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ES2365037T3 - Ensayos y métodos usando biomarcadores. - Google Patents

Ensayos y métodos usando biomarcadores. Download PDF

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ES2365037T3
ES2365037T3 ES05788528T ES05788528T ES2365037T3 ES 2365037 T3 ES2365037 T3 ES 2365037T3 ES 05788528 T ES05788528 T ES 05788528T ES 05788528 T ES05788528 T ES 05788528T ES 2365037 T3 ES2365037 T3 ES 2365037T3
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agonist antibody
agonist
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Klaus W. Wagner
Avi J. Ashkenazi
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Genentech Inc
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Abstract

Un procedimiento para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero a un anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5, procedimiento que comprende las etapas de: examinar la muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X, en el que determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control es predictiva de que dicha muestra de tejido o de células es sensible a actividad inductora de apoptosis de uno o más anticuerpos de receptores de muerte.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La invención descrita en este documento se refiere a procedimientos y ensayos para detectar biomarcadores predictivos de sensibilidad de células de mamífero a Apo2L/TRAIL y/o anticuerpos agonistas de receptores de muerte.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] En la materia se han identificado diversos ligandos y receptores que pertenecen a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). Entre tales ligandos están incluidos factor de necrosis tumoral-alfa (“TNF-alfa”), factor de necrosis tumoral-beta (“TNF-beta” o “linfotoxina-alfa”), linfotoxina-beta (“LT-beta”), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-18B, LIGHT, ligando Apo-1 (también denominado en lo sucesivo ligando Fas o ligando CD95), ligando Apo-2 (también denominado en lo sucesivo Apo2L o TRAIL), ligando Apo-3 (también denominado en lo sucesivo TWEAK), APRIL, ligando OPG (también denominado en lo sucesivo ligando RANK, ODF o TRANCE) y TALL-1 (también denominado en lo sucesivo BlyS, BAFF o THANK) (véanse, por ejemplo, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986): Dealtry y col., Eur. J. Immunol.,
17:689 (1987); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning y col., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage y col. Nature, 357:80-82 (1992); documento WO 97/01633 publicado el 16 de enero de 1997; documento WO 97/25428 publicado el 17 julio de 1997; Marsters y col., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche y col., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne y col., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); documento WO98/28426 publicado el 2 de julio de 1998; documento WO98/46751 publicado el 22 de octubre de 1998; documento WO/98/18921 publicado el 7 de mayo de 1998; Moore y col., Science, 285:260-263 (1999) : Shu y col., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999) : Schneider y col., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay y col., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).
[0003] La inducción de diversas respuestas celulares mediadas por tales ligandos de la familia TNF se inicia normalmente por su unión a receptores de células específicas. Algunos, pero no todos los ligandos de la familia de TNF, se unen a e inducen diversa actividad biológica mediante “receptores de muerte” de la superficie celular para activar caspasas, o enzimas que llevan a cabo la ruta de muerte celular o apoptosis (Salvesen y col., Cell, 91:443446 (1997)). Entre los miembros de la superfamilia de receptores de TNF identificados hasta la fecha están incluidos TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (también denominado en lo sucesivo Apo-1 o CD95), DR4 (también denominado en lo sucesivo TRAIL-R1), DR5 (también denominado en lo sucesivo Apo-2 o TRAIL-R2), DcR1, DcR2, osteoprotegerina (OPG), RANK y Apo-3 (también denominado en lo sucesivo DR3 o TRAMP) (véanse, por ejemplo, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:13051308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman y col., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); documento EP 417.563 publicado el 20 de marzo de 1991; Loetscher y col., Cell, 61:351 (1990); Schall y col., Cell, 61:361 (1990); Smith y col., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic y col., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett y col., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson y col., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche y col., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); Pan y col., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti y col., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters y col., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda y col., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow y col., Science, 278:138-141 (1997)).
[0004] La mayoría de estos miembros de la familia de receptores de TNF comparten la estructura típica de los receptores de la superficie celular que incluyen las regiones extracelular, transmembranaria e intracelular, mientras que los otros se encuentran naturalmente como proteínas solubles que carecen de un dominio transmembranario e intracelular. La porción extracelular de los TNFR típicos contiene un patrón repetitivo de secuencias de aminoácidos de múltiples dominios ricos en cisteína (CRD) a partir del extremo NH2.
[0005] El ligando denominado en lo sucesivo Apo-2L o TRAIL se identificó hace varios años como un miembro de la familia de TNF de citocinas. (véanse, por ejemplo, Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); documento WO 97/01633; documento WO 97/25428; patente de EE.UU.
5.763.223 concedida el 9 de junio de 1998; patente de EE.UU. 6.284.236 concedida el 4 de septiembre de 2001). El polipéptido Apo2L/TRAIL humano de secuencia nativa de longitud completa tiene 281 aminoácidos de longitud, proteína transmembranaria tipo II. Algunas células pueden producir una forma soluble natural del polipéptido mediante escisión enzimática de la región extracelular del polipéptido (Mariani y col., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Los estudios cristalográficos de formas solubles de Apo2L/TRAIL revelan una estructura homotrimérica similar a las estructuras de TNF y otras proteínas relacionadas (Hymowitz y col., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha y col., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya y col., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz y col., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Sin embargo, se encontró que Apo2L/TRAIL, a diferencia de otros miembros de la familia de TNF, tenía una característica estructural única en la que tres residuos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad en el homotrímero) se coordinan juntos con un átomo de cinc, y que la unión del cinc es importante para la estabilidad y actividad biológica del trímero (Hymowitz y col., arriba; Bodmer y col., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).
[0006] En la bibliografía se ha informado que Apo2L/TRAIL puede desempeñar una función en la modulación del sistema inmunitario que incluye enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide [véanse, por ejemplo, Thomas y col., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen y col., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith y col., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song y col., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].
[0007] También se ha informado de las formas solubles de Apo2L/TRAIL inducen apoptosis en una variedad de células cancerosas que incluyen tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñón, ovario y cerebral, además de melanoma, leucemia y mieloma múltiple (véanse, por ejemplo, Wiley y col., arriba; Pitti y col., arriba; patente de EE.UU. 6.030.945 concedida el 29 de febrero de 2000; patente de EE.UU. 6.746.668 concedida el 8 de junio de 2004; Rieger y col., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi y col., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak y col., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane y col., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani y col., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu y col., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Los estudios in vivo en modelos de tumor murino sugieren adicionalmente que Apo2L/TRAIL, solo o en combinación con quimioterapia o radioterapia, puede ejercer efectos antitumorales sustanciales (véase, por ejemplo, Ashkenazi y col., arriba; Walzcak y col., arriba; Gliniak y col., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan y col., arriba; Roth y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); documento WO 00/75191 (solicitud PCT US/00/15512); documento WO 02/09755 (solicitud PCT US/01/23691)). A diferencia de muchos tipos de células cancerosas, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen ser resistentes a inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi y col., arriba; Walzcak y col., arriba). Jo y col. han informado que una forma soluble de Apo2L/TRAIL marcada con polihistidina indujo apoptosis in vitro en hepatocitos humanos aislados normales, pero no en no humanos (Jo y col., Nature Med., 6:564-567 (2000); véase también Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Se cree que ciertas preparaciones de Apo2L/TRAIL recombinante pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas en células enfermas frente a normales dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula de marca, contenido de cinc y contenido de trímero en % (véase, Lawrence y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).
[0008] Se ha encontrado que Apo2L/TRAIL se une a al menos cinco receptores diferentes. Al menos dos de los receptores que se unen a Apo2L/TRAIL contienen un dominio de muerte citoplásmica funcional. Un receptor tal se ha denominado en lo sucesivo “DR4” (y alternativamente TR4 o TRAIL-R1) (Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); véanse también el documento WO98/32856 publicado el 30 julio de 1998; el documento WO99/37684 publicado el 29 julio de 1999; el documento WO 00/73349 publicado el 7 de diciembre de 2000; el documento US
6.433.147 concedido el 13 de agosto de 2002; el documento US 6.461.823 concedido el 8 de octubre de 2002 y el documento US 6.342.383 concedido el 29 de enero de 2002).
[0009] Otro receptor tal para Apo2L/TRAIL se ha denominado en lo sucesivo DR5 (también se ha denominado alternativamente en lo sucesivo Apo-2; TRAIL-R o TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, STRICK2 o KILLER) (véanse, por ejemplo, Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997), Pan y col., Science, 277:815-818 (1997), el documento WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998; el documento WO98/41629 publicado el 24 septiembre de 1998; Screaton y col., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak y col.; EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu y col., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); el documento WO98/35986 publicado el 20 de agosto de 1998; el documento EP870.827 publicado el 14 de octubre de 1998; el documento WO98/46643 publicado el 22 de octubre de 1998; el documento WO99/02653 publicado el 21 de enero de 1999; el documento WO99/09165 publicado el 25 de febrero de 1999; el documento WO99/11791 publicado el 11 de marzo de 1999; el documento US 2002/0072091 publicado el 13 de agosto de 2002; el documento US 2002/0098550 publicado el 7 de diciembre de 2001; el documento US
6.313.269 concedido el 6 de diciembre de 2001; el documento US 2001/0010924 publicado el 2 de agosto de 2001; el documento US 2003/01255540 publicado el 3 de julio de 2003; el documento US 2002/0160446 publicado el 31 de octubre de 2002, el documento US 2002/0048785 publicado el 25 de abril de 2002; el documento US 6.342.369 concedido en febrero de 2002; el documento US 6.569.642 concedido el 27 de mayo de 2003, el documento US
6.072.047 concedido el 6 de junio de 2000, el documento US 6.642.358 concedido el 4 de noviembre de 2003; el documento US 6.743.625 concedido el 1 de junio de 2004). Al igual que DR4, se informa que DR5 contiene un dominio de muerte citoplásmica y que puede señalizar apoptosis tras la unión al ligando (o tras la unión a una molécula tal como un anticuerpo agonista que imite la actividad del ligando). La estructura cristalina del complejo formado entre Apo-2L/TRAIL y DR5 se describe en Hymowitz y col., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).
[0010] Tras la unión al ligando, tanto DR4 como DR5 pueden desencadenar apoptosis independientemente reclutando y activando el iniciador de apoptosis, la caspasa 8, mediante la molécula adaptadora que contiene el dominio de muerte denominada en lo sucesivo FADD/Mort1 [Kischkel y col., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick y col., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer y col., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)].
[0011] Se ha informado que Apo2L/TRAIL también se une a aquellos receptores denominados en lo sucesivo DcR1, DcR2 y OPG que se cree que funcionan de inhibidores, en vez de transductores de la señalización (véanse, por ejemplo, DCR1 (también denominado en lo sucesivo TRID, LIT o TRAIL-R3) [Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane y col., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider y col., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti y col., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); y Mongkolsapaya y col., J. Immunol., 160:3-6 (1998); DCR2 (también llamado TRUNDD o TRAIL-R4) [Marsters y col., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan y col., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti y col., Immunity, 7:813820 (1997)] y OPG [Simonet y col., arriba]. A diferencia de DR4 y DR5, los receptores DcR1 y DcR2 no señalizan apoptosis.
[0012] En la bibliografía se ha informado de ciertos anticuerpos que se unen a los receptores DR4 y/o DR5. Por ejemplo, los anticuerpos anti-DR4 dirigidos contra el receptor DR4 y que tienen actividad agonista o apoptósica en ciertas células de mamífero se describen en, por ejemplo, el documento WO 99/37684 publicado el 29 de julio de 1999; el documento WO 00/73349 publicado el 12 de julio de 2000; el documento WO 03/066661 publicado el 14 de agosto de 2003. Véanse también, por ejemplo, Griffith y col., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai y col., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); el documento WO 02/097033 publicado el 2 de diciembre de 2002; el documento WO 03/042367 publicado el 22 de mayo de 2003; el documento WO 03/038043 publicado el 8 de mayo de 2003; el documento WO 03/037913 publicado el 8 de mayo de 2003. Asimismo se han descrito ciertos anticuerpos anti-DR5, véanse, por ejemplo, el documento WO 98/51793 publicado el 8 de noviembre de 1998; Griffith y col., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa y col., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hilander y col., “An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”, resumen, 2º Congreso internacional de anticuerpos monoclonales en cánceres, 29 de agosto-1 de septiembre de 2002, Banff, Alberta, Canadá; el documento WO 03/038043 publicado el 8 de mayo de 2003; el documento WO 03/037913 publicado el 8 de mayo de 2003. Además, se han descrito ciertos anticuerpos que tienen reactividad cruzada con tanto receptores DR4 como DR5 (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.252.050 concedida el 26 de junio de 2001).
[0013] La transformación neoplásica de algunas células de mamífero se ha asociado en ciertos casos a cambios característicos en la expresión de antígenos Sialyl Lewis A y Sialyl Lewis X. Están presentes cantidades relativamente altas de Sialyl Lewis A/X, por ejemplo, en algunos adenocarcinomas humanos de colon, páncreas y estómago, y se han empleado ensayos usando anticuerpos dirigidos contra las estructuras de hidratos de carbono sobre estos antígenos como medio para detectar cánceres pancreáticos y gastrointestinales (véase, por ejemplo, Ugorski y col., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002)). El nivel de expresión de estos marcadores tumorales de hidratos de carbono también ha guardado relación con el resultado clínico, los tiempos de supervivencia del paciente y un indicador de enfermedad metastásica.
[0014] Se ha mostrado que tanto Sialyl Lewis A como Sialyl Lewis X se unen a una familia de proteínas de unión a hidratos de carbono que participan en la extravasación de células de la circulación sanguínea llamadas las selectinas. Algunos informes sugieren que Sialyl Lewis A y X son ligandos para E-selectina y pueden ser responsables de la adhesión de células cancerosas humanas al endotelio. Las estructuras de Lewis sialiladas presentes sobre la superficie de células cancerosas son llevadas por las cadenas de hidratos de carbono de glicoproteínas y glicolípidos y se unen a la E-selectina presente sobre células endoteliales. Por consiguiente, las selectinas y sus ligandos de hidrato de carbono pueden desempeñan una función importante en la recirculación selectiva de células tumorales durante la metástasis.
[0015] Se cree que la biosíntesis de Sialyl Lewis A y X es dependiente de la adición final de fucosa de guanosina-difosfato-fucosa (GDP-Fuc) en el enlace alfa (1,3) y alfa (1,4) a precursores sialilados mediante enzimas específicas del tipo de célula y específicas de la fase de desarrollo, una etapa catalizada por alfa-1,3/1,4fucosiltransferasas (alfa 1,3/1,4 Fuc-T, FUT).
[0016] Hasta la fecha se han clonado y caracterizado varios genes de fucosiltransferasa humana. La expresión de estos genes (FUT 3-7) y sus productos enzimáticos (Fuc-TIII-VII) parecer ser específica de tejido. Las enzimas codificadas por los cinco genes se llaman FUTIII, FUTIV, FUTV, FUTVI y FUTVII. Los tres genes que codifican FUTIII, FUTV y FUTVI están localizados en posiciones físicas próximas sobre el cromosoma 19p13.3. Los estudios bioquímicos y de clonación molecular sugieren que la expresión específica de linaje del resto de Sialyl Lewis A/X se determina por expresión específica de linaje de genes alfa-1,3-fucosiltransferasa cuyos productos enzimáticos operan en precursores de oligosacáridos constitutivamente expresados para dar determinantes de Sialyl Lewis A/X localizados en la superficie. Las fucosiltransferasas humanas responsables de la actividad en tejidos epiteliales son FUT3 y FUT6. Los transcritos de FUT3 [también llamados el gen alfa(1,3/1,4)fucosiltransferasa de Lewis] y FUT6 [el gen alfa(1,3)fucosiltransferasa en plasma] están presentes tanto en tejidos normales como transformados. Los transcritos de fucosiltransferasa también son frecuentes en numerosas líneas celulares de adenocarcinoma con expresión notablemente alta de FUT3 y 6 en carcinoma de colon (véanse, por ejemplo, Ugorski y col., Acta Biochimica Polonica, 49:303-311 (2002); Nakamori y col., Dis. Colon Rectum., 40:420-431 (1997); Takada y col., Cancer Res., 53:354-361 (1993); Ichikawa y col., J. Surg. Oncol., 75:98-102 (2000)); Nakagoe y col., J Exp Clin Cancer Res., marzo de 2002; 21(1):107-13; Matsumoto y col., Br J Cancer. 21 de enero de 2002; 86(2):1617; Ito y col., J Gastroenterol. Diciembre de 2001; 36(12):823-9; Nakagoe y col., Cancer Detect Prev. 2001; 25(3):299308; Kumamoto y col., Cancer Res. 1 de junio de 2001; 61(11):4620-7; Murata y col., Dis Colon Rectum. Abril de 2001; 44(4):A2-A4; Nakagoe y col., J Exp Clin Cancer Res. Marzo de 2001; 20(1):85-90; Nakagoe y col., J Gastroenterol. Marzo de 2001; 36(3):166-72; Nakagoe y col., Tumour Biol. Marzo-Abril de 2001; 22(2):115-22; Nakagoe y col., Can J Gastroenterol. Octubre de 2000; 14 (9):753-60; Izawa y col., Cancer Res. 1 de marzo de 2000; 60(5):1410-6; Tanaka y col., Hepatogastroenterology. Marzo-Abril de 1999; 46(26):875-82; Matsushita y col., Cancer Lett. 27 de noviembre de 1998; 133(2):151-60; Sato y col., Anticancer Res. Septiembre-Octubre de 1997; 17(5A):3505-11; Yamada y col., Br J Cancer. 1997; 76(5):582-7; Nakamori y col., Dis Colon Rectum. Abril de 1997; 40(4):420-31; Srinivas y col., Scand J Immunol. Septiembre de 1996; 44(3):197-203; Matsushita y col., Lab Invest. Diciembre de 1990; 63(6):780-91; Ashizawa y col., J Exp Clin Cancer Res. Marzo de 2003; 22(1):91-8; Nakagoe y col., J Exp Clin Cancer Res. Septiembre de 2002; 21(3):363-9; Nakagoe y col., Anticancer Res. Enero-Febrero de 2002; 22 (1A):451-8; Nakagoe y col., J Clin Gastroenterol. Abril de 2002; 34(4):408-15; Nakagoe y col., Cancer Lett. 25 de enero de 2002; 175(2):213-21; Tatsumi y col., Clin Exp Metastasis. Noviembre de 1998; 16(8):743-50; Ikeda y col., J Surg Oncol. Julio de 1996; 62(3):171-6; Ikeda y col., Eur J Surg Oncol. Abril de 1995; 21(2):168-75; Togayachi y col., Int J Cancer. 24 de septiembre de 1999; 83(1):70-9; Satoh y col., Clin Cancer Res. Abril de 1997; 3(4):495-9; Satoh y col., Respiration. 1998; 65(4):295-8; Satoh y col., Anticancer Res. Julio-Agosto de 1998; 18(4B):2865-8; Fukuoka y col., Lung Cancer. Mayo de 1998; 20(2):109-16; Fujiwara y col., Anticancer Res. Marzo-Abril de 1998; 18(2A):1043-6; Ogawa y col., Int J Cancer. 22 de abril de 1997; 74(2):189-92; Ogawa y col., J Thorac Cardiovasc Surg. Agosto de 1994; 108(2):329-36; Asao y col., Cancer. 15 de diciembre de 1989; 64(12):2541-5; Narita y col., Breast Cancer. 29 de marzo de 1996; 3(1):19-23; Yamaguchi y col., Oncology. Julio-Agosto de 1998; 55(4):357-62; Sikut y col., Int J Cancer. 29 de mayo de 1996; 66(5):617-23; Saito y col., Anticancer Res. Julio-Agosto de 2003; 23(4):3441-6; Fujii y col., Urol Int. 2000; 64(3):129-33; Idikio y col., Glycoconj J. Noviembre de 1997; 14(7):875-7; Inoue y col., Obstet Gynecol. Marzo de 1992; 79(3):434-40; Yamashita y col., Eur J Cancer. Enero de 2000; 36(1):113-20; Hamanaka y col., Pancreas. Agosto de 1996; 13(2):160-5; Ho y col., Cancer Res. 15 de agosto de 1995; 55(16):3659-63.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0017] La invención desvelada en este documento proporciona procedimientos y ensayos que examinan la expresión de uno o más biomarcadores en una muestra de tejido o de células de mamífero, siendo la expresión de uno o más de tales biomarcadores predictiva de si la muestra de tejido o de células será sensible o no a agentes inductores de apoptosis tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas anti-DR5. En diversas realizaciones de la invención, los procedimientos y ensayos examinan la expresión de biomarcadores tales como ciertas fucosiltransferasas, en particular fucosiltransferasa 3 (FUT3) y/o fucosiltransferasa 6 (FUT6), además de antígenos Sialyl Lewis A y/o X.
