ES2367194T3 - Cambio del equilibrio th1/th2 en vacunas contra la gripe fraccionadas con adyuvantes. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un antígeno del virus de la gripe fraccionado y un adyuvante Th1, en la que el antígeno se prepara a partir de un virus desarrollado en un cultivo celular y no incluye ninguna proteína de huevo y el adyuvante Th1 está en forma de (i) una emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, un tocoferol y polisorbato 80, o (ii) una emulsión submicrométrica de escualeno, polisorbato 80, trioleato de sorbitano y un oligonucleótido inmunoestimulador.

Description

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de las vacunas para proteger contra la infección por el virus de la gripe y, en particular, de vacunas fraccionadas.

Técnica antecedente

En los capítulos 17 y 18 de la referencia 1 se describen vacunas contra la gripe. Están basadas en virus vivos o virus inactivados, y las vacunas inactivadas pueden basarse en virus enteros, virus “fraccionados” o en antígenos de superficie purificados (incluyendo hemaglutinina y neuraminidasa). La hemaglutinina (HA) es el inmunógeno principal de las vacunas contra la gripe inactivadas, y las dosis de las vacunas se estandarizan tomando como referencia los niveles de HA, conteniendo típicamente las vacunas aproximadamente 15 µg de HA por cepa.

Las vacunas “fraccionadas” se obtienen tratando viriones con detergentes para producir preparaciones de subviriones, usando procedimientos tales como el procedimiento de fraccionamiento con “Tween-éter”. Las vacunas fraccionadas generalmente incluyen múltiples antígenos del virión de la gripe. Los productos BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ y FLUSHIELD™ son vacunas fraccionadas. El documento WO 01/80836 combina vacunas fraccionadas con un vector que comprende un núcleo hidrófilo no líquido.

Durante la temporada 2000-01 en Canadá, se observó un síndrome oculorespiratorio (SOR) recién identificado en pacientes que habían recibido vacunas fraccionadas. El SOR se ha asociado con un fraccionamiento incompleto de viriones durante la fabricación, proporcionando composiciones con una alta proporción de microagregados de viriones no fraccionados [2].

Es un objeto de la invención minimizar el riesgo de que una vacuna fraccionada contra la gripe pueda inducir SOR.

Divulgación de la invención

No hay ninguna explicación causal de la asociación entre las vacunas fraccionadas y el SOR, pero las características clínicas y epidemiológicas del SOR sugieren hipersensibilidad, y por lo tanto se ha propuesto que la vacuna puede alterar el equilibrio Th1/Th2 natural, causando los viriones no fraccionados en forma de partículas una desviación hacia un fenotipo Th2. En la referencia 3, por ejemplo, se descubrió que la presencia de agregados en vacunas fraccionadas contra la gripe desviaba la respuesta inmune a un patrón de citocinas Th2 mayor. Sin embargo, en la referencia 4 no puedo confirmarse ninguna asociación entre el SOR y el equilibrio Th1/Th2.

A pesar de la ausencia de cualquier evidencia razonable que asocie el SOR y una desviación Th2, la invención pretende minimizar la posibilidad de que una vacuna fraccionada pueda producir una respuesta Th2 excesiva. En una situación en la que tienen que producirse vacunas contra la gripe con rapidez (por ejemplo, después de un brote pandémico) las presiones sobre los fabricantes podrían hacer que, sin querer, se suministraran vacunas que tuvieran los mismos problemas que los lotes canadienses agregados parcialmente no fraccionados de la temporada 2000-01. De hecho, la referencia 2 indica que “es posible que no puedan eliminarse completamente los viriones no fraccionados y los agregados”, y que “puede ser inevitable algún riesgo de bajo nivel para desencadenar síntomas oculares y respiratorios”. Por consiguiente, la invención pretende evitar componentes en las vacunas fraccionadas que puedan causar una respuesta Th2 excesiva. Las respuestas Th2 no necesariamente se evitan completamente, ya que pueden ser importantes para la protección, sino una fuerte polarización Th2. Si se produce un fraccionamiento incompleto sin querer durante la fabricación, o si una vacuna fraccionada experimenta agregación durante el almacenamiento, pueden evitarse algunos efectos adversos (por ejemplo SOR) relacionados con la polarización Th2.

Para evitar la polarización Th2 se siguen dos enfoques, preferentemente en combinación. En primer lugar, cuando una vacuna fraccionada incluye un adyuvante, entonces el adyuvante se elige para estimular al menos una respuesta de tipo Th1 parcial, por ejemplo, se prefiere evitar añadir como adyuvante a una vacuna fraccionada contra la gripe únicamente sales de aluminio. En segundo lugar, en las vacunas fraccionadas se evita la presencia de alérgenos. Como las vacunas contra la gripe son especiales ya que se administran en cualquier estación, los pacientes que reciben múltiples dosis se sensibilizan a cualquier impureza que esté presente, y se ha notificado que los alérgenos producen respuestas Th2 en pacientes sensibilizados [5]. Para evitar los alérgenos, los procedimientos actuales basados en huevo para desarrollar virus de la gripe se reemplazan por procedimientos que usan cultivos celulares, evitando de esta manera la presencia de alérgenos del huevo contaminantes tales como ovoalbúmina y ovomucoide.

De esta manera, la invención proporciona una composición inmunogénica como se define en la reivindicación 1.

La invención también proporciona un kit como se define en la reivindicación 17.

El antígeno del virus de la gripe fraccionado

Las composiciones de la invención incluyen un antígeno obtenido por fraccionamiento de viriones de la gripe que se obtienen por crecimiento viral en cultivos celulares. El virión fraccionado típicamente incluirá múltiples antígenos del virión de la gripe, incluyendo hemaglutinina, neuraminidasa, matriz y nucleoproteína. La invención no incluye vacunas de virus vivos (tales como el producto FLUMIST™), vacunas inactivadas de viriones enteros (tales como el producto INFLEXAL™), vacunas de antígeno de superficie purificado (que incluyen sólo las glicoproteínas de superficie hemaglutinina y neuraminidasa, tales como los productos FLUVIRIN™, AGREPPAL™ e INFLUVAC™) o vacunas virosomales (que toman la forma de partículas liposomales de tipo viral sin ácidos nucleicos [6], como en los productos INFLEXAL V™ e INVAVAC™).

Los viriones pueden recogerse a partir de fluidos que contienen virus por diversos procedimientos. Por ejemplo, un procedimiento de purificación puede implicar centrifugación zonal usando una solución en gradiente de sacarosa lineal que incluye detergente para romper los viriones.

Pueden obtenerse viriones fraccionados tratando viriones purificados con detergentes (por ejemplo, éter etílico, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, bromuro de cetiltrimetilamonio, Tergitol NP9, etc.) para producir preparaciones de subviriones, incluyendo el proceso de fraccionamiento “Tween-éter”. Los procedimientos para fraccionar virus de la gripe son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véanse las referencias 7-12, etc. El fraccionamiento del virus típicamente se realiza rompiendo o fragmentando el virus entero, ya sea infeccioso o no infeccioso, con una concentración de disociación de un agente de fraccionamiento. La disociación da como resultado una solubilización parcial o completa de las proteínas del virus, alterando la integridad del virus. Son agentes de fraccionamiento preferidos tensioactivos no iónicos e iónicos (por ejemplo catiónicos), por ejemplo, alquilglucósidos, alquiltioglucósidos, acil azúcares, sulfobetaínas, betaínas, éteres alquílicos de polioxietileno, N,N-dialquil-Glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanoles, compuestos de amonio cuaternario, sarcosilo, CTAB (bromuros de cetil trimetil amonio), tri-N-butil fosfato, Cetavlon, sales de miristiltrimetilamonio, lipofectina, lipofectamina y DOT-MA, los octil-o nonilfenoxi polioxietanoles (por ejemplo, los tensioactivos Triton, tales como Triton X-100 o Triton N101), ésteres de polioxietileno sorbitano (los tensioactivo Tween), éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc. Un procedimiento de fraccionamiento útil usa los efectos consecutivos del desoxicolato sódico y el formaldehído, y el fraccionamiento puede realizarse durante la purificación inicial de los viriones (por ejemplo, en una solución en gradiente de densidad de sacarosa). Los viriones fraccionados pueden resuspenderse de forma provechosa en solución isotónica de cloruro sódico tamponada con fosfato sódico.

El virus de la gripe puede atenuarse. El virus de la gripe puede ser sensible a la temperatura. El virus de la gripe puede adaptarse al frío.

