ES2366061T3

ES2366061T3 - Un vector y una línea celular de expresión novedosos para la producción en masa de una proteína recombinante y un proceso de producción de proteína recombinante usando los mismos.

Info

Publication number: ES2366061T3
Application number: ES07833373T
Authority: ES
Inventors: In Young Choi; Chang Hwan Kim; Hyun Ji Lee; Seong Hee Park; Se Chang Kwon; Gwan Sun Lee
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd; Hanmi Holdings Co Ltd
Current assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd; Hanmi Holdings Co Ltd
Priority date: 2006-10-16
Filing date: 2007-10-16
Publication date: 2011-10-14
Anticipated expiration: 2027-10-16
Also published as: US8957196B2; JP5076084B2; EP2087118A1; JP2010506586A; EP2087118B1; KR20080034364A; US20100120089A1; CN101605899A; WO2008048037A1; CN101605899B; KR100880509B1; EP2087118A4; ATE512229T1; HK1137481A1

Abstract

Un modulo de alta expresión inducible que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una dihidrofolato reductasa y una secuencia nucleotídica que está ligada con la secuencia nucleotídica y codifica un promotor de dihidrofolato reductasa del que se han eliminado una o más secuencias CCGCCC repetidas.

Description

Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a un vector para la producción en masa de una proteína recombinante, a una línea celular de expresión para producir la proteína recombinante y a un procedimiento de producción y purificación de la proteína recombinante usando la línea celular. Más particularmente, la presente invención se refiere a un vector capaz de potenciar en gran medida la eficacia de la amplificación génica al debilitar artificialmente un promotor del gen de dihidrofolato reductasa, que es una secuencia de control transcripcional del gen, a una línea celular animal transformada con el vector y a un procedimiento de expresión de una proteína de interés usando la línea celular animal y purificando solo una forma altamente glucosilada de la proteína.

Antecedentes de la técnica

[0002] Se han usado una variedad de vectores y hospedadoras para la producción en masa de proteínas recombinantes. Se ha usado ampliamente E. coli, pero tiene una utilidad limitada en la producción de proteínas que necesitan glucosilarse o tienen estructuras complicadas. Estos problemas pueden superarse usando células animales, células de levadura, animales transformados, plantas transformadas y similares.

[0003] La levadura es ventajosa en la producción en masa de proteínas, pero es bien conocido que la glucosilación de levadura es diferente de la glucosilación humana y que es por tanto altamente inmunogénica (Hermeling y col., Pharm. Res. 21(6): 897-903 (2004)). No se han comercializado animales transformados debido a la dificultad en el cuidado y el mantenimiento de los animales y a la potencial contaminación con patógenos microbiológicos.

[0004] El uso de líneas celulares animales está gravado por el alto coste de la producción de proteína y el tiempo y los gastos requeridos para el establecimiento de una línea celular, pero se usa muy comúnmente para la producción de proteína recombinante porque este sistema produce proteína recombinante de forma muy similar a la observada en células humanas y posibilita una producción y mantenimiento de proteína estables. Sin embargo, cuando se transforman para la producción de proteína recombinante, la mayoría de líneas celulares animales exhiben bajos niveles de expresión y por tanto no se han usado todavía para realizar una producción de alto rendimiento. La amplificación génica es la estrategia que se usa rutinariamente para superar los problemas asociados a los sistemas de expresión de células animales. Los dos sistemas de amplificación usados ampliamente son amplificación basada en dihidrofolato reductasa (DHFR) y amplificación basada en glutamina sintetasa, pudiendo ambas aumentar considerablemente el rendimiento de proteína recombinante de las líneas celulares animales. A pesar de su ventaja de mejorar la producción de proteína, los sistemas de amplificación génica tienen los inconvenientes de que requieren múltiples ciclos de amplificación génica para usar altas concentraciones de metotrexato (de aquí en adelante, designado simplemente como "MTX"), que consumen tiempo, y el subcultivo a largo plazo de líneas celulares conduce a una pérdida génica y una expresión inestable.

[0005] Se han realizado muchos intentos por superar los inconvenientes de los sistemas de amplificación génica. Por ejemplo, la patente coreana de número de registro 0162021 emplea un gen de DHFR que se sitúa bajo el control de un promotor de SV40 parcialmente eliminado. La patente coreana de número de registro 0493703 describe la introducción de una mutación en un promotor de citomegalovirus (CMV) de modo que se altere la afinidad de la proteína de unión a ADN metilada por su secuencia de reconocimiento en el promotor. La patente coreana de número de registro 0184778 emplea la región 5’ no codificante de una proteína de unión (Bip) a la cadena pesada de inmunoglobulina como sitio de entrada interno de ribosoma (IRES) para poner un gen de DHFR bajo el control no de un promotor independiente, sino de una secuencia de control de la transcripción de una proteína recombinante de interés.

[0006] La patente coreana de número de registro 0162021 estaba dirigida al control de la actividad del promotor de SV40 eliminando de 128 a 270 nucleótidos. Sin embargo, no es conocido exactamente el papel de la secuencia eliminada, y no se menciona el papel de la secuencia restante. En particular, debido a que esta patente no muestra que la amplificación génica no aumenta más a concentraciones de MTX mayores de 20 nM en condiciones que no contengan un control, no proporciona apoyo alguno al cambio de la actividad del promotor de DHFR y a la expresión optimizada a baja concentración de MTX. La patente coreana de número de registro 0493703 pretendía conseguir una amplificación génica eficaz modificando la secuencia de reconocimiento de proteína de unión a ADN metilada en el promotor de CMV, pero el efecto de amplificación sobre la expresión es menor que en otros procedimientos. En la patente coreana de número de registro 0184778, la expresión dependiente de IRES, realizada en lugar del uso de un promotor independiente, permite la amplificación génica meramente a niveles de MTX tan bajos como de varios micromoles (µM) y un aumento de expresión de aproximadamente 30 veces. Por tanto, la amplificación del gen de DHFR no puede predecirse a partir de la modificación de un promotor genérico, y la aplicación de un promotor modificado se determinará solo cuando la amplificación génica se efectúe usando sustancialmente varias clases de promotores.