[0018] Como se ha tratado anteriormente, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen ser resistentes a la inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi y col., arriba; Walzcak y col., arriba). También se ha observado que algunas poblaciones de tipos de células humanas enfermas (tales como ciertas poblaciones de células cancerosas) son resistentes a inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi y col., J. Clin. Invest., 1999, arriba; Walczak y col., Nature Med., 1999, arriba). Por consiguiente, examinando una muestra de tejido o de células de mamífero para la expresión de ciertos biomarcadores a modo de ensayo puede obtenerse convenientemente y eficientemente información útil en la evaluación de terapias apropiadas o eficaces para tratar pacientes. Por ejemplo, la información obtenida de un ensayo para detectar la expresión de PUT3 o FUT6 en una muestra de tejido o de células de mamífero puede proporcionar a los médicos datos útiles que pueden usarse para determinar una pauta terapéutica óptima (usando Apo2L/TRAIL o anticuerpos agonistas de receptores de muerte) para pacientes que padecen un trastorno tal como cáncer.
[0019] La invención proporciona procedimientos para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero (tal como una célula cancerosa) a Apo2L/TRAIL o un anticuerpo agonista de receptores de muerte. En ciertas realizaciones, los procedimientos comprenden obtener una muestra de tejido o de células de mamífero y examinar el tejido o célula para la expresión de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6. Los procedimientos también pueden comprender examinar el tejido o célula para la expresión de otro biomarcador tal como el (los) antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X. Los procedimientos pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática, ensayos inmunohistoquímicos y otros tratados en este documento. La determinación de la expresión de tales biomarcadores en dichos tejidos o células será predictiva de que tales tejidos o células serán sensibles a la actividad inductora de apoptosis de Apo2/TRAIL y/o anticuerpo de receptores de muerte. En realizaciones opcionales, los tejidos o células también pueden examinarse para la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2.
[0020] Otros procedimientos de la invención incluyen procedimientos de inducción de apoptosis en una muestra de tejido o de células de mamífero que comprende las etapas de obtener una muestra de tejido o de células de mamífero, examinar el tejido o célula para la expresión de uno o más biomarcadores tales como fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X y, tras determinar que dicha muestra de tejido o de células expresa dicho uno o más biomarcadores, exponer dicha muestra de tejido o de células a una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL o anticuerpo agonista de receptores de muerte. Las etapas en los procedimientos para examinar la expresión de uno o más biomarcadores pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática y ensayos inmunohistoquímicos. En realizaciones opcionales, los procedimientos también comprenden examinar la muestra de tejido o de células para la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2. Opcionalmente, la muestra de tejido o de células comprende tejido o células de cáncer.
[0021] En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno en un mamífero, comprendiendo el procedimiento de tratamiento:
examinar una muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X, y tras determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control, administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para así inducir apoptosis y tratar el trastorno.
[0022] Las etapas en los procedimientos para examinar la expresión de uno o más biomarcadores pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática y ensayos inmunohistoquímicos. En realizaciones opcionales, los procedimientos también comprenden examinar la muestra de tejido o de células para la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2. Opcionalmente, los usos comprenden tratar cáncer en un mamífero. Opcionalmente, los usos comprenden, además de administrar una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL y/o anticuerpo agonista de receptores de muerte, administrar agente(s) quimioterapéutico(s) o radioterapia a dicho mamífero.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS [0023]
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del ligando Apo-2 humano (SEQ ID NO:2) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:1). El “N” en la posición de nucleótido 447 se usa para indicar que la base de nucleótidos puede ser “T” o “G”. Las Figuras 2A y 2B muestran la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO:4) para DR4 humano de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:3). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos respectivas para DR4 humano también se informan en Pan y col., Science, 276:111 (1997). La Figura 3A muestra la secuencia de 411 aminoácidos (SEQ ID NO:5) de DR5 humano como se ha publicado en el documento WO 98/51793 el 19 de noviembre de 1998. En la técnica se conoce una variante de corte y empalme de la transcripción de DR5 humano. Esta variante de corte y empalme de DR5 codifica la secuencia de 440 aminoácidos (SEQ ID NO:6) de DR5 humano mostrada en las Figuras 3B y 3C como se ha publicado en el documento WO 98/35986 el 20 de agosto de 1998. La Figura 3D muestra las secuencias de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO:7) para DcR1 humano de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:8). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos respectivas para DcR1 humano (y dominios particulares del mismo) también se muestran y se describen en el documento WO 98/58062. La Figura 3E muestra las secuencias de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO:9) para DcR2 humano de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:10). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos respectivas para DcR2 humano (y dominios particulares del mismo) se muestran en el documento WO 99/10484. La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO:11) para fucosiltransferasa (FUT3) humana de longitud completa (1,3/1,4) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:12). Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27328 y se describen, por ejemplo, en Kukowska-Latallo y col., Genes Dev. Agosto de 1990; 4(8):1288-303. La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO:13) para alfa (1,3) fucosiltransferasa (FUT6) humana de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:14). Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27333 y se describen, por ejemplo, en Koszdin y Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 31 de agosto de 1992; 187(1):152-7. La Figura 6 proporciona un cuadro resumen de los datos obtenidos en el análisis de 28 líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para sensibilidad o resistencia a actividad apoptósica de Apo2L (+ suero bovino fetal al 0,5% “SBF” o SBF al 10%) o anticuerpo monoclonal “mAb” contra DR5, reticulado “XL” o no reticulado,
+
suero bovino fetal al 0,5% “SBF” o SBF al 10%) y expresión de FUT 3, FUT 6, Sialyl Lewis A y Sialyl Lewis
X.
La Figura 7 proporciona una comparación de la sensibilidad de diversas líneas de células de cáncer de colon
o colorrectal para el anticuerpo contra DR5 y la expresión de FUT 3, como se mide por PCR cuantitativa. La Figura 8 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para sensibilidad o resistencia al anticuerpo contra DR5 (más reticulante) y expresión de Sialyl Lewis X o A, como se determina por FACS. La Figura 9A muestra una prueba de correlación de rangos de Spearman que analiza la sensibilidad o la resistencia de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la correlación con la expresión de FUT3. La Figura 9B muestra los resultados de una prueba exacta de Fisher que analiza la sensibilidad (“sens”) o la resistencia (“res”) de las diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la significancia estadística entre la expresión de FUT 3 y Sialyl Lewis A/X y la sensibilidad de las líneas celulares respectivas a la actividad apoptósica del anticuerpo contra DR5. La Figura 10 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (como se determina por PCR cuantitativa) y el estado (sensible
o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. La Figura 11 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (como se determina por FACS) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. La Figura 12 muestran tinción inmunohistoquímica para Sialyl Lewis A y X en cuatro líneas de células de cáncer colorrectal, CaCo2, SW 1417, DLD-1 y Colo 205, y su correlación con la expresión de Sialyl Lewis A y X como se mide por FACS y su correlación con la sensibilidad a Apo2L. La Figura 13 muestra un resumen de experimentos de IHC que demuestran la expresión de Sialyl Lewis A y X en muestras de tejido de mucosa de colon normal, tejido de hígado normal, cáncer de colon primario y metástasis de cáncer de colon.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0024] Las técnicas y procedimientos descritos o citados en este documento son generalmente bien entendidos y comúnmente se emplean usando metodología convencional por aquellos expertos en la materia tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y. Según corresponda, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos comercialmente disponibles se llevan a cabo generalmente según protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se indique de otro modo.
[0025] Antes de describir los presentes procedimientos y ensayos debe entenderse que la presente invención no se limita a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, construcciones y reactivos descritos ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con el fin de sólo describir realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado sólo por las reivindicaciones adjuntas.
[0026] Debe observarse que, como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, referencia a “una alteración genética” incluye una pluralidad de tales alteraciones y referencia a “una sonda” incluye referencia a una o más sondas y equivalentes de las mismas conocidas para aquellos expertos en la materia, etc.
[0027] Las publicaciones citadas en este documento se citan para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder las publicaciones en virtud de una fecha de prioridad anterior o fecha anterior de la invención. Adicionalmente, las fechas de publicación reales pueden ser diferentes de aquellas mostradas y requieren verificación independiente.
I. DEFINICIÓN
[0028] Los términos “Apo2L/TRAIL”, “Apo-2L” y “TRAIL” se usan en este documento para referirse a una secuencia de polipéptidos que incluye los residuos de aminoácidos 114-281, ambos incluidos, 95-281, ambos incluidos, los residuos 92-281, ambos incluidos, los residuos 91-281, ambos incluidos, los residuos 41-281, ambos incluidos, los residuos 15-281, ambos incluidos, o los residuos 1-281, ambos incluidos, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1, además de fragmentos biológicamente activos, variantes de deleción, inserción o sustitución de las secuencias anteriores. En una realización, la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 114-281 de la Figura 1) y opcionalmente consiste en los residuos 114-281 de la Figura 1. Opcionalmente, la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 92-281 o los residuos 91-281 de la Figura 1. Los polipéptidos Apo-2L pueden estar codificados por la secuencia de nucleótidos nativa mostrada en la Figura 1. Opcionalmente, el codón que codifican el residuo Pro119 (Figura 1) puede ser “CCT” o “CCG”. En otras realizaciones, los fragmentos o las variantes son biológicamente activos y tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencias de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias, e incluso más preferentemente al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de secuencias con una cualquiera de las secuencias de Apo2L/TRAIL anteriormente citadas. Opcionalmente, el polipéptido Apo2L/TRAIL es codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de polinucleótidos codificante proporcionada en la Figura 1. La definición engloba variantes de sustitución de Apo2L/TRAIL en las que al menos un aminoácido está sustituido por un residuo de alanina. Variantes de sustitución particulares de Apo2L/TRAIL incluyen aquellas en las que al menos un aminoácido está sustituido por un residuo de alanina. Estas variantes de sustitución incluyen aquellas identificadas, por ejemplo, como “D203A”; “D218A” y “D269A.” Esta nomenclatura se usa para identificar variantes de Apo2L/TRAIL en las que los residuos de ácido aspártico en las posiciones 203, 218 y/o 269 (usando la numeración mostrada en la Figura 1) están sustituidas por residuos de alanina. Opcionalmente, las variantes de Apo2L pueden comprender una o más de las sustituciones de alanina que se citan en la Tabla I de la solicitud PCT publicada WO 01/00832. Las variantes de sustitución incluyen una o más de las sustituciones de residuos identificadas en la Tabla I del documento WO 01/00832 publicado el 4 de enero de 2001. La definición también engloba un Apo2L/TRAIL de secuencia nativa aislado de una fuente de Apo2L/TRAIL o preparado por procedimientos recombinantes o sintéticos. El Apo2L/TRAIL de la invención incluye los polipéptidos denominados en lo sucesivo Apo2L/TRAIL o TRAIL desvelados en las publicaciones PCT nº WO97/01633 y WO97/25428. Los términos “Apo2L/TRAIL” o “Apo2L” se usan para referirse generalmente a formas de Apo2L/TRAIL que incluyen formas monómeras, dímeras o trímeras del polipéptido. Todas las numeraciones de residuos de aminoácidos citadas en la secuencia de Apo2L usan la numeración según la Figura 1, a menos que se establezca específicamente de otro modo. Por ejemplo, “D203” o “Asp203” se refiere al residuo de ácido aspártico en la posición 203 en la secuencia proporcionada en la Figura 1.
[0029] El término “dominio extracelular de Apo2L/TRAIL” o “DEC de Apo2L/TRAIL” se refiere a una forma de Apo2L/TRAIL que está esencialmente libre de dominios transmembranario y citoplásmico. Generalmente, el DEC tendrá menos del 1% de tales dominios transmembranario y citoplásmico y preferentemente tendrá menos del 0,5% de tales dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembranario identificado para los polipéptidos de la presente invención se identifica con arreglo a criterios rutinariamente empleados en la materia para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembranario pueden variar, pero lo más probable es no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se ha identificado inicialmente. En realizaciones preferidas, el DEC consistirá en una secuencia de dominio extracelular soluble del polipéptido que está libre de los dominios transmembranario y citoplásmico o intracelular (y no está unido a la membrana). Secuencias particulares del dominio extracelular de Apo-2L/TRAIL se describen en las publicaciones PCT nº WO97/01633 y WO97/25428.
[0030] El término “monómero de Apo2L/TRAIL” o “monómero de Apo2L” se refiere a una cadena covalente de una secuencia del dominio extracelular de Apo2L.
[0031] El término “dímero de Apo2L/TRAIL” o “dímero de Apo2L” se refiere a dos monómeros de Apo-2L unidos en un enlace covalente mediante un enlace disulfuro. El término como se usa en este documento incluye dímeros de Apo2L aislados y dímeros de Apo2L que están dentro de formas trímeras de Apo2L (es decir, asociados a otro tercer monómero de Apo2L).
[0032] El término “trímero de Apo2L/TRAIL” o “trímero de Apo2L” se refiere a tres monómeros de Apo2L que están asociados de forma no covalentemente.
[0033] El término “agregado de Apo2L/TRAIL” se usa para referirse a formas oligoméricas superiores autoasociadas de Apo2L/TRAIL tales como trímeros de Apo2L/TRAIL que forman, por ejemplo, formas hexaméricas y nanoméricas de Apo2L/TRAIL. La determinación de la presencia y la cantidad de monómero, dímero o trímero de Apo2L/TRAIL (u otros agregados) puede hacerse usando procedimientos y ensayos conocidos en la técnica (y usando materiales comercialmente disponibles) tales como HPLC de exclusión por tamaño nativa (“SEC”), exclusión por tamaño desnaturalizante usando dodecilsulfato de sodio (“SDS-SEC”), HPLC de fase inversa y electroforesis capilar.
[0034] “Receptor del ligando Apo-2” incluye los receptores denominados en la materia “DR4” y “DR5” cuyas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos se muestran en las Figuras 2 y 3 respectivamente. Pan y col. han descrito el miembro de la familia de receptores de TNF denominado en lo sucesivo “DR4” (Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); véanse también el documento WO98/32856 publicado el 30 de julio de 1998; el documento WO 99/37684 publicado el 29 de julio de 1999; el documento WO 00/73349 publicado el 7 de diciembre de 2000; el documento US 6.433.147 concedido el 13 de agosto de 2002; el documento US 6.461.823 concedido el 8 de octubre de 2002 y el documento US 6.342.383 concedido el 29 de enero de 2002). Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997) y Pan y col., Science, 277:815-818 (1997) describieron otro receptor para Apo2L/TRAIL (véanse también el documento WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998; el documento WO98/41629 publicado el 24 de septiembre de 1998). Este receptor se denomina en lo sucesivo DR5 (el receptor también se ha denominado alternativamente en lo sucesivo Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 o KILLER; Screaton y col., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak y col., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu y col., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); el documento WO98/35986 publicado el 20 de agosto de 1998; el documento EP870.827 publicado el 14 de octubre de 1998; el documento WO98/46643 publicado el 22 octubre de 1998; el documento WO99/02653 publicado el 21 de enero de 1999; el documento WO99/09165 publicado el 25 de febrero de 1999; el documento WO99/11791 publicado el 11 de marzo de 1999; el documento US 2002/0072091 publicado el 13 de agosto de 2002; el documento US 2002/0098550 publicado el 7 de diciembre de 2001; el documento US 6.313.269 concedido el 6 de diciembre de 2001; el documento US 2001/0010924 publicado el 2 de agosto de 2001; el documento US 2003/01255540 publicado el 3 de julio de 2003; el documento US 2002/0160446 publicado el 31 de octubre de 2002, el documento US 2002/0048785 publicado el 25 de abril de 2002; el documento US 6.569.642 concedido el 27 de mayo de 2003, el documento US 6.072.047 concedido el 6 de junio de 2000, el documento US 6.642.358 concedido el 4 de noviembre de 2003). Como se ha descrito anteriormente, otros receptores para Apo-2L incluyen DcR1, DcR2 y OPG (véase, Sheridan y col., arriba; Marsters y col., arriba; y Simonet y col., arriba). El término “receptor para Apo2L” cuando se usa en este documento engloba el receptor de secuencia nativa y variantes del receptor. Estos términos engloban el receptor para Apo-2L expresado en una variedad de mamíferos que incluye seres humanos. El receptor para Apo-2L puede expresarse endógenamente cuando se produce naturalmente en una variedad de linajes de tejido humano, o puede expresarse por procedimientos recombinantes o sintéticos. Un “receptor para Apo2L de secuencia nativa” comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un receptor para Apo-2L derivado de la naturaleza. Por tanto, un receptor para Apo-2L de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos del receptor para Apo-2L que se produce naturalmente a partir de cualquier mamífero. Tal receptor para Apo-2L de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término “receptor para Apo-2L de secuencia nativa” engloba específicamente formas truncadas o secretadas que se producen naturalmente del receptor (por ejemplo, una forma soluble que contiene, por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes que se producen naturalmente (por ejemplo, formas alternativamente cortadas y empalmadas) y variantes alélicas que se producen naturalmente. Las variantes del receptor pueden incluir fragmentos o mutantes de deleción del receptor para Apo-2L de secuencia nativa. La Figura 3A muestra la secuencia de 411 aminoácidos de DR5 humano como se ha publicado en el documento WO 98/51793 el 19 de noviembre de 1998. Una variante de corte y empalme de transcripción de DR5 humano se conoce en la técnica. Esta variante de corte y empalme de DR5 codifica la secuencia de 440 aminoácidos de DR5 humano mostrada en las Figuras 3B y 3C como se ha publicado en el documento WO 98/35986 el 20 de agosto de 1998.
[0035] “Anticuerpo de receptores de muerte” se usa en este documento para referirse generalmente a anticuerpo o anticuerpos dirigidos contra un receptor en la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral y que contiene un dominio de muerte que puede señalizar apoptosis, y tales anticuerpos incluyen anticuerpo contra DR5 y anticuerpo contra DR4.
[0036] “Anticuerpo del receptor DR5”, “anticuerpo contra DR5” o “anticuerpo anti-DR5” se usan en un amplio sentido para referirse a anticuerpos que se unen a al menos un forma de un receptor DR5 o dominio extracelular del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR5 está fusionado o ligado a una secuencia o molécula heteróloga. Preferentemente, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo a que forme complejos de mayor orden u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR5 se une al receptor DR5, pero no se une ni reacciona de forma cruzada con ningún receptor para Apo-2L adicional (por ejemplo DR4, DcR1 o DcR2). Opcionalmente, el anticuerpo es un agonista de actividad de señalización de DR5.