Las cepas de virus de la gripe usadas en las vacunas cambian de una estación a otra. En el periodo interpandémico actual, son típicas las vacunas trivalentes, incluyendo dos cepas de gripe A (H1N1 y H3N2) y una cepa de gripe B. La invención puede usarse con cepas interpandémicas de este tipo, pero también puede usarse con virus de cepas pandémicas (es decir, cepas frente a las que el receptor de la vacuna y la población humana general son inmunológicamente vírgenes), tales como las cepas de subtipo H2, H5, H7 o H9 (en particular del virus de la gripe A), y las vacunas contra la gripe para cepas pandémicas pueden ser monovalentes o, por ejemplo, pueden estar basadas en una vacuna trivalente normal suplementada con una cepa pandémica. Dependiendo de la estación y de la naturaleza del antígeno incluido en la vacuna, sin embargo, la invención puede proteger contra uno o más de los subtipos de HA del virus de la gripe A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. La invención puede proteger contra uno o más subtipos de NA del virus de la gripe A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9.

Además de ser adecuadas para la inmunización contra cepas interpandémicas, las composiciones de la invención son particularmente útiles para inmunizar contra cepas pandémicas. Las características de una cepa de gripe que le dan la posibilidad de producir un brote pandémico son: (a) contiene una nueva HA en comparación con las HA presentes en las cepas humanas circulantes actualmente, es decir, una que no se ha visto en la población humana durante una década (por ejemplo H2) o previamente no se ha visto en absoluto en la población humana (por ejemplo H5, H6 o H9, que generalmente se han encontrado únicamente en poblaciones de aves), de tal forma que la población humana será inmunológicamente virgen a las HA de las cepas; (b) es capaz de transmitirse horizontalmente en la población humana; y (c) es patógena en seres humanos. Se prefiere un virus con el tipo de hemaglutinina H5 para inmunizar contra una gripe pandémica, tal como una cepa H5N1. Otras cepas posibles incluyen H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 y H7N7, y cualquier otra cepa pandémica potencialmente emergente. Dentro del subtipo H5, un virus puede clasificarse en HA clado 1, HA clado 1’, HA clado 2 o HA clado 3 [13], siendo particularmente relevantes los clados 1 y 3.

Las cepas del virus de la gripe usadas con la invención pueden ser resistentes a una terapia antiviral (por ejemplo, resistentes a oseltamivir [14] y/o zanamivir), incluyendo cepas pandémicas resistentes [15].

Las composiciones de la invención pueden incluir antígenos de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más) cepas del virus de la gripe, incluyendo virus de la gripe A y/o virus de la gripe B. Cuando una vacuna incluye más de una cepa de gripe, las diferentes cepas típicamente se desarrollan por separado y se mezclan después de haber recogido y fraccionado los virus. De esta manera, un procedimiento de la divulgación puede incluir la etapa de mezclar antígenos fraccionados de más de una cepa de gripe. Se prefiere una vacuna trivalente, que incluye dos cepas del virus de la gripe A y una cepa del virus de la gripe B.

En algunas realizaciones de la invención, las composiciones pueden incluir antígenos de una sola cepa de la gripe

A. En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir antígenos de dos cepas de la gripe A, siempre que estas dos cepas no sean H1N1 y H3N2. En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir antígenos de más de dos cepas de la gripe A.

El virus de la gripe puede ser una cepa reordenante y puede haberse obtenido por técnicas genéticas inversas. Las técnicas genéticas inversas [por ejemplo, 16-20] permiten preparar virus de la gripe con segmentos genómicos deseados in vitro usando plásmidos. Típicamente, implican la expresión de (a) moléculas de ADN que codifican moléculas de ARN virales deseadas, por ejemplo, a partir de promotores de polI, y (b) moléculas de ADN que codifican proteínas virales, por ejemplo, a partir de promotores de polII, de tal forma que la expresión de los dos tipos de ADN en una célula conduce al montaje de un virión infeccioso intacto completo. El ADN preferentemente proporciona todas las proteínas y ARN virales, pero también es posible usar un virus auxiliar para proporcionar algunos de los ARN y proteínas. Se prefieren procedimientos basados en plásmidos que usan plásmidos separados para producir cada ARN viral [21-23], y estos procedimientos también implicarán el uso de plásmidos para expresar todos o algunos (por ejemplo, sólo las proteínas PB1, PB2, PA y NP) de las proteínas virales, usándose 12 plásmidos en algunos procedimientos.

Para reducir el número de plásmidos necesarios, un enfoque reciente [24] combina una pluralidad de casetes de trascripción de ARN polimerasa I (para la síntesis de ARN viral) en el mismo plásmido (por ejemplo, secuencias que codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8 segmentos de ARNv de la gripe A) y una pluralidad de regiones codificantes de proteínas con promotores de la ARN polimerasa II en otro plásmido (por ejemplo, secuencias que codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8 transcritos de ARNm de la gripe A). Los aspectos preferidos del procedimiento de la referencia 24 implican: (a) regiones codificantes de ARNm de PB1, PB2 y PA en un solo plásmido; y (b) los 8 segmentos que codifican ARNv en un solo plásmido. También puede facilitar el asunto incluir los segmentos NA y HA en un plásmido y los otros seis segmentos en otro plásmido.

Como alternativa al uso de promotores de poll para codificar los segmentos de ARN virales, es posible usar promotores de polimerasas de bacteriófagos [25]. Por ejemplo, pueden usarse convenientemente promotores para las polimerasas de SP6, T3 o T7. Debido a la especificidad de especie de los promotores de polI, los promotores de polimerasas de bacteriófagos pueden ser más convenientes para muchos tipos celulares (por ejemplo, MDCK) aunque una célula también debe transfectarse con un plásmido que codifique la enzima polimerasa exógena.

En otras técnicas es posible usar promotores de polI y polII dobles para codificar simultáneamente los ARN virales y para ARNm expresables a partir de un solo molde [26,27].

De esta manera, un virus de la gripe A puede incluir uno o más segmentos de ARN de un virus A/PR/8/34 (típicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, siendo los segmentos HA y N de una cepa de vacuna, es decir, un reordenante 6:2). También puede incluir uno o más segmentos de ARN de un virus A/WSN/33, o de cualquier otra cepa de virus útil para generar virus reordenantes para la preparación de vacunas. Típicamente, la composición de la invención protege contra una cepa que es capaz de transmitirse de un ser humano a otro, y de esta forma el genoma de la cepa normalmente incluirá al menos un segmento de ARN que se originó en un virus de la gripe de mamífero (por ejemplo, en un ser humano). Puede incluir un segmento NS que se originó en un virus de la gripe aviar.

Los virus usados como fuente de los antígenos se desarrollan en cultivo celular. El sustrato de crecimiento viral típicamente será una línea celular procedente de un mamífero. Las células de mamífero de origen adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de hámster, vaca, primate (incluyendo seres humanos y monos) y perro. Pueden usarse diversos tipos celulares, tales como células renales, fibroblastos, células de retina, células pulmonares, etc. Son ejemplos de células de hámster adecuadas las líneas celulares que tienen los nombres BHK21

o HKCC. Son células de mono adecuadas, por ejemplo, células de mono verde africano, tales como células renales como en la línea celular Vero. Son células de perro adecuadas, por ejemplo, células renales, como en la línea celular MDCK. De esta manera, las líneas celulares adecuadas incluyen, pero sin limitación: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Las líneas celulares de mamífero preferidas para desarrollar virus de la gripe incluyen: células MDCK [28-31], derivadas de riñón canino Madin Darby; células Vero [32-34], derivadas de riñón de mono verde africano (Cercopithecus aethiops); o células PER.C6 [35], derivadas de retinoblastos embrionarios humanos. Estas líneas celulares están disponibles ampliamente, por ejemplo, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) [36], en el Depósito de Células Coriell [37], o de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Por ejemplo, la ATCC suministra diversas células Vero diferentes con los números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 y CRL-1587, y suministra células MDCK con el número de catálogo CCL-34. PER.C6 está disponible en la ECACC con el número de depósito 96022940. Como alternativa menos preferida a las líneas celulares de mamífero, pueden desarrollarse virus en líneas celulares aviares [por ejemplo, refs. 38-40], incluyendo líneas celulares derivadas de patos (por ejemplo, retina de pato) o gallinas, por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo (CEF), etc. Los ejemplos incluyen células madre embrionarias aviares [38, 41], incluyendo la

línea celular EBx derivada de células madre embrionarias de pollo, EB45, EB14 y EB14-074 [42].

