre todo por su aporte al poder limpiador secundario de un detergente y por su acción sobre las fibras textiles. Los respectivos productos de hidrólisis son atacados, disueltos, emulsionados o suspendidos por los demás componentes del detergente o producto limpiador o debido a su mayor solubilidad son arrastrados por el agua de lavado, con cual se producen ventajosamente efectos sinérgicos entre los enzimas y los demás ingredientes.

Las proteasas pueden tener sobre las fibras naturales, especialmente sobre lana o seda, tener un efecto comparable al de la contribución de las celulasas al poder limpiador secundario de un detergente. Por su acción sobre la estructura superficial de dichos tejidos pueden ejercer un efecto alisador sobre el material y, por lo tanto, contrarrestar el afieltrado.

Otros enzimas multiplican el poder detergente de los respectivos productos por su correspondiente rendimiento enzimático específico. Entre éstos se cuentan por ejemplo hemicelulasas como las β -glucanasas, óxidorreductasas como las lacasas o enzimas que disuelven la pectina, los cuales se usan concretamente en detergentes especiales.

Para usar en los detergentes o productos de limpieza de la presente invención entran primero en consideración los enzimas obtenidos a partir de microorganismos como bacterias u hongos. Se producen del modo conocido mediante procesos de fermentación con microorganismos adecuados.

Una proteína de la presente invención y/u otras proteínas incluidas se pueden proteger con estabilizadores, por ejemplo contra la desnaturalización, la descomposición o la inactivación causada por factores físicos, por oxidación o por disociación proteolítica, sobre todo durante el almacenamiento. Esto es válido para todos los productos de la presente invención, sobre todo para detergentes o productos de limpieza.

Un grupo de estabilizadores lo constituyen los inhibidores de proteasa reversibles, los cuales se disocian al diluir el producto en el agua de lavado. El hidrocloruro de benzamidina y la leupeptina se han introducido para este uso. A menudo se usa bórax, ácidos bóricos, ácidos borónicos o sus sales o ésteres y entre ellos, sobre todo, derivados con grupos aromáticos, ácidos fenilborónicos orto-, meta-y para-sustituidos, así como sus sales o ésteres. Los peptidoaldehídos, es decir oligopéptidos con el extremo C reducido y en concreto de 2 -50 monómeros, se utilizan para la inhibición reversible de la proteasas en los detergentes y productos de limpieza. A los inhibidores peptídicos de proteasa reversibles pertenece entre otros el ovomucoide. Por ejemplo, se pueden usar inhibidores peptídicos reversibles específicos de la proteasa subtilisina en medios que contengan proteasas y proteínas de fusión de proteasa e inhibidor adecuadas.

Otros estabilizadores enzimáticos son aminoalcoholes como mono-, di-, trietanol-y –propanolamina y sus mezclas, ácidos carboxílicos alifáticos de hasta C12, como el ácido succínico, otros ácidos dicarboxílicos o sales de dichos ácidos. En el estado técnico se revelan para esta finalidad amidoalcoxilatos de ácidos grasos con grupos terminales cerrados. Algunos ácidos orgánicos empleados como potenciadores también tienen la capacidad de estabilizar un enzima contenido en el producto.

Otros estabilizadores enzimáticos usados con frecuencia son alcoholes alifáticos inferiores, pero sobre todo polioles como, por ejemplo, glicerina, etilenglicol, propilenglicol o sorbita. También se usan sales de calcio, como por ejemplo el acetato o el formiato cálcico, y sales de magnesio.

Los oligómeros de poliamida o compuestos poliméricos como la lignina, copolímeros vinílicos hidrosolubles o éteres de celulosa, polímeros acrílicos y/o poliamidas estabilizan el preparado enzimático contra factores físicos u oscilaciones de pH, entre otros. Los polímeros que contienen poliamina-N-óxido actúan a la vez como estabilizadores enzimáticos e inhibidores del desteñido. Otros estabilizadores poliméricos son los polioxialquilenos C8-C18 lineales. Los alquilpoliglicósidos podrían estabilizar los componentes enzimáticos del producto de la presente invención e incluso incrementar su rendimiento. Los compuestos nitrogenados reticulados cumplen una doble función como agentes de liberación de suciedad y como estabilizadores enzimáticos. En una mezcla con otros estabilizadores un polímero no iónico hidrófobo estabiliza una celulasa y por tanto estos u otros componentes análogos también serían adecuados para el enzima principal de la presente invención.

Los reductores y los antioxidantes aumentan la estabilidad de los enzimas frente a la degradación oxidativa. Son conocidos los reductores que contienen azufre. Otros ejemplos son el sulfito sódico y los azúcares reductores.

En muchos casos también se utilizan combinaciones de estabilizadores, por ejemplo de polioles, ácido bórico y/o bórax, la combinación de ácido bórico o borato, sales reductoras y ácido succínico u otros ácidos dicarboxílicos o la combinación de ácido bórico o borato con polioles o compuestos poliamínicos y con sales reductoras. El efecto de los estabilizadores péptido-aldehídicos se incrementa mediante la combinación con ácido bórico y/o derivados del mismo y aún más con el uso de iones calcio.

Los productos con las actividades enzimáticas estabilizadas son formas de ejecución preferidas de la presente invención. Se prefieren especialmente los que llevan enzimas estabilizados según varias de las maneras descritas.