[0007] La eritropoyetina humana (EPO), que se ilustra como un ejemplo de proteínas recombinantes de la presente invención, es una glucoproteína de aproximadamente 34 kDa, pero la masa molecular de la cadena peptídica (EPO no glucosilada) es solo de aproximadamente 18 kDa. La EPO se sintetiza en el riñón en respuesta a anemia, hipoxia o hemorragia, y estimula la producción de eritrocitos y mantiene la hemostasia. La EPO está presente en aproximadamente 10 a 20 mUI/ml en adultos, y la disfunción renal produce una anemia grave (Jacobson, y col., Nature, 179: 633-634 (1957)). Por tanto, la EPO se ha usado como agente terapéutico para insuficiencia renal crónica y anemia causada por diversos factores. En el pasado, la EPO se recogía del plasma sanguíneo de animales, o de la sangre u orina de pacientes con anemia aplásica, que producen EPO a niveles mayores que las personas sanas, pero la EPO se obtiene en forma inestable y con bajo rendimiento. La EPO urinaria de personas sanas se obtiene a bajas concentraciones, y requiere una gran purificación porque la orina contiene un inhibidor de la actividad de la EPO (véanse las patentes de EE.UU. nº 4.397.840, 4.303.650 y 3.865.810). Puesto que es difícil obtener grandes cantidades de EPO de alta pureza a partir de la sangre o la orina, se han desarrollado procedimientos de preparación de EPO usando técnicas de recombinación genética. Sin embargo, puesto que se requiere glucosilación para la actividad in vivo de la EPO, cuando se clona y expresa un gen de EPO en E. coli o levadura, la EPO no está glucosilada en su forma nativa, y por tanto no exhibe su actividad biológica. Por ello, el uso de una línea celular animal recombinante es esencialmente necesario para la producción de EPO. En el caso de usar una línea celular animal recombinante, la EPO se produce habitualmente basándose en un sistema de amplificación génica de DHFR (Malik y col., DNA and Cell Bio., 6: 453-459 (1992)).

Descripción de la invención Problema técnico

[0008] Basándose en un estudio previo realizado por Michel Fromm y Paul Berg (J. Mol. Appl. Genet. 1983. 2(1): 127-135), que sugería que seis secuencias repetidas ricas en GC en una región promotora ligada a un gen estructural de DHFR son importantes para la actividad transcripcional del promotor, los inventores de esta solicitud construyeron un vector de expresión para células animales que es más eficaz en la amplificación y expresión génica eliminando secuencialmente las secuencias ricas en GC, conduciendo así a la presente invención.

Solución técnica

[0009] Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar un vector de expresión que sea más eficaz en la amplificación génica para la producción de una proteína recombinante en células animales.

[0010] Es otro objeto de la presente invención proporcionar una línea celular animal transformada con el vector de expresión.

[0011] Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción en masa de una proteína recombinante usando la línea celular animal.

Breve descripción de los dibujos

[0012] La FIG. 1 representa esquemáticamente un proceso de construcción de los vectores de expresión X1GC/dhfr, X3GC/dhfr y X6GC/dhfr, que contienen secuencias ricas en GC completas o truncadas secuencialmente;

[0013] la FIG. 2 representa esquemáticamente un proceso de construcción de un vector de expresión X0GC/dhfr del que se han eliminado todas las seis secuencias ricas en GC;

[0014] la FIG. 3 representa esquemáticamente un proceso de clonación de un gen gEPO en los vectores de expresión de las FIG. 1 y 2;

[0015] las FIG. 4 a 7 muestran los resultados del análisis ELISA de los niveles de expresión de EPO de líneas celulares transformadas cada una con un vector de expresión según la presente invención;

[0016] la FIG. 8 muestra los resultados de la transferencia Western para los niveles de expresión de un gen de DHFR amplificado;

[0017] la FIG. 9 muestra los resultados del análisis ELISA indirecto para los niveles de expresión de EPO humana en especímenes de sobrenadante que se recogieron nueve veces durante el cultivo a gran escala de un clon monocelular XOGC/GEP09647(DXB11), que se selecciona en el ejemplo 6;

[0018] la FIG. 10 muestra los resultados de los análisis de PAGE-SDS y transferencia Western de EPO recombinante purificada en el ejemplo 8;

[0019] la FIG. 11 muestra los resultados del enfoque isoeléctrico de la EPO recombinante purificada en el ejemplo 4; y

[0020] la FIG. 12 muestra los resultados del enfoque isoeléctrico de EPO expresada cultivando X1GC/GEPO9629(DG44) y X0GC/GEP09603(DG44), que están completamente asimilados a una condición exenta de suero.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

[0021] Para lograr los objetos anteriores, la presente invención proporciona un vector de expresión para una línea celular animal que comprende un promotor del gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) del que se han eliminado algunas secuencias repetidas ricas en GC.

[0022] Como se describe anteriormente, se ha usado ampliamente un sistema de amplificación génica basado en DHFR para inducir un alto nivel de expresión de proteínas recombinantes en células animales, pero es problemático que no garantice la estabilización de la línea celular y que consuma tiempo y sea caro debido al uso a largo plazo de un inhibidor de DHFR a alta concentración. Los presentes inventores encontraron que un vector de expresión que alberga un gen DHFR, que está situado bajo el control de un promotor de DHFR truncado del que se han eliminado parcial o completamente las secuencias repetidas ricas en GC, es capaz de inducir la expresión del gen de DHFR y/o un gen recombinante de interés portado por el mismo, a una mayor eficacia y en menor tiempo incluso a una menor concentración de inhibidor de DHFR.

[0023] Como se usa en la presente memoria, el término “secuencias repetidas ricas en GC” designa las secuencias CCGCCC repetidas que están contenidas en un promotor de DHFR, que es una secuencia de control transcripcional de DHFR. Cuando las secuencias repetidas se vuelven parcial o totalmente inactivas mediante una deleción u otras mutaciones, se minimiza la expresión de DHFR. Cuando se añade un inhibidor de DHFR en un estado en que se mantiene la expresión de DHFR a niveles mínimos, las células amplifican un mayor número de genes de DHFR para su supervivencia y, también, se amplifica y por tanto se expresa a altos niveles un gen recombinante de interés portado por un vector de expresión que alberga el gen de DHFR.

[0024] Por tanto, en un aspecto detallado de la presente invención se proporciona un módulo de expresión inducible para expresión a alto nivel que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) que contiene un promotor del que se han eliminado una o más secuencias CCGCCC repetidas. El módulo de alta expresión inducible comprende preferiblemente un promotor de DHFR que contiene menos de seis secuencias CCGCCC repetidas, más preferiblemente un promotor de DHFR que contiene menos de tres secuencias CCGCCC repetidas, particularmente preferiblemente un promotor de DHFR que contiene cero o una secuencias CCGCCC repetidas, y más particularmente un promotor de DHFR del que se han eliminado todas las secuencias CCGCCC repetidas.

[0025] La eliminación de las secuencias CCGCCC repetidas puede conseguirse mediante sustitución, deleción o similares de nucleótidos según una técnica de recombinación genética ampliamente conocida en la materia. En la práctica de la presente invención, se eliminan parcial o totalmente las secuencias ricas en GC del promotor mediante la deleción parcial o completa de una secuencia nucleotídica que contiene las secuencias CCGCCC.

[0026] En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende el módulo de alta expresión inducible.