Las líneas celulares más preferidas para desarrollar virus de la gripe son líneas celulares MDCK. La línea celular MDCK original está disponible en la ATCC como CCL-34, pero también pueden usarse derivados de esta línea celular. Por ejemplo, la referencia 28 desvela una línea celular MDCK que se adaptó para el crecimiento en cultivo en suspensión (“MDCK 33016”, depositada como DSM ACC 2219). De forma similar, la referencia 43 desvela una línea celular derivada de MDCK que se desarrolla en suspensión en un cultivo sin suero (“B-702”, depositada como FERM BP-7449). La referencia 44 desvela células MDCK no tumorigénicas, incluyendo “MDCK-S” (ATCC PTA6500), “MDCK-SF101” (ATCC PTA-6501), “MDCK-SF102” (ATCC PTA-6502) y “DCK-SF103” (PTA-6503). La referencia 45 desvela líneas celulares MDCK con alta susceptibilidad a la infección, incluyendo células “MDCK.5F1” (ATCC CRL-12042). Puede usarse cualquiera de estas líneas celulares MDCK.

Los virus pueden desarrollarse en células en suspensión [28, 46, 47] o en cultivos adherentes. Como alternativa, puede usarse un cultivo sobre microsoporte. Una línea celular MDCK adecuada para el cultivo en suspensión es MDCK 33016 (depositada como DSM ACC 2219).

Las líneas celulares que soportan la replicación del virus de la gripe preferentemente se dejan crecer en un medio de cultivo sin suero y/o medio sin proteínas. Se dice que un medio es un medio sin suero en el contexto de la presente invención cuando no hay aditivos procedentes de suero de un ser humano o animal. Se entiende que sin proteínas significa cultivos en los que la multiplicación de las células se produce con la exclusión de proteínas, factores de crecimiento, otros aditivos proteicos y proteínas no séricas, pero pueden incluir opcionalmente proteínas tales como tripsina u otras proteasas que pueden ser necesarias para el crecimiento viral. Las células que se desarrollan en estos cultivos contienen naturalmente proteínas por sí mismas.

El cultivo celular usado para el crecimiento, y también el inóculo viral usado para iniciar el cultivo, preferentemente carece de (es decir se habrá ensayado y habrá dado un resultado negativo para la contaminación por) virus del herpes simple, virus sincitial respiratorio, virus paragripal 3, coronavirus SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, poliomavirus, bimavirus, circovirus y/o parvovirus [48]. Se prefiere particularmente la ausencia de virus del herpes simple.

Las líneas celulares que soportan la replicación del virus de la gripe preferentemente se desarrollan por debajo de 37 ºC [49], por ejemplo, a 30-36 ºC durante la replicación viral.

Las vacunas de la invención preferentemente contienen menos de 10 ng (preferentemente menos de 1 ng y más preferentemente menos de 100 pg) de ADN residual de la célula huésped por dosis, aunque pueden estar presentes cantidades muy pequeñas de ADN de la célula huésped. En general, el ADN de célula huésped que es deseable excluir de las composiciones de la invención es el ADN que es mayor de 100 pb.

La medición del ADN residual de la célula huésped actualmente es un requisito regulador rutinario para los productos biológicos y está dentro de las competencias normales del experto en la materia. El ensayo usado para medir ADN típicamente será un ensayo validado [50,51]. Las características de comportamiento de un ensayo validado pueden describirse en términos matemáticos y cuantificables, y se habrán identificado sus posibles fuentes de error. El ensayo generalmente se habrá ensayado con respecto a características tales como exactitud, precisión y especificidad. Una vez que un ensayo se ha calibrado (por ejemplo, contra cantidades patrón conocidas de ADN de célula huésped) y se ha probado, entonces pueden realizarse rutinariamente las mediciones cuantitativas del ADN. Pueden usarse tres técnicas principales para la cuantificación de ADN: procedimientos de hibridación, tales como transferencias de Southern o transferencias en ranura [52]; procedimientos de inmunoensayo tales como el sistema Threshold™ [53]; y PCR cuantitativa [54]. El experto en la materia estará familiarizado con todos estos procedimientos, aunque las características precisas de cada procedimiento pueden depender de la célula hospedadora en cuestión, por ejemplo, la elección de sondas para la hibridación, la elección de cebadores y/o sondas para la amplificación, etc. El sistema Threshold™ de Molecular Devices es un ensayo cuantitativo para niveles de picogramos de ADN total, y se ha usado para supervisar niveles de ADN contaminante en productos biofarmacéuticos [53]. Un ensayo típico implica la formación no específica de secuencia de un complejo de reacción entre una proteína de unión a ADNmc (monocatenario) biotinilado, un anticuerpo anti-ADNmc conjugado con ureasa, y ADN. Todos los componentes del ensayo se incluyen en el kit de ensayo de ADN total completo disponible en el fabricante. Diversos fabricantes comerciales ofrecen ensayos de PCR cuantitativos para detectar el ADN residual de la célula huésped, por ejemplo, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, etc. En la referencia 55 puede encontrarse una comparación de un ensayo de hibridación quimioluminiscente y el sistema Threshold™ de ADN total para medir la contaminación por ADN de la célula huésped de una vacuna viral humana.

El ADN contaminante puede retirarse durante la preparación de la vacuna usando procedimientos de purificación convencionales, por ejemplo, cromatografía, etc. La eliminación del ADN residual de la célula huésped puede aumentarse por tratamiento con nucleasas, por ejemplo, usando DNasa. En las referencias 56 y 57 se desvela un procedimiento conveniente para reducir la contaminación por ADN de la célula huésped que implica un tratamiento de dos etapas, usando primero una DNasa (por ejemplo Benzonase), que puede usarse durante el desarrollo viral, y después un detergente catiónico (por ejemplo CTAB), que puede usarse durante la disociación de los viriones. También puede usarse el tratamiento con un agente alquilante, tal como β-propiolactona, para retirar el ADN de la

célula huésped, y ventajosamente también puede usarse para inactivar viriones [58].

Se prefieren vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo <1 ng, <100 pg) de ADN de la célula huésped por 15 µg de hemaglutinina, tales como vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo <1 ng, <100 pg) de ADN de la célula huésped por volumen de 0,25 ml. Son más preferidas las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo <1 ng, <100 pg) de ADN de la célula huésped por 50 µg de hemaglutinina, como lo son las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo <1 ng, <100 pg) de ADN de la células huésped por volumen de 0,5 ml.

El procedimiento para propagar virus en células cultivadas generalmente incluye las etapas de inocular las células cultivadas con la cepa a cultivar, cultivar las células infectadas durante un periodo de tiempo deseado para la propagación del virus, tal como, por ejemplo, como se determina por el título de virus o la expresión de antígeno (por ejemplo entre 24 y 168 horas después de la inoculación) y recoger el virus propagado. Las células cultivadas se inoculan con un virus (medido por PFU o TCID50) a una relación de células de 1:500 a 1:1, preferentemente de 1:100 a 1:5, y más preferentemente de 1:50 a 1:10. El virus se añade a una suspensión de las células o se aplica a una monocapa de las células, y el virus se absorbe en las células durante al menos 60 minutos, pero normalmente menos de 300 minutos, preferentemente entre 90 y 240 minutos a una temperatura de 25 ºC a 40 ºC, preferentemente de 28 ºC a 37 ºC. El cultivo celular infectado (por ejemplo monocapas) puede retirarse por congelación-descongelación o por acción enzimática para aumentar el contenido viral de los sobrenadantes de cultivo recogidos. Los fluidos recogidos después se inactivan o se almacenan congelados. Las células cultivadas pueden infectarse a una multiplicidad de infección (“m.d.i.”) de aproximadamente 0,0001 a 10, preferentemente de 0,002 a 5, y más preferentemente de a 0,001 a 2. Aún más preferentemente, las células se infectan a una m.d.i de aproximadamente 0,01. Las células infectadas pueden recogerse de 30 a 60 horas después de la infección. Preferentemente, las células se recogen de 34 a 48 horas después de la infección. Aún más preferentemente, las células se recogen de 38 a 40 horas después de la infección. Generalmente se añaden proteasas (típicamente tripsinas) durante el cultivo celular para permitir la liberación viral, y las proteasas pueden añadirse en cualquier fase adecuada durante el cultivo.

La hemaglutinina (HA) es el inmunógeno principal de las vacunas de la gripe inactivadas, incluyendo las vacunas fraccionadas, y las dosis de las vacunas se estandarizan tomando como referencia los niveles de HA, típicamente medidos por un ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID). Las vacunas fraccionadas existentes típicamente contienen aproximadamente 15 µg de HA por cepa, aunque también se usan dosis inferiores, por ejemplo, para niños o en situaciones pandémicas. Se han usado dosis fraccionales tales como 1/2 (es decir, 7,5 µg de HA por cepa, y 1/8 [63,64], así como dosis superiores (por ejemplo, 3x o 9x [59,60]). De esta manera, las vacunas pueden incluir entre 0,1 y 150 µg de HA por cepa de la gripe, preferentemente entre 0,1 y 50 µg, por ejemplo, 0,1-20 µg, 0,115 µg, 0,1-10 µg, 0,1-7,5 µg, 0,5-5 µg, etc. Las dosis particulares incluyen, por ejemplo, aproximadamente 45, aproximadamente 30, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5, etc. por cepa. La inclusión de un adyuvante en la vacuna puede compensar la inmunogenicidad intrínseca inferior de estas dosis menores.