Como los productos de la presente invención pueden suministrarse en cualquier forma imaginable, todas las formulaciones de enzimas o proteínas de la presente invención que sirvan de aditivo para los correspondientes productos también son respectivamente formas de ejecución preferidas de la misma. Como ejemplo cabe citar formulaciones líquidas, granulados sólidos o cápsulas.

La forma encapsulada se ofrece para proteger los enzimas u otros ingredientes frente a otros componentes, como por ejemplo los blanqueadores, o para permitir una liberación controlada. Según su tamaño se distingue entre mili-, micro-y nanocápsulas. Para los enzimas se prefieren especialmente las microcápsulas. Un método de encapsulación posible consiste en encapsular las proteínas, partiendo de una mezcla de la solución proteica con una solución

o suspensión de almidón o de un derivado de almidón, en esta sustancia.

En caso de productos sólidos las proteínas se pueden usar, por ejemplo, en forma seca, granulada y/o encapsulada. Se pueden añadir por separado, es decir como fase única, o junto con otros componentes en la misma fase, con o sin compactación. Si hay que elaborar enzimas microencapsulados en forma sólida, el agua de las soluciones acuosas resultantes del proceso se puede eliminar por métodos conocidos del estado técnico como secado por pulverización, centrifugación o resolubilización en otro disolvente. Las partículas obtenidas de este modo suelen tener un tamaño comprendido entre 50 y 200 µm.

Los enzimas y también la proteína de la presente invención pueden añadirse a los productos líquidos, geles o pastas de la presente invención en solución concentrada, suspensión o emulsión, acuosa o no, partiendo de un procedimiento de obtención y preparación de proteínas realizado según el estado técnico, pero también en forma de gel o encapsuladas o en forma de polvo desecado. Estos detergentes o productos de limpieza de la presente invención se preparan en general mezclando simplemente los ingredientes, que pueden introducirse tal cual o en disolución en un mezclador automático.

Aparte del poder detergente primario, las esterasas contenidas en los productos de limpieza también cumplen la función de activar otros componentes por división esterolítica o inactivarlos tras un determinado tiempo de acción. La proteína de la presente invención también puede ejercer funciones reguladoras similares. Otra forma de ejecución de la presente invención son los productos con cápsulas de material sensible a las esterasas, que al cabo de un tiempo prefijado son hidrolizadas por las proteínas de la presente invención, por ejemplo, liberando su contenido. También se puede conseguir un efecto parecido en otros productos de varias fases.

Otra forma de ejecución son los detergentes o productos de limpieza para el tratamiento de materias primas textiles

o el cuidado de los tejidos, los cuales se caracterizan por contener una de las proteínas de la presente invención arriba descritas, sola o junto con otros ingredientes activos, especialmente para fibras o tejidos con componentes de fibra sintética y sobre todo de poliéster.

Las fibras sintéticas, como por ejemplo las de poliéster, también tienen una estructura superficial característica, la cual después de muchos procesos de lavado puede presentar efectos no deseados, como por ejemplo la tendencia al afieltrado, el llamado “pilling”. Para evitarlo, las materias primas o el tejido terminado, es decir el material textil o las fibras, se tratan con productos de la presente invención, los cuales contribuyen por ejemplo a alisar la estructura superficial y a contrarrestar el afieltrado.

Los productos de la presente invención se usan preferentemente para mejorar el aspecto y/o la estructura superficial de fibras afieltradas, sobre todo de poliéster. Los enzimas de la presente invención tienen la capacidad de partir los enlaces éster de las fibras sintéticas afieltradas y por tanto revertir el afieltrado del tejido o de las fibras (“depilling”), evitarlo de antemano, mantenerlo, ralentizarlo claramente y/o pararlo del todo.

En una forma de ejecución preferida el producto está concebido con una esterasa de la presente invención para poder emplearlo regularmente como agente de conservación, por ejemplo añadiéndolo al proceso de lavado, tras el lavado o aplicándolo independientemente del lavado. El efecto deseado consiste en lograr que el tejido mantenga una estructura superficial lisa durante largo tiempo y/o en prevenir y/o reducir su deterioro.

Un objeto propio de la presente invención son los procesos automáticos de limpieza de tejidos o de superficies duras caracterizados porque al menos en una de sus etapas se activa una proteína, arriba descrita, de la presente invención, un fragmento de proteína, una proteína de fusión o un derivado de la misma, concretamente en una cantidad de 0,01 µg hasta 96 g, preferiblemente de 0,05 µg hasta 72 g, con especial preferencia de 0,1 µg hasta 48 g y sobre todo de 0,5 µg hasta 24 g por aplicación.

Aquí se incluyen tanto procesos manuales como automáticos, prefiriéndose los automáticos por ser más precisos a la hora de regular, por ejemplo, las cantidades empleadas y los tiempos de actuación.

En general los procesos de limpieza de tejidos se caracterizan por aplicar al objeto del lavado, en varias etapas, diversas sustancias detergentes que luego se enjuagan tras un tiempo de acción o por tratar el objeto del lavado de otro modo con un detergente o una disolución de este producto. Lo mismo vale para la limpieza de todos los demás materiales que no son tejidos, agrupados bajo el término de superficies duras. Todos los procesos imaginables de lavado o de limpieza se pueden enriquecer con proteínas de la presente invención en al menos una de sus etapas y por tanto constituyen formas de ejecución de la presente invención.