[0037] Opcionalmente, el anticuerpo contra DR5 de la invención se une a un receptor DR5 en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 20 mM como se mide en un ensayo de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpo contra DR5 de la invención presentan un valor de CI50 de aproximadamente 0,6 nM a aproximadamente 18 mM como se mide en un ensayo de unión BIAcore.
[0038] “Anticuerpo del receptor DR4”, “anticuerpo contra DR4” o “anticuerpo anti-DR4” se usa en un amplio sentido para referirse a anticuerpos que se unen a al menos una forma de un receptor DR4 o dominio extracelular del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR4 está fusionado o ligado a una secuencia o molécula heteróloga. Preferentemente, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo a que forme complejos de mayor orden u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo contra DR4 se une al receptor DR4, pero no se une ni reacciona de forma cruzada con ningún receptor para Apo-2L adicional (por ejemplo DR5, DcR1 o DcR2). Opcionalmente, el anticuerpo es un agonista de actividad de señalización de DR4.
[0039] Opcionalmente, el anticuerpo contra DR4 de la invención se une a un receptor DR4 en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 20 mM como se mide en un ensayo de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos contra DR5 de la invención presentan un valor de CI50 de aproximadamente 0,6 nM a aproximadamente 18 mM como se mide en un ensayo de unión BIAcore.
[0040] El término “agonista” se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que potencie, estimule o active parcial o completamente una o más actividades biológicas de Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo. Ejemplos de tales actividades biológicas de unión de Apo2L/TRAIL a DR4 o DR5 incluyen apoptosis, además de aquellas adicionalmente informadas en la bibliografía. Un agonista puede funcionar en un modo directo o indirecto. Por ejemplo, el agonista puede funcionar para potenciar, estimular o activar parcial o completamente una o más actividades biológicas de DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo, como resultado de su unión directa a DR4 o DR5 que produce la activación del receptor o la transducción de señales. El agonista también puede funcionar indirectamente para potenciar, estimular o activar parcial o completamente una o más actividades biológicas de DR4
o DR5, in vitro, in situ o in vivo, como resultado de, por ejemplo, estimular otra molécula efectora que luego produce la activación de DR4 o DR5 o la transducción de señales. Se contempla que un agonista puede actuar de molécula potenciadora que funciona indirectamente para potenciar o aumentar la activación o actividad de DR4 o DR5. Por ejemplo, el agonista puede potenciar la actividad de Apo-2L endógeno en un mamífero. Esto podría llevarse a cabo, por ejemplo, complejando previamente DR4 o DR5 o estabilizando complejos del ligando respectivo con el receptor DR4 o DR5 (tal como estabilizando el complejo nativo formado entre Apo-2L y DR4 o DR5).
[0041] El término “biomarcador” como se usa en la presente solicitud se refiere generalmente a una molécula que incluye un gen, proteína, estructura de hidrato de carbono o glicolípido cuya expresión en o sobre un tejido o célula de mamífero puede detectarse mediante procedimientos convencionales (o procedimientos desvelados en este documento) y es predictiva de una sensibilidad de células o tejidos de mamífero a Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte. Tales biomarcadores contemplados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, “(1,3/1,4) fucosiltransferasa” o “FUT3”, “alfa (1,3) fucosiltransferasa” o “FUT6”, “Sialyl Lewis A”, y “Sialyl Lewis X”. Opcionalmente, la expresión de un biomarcador tal se determina que es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control. Opcionalmente, por ejemplo, la expresión de un biomarcador tal se determinará en un ensayo de PCR o FACS que es al menos 50 veces, o preferentemente al menos 100 veces, superior en la muestra de tejido o de células de prueba que la observada para una muestra de tejido o de células de control. Opcionalmente, la expresión de un biomarcador tal se determinará en un ensayo de IHC para puntuar al menos 2 o más para la intensidad de tinción.
[0042] “(1,3/1,4) fucosiltransferasa” o “FUT3” se usa en este documento para referirse a una molécula que tiene características estructurales como se describen en este documento y opcionalmente que cataliza la transferencia de un residuo de fucosa del sustrato donante, GDP-fucosa, a un sustrato receptor en un enlace α3-o α4-para GlcNAc (FUT III-VII y IX). La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos para FUT3 humana se proporciona en la Figura 4. Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27328 y se describen, por ejemplo, en Kukowska-Latallo y col., Genes Dev. 1990 Aug; 4(8):1288-303. Las FUT son generalmente glicoproteínas transmembranarias de tipo II que residen en las vacuolas de Golgi y normalmente están compuestas por una cola citoplásmica del extremo N, una región que atraviesa la membrana y un dominio catalítico orientado lumenalmente en el aparato de Golgi. Entre la región que atraviesa la membrana y el dominio catalítico está una región llamada el tallo (Paulson y Colley, J. Biol. Chem., 264:17615-17618 (1989)).
[0043] “Alfa (1,3) fucosiltransferasa” o “FUT6” se usa en este documento para referirse a una molécula que estructuralmente se refiere a, por ejemplo, la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos para FUT6 humana proporcionada en la Figura 5. Estas secuencias se corresponden con el número de acceso de GenBank HSU27333 y se describen, por ejemplo, en Koszdin y Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 31 de agosto de 1992; 187(1):152-7. FUT 6 se expresa normalmente en células epiteliales y en tejidos de hígado, riñón y gastrointestinal, específicamente estómago, yeyuno y colon (y normalmente se expresa mínimamente en bazo, pulmón y cuello del útero). FUT 6 no se detecta normalmente en cerebro, corteza suprarrenal o leucocitos de sangre periférica.
[0044] “Sialyl Lewis A” se usa en este documento para referirse a una estructura o antígeno de hidratos de carbono de tetrasacáridos que tiene la siguiente secuencia o estructura que puede estar unida a la membrana o en forma soluble circulando, por ejemplo, en suero:
NeuAcα2-->3Galβ1-->3[Fucα1-->4]GlcNAcβ1-->R (NeuAcalfa2-->3Galbeta1->3(Fucalfa1-->4)GlcNAcbeta1->R)
imagen1
[0045] “Sialyl Lewis X” se usa en este documento para referirse a una estructura o antígeno de hidratos de carbono de tetrasacáridos que tiene la siguiente secuencia o estructura que puede estar unida a la membrana o en 5 forma soluble circulando, por ejemplo, en suero:
NeuAcα2-->3Galβ1-->4[Fucα1-->3]GlcNAcβ1-->R (NeuAcalfa2-->3Galbeta1->4(Fucalfa1-->3)GlcNAcbeta1->R)
imagen2
[0046] Por “sujeto” o “paciente” se indica cualquier sujeto individual para el que sea desea terapia que incluye seres humanos, ganado, perros, cobayas, conejos, pollos, insectos, etc. También está previsto incluir como sujeto cualquier sujeto que participe en ensayos de investigación clínica que no muestren ningún síntoma de enfermedad,
15 o sujetos que participan en estudios epidemiológicos, o sujetos usados como controles.
[0047] El término “mamífero” como se usa en este documento se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero que incluye seres humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención el mamífero es un ser humano.
[0048] Por “muestra de tejido o de células” se indica una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra de tejido o de células puede ser tejido sólido como de un órgano fresco, congelado y/o conservado o muestra de tejido o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente de la sangre; fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; células de cualquier tiempo en gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido también puede ser células o líneas de células primarias o cultivadas. Opcionalmente, la muestra de tejido o de células se obtiene de un tumor primario o metastásico. La muestra de tejido puede contener compuestos que no están naturalmente entremezclados con el tejido en la naturaleza tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares.
[0049] Con los fines en este documento, una “sección” de una muestra de tejido indica una parte individual o trozo de una muestra de tejido, por ejemplo, una fina rebanada de tejido o células cortada de una muestra de tejido. Se entiende que pueden tomarse múltiples secciones de muestras de tejido y someterse a análisis según la presente invención, siempre que se entienda que la presente invención comprende un procedimiento por el cual la misma sección de muestra de tejido se analiza a niveles tanto morfológicos como moleculares, o se analiza con respecto tanto a proteína como a ácido nucleico.
[0050] Por “guardan relación” o “guardar relación” se indica comparar, de cualquier forma, el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis o protocolo con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, los resultados de un primer análisis o protocolo pueden usarse en la realización de un segundo protocolo y/o los resultados de un primer análisis o protocolo pueden usarse para determinar si debería realizarse o no un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la realización de análisis o protocolo inmunohistoquímico, los resultados de IHC pueden usarse para determinar si debería realizarse o no una pauta terapéutica específica.
[0051] Por “ácido nucleico” se pretende incluir cualquier ADN o ARN. Por ejemplo, ácido nucleico cromosómico, mitocondrial, vírico y/o bacteriano presente en la muestra de tejido. El término “ácido nucleico” engloba tanto una como ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico bicatenaria e incluye cualquier fragmento o porción de una molécula de ácido nucleico intacta.
[0052] Por “gen” se indica cualquier secuencia de ácidos nucleicos o porción de la misma con una función funcional en codificar o transcribir una proteína o regular otra expresión génica. El gen puede consistir en todos los ácidos nucleicos responsables de codificar una proteína funcional o sólo una parte de los ácidos nucleicos responsables de codificar o expresar una proteína. La secuencia de ácidos nucleicos puede contener una anomalía genética dentro de exones, intrones, regiones de iniciación o terminación, secuencias promotoras, otras secuencias reguladoras o regiones adyacentes únicas al gen.
[0053] La palabra “marca” cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o composición que está conjugado o fusionado directamente o indirectamente con un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo con el que está conjugado o fusionado. La marca puede ser por sí misma detectable (por ejemplo, marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición del sustrato que es detectable.
[0054] El término “anticuerpo” en este documento se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos mientras que presenten la actividad biológica deseada.
[0055] Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto que comprende preferentemente la región de unión a antígeno o región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
[0056] Los “anticuerpos nativos” son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente
150.000 daltons compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre las cadenas regularmente separados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas.
[0057] El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables se diferencien ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida por todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad tanto en los dominios variables de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman las regiones estructurales (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran parte una configuración de hoja β, conectadas por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de hoja β. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en una estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras tales como la participación del anticuerpo en citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC).
[0058] La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y que todavía puede reticular el antígeno.
[0059] “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras en estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. En conjunto, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que sólo comprende tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse a antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión entero.
[0060] El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio de las cadenas pesadas CH1 que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en este documento para Fab' en el que el (los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
[0061] Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos llamados kappa (κ) y lambda (λ) basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
[0062] Los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varios de éstos pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se llaman α, δ, ε, γ y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.
[0063] Los fragmentos de anticuerpos “Fv monocatenario” o “scfv” comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL, estando estos dominios presentes en una única cadena de polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende además un ligador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994).
[0064] El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable (VH) de las cadenas pesadas conectados a un dominio variable (VL) de las cadenas ligeras en la misma cadena de polipéptidos (VH -VL). Usando un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
[0065] El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicas, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan por el cultivo de hibridomas, sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
[0066] Los anticuerpos monoclonales en este documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias en anticuerpos correspondientes derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas a u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, además de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. nº 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en este documento incluyen anticuerpos “privatizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo tal como babuino, mono Rhesus o cinomolgo) y secuencias de la región constante humanas (patente de EE.UU. nº 5.693.780).
[0067] Formas “humanizas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen la mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana están sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, correspondiéndose todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables con los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles véase Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
[0068] El término “región hipervariable” cuando se usa en este documento se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de una “región determinante de la complementariedad” o “CDR” (por ejemplo, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de las cadenas ligeras y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de las cadenas pesadas; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de las cadenas ligeras y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de las cadenas pesadas; Chothia y Lesk J. Mol.
Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos de la “región estructural” o “FR” son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable que se han definido en este documento.
[0069] Un anticuerpo “que une” un antígeno de interés es uno que puede unirse a ese antígeno con suficiente afinidad y/o avidez de forma que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico o de diagnóstico para elegir como diana una célula que expresa el antígeno.
[0070] Con los fines en este documento, “inmunoterapia” se referirá a un procedimiento para tratar un mamífero (preferentemente un paciente humano) con un anticuerpo, pudiendo ser el anticuerpo un anticuerpo sin conjugar o “desnudo”, o el anticuerpo puede conjugarse o fusionarse con molécula(s) o agente(s) heterólogo(s) tales como uno o más agentes citotóxico, generándose así un “inmunoconjugado”.
[0071] Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el antagonista o anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso de anticuerpo como se determina por el procedimiento de Lowry, y lo más preferentemente a más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos del extremo N o internos usando un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o preferentemente tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, generalmente, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
[0072] La expresión “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de un agente (por ejemplo, Apo2L/TRAIL, anticuerpo anti-DR4 o DR5, etc.) que es eficaz para prevenir, mejorar o tratar la enfermedad o afección en cuestión.
[0073] Los términos “tratar”, “tratamiento” y “terapia” como se usan en este documento se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva. Tratamiento o administración consecutiva se refiere a tratamiento al menos una vez al día sin interrupción en el tratamiento por uno o más días. Tratamiento o administración intermitente, o tratamiento o administración de un modo intermitente, se refiere a tratamiento que no es consecutivo, sino que es de naturaleza cíclica.
[0074] El término “citocina” es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen la hormona de crecimiento tal como la hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana de N-metionilo y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante tiroidea (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral α y β; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-α y TGF-β; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón α, β y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; y otros factores de polipéptidos que incluyen LSI y el ligando kit (KL). Como se usa en este documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
[0075] El término “agente citotóxico” como se usa en este documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o produce la destrucción de células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.
[0076] Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como el antibiótico enediína (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina γ1I y caliqueamicina θI1, véase, por ejemplo, Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, que incluye dinemicina A; bifosfonatos tales como clodronato; una esperamicina; además del cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enediína de cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (AdriamycinTM) (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolinodoxorubicina, 2-pirrolinodoxorubicina y desoxi-doxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reparadores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (GemzarTM); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NavelbineTM); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En esta definición también están incluidos agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógeno (SERM) que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FarestonTM); e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales tales como, por ejemplo, 4(5)imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) y anastrozol (Arimidax™); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
[0077] Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente célula cancerosa que expresa en exceso cualquiera de los genes identificados en este documento, tanto in vitro como in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan tales genes en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un sitio distinto de la fase S) tales como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase
M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxol e inhibidores de topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado “Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs” de Murakami y col. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la pág. 13.
[0078] Los términos “apoptosis” y “actividad apoptósica” se usan en un amplio sentido y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que normalmente va acompañada de uno o más cambios celulares característicos que incluyen condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación de ADN cromosómico o pérdida de función mitocóndrica. Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, por ensayos de viabilidad celular (tales como ensayos con azul Alamar o ensayos de MTT), análisis por FACS, activación de caspasas, fragmentación de ADN (véase, por ejemplo, Nicoletti y col., J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991), y poli-ADP-ribosa-polimerasa, “PARP”, ensayos de escisión conocidos en la técnica.
[0079] Como se usa en este documento, el término “trastorno” se refiere en general a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con las composiciones descritas en este documento que incluye cualquier enfermedad o trastorno que pueda tratarse por cantidades eficaces de Apo2L/TRAIL, un anticuerpo anti-DR4 y/o un anticuerpo anti-DR5. Éste incluye trastornos crónicos y agudos, además de aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de trastornos que van a tratarse en este documento incluyen cánceres benignos y malignos; trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, trastornos autoinmunitarios, artritis (incluyendo artritis reumatoide), esclerosis múltiple y VIH/SIDA.
[0080] Los términos “cáncer”, “canceroso” o “maligno” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por crecimiento celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma y sarcoma. Más ejemplos particulares de tales cánceres incluyen carcinoma de células escamosas, mieloma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, cáncer (del tracto) gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de hígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer del cuello del útero, cáncer cerebral, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer de cabeza y cuello.
[0081] El término “enfermedad relacionada con la inmunidad” significa una enfermedad en la que un componente del sistema inmunitario de un mamífero produce, media o contribuye de otro modo a la morbilidad en el mamífero. También están incluidas enfermedades en las que la estimulación o la intervención de la respuesta inmunitaria tiene un efecto paliativo sobre la progresión de la enfermedad. Incluido dentro de este término están enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias mediadas por inmunidad, enfermedades inflamatorias no mediadas por inmunidad, enfermedades infecciosas y enfermedades de inmunodeficiencia. Ejemplos de enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias, algunas de las cuales son inmunitarias o están mediadas por linfocitos T, que pueden tratarse según la invención incluyen lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (esclerodermia), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjögren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmunitaria (pancitopenia inmunitaria, hemoglobinuria paroxística nocturna), trombocitopenia autoinmunitaria (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada por inmunidad), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal mediadas por inmunidad (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa crónica autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades inflamatorias y pulmonares fibróticas tales como enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerosa: enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunitarias o mediadas por inmunidad que incluyen enfermedades de piel ampollosa, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinófilas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas a trasplante que incluyen rechazo de injerto y enfermedades de injerto frente a huésped. Las enfermedades infecciosas incluyen SIDA (infección por el VIH), hepatitis A, B, C, D y E, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones protozoicas e infecciones parasíticas.
[0082] “Enfermedad autoinmunitaria” se usa en este documento en un amplio sentido general para referirse a trastornos o afecciones en mamíferos en los que la destrucción de tejido normal o sano se produce a partir de respuestas inmunitarias humorales o celulares del mamífero individual a sus propios constituyentes de tejido. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso, tiroiditis, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes autoinmunitaria y enfermedad inflamatoria del intestino (EII).
[0083] El término “marcado” cuando se usa en este documento se refiere a una molécula quimérica que comprende un anticuerpo o polipéptido fusionado con un “polipéptido de marca”. El polipéptido de marca tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el que un anticuerpo puede prepararse o para proporcionar alguna otra función tal como la capacidad para oligomerizar (por ejemplo, como se produce con péptidos que tienen dominios de cremallera de leucina), todavía es suficientemente corto de forma que generalmente no interfiere con la actividad del anticuerpo o polipéptido. El polipéptido de marca también es casi preferentemente único de manera que un anticuerpo específico de marca no reacciona sustancialmente de forma cruzada con otros epítopes. Los polipéptidos de marca adecuados tienen generalmente al menos seis residuos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 residuos).
[0084] El término “ión metálico divalente” se refiere a un ión metálico que tiene dos cargas positivas. Ejemplos de iones metálicos divalentes incluyen, pero no se limitan a, cinc, cobalto, níquel, cadmio, magnesio y manganeso. Formas particulares de tales metales que pueden emplearse incluyen formas de sal (por ejemplo, formas de sal farmacéuticamente aceptable) tales como formas de cloruro, acetato, carbonato, citrato y sulfato de los iones metálicos divalentes anteriormente mencionados. Opcionalmente, un ión metálico divalente para uso en la presente invención es cinc y preferentemente la forma de sal, sulfato de cinc o cloruro de cinc.
[0085] “Aislado” cuando se usa para describir los diversos péptidos o proteínas desvelados en este documento significa péptido o proteína que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos para el péptido o proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el péptido o proteína se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos del extremo N o internos usando un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata, o (3) hasta homogeneidad por técnicas de espectroscopía de masa o de mapeo de péptidos. El material aislado incluye péptido o proteína in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente de su entorno natural no estará presente. Generalmente, sin embargo, el péptido o proteína aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
[0086] “Identidad de secuencias de aminoácidos en porcentaje (%)” con respecto a las secuencias identificadas en este documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr la identidad de secuencias en porcentaje máxima, y sin considerar sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencias. El alineamiento para determinar la identidad de secuencias de aminoácidos en porcentaje puede lograrse de diversas formas que están dentro de la habilidad en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento que incluye asignar algoritmos necesarios para lograr el máximo alineamiento con respecto a las secuencias de longitud completa que se comparan. Para los fines en este documento, los valores de identidad de aminoácidos en porcentaje pueden obtenerse usando el programa informático de comparación de secuencias, ALIGN-2, que fue escrito por Genentech, Inc. y el código fuente que ha sido presentado con documentación de usuario en la oficina de derechos de autor de EE.UU., Washington, DC, 20559, registrado bajo el nº de registro de derechos de autor de EE.UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible por Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencias están fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.