La HA usada con la invención puede ser una HA natural como la que se encuentra en un virus, o puede haberse modificado. Por ejemplo, se sabe como modificar HA para retirar determinantes (por ejemplo, regiones hiperbásicas alrededor del sitio de escisión entre HA1 y HA2) que hacen que un virus sea muy patógeno en especies aviares.

Las composiciones de la invención pueden incluir un detergente, por ejemplo, un tensioactivo de éster de polioxietileno sorbitano (conocido como “Tween”), un octoxinol (tal como octoxinol-9 (Triton X-100) o toctilfenoxipolietoxietanol), un bromuro de cetil trimetil amonio (“CTAB”), o desoxicolato sódico, particularmente para una vacuna de antígeno de superficie o fraccionada. El detergente puede estar presente sólo en cantidades muy pequeñas. De esta manera, la vacuna puede incluir menos de 1 mg/ml de cada uno de octoxinol-10 y polisorbato 80. Otros componentes residuales en cantidades muy pequeñas podrían ser antibióticos (por ejemplo, neomicina, kanamicina o polimixina B).

Los adyuvantes

Se conoce el uso de adyuvantes con vacunas contra la gripe. Por ejemplo, el producto FLUAD™, que está basado en antígenos de superficie purificados, incluye un adyuvante de emulsión MF59. Además, las referencias 61 a 64 desvelan el uso de sales de aluminio para actuar como adyuvante en vacunas contra la gripe de viriones completos, para reducir la cantidad de antígeno requerido para una sola dosis de vacuna contra la gripe (permitiendo de esta manera producir un mayor número de dosis a partir de una cantidad fija de antígeno). Actualmente no hay vacunas fraccionadas contra la gripe con adyuvantes en el mercado.

Como las sales de aluminio (como las usadas en las referencias 61 a 64) promueven una respuesta inmune de tipo Th2 cuando se usan por sí mismas, la invención no utiliza este adyuvante para virus de la gripe fraccionados. En su lugar, se usan adyuvantes alternativos como los descritos más adelante.

La distinción entre linfocitos T auxiliares Th1 y Th2 es bien conocida. Los adyuvantes Th1 y Th2 producen una respuesta inmune frente a un antígeno coadministrado que se desviará, respectivamente, hacia una respuesta de tipo Th1 o de tipo Th2. De esta manera, los adyuvantes Th1 dan como resultado la producción de linfocitos T específicos de antígeno que liberan citocinas tales como IL-2 e interferón-γ (que conducen a anticuerpos IgG2a) y TNF-α, mientras que los adyuvantes Th2 dan como resultado la producción de linfocitos T específicos de antígeno que liberan citocinas tales como IL-4 (que conducen a IgG1) e IL-5. El equilibrio Th1/Th2 de un adyuvante particular puede evaluarse por ensayos conocidos (véase más adelante), pero puede variar dependiendo de factores tales como la vía de administración o la presencia de sustancias coadministradas. Los adyuvantes usados con la invención pueden inducir una respuesta exclusivamente de tipo Th1 contra antígenos de la gripe cuando se administran a un paciente, pero preferentemente inducirán una respuesta mixta de tipo Th1/Th2. También pueden inducirse linfocitos Th0, pero se evitará una respuesta Th2 polarizada.

Las respuestas de tipo Th1 están asociadas de forma natural a infecciones bacterianas y, por lo tanto, los adyuvantes usados con la invención generalmente incluyen sustancias que imitan una sustancia bacteriana. Los adyuvantes Th1 pueden ser moduladores y/o agonistas de receptores de tipo Toll (TLR). Por ejemplo, pueden ser agonistas de una o más de las proteínas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9 humanas. Los agentes preferidos son agonistas de TLR7 (por ejemplo, imidazoquinolinas) y/o TLR9 (por ejemplo, oligonucleótidos CpG). Estos agentes son útiles para activar rutas de inmunidad innatas.

Oligonucleótidos inmunoestimuladores

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o (con la excepción del ARNbc) monocatenarios. Las referencias 111, 112 y 113 desvelan posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, reemplazos de guanosina con 2’-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de oligonucleótidos CpG se analiza adicionalmente en las referencias 114-119. La secuencia CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [120]. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Th1, tal como un ODN (oligodesoxinucleótido) CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. En las referencias 121-123 se analizan ODN CpG-A y CpG-B. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A. Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de forma que el extremo 5’ sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias oligonucleotídicas CpG pueden unirse por sus extremos 3’ para formar “inmunómeros”. Véanse, por ejemplo, las referencias 120 y 124-126. Un adyuvante CpG útil es CpG7909, también conocido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.).

Como alternativa o además del uso de secuencias CpG, pueden usarse secuencias TpG [127]. Estos oligonucleótidos pueden carecer de motivos CpG no metilados.

El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo TTTT, como se desvela en la referencia 127), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25% de timidina (por ejemplo >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC, como se desvela en la ref. 127), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25% de citosina (por ejemplo >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Estos oligonucleótidos pueden carecer de motivos CpG no metilados.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores típicamente comprenderán al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

3dMPL

El 3dMPL (también conocido como monofosforil lípido A o 3-des-O-acilado o 3-O-desacil-4’-monofosforil lípido A) es un adyuvante en el que la posición 3 de la glucosamina terminal reductora del monofosforil lípido A se ha desacilado. El 3dMPL se ha preparado a partir de un mutante sin heptosa de Salmonella minnesota, y es químicamente similar al lípido A pero carece de un grupo fosforilo lábil a ácidos y de un grupo acilo lábil a bases. Activa a células del linaje de los monocitos/macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-α y GM-CSF (véase también la ref. 103). En la referencia 129 se describió originalmente la preparación de 3dMPL.

El 3dMPL puede tomar la forma de una mezcla de moléculas relacionadas, que varían por su acilación (es decir, que tienen 3, 4, 5 ó 6 cadenas acilo, que pueden ser de diferentes longitudes). Los dos monosacáridos de glucosamina (también conocida como 2-desoxi-2-aminoglucosa) están N-acilados en sus carbonos en la posición 2 (es decir, en las posiciones 2 y 2’) y también hay una O-acilación en la posición 3’. El grupo unido al carbono 2 tiene la fórmula NH-CO-CH2-CR1R1’. El grupo unido al carbono 2’ tiene la fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2’. El grupo unido al carbono 3’ tiene la fórmula -O-CO-CH2-CR3R3’. Una estructura representativa es:

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Los grupos R1, R2 y R3 son cada uno, independientemente, -(CH2)n-CH3. El valor de n preferentemente está comprendido entre 8 y 16, más preferentemente entre 9 y 12, y aún más preferentemente es 10.

Los grupos R1’, R2’ y R3’ pueden ser, independientemente: (a) -H; (b) -OH; o (c) -O-CO-R4, en el que R4 es -H o (CH2)m-CH3, en el que el valor de m está comprendido preferentemente entre 8 y 16, y más preferentemente es 10, 12 ó 14. En la posición 2, m es preferentemente 14. En la posición 2’, m es preferentemente 10. En la posición 3’, m es preferentemente 12. Los grupos R1, R2’ y R3’ son, por lo tanto, preferentemente grupos -O-acilo del ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico o ácido hexadecanoico.

Cuando todos de R1’, R2’ y R3’ son -H, entonces el 3dMPL tiene sólo 3 cadenas acilo (una en cada una de las posiciones 2, 2’ y 3’). Cuando sólo dos de R1’, R2’ y R3’ son -H, entonces el 3dMPL puede tener 4 cadenas acilo. Cuando sólo uno de R1’, R2’ y R3’ es -H, entonces el 3dMPL puede tener 5 cadenas acilo. Cuando ninguno de R1’, R2’ y R3’ es -H, entonces el 3dMPL puede tener 6 cadenas acilo. El adyuvante 3dMPL usado de acuerdo con la invención puede ser una mezcla de estas formas, con 3 a 6 cadenas acilo, pero se prefiere incluir 3dMPL con 6 cadenas acilo en la mezcla, y en particular para asegurar que la cadena hexaacilo constituye al menos un 10% en peso del 3dMPL total, por ejemplo, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50% o más. Se ha descubierto que el 3dMPL con 6 cadenas acilo es la forma activa más adyuvante.

De esta manera, la forma más preferida de 3dMPL para la inclusión en las composiciones de la invención está en la Figura 2.

Cuando 3dMPL se usa en forma de una mezcla, entonces las referencias a cantidades o concentraciones de 3dMPL en las composiciones de la invención se refieren a las especies de 3dMPL combinadas en la mezcla.