Una etapa individual de un proceso de este tipo para la limpieza automática de tejidos puede consistir, si se desea, en aplicar un enzima de la presente invención como único ingrediente activo junto a los compuestos estabilizantes,sales o sustancias tampón. Ésta es una forma de ejecución especialmente preferida de la presente invención.

En otra forma de ejecución preferida de dichos procesos, los respectivos enzimas de la presente invención se preparan en el marco de una de las recetas arriba indicadas para los detergentes o productos de limpieza de la presente invención.

Las formas de ejecución preferidas de este objeto de la presente invención son procesos para el tratamiento o el cuidado de materiales textiles, que se caracterizan porque al menos en una de sus etapas se activa una proteína de la presente invención, arriba descrita, sobre todo para materiales textiles, fibras o tejidos con componentes sintéticos y especialmente para aquellos que llevan fibras sintéticas, en concreto de poliéster.

Puede tratarse por ejemplo de procesos de preparación de materiales destinados a la elaboración de tejidos, como acabado antiafieltrado, o por ejemplo de procesos en que la limpieza de tejidos usados se enriquece con un componente de mantenimiento. En las formas de ejecución preferidas son preferentemente procesos de tratamiento de materiales textiles, fibras o tejidos que llevan componentes sintéticos, sobre todo fibras sintéticas, en concreto de poliéster.

Un objeto propio de la presente invención es el uso de una proteína arriba descrita, de la presente invención, para limpiar tejidos o superficies duras.

Para dicho uso son válidos, preferiblemente, los márgenes de concentración arriba indicados.

Por tanto las proteínas de la presente invención, sobre todo aquellas que poseen las propiedades arriba descritas y las que corresponden a los procesos arriba descritos, se pueden usar para eliminar nódulos o afieltrados molestos (“depilling”). Las formas de ejecución son, por ejemplo, el lavado manual o la eliminación manual de manchas de tejidos o de superficies duras o el uso en un proceso automático.

En una forma de ejecución preferida de dicha aplicación los correspondientes enzimas de la presente invención se preparan en el marco de una de las recetas arriba indicadas para los productos de la presente invención, preferiblemente detergentes o productos de limpieza.

El uso de las proteínas de la presente invención en detergentes y productos de limpieza también puede rebajar el brillo satinado que puede observarse en las fibras de poliéster y que los clientes consideran más bien de mala calidad. Asimismo se puede reducir la aparición de zonas brillantes en las fibras sintéticas durante el lavado o incluso evitarlas sustancialmente. Estas zonas brillantes en las fibras, producidas p.ej. por roce o fricción, se reducen con el uso de detergentes y productos de limpieza que contienen los enzimas de la presente invención.

Además los enzimas de la presente invención se pueden usar para evitar y/o impedir totalmente la redeposición, es decir la adhesión, de la suciedad del agua de lavado durante el proceso de limpieza.

Además el uso de los enzimas de la presente invención en detergentes y productos de limpieza permite mejorar globalmente el rendimiento del lavado.

Las para-nitrobencilesterasas se pueden usar asimismo en síntesis química o en métodos de purificación de una síntesis química. Como los enzimas poseen en general centros catalíticos estéreoselectivos es posible utilizarlos para separar racematos o para síntesis estéreoselectivas.

Otra forma de ejecución del objeto de la presente invención es el uso de una proteína de la presente invención como la descrita arriba para el tratamiento de materias primas naturales o sintéticas, particularmente para el tratamiento de la superficie.

Esta aplicación tiene lugar preferiblemente en el marco de productos o procesos adecuados. Es necesaria, por ejemplo, cuando hay que liberar materias primas de ciertas impurezas. En este caso cabe citar en primer lugar la obtención de materias primas sintéticas, pero también sustancias preparadas biotecnológicamente mediante fermentaciones, como por ejemplo los antibióticos.

El uso de para-nitrobencilesterasas, obtenibles preferentemente de bacterias del género Bacillus, en procesos de preparación y/o purificación de poliésteres, sobre todo de polialquilentereftalatos, es otro objeto preferido de la presente invención. En la preparación de polialquilentereftalatos, sobre todo de polietilentereftalatos (PET), el rendimiento de polímero se ve influido por una reacción secundaria que produce la formación de oligómeros cíclicos. El uso de la presente invención permite contrarrestar la formación de oligómeros cíclicos y disponer de los monómeros para proseguir la reacción. Así se limitan los productos de la reacción secundaria y se alcanza un mayor rendimiento del polímero deseado.

Otra forma de ejecución de este objeto de la presente invención es el uso de una proteína de la presente invención como la descrita arriba para obtener o tratar materias primas o productos intermedios de la producción textil, sobre todo para eliminar capas protectoras de los tejidos.

Esta aplicación tiene lugar preferiblemente en el marco de productos o procesos adecuados. Un ejemplo de obtención o de tratamiento de materias primas o de productos intermedios para la producción textil es el acabado de fibras sintéticas. Los procesos o aplicaciones enzimáticas superan a los procedimientos químicos comparables, especialmente en los que respecta a su compatibilidad medioambiental.

En una forma de ejecución preferida se usan proteínas de la presente invención para eliminar capas protectoras de los tejidos, sobre todo de productos intermedios o materias primas, o alisar su superficie, antes de seguir elaborándolos en una etapa subsiguiente.