[0027] Como se usa en la presente memoria, el término “vector” significa un vehículo para introducir un gen de interés en una célula hospedadora para expresar el gen. Los vectores útiles en la presente invención incluyen vectores plasmídicos, vectores cosmídicos, vectores de bacteriófagos y vectores víricos tales como vectores adenovíricos, vectores retrovíricos y vectores víricos adenoasociados. Se prefieren los vectores plasmídicos.

[0028] Preferiblemente, el vector de expresión puede incluir adicionalmente un gen que codifica una proteína recombinante de interés. La proteína recombinante de interés puede expresarse a altos niveles expresando el vector de expresión.

[0029] La proteína recombinante de interés incluye típicamente polipéptidos fisiológicamente activos. Dichos polipéptidos fisiológicamente activos incluyen una variedad de proteínas tales como hormonas, citocinas, interleucinas, proteínas de unión a interleucina, enzimas, anticuerpos, factores de crecimiento, factores reguladores de la transcripción, factores de coagulación, vacunas, proteínas estructurales, proteínas o receptores de ligando, antígenos de superficie celular, antagonistas de receptor y derivados y análogos de los mismos.

[0030] Los ejemplos no limitantes detallados de polipéptidos fisiológicamente activos incluyen hormona de crecimiento humana, interferones y receptores de interferón, factores estimulantes de colonia, interleucinas, eritropoyetina, insulina, angiotensina, factor de crecimiento óseo, factor de linfocitos B, factor de linfocitos T, factores de crecimiento nervioso, antígenos de superficie celular, anticuerpos monoclonales y antígenos de vacuna derivados de virus.

[0031] Los especialistas en la materia seleccionarán fácilmente una proteína recombinante capaz de aplicarse a un sistema de amplificación génica basado en DHFR usando la tecnología actual. En la práctica preferida de la presente invención, la proteína recombinante es eritropoyetina humana.

[0032] La proteína recombinante de interés puede expresarse bajo el control del promotor del gen de DHFR o bajo el control de un promotor independiente. Preferiblemente, la proteína recombinante de interés puede situarse bajo el control de un promotor independiente. Dichos promotores incluyen aquellos ampliamente conocidos en la materia, y los ejemplos no limitantes de dichos promotores incluyen promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de LTR, promotor de EFα, promotor de SV40 y promotor de TK. Los especialistas en la materia seleccionarán fácilmente cualquiera del grupo constituido por los promotores anteriormente mencionados.

[0033] El vector de expresión de la presente invención, que se proporciona para inducir una alta expresión de un gen de interés en células animales, puede incluir preferiblemente además un gen de resistencia para células animales, que se usa como marcador seleccionable para la expresión permanente del gen en células animales. Los ejemplos no limitantes de dichos genes de resistencia para células animales incluyen aquellos usados comúnmente en la materia, tales como el gen de resistencia a neomicina, el gen de resistencia a zeomicina, el gen de resistencia de higromicina y el gen de resistencia a blastomicina.

[0034] También el vector de expresión de la presente invención puede incluir adicionalmente, pero sin limitación, elementos constituyentes genéricos de un vector, tales como un origen de replicación y una señal de poliadenilación y otros elementos de control transcripcional.

[0035] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una línea celular transformada con el vector de expresión.

[0036] En un aspecto detallado, la presente invención proporciona líneas celulares de E. coli que se transforman con un vector de expresión que alberga un módulo de alta expresión inducible que contiene una secuencia CCGCCC repetida en el promotor de DHFR y otro módulo de alta expresión inducible que no contiene ninguna secuencia CCGCCC. Se depositaron los transformantes de E. coli en una autoridad depositaria internacional, el KCTC (Korean Collection for Type Cultures; Genetic Resources Center, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Yusong-ku, Taejon, Corea) el 2 de octubre de 2006 y se les asignaron los números de acceso KCTC 10991 BP y KCTC 10992 BP, respectivamente. Para inducir la alta expresión de una proteína recombinante de interés, pueden usarse líneas celulares de E. coli para construir un vector de expresión que incluya adicionalmente un gen que codifica la proteína recombinante de interés mediante un procedimiento de clonación en el vector de expresión que contiene el módulo de alta expresión inducible, aislado de las líneas celulares, usando una técnica de recombinación génica.

[0037] En otro aspecto detallado, la presente invención proporciona una línea celular transformada con el vector de expresión que incluye adicionalmente un gen que codifica una proteína recombinante de interés.

[0038] En un aspecto preferido, la proteína recombinante de interés tiene que expresarse en células animales. Con respecto al fin de la presente invención, los ejemplos de células animales adecuadas para uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, células de carcinoma de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de mono (COS7), células NSO, células SP2/0, células W138, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células MDCK, células de mieloma, células HuT 78 y células 293. Los especialistas en la materia pueden seleccionar fácilmente una línea celular animal adecuada para uso en el sistema de amplificación basado en DHFR según la presente invención.

[0039] En la práctica, se usaron células CHO. Se usó detalladamente una línea celular de carcinoma de ovario de hámster chino deficiente en dihidrofolato reductasa (DHFR) (CHO/dhfr-). Es decir, se transformaron células CHO deficientes en DHFR con un vector de expresión que porta un gen que codifica eritropoyetina humana recombinante según la presente invención. En las células CHO transformadas, se encontró que el gen se amplificaba a un número suficiente de copias incluso a una concentración de metotrexato menor de 100 nM, e incluso menor de 50 nM, que era preferible. Por tanto, la presente invención proporciona dicha línea celular animal. Se depositaron los transformantes de CHO, que se describirán con detalle en los ejemplos, en el KCTC (Genetic Resources Center, KRIBB, Yusong-ku, Taejon, Corea) el 2 de octubre de 2006, y se les asignaron los números de acceso KCTC 10993BP, KCTC 10994BP y KCTC 10995BP.

[0040] En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de producción de una proteína recombinante que comprende transformar una línea celular animal con el vector de expresión para células animales según la presente invención, que incluye un gen que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR), que contiene un promotor del que se han eliminado parcial o totalmente las secuencias ricas en GC y un gen que codifica la proteína recombinante; y cultivar la línea celular animal transformada.

[0041] En la presente invención, “transformación” en células animales incluye cualquier procedimiento mediante el que los ácidos nucleicos puedan introducirse en organismos, células, tejidos u órganos y, como es conocido en la materia, puede efectuarse seleccionando técnicas estándar adecuadas según las líneas celulares animales. Las células de mamífero que no tienen paredes celulares pueden transformarse usando precipitación con fosfato de calcio (Graham y col., 1978, Virology, 52: 456-457). Se describen los procedimientos y rasgos generales para la transformación en células hospedadoras de mamífero en la patente de EE.UU. nº 4.399.216. Detalladamente, se introdujo un vector que expresa una proteína recombinante en células CHO usando lipofectamina. Las células animales pueden cultivarse en un medio adecuado y en condiciones de cultivo adecuadas, que son conocidas en la materia. Las condiciones de cultivo pueden ajustarse fácilmente por los especialistas en la materia para ser adecuadas para las líneas celulares animales seleccionadas. El cultivo puede efectuarse en una suspensión o en estado adherente según los rasgos de crecimiento de las células según cualquiera de cultivo discontinuo, cultivo discontinuo en lecho y cultivo continuo. El medio usado para el cultivo debería satisfacer los requisitos de crecimiento de las líneas celulares específicas.