En condiciones acuosas, 3dMPL puede formar agregados micelares o partículas con diferentes tamaños, por ejemplo, con un diámetro <150 nm o >500 nm. Con la invención puede usarse cualquiera de ellos o ambos, y las mejores partículas pueden seleccionarse por un ensayo rutinario. Se prefieren partículas más pequeñas (por ejemplo, suficientemente pequeñas para proporcionar una suspensión acuosa transparente de 3dMPL) para uso de acuerdo con la invención debido a su actividad superior [130]. Las partículas preferidas tienen un diámetro medio menor de 220 nm, más preferentemente menor de 200 nm o menor de 150 nm o menor de 120 nm, y pueden tener incluso un diámetro medio menor de 100 nm. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el diámetro medio no será menor de 50 nm. Estas partículas son suficientemente pequeñas como para ser adecuadas para la esterilización por filtración. El diámetro de partículas puede evaluarse por la técnica rutinaria de dispersión de luz dinámica, que revela un diámetro medio de partículas. Cuando se dice que una partícula tiene un diámetro de x nm, generalmente, será una distribución de partículas alrededor de esta media, pero al menos un 50% en número (por ejemplo, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, o más) de las partículas tendrá un diámetro dentro del intervalo x±25%.

3dMPL puede usarse ventajosamente en combinación con una emulsión de aceite en agua. Sustancialmente todo el 3dMPL puede localizarse en la fase acuosa de la emulsión.

Un cantidad típica de 3dMPL en una vacuna es 10-100 µg/dosis, por ejemplo, aproximadamente 25 µgo aproximadamente 50 µg.

Compuestos de vitamina E

La referencia 135 notifica que un suplemento de vitamina E aumenta las respuestas de tipo Th1. La mejora de la inmunidad humoral y mediada por células por un suplemento de vitamina E también se notifica en la referencia 136, pero se indica que la administración como adyuvante de vacuna tiene un efecto mucho mayor. Además, la referencia 104 notifica que la vitamina E tiene un impacto significativo sobre la expresión de genes implicados en el equilibrio Th1/Th2. Por ejemplo, la estimulación con vitamina E de células inmunes puede conducir directamente a una mayor producción de IL-2 (es decir, una respuesta de tipo Th1).

La vitamina E natural existe en ocho formas diferentes o isómeros: cuatro tocoferoles y cuatro tocotrienoles. Todos los isómeros tienen un anillo de cromanol, con un grupo hidroxilo que puede donar un átomo de hidrógeno para reducir radicales libres y una cadena lateral hidrófoba que permite la penetración en membranas biológicas. Hay una forma α, β, γ y δ tanto de los tocoferoles como de los tocotrienoles, determinadas por el número de grupos metilo en el anillo de cromanol. Cada forma tiene su propia actividad biológica, la medida de potencia o uso funcional en el cuerpo.

Los compuestos de vitamina E para la inclusión en las composiciones de la invención son tocoferoles, y puede usarse cualquiera de los tocoferoles α, β, γ, δ, ε o ξ. Se prefieren los α-tocoferoles. Los tocoferoles preferidos tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las composiciones, particularmente emulsiones [137].

Los tocoferoles pueden tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Puede usarse tanto D-α-tocoferol como DL-α-tocoferol. Un α-tocoferol preferido es el DL-α-tocoferol, y la sal preferida de este tocoferol es el succinato. Ventajosamente, se sabe que el succinato de α-tocoferol es compatible con vacunas de la gripe y que es un conservante útil como alternativa a los compuestos mercuriales [11].

Como los compuestos de vitamina E normalmente son aceites, convenientemente pueden incluirse como un componente en una emulsión de aceite en agua, ya que se sabe que dichas emulsiones son compatibles con las vacunas contra la gripe (véase más adelante), y en la referencia 138 se notifica que las emulsiones de aceite en agua que contienen tocoferoles son adyuvantes de inducción de Th1.

Adyuvantes de emulsión de aceite en agua

Se sabe que las emulsiones de aceite en agua son adecuadas como adyuvantes en vacunas del virus de la gripe, por ejemplo, el producto FLUAD™ contiene un adyuvante de emulsión MF59. Estas emulsiones típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el aceite o los aceites y el tensioactivo o los tensioactivos biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Los componentes de la emulsión influyen en el equilibrio Th1/Th2 y, por lo tanto, no todas las emulsiones son adecuadas para uso con la invención. Por ejemplo, el adyuvante MF59 preferentemente desvía la respuesta inmune hacia una respuesta de tipo Th2 y, por lo tanto, la invención no usa el adyuvante MF59 solo (aunque puede usar MF59 en combinación con un inmunopotenciador, tal como un oligonucleótido inmunoestimulador). Por el contrario, las emulsiones que contienen tocoferol desveladas en la referencia 138 inducen una respuesta de tipo Th1, y por lo tanto pueden usarse con la invención. El equilibrio Th1/Th2 de una emulsión particular puede evaluarse por ensayos convencionales, por ejemplo, usando los ensayos ELISPOT de doble color de las refs. 139 y 140, el ensayo múltiple basado en microesferas de la ref. 141 o el ensayo rápido de citometría de flujo de la ref.142.

Las gotas de aceite de una emulsión adecuada generalmente tienen menos de 5 µm de diámetro, e incluso pueden tener un diámetro submicrométrico, consiguiéndose estos pequeños tamaños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotas con un tamaño menor de 220 nm, ya que pueden someterse a esterilización por filtración.

Las emulsiones pueden incluir aceites tales como los procedentes de una fuente animal (tal como un pez) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y cereales. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, que son los disponibles más comúnmente, sirven como ejemplos de aceites de frutos secos. Puede usarse aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido a partir de la jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo y similares. En el grupo de los cereales, el aceite de maíz es el más disponible, pero también puede usarse el aceite de otros cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Pueden prepararse ésteres de ácidos grasos de 610 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se producen de forma natural en aceites de semillas, por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados procedentes de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites procedentes de leche de mamíferos son metabolizables y, por lo tanto, pueden usarse en la práctica de la presente invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena, tal como el esperma de ballena, sirven como ejemplos de varios de los aceites de pescado que pueden usarse en la presente memoria. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene terpenoides insaturados ramificados conocidos como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que se usa en la presente memoria. Los aceites de pescado, incluyendo el escualeno, se pueden adquirir fácilmente en fuentes comerciales o pueden obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica. Como se ha mencionado anteriormente, otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase más adelante). Pueden usarse mezclas de aceites.

Los tensioactivos pueden clasificarse por su “EHL” (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferidos de la invención tienen un EHL de al menos 10, preferentemente al menos 15 y más preferentemente al menos 16. La invención puede usarse con tensioactivos que incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de ésteres de polioxietileno sorbitano (denominados comúnmente Tweens), especialmente el polisorbato 20 y el polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP), y/u óxido de butileno (OB), vendidos con el nombre comercial DOWFAX™, tales como copolímeros de bloque OE/OP lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) repetidos, siendo de un interés particular el octoxinol 9 (Triton X-100, o toctilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); nonifenol etoxilatos, tales como la serie Tergitol™ NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como tensioactivos Brij), tales como monolauril éter de trietilenglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitano (conocidos comúnmente como SPAN), tales como trioleato de sorbitano (Span 85) y monolaurato de sorbitano. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. Son tensioactivos preferidos para incluir en la emulsión Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina y Triton X-100.

Pueden usarse mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietileno sorbitano tal como monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietileno sorbitano y/o un octoxinol.

Son cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso): de un 0,01 a un 1% de ésteres de polioxietileno sorbitano (tales como Tween 80), en particular aproximadamente un 0,1%; de un 0,001 a un 0,1% de octil-o nonilfenoxi polioxietanoles (tales como Triton X-100 u otros detergentes de la serie Triton), en particular de un 0,005 a un 0,02%; de un 0,1 a un 20 % de éteres de polioxietileno (tales como laureth 9), preferentemente de un 0,1 a un 10% y, en particular, de un 0,1 a un 1%, o aproximadamente un 0,5%.

Dos emulsiones de aceite en agua específicas usadas como adyuvantes con la invención son:

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Una emulsión de escualeno, un tocoferol y Tween 80. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo al 1%) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de un 2 a un 10% de escualeno, de un 2 a un 10% de tocoferol y de un 0,3 a un 3% de Tween 80, y la relación en peso entre escualeno y tocoferol preferentemente es ≤ 1, ya que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el Tween 80 pueden estar presentes en una relación en volumen de aproximadamente 5:2. Esta emulsión puede obtenerse disolviendo Tween 80 en PBS para dar una solución al 2%, y después mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-α-tocoferol y 5 ml de escualeno), y después sometiendo la mezcla a microfluidización. La emulsión resultante puede tener gotas de aceite submicrométricas, por ejemplo, con un diámetro medio comprendido entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm.