Otra forma de ejecución de este objeto de la presente invención es el uso de una proteína de la presente invención como la descrita arriba para tratar materias primas textiles o cuidar tejidos, sobre todo para tratar fibras sintéticas, en particular de poliéster, o tejidos mixtos que llevan fibras sintéticas.

Esta aplicación tiene lugar preferiblemente en el marco de productos o procesos adecuados. Según lo antedicho las respectivas materias primas textiles se liberan de impurezas gracias a las esterasas; además un material que consta al menos parcialmente de proteína se beneficia de la capacidad alisadora de la superficie y de las propiedades protectoras del enzima esterolítico. Por este motivo también se incluye como aplicación el cuidado de los materiales en cuestión. Por tanto se reivindica el tratamiento superficial de fibras sintéticas, sobre todo de poliéster, o de tejidos

5 mixtos que llevan fibras sintéticas, lo cual es válido tanto para la fabricación de dichos tejidos como para el cuidado durante su uso, por ejemplo en relación con su limpieza (véase arriba).

Ejemplos:

10 1. Secuencias de las esterasas de la presente invención

Tabla 1: asignación de los números ID de secuencia

SEQ-ID No.

Organismo Proteína/ADN/ARN Nº de registro en el banco de datos NCBI Esterasa/lipasa

1

Bacillus subtilis Proteína - PNBE

2

Bacillus licheniformis Proteína - PNBE

3

Bacillus subtilis ADN/ARN - PNBE

4

Bacillus licheniformis ADN/ARN - PNBE

5

Bacillus subtilis Preproteína - PNBE

6

Bacillus licheniformis Preproteína - PNBE

7

Bacillus subtilis ADN/ARN - PNBE

8

Bacillus subtilis ADN/ARN - PNBE

9

Artificial Péptido señalizador - PNBE

10

Artificial ADN/ARN - PNBE

11

Bacillus subtilis Proteína gi|1762126 PNBE

12

Bacillus licheniformis DSM 13 Proteína gil52346943 PNBE

13

Bacillus subtilis Proteína gi|7546321 PNBE

14

Bacillus subtilis Proteína gi|468046 PNBE

15

Bacillus subtilis Proteína gil1762126 PNBE

16

Bacillus subtilis Proteína gi|1495277 PNBE

17

Bacillus subtilis Proteína gi|1945688 PNBE

18

Bacillus subtilis Proteína gi|2635952 PNBE

19

Bacillus licheniformis ATCC 14580 Proteína gi|52002286 PNBE

20

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Proteína gi|27316488 PNBE

21

Staphylococcus aureus Proteína gi|57286454 PNBE

22

Streptomyces avermitilis MA-4680 Proteína gi|29611030 PNBE

23

Caulobacterium crescentus CB15 Proteína gi|13422044 PNBE

24

Clostridium acetobutylicum ATCC824 Proteína gi|14994366 PNBE

25

Artificial Proteína gi|7546320 PNBE

26

Burkholderia cepacia Proteína gi|67464317 Lipasa

27

Bacillus licheniformis DSM 13 ADN - PNBE

2. Determinación de las actividades enzimáticas 2.1 Determinación de la actividad de la esterasa con para-nitrofenilésteres

La actividad de la esterasa se determinó de forma estándar con para-nitrofenil-acetato (pNPA). Para ello se preparó una solución estándar 400 mM en DMSO. Se mezclaron 980 µl de una solución 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 8,0)

20 con 10 µl de para-nitrofenil-acetato disuelto en DMSO. Si no se describe lo contrario, la reacción se realizó a temperatura ambiente y se inició mediante la adición de 10 µl de solución enzimática. A continuación se midió el aumento de la absorción a 410 nm (UV MC2, de SAFAS, Mónaco). La actividad enzimática se alcanzó con un coeficiente de extinción de 17100 [M-1·cm-1], definiéndose como 1 unidad la cantidad de enzima que liberaba 1 µmol de p-nitrofenol por minuto.

2.2 Determinación de la actividad de la esterasa con rojo fenol

Para el lavado bioquímico con dialquilftalato-hidrolasa se determinó la actividad esterolítica frente a dietilftalato (DE-T) como substrato, empleando un método de medición fotométrico que señala la acidificación del sistema de ensayo 30 mediante un indicador de pH. Este sistema de ensayo se basa en la misma afinidad protónica del tampón empleado (tampón EPPS; pKa = 8,0) y del indicador de pH utilizado (rojo fenol; pKa = 8,0), que da un recorrido lineal del descenso de absorción a 560 nm. Para el cálculo de actividad se usaron las siguientes fórmulas 2.1 y 2.2, donde Q = “factor tampón”; Ctampón = concentración final de tampón; Cindicador = concentración final de indicador; Δε560nm: diferencia entre la forma desprotonada y la forma protonada del rojo fenol; A: actividad de la esterasa; dE/dt: descenso de

35 la extinción frente a un intervalo de tiempo; Vreacción: volumen de reacción: Se encontró una actividad enzimática correspondiente a un coeficiente de extinción molar determinado empíricamente de 58000 [M-1·cm-1] para la forma desprotonada y de 100 [M-1·cm-1] para la forma protonada, definiéndose como 1 unidad la cantidad de enzima que liberaba 1 µmol de ácido por minuto.