[0042] El medio usado en el cultivo celular animal contiene una variedad de fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos. Los ejemplos de fuentes de carbono disponibles incluyen carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Estas fuentes de carbono pueden usarse individualmente o en combinaciones de dos o más. Los ejemplos de fuentes de nitrógeno disponibles incluyen fuentes de nitrógeno orgánicas tales como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración del maíz (CSL) y suero de soja, y fuentes de nitrógeno inorgánicas tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse individualmente o en combinaciones de dos o más. El medio puede incluir adicionalmente aminoácidos, vitaminas, precursores adecuados y similares.

[0043] También el medio puede complementarse con un inhibidor de DHFR, tal como metotrexato. Esto es debido a que, como se describe anteriormente, la presente invención se dirige a establecer eficazmente en un tiempo corto un sistema mediante el que se amplifica un gen de DHFR portado en un vector y se selecciona transformando células animales deficientes en DHFR con un vector de expresión según la presente invención, y dosificando a las células un inhibidor de DHFR para amplificar un gen recombinante.

[0044] En una realización preferida, se usa preferiblemente un inhibidor de DHFR a una concentración lo más baja posible durante un corto periodo de tiempo con respecto a la estabilidad de las líneas celulares y al coste de producción. Es decir, el uso de un inhibidor de DHFR a baja concentración asegura la producción en masa estable de una proteína de interés y acorta el tiempo necesario para el desarrollo de una línea celular de expresión. Detalladamente, la presente invención proporciona un procedimiento de producción de una proteína recombinante mediante la transformación de células CHO deficientes en DHFR con el vector de expresión de proteína recombinante y dosificando las células con metotrexato menos de 100 nM, y preferiblemente metotrexato menos de 50 nM.

[0045] Cuando se produce eritropoyetina en la línea celular anteriormente mencionada, el procedimiento puede incluir adicionalmente purificar a gran escala eritropoyetina que tiene un alto contenido de ácido siálico, lo que confiere una actividad biológica potenciada a la eritropoyetina.

[0046] En una realización de la presente invención, se volvieron inactivas las secuencias ricas en GC contenidas en el promotor de DHFR de modo que se minimizara la expresión de DHFR, y se amplificó entonces el gen de DHFR mediante la adición de un inhibidor de DHFR. Se sometieron las células transformadas en que ocurre la amplificación génica a dilución limitante para obtener poblaciones clonales derivadas de células individuales. Se cultivaron los clones monocelulares así obtenidos en un medio exento de suero a gran escala para producir eritropoyetina humana recombinante. Basándose en el hecho de que la eritropoyetina (EPO) que tiene un alto contenido de ácido siálico eluye a una concentración salina baja y que la EPO que tiene un bajo contenido de ácido siálico eluye a una concentración salina alta, se aplicó la EPO producida en una columna y se eluyó de la columna con un gradiente salino creciente. Se encontró que la actividad de la EPO purificada, que tenía un alto contenido de ácido siálico, estaba intacta.

Modo de la invención

[0047] Puede obtenerse una mejor comprensión de la presente invención mediante los siguientes ejemplos, que se exponen para ilustrar, pero no se consideran como límites de la presente invención.

[0048] EJEMPLO 1: Construcción de vectores de expresión que contienen secuencias ricas en GC completas o truncadas

[0049] Se prepararon módulos de expresión del gen de DHFR de modo que se situara el gen de DHFR bajo el control de un promotor truncado del que se han eliminado algunas secuencias repetidas ricas en GC como sigue.

Para amplificar un gen de DHFR, se llevó a cabo una PCR usando un plásmido pSV2-dhfr (ATCC nº 37146) con un par de cebadores: el cebador dhfr-01 que tiene un sitio SmaI (5’-GCG CCC GGG ATG GTT CGA CCA TTG AAC TGC-3’) y el cebador dhfr-02 que tiene un sitio BstBI (5’-CAC TTA GAA CCT GTT AGT CTT TCT TCT CGT AGA C3’). Se sometió a electroforesis un producto de PCR de aproximadamente 200 pb en un gel de agarosa al 1% y se purificó usando un kit de extracción en gel (QIAGEN, nº de cat. 28706). Se clonó el fragmento de ADN en un vector pDRIVE (Qiagen) y se sometió a secuenciación de ADN. La secuenciación de ADN reveló que el gen de DHFR amplificado no tenía errores. Se digirió entonces el plásmido pDRIVE-dhfr con SmaI y BstBI para escindir el gen de DHFR y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Se purificó un fragmento del gen de DHFR de aproximadamente 200 pb usando un kit de extracción en gel (QIAGEN, nº de cat. 28706) y se insertó en pcDNA 3.1 (Invitrogen), que se había predigerido con las mismas enzimas de restricción. Usando el plásmido pcDNA3.1-dhfr resultante como molde, se efectuó una PCR en un estado en que se usaron cebadores que tenían un sitio BamHI y eran complementarios de diferentes secuencias repetidas ricas en GC, x 1GC (5’-TCA GGA TCC ATT CTC CGC CCC ATG GCT GAC TAA-3’), x 3GC (5’-CAT GGA TCC TAA CTC CGC CCA GTT CCG CCC ATT CT-3’) y x 6GC (5’-CAT GGA TCC CAT AGT CCC GCC CCT AAC TCC GCC C-3’) y un cebador que tenía un sitio BamHI y era complementario de una secuencia señal de poliadenilación ligada estructuralmente con el gen de DHFR BISVpAR (5’-TCA GGA TCC CAG ACA TGA TAA GAT ACA TTG ATG -3’) para obtener dos módulos génicos que contienen secuencias ricas en GC parcialmente truncadas y un módulo génico que contiene secuencias ricas en GC completas. Se insertaron entonces los módulos génicos en pcDNA 3.1 (Invitrogen), que se había predigerido con BglII. Se seleccionaron clones que tienen la misma orientación que el promotor de CMV del vector usando cartografía de restricción, obteniéndose así los plásmidos X1GC/dhfr, X3GC/dhfr y X6GC/dhfr. Se obtuvo un gen de eritropoyetina a partir de ADN genómico humano y se clonó en cada uno de los plásmidos. Además, como control, se construyó como sigue un vector de expresión que contiene un promotor de DHFR del que se habían eliminado todas las secuencias ricas en GC.