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Una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80 y Span 85 [143-145], que también incluye un oligonucleótido inmunoestimulador. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente un 5% de escualeno, aproximadamente un 0,5% de polisorbato 80 y aproximadamente un 0,5% de Span 85. En términos en peso, estas relaciones se convierten en un 4,3% de escualeno, un 0,5% de polisorbato 80 y un 0,48% de Span 85, como se describe con más detalle en el Capítulo 10 de la ref. 146 y el capítulo 12 de la ref.

147. La emulsión ventajosamente incluye iones citrato, por ejemplo, tampón citrato sódico 10 mM.

Estas emulsiones pueden suplementarse con 3dMPL y/o con una saponina, como se describe en la referencia 138.

Las emulsiones pueden mezclarse con antígeno antes de la distribución, o pueden mezclarse con antígeno extemporáneamente, en el momento de la administración. De esta manera, el adyuvante y el antígeno pueden mantenerse separados en una vacuna envasada o distribuida, preparada para la formulación final en el momento de uso. El antígeno generalmente estará en una forma acuosa, de tal forma que la vacuna finalmente se prepara mezclando dos líquidos. La relación de volumen de los dos líquidos para mezcla puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5), pero generalmente es aproximadamente 1:1. Después de haber mezclado el antígeno y el adyuvante, el antígeno de hemaglutinina generalmente permanecerá en la solución acuosa, pero puede distribuirse en la interfaz de aceite/agua. En general, en la fase de aceite de la emulsión entrará, si acaso, una pequeña cantidad de hemaglutinina.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones de la invención son farmacéuticamente aceptables. Pueden incluir componentes además del antígeno fraccionado y el adyuvante, por ejemplo, típicamente incluyen uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticos. En la ref. 148 está disponible un análisis minucioso de dichos componentes.

Las composiciones generalmente estarán en forma acuosa. En antígeno fraccionado y el adyuvante típicamente estarán mezclados.

La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que las vacunas carezcan sustancialmente (es decir, tengan menos de 5 µg/ml) de material mercurial, por ejemplo, que carezcan de tiomersal [11,149]. Son más preferidas las vacunas que no contiene mercurio, y esto puede conseguirse convenientemente usando un adyuvante que contenga tocoferol siguiendo la ref. 11. Se prefieren particularmente las vacunas sin conservantes.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro sódico (NaCl), que puede estar presente en cantidades comprendidas entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro potásico, fosfato potásico diácido, fosfato disódico dihidrato, cloruro de magnesio, cloruro cálcico, etc.

Las composiciones generalmente tendrán una osmolalidad comprendida entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y más preferentemente estará dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg. Previamente se ha notificado que la osmolalidad no tiene un impacto sobre el dolor producido por la vacunación [150], sin embargo se prefiere mantener la osmolalidad en este intervalo.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Los tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM. Convenientemente puede usarse una emulsión formada en solución salina tamponada con fosfato.

El pH de una composición generalmente estará comprendido entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5 o entre 7,0 y 7,8. Por lo tanto, un procedimiento de la invención puede incluir una etapa de ajustar el pH de la vacuna a granel antes del envasado.

La composición preferentemente es estéril. La composición preferentemente es no pirogénica, es decir, contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. La composición preferentemente carece de gluten.

La composición puede incluir material para una sola inmunización, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit “multidosis”). En disposiciones multidosis se prefiere la inclusión de un conservante. Como alternativa (o además) a la inclusión de un conservante en composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para extraer el material.

Las vacunas contra la gripe típicamente se administran en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque puede administrarse la mitad de una dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) por ejemplo a niños.

Las composiciones y kits preferentemente se almacenan a una temperatura comprendida entre 2 ºC y 8 ºC. No deben congelarse. Idealmente, deben mantenerse protegidas de la luz directa.

Kits de la invención

Las composiciones de la invención pueden prepararse extemporáneamente, en el momento de la administración. De esta manera, la invención proporciona kits que incluyen los diversos componentes listos para la mezcla. El kit permite mantener separados el adyuvante y el antígeno hasta el momento de uso, lo cual puede ser útil cuando se usa un adyuvante de emulsión de aceite en agua.

Los componentes están separados físicamente entre sí dentro de un kit, y esta separación puede conseguirse de diversas formas. Por ejemplo, los dos componentes pueden estar en dos recipientes separados, tales como viales. Los contenidos de los dos viales después pueden mezclarse, por ejemplo, retirando el contenido de un vial y añadiéndolo al otro vial, o retirando por separado los contenidos de los dos viales y mezclándolos en un tercer recipiente.

En una disposición preferida, uno de los componentes del kit está en una jeringa y el otro está en un recipiente tal como un vial. La jeringa puede usarse (por ejemplo, con una aguja) para insertar su contenido en el segundo recipiente para la mezcla, y la mezcla después puede extraerse al interior de la jeringa. El contenido mezclado de la jeringa después puede administrarse a un paciente, típicamente a través de una nueva aguja estéril. El envasado de un componente en una jeringa elimina la necesidad de usar una jeringa separada para la administración al paciente.

En otra disposición preferida, los dos componentes del kit se mantienen, pero por separado, en la misma jeringa, por ejemplo, en una jeringa de doble cámara tal como la desvelada en las referencias 151-158 etc. Cuando se acciona la jeringa (por ejemplo, durante la administración a un paciente), entonces se mezclan los contenidos de las dos cámaras. Esta disposición evita la necesidad de una etapa de mezcla separada en el momento del uso.

Los componentes del kit generalmente estarán en forma acuosa. En algunas disposiciones, un componente (típicamente el componente de antígeno en lugar del componente de adyuvante) está en forma seca (por ejemplo, en una forma liofilizada), estando el otro componente en una forma acuosa. Los dos componentes pueden mezclarse para reactivar el componente seco y proporcionar una composición acuosa para la administración a un paciente. Un componente liofilizado típicamente se localizará dentro de un vial en lugar de en una jeringa. Los componentes secos pueden incluir estabilizantes tales como lactosa, sacarosa o manitol, así como mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol etc. Una posible disposición usa un componente adyuvante acuoso en una jeringa precargada y un componente de antígeno liofilizado en un vial.

Envasado de composiciones o componentes del kit

Los recipientes adecuados para las composiciones de la invención (o componentes de kit) incluyen viales, jeringas (por ejemplo, jeringas desechables), pulverizaciones nasales, etc. Estos recipientes deben ser estériles.

Cuando una composición/componente se pone en un vial, el vial puede estar hecho de un material de plástico o vidrio. Puede esterilizarse antes de que se añada la composición/componente. Para evitar problemas con los pacientes sensibles al látex, los viales pueden sellarse con un tapón sin látex, y se prefiere la ausencia de látex en todos los materiales de envasado. El vial puede incluir una sola dosis de vacuna, o puede incluir más de una dosis (un vial “multidosis”), por ejemplo, 10 dosis. Los viales preferidos están hechos de vidrio incoloro.

Un vial puede tener una tapa (por ejemplo, un cierre tipo Luer) adaptada de tal forma que puede insertarse una jeringa precargada en la tapa, el contenido de la jeringa puede expulsarse al interior del vial (por ejemplo, para reconstituir el material liofilizado en su interior) y el contenido del vial puede extraerse de nuevo al interior de la jeringa. Después de retirar la jeringa del vial, puede acoplarse una aguja y la composición puede administrarse al paciente. La tapa preferentemente si sitúa dentro de un precinto o cubierta, de tal forma que el precinto o cubierta tenga que retirarse antes de que pueda accederse a la tapa. Un vial puede tener una tapa que permita la retirada aséptica de su contenido, particularmente en caso de viales multidosis.

Cuando un componente se envasa en una jeringa, la jeringa puede tener una aguja acoplada a la misma. Si no está acoplada una aguja, puede suministrarse una aguja separada con la jeringa para el montaje y el uso. Dicha jeringa puede estar cubierta. Se prefieren las agujas de seguridad. Son típicas las agujas de 25,4 mm de calibre 23, de 25,4 mm de calibre 25 y 15,87 mm de calibre 25. Las jeringas pueden proporcionarse con etiquetas desprendibles sobre las que puede estar impreso el número de lote, la estación de gripe y la fecha de caducidad del contenido, para facilitar el mantenimiento del registro. El émbolo de la jeringa preferentemente tiene un tope para impedir que el émbolo se extraiga accidentalmente durante la aspiración. Las jeringas pueden tener una tapa de goma de látex y/o émbolo. Las jeringas desechables contienen una sola dosis de vacuna. La jeringa generalmente tendrá una tapa en la punta para sellar la punta antes del acoplamiento de una aguja, y la tapa de la punta preferentemente está hecha de una goma de butilo. Si la jeringa y la aguja se envasan por separado, entonces la aguja preferentemente está equipada con una cubierta de goma de butilo. Son jeringas preferidas las comercializadas con el nombre comercial “Tip-Lok” ™.