2.3 Determinación de la actividad de la esterasa por valoración

Se determinaron las actividades de las esterasas frente a varios substratos de la familia de los ftalatos (fig. 4) utilizando el aparato de valoración 702 STAT (de METROHM LDT., Suiza). Los ftalatos se disolvieron en dietiléter con 0,5 g de Triton X100. A continuación se eliminó el dietiléter con corriente de nitrógeno. Se añadieron 50 ml de tampón (Tris/HCl 2 mM, pH 9), se homogeneizó con ultrasonidos y se emplearon a distintas concentraciones finales (0,3 mM hasta 100 mM) en un volumen total de reacción de 2 ml (incluyendo el enzima). El tampón de reacción se incubó previamente a 30ºC durante al menos 10 minutos. Después de añadir el enzima se anotó el consumo de NaOH (determinación de la concentración valorando tres veces con ácido oxálico) a una temperatura de reacción de 30ºC. Se definió una unidad como la actividad enzimática correspondiente a la liberación de 1 µmol de ácido por minuto.

2.4 Determinación de la actividad de la esterasa por hidrólisis del bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol 2.4.1 Síntesis del bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol

El bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol se sintetizó por esterificación de cloruro de 4-metilbenzoílo con etilenglicol (véase fig. 1). Se introduce etilenglicol y piridina en un matraz redondo con condensador de reflujo y se añade gota a gota cloruro de 4-metilbenzoílo, enfriando con hielo. Después de dejar la mezcla 16 horas en reposo, el éster sólido resultante se separó por filtración y se recristalizó en 70% de etanol-30% de agua. A continuación se lavó el sólido con etanol al 70% y se liofilizó durante 24 horas.

2.4.2 Determinación de la actividad enzimática

La disociación del bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol catalizada por los enzimas de la presente invención da 2 equivalentes de ácido 4-metilbenzoico y etilenglicol (véase fig. 2).

Para la preparación del ensayo enzimático se mezcla la cantidad deseada de substrato con 0,5 g de Triton X100 y se disuelve en 50 ml de etanol (al 99%, desnaturalizado), calentando. Una vez disuelto todo el substrato se añade la solución a 50 ml de tampón (Tris/HCl 2 mM, pH 9), agitando fuertemente con un Ultra-Turrax. A continuación esta solución se agitó al menos durante 12 horas a temperatura ambiente para eliminar gran parte del etanol empleado. La solución de substrato así preparada se valoró directamente. El tampón de reacción se preincubó a 30ºC durante al menos 10 minutos.

Se usaron distintas concentraciones finales (0,67 mM hasta 50 mM) en un volumen total de reacción de 2 ml, incluyendo el enzima. Después de añadir el enzima se anotó el consumo de NaOH (determinación de la concentración valorando tres veces con ácido oxálico mediante el aparato de valoración 702 STAT (de METROHM LDT., Suiza)) a una temperatura de reacción de 30ºC. Se definió una unidad como la actividad enzimática correspondiente a la liberación de 1 µmol de ácido por minuto.

En éste y en los demás ejemplos, para las esterasas empleadas se usan las siguientes abreviaturas: enzima según SeqID No. 12 (pNB-Est13), enzima según SeqID No, 2 (pNB-Est19), enzima según SeqID No. 1 (pNB-Est17). Los datos de la tabla 2 obtenidos para dichas esterasas se determinaron por valoración y son los valores medios de tres mediciones efectuadas independientemente entre sí, con una desviación estándar relativa inferior al 5%.

Tabla 2: datos cinéticos de la hidrólisis del bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol por las para-nitrobencil-esterasas pNB-Est17, pNB-Est19 y pNB-Est13

bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol Enzima según SeqID No. 1 (pNB-Est17) Enzima según SeqID No, 2 (pNB-Est19) Enzima según SeqID No. 12 (pNB-Est13)

Vmax [µmol/min] 0,642 0,385 1,801 kM [mM] 9,83 3,59 11,21 kcat (1/s] 5177 3838 9358 kcat / kM [1/mM*s] 527 1070 835 Actividad específica [umol/min*mg] 1,60 1,19 2,87

14

3. Análisis de la especificidad del substrato frente a para-nitrofenilésteres y triglicéridos de distinta longitud de cadena

Para determinar las especificidades de las esterasas estudiadas respecto a las longitudes de cadena se emplearon

5 p-nitrofenilésteres de distinta longitud de cadena como substrato de las mediciones espectroscópicas de actividad. Para ello los p-nitrofenilésteres se disolvieron en 10 ml de isopropanol y se mezclaron con 90 ml de tampón fosfato (pH 8, hidrógenofosfato disódico y dihidrógenofosfato potásico). La concentración final del substrato fue de 0,8 mM. Se mezclaron respectivamente 990 µl de la mezcla tampón-substrato con 10 µl del enzima analizado y se incubó un minuto a temperatura ambiente. A continuación se midió el aumento de absorción a 410 nm (UV MC2, de SAFAS,

10 Mónaco). La actividad enzimática se alcanzó con un coeficiente de extinción de 17100 [M-1·cm-1], definiéndose como 1 unidad la cantidad de enzima que liberaba 1 µmol de p-nitrofenol por minuto.