[0087] La “rigurosidad” de reacciones de hibridación puede ser fácilmente determinada por un experto en la materia, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para la hibridación apropiada, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para la re-hibridación cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de identidad deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, de esto resulta que temperaturas relativas mayores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas menores menos. Para detalles adicionales y la explicación de la rigurosidad de reacciones de hibridación véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
[0088] “Condiciones de alta rigurosidad”, como se define en este documento, se identifican por aquellas que:
(1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado; cloruro sódico 0,015 M / citrato de sodio 0,0015 M / dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante; 50% (v/v) de formamida con albúmina de suero bovino al 0,1% / Ficoll al 0,1% / polivinilpirrolidona al 0,1% de / tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x disolución Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
[0089] “Condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse como se describe por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen incubación durante la noche a 37ºC en una disolución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 3750ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para adaptar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
[0090] El término “cebador” o “cebadores” se refiere a secuencias de oligonucleótidos que se hibridan con un polinucleótido diana de ARN o ADN complementario y sirven de puntos de partida para la síntesis escalonada de un polinucleótido a partir de mononucleótidos por la acción de una nucleotidiltransferasa como se produce, por ejemplo, en una reacción en cadena de la polimerasa.
[0091] El término “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. La células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
[0092] El ácido nucleico está “operativamente ligado” cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está operativamente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado de forma que facilite la traducción. Generalmente, “operativamente ligado” significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La ligación se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos se usan según la práctica convencional.
[0093] La “citotoxicidad celular mediada por anticuerpos” y “ADCC” se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos espontáneos (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido sobre una célula diana y posteriormente producen lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar ADCC, los linfocitos NK, sólo expresan FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII yFcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de EE.UU. nº 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre de periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos espontáneos (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes y col. PNAS (USA), 95:652-656 (1998). [0094] Las “células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcγRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre de periférica (PBMC), linfocitos citolíticos espontáneos (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose PBMC y linfocitos NK.
[0095] Los términos “receptor Fc” y “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, que incluyen variantes alélicas y alternativamente formas cortadas y empalmadas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activador”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”) que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación de inmunorreceptores basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR que incluyen aquellos que van a identificarse en el futuro están englobados por el término “FcR” en este documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim y col., J. Immunol., 24:249 (1994)). Los FcR en este documento incluyen polimorfismos tales como el dimorfismo genético en el gen que codifica FcγRIIIa produciendo tanto una fenilalanina (F) como una valina (V) en la posición de aminoácido 158, localizada en la región del receptor que se une a IgG1. Se ha mostrado que la valina homocigótica FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V) tiene una mayor afinidad por IgG1 humana y median en el aumento de ADCC in vitro con respecto a la fenilalanina homocigótica FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) o receptores heterocigóticos (FcγRIIIa-158F/V).
[0096] La “citotoxicidad dependiente de complemento” o “CDC” se refiere a la capacidad de una molécula de lisar una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejado con un antígeno consanguíneo. Para evaluar la activación del complemento puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
II. PROCEDIMIENTOS TÍPICOS Y MATERIALES DE LA INVENCIÓN
[0097] Los procedimientos y ensayos desvelados en este documento están dirigidos al examen de la expresión de uno o más biomarcadores en una muestra de tejido o de células de mamífero, siendo la determinación de esa expresión de uno o más biomarcadores tales predictiva o indicativa de si la muestra de tejido o de células será sensible o no a agentes inductores de apoptosis tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas anti-DR5. Los procedimientos y ensayos incluyen aquellos que examinan la expresión de biomarcadores tales como ciertas fucosiltransferasas, en particular fucosiltransferasa 3 (FUT3) y/o fucosiltransferasa 6 (FUT6), además de los antígenos Sialyl Lewis A y/o X.
[0098] Como se ha tratado anteriormente, hay algunas poblaciones de tipos de células humanas enfermas (tales como ciertas poblaciones de células cancerosas) que son resistentes a la inducción de apoptosis. Por tanto, se cree que los procedimientos y ensayos desvelados pueden proporcionar medios convenientes, eficientes y posiblemente rentables para obtener datos e información útil en la evaluación de terapias apropiadas o eficaces para tratar pacientes. Por ejemplo, en un paciente que ha sido diagnosticado con cáncer o una afección relacionada con la inmunidad podría realizarse una biopsia para obtener una muestra de tejido o de células, y la muestra podría examinarse a modo de diversos ensayos in vitro para determinar si las células del paciente serían sensibles o no a un agente terapéutico tal como Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte.
[0099] La invención proporciona procedimientos para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero (tal como una célula cancerosa) a Apo2L/TRAIL o un anticuerpo agonista de receptores de muerte. En los procedimientos se obtiene una muestra de tejido o de células de mamífero y se examina para la expresión de uno o más biomarcadores. Los procedimientos pueden realizarse en una variedad de formas de ensayo que incluyen ensayos que detectan la expresión de ARNm, ensayos enzimáticos que detectan la presencia de actividad enzimática y ensayos inmunohistoquímicos. La determinación de la expresión de biomarcadores tales en dichos tejidos o células será predictiva de que tales tejidos o células serán sensibles a la actividad inductora de apoptosis de Apo2L/TRAIL y/o anticuerpo de receptores de muerte. Los solicitantes encontraron sorprendentemente que la expresión de tales biomarcadores particulares establece una correlación con la sensibilidad de tales tejidos y células a agentes inductores de apoptosis tales como Apo2L/TRAIL y anticuerpos agonistas de receptores de muerte.
[0100] Como se trata más adelante, la expresión de diversos biomarcadores en una muestra puede analizarse por varias metodologías, muchas de las cuales se conocen en la técnica y son entendidas por el experto que incluyen, pero no se limitan a, análisis inmunohistoquímico y/o Western, ensayos cuantitativos basados en sangre (como, por ejemplo, ELISA en suero) (para examinar, por ejemplo, niveles de expresión de proteínas), ensayos enzimáticos de actividad bioquímica, hibridación in situ, análisis Northern y/o análisis por PCR de ARNm y análisis de Southern genómico (para examinar, por ejemplo, la deleción o amplificación de genes), además de uno cualquiera de la amplia variedad de ensayos que pueden realizarse por análisis de matrices de genes y/o tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de genes y productos génicos se encuentran, por ejemplo, en Ausubel y col. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (transferencia Northern), 4 (transferencia Southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (análisis por PCR).
[0101] Los protocolos más adelante que se refieren a la detección de biomarcadores particulares, tales como fucosiltransferasa 3 (FUT3), fucosiltransferasa 6 (FUT6), Sialyl Lewis A, y Sialyl Lewis X, en una muestra se proporcionan más adelante para fines ilustrativos.
[0102] Los procedimientos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o prueban la presencia de proteínas Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en una muestra de tejido o de células de mamífero. Puede emplearse una variedad de procedimientos para detectar proteínas relacionadas con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X e incluyen, por ejemplo, análisis inmunohistoquímico, inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA, citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) y similares. Por ejemplo, un procedimiento opcional de detección de la expresión de proteína relacionada con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en un tejido o muestra comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo de Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X, un fragmento reactivo con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X del mismo o una proteína recombinante que contiene una región de unión a antígeno de un anticuerpo de Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X; y luego detectar la unión de la proteína relacionada con Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en la muestra.
[0103] En realizaciones particulares de la invención, la expresión de proteínas de Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X en una muestra se examina usando protocolos de inmunohistoquímica y tinción. Se ha mostrado que la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido es un procedimiento fidedigno de evaluación o detección de la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica (“IHC”) utilizan un anticuerpo para la sonda y visualizan antígenos celulares in situ, generalmente por procedimientos cromogénicos o fluorescentes.
[0104] Para la preparación de muestras puede usarse una muestra de tejido o de células de un mamífero (normalmente un paciente humano). Ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas tales como células de cáncer de colon, mama, próstata, ovario, pulmón, estómago, páncreas, linfoma y leucemia. La muestra puede obtenerse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, extirpación quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una realización, la muestra se fija y se incorpora en parafina o similares.
[0105] La muestra de tejido puede fijarse (es decir, conservarse) por metodología convencional (véase, por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, 3ª edición (1960) Lee
G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, Nueva York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Un experto en la materia apreciará que la elección de un fijador se determina por el fin para el que la muestra va a teñirse histológicamente o analizarse de otro modo. Un experto en la materia también apreciará que la duración de la fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y el fijador usado. A modo de ejemplo, para fijar una muestra puede usarse formalina tamponada neutra, Bouin o paraformaldehído.
[0106] Generalmente, la muestra se fija primero y luego se deshidrata mediante una serie ascendente de alcoholes, se infiltra y se incorpora en parafina u otros medios de seccionamiento de manera que la muestra de tejido pueda seccionarse. Alternativamente, el tejido puede seccionarse y fijarse las secciones obtenidas. A modo de ejemplo, la muestra de tejido puede incorporarse y procesarse en parafina por metodología convencional (véase por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). Ejemplos de parafina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vez que se incorpora la muestra de tejido, la muestra puede seccionarse por un microtomo o similares (véase por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). A modo de ejemplo de este procedimiento, las secciones pueden oscilar de aproximadamente tres micrómetros a aproximadamente cinco micrómetros de espesor. Una vez seccionada, las secciones pueden unirse a portaobjetos por varios procedimientos convencionales. Ejemplos de adhesivos a portaobjetos incluyen, pero no se limitan a, silano, gelatina, poli-L-lisina y similares. A modo de ejemplo, las secciones incorporadas en parafina pueden unirse a portaobjetos positivamente cargados y/o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina.
[0107] Si la parafina se ha usado como material de incorporación, las secciones de tejido se desparafinan generalmente y se rehidratan en agua. Las secciones de tejido pueden desparafinarse por varias metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, pueden usarse xilenos y una serie gradualmente descendente de alcoholes (véase por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). Alternativamente pueden usarse agentes no orgánicos desparafinantes comercialmente disponibles tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).
[0108] Opcionalmente, posterior a la preparación de muestras, una sección de tejido puede analizarse usando IHC. La IHC puede realizarse en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica e/o hibridación por fluorescencia in situ. Están disponibles dos procedimientos generales de IHC; ensayos directos e indirectos. Según el primer ensayo, la unión de anticuerpo al antígeno diana (por ejemplo, Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X) se determina directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado tal como una marca fluorescente
o un anticuerpo primario marcado con enzima que puede visualizarse sin más interacción de anticuerpos. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario sin conjugar se une al antígeno y luego un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Si el anticuerpo secundario está conjugado con una marca enzimática, se añade un sustrato cromogénico o fluorogénico para proporcionar la visualización del antígeno. La amplificación de señales se produce debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopes en el anticuerpo primario.
[0109] Los anticuerpos primarios y/o secundarios usados para la inmunohistoquímica normalmente se marcarán con un resto detectable. Están disponibles numerosas marcas que pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías:
(a)
Radioisótopos tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, volúmenes 1 y 2, Coligen y col.; Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991), por ejemplo, y la radiactividad puede medirse usando recuento por centelleo.
(b)
Partículas de oro coloidal.
(c)
Marcas fluorescentes que incluyen, pero no se limitan a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio), Texas Red, rodamina, fluoresceína, dansilo, Lissamine, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina o fluoróforos comercialmente disponible tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de uno cualquiera o más de los anteriores. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo usando, por ejemplo, las técnicas desveladas en Current Protocols in Immunology, arriba. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.
(d)
Están disponibles diversas marcas enzima-sustrato y la patente de EE.UU. nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunas de éstas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y puede entonces emitir luz que puede medirse (usando, por ejemplo, un quimioluminómetro)
o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; la patente de EE.UU. nº 4.737.456), luciferina, 2,3dihidroftalazindionas, malato-deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido-oxidasas (por ejemplo, glucosaoxidasa, galactosa-oxidasa y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina-oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay en Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nueva York, 73:147-166 (1981).
[0110] Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i)
Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno-peroxidasa como sustrato, oxidando la hidrógenoperoxidasa un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'tetrametilbencidina (TMB));
(ii)
fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenilfosfato como sustrato cromogénico; y
(iii) β-D-galactosidasa (β-D-Gal) con sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-β-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidasa).
[0111] Están disponibles numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato para aquellos expertos en la materia. Para una revisión general de éstas véanse las patentes de EE.UU. nº 4.275.149 y 4.318.980. Algunas veces, la marca está indirectamente conjugada con el anticuerpo. El experto será consciente de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de marcas mencionadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une
5 selectivamente a avidina y, por tanto, la marca puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo, el anticuerpo está conjugado con un hapteno pequeño y uno de los diferentes tipos de marcas mencionados anteriormente está conjugado con un anticuerpo anti-hapteno. Por tanto, puede lograrse la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo.
[0112] Aparte de los procedimiento de preparación de muestras tratados anteriormente puede desearse otro tratamiento de la sección de tejido antes de, durante o tras la IHC, por ejemplo, pueden llevarse a cabo procedimientos de recuperación de epítopes tales como calentamiento de la muestra de tejido en tampón citrato (véase, por ejemplo, Leong y col. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).
15 [0113] Tras una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone a anticuerpo primario durante un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas de forma que el anticuerpo primario se una al antígeno de proteína diana en la muestra de tejido. Condiciones apropiadas para lograr esto pueden determinarse por experimentación rutinaria. El grado de unión del anticuerpo a la muestra se determina usando una cualquiera de las marcas detectables tratadas anteriormente. Preferentemente, la marca es una marca enzimática (por ejemplo, HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico tal como el cromógeno 3,3'-diaminobencidina. Preferentemente, la marca enzimática está conjugada con anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo de cabra anti-conejo).
25 [0114] Opcionalmente, los anticuerpos empleados en el análisis de IHC para detectar la expresión de Sialyl Lewis A o anti-Sialyl Lewis X son anticuerpos anti-Sialyl Lewis A y anti-Sialyl Lewis X, respectivamente. Opcionalmente, el anticuerpo anti-Sialyl Lewis A y anti-Sialyl Lewis X es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos Anti-Sialyl Lewis A y anti-Sialyl Lewis X están fácilmente disponibles en la materia, incluyendo a partir de diversas fuentes comerciales.
[0115] Por tanto, los especímenes preparados pueden montarse y cubrirse con cubreobjetos. Entonces se determina la evaluación del portaobjetos, por ejemplo, usando un microscopio, y pueden emplearse criterios de intensidad de tinción rutinariamente usados en la materia. Si el antígeno es la proteína Sialyl Lewis A y/o Sialyl Lewis X, los criterios de intensidad de tinción pueden evaluarse del siguiente modo:
35
TABLA 1
Patrón de tinción
Puntuación
No se observa tinción en las células
0
Se detecta tinción débil/apenas perceptible en más del 10% de las células.
1+
Se observa tinción de débil a moderada en más del 10% de las células.
2+
Se observa tinción de moderada a fuerte en más del 10% de las células.
3+
[0116] Normalmente, una puntuación del patrón de tinción de aproximadamente 2+ o superior en un ensayo de IHC tal se cree que es predictiva o indicativa de la sensibilidad de una célula de mamífero (tal como una célula cancerosa de mamífero) a Apo2L/TRAIL o un anticuerpo agonista de receptores de muerte.
[0117] En procedimientos alternativos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para dicho biomarcador en condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-biomarcador y luego detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador puede llevarse a cabo de varias formas tales como por
45 procedimientos de transferencia Western y ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, que incluye plasma o suero. Está disponible un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayo que usan una forma de ensayo tal, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653. Éstas incluyen tanto ensayos de un único sitio y de dos sitios como tipo “sándwich” de los tipos no competitivos, además de en los ensayos de unión competitivos tradicionales. Estos ensayos también incluyen la unión directa de un anticuerpo marcado a un biomarcador diana.
[0118] Los ensayos de tipo sándwich están entre los ensayos más útiles y comúnmente usados. Existen varias variaciones de la técnica de ensayos de tipo sándwich, y todas pretenden estar englobadas por la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo típico, un anticuerpo sin marcar se inmoviliza sobre un sustrato sólido, y la muestra que va a probarse se pone en contacto con la molécula unida. Entonces, después de un periodo de incubación adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un inmunocomplejo, se añade un segundo anticuerpo específico para el antígeno, marcado con una molécula indicadora que puede producir una señal detectable, y se incuba, dejando el tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo-anticuerpo marcado con antígeno. Cualquier material sin reaccionar se lava, y la presencia del antígeno se determina por la observación de una señal producida por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser tanto cualitativos, por simple observación de la señal visible, como pueden cuantificarse comparando con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de biomarcador.
[0119] Las variaciones en el ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo en el que tanto la muestra como el anticuerpo marcado se añaden simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son muy conocidas para aquellos expertos en la materia, que incluyen cualquier variación mínima como serán rápidamente evidentes. En un ensayo de tipo sándwich directo típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad por el biomarcador está tanto covalentemente como pasivamente unido a una superficie sólida. La superficie sólida es normalmente vidrio o un polímero, siendo los polímeros más comúnmente usados celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos de microplacas o cualquier otra superficie adecuada para realizar un inmunoensayo. Los procedimientos de unión son muy conocidos en la técnica y generalmente consisten en reticulación, unión covalente o adsorción física, el complejo polímeroanticuerpo se lava en la preparación para la muestra de prueba. Entonces se añade una alícuota de la muestra que va a probarse al complejo en fase sólida y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos o durante la noche si es más conveniente) y bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, de temperatura ambiente a 40ºC tal como entre 25ºC y 32ºC, ambos incluidos) para permitir la unión de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Tras el periodo de incubación, la fase sólida de la subunidad de anticuerpo se lava y se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una parte del biomarcador. El segundo anticuerpo está ligado a una molécula indicadora que se usa para indicar la unión del segundo anticuerpo al marcador molecular.
[0120] Un procedimiento alternativo implica inmovilizar los biomarcadores diana en la muestra y luego exponer la diana inmovilizada a un anticuerpo específico que puede o puede no marcarse con una molécula indicadora. Dependiendo de la cantidad de diana y la intensidad de la señal de la molécula indicadora, una diana unida puede ser detectable mediante marcado directo con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico para el primer anticuerpo, se expone al complejo diana-primer anticuerpo para formar un complejo terciario diana-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta por la señal emitida por la molécula indicadora. Por “molécula indicadora” como se usa en la presente memoria descriptiva se indica una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección del anticuerpo unido a antígeno. Las moléculas indicadoras más comúnmente usadas en este tipo de ensayo son tanto enzimas, fluoróforos como moléculas que contienes radionúclidos (es decir, radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes.
[0121] En el caso de un inmunoensayo de enzima, una enzima está conjugada con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, como será fácilmente reconocido, existe una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes que están fácilmente disponibles para el experto. Las enzimas comúnmente usadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa-oxidasa, glucosa-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que van a usarse con las enzimas específicas se eligen generalmente para la producción, tras la hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogénicos que dan un producto fluorescente en vez de los sustratos cromogénicos anotados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo marcado con enzima se añade al primer complejo anticuerpo-marcador molecular que permite que se una, y luego se lava el reactivo en exceso. Entonces, una disolución que contiene el sustrato apropiado se añade al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionará con la enzima ligada al segundo anticuerpo dando una señal visual cualitativa que puede cuantificarse adicionalmente, normalmente espectrofotométricamente, para dar una indicación de la cantidad de biomarcador que estaba presente en la muestra. Alternativamente, los compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Si se activa por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de la luz, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido de emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio óptico. Como en el EIA, se deja que el anticuerpo marcado fluorescente se una al primer complejo anticuerpo-marcador molecular. Después de eliminarse por lavado el reactivo sin unir, el complejo terciario restante se expone entonces a luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA están ambas muy bien establecidas en la materia. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas indicadores tales como moléculas de radioisótopos, quimioluminiscentes o bioluminiscentes.