Los recipientes pueden comercializarse para mostrar un volumen de la mitad de una dosis, por ejemplo, para facilitar la administración en niños. Por ejemplo, una jeringa que contiene una dosis de 0,5 ml puede tener una marca que muestre un volumen de 0,25 ml.

Cuando se usa un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringa o vial), se prefiere usar un recipiente hecho de un vidrio de borosilicato en lugar de un vidrio sódico-cálcico.

Un kit o composición puede envasarse (por ejemplo, en la misma caja) con un folleto que incluya detalles de la vacuna, por ejemplo, instrucciones para la administración, detalles de los antígenos dentro de la vacuna, etc. Las instrucciones también pueden contener advertencias, por ejemplo, que se tenga disponible una solución de adrenalina en caso de que se produzca una reacción anafiláctica después de la vacunación, etc.

Procedimientos de tratamiento y administración de la vacuna

Las composiciones de la invención son adecuadas para la administración a pacientes humanos en un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un paciente, que comprende la etapa de administrar una composición de la invención al paciente.

La respuesta inmune inducida por estos procedimientos generalmente incluirá una respuesta de anticuerpos, preferentemente una respuesta de anticuerpos protectores. En la técnica se conocen bien procedimientos para evaluar las respuestas de anticuerpos, la capacidad neutralizadora y la protección después de la vacunación con virus de la gripe. Los estudios humanos han demostrado que los títulos de anticuerpo contra la hemaglutinina del virus de la gripe humana están correlacionados con la protección (un título de inhibición de hemaglutinación en muestra de suero de aproximadamente 30-40 proporciona aproximadamente un 50% de protección frente a la infección por un virus homólogo) [159]. Las respuestas de anticuerpos típicamente se miden por inhibición de hemaglutinación, por microneutralización, por inmunodifusión radial simple (SRID) y/o por hemólisis radial simple (SRH). Estas técnicas de ensayo son bien conocidas en este campo.

Las composiciones de la invención pueden administrarse de diversas maneras. La vía de inmunización más preferida es por inyección intramuscular (por ejemplo, en el brazo o la pierna), pero otras vías disponibles incluyen la inyección subcutánea, intranasal [160-162], oral [163], intradérmica [164,165], transcutánea, transdérmica [166], etc.

Las composiciones de la invención pueden usarse para tratar tanto a niños como a adultos. Las vacunas contra la gripe actualmente se recomiendan para uso en inmunización pediátrica y de adultos, desde la edad de 6 meses. De esta manera, el paciente puede tener menos de 1 año de edad, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años o al menos 55 años. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, ≥50 años, ≥60 años, preferentemente ≥65 años), los niños pequeños (por ejemplo, ≤5 años), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, pacientes inmunodeficientes enfermos crónicamente, pacientes que han tomado un compuesto antiviral (por ejemplo, un compuesto de oseltamivir o zanamivir; véase más adelante) en los 7 días previos a la recepción de la vacuna, personas con alergias al huevo y personas que viajan al extranjero. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden usarse más generalmente en una población. Para cepas pandémicas, se prefiere la administración a todos los grupos de edad.

Las composiciones preferidas de la invención satisfacen 1, 2 ó 3 de los criterios CPMP para la eficacia. En adultos (18-60 años), estos criterios son: (1) ≥70% de seroprotección; (2) ≥40% de seroconversión; y/o (3) un aumento de GMT de ≥2,5 veces. En ancianos (>60 años), estos criterios son: (1) ≥60% de seroprotección; (2) ≥30% de seroconversión; y/o (3) un aumento de GMT de ≥2 veces. Estos criterios se basan en estudios de etiqueta descubierta con al menos 50 pacientes.

El tratamiento puede realizarse por un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, una estimulación parenteral y un refuerzo mucoso, una estimulación mucosa y un refuerzo parenteral, etc. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útil en pacientes inmunológicamente vírgenes, por ejemplo, para personas que nunca han recibido una vacuna contra la gripe antes,

o para la vacunación contra un nuevo subtipo de HA (como en un brote pandémico). Las dosis múltiples típicamente se administrarán con un intervalo de al menos 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Las vacunas de la invención pueden administrarse a los pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita al profesional sanitario o centro de vacunación) que otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubéola, una vacuna MMR, una vacuna contra la varicela, una vacuna MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna antitetánica, una vacuna contra la tos ferina, una vacuna DTP, una vacuna de H. influenzae de tipo b conjugada, una vacuna de poliovirus inactivado, una vacuna de virus de hepatitis B, una vacuna meningocócica conjugada (tal como una vacuna A-C-W135-Y tetravalente), una vacuna de virus sincitial respiratorio, una vacuna neumocócica conjugada, etc. La administración sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna neumocócica y/o una vacuna meningocócica es particularmente útil en pacientes de edad avanzada.

De forma similar, las vacunas de la invención pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario) que un compuesto antiviral, y en particular un compuesto antiviral activo contra el virus de la gripe (por ejemplo, oseltamivir y/o zanamivir). Estos antivirales incluyen inhibidores de neuraminidasa, tales como ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1etilpropoxi)-1-ciclohexano-1-carboxílico o ácido 5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anhidro-3,4,5tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enónico, incluyendo ésteres del mismo (por ejemplo, los ésteres etílicos) y sales del mismo (por ejemplo las sales fosfato). Un antiviral preferido es el ácido (3R,4R, SS)-4-acetilamino-5-amino-3(1etilpropoxi)-1-ciclohexeno-1-carboxílico, éster etílico, fosfato (1:1), también conocido como fosfato de oseltamivir (TAMIFLU™).

General

La expresión “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

El término “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que “carece sustancialmente” de Y puede carecer completamente de Y. Cuando es necesario, el término “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10%.

A menos que se indique específicamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezcla de dos o más componentes no requiere ningún orden de mezcla específico. De esta manera, los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces dos componentes pueden combinarse entre sí, y la combinación después puede combinarse con el tercer componente, etc.

Cuando se usan materiales animales (y en particular bovinos) en el cultivo de células, deben obtenerse de fuentes que estén libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) y, en particular, libres de encefalopatía

5

10

15

20

25

30

espongiforme bovina (EEB). En general, se prefiere cultivar células en ausencia total de materiales de origen animal. Cuando un compuesto se administra al cuerpo como parte de una composición, entonces ese compuesto puede reemplazarse alternativamente por un profármaco adecuado.

Cuando se usa un sustrato celular para el reordenamiento o procedimientos genéticos inversos, preferentemente es uno que se haya aprobado para uso en la producción de vacunas humanas, por ejemplo, en el capítulo general 5.2.3 de la Ph Eur.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el número de células positivas para citocinas, como un % de células CD4+ totales. Se muestran las respuestas de dos ratones individuales. Los ratones se inmunizaron con vacunas fraccionadas “A” o “B”, sin adyuvante o con (i) alumbre o (ii) MF59 con un oligonucleótido CpG como adyuvantes.

La Figura 2 muestra la fórmula de la forma más preferida de 3dMPL para uso con la invención.

Modos para realizar la invención

Adyuvante de emulsión de aceite en agua que favorece la respuesta a Th1

Se obtuvieron dos vacunas contra la gripe trivalentes de virión fraccionado sin adyuvante disponibles en el mercado ("SPLIT (A)" y SPLIT (B)") y se usaron para inmunizar ratones a una dosis de 0,2 µg de HA. Las vacunas se usaron sin adyuvante o utilizando como adyuvante (i) hidróxido de aluminio o (ii) una mezcla de emulsión MF59 y 10 µg de un oligonucleótido CpG inmunoestimulador. Se inmunizaron por vía intramuscular con las vacunas grupos de 8 ratones Balb/C hembra, de 8 semanas de edad, con dosis de 50 µl los días 0 y 28. Se obtuvieron sueros los días 14 y 42 y se analizaron con respecto al título anti-HA (IgG), título HI y células T.

Los títulos de anticuerpo IgG en suero (ELISA) en el día 42 fueron los siguientes, considerando cada virus por separado.