Los valores que figuran en la tabla 3 son promedios de tres mediciones efectuadas independientemente entre sí, con una desviación estándar relativa inferior al 10%. 15 Tabla 3: especificidades de substrato de pNB-Est13, pNB-Est17 y pNB-Est19 para distintas longitudes de cadena de los para-nitrofenilésteres en las condiciones descritas

Substrato

Actividad específica [U/mg]

pNB-Est13

pNB-Est17 pNB-Est19

p-NP-butirato p-NP-caproato

22,4 50,5 196,3 102,7 234,8 249,6

p-NP-caprilato p-NP-caprato p-NP-laurato p-NP-miristato

13,0 4,4 1,3 < 1 73,2 10,2 3,4 < 1 83,6 3,9 4,0 1,3

p-NP-palmitato p-NP-estearato

< 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1

20 4. Detección analítica de los productos de hidrólisis de diferentes ftalatos de dialquilo tras la incubación con las para-nitrobencil-esterasas pNB-Est17, pNB-Est19 y pNB-Est13

La actividad esterolítica de las pNB-esterasas analizadas frente a distintos ftalatos de dialquilo se verificó mediante la detección de los productos de disociación. La detección se llevó a cabo tanto por cromatografía de capa fina como

25 por cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas (GC/MS). En la siguiente tabla 4 se indican los valores RF de los eductos y de los productos después de realizar una cromatografía de capa fina. La detección de una o dos manchas nuevas ya denotaba una hidrólisis. Las respectivas pruebas en blanco no mostraron manchas adicionales.

30 Como eluyente en la cámara de capa fina presaturada se usó 90% de diclorometano/10% de metanol, las sustancias se separaron sobre láminas recubiertas de gel de sílice 60 F254; la detección de las manchas individuales se llevó a cabo bajo luz UV; la concentración de substrato en la mezcla fue de 6,67 mM, el tiempo de incubación 2 h a temperatura ambiente.

35 Tabla 4: recorridos característicos (valores RF) de los eductos y productos determinados por análisis de cromatografía en capa fina de las mezclas reactivas con pNB-esterasas

Substrato Valor RF del substrato Valor RF del producto 1 Valor RF del producto 2

Dimetiltereftalato 0,78 0,18 -Dietiltereftalato 0,75 0,21 -Dimetilisoftalato 0,78 0,23 -Dimetilftalato 0,70 0,07 -Dietilftalato 0,73 0,13 -Dibutilftalato 0,74 0,13 -Fenilbenzoato 0,76 0,45 0,25

Tras el análisis GC/MS de la mezcla reactiva los picos de masa de los productos disociados se asignaron por com

40 paración con la base de datos WILEY, confirmándose la hidrólisis ya observada en los análisis de cromatografía en capa fina. En la figura 4 están representadas esquemáticamente todas las reacciones observadas. Para cada reacción enzimática se midieron muestras en blanco consistentes en la mezcla reactiva sin enzima o sin substrato. En todos los ftalatos y tereftalatos investigados se ha comprobado que solo se hidroliza uno de los dos posibles grupos funcionales. En ninguna mezcla reactiva se detectó el ácido ftálico, tereftálico o isoftálico libre. El correspondiente

45 producto de la reacción es el monoéster del compuesto de partida, así como el respectivo alcanol. Como substrato ajeno a los ftalatos se analizó la hidrólisis del benzoato de fenilo. Como productos de la hidrólisis se detectaron fenol y ácido benzoico.

5. Determinación de los valores Vmax, kM, kcat y kcat/kM de las para-nitrobencil-esterasas pNB-Est17, pNB-Est19 y pNBEst13 frente a distintos ftalatos y tereftalatos

Para la determinación de constantes cinéticas como Vmax, kM, kcat y kcat/kM para las tres para-nitrobencil-esterasas

5 pNB-Est17, pNB-Est19 y pNBEst13 frente a distintos ftalatos y tereftalatos se realizaron valoraciones titulométricas. Las respectivas actividades enzimáticas se determinaron para distintas concentraciones de substrato y se evaluaron según MICHAELIS-MENTEN (véanse fig. 5 a 7). Para calcular la constante cinética (kcat o k2) y la eficiencia catalítica (kcat/kM) se tomaron los valores kM y Vmax encontrados – suponiendo que la concentración de enzima empleada era la misma que la de enzima activo. Los valores resultantes están resumidos respectivamente en la tabla.

10 Los valores que aparecen en las figuras 5 a 7 son promedios de tres valoraciones titulométricas realizadas independientemente entre sí, con una desviación estándar relativa inferior al 5%. El cálculo de kcat y kcat/kM se efectuó suponiendo que la concentración de enzima empleada era la misma que la de enzima activo.

15 En el caso de las tres para-nitrobencil-esterasas investigadas se pudo detectar el monoéster del compuesto de partida con su alcohol correspondiente. En ningún caso pudo detectarse el ácido ftálico, tereftálico o isoftálico libre.