[0050] Para obtener un gen de DHFR y una secuencia de poliadenilación vírica de SV40, se sintetizaron los cebadores que contienen un sitio BamHI, X0GC (5’-CGA TGG ATC CGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA T-3’) y X0GCRR (5’-CGT TGG ATC CAC AGC TCA GGG CTG CGA TTT C-3’). Se llevó a cabo la PCR usando pSV2-dhfr como molde con los cebadores. Se obtuvo un producto de 1,5 kb, que se extiende desde la secuencia de poliadenilación vírica de SV40 hasta la región 5’ no codificante del gen de DHFR. Se sometió a electroforesis el fragmento de ADN amplificado en gel de agarosa al 1%, se purificó usando un kit de extracción en gel (QIAGEN, nº de cat. 28706) y se insertó en pcDNA 3.1 (Invitrogen), que se había predigerido con BglII. Se seleccionó un clon en que el gen de DHFR tenía la orientación opuesta a la del promotor de CMV usando cartografía de restricción. Se digirió el sitio de multiclonación del vector con NdeI y DraIII para eliminar algunos sitios de reconocimiento de enzima de restricción, se insertó el fragmento génico escindido en pRcCMV (Invitrogen) y se predigirió con las mismas enzimas de restricción, obteniendo así el vector X0GC/dhfr.

[0051]: Los procedimientos de clonación se muestran esquemáticamente en las FIG. 1 y 2.

[0052]: EJEMPLO 2: Clonación del gen cepo

[0053]: Se digirió un plásmido pCI-neo/gEPO con XhoI y EcoRI, se rellenó con el fragmento Klenow de una

ADN polimerasa I en sus extremos cohesivos para generar extremos romos y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,7%. Se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,2 kb, correspondiente al gen de EPO humano genómico, usando un kit de extracción en gel (QIAGEN, nº de cat. 28706). Se digirió un vector pRcCMV (Invitrogen) con EcoRV y se purificó usando un kit de purificación (QIAGEN, nº de cat. 28106). Se ligó el gen de EPO genómico en el sitio EcoRV del vector. Se seleccionó un clon en que el gen de EPO tenía la misma orientación que el promotor de CMV usando cartografía de restricción. Se digirieron los vectores X0GC/dhfr, x1GC/dhfr, x3GC/dhfr y x6GC/dhfr preparados en el ejemplo 1 con BamHI y XhoI, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,7% y se purificaron usando un kit de extracción en gel (QIAGEN, nº de cat. 28706). Según el mismo procedimiento, se purificó el fragmento del gen de EPO genómico, clonado en pRcCMV, y se insertó en los sitios BamHI/XhoI del sitio de multiclonación de los vectores x0GC/dhfr, x1GC/dhfr, x3GC/dhfr y x6GC/dhfr. Se confirmó que los vectores así obtenidos no tenían errores mediante secuenciación de ADN, y se designaron X0GC/GEPO, X1GC/GEPO, X3GC/GEPO y X6GC/GEPO, respectivamente. Se muestra esquemáticamente el procedimiento de clonación en la FIG. 3 y se muestra cada secuencia nucleotídica final en la lista de secuencias acompañante.

[0054] EJEMPLO 3: Transformación de células CHO deficientes en DHFR

[0055] Se subcultivaron células CHO deficientes en DHFR (cepas CHO/DXB11 y CHO/DG44) en medio DMEM/F12 (Welgene, nº de cat. LM002-04) complementado con 10% de suero bovino fetal (Welgene, nº de cat. S101-01) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, nº de cat. 15140-122) en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC. Para transformar las células CHO deficientes en DHFR con los plásmidos X0GC/GEPO, X1GC/GEPO, X3GC/GEPO y X6GC/GEPO, se sembraron 1 x 106 células en discos de cultivo de 6 cm, se cultivaron durante 24 horas en incubadora con 5% de CO2 a 37ºC y se lavaron con medio Opti-MEM (Gibco, nº de cat. 31985-070) dos veces. Se mezcló 1 ml de reactivo Lipofectamine™ (Invitrogen, nº de cat. 18324-020) con 10 µg de cada ADN plasmídico en 1 ml de Opti-MEM y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 min. Se depositaron los complejos de ADNlipofectamina en las células CHO deficientes en DHFR preparadas y se cultivaron las células durante 18 h en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC. Se intercambió entonces el medio por medio DMEM/F12 complementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y se cultivaron adicionalmente las células durante 48 horas. Para seleccionar las células transformadas, se trataron las células con tripsina-EDTA al 0,5% (Gibco., nº de cat. 15400054), se recogieron mediante centrifugación y se sembraron en un matraz de cultivo T25 que contenía medio de selección α-MEM (Welgene, nº de cat. LM008-02), complementado con 10% de FBS dializado (Welgene) y 1% de penicilina-estreptomicina y geneticina 800 µg/ml (Mediatech, nº de cat. 61-234 RG). Se dejaron crecer las células en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC hasta que alcanzaron más de un 90% de confluencia. Se continuó la selección de células transformadas usando la misma concentración de geneticina y en las mismas condiciones de cultivo. Cuando se eliminó un número mayor de secuencias repetidas ricas en GC, se seleccionaron las células transformadas más rápidamente. No se observó una diferencia significativa entre las cepas de CHO deficientes en DHFR.

[0056] EJEMPLO 4: Selección de líneas celulares recombinantes y amplificación del gen de EPO

[0057] Para aumentar los niveles de expresión de EPO en las células transformadas (cepa CHO/DXB 11 o cepa CHO/DG44) seleccionadas usando geneticina, se sembraron 2 x 104 células en una placa de 24 pocillos que contenía el mismo medio de selección que se describe anteriormente, complementado con metotrexato 20 nM (MTX, Sigma, nº de cat. M-8407), y se cultivaron durante dos semanas en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC. Para seleccionar las células transformadas que expresan EPO a altos niveles, cuando las células alcanzaron un 100% de confluencia, se lavaron con PBS (Welgene, nº de cat. LB 001-02) dos veces y se añadieron 200 µl de un medio de producción de EPO, CHO-A-SFM (Gibco, nº de cat. 05-5072EF), a cada pocillo. Después de cultivar las células durante 24 horas, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se analizaron usando un kit EPO ELISA (R&D Systems, nº de cat. DEP00). Además, se cultivaron las células transformadas durante dos semanas en el medio de selección complementado con MTX 30 nM, y se midieron los niveles de expresión de EPO de las células transformadas usando un kit ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzima) (R&D Systems, nº de cat. DEP00). Como se muestra en las FIG. 4 a 7, los plásmidos X0GC/GEPO y X1GC/GEPO exhibieron los niveles de expresión de EPO mayores a las mismas concentraciones de MTX, seguidos por X3GC/GEPO y X6GC/GEPO. Estos resultados indican que la eliminación de un mayor número de secuencias repetidas ricas en GC aumenta la amplificación génica a la misma concentración de MTX. Además, se encontró que X0GC/GEPO, del que se eliminaron todas las secuencias repetidas ricas en GC, era eficaz en la amplificación génica. Por tanto, se encontró que la amplificación génica se maximizaba cuando las secuencias repetidas ricas en GC estaban presentes en un número mínimo. Además, cuando la concentración de MTX se aumentaba a 40 nM a 60 nM en el medio de selección para determinar la concentración de MTX que maximizaba la expresión génica, no se observó un aumento significativo de la expresión génica o del contenido de isómero ácido. Basándose en estos resultados, se sometieron dos cepas de CHO transformadas con X0GC/GEPO y X1GC/GEPO a dilución limitante, como se describe en el ejemplo 6.