Sin adyuvante

Alumbre MF59+CpG

Anti-H1N1

SPLIT (A)

749 1329 8808

SPLIT (B)

1175 1991 6754

Anti-H3N2

SPLIT (A)

412 977 6032

SPLIT (B)

1111 1465 5308

Anti-B

SPLIT (A)

707 2534 11211

SPLIT (B)

1585 2520 10837

Los títulos de anticuerpo en el suero HI en el día 42 fueron los siguientes:

Sin adyuvante

Alumbre MF59+CpG

Anti-H1N1

SPLIT (A)

140 280 1387

SPLIT (B)

285 330 1371

Anti-H3N2

SPLIT (A)

290 780 800

SPLIT (B)

380 440 1371

Anti-B

SPLIT (A)

280 780 800

SPLIT (B)

550 440 1371

Como se muestra en la Figura 1, las vacunas sin adyuvante indujeron niveles muy bajos de células T específicas de antígeno. El alumbre como adyuvante aumentó los niveles, de una manera desviada a Th2: en un ratón, el alumbre produjo un gran aumento en linfocitos T IL-5+IFN-γ-TNF-α-(es decir, tipo Th2), pero no se vieron células IL-5-IFNγ+TNF-α+ (es decir, de tipo Th1). Por el contrario, una combinación de MF59 y un oligonucleótido CpG produjo tanto un gran aumento en el número de linfocitos T específicos de antígeno como un desplazamiento hacia una respuesta de tipo Th1.

Por lo tanto, es posible usar un adyuvante de emulsión de aceite en agua para elevar el número de linfocitos T específicos de antígeno inducidos por una vacuna fraccionada contra la gripe, y también para desplazar la respuesta inmune hacia una respuesta de tipo Th1. Por el contrario, un adyuvante de alumbre induce bajos niveles de células T con una respuesta de tipo Th2.

Ensayos Humanos [referencia 167]

Como se describe en la referencia 167, a vacunas fraccionadas contra la gripe se les añadió como adyuvante una emulsión de aceite en agua que tenía una fase orgánica constituida por dos aceites (α-tocoferol y escualeno) y una

5 fase acuosa de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween 80 como agente emulsionante. Tiene una concentración final de un 2,5% de escualeno (v/v), un 2,5% de α-tocoferol (v/v) y un 0,9% de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) (Tween 80). Inicialmente se preparó como un concentrado de dos veces para mezclar con antígenos de la gripe. Se notifica que esta emulsión es un adyuvante de inducción de Th1.

La emulsión se preparó disolviendo Tween 80 en (PBS) para dar una solución al 2%. Para proporcionar 100 ml de

10 un concentrado de dos veces, se agitaron vorticialmente 5 g de D,L-α-tocoferol y 5 ml de escualeno para mezclarlos minuciosamente. Se añadieron 90 ml de la solución de PBS/Tween a la mezcla de aceite y se mezclaron minuciosamente. La emulsión resultante después se pasó a través de una jeringa y finalmente se microfluidizó. Las gotas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 120-180 nm (media Z).

En los experimentos de control, no se incluyó la emulsión.

15 Se administraron vacunas trivalentes a pacientes humanos de edad avanzada. Se midieron las respuestas inmunes humorales y mediadas por células en los pacientes como se describe en la referencia 167. Se determinaron la seroprotección y la seroconversión.

Los porcentajes de seroprotección y seroconversión fueron los siguientes (izquierda = control; derecha = con adyuvante):

A/New Caledonia

A/Panama B/Shangdong

Seroprotección

98,0 98,0 91,8 100,0 95,9 100,0

Seroconversión

69,4 69,4 65,3 55,1 69,4 73,5

Las respuestas de anticuerpo anti-HA fueron las siguientes:

Día

A/New Caledonia A/Panama B/Shangdong

Control: sin adyuvante

0

26,3 40,9 26,0

21

358,5 296,0 270,0

Emulsión como adyuvante

0

25,6 52,3 27,5

21

317,7 366,1 317,7

Para comparar las respuestas Th1 y Th2 entre la vacuna sin adyuvante de control y la vacuna con emulsión como adyuvante, se ensayaron las respuestas de citocinas. Se reestimularon linfocitos T CD4+ tomados de pacientes

25 inmunizados con un antígeno fraccionado y se evaluaron con respecto al número que secretaba (i) al menos interferón-γ (indicativo de una respuesta Th1) y otro de IL-2, TNFα o CD40L; o (ii) al menos IL-2 (de nuevo, indicativo de una respuesta Th1) y otro de IFN-γ, TNFα o CD40L. Los resultados, expresados como una diferencia antes y después de la inmunización, fueron los siguientes:

Sin Adyuvante

Con Adyuvante

IFN- imagen2

IL-2 IFN- imagen2 IL-2

CD4

1149 1738 2712 3465

30 La vacuna con adyuvante muestra más respuesta de tipo Th1 que el control sin adyuvante. De esta manera, el adyuvante que contiene tocoferol puede modular el equilibrio Th1/Th2 de una vacuna fraccionada contra la gripe.

Se entenderá que la invención se ha descrito sólo a modo de ejemplo y que pueden realizarse modificaciones siempre que se mantenga dentro del alcance de la invención.

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[146] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[147] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O’Hagan.

[148] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20ª edición, ISBN: 0683306472.

[149] Banzhoff (2000) Immmology Letters 71: 91-96.

[150] Nony y col. (2001) Vaccine 27: 3645-51.

[151] Documento WO2005/089837.

[152] Patente de Estados Unidos 6.692.468.

[153] Documento WO00/07647.

[154] Documento WO99/17820.

[155] Patente de Estados Unidos 5.971.953.

[156] Patente de Estados Unidos 4.060.082.

[157] Documento EP-A-0520618.

[158] Documento WO98/01174.

[159] Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75.

[160] Greenbaum y col. (2004) Vaccine 22: 2566-77.

[161] Zurbriggen y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2: 295-304.

[162] Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43: 728-30.

[163] Mann y col. (2004) Vaccine 22: 2425-9.

[164] Halperin y col. (1979) Am J Public Health 69: 1247-50.

[165] Herbert y col. (1979) J Infect Dis 140: 234-8.

[166] Chen y col. (2003) Vaccine 21: 2830-6.

[167] Documento WO2006/100109.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición inmunogénica que comprende un antígeno del virus de la gripe fraccionado y un adyuvante Th1, en la que el antígeno se prepara a partir de un virus desarrollado en un cultivo celular y no incluye ninguna proteína de huevo y el adyuvante Th1 está en forma de (i) una emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, un tocoferol y polisorbato 80, o (ii) una emulsión submicrométrica de escualeno, polisorbato 80, trioleato de sorbitano y un oligonucleótido inmunoestimulador.

2. 2.

   La composición de la reivindicación 1, en la que el antígeno del virus de la gripe es de un subtipo de virus de la gripe A H1, H2, H3, H5, H7 o H9.

3. 3.

   La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la composición carece de ovoalbúmina, ovomucoide y ADN de pollo.

4. 4.

   La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la composición contiene entre 0 y 20 µg de hemaglutinina por cepa viral.

5. 5.

   La composición de la reivindicación 4, en la que la composición contiene aproximadamente 15 µg de HA por cepa

   o contiene aproximadamente 3,8 µg de HA por cepa.

6. 6.

   La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que el tocoferol es de DL-α-tocoferol.

7. 7.

   La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la emulsión tiene gotas con un diámetro submicrométrico.

8. 8.

   La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que el antígeno del virus de la gripe se prepara a partir de un virus de la gripe que tiene uno o más segmentos de ARN procedentes de un virus de la gripe A/PR/8/34.

9. 9.

   La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que el adyuvante comprende un monofosforil lípido A 3O-desacilado (3dMPL).

10. 10.

    La composición de la reivindicación 16, en la que al menos un 10% en peso del 3dMPL es la forma de cadena hexaacilo.

11. 11.

    La composición de cualquier reivindicación anterior, que carece sustancialmente de material mercurial.

12. 12.

    La composición de cualquier reivindicación anterior, que incluye uno o más tampones.

13. 13.

    La composición de la reivindicación 12, en la que el tampón o tampones incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón de histidina; o un tampón citrato.

14. 14.

    La composición de cualquier reivindicación anterior, que tiene un pH comprendido entre 5,0 y 8,1.

15. 15.

    La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la composición incluye dos cepas de la gripe A y una cepa de la gripe B.

16. 16.

    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la composición es una vacuna monovalente contra una cepa del virus de la gripe pandémica.

17. 17.

    Un kit para preparar la composición de cualquier reivindicación anterior, que comprende (a) un primer componente del kit que comprende un antígeno del virus de la gripe fraccionado preparado a partir de un virus desarrollado en cultivo celular y que no incluye ninguna proteína de huevo, y (b) un segundo componente de kit que comprende un adyuvante Th1 en forma de (i) una emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, un tocoferol y polisorbato 80, o (ii) una emulsión submicrométrica de escualeno, polisorbato 80, trioleato de sorbitano y un oligonucleótido inmunoestimulador; en el que el primer y segundo componentes están en recipientes separados.