Hidrólisis de ftalato de dimetilo con distinta posición (orto, meta, para)

20 Tabla 5: valores de kM y Vmax y de kcat y kcat/kM de la hidrólisis de ácido dimetilftálico en posición orto, meta y para; DMP = ácido dimetilftálico; DMIP = ácido dimetilisoftálico; DMT = ácido dimetiltereftálico; por pNB-Est17, pNB-Est19 y pNB-Est13

Substrato DMP pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg] 14,09 15,76 9,11 kM [mM] 27,70 20,35 8,68 kcat [1/s] 45672 50970 29735 kcat/kM [1/mM·s] 1649 2505 3427

Substrato DMIP pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg] 11,99 8,55 27,67 kM [mM] 3,67 2,44 2,93 kcat [1/s] 38880 27637 90267 kcat/kM [1/mM·s] 10594 11327 30808

Substrato DMT pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg] 18,52 15,96 4,53 kM [mM] 5,99 13,56 6,87 kcat [1/s] 60028 50718 14784 kcat/kM [1/mM·s] 10021 3741 2152

25 Hidrólisis de ftalatos con distinta longitud de cadena (orto)

Tabla 6: valores de kM y Vmax y de kcat y kcat/kM de la hidrólisis de ftalatos en posición orto con distinta longitud de la cadena alquílica (DMP = ácido dimetilftálico; DEP = ácido dietilftálico; DBP = ácido dibutilftálico) por pNB-Est17, pNB-Est19 y pNB-Est13

Substrato DMP pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg] 14,09 15,76 9,11 kM [mM] 27,70 20,35 8,68 kcat [1/s] 45672 50970 29735 kcat/kM [1/mM·s] 1649 2505 3427

Substrato DEP

pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg]

9,57 7,20 3,21

kM [mM]

5,20 3,55 4,14

kcat [1/s]

31065 23265 10468

kcat/kM [1/mM·s]

5974 6554 2528

Substrato DBP

pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg]

48,03 40,69 2,87

kM [mM]

1,24 0,70 1,16

kcat [1/s]

155676 23265 9356

kcat/kM [1/mM·s]

125545 187329 8066

Hidrólisis de ftalatos con distinta longitud de cadena (para)

Tabla 7: valores de kM y Vmax y de kcat y kcat/kM de la hidrólisis del tereftalato de dimetilo (DMT) y del tereftalato de dietilo (DET) por pNB-Est17, pNB-Est19 y pNB-Est13

Substrato DMT pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg] 18,52 15,69 4,53 kM [mM] 5,99 13,56 6,87 kcat [1/s] 60028 50718 14784 kcat/kM [1/mM·s] 10021 3741 2152

Substrato DET pNB-Est17 pNB-Est19 pNB-Est13

VMax [U/mg] 28,06 30,79 3,57 kM [mM] 1,06 0,97 1,21 kcat [1/s] 90998 99411 12574 kcat/kM [1/mM·s] 85847 102486 10392

Explicación de las figuras Fig. 1: síntesis de bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol por esterificación de ácido 4-metilbenzoico con etilenglicol. Fig. 2: esquema de la hidrólisis enzimática del bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol.

10 Fig. 3: detección de la hidrólisis enzimática e identificación de los productos de la hidrólisis del bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol por para-nitrobencil-esterasas. Fig. 4: representación esquemática de las reacciones de tereftalato de dimetilo, tereftalato de dietilo, ftalato de dimetilo, ftalato de dietilo, ftalato de dibutilo, isoftalato de dimetilo y benzoato de fenilo catalizadas enzimáticamente. Fig. 5: cinéticas MICHAELIS-MENTEN de las para-nitrobencil-esterasas pNB-Est17 (o), pNB-Est19 (Δ) y pNBEst13

15 (□) frente a ácido dimetilftálico (DMP), ácido dimetilisoftálico (DMIP) y ácido dimetiltereftálico (DMT). Fig. 6: cinéticas MICHAELIS-MENTEN de las para-nitrobencil-esterasas pNB-Est17 (o), pNB-Est19 (Δ) y pNBEst13 (□) frente a los ésteres orto-ftálicos de: ácido dimetilftálico (DMP), ácido dietilftálico (DEP) y ácido dibutilftálico (DBP). Fig. 7: cinéticas MICHAELIS-MENTEN de las para-nitrobencil-esterasas pNB-Est17 (o), pNB-Est19 (Δ) y pNBEst13 (□) frente a los ésteres para-ftálicos: tereftalato de dimetilo (DMT) y tereftalato de dietilo (DET).

20 _____________________________________________________________________________________________

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Henkel KGaA 25 <120> H 06819 PCT

<130> Esterasa

<150> DE 10 2005 037 659.2 <151> 05.08.2005

<160> 27

<170> PatentIn versión 3.1 30 <210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 1 35

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 2

<210> 3

<211> 1470

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

<210> 4

<211> 1470

<212> ADN

<213> Bacillus licheniformis

<400> 4

<210> 5

<211> 518

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 5

<210> 6

<211> 518

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 6

<210> 7

<211> 1557

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 7

<210> 8

<211> 1557

<212> ADN

<213> Bacillus licheniformis

<400> 8

<210> 9

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220> SEÑAL

<223>

<400> 9

<210> 10

<211> 87

<212> ADN

<213> Artificial 15 <220> péptido señalizador

<223>

<400> 10

20 <210> 11

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 11 25

<210> 12

<211> 490

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 12

<210> 13

<211> 489

<212> PRT

<213> bacillus subtilis

<400> 13

<210> 14

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 14

<210> 15

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 15

<210> 16

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 16

<210> 17

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 17

<210> 18

<211> 489

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 18

<210> 19

<211> 490

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 19

<210> 20

<211> 455

<212> PRT

<213> Staphylococcus epidermidis

<400> 20

<210> 21

<211> 450

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 21

<210> 22

<211> 492

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 22

<210> 23

<211> 515

<212> PRT

<213> Caulobacter crescentus

<400> 23

<210> 24

<211> 497

<212> PRT

<213> Clostridium acetobuylicum

<400> 24

<210> 25

<211> 489

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> proteína de origen desconocido, registro en la base de datos gi 7546320

<400> 25

<210> 26

<211> 320

<212> PRT

<213> burkholderia cepacia

<400> 26

<210> 27

<211> 1473

<212> ADN

<213> Bacillus licheniformis

<400> 27

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Detergente o producto de limpieza, caracterizado porque lleva para-nitrobencilesterasas (PNB-esterasas).