[0058] EJEMPLO 5: Evaluación de la amplificación génica de DHFR

[0059] Se lavaron las células transformadas obtenidas en el ejemplo 4 con D-PBS una vez, se separaron de un matraz de cultivo usando tripsina-EDTA y se centrifugaron durante 3 min a 1.000 rpm. Se lavaron las células recogidas con D-PBS una vez y se contaron usando un hemacitómetro (Incyto). Después de centrifugar 3 x 106 células, se suspendió el sedimento celular en 1,5 ml de tampón de lisis celular (PBS, EDTA 5 mM, 1% de NP-40), se desestabilizó a 4ºC durante 30 min y se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 min obteniéndose el sobrenadante.

[0060] Se mezclaron 20 µl de cada lisado celular, y un lisado celular de CHO/dhfr- como control negativo, con 10 µl de tampón de muestra, se hirvieron a 100ºC durante 5 min y se cargaron en un gel de PAGE-SDS al 12,5%. Como control positivo, se mezclaron 20 ng a 100 ng de dihidrofolato reductasa (Sigma, nº de cat. D6566) con el tampón de muestra y se cargaron en el gel de PAGE-SDS. Se sometió el gel a electroforeis a 30 mA. Se dispuso entonces el gel en una membrana de PVDF y se situó entre dos papeles de filtro Whatman 3M. Se transfirieron las proteínas a la membrana de PVDF durante 1 hora a 90 mA usando una unidad de transferencia Hoefer Semi-Phor Semi-Dry. Se sondeó entonces la transferencia con anticuerpo de ratón anti-DHFR (diluido 1:500, BD Biosciences, nº de cat. 610697) en 10 ml de TBS-T que contiene leche desnatada al 0,5% durante 1 h con agitación suave. Se lavó la transferencia con TBS-T 5 veces durante 10 min cada vez, y se incubó con anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (diluido 1:3000, Amersham Biosciences, nº de cat. RPN2108) en 10 ml de TBS-T que contiene leche desnatada al 0,5% durante 1 h con agitación suave. Después de lavar la transferencia con TBS-T 5 veces durante 10 min cada vez, se mezclaron los reactivos de detección 1 y 2 de un sistema de análisis de transferencia Western ECL (Amersham Biosciences, nº de cat. RPN2108) a una relación 1:1, se añadieron a la transferencia y se dejaron reaccionar durante 1 min. Se expuso la transferencia a una película de rayos X y se reveló la película. Se muestran los resultados de la transferencia Western en la FIG. 9. Como se muestra en la FIG. 9, las células transformadas exhibían una expresión génica de DHFR aumentada. Las células transformadas con X0GC/GEPO y X1GC/GEPO exhibían mayor expresión de DHFR a la misma densidad celular.

[0061] EJEMPLO 6: Aislamiento y selección de clones monocelulares

[0062] Se transfirieron células transformadas con X0GC/GEPO y X1GC/GEPO, que se encontró que tenían la mayor expresión de EPO en el ejemplo 4, a placas de cultivo de 6 pocillos. Para aislar clones monocelulares, se efectuó una dilución limitante para alcanzar una densidad de 0,5 células por pocillo de una placa de 96 pocillos usando el medio de selección complementado con metotrexato, y se sembraron las células en la placa. Se incubó la placa de 96 pocillos durante aproximadamente dos o tres semanas en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC. Se seleccionaron los pocillos que contienen colonias individuales y se transfirieron las colonias individuales a placas de 24 pocillos y se dejaron crecer. Se midieron los niveles de expresión de EPO usando ELISA indirecta como se describe en el ejemplo 4.

[0063] Finalmente, se aislaron como clones monocelulares los clones X0GC/GEP09647(DXB11), X1GC/GEP09629(DG44) y X0GC/GEP09603, que mostraron altos niveles de expresión y una alta relación de isómero ácido respecto a los dímeros de enfoque isoeléctrico, y se ensayaron entonces los niveles de expresión y patrones diméricos de enfoque isoeléctrico.

[0064] Se encontró que el clon X0GC/GEP09647(DXB11) tenía un nivel de expresión de aproximadamente 80 µg/106 células/día. Estos resultados indican que X0GC/GEPO o X1GC/GEPO posibilitan el establecimiento de una línea celular de alta expresión solo mediante una amplificación génica de dos etapas, facilitando así el establecimiento de un clon monocelular para la producción de proteína con cultivo de bajo pase.

[0065] EJEMPLO 7: Cultivo a gran escala de clones monocelulares

[0066] Para la producción en masa de EPO humana, se subcultivó el clon X0GC/GEPO9647(DXB 11), entre los clones monocelulares seleccionados en el ejemplo 6, en un matraz T-175 y se propagó por etapas hasta 120 matraces T-175. Se sembraron 8 Cell Factories (Nunc, nº de cat. 170009) con aproximadamente 2,5 X 108 células por Cell Factory y se incubaron en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC durante aproximadamente 48 h. Después de lavar cada Cell Factory con 1 l de tampón fosfato dos veces, se realimentaron las células con 1 l de medio de producción en masa de EPO CHO-A-SFM (Gibco, nº de fórmula 05-5072EF), complementado con butirato de sodio 0,3 mM (Sigma, nº de cat. B-5887) y se cultivaron en una incubadora con 5% de CO2 a 33ºC. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo que contenían EPO expresada nueve veces cada dos días. Se eliminaron los sólidos en suspensión incluyendo desechos celulares de los sobrenadantes de cultivo usando una centrífuga y un filtro de 0,2 µm. Se ensayaron entonces los niveles de expresión de EPO en los sobrenadantes de cultivo usando ELISA indirecto y el contenido de dímero de enfoque isoeléctrico ácido usando el enfoque isoeléctrico. Como se muestra en la FIG. 10, se encontró que el clon expresaba EPO a un alto nivel de 40-50 mg/l incluso en cultivo a gran escala. Se encontró que la EPO expresada tenía un alto contenido de los isómeros nº 6 a 8, que son indicativos de un alto contenido de ácido sálico, a pesar de no haberse sometido a un proceso de purificación.