[0122] Se contempla que las técnicas anteriormente descritas también puedan emplearse para detectar la expresión de polipéptidos de FUT3 o FUT 6.
[0123] Los procedimientos de la invención incluyen adicionalmente protocolos que examinan la presencia y/o expresión de ARNm tales como ARNm de FUT3 y/o FUT6 en una muestra de tejido o de células. Los procedimientos para la evaluación de ARNm en células son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementario (tales como hibridación in situ usando ribosondas de FUT3 y/o FUT6 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para FUT3 y/o FUT6, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).
[0124] Las muestras de tejido o de células de mamíferos pueden ensayarse convenientemente para, por ejemplo, ARNm de FUT3 y/o FUT6 usando transferencia Northern, puntual o análisis de PCR. Por ejemplo, los ensayos de RT-PCR tales como los ensayos de PCR cuantitativa son muy conocidos en la técnica. En una realización ilustrativa de la invención, un procedimiento para detectar un ARNm de FUT3 y/o FUT6 en una muestra biológica comprende producir ADNc de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc así producido usando un polinucleótido de FUT3 y/o FUT6 como cebadores de sentido directo y de sentido contrario para amplificar ADNc de FUT3 y/o FUT6 en él; y detectar la presencia del ADNc de FUT3 y/o FUT6 amplificado. Además, tales procedimientos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de ARNm de FUT3 y/o FUT6 en una muestra biológica (por ejemplo, examinando simultáneamente los niveles en la secuencia de ARNm de control comparativa de un gen “de mantenimiento” tal como un miembro de la familia de actina). Opcionalmente puede determinarse la secuencia del ADNc de FUT3 y/o FUT6 amplificado.
[0125] Las realizaciones de material de este aspecto de la invención incluyen cebadores de FUT3 y/o FUT6 y pares de cebadores que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que se hibridan selectivamente o específicamente con moléculas de ácidos nucleicos de la invención o con cualquier parte de los mismos. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico o enzima. Tales sondas y cebadores pueden usarse para detectar la presencia de polinucleótidos de FUT3 y/o FUT6 en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa proteínas de FUT3 y/o FUT6. Como entenderá el experto, pueden prepararse muchísimos cebadores y sondas diferentes basándose en las secuencias proporcionadas en este documento y usadas eficazmente para amplificar, clonar y/o determinar la presencia y/o niveles de ARNm de FUT3 y/o FUT6.
[0126] Procedimientos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan ARNm tales como FUT3 y FUT6 u otros ARNm de fucosiltransferasa, en una muestra de tejido o de células, por tecnologías de micromatrices. Usando micromatrices de ácido nucleico, muestras de ARNm de prueba y de control de muestras de tejido de prueba y de control se transcriben inversamente y se marcan para generar sondas de ADNc. Las sondas se hibridan entonces con una matriz de ácidos nucleicos inmovilizada sobre un soporte sólido. La matriz está configurada de forma que se conozca la secuencia y posición de cada miembro de la matriz. Por ejemplo, una selección de genes que tiene posibilidad de expresarse en ciertos estados de enfermedad puede disponerse en matriz sobre un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro de matriz particular indica que la muestra de la que se derivó la sonda expresa ese gen. El análisis de expresión génica diferencial de tejido de enfermedad puede proporcionar valiosa información. La tecnología de micromatrices utiliza técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de computación para evaluar la expresión del perfil de ARNm de miles de genes dentro de un único experimento (véase, por ejemplo, documento WO 01/75166 publicado el 11 de octubre de 2001; (véanse, por ejemplo, el documento US 5.700.637, la patente de EE.UU. 5.445.934 y la patente de EE.UU. 5.807.522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. y col., Nature Genetics 21(Suppl):1519 (1999) para una discusión de la fabricación de matrices). Las micromatrices de ADN son matrices en miniatura que contienen fragmentos génicos que tanto se sintetizan directamente sobre como se aplican en puntos sobre vidrio u otros sustratos. Miles de genes están normalmente representados en una única matriz. Un experimento de micromatrices típico implica las siguientes etapas: 1. preparación de diana fluorescentemente marcada de ARN aislado de la muestra, 2. hibridación de la diana marcada con la micromatriz, 3. lavado, tinción y barrido de la matriz,
4. análisis de la imagen barrida y 5. generación de perfiles de expresión génica. Actualmente se están usando dos tipos principales de micromatrices de ADN: matrices de oligonucleótidos (normalmente 25 a 70 meros) y matrices de expresión génica que contienen productos de PCR preparados a partir de ADNc. En la formación de una matriz, los oligonucleótidos pueden ser tanto prefabricados como aplicados por puntos a la superficie o sintetizarse directamente sobre la superficie (in situ).
[0127] El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de micromatrices comercialmente disponible que comprende matrices fabricadas mediante síntesis directa de oligonucleótidos sobre una superficie de vidrio. Matrices de sondas/genes: los oligonucleótidos, normalmente 25 meros, se sintetizan directamente sobre una oblea de vidrio mediante una combinación de fotolitografía basada en semiconductores y tecnologías químicas de síntesis en fase sólida. Cada matriz contiene hasta 400.000 oligonucleótidos diferentes y cada oligonucleótido está presente en millones de copias. Como las sondas de oligonucleótidos se sintetizan en localizaciones conocidas sobre la matriz, los patrones de hibridación y las intensidades de señal pueden interpretarse en términos de identidad génica y niveles relativos de expresión por el software Affymetrix Microarray Suite. Cada gen está representado sobre la matriz por una serie de sondas de oligonucleótidos diferentes. Cada par de sondas consiste en un oligonucleótido de apareamiento perfecto y un oligonucleótido de desapareamiento. La sonda de apareamiento perfecto tiene una secuencia exactamente complementaria al gen particular y, por tanto, mide la expresión del gen. La sonda de desapareamiento se diferencia de la sonda de apareamiento perfecto por una única sustitución de bases en la posición de bases central, perturbando la unión del transcrito del gen diana. Esto ayuda a determinar la hibridación de fondo y no específica que contribuye a la señal medida para el oligonucleótido de apareamiento perfecto. El software Microarray Suite resta las intensidades de hibridación de las sondas de desapareamiento de aquellas de las sondas de apareamiento perfecto para determinar el valor de intensidad absoluto o específico para cada conjunto de sondas. Las sondas se eligen basándose en la actual información de Genbank y otros repositorios de nucleótidos. Se cree que las secuencias reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Se usa un horno de hibridación de GeneChip (horno “asador”) para llevar a cabo la hibridación de hasta 64 matrices a la vez. La estación hidráulica realiza el lavado y la tinción de las matrices de sondas. Está completamente automatizada y contiene cuatro módulos, conteniendo cada módulo una matriz de sondas. Cada módulo está controlado independientemente por el software Microarray Suite usando protocolos hidráulicos previamente programados. El escáner es un escáner de fluorescencia láser confocal que mide la intensidad de fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a las matrices de sondas. El terminal de trabajo informático con el software Microarray Suite controla la estación hidráulica y el escáner. El software Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones hidráulicas usando protocolos de hibridación previamente programados, de lavado y de tinción para la matriz de sondas. El software adquiere y convierte los datos de intensidad de hibridación en una llamada de presencia/ausencia para cada gen usando algoritmos apropiados. Finalmente, el software detecta cambios en la expresión génica entre experimentos por análisis de comparación y formatea las salidas en archivos .txt que pueden usarse con otros programas informáticos para el análisis de datos adicional.
[0128] La expresión de un biomarcador seleccionado también puede evaluarse examinando la deleción génica o amplificación génica. La deleción o amplificación génica puede medirse por una cualquiera de una amplia variedad de protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo, por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ (por ejemplo, FISH) usando una sonda apropiadamente marcada, procedimientos citogenéticos o hibridación genómica comparativa (CGH) usando una sonda apropiadamente marcada. A modo de ejemplo, estos procedimientos pueden emplearse para detectar la deleción de la amplificación de los genes FUT3 y/o FUT6.
[0129] Adicionalmente puede examinarse el estado de metilación del biomarcador tal como el gen FUT3 y/o FUT6 en una muestra de tejido o de células. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de islas CpG en las regiones reguladoras de 5' del gen producida frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas puede producir expresión alterada de diversos genes. Son muy conocidos en la técnica una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, pueden utilizarse, en soluciones de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de islas CpG. Además, MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial de ADN por bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas sin metilar en uracilo), seguido de amplificación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a sin metilar. Los protocolos que implican la interferencia de metilación también pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, unidad 12, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995; De Marzo y col., Am. J. Patol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536); y Lethe y col., Int. J. Cancer 76 (6): 903-908 (1998).
[0130] La expresión de un biomarcador seleccionado en una muestra de tejido o de células también puede examinarse a modo de ensayos funcionales o basados en actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, pueden realizarse ensayos conocidos en la técnica para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o de células.
[0131] En los procedimientos de la presente invención se contempla que la muestra de tejido o de células también pueda examinarse para la expresión de Apo2L/TRAIL o receptores en la muestra que se unen a Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte. Como se ha descrito anteriormente y en la materia, actualmente se cree que Apo2L/TRAIL se une a al menos cinco receptores diferentes: DR4, DR5, DcR1, DcR2 y OPG. Usando procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en este documento, la expresión de Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2 y/o OPG puede detectarse al nivel de ARNm y al nivel de proteínas. Como se muestra en las Figuras 10 y 11, los datos sugieren que el examinar la muestra de tejido o de células para la expresión de receptores DcR1 y/o DcR2 puede facilitar adicionalmente información de si la muestra de tejido o de células será sensible o no a tanto Apo2L/TRAIL como a anticuerpo de receptores de muerte. A modo de ejemplo, las técnicas de IHC descritas anteriormente pueden emplearse para detectar la presencia de una o más moléculas tales en la muestra. Se contempla que en procedimientos en los que un tejido o muestra está siendo examinado no sólo para la presencia de un marcador de antígeno de FUT o Lewis, sino también para la presencia, por ejemplo, de DR4, DR5 o DcR1, puedan prepararse portaobjetos separados a partir del mismo tejido o muestra, y probar cada portaobjetos con un reactivo específico para cada biomarcador o receptor específico. Alternativamente, un único portaobjetos puede prepararse a partir de la muestra de tejido o de células, y los anticuerpos dirigidos contra cada biomarcador o receptor pueden usarse a propósito de un protocolo de tinción multicolor para permitir la visualización y detección de los biomarcadores o receptores respectivos.
[0132] Posterior a la determinación de que la muestra de tejido o de células expresa uno o más de los biomarcadores que indican que la muestra de tejido o de células será sensible a la actividad de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte, se contempla que una cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte pueda administrarse al mamífero para tratar un trastorno, tal como cáncer o trastorno relacionado con la inmunidad que está afectando al mamífero. El médico experto puede hacer el diagnóstico en mamíferos de las diversas afecciones patológicas descritas en este documento. Las técnicas de diagnóstico disponibles en la materia permiten, por ejemplo, el diagnóstico o la detección de cáncer o enfermedad relacionada con la inmunidad en un mamífero. Por ejemplo, los cánceres pueden identificarse mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, palpación, análisis de sangre, rayos X, RMN y similares. Las enfermedades relacionadas con la inmunidad también pueden identificarse fácilmente.
[0133] Apo2L/TRAIL o el anticuerpo de receptores de muerte puede administrarse según procedimientos conocidos tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalaciones. Opcionalmente, la administración puede realizarse mediante infusión por minibombas usando diversos dispositivos comercialmente disponibles.
[0134] Las dosificaciones eficaces y los programas para administrar Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte pueden determinarse empíricamente, y el hacer tales determinaciones está dentro de la habilidad en la materia. Pueden emplearse dosificaciones únicas o múltiples. Actualmente se cree que una dosificación o cantidad eficaz de Apo2L/TRAIL usada sola puede oscilar de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más por día. El escalado entre especies de dosificaciones puede realizarse de un modo conocido en la técnica, por ejemplo, como se desvela en Mordenti y col., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991).
[0135] Si se emplea administración in vivo de Apo2L/TRAIL, las cantidades de dosificación normal pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferentemente de aproximadamente 1 µg/kg/día a 10 mg/kg/día, que depende de la vía de administración. La orientación de las dosificaciones particulares y los procedimientos de administración se proporciona en la bibliografía; véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que las diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración que elige como diana, por ejemplo, un órgano o tejido puede necesitar la administración de un modo diferente al de otro órgano o tejido.
[0136] Se contempla que terapias todavía adicionales puedan emplearse en los procedimientos. Las una o varias terapias pueden incluir, pero no se limitan a, administración de radioterapia, citocina(s), agente(s) inhibidor(es) del crecimiento, agente(s) quimioterapéutico(s), agente(s) citotóxico(s), inhibidores de tirosina-cinasas, inhibidores de farnesil-transferasa ras, inhibidores de la angiogénesis e inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas que se conocen en la técnica y se definen adicionalmente con particularidad anteriormente. Se contempla que tales otras terapias puedan emplearse como un agente separado de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte. Además, terapias basadas en anticuerpos terapéuticos que eligen como diana antígenos tumorales tales como Rituxan™ o Herceptin™, además de anticuerpos antiangiogénicos tales como anti-VEGF.
[0137] La preparación y los programas de dosificación de agentes quimioterapéuticos pueden usarse según las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el médico experto. La preparación y los programas de dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo de receptores de muerte, o puede administrarse simultáneamente con el mismo.
[0138] También puede desearse administrar anticuerpos contra otros antígenos tales como anticuerpos que se unen a CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, factor endotelial vascular (VEGF), u otros miembros de la familia de TNFR (tales como OPG, TNFR1, TNFR2, GITR, Apo-3, TACI, BCMA, BR3). Alternativamente, o además, dos o más anticuerpos que se unen al mismo antígeno o a dos o más antígenos diferentes desvelados en este documento pueden coadministrarse al paciente. Algunas veces también puede ser beneficioso administrar una o más citocinas al paciente. Tras la administración pueden analizarse las células tratadas in vitro. Si ha habido tratamiento in vivo, un mamífero tratado puede monitorizarse de diversas formas muy conocidas para el médico experto. Por ejemplo, las células tumorales pueden examinarse patológicamente para ensayar necrosis o el suero puede analizarse para respuestas del sistema inmunitario.
[0139] Para uso en las aplicaciones descritas o sugeridas anteriormente pueden usarse kits o artículos de fabricación. Tales kits pueden comprender un medio de vehículo que está compartimentalizado para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios de recipiente tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada medio de recipiente uno de los elementos separados que van a usarse en el procedimiento. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender una sonda que está marcada detectablemente o que puede marcarse detectablemente. Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína FUT3 y/o FUT6 o un gen FUT3 y/o FUT6 o mensajero, respectivamente. Si el kit utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener recipientes que contienen nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana y/o un recipiente que comprende un medio indicador tal como una proteína de unión a biotina tal como avidina o estreptavidina unida a una molécula indicadora tal como una marca enzimática, fluorescente o de radioisótopo.
[0140] El kit comprenderá normalmente el recipiente descrito anteriormente y uno o varios recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario que incluyen tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar indicaciones para uso tanto in vivo como in vitro tales como aquellas descritas anteriormente.
[0141] Los kits pueden incluir varios otros componentes, por ejemplo, un recipiente, una etiqueta en dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; incluyendo la composición un anticuerpo primario que se une a una secuencia de polipéptidos de FUT3 y/o FUT6, indicando la etiqueta en dicho recipiente que la composición puede usarse para evaluar la presencia de proteínas FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para usar el anticuerpo de FUT3 y/o FUT6 para evaluar la presencia de proteínas FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero. El kit puede comprender adicionalmente un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido y aplicar anticuerpo y sonda a la misma sección de una muestra de tejido. El kit puede incluir tanto un anticuerpo primario como secundario, estando el anticuerpo secundario conjugado con una marca, por ejemplo, una marca enzimática.
[0142] Alternativamente, un kit puede comprender un recipiente, una etiqueta en dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; incluyendo la composición un polinucleótido que se hibrida con un complemento de polinucleótido de FUT3 y/o FUT6 bajo condiciones rigurosas, indicando la etiqueta en dicho recipiente que la composición puede usarse para evaluar la presencia de FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para usar el polinucleótido de FUT3 y/o FUT6 para evaluar la presencia de ARN
o ADN de FUT3 y/o FUT6 en al menos un tipo de célula de mamífero.
[0143] Otros componentes opcionales en el kit incluyen uno o más tampones (por ejemplo, tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que está químicamente alterado por una marca enzimática, disolución de recuperación de epítopes, muestras de control (controles positivos y/o negativos), portaobjeto(s) de control, etc.
EJEMPLOS
[0144] Adicionalmente se describen y se ilustran diversos aspectos de la invención a modo de los siguientes ejemplos, ninguno de ellos pretende limitar el alcance de la invención.
PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES:
Cultivo celular y líneas celulares
[0145] Las siguientes líneas de células de adenocarcinoma colorrectal humano: HCT-8, COLO 205, HCT 116, SW403, LoVo, SW948, Caco-2, COLO 201, SW1417, DLD-1, CX-1, HCT-15, LS 180, RKO, RKO-AS4S-1, SK-CO-1, SW480, SW620, SW837, CL-40, COLO-206F, COLO 320DM, COLO 320HSR, COLO-678, HT-29, KM12, LS1034, SW1116 se obtuvieron del depósito ATCC (Manassas, Virginia), DSMZ (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares), JCRB (banco japonés de recursos celulares) o ECACC (Colección europea de cultivos celulares) y se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mM y HEPES 10 mM.
Ensayos de citotoxicidad
[0146] Se usó el ensayo de MTT (ensayo de proliferación celular no radiactivo CellTiter 96® de Promega), que es un ensayo colorimétrico basado en la capacidad de células viables para reducir una sal de tetrazolio amarilla soluble (MTT) a cristales de formazano azules, para determinar la cantidad de células viables después del tratamiento con Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5. El ensayo de MTT se realizó mediante la adición de una disolución de colorante optimizada previamente mezclada a pocillos de cultivo de una placa de 96 pocillos que contenía diversas concentraciones (0 a 1000 ng/ml) de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5. Durante una incubación de 4 horas, las células vivas convierten el componente de tetrazolio de la disolución de colorante en un de producto de formazano. Entonces, la disolución de solubilización/parada se añadió a los pocillos de cultivo para solubilizar el producto de formazano, y la absorbancia se registró a 570 nm usando un lector de placas de 96 pocillos (SpectraMax). La lectura de absorbancia a 570 nm es directamente proporcional al número de células normalmente usadas en los ensayos de proliferación. Aunque la absorbancia máxima para el producto de formazano es 570 nm y las disoluciones puras aparecen azules, el color al final del ensayo puede no ser azul y depende de la cantidad de formazano presente con respecto a otros componentes (incluyendo suero, rojo fenol acidificado y MTT sin reducir) en el medio de cultivo.
[0147] Los números de células se optimizaron realizando una valoración de células para producir una señal de ensayo próxima al extremo superior del intervalo lineal del ensayo. Como diferentes tipos de células tienen diferentes niveles de actividad metabólica, esto se hizo para cada línea celular por separado. Para la mayoría de las células tumorales examinadas se usaron 5.000 células por pocillo a 20.000 células por pocillo.
[0148] Lo siguiente es una descripción etapa por etapa de los ensayos empleados:
1.