2. 2.

   Producto según la reivindicación 1, caracterizado porque la esterasa está escogida entre las esterasas con una secuencia aminoácida idéntica a una de las indicadas en las SEQ ID NO. 1, 2, 4, 6 u 11-26, preferiblemente 1,2,5, 6 o 12, en al menos un 50%, preferiblemente 60%, especialmente 70%, preferentemente en al menos un 80%, preferiblemente 90%, especialmente 95% y sobre todo en un 100%, u homóloga de las mismas en al menos un 80%, preferiblemente 90%, con especial preferencia 95% y sobre todo en un 100%.

3. 3.

   Producto según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las esterasas muestran a 30ºC una actividad específica frente al substrato bis-(p-metilbenzoato) de etilenglicol de 0,1 hasta 30, preferiblemente de 0,6 hasta 20, especialmente de 0,7 hasta 15, con especial preferencia de 0,9 hasta 10, con mayor preferencia de 1 hasta 5, particularmente de 1,1 hasta 4, sobre todo de 1,5 hasta 3 µmoles de ácido liberado/min·mg de enzima.

4. 4.

   Producto según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las esterasas provienen de microorganismos, sobre todo de microorganismos del género Bacillus.

5. 5.

   Producto según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque al menos contiene uno o varios tensioactivos.

6. 6.

   Producto según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque además contiene otros enzimas, sobre todo proteasas amilasas, celulasas, hemicelulasas, óxidorreductasas y/o lipasas.

7. 7.

   Producto según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque contiene una o varias paranitrobencil-esterasas en una cantidad de 0,0001 µg hasta 480 mg, preferiblemente de 0,005 µg hasta 420 mg, con especial preferencia de 0,02 µg hasta 360 mg, sobre todo de 0,050 µg hasta 240 mg por g de producto.

8. 8.

   Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 para acabado de tejidos.

9. 9.

   Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 para proteger fibras, especialmente fibras sintéticas, o para disminuir el “pilling” sobre las mismas.

10. 10.

    Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 para humectar tejidos antes de teñirlos.

11. 11.

    Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 para disociar

    o degradar plásticos, sobre todo poliésteres y/o plastificantes.

12. 12.

    Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 en la síntesis química de polímeros, sobre todo de poliésteres, especialmente de polialquilentereftalatos.

13. 13.

    Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 para limpiar tejidos o superficies duras, especialmente en una cantidad de 0,04 µg hasta 96 g, preferiblemente de 0,05 µg hasta 72 g, con especial preferencia de 1 µg hasta 48 g y sobre todo de 2 µg hasta 24 g por aplicación.

14. 14.

    Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 para obtener o tratar materias primas o productos intermedios en la producción textil, sobre todo para eliminar capas protectoras de los tejidos.

15. 15.

    Uso de una para-nitrobencil-esterasa o de un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7 para tratar materias primas textiles o cuidar tejidos, sobre todo para tratar fibras sintéticas o tejidos mixtos que llevan fibras sintéticas, especialmente de poliéster.

16. 16.

    Proceso para el lavado automático de tejidos o superficies duras, caracterizado porque al menos en una de las etapas se activa una para-nitrobencil-esterasa y/o un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7, especialmente en una cantidad de 0,01 µg hasta 96 g, preferiblemente de 0,05 µg hasta 72 g, con especial preferencia de 0,1 µg hasta 48 g y sobre todo de 0,5 µg hasta 24 g por aplicación.

17. 17.

    Proceso para tratar materias primas textiles o cuidar tejidos, caracterizado porque al menos en una de las etapas se activa una para-nitrobencil-esterasa y/o un producto según una de las reivindicaciones 1 a 7, sobre todo para materias primas textiles, fibras o tejidos con componentes sintéticos y con especial preferencia para aquellos que llevan fibras sintéticas, especialmente de poliéster.

    Fig. 1:

    Fig. 2:

    Fig. 3: Fig. 4: Fig. 5 (a):

    Tereftalato de dimetilo

    Tereftalato de monometilo Metanol

    Tereftalato de dietilo

    Tereftalato de monoetilo Etanol

    Ftalato de dimetilo

    Ftalato de monometilo Metanol

    Ftalato de dietilo

    Ftalato de monoetilo Etanol

    Ftalato de dibutilo

    Ftalato de monobutilo Butanol

    Isoftalato de dimetilo

    Isoftalato de monometilo Metanol

    Benzoato de fenilo

    Ácido benzoico Fenol

    Fig. 5 (b): Fig. 5 (c):

    Fig. 6 (a): Fig. 6 (b):

    Fig. 6 (c): Fig. 7 (a):

    Fig. 7 (b):