[0067] EJEMPLO 8: Aislamiento y purificación de EPO humana que tiene un alto contenido de ácido siálico

[0068] Se centrifugaron los sobrenadantes celulares preparados en el ejemplo 7 a 7.000 rpm usando una centrífuga Beckman XL-90 equipada con un rotor JLA-8.1000 para eliminar las sustancias en suspensión. Se recuperó el sobrenadante de centrifugación y se pasó a través de un filtro de 0,2 µm y entonces a través de una membrana de ultrafiltración para concentrarlo a 1/10 de volumen. Se mezcló el concentrado con un volumen igual de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4) y se cargó en una columna Blue FF (Amersham), que se había preequilibrado con fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4). Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4). Se eluyó la EPO de la columna con dos volúmenes de columna de un gradiente lineal de tampón B (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4) más NaCl 2 M.

[0069] Se combinaron las fracciones principales que contienen EPO, se desalaron en una columna Sephadex G-25 en fosfato de sodio 20 mM, pH 5,4, y se cargaron en una columna SP HP (Amersham), preequilibrada con fosfato de sodio 20 mM, pH 5,4. Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, pH 5,4. Se eluyó la EPO de la columna con 12 volúmenes de columna de un gradiente lineal de tampón B (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4) más NaCl 1 M. Basándose en el hecho de que la EPO que tiene un alto contenido de ácido siálico se eluye a una baja concentración salina, y que la EPO que tiene un bajo contenido de ácido siálico se eluye a una alta concentración salina, se excluyeron las fracciones eluidas con altas concentraciones salinas, que dan cuenta de un 30% de las fracciones totales, y se recogieron las fracciones restantes. Se combinaron las fracciones de EPO purificada usando la columna SP HP, se desalaron en una columna Sephadex G25 en Tris 10 mM, pH 7,5, y se cargaron en una columna Source 15 Q (Amersham), preequilibrada con Tris 10 mM, pH 7,5. Se eluyó la EPO de la columna con 6 volúmenes de columna de un gradiente lineal de tampón B (Tris 10 mM, pH 7,5) más NaCl 0,25 M. Se recogieron más de 15 fracciones que contenían EPO. Se analizó la distribución de isómeros cargados en cada fracción usando PAGE-SDS, enfoque isoeléctrico y electroforesis en zona capilar (CZE). Se combinaron finalmente las fracciones que contienen EPO que tiene 10 restos de ácido siálico y no contienen impurezas con las fracciones de alta salinidad. Mediante el procedimiento de purificación, se produjo EPO humana recombinante que contenía más de 10 moles de ácido siálico a un rendimiento de aproximadamente 20 µg/ml.

[0070] EJEMPLO 9: Evaluación de las propiedades de la EPO

[0071] 1) PAGE-SDS y transferencia Western [0072] Se sometió a electroforesis la EPO recombinante purificada en el ejemplo 8 en dos geles de PAGESDS al 12%. Se tiñó un gel con azul brillante de Coomasie y se destiñó. Se puso el otro gel en una membrana de PVDF (Roche) usando una unidad de transferencia Semi-Dry. Se sondeó entonces la transferencia con un anticuerpo anti-EPO humana (diluido 1:5.000, R& D Systems, nº de cat. AB-286-NA). Se lavó la transferencia y se incubó con anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Amersham, nº de cat. NA934V). Se lavó suficientemente la transferencia con Tween 20 al 0,5% en tampón fosfato y se trató con los reactivos de detección de transferencia Western Amersham ECL (nº de cat. RPN2108). Se expuso la transferencia a una película en sala oscura y se reveló la película usando un revelador automático. Se encontró que eran EPO bandas en el gel de PAGE-SDS, y resultaron bandas de EPO de diferentes tamaños por el grado de glucosilación de la EPO (véase la FIG. 10).

[0073] 2) Enfoque isoeléctrico (IEF)

[0074] Se mezclaron el concentrado de sobrenadante de cultivo y la EPO recombinante purificada en el ejemplo 4 con un tampón de muestra (Invitrogen, nº de cat. LC5371) a una relación 1:1, y se cargaron en un gel de enfoque isoeléctrico (Invitrogen, nº de cat. EC6655B) junto con hEPO recombinante BRP (European Pharmacopoeia Comission, nº de cat. E1515000) y un marcador estándar de IEF. Se inició el enfoque isoeléctrico a un voltaje bajo y se llevó a cabo entonces a un voltaje alto. Se fijó el gel de IEF con una disolución fijadora que contenía 12% de TCA y 3% de ácido sulfosalicílico durante 30 min con agitación suave, y se tiñó con azul brillante de Coomasie R250 (Amresco, nº de cat. 6104-59-2). Se observó EPO a los puntos isoeléctricos de la misma (véase la FIG. 11).

[0075] 3) Evaluación de la valoración y actividad usando células TF-1

[0076] Se cultivaron células TF-1 (ATCC, nº de cat. CRL-2003) en RPMI 1640 (Welgene, nº de cat. LM 01103) complementado con 10% de FBS, β-mercaptoetanol 10 µM, transferrina 20 µg/ml y GM-CSF 12 ng/ml, y se recogieron mediante centrifugación a 1.000 rpm durante 5 min. Se lavaron entonces las células TF-1 con tampón fosfato dos veces, y se lavaron una vez con un medio de ensayo que contenía 2% de FBS, transferrina 100 µg/ml, suero bovino exento de proteasa 2 mg/ml y 1% de penicilina-estreptomicina. Se añadieron 50 µl del medio de ensayo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 25 µl de una muestra y un patrón a un primer pocillo y se diluyó en serie tres veces hasta una concentración final de 1 µg/ml. Se añadieron las células TF-1, lavadas con el medio de ensayo, a cada pocillo a una densidad de 2 x 104/50 µl/pocillo. Después de incubar la placa en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC durante aproximadamente 72 h, se añadieron 20 µl de reactivo CellTiter One Solution (Promega, nº de cat. G4102) a cada pocillo. Se incubó la placa en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC durante 4 h para el desarrollo del color. Después de agitar bien la placa, se midió la absorbancia a 490 nm usando un lector ELISA (Molecular Dynamics). No se observó una diferencia notable entre la actividad de la EPO recombinante expresada por X0GC/GEPO y la de la forma patrón.