Las células usadas para el bioensayo fueron de cultivos madre.
2.
Determinación del número de células y viabilidad con azul de tripano, y suspensión de las células a un número final de 5.000 a 20.000 células por pocillo.
3.
Dispensión de 50 µl de la suspensión de células a placa de 96 pocillos.
4.
Incubación de las placas a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 durante la noche.
5.
Adición de 50 µl de medio de cultivo que contiene diversas concentraciones que oscilan de 0 a 1000 ng/ml de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5 a muestras de la placa de 96 pocillos. Los controles fueron 50 µl de medio de cultivo (sin Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5) y 100 µl de medio de cultivo (sin células). Cada experimento se realizó en un conjunto por triplicado de pocillos y en tres días independientes. El volumen total de los pocillos fue 100 µl/pocillo.
6.
Incubación de las placas a 37ºC durante 72 horas en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
7.
Adición de 15 µl de disolución de colorante a cada pocillo.
8.
Incubación de las placas a 37ºC durante hasta 4 horas en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
9.
Adición de 100 µl de la disolución de solubilización/parada a cada pocillo.
10.
Incubación de las placas durante la noche a 37ºC durante la noche.
11.
Registro de la absorbancia a 570 nm de longitud de onda usando un lector de placas de 96 pocillos. Se usó
una longitud de onda de referencia de 750 nm para reducir el fondo contribuido por los residuos de células, huellas y otra absorbancia no específica.
12.
El promedio de los valores de absorbancia para el control negativo se usó como valor blanco y se restó de todas las otras lecturas. El promedio de los valores de absorbancia para cada concentración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5 se dividió entre el promedio de los valores de absorbancia del control positivo (100% de células viables – sin tratar) para calcular la cantidad de células viables (en %).
13.
Se representó el porcentaje de células viables (eje Y) frente a una concentración de Apo2L/TRAIL o anticuerpo contra DR5 (eje X, escala logarítmica) y el valor de CI50 se determinó localizando el valor del eje X (ng/ml) correspondiente al 50% de células viables.
Protocolo de marcado de Affymetrix
[0149] Se tomó una lectura de DO 260/280 para todas las muestras, y las muestras se ejecutaron en el BioAnalyzer. Se usaron 5 µg de ARN total de alta calidad.
A. Síntesis de la primera cadena de ADNc:
1. Hibridación de cebadores
[0150]
DEPC-H2O x µl Mezclar con vórtex. Centrifugar rápido. ARN(5ug) y µl Incubar a 70ºC durante 10 minutos. Adición (dilución 1:4 de mezcla madre para 5 ug) 1 µl Centrifugar rápido y poner sobre hielo Cebador T7-(dT)24 1 µl Volumen 12 µl
2. Ajuste de temperatura
[0151]
5X-tampón de 1ª cadena de ADNc 4 µl Añadir 7 µl (de la mezcla que queda) a cada muestra. DTT0,1M 2 µl Mezclar con vórtex. Centrifugar rápido. Mezcla de dNTP 10 mM 1 µl Incubar a 42ºC durante 2 minutos. Volumen 7 µl
3. Síntesis de la primera cadena
[0152]
Añadir 1 µl de SSII RT a cada muestra. SSII RT 1 µl Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con vórtex ligeramente. Centrifugar rápido. Volumen total 20 µl Incubar a 42ºC durante 1 hora.
B. Síntesis de la segundo cadena de ADNc
[0153]
1.
Colocar la reacción de la primera cadena sobre hielo. Centrifugar brevemente para rebajar la condensación en los lados del tubo.
2.
Preparar la siguiente mezcla madre de la segunda cadena.
H2O tratada con DEPC 91 µl 5X-tampón de reacción de la 2ª cadena 30 µl Mezcla de dNTP 10 mM 3 µl 10 U/µl de ADN ligasa 1 µl
10 U/µl de ADN-polimerasa I 4 µl 2 U/µl de RNasa H 1 µl Volumen total 130 µl
3.
Añadir 130 µl de la mezcla madre de la segunda cadena a los 20 µl de ADNc de la primera cadena (volumen final = 150 µl)
4.
Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con vórtex ligeramente. Centrifugar rápido.
5.
Incubar a 16ºC durante 2 horas en un baño de agua de refrigeración.
6.
Añadir 2 µl [10 U] de ADN-polimerasa T4. Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con vórtex ligeramente. Centrifugar rápido.
7.
Incubar durante 5 minutos a 16ºC.
8.
Añadir 10 µl de EDTA 0,5 M. Agitar ligeramente con vórtex. Centrifugar rápido.
9.
Avanzar al procedimiento de purificación para ADNc -O-guardar a -20ºC para uso posterior.
[0154] Purificación del ADNc bicatenario (módulo de purificación de muestras GeneChip)
1.
Añadir luego 600 µl de tampón de unión a ADNc a 162 µl de la preparación de síntesis de ADNc bicatenario final. Mezclar con vórtex durante 3 segundos.
2.
Comprobar que el color de la mezcla es amarillo (similar al del tampón de unión a ADNc sin la reacción de síntesis de ADNc). Si el color de la mezcla es naranja o violeta, añadir 10 µl de acetato sódico 3 M, pH 5,0, y mezclar. El color de la mezcla virará a amarillo.
3.
Aplicar 500 µl de la muestra a la columna de centrifugación para la purificación del ADNc que se encuentra en un tubo de recogida de 2 ml y centrifugar durante 1 minuto a ≥ 8.000 x g (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo como residuo peligroso.
4.
Volver a cargar la columna de centrifugación con el resto de la mezcla (262 µl) y centrifugar como antes. Desechar el flujo continuo como residuo peligroso y desechar el tubo de recogida.
5.
Transferir la columna de centrifugación a un nuevo tubo de recogida de 2 ml (suministrado). Pipetear 750 µl de tampón de lavado de ADNc sobre la columna de centrifugación. Centrifugar durante 1 minuto a ≥ 8.000 x g (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo.
6.
Abrir la tapa de la columna de centrifugación y centrifugar durante 5 minutos a velocidad máxima (≤ 25.000 x g). Colocar las columnas en la centrífuga usando dos cubos. Posicionar las tapas sobre el cubo contiguo de manera que estén orientadas en la dirección opuesta a la rotación, es decir, si la rotación es en la dirección de las agujas del reloj, orientar las tapas en una dirección contraria a las agujas del reloj. Esto evita dañar las tapas. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
7.
Transferir la columna de centrifugación a un tubo de recogida de 1,5 ml. Pipetear 10 µl de tampón de elución de ADNc directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación. Garantizar que el tampón de elución de ADNc se dispensa directamente sobre la membrana. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 1 minuto a velocidad máx. (≤ 25.000 x g) para eluir.
Establecimiento y ejecución de la reacción de IVT
[0155] Enzo: kit de marcado del transcrito de ARN de alto rendimiento de Bioarray (nº de artículo 900182)
1.
Usar 10 µl del ADNc bicatenario purificado
2.
Preparar la siguiente mezcla madre de IVT: H2O destilada o desionizada 12 µl 10X tampón de reacción HY 4 µl 10X ribonucleótidos marcados con biotina 4 µl 10X DTT 4 µl 10X mezcla inhibidora de RNasa 4 µl 20X ARN-polimerasa T7 2 µl Volumen total: 30 µl
3.
Añadir 30 µl de la mezcla madre de IVT a 10 µl de ADNc bicatenario (volumen total = 40 µl)
4.
Mezclar pipeteando arriba y abajo -O-con vórtex ligeramente. Centrifugar rápido.
5.
Colocar inmediatamente el tubo en un baño de agua a 37ºC. Incubar durante 5 horas.
6.
Guardar a -20ºC si no se purifica inmediatamente el ARN.
[0156] Purificación de ARNc marcado con biotina (módulo de purificación de muestras GeneChip)
1.
Añadir 60 µl de H2O a la reacción de IVT y mezclar con vórtex durante 3 segundos.
2.
Añadir 350 µl de tampón de unión de ARNc de IVT a la muestra, mezclar con vórtex durante 3 segundos.
3.
Añadir 250 µl de etanol (96-100%) al lisado y mezclar bien pipeteando. No centrifugar.
4.
Aplicar la muestra (700 µl) a la columna de centrifugación para la purificación de ARNc de IVT colocando en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 xg (≥ 10.000 rpm).
5.
Pasar el eluato por la columna una vez más. Centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 xg (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo como residuo peligroso y desechar el tubo de recogida.
6.
Transferir la columna de centrifugación a un nuevo tubo de recogida de 2 ml (suministrado).
7.
Añadir 500 µl de tampón de lavado de ARNc de IVT y centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 x g (≥
10.000 rpm) para lavar. Desechar el flujo continuo.
8.
Pipetear 500 µl (v/v) de etanol al 80% sobre la columna de centrifugación y centrifugar durante 15 segundos a ≥ 8.000 xg (≥ 10.000 rpm). Desechar el flujo continuo.
9.
Abrir la tapa de la columna de centrifugación y centrifugar durante 5 minutos a la velocidad máx. (≤
25.000 x g). Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
10.
Transferir la columna de centrifugación a un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml.
11.
Pipetear 11 µl de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación. Dejar reposar durante 1 minuto. Centrifugar durante 1 minuto a la velocidad máxima (≤ 25.000 x g) para eluir.
12.
Pipetear 10 µl de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación. Dejar reposar durante 1 minuto. Centrifugar durante 1 minuto a la velocidad máxima (≤ 25.000 x g) para eluir.
[0157] Cuantificación del ARNc (producto de IVT)
[0158] Usar análisis espectrofotométrico para determinar el rendimiento de ARN. Aplicar el convenio de que 1 DO a 260 nm es igual a 40 µg/ml de ARN.
[0159] Comprobar la DO a 260 nm y 280 nm para determinar la concentración y la pureza de la muestra.
[0160] Mantener la relación A260/A280 próxima a 2,0 para ARN puro (relaciones entre 1,9, y 2,1 son aceptables).
[0161] Para la cuantificación del ARNc cuando se usa ARN total como material de partida debe calcularse un rendimiento de ARNc ajustado para reflejar el remanente de ARN total marcado. Usando un cálculo estimado del 100% de remanente, usar la siguiente fórmula para determinar el rendimiento de ARNc ajustado:
rendimiento de ARNc ajustado = ARNm – (ARNi total) (y)
ARNm = cantidad de ARNc medido después de IVT (µg) ARNi total = cantidad de partida de ARN total (µg) y = fracción de reacción de ADNc usada en IVT Fragmentar el ARNc para la preparación diana
[0162] Para la fragmentación, usar la concentración de ARNc ajustada.
1.
Añadir 2 µl de 5x tampón de fragmentación para cada 8 µl de ARN más H2O.
20 µg de ARNc 1 a 32 µl 5X tampón de fragmentación 8 µl Agua libre de RNasa a 40 µl Volumen total: 40 µl
2.
Incubar a 94ºC durante 30 minutos. Poner inmediatamente sobre hielo tras la incubación.
[0163] Preparar la diana de hibridación 5
1.
Calentar 20X controles de hibridación eucariotas y el oligonucleótido B2 durante 5 minutos a 65ºC. Kit de control de hibridación eucariota GeneChip de Affymetrix, art. nº 900362 (para 150 reacciones)
2.
Remover ligeramente con vórtex, centrifugar.
3.
Mezcla madre (suponiendo que la concentración de ARNc fragmentado es 0,5 µg/µl):
10 Matriz patrón (µl) Conc. final ARNc fragmentado 15 µg 30 0,05 µg/µl Oligonucleótido B2 (3 nM) 5 50 pM 20x adición de control 15 1,5, 5, 25, 100 pM (Bio B, C, D, Cre) ADN de esperma de arenque 3 0,1 mg/ml BSA acetilada 3 0,5 mg/ml AND de cot-1 humano (1 mg/ml) 30 0,1 mg/ml 2X tampón de hibridación MES 150 1X H2O 64 Volumen final 300
4.
Separar 270 µl de mezcla madre en alícuotas en tubos y añadir 30 µl de ARNc fragmentado a cada uno. Esta es la mezcla de hibridación.
5.
Equilibrar las matrices de sondas hasta temperatura ambiente inmediatamente antes de uso.
15 6. Llenar la matriz de sondas con 1x tampón de hibridación MES e incubar en el horno asador durante 10 minutos a 45ºC, 60 rpm.
7.
Calentar la mezcla de hibridación en un baño de agua a 99ºC durante 5 minutos.
8.
Transferir la mezcla de hibridación a un baño de agua de 45ºC durante 5 minutos.
9.
Centrifugar la mezcla de hibridación durante 5 minutos a la máxima velocidad. 20 10. Eliminar 1x tampón de hibridación MES de las matrices de sondas.
11.
Llenar la matriz de sondas con los 200 µl superiores de la mezcla de hibridación.
12.
Cerrar el tapón con Tough-Spots.
13.
Hibridar la matriz de sondas a 45ºC, 60 rpm, durante 19 horas.
14.
Lavar, teñir y cribar la matriz de sondas según los protocolos de Affymetrix. 25
Materiales de Affymetrix
[0164]
30 Artículo Proveedor Nº de catálogo Cebador T7-(dT)24 Biosearch Technologies Por encargo Adiciones de control en la empresa -Superscript II/5X tampón de la primera cadena/DTT 0,1 M Invitrogen 18064-014 5X tampón de la segunda cadena Invitrogen 10812-014
35 dNTP 10 mM Invitrogen 18427-088 10 U/ul de ADN-ligasa de E. coli Invitrogen 18052-019 10 U/ul de ADN-polimerasa I de E. coli Invitrogen 18010-025 2 U/ul de RNasa H Invitrogen 18021-071. 10 U/ul de ADN-polimerasa T4 Invitrogen 18005-025
40 EDTA 0,5 M Sigma E-7889 Kit de marcado de transcritos de ARN de alto rendimiento ENZO Affymetrix o ENZO 900182 (ENZO) Módulo de purificación de muestras GeneChip Affymetrix 900371 Albúmina de suero bovino acetilada Invitrogen 15561-020 IgG de cabra – calidad de reactivo Sigma I-5256
45 Anticuerpo anti-estreptavidina (cabra), biotinilado Vector Labs BA-0500 R-Ficoeritrina-estreptavidina Molecular Probes S-866 20X SSPE BioWhittaker 51214 Kit de control eucariota Affymetrix 900362 Condiciones de incubación:
Agua, calidad para biología molecular
Ambion 9934
ADN de Cot-1 humano
Roche 1-581-074
NaCl 5 M libre de RNasa, libre de ADNsa
Ambion 9760
Antiespumante 0-30
Sigma A-8082
Tween-20 al 10% 5
Pierce Chemical 28320
Ácido monohidratado libre de MES
Sigma M5287
Sal sódica de MES
Sigma M3885
Sal disódica de EDTA, disolución 0,5 M
Sigma E7889
Tough Spots,
Label Dots USA Scientific 9902
Horno de hibridación GeneChip 640 10
Affymetrix 800139
Escáner GeneChip 3000 con terminal de trabajo
Affymetrix 00-0074
Estación hidráulica
Affymetrix 00-0081
Cargador automático con lector de código de barras externo
Affymetrix 00-0129
15 PCR cuantitativa
Síntesis de ADNc:
[0165]
20
Componente
Volumen (ul)
10X tampón RT
10
25X mezcla de dNTP
4
10X cebadores al azar
10
MultiScribe RT
5
(50 U/ul)
H2O libre de RNasa
21
ARN (100 ng)
50
Volumen final
100
[0166]
25 25°durante 10 minutos 37°durante 2 horas
[0167] Reacción TaqMan usando el detector de la secuenciación ABI Prism 7700: 30
Componente
Volumen (ul)
PCR TaqMan Universal
25
Mezcla madre (2X)
Sonda TaqMan (20X)
2,5
(Assays-on-Demand™)
ADNc (100ng)
2
H2O
20,5
Volumen final
50
Condiciones de ciclado térmico:
[0168]
35 95º durante 10 minutos 40 ciclos: 95º durante 15 segundos 60º durante 1 minuto
•
Sondas TaqMan: Assays-on-Demand™ (sondas TaqMan® MGB, FAM™ marcada con colorante)
•
Amplificación del control endógeno, GAPDH (concentración de sonda 100 nM, concentraciones de cebador directo e inverso 200 nM), se realizó para normalizar la cantidad de ARN de muestra (ADNc) añadido a
cada reacción.
[0169] La cuantificación relativa se realizó usando el procedimiento de la curva patrón. Para la cuantificación normalizada a un control endógeno, las curvas patrón se prepararon para tanto la diana como la referencia
5 endógena. Para cada muestra experimental, la cantidad de diana y de referencia endógena se determinó a partir de la curva patrón apropiada. Entonces, la cantidad de diana se dividió entre la cantidad de referencia endógena para obtener un valor de diana normalizado. Una de las muestras experimentales sirvió de calibrador, o 1x muestra. Cada uno de los vectores diana normalizados se dividió entonces entre el valor de la diana normalizada con el calibrador para generar los niveles de expresión relativos.
FACS/Citometría de flujo (protocolo de tinción del 2º anticuerpo):
[0170] Todas las incubaciones y centrifugaciones se realizaron a 4ºC y los tubos se mantuvieron sobre hielo mientras que no estuvieron en la nevera.
15 1. Determinar la forma del tubo identificando las líneas celulares que van a usarse, los anticuerpos de interés, y cualquier condición especial o tratamiento.
a.
Controles.
i. Sin teñir, 2º anticuerpo, y compensación si los fluorócromos tienen espectros de emisión que se solapan.
b.
Ejemplo:
Tubo
Línea celular Tiempo (min) 1º anticuerpo 2º anticuerpo
1
por ejemplo, COLO-205 0 - -
2
por ejemplo, COLO-205 0 - Anti-FITC de ratón
3
por ejemplo, COLO-205 0 Anti-Sialyl Lewis A Anti-FITC de ratón
4
por ejemplo, COLO-205 0 Anti-CD15s (Sialyl Lewis X) Anti-FITC de ratón
2. Etiquetar los tubos de FACS. 25
a. BD Falcon 12 x 75 mm redondos de poliestireno. Nº de catálogo: 352052
3. Preparar las células para la tinción.
a.
Tratar las células adherentes con Accutase o tripsina.
i. Innovative Cell Technologies Inc, Accutase.
ii. Gibco, Tripsina. Nº de catálogo: 25200-106.
b.
Proceder con el resto de las etapas si las células están en suspensión.
35 4. Separar en alícuotas las células en tubo cónico de 15 ml o 50 ml.
5.
Centrifugar las células durante 5 min, 1200 rpm, 4ºC.
6.
Aspirar el sobrenadante.
7.
Resuspender las células en 5 ml de tampón de FACS.
8.
Centrifugar las células durante 5 min, 1200 rpm, 4ºC.
9.
Aspirar el sobrenadante.
10.
Resuspender las células en tampón de bloqueo.
a. Determinar el volumen de tampón de bloqueo necesario:
i.
Número de tubos por línea celular/tratamiento X 100 µl de tampón de bloqueo por tubo. 45 ii. Se desean 1x106 células por 100 µl de tampón de bloqueo.
11. Separar en alícuotas 100 µl de las células en el tubo apropiado.
a. Basándose en la forma de tubo predeterminada.
12. Añadir el 1º anticuerpo al tubo apropiado.
a.
Lewis A:
i. Usar 10 µl de 0,2 µg/µl de mezcla madre por tubo.
1. La concentración final es 2 µg.
ii. Chemicon: anti-Sialyl Lewis A. Nº de catálogo: MAB2095.
b.
Lewis X:
i. Usar 5 µl de 0,5 µg/µl de mezcla madre por tubo.
1. La concentración final es 2,5µg.
ii. BD Pharmingen: CD15 (Sialyl Lewis X). Nº de catálogo: 551344.
13.
Incubar durante 30 min a 4ºC.
14.
Añadir 1 ml de tampón de FACS a cada tubo.
15.
Centrifugar las células durante 5 min, 1200 rpm, 4ºC.
16.
Aspirar el sobrenadante
17.
Sacudir cuidadosamente los tubos para sacar el sedimento.
a. Ejecución de “sacudida” de tubos a través de la superficie de la gradilla de tubos de 12 x 75 mm.
18.
Repetir las etapas 14-17.
19.
Añadir 100 µl de tampón de bloqueo a cada tubo.
20.
Añadir el 2º anticuerpo al tubo apropiado.
a.
Usar 10 µl por tubo.
b.
Jackson, Cabra anti-FITC de ratón. Nº de catálogo: 115-096-068.
21.
Incubar durante 30 min a 4ºC.
22.
Repetir las etapas 14-17 dos veces.
23.
Resuspender las células en tampón de FACS/PI.
a.
Determinar el volumen necesario:
i. Se necesita 1 ml de disolución por tubo.
ii. PI= 1 µl por 1 ml de tampón.
b.
Molecular Probes, yoduro de propidio. Nº de catálogo: P3566.
24.Colocar los tubos en un cubo con hielo o gradilla de tubos con hielo. 25.Cubrir con lámina de aluminio y llevar al laboratorio de FACS para que un operario cualificado adquiera y analice las muestras.
[0171] 5% de tampón de bloqueo:
1.
SBF al 5% de volumen total.
2.
Tampón de FACS.
3.
Filtrar la disolución mediante un filtro de 0,2 µm.
[0172] Tampón de FACS:
1.
980 ml de PBS.
2.
8 ml de EDTA 0,25M.
3.
20 ml de SBF.
4.
Filtrar la disolución mediante un filtro de 0,2 µm.
Procedimiento inmunohistoquímico: Sialyl Lewis A
[0173]
Anticuerpo: Sialyl Lewis A AB-1
Clon: 121SLE Proveedor: NeoMarkers Nº de catálogo MS-279-P Especie de Ig: Ratón
Procedimiento de IHC: Parafina Pretratamiento: Ninguno Manipulación de IHC: Teñidor automático Isotipo: IgM de ratón Especie del procedimiento: Humana Concentración de IgG: 200 ug/ml
Procedimiento normal:
[0174]
Desparafinar e hidratar en agua destilada. Bloquear biotina endógena con el sistema de bloqueo de avidina-biotina de Vector. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Bloquear con suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a TA. Incubar las secciones con el anticuerpo monoclonal de ratón Sialyl Lewis A diluido a 5 ug/ml con suero de caballo normal al 10% durante 60 minutos a TA. Usar un isotipo de ratón IgM diluido a 5 ug/ml en suero de caballo normal al 10% para el control negativo. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con anticuerpo de caballo biotinilado anti-ratón; diluido 1:200 en suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a TA. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con el sistema diluido Vector ABC Elite durante 30 minutos a TA. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con DAB potenciado con metal de Pierce durante 5 minutos Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Contrateñir con hematoxilina de Mayers durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Azular con hematoxilina con reactivo de azulado de Richard-Allan durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 2 minutos. Deshidratar, purificar y montar en medios de montaje sintéticos.
Procedimiento inmunohistoquímico: Sialyl Lewis X
[0175]
Anticuerpo: anti-Sialyl Lewis X de ratón
Clon: KM93 Proveedor: Chemicon Nº de catálogo. MAB2096 Especie de Ig: Ratón Procedimiento de IHC: Parafina Pretratamiento: DAKO Target Retrieval Manipulación de IHC: Teñidor automático Isotipo: IgM de ratón Especie del procedimiento: Humana Concentración de IgG: 100 µg/ml
Procedimiento normal:
[0176]
Desparafinar e hidratar en agua destilada. Extinguir la actividad de peroxidasa endógena con disolución de bloqueo KPL – concentrado diluido 1:10 en dH2O, TA durante 4 minutos. Aclarar en agua destilada durante 5 minutos. Incubar en DAKO Target Retrieval (S1700) precalentado a 99 grados durante 20 minutos en un baño de agua hirviendo. Sacar del baño hirviendo y dejar enfriar durante 20 minutos. Bloquear biotina endógena con el sistema de bloqueo de avidina-biotina de Vector.
Bloquear con suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a TA. Incubar las secciones con el anticuerpo monoclonal de ratón Sialyl Lewis X diluido a 5 ug/ml con suero de caballo normal al 10% durante 60 minutos a TA. Usar un isotipo de ratón IgM diluido a 5 µg/ml en suero de caballo normal al 10% para el control negativo. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con anticuerpo de caballo biotinilado anti-ratón de Vector; diluido 1:200 en suero de caballo normal al 10% durante 30 minutos a TA. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con el sistema diluido Vector ABC Elite durante 30 minutos a TA. Aclarar con TBS: 2 cambios, 5 minutos cada vez. Incubar las secciones con DAB potenciado con metal de Pierce durante 5 minutos Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Contrateñir con hematoxilina de Mayers durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 5 minutos. Azular con hematoxilina con reactivo de azulado de Richard-Allan durante 1 minuto. Aclarar en agua de grifo corriente durante 2 minutos. Deshidratar, purificar y montar en medios de montaje sintéticos.
Resultados experimentales:
[0177]
Los experimentos se realizaron usando los procedimientos y materiales descritos anteriormente. Los resultados de estos experimentos se ilustran en las Figuras 6-13, como se trata más adelante. La Figura 6 proporciona un cuadro resumen de los datos obtenidos en el análisis de 28 líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para sensibilidad o resistencia a actividad apoptósica de Apo2L (+ suero bovino fetal al 0,5% “SBF” o SBF al 10%) o anticuerpo monoclonal “mab” contra DR5, reticulado “XL” o no reticulado, + suero bovino fetal al 0,5% “SBF” o SBF al 10%) y expresión de FUT 3, FUT 6, Sialyl Lewis A y Sialyl Lewis X. La Figura 7 proporciona una comparación de la sensibilidad de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para el anticuerpo contra DR5 y la expresión de FUT 3, como se mide por PCR cuantitativa. La Figura 8 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para sensibilidad o resistencia al anticuerpo contra DR5 (más reticulante) y expresión de Sialyl Lewis X o A, como se determina por FACS. La Figura 9A muestra una prueba de correlación de rangos de Spearman que analiza la sensibilidad o la resistencia de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la correlación con la expresión de FUT3. La Figura 9B muestra los resultados de una prueba exacta de Fisher que analiza la sensibilidad (“sens”) o resistencia (“res”) de las diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal y la significancia estadística entre la expresión de FUT 3 y Sialyl Lewis A/X y la sensibilidad de las líneas celulares respectivas a la actividad apoptósica del anticuerpo contra DR5. La Figura 10 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (como se determina por PCR cuantitativa) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. La Figura 11 proporciona una comparación de diversas líneas de células de cáncer de colon o colorrectal para la expresión de receptores DcR1 o DcR2 (como se determina por FACS) y el estado (sensible o resistente) de ciertas líneas celulares a Apo2L o anticuerpo contra DR5. La Figura 12 muestra tinción inmunohistoquímica para Sialyl Lewis A y X en cuatro líneas de células de cáncer colorrectal, CaCo 2 (Colo2), SW 1417, DLD-1 y Colo 205, y su correlación con la expresión de Sialyl Lewis A y X como se mide por FACS y su correlación con la sensibilidad a Apo2L/TRAIL. Las líneas de células de cáncer colorrectal Colo 2 y SW1417 no muestran tinción y muestran una débil tinción, respectivamente, o los antígenos Sialyl Lewis son negativos y débilmente positivos, respectivamente, por FACS y son resistentes a Apo2L/TRAIL. Las células de cáncer colorrectal DLD-1 y Colo 205 muestran tinción moderada y fuerte, respectivamente, para antígenos Sialyl Lewis, son moderadas y fuertemente positivas, respectivamente, por FACS y son sensibles a Apo2L/TRAIL.
La Figura 13 muestra un resumen de experimentos de IHC que demuestran la expresión de Sialyl Lewis A y X en muestras de tejido de mucosa de colon normal, tejido de hígado normal, cáncer de colon primario y metástasis de cáncer de colon. Las muestras de tejido de colon normal y cáncer de colon primario dispuestas en matriz en una micromatriz de tejido se probaron en el experimento de IHC, mientras que las muestras de tejido del hígado normal y cáncer de colon metastásico estuvieron sobre portaobjetos de vidrio individuales. La prevalencia de expresión de Sialyl Lewis A y X y la intensidad de tinción inmunohistoquímica aumenta de tejido de colon normal a cáncer de colon primario a cáncer de colon metastásico. Las células de hígado normal no se tiñeron ni para Sialyl Lewis A ni X.

Claims (30)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un procedimiento para predecir la sensibilidad de una muestra de tejido o de células de mamífero a un anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5, procedimiento que comprende las etapas de:
    examinar la muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X, en el que determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control es predictiva de que dicha muestra de tejido o de células es sensible a actividad inductora de apoptosis de uno o más anticuerpos de receptores de muerte.
  2. 2.
    Un procedimiento para inducir apoptosis en una muestra de tejido o de células de mamífero, procedimiento que comprende las etapas de:
    examinar una muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X, y tras determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control, exponer dicha muestra de tejido o de células a una cantidad eficaz de un anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para así inducir apoptosis en una muestra de tejido o de células de mamífero.
  3. 3.
    El procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6.
  4. 4.
    El procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina por inmunohistoquímica para detectar la expresión del (de los) antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X.
  5. 5.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además la etapa de examinar la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2 en dicha muestra de tejido o de células.
  6. 6.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha muestra de tejido o de células comprende tejido o células de cáncer.
  7. 7.
    El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dichas células cancerosas son células o tejido de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal o pancreático.
  8. 8.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es anticuerpo monoclonal contra DR5.
  9. 9.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano que se une a DR5.
  10. 10.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado que se une a DR5.
  11. 11.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo contra DR5 que se une a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1-411 de la Figura 3A (SEQ ID NO:5).
  12. 12.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es anticuerpo monoclonal contra DR4.
  13. 13.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano que se une a DR4.
  14. 14.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado que se une a DR4.
  15. 15.
    El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo contra DR4 que se une a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1-468 de la Figura 2 (SEQ ID NO:3).
  16. 16.
    Un anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con la inmunidad o cáncer en un mamífero, en el que el procedimiento de tratamiento comprende:
    examinar una muestra de tejido o de células de mamífero para detectar la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo de fucosiltransferasa 3, fucosiltransferasa 6, antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X, y tras determinar que la expresión de uno o más de los biomarcadores es superior a la observada para una muestra de tejido o de células de control, administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para así inducir apoptosis y tratar el trastorno relacionado con la inmunidad o cáncer.
  17. 17.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según la reivindicación 16, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina detectando la expresión de ARNm de fucosiltransferasa 3 o fucosiltransferasa 6.
  18. 18.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según la reivindicación 16, en el que dicha expresión de uno o más biomarcadores se examina por inmunohistoquímica para detectar la expresión del (de los) antígeno(s) Sialyl Lewis A y/o X.
  19. 19.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 que comprende además la etapa de examinar la expresión de receptores DR4, DR5, DcR1 o DcR2 en dicho tejido o célula.
  20. 20.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que dicha muestra de tejido o de células comprende tejido o células de cáncer.
  21. 21.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según la reivindicación 20, en el que dichas células cancerosas o tejido canceroso comprende células o tejido de cáncer de colon, colorrectal, gastrointestinal o pancreático.
  22. 22.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que un agente quimioterapéutico o radioterapia también se administra a dicho mamífero.
  23. 23.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que una citocina, agente citotóxico o inhibidor del crecimiento también se administra a dicho mamífero.
  24. 24.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es anticuerpo monoclonal contra DR5.
  25. 25.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano que se une a DR5.
  26. 26.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado que se une a DR5.
  27. 27.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo contra DR5 que se une a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1-411 de la Figura 3A (SEQ ID
    NO: 5)
  28. 28.
    El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de
    tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es anticuerpo 5 monoclonal contra DR4.
  29. 29. El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano que se une a DR4.
    10
  30. 30. El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado que se une a DR4.
    15 31. El anticuerpo agonista de DR4 o anticuerpo agonista de DR5 para uso en un procedimiento de tratamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo contra DR4 que se une a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1-468 de la Figura 2 (SEQ ID NO:3).
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Families Citing this family (517)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9060770B2 (en) 2003-05-20 2015-06-23 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-driven surgical instrument with E-beam driver
US20070084897A1 (en) 2003-05-20 2007-04-19 Shelton Frederick E Iv Articulating surgical stapling instrument incorporating a two-piece e-beam firing mechanism
SG151294A1 (en) 2004-03-23 2009-04-30 Biogen Idec Inc Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
US11998198B2 (en) 2004-07-28 2024-06-04 Cilag Gmbh International Surgical stapling instrument incorporating a two-piece E-beam firing mechanism
US9072535B2 (en) 2011-05-27 2015-07-07 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling instruments with rotatable staple deployment arrangements
US11890012B2 (en) 2004-07-28 2024-02-06 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising cartridge body and attached support
US8215531B2 (en) 2004-07-28 2012-07-10 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling instrument having a medical substance dispenser
US11484312B2 (en) 2005-08-31 2022-11-01 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a staple driver arrangement
US11246590B2 (en) 2005-08-31 2022-02-15 Cilag Gmbh International Staple cartridge including staple drivers having different unfired heights
US10159482B2 (en) 2005-08-31 2018-12-25 Ethicon Llc Fastener cartridge assembly comprising a fixed anvil and different staple heights
US9237891B2 (en) 2005-08-31 2016-01-19 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-controlled surgical stapling devices that produce formed staples having different lengths
US7669746B2 (en) 2005-08-31 2010-03-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Staple cartridges for forming staples having differing formed staple heights
US20070194079A1 (en) 2005-08-31 2007-08-23 Hueil Joseph C Surgical stapling device with staple drivers of different height
US7934630B2 (en) 2005-08-31 2011-05-03 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Staple cartridges for forming staples having differing formed staple heights
US20070106317A1 (en) 2005-11-09 2007-05-10 Shelton Frederick E Iv Hydraulically and electrically actuated articulation joints for surgical instruments
US8820603B2 (en) 2006-01-31 2014-09-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Accessing data stored in a memory of a surgical instrument
US7753904B2 (en) 2006-01-31 2010-07-13 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Endoscopic surgical instrument with a handle that can articulate with respect to the shaft
US11793518B2 (en) 2006-01-31 2023-10-24 Cilag Gmbh International Powered surgical instruments with firing system lockout arrangements
US20110290856A1 (en) 2006-01-31 2011-12-01 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-controlled surgical instrument with force-feedback capabilities
US11278279B2 (en) 2006-01-31 2022-03-22 Cilag Gmbh International Surgical instrument assembly
US11224427B2 (en) 2006-01-31 2022-01-18 Cilag Gmbh International Surgical stapling system including a console and retraction assembly
US20110024477A1 (en) 2009-02-06 2011-02-03 Hall Steven G Driven Surgical Stapler Improvements
US9861359B2 (en) 2006-01-31 2018-01-09 Ethicon Llc Powered surgical instruments with firing system lockout arrangements
US8708213B2 (en) 2006-01-31 2014-04-29 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical instrument having a feedback system
US8186555B2 (en) 2006-01-31 2012-05-29 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Motor-driven surgical cutting and fastening instrument with mechanical closure system
US7845537B2 (en) 2006-01-31 2010-12-07 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical instrument having recording capabilities
US20110006101A1 (en) 2009-02-06 2011-01-13 EthiconEndo-Surgery, Inc. Motor driven surgical fastener device with cutting member lockout arrangements
US20120292367A1 (en) 2006-01-31 2012-11-22 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-controlled end effector
US8992422B2 (en) 2006-03-23 2015-03-31 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-controlled endoscopic accessory channel
US20070225562A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Articulating endoscopic accessory channel
US8322455B2 (en) 2006-06-27 2012-12-04 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Manually driven surgical cutting and fastening instrument
US10568652B2 (en) 2006-09-29 2020-02-25 Ethicon Llc Surgical staples having attached drivers of different heights and stapling instruments for deploying the same
US7665647B2 (en) 2006-09-29 2010-02-23 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical cutting and stapling device with closure apparatus for limiting maximum tissue compression force
US10130359B2 (en) 2006-09-29 2018-11-20 Ethicon Llc Method for forming a staple
US11980366B2 (en) 2006-10-03 2024-05-14 Cilag Gmbh International Surgical instrument
CA2666484A1 (en) * 2006-10-23 2008-06-19 The Uab Research Foundation Biomarkers for cancer sensitivity and uses thereof
US8632535B2 (en) 2007-01-10 2014-01-21 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Interlock and surgical instrument including same
US8652120B2 (en) 2007-01-10 2014-02-18 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical instrument with wireless communication between control unit and sensor transponders
US11291441B2 (en) 2007-01-10 2022-04-05 Cilag Gmbh International Surgical instrument with wireless communication between control unit and remote sensor
US8684253B2 (en) 2007-01-10 2014-04-01 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical instrument with wireless communication between a control unit of a robotic system and remote sensor
US11039836B2 (en) 2007-01-11 2021-06-22 Cilag Gmbh International Staple cartridge for use with a surgical stapling instrument
US20080169333A1 (en) 2007-01-11 2008-07-17 Shelton Frederick E Surgical stapler end effector with tapered distal end
SI2129396T1 (sl) * 2007-02-16 2013-12-31 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Protitelesa proti ErbB3 in njihove uporabe
US20090001121A1 (en) 2007-03-15 2009-01-01 Hess Christopher J Surgical staple having an expandable portion
US8893946B2 (en) 2007-03-28 2014-11-25 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Laparoscopic tissue thickness and clamp load measuring devices
US11672531B2 (en) 2007-06-04 2023-06-13 Cilag Gmbh International Rotary drive systems for surgical instruments
US8931682B2 (en) 2007-06-04 2015-01-13 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-controlled shaft based rotary drive systems for surgical instruments
US8308040B2 (en) 2007-06-22 2012-11-13 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling instrument with an articulatable end effector
US7753245B2 (en) 2007-06-22 2010-07-13 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling instruments
US11849941B2 (en) 2007-06-29 2023-12-26 Cilag Gmbh International Staple cartridge having staple cavities extending at a transverse angle relative to a longitudinal cartridge axis
WO2009033011A1 (en) 2007-09-07 2009-03-12 Children's Hospital Medical Center Use of secretor, lewis and sialyl antigen levels as predictors for disease
US8561870B2 (en) 2008-02-13 2013-10-22 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling instrument
US7819298B2 (en) 2008-02-14 2010-10-26 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling apparatus with control features operable with one hand
US8636736B2 (en) 2008-02-14 2014-01-28 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Motorized surgical cutting and fastening instrument
US11986183B2 (en) 2008-02-14 2024-05-21 Cilag Gmbh International Surgical cutting and fastening instrument comprising a plurality of sensors to measure an electrical parameter
US8573465B2 (en) 2008-02-14 2013-11-05 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-controlled surgical end effector system with rotary actuated closure systems
US8758391B2 (en) 2008-02-14 2014-06-24 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Interchangeable tools for surgical instruments
US7866527B2 (en) 2008-02-14 2011-01-11 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling apparatus with interlockable firing system
BRPI0901282A2 (pt) 2008-02-14 2009-11-17 Ethicon Endo Surgery Inc instrumento cirúrgico de corte e fixação dotado de eletrodos de rf
US8657174B2 (en) 2008-02-14 2014-02-25 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Motorized surgical cutting and fastening instrument having handle based power source
US9179912B2 (en) 2008-02-14 2015-11-10 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Robotically-controlled motorized surgical cutting and fastening instrument
US9770245B2 (en) 2008-02-15 2017-09-26 Ethicon Llc Layer arrangements for surgical staple cartridges
US20090206131A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Ethicon Endo-Surgery, Inc. End effector coupling arrangements for a surgical cutting and stapling instrument
US11272927B2 (en) 2008-02-15 2022-03-15 Cilag Gmbh International Layer arrangements for surgical staple cartridges
MX2011001764A (es) * 2008-08-15 2011-05-19 Merrimack Pharmaceuticals Inc Metodos, sistemas y productos para predecir la respuesta de las celulas tumorales a un agente terapeutico y tratar un paciente de acuerdo con la respuesta predicha.