[0077] EJEMPLO 10: Adaptación de clones monocelulares a medio exento de suero

[0078] Se cultivaron cepas X1GC/GEPO9629(DG44) y X0GC/GEP09603(DG44) para alcanzar más de un 90% de confluencia en dos matraces T-175 que contenían medio de selección, α-MEM (Welgene, nº de cat. LM00802) completado con 10% de suero bovino fetal dializado), 1% de penicilina-estreptomicina y geneticina 800 µg/ml (Mediatech, nº de cat. 61-234 RG). Se separaron las células con 0,5% de tripsina (Gibco, nº de cat. 15400-054) y se centrifugaron. Se suspendió el sedimento celular en medio EX-CELL CD CHO de JRH (nº de cat. 14360) complementado con glutamina 8 mM. Se dispuso la suspensión celular en medio exento de suero en un matraz T175 y se sometió a cultivo estacionario en una incubadora de CO2. Después de 3 días, se recogieron las células en suspensión mediante centrifugación y se transfirieron a un matraz T-25, seguido de cultivo estacionario. Después de 9 días, se recogieron de nuevo las células en suspensión y se ensayaron el número de células, la velocidad de crecimiento y la viabilidad. Se repitió este procedimiento hasta que ocurrió la división celular en aproximadamente 24 horas y la viabilidad celular alcanzó más de un 80%. Para determinar los patrones de expresión de las células X0GC/GEPO9603(DG44) y X1GC/GEPO9629(DG44) asimiladas completamente a la condición sin suero, se inocularon 1,0 x 105 células/ml en un matraz de agitación de 500 ml (Bellco) que contenía 200 ml de medio de cultivo y se cultivaron con agitación a 50 rpm. Después de 7 días, se intercambiaron 100 ml del medio por medio reciente y se cultivaron las células a 33ºC. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo a intervalos de 24 h y se ensayó el contenido de isómero ácido de la EPO expresada. Como se muestra en la FIG. 12, las células X0GC/GEPO9603(DG44) y X1GC/GEP09629(DG44), completamente asimiladas a una condición exenta de suero, exhibían perfiles de enfoque isoeléctrico similares a los de la EPO convencional producida en una Cell Factory.

Aplicabilidad industrial

[0079] Como se describe a continuación en la presente memoria, la presente invención proporciona vectores que contienen un promotor de DHFR del que se han eliminado parcial o totalmente secuencias ricas en GC y líneas celulares transformadas con los vectores. Los vectores posibilitan la selección de una línea celular productora de EPO humana en menos tiempo usando una concentración menor de inhibidor de DHFR, acortando así el tiempo necesario para establecer una línea celular que produce altos niveles de EPO. Además, las líneas celulares son capaces de producir en masa una proteína recombinante con alto rendimiento. Por tanto, la presente invención es capaz de mejorar más eficazmente un sistema de amplificación génica, que es una estrategia para producir una proteína deseada en células animales.

5 <110> Hanni Pharm Co., Ltd.

<120> Un vector y una línea celular de expresión novedosos para la producción en masa de una proteína recombinante y un proceso para producir proteína recombinante usando los mismos

<160> 18

<170> Kopatent In 1.71 10 <210> 1

<211> 9227

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> vector X0GC/GEPO

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 8635 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> vector X1GC/GEPO

<400> 2

imagen2

imagen1

<210> 3 <211> 8657

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> vector X3GC/GEPO

<400> 3

imagen1

<210> 4

<211>: 8691 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> vector x6GC/GEPO

<400> 4

<210> 5

<211>: 7022 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> vector X0GC/dhfr

<400> 5

<210> 6

<211>: 6422 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> vector X1GC/dhfr

<400> 6

<210> 7

<211>: 1572 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> módulo x0GC/dhfr

<400> 7

<210> 8

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> módulo x1GC/dhfr

<400> 8

<210> 9

<211>: 1010 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> módulo x3GC/dhfr

<400> 9

<210> 10

<211>: 1044 5 <212> ADN

imagen2

imagen1

imagen2

imagen1

imagen2

imagen1

imagen3

imagen1

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> módulo x6GC/dhfr

<400> 10

imagen1

<210>: 11

<211>: 30

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador dhfr-01

<400>: 11

imagen1

<210>: 12

<211>: 34

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador dhfr-02

imagen4

<210>: 13

<211>: 33

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador x1GC

<400>: 13

imagen1

<210>: 14

<211>: 35

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223> cebador x3GC

<400> 14

imagen1

<210>: 15

<211>: 34

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador x6GC

<400>: 15

imagen1

<210>: 16

<211>: 31

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador X0GC

<400>: 16

imagen1

<210>: 17

<211>: 31

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador X0GCRR

<400>: 17

imagen1

<210> 18

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador BI SVpAR

<400> 18

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un modulo de alta expresión inducible que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una dihidrofolato reductasa y una secuencia nucleotídica que está ligada con la secuencia nucleotídica y codifica un promotor de dihidrofolato reductasa del que se han eliminado una o más secuencias CCGCCC repetidas.
2.

El módulo de alta expresión inducible según la reivindicación 1, en el que el promotor de dihidrofolato reductasa contiene una o cero secuencias CCGCCC repetidas
3.

El módulo de alta expresión inducible según la reivindicación 1, que tiene una secuencia nucleotídica cualquiera seleccionada del grupo constituido por las representadas por las SEQ ID Nos. 7 a 10.
4.

Un vector de expresión que comprende el módulo de alta expresión inducible de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5.

El vector de expresión según la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un gen que codifica un polipéptido fisiológicamente activo.
6.

El vector de expresión según la reivindicación 5, en el que el polipéptido fisiológicamente activo es eritropoyetina humana.
7.

El vector de expresión según la reivindicación 6, que tiene una secuencia nucleotídica cualquiera de las seleccionadas del grupo constituido por las representadas por las SEQ ID Nos. 1 a 4.
8.

El vector de expresión según la reivindicación 4, que tiene una secuencia nucleotídica representada por la SEQ ID No. 5 o 6.
9.

Una línea celular transformada con el vector de expresión de la reivindicación 8.
10.

La línea celular según la reivindicación 9, que tiene los números de acceso KCTC10991BP o KCTC10992BP.
11.

Una línea celular transformada con el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
12.

La línea celular según la reivindicación 11, que es una línea celular de CHO.
13.

La línea celular según la reivindicación 12, en la que la línea celular de CHO es deficiente en el gen de dihidrofolato reductasa.
14.

La línea celular según la reivindicación 12, que tiene los números de acceso KCTC10993BP, KCTC10994BP o KCTC10995BP.
15.

Un procedimiento de producción de una proteína recombinante que comprende las etapas de: (a) transformar una línea celular animal con un vector de expresión que incluye un gen que codifica la dihidrofolato reductasa que contiene un promotor del que se han eliminado parcial o completamente las secuencias CCGCCC repetidas y un gen que codifica una proteína recombinante; y (b) cultivar la línea celular animal transformada en presencia de un inhibidor de dihidrofolato reductasa.
16.

El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la proteína recombinante es eritropoyetina humana
17.El procedimiento según la reivindicación 16, que comprende adicionalmente purificar eritropoyetina que tiene un alto contenido de ácido siálico.
18. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que el vector de expresión es un vector de expresión mostrado en la FIG. 1.
19.El procedimiento según la reivindicación 15 o 16, en el que la línea celular animal de la etapa (a) es una línea celular de CHO deficiente en dihidrofolato reductasa.
20. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la línea celular animal transformada de la etapa (b) tiene los números de acceso KCTC10993BP, KCTC10994BP o KCTC10995BP.