PL3476312T3 (pl) 2008-09-19 2024-03-11 Ethicon Llc Stapler chirurgiczny z urządzeniem do dopasowania wysokości zszywek
US7857186B2 (en) 2008-09-19 2010-12-28 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapler having an intermediate closing position
US9005230B2 (en) 2008-09-23 2015-04-14 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Motorized surgical instrument
US8210411B2 (en) 2008-09-23 2012-07-03 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Motor-driven surgical cutting instrument
US11648005B2 (en) 2008-09-23 2023-05-16 Cilag Gmbh International Robotically-controlled motorized surgical instrument with an end effector
US9386983B2 (en) 2008-09-23 2016-07-12 Ethicon Endo-Surgery, Llc Robotically-controlled motorized surgical instrument
US8608045B2 (en) 2008-10-10 2013-12-17 Ethicon Endo-Sugery, Inc. Powered surgical cutting and stapling apparatus with manually retractable firing system
US8517239B2 (en) 2009-02-05 2013-08-27 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling instrument comprising a magnetic element driver
US8444036B2 (en) 2009-02-06 2013-05-21 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Motor driven surgical fastener device with mechanisms for adjusting a tissue gap within the end effector
RU2525225C2 (ru) 2009-02-06 2014-08-10 Этикон Эндо-Серджери, Инк. Усовершенствование приводного хирургического сшивающего инструмента
JP5282286B2 (ja) * 2009-05-28 2013-09-04 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 腫瘍の検査方法
EP2451462B1 (en) 2009-07-06 2017-09-06 Children's Hospital Medical Center Inhibiting inflammation with milk oligosaccharides
JP5863047B2 (ja) * 2009-07-17 2016-02-16 ミリアド ジェネティクス， インコーポレイテッド ５−ｆｕをアッセイする方法
US8851354B2 (en) 2009-12-24 2014-10-07 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical cutting instrument that analyzes tissue thickness
US8220688B2 (en) 2009-12-24 2012-07-17 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Motor-driven surgical cutting instrument with electric actuator directional control assembly
US8608046B2 (en) 2010-01-07 2013-12-17 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Test device for a surgical tool
CA2792327C (en) 2010-03-11 2019-09-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Use of erbb3 inhibitors in the treatment of triple negative and basal-like breast cancers
US8783543B2 (en) 2010-07-30 2014-07-22 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Tissue acquisition arrangements and methods for surgical stapling devices
US8360296B2 (en) 2010-09-09 2013-01-29 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling head assembly with firing lockout for a surgical stapler
US8632525B2 (en) 2010-09-17 2014-01-21 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Power control arrangements for surgical instruments and batteries
US9289212B2 (en) 2010-09-17 2016-03-22 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical instruments and batteries for surgical instruments
US8733613B2 (en) 2010-09-29 2014-05-27 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Staple cartridge
US9848875B2 (en) 2010-09-30 2017-12-26 Ethicon Llc Anvil layer attached to a proximal end of an end effector
US9517063B2 (en) 2012-03-28 2016-12-13 Ethicon Endo-Surgery, Llc Movable member for use with a tissue thickness compensator
US9301752B2 (en) 2010-09-30 2016-04-05 Ethicon Endo-Surgery, Llc Tissue thickness compensator comprising a plurality of capsules
US9332974B2 (en) 2010-09-30 2016-05-10 Ethicon Endo-Surgery, Llc Layered tissue thickness compensator
US11812965B2 (en) 2010-09-30 2023-11-14 Cilag Gmbh International Layer of material for a surgical end effector
RU2013119928A (ru) 2010-09-30 2014-11-10 Этикон Эндо-Серджери, Инк. Сшивающая система, содержащая удерживающую матрицу и выравнивающую матрицу
US9364233B2 (en) 2010-09-30 2016-06-14 Ethicon Endo-Surgery, Llc Tissue thickness compensators for circular surgical staplers
US9204880B2 (en) 2012-03-28 2015-12-08 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Tissue thickness compensator comprising capsules defining a low pressure environment
US9386988B2 (en) 2010-09-30 2016-07-12 Ethicon End-Surgery, LLC Retainer assembly including a tissue thickness compensator
US9629814B2 (en) 2010-09-30 2017-04-25 Ethicon Endo-Surgery, Llc Tissue thickness compensator configured to redistribute compressive forces
US11849952B2 (en) 2010-09-30 2023-12-26 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising staples positioned within a compressible portion thereof
US9055941B2 (en) 2011-09-23 2015-06-16 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Staple cartridge including collapsible deck
US9301755B2 (en) 2010-09-30 2016-04-05 Ethicon Endo-Surgery, Llc Compressible staple cartridge assembly
US10123798B2 (en) 2010-09-30 2018-11-13 Ethicon Llc Tissue thickness compensator comprising controlled release and expansion
US12213666B2 (en) 2010-09-30 2025-02-04 Cilag Gmbh International Tissue thickness compensator comprising layers
US10945731B2 (en) 2010-09-30 2021-03-16 Ethicon Llc Tissue thickness compensator comprising controlled release and expansion
US9220501B2 (en) 2010-09-30 2015-12-29 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Tissue thickness compensators
US11298125B2 (en) 2010-09-30 2022-04-12 Cilag Gmbh International Tissue stapler having a thickness compensator
US9241714B2 (en) 2011-04-29 2016-01-26 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Tissue thickness compensator and method for making the same
US8695866B2 (en) 2010-10-01 2014-04-15 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical instrument having a power control circuit
US8827903B2 (en) 2011-03-14 2014-09-09 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Modular tool heads for use with circular surgical instruments
BR112013026199A2 (pt) * 2011-04-15 2017-11-07 Compugen Ltd polipeptídeo isolado, proteína de fusão, sequência de ácidos nucleicos, vetor de expressão ou um vírus, célula recombinante, método de produção de um polipeptídeo com ectodomínio solúvel lsr, ou seu fragmento ou proteína de fusão, composição farmacêutica, uso de um anticorpo monoclonal ou policlonal ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, uso do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno, uso de qualquer um de um polipeptídeo isolado, método de regulação por cima de citocinas, indução da expansão de células t, promoção da imunidade de células t específica antigênica e promoção da ativação das células t cd4+ e/ou cd8+ em um sujeito, método para potenciação de uma resposta imune secundária a um antígeno em um paciente, método de uso de pelo menos um de: um polipeptídeo isolado, método para tratamento ou prevenção de uma condição relacionada com o sistema imune, método para tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa, método para diagnóstico de uma doença em um sujeito, método de produção de um polipeptídeo com ectodomínio solúvel tmem25, vsig10, ly6g6f, ou seu fragmento ou proteína de fusão, anticorpo monoclonal ou policlonal ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, método de imunoterapia em um paciente e método para combinação de vacinação terapêutica com um antígeno em conjunto com a administração de qualquer um de um polipeptídeo
RU2606493C2 (ru) 2011-04-29 2017-01-10 Этикон Эндо-Серджери, Инк. Кассета со скобками, содержащая скобки, расположенные внутри ее сжимаемой части
US11207064B2 (en) 2011-05-27 2021-12-28 Cilag Gmbh International Automated end effector component reloading system for use with a robotic system
US9050084B2 (en) 2011-09-23 2015-06-09 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Staple cartridge including collapsible deck arrangement
US9044230B2 (en) 2012-02-13 2015-06-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical cutting and fastening instrument with apparatus for determining cartridge and firing motion status
US9078653B2 (en) 2012-03-26 2015-07-14 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical stapling device with lockout system for preventing actuation in the absence of an installed staple cartridge
JP6305979B2 (ja) 2012-03-28 2018-04-04 エシコン・エンド−サージェリィ・インコーポレイテッドＥｔｈｉｃｏｎ Ｅｎｄｏ−Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｉｎｃ． 複数の層を含む組織厚さコンペンセーター
MX350846B (es) 2012-03-28 2017-09-22 Ethicon Endo Surgery Inc Compensador de grosor de tejido que comprende cápsulas que definen un ambiente de baja presión.
MX353040B (es) 2012-03-28 2017-12-18 Ethicon Endo Surgery Inc Unidad retenedora que incluye un compensador de grosor de tejido.
US9101358B2 (en) 2012-06-15 2015-08-11 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Articulatable surgical instrument comprising a firing drive
US20140005718A1 (en) 2012-06-28 2014-01-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Multi-functional powered surgical device with external dissection features
US9282974B2 (en) 2012-06-28 2016-03-15 Ethicon Endo-Surgery, Llc Empty clip cartridge lockout
US9561038B2 (en) 2012-06-28 2017-02-07 Ethicon Endo-Surgery, Llc Interchangeable clip applier
US9119657B2 (en) 2012-06-28 2015-09-01 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Rotary actuatable closure arrangement for surgical end effector
US20140005678A1 (en) 2012-06-28 2014-01-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Rotary drive arrangements for surgical instruments
US11197671B2 (en) 2012-06-28 2021-12-14 Cilag Gmbh International Stapling assembly comprising a lockout
BR112014032776B1 (pt) 2012-06-28 2021-09-08 Ethicon Endo-Surgery, Inc Sistema de instrumento cirúrgico e kit cirúrgico para uso com um sistema de instrumento cirúrgico
BR112014032740A2 (pt) 2012-06-28 2020-02-27 Ethicon Endo Surgery Inc bloqueio de cartucho de clipes vazio
US9072536B2 (en) 2012-06-28 2015-07-07 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Differential locking arrangements for rotary powered surgical instruments
US9125662B2 (en) 2012-06-28 2015-09-08 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Multi-axis articulating and rotating surgical tools
US12383267B2 (en) 2012-06-28 2025-08-12 Cilag Gmbh International Robotically powered surgical device with manually-actuatable reversing system
US9028494B2 (en) 2012-06-28 2015-05-12 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Interchangeable end effector coupling arrangement
US20140001231A1 (en) 2012-06-28 2014-01-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Firing system lockout arrangements for surgical instruments
US9289256B2 (en) 2012-06-28 2016-03-22 Ethicon Endo-Surgery, Llc Surgical end effectors having angled tissue-contacting surfaces
US9101385B2 (en) 2012-06-28 2015-08-11 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Electrode connections for rotary driven surgical tools
US9386985B2 (en) 2012-10-15 2016-07-12 Ethicon Endo-Surgery, Llc Surgical cutting instrument
DK2914739T3 (da) 2012-11-05 2017-11-27 Novigenix Sa Kombinationer af biomarkører for kolorektale tumorer
US9386984B2 (en) 2013-02-08 2016-07-12 Ethicon Endo-Surgery, Llc Staple cartridge comprising a releasable cover
US10626460B2 (en) 2013-02-21 2020-04-21 Children's Hospital Medical Center Use of glycans and glycosyltransferases for diagnosing/monitoring inflammatory bowel disease
US9468438B2 (en) 2013-03-01 2016-10-18 Eticon Endo-Surgery, LLC Sensor straightened end effector during removal through trocar
BR112015021098B1 (pt) 2013-03-01 2022-02-15 Ethicon Endo-Surgery, Inc Cobertura para uma junta de articulação e instrumento cirúrgico
RU2669463C2 (ru) 2013-03-01 2018-10-11 Этикон Эндо-Серджери, Инк. Хирургический инструмент с мягким упором
US9345481B2 (en) 2013-03-13 2016-05-24 Ethicon Endo-Surgery, Llc Staple cartridge tissue thickness sensor system
US9687230B2 (en) 2013-03-14 2017-06-27 Ethicon Llc Articulatable surgical instrument comprising a firing drive
US9629629B2 (en) 2013-03-14 2017-04-25 Ethicon Endo-Surgey, LLC Control systems for surgical instruments
US9332984B2 (en) 2013-03-27 2016-05-10 Ethicon Endo-Surgery, Llc Fastener cartridge assemblies
US9572577B2 (en) 2013-03-27 2017-02-21 Ethicon Endo-Surgery, Llc Fastener cartridge comprising a tissue thickness compensator including openings therein
US9795384B2 (en) 2013-03-27 2017-10-24 Ethicon Llc Fastener cartridge comprising a tissue thickness compensator and a gap setting element
US9814460B2 (en) 2013-04-16 2017-11-14 Ethicon Llc Modular motor driven surgical instruments with status indication arrangements
BR112015026109B1 (pt) 2013-04-16 2022-02-22 Ethicon Endo-Surgery, Inc Instrumento cirúrgico
US9574644B2 (en) 2013-05-30 2017-02-21 Ethicon Endo-Surgery, Llc Power module for use with a surgical instrument
WO2015003744A1 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Gotthardt Daniel Medical analysis system for assessing the risk for colorectal cancer
CN105764501A (zh) 2013-07-26 2016-07-13 现代化制药公司 改善比生群治疗效益的组合物
BR112016003329B1 (pt) 2013-08-23 2021-12-21 Ethicon Endo-Surgery, Llc Instrumento cirúrgico
US9808249B2 (en) 2013-08-23 2017-11-07 Ethicon Llc Attachment portions for surgical instrument assemblies
US20150173756A1 (en) 2013-12-23 2015-06-25 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical cutting and stapling methods
US20150173749A1 (en) 2013-12-23 2015-06-25 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Surgical staples and staple cartridges
US9839428B2 (en) 2013-12-23 2017-12-12 Ethicon Llc Surgical cutting and stapling instruments with independent jaw control features
US9724092B2 (en) 2013-12-23 2017-08-08 Ethicon Llc Modular surgical instruments
US9642620B2 (en) 2013-12-23 2017-05-09 Ethicon Endo-Surgery, Llc Surgical cutting and stapling instruments with articulatable end effectors
US9681870B2 (en) 2013-12-23 2017-06-20 Ethicon Llc Articulatable surgical instruments with separate and distinct closing and firing systems
WO2015100459A2 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarker profiles for predicting outcomes of cancer therapy with erbb3 inhibitors and/or chemotherapies
US9962161B2 (en) 2014-02-12 2018-05-08 Ethicon Llc Deliverable surgical instrument
CN106232029B (zh) 2014-02-24 2019-04-12 伊西康内外科有限责任公司 包括击发构件锁定件的紧固系统
US9839423B2 (en) 2014-02-24 2017-12-12 Ethicon Llc Implantable layers and methods for modifying the shape of the implantable layers for use with a surgical fastening instrument
US9690362B2 (en) 2014-03-26 2017-06-27 Ethicon Llc Surgical instrument control circuit having a safety processor
US10004497B2 (en) 2014-03-26 2018-06-26 Ethicon Llc Interface systems for use with surgical instruments
US10028761B2 (en) 2014-03-26 2018-07-24 Ethicon Llc Feedback algorithms for manual bailout systems for surgical instruments
US12232723B2 (en) 2014-03-26 2025-02-25 Cilag Gmbh International Systems and methods for controlling a segmented circuit
BR112016021943B1 (pt) 2014-03-26 2022-06-14 Ethicon Endo-Surgery, Llc Instrumento cirúrgico para uso por um operador em um procedimento cirúrgico
US9913642B2 (en) 2014-03-26 2018-03-13 Ethicon Llc Surgical instrument comprising a sensor system
JP6612256B2 (ja) 2014-04-16 2019-11-27 エシコン エルエルシー 不均一な締結具を備える締結具カートリッジ
US20150297222A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Fastener cartridges including extensions having different configurations
US10299792B2 (en) 2014-04-16 2019-05-28 Ethicon Llc Fastener cartridge comprising non-uniform fasteners
JP6532889B2 (ja) 2014-04-16 2019-06-19 エシコン エルエルシーＥｔｈｉｃｏｎ ＬＬＣ 締結具カートリッジ組立体及びステープル保持具カバー配置構成
JP6636452B2 (ja) 2014-04-16 2020-01-29 エシコン エルエルシーＥｔｈｉｃｏｎ ＬＬＣ 異なる構成を有する延在部を含む締結具カートリッジ
US10426476B2 (en) 2014-09-26 2019-10-01 Ethicon Llc Circular fastener cartridges for applying radially expandable fastener lines
US10045781B2 (en) 2014-06-13 2018-08-14 Ethicon Llc Closure lockout systems for surgical instruments
US11311294B2 (en) 2014-09-05 2022-04-26 Cilag Gmbh International Powered medical device including measurement of closure state of jaws
US10016199B2 (en) 2014-09-05 2018-07-10 Ethicon Llc Polarity of hall magnet to identify cartridge type
BR112017004361B1 (pt) 2014-09-05 2023-04-11 Ethicon Llc Sistema eletrônico para um instrumento cirúrgico
US10105142B2 (en) 2014-09-18 2018-10-23 Ethicon Llc Surgical stapler with plurality of cutting elements
US11523821B2 (en) 2014-09-26 2022-12-13 Cilag Gmbh International Method for creating a flexible staple line
MX380639B (es) 2014-09-26 2025-03-12 Ethicon Llc Refuerzos de grapas quirúrgicas y materiales auxiliares.
US10076325B2 (en) 2014-10-13 2018-09-18 Ethicon Llc Surgical stapling apparatus comprising a tissue stop
US9924944B2 (en) 2014-10-16 2018-03-27 Ethicon Llc Staple cartridge comprising an adjunct material
US10517594B2 (en) 2014-10-29 2019-12-31 Ethicon Llc Cartridge assemblies for surgical staplers
US11141153B2 (en) 2014-10-29 2021-10-12 Cilag Gmbh International Staple cartridges comprising driver arrangements
US9844376B2 (en) 2014-11-06 2017-12-19 Ethicon Llc Staple cartridge comprising a releasable adjunct material
US10736636B2 (en) 2014-12-10 2020-08-11 Ethicon Llc Articulatable surgical instrument system
US9987000B2 (en) 2014-12-18 2018-06-05 Ethicon Llc Surgical instrument assembly comprising a flexible articulation system
US10117649B2 (en) 2014-12-18 2018-11-06 Ethicon Llc Surgical instrument assembly comprising a lockable articulation system
MX389118B (es) 2014-12-18 2025-03-20 Ethicon Llc Instrumento quirurgico con un yunque que puede moverse de manera selectiva sobre un eje discreto no movil con relacion a un cartucho de grapas.
US10188385B2 (en) 2014-12-18 2019-01-29 Ethicon Llc Surgical instrument system comprising lockable systems
US9844374B2 (en) 2014-12-18 2017-12-19 Ethicon Llc Surgical instrument systems comprising an articulatable end effector and means for adjusting the firing stroke of a firing member
US10085748B2 (en) 2014-12-18 2018-10-02 Ethicon Llc Locking arrangements for detachable shaft assemblies with articulatable surgical end effectors
US9844375B2 (en) 2014-12-18 2017-12-19 Ethicon Llc Drive arrangements for articulatable surgical instruments
US10004501B2 (en) 2014-12-18 2018-06-26 Ethicon Llc Surgical instruments with improved closure arrangements
US10501552B2 (en) 2015-01-26 2019-12-10 Macrogenics, Inc. Multivalent molecules comprising DR5-binding domains
US11154301B2 (en) 2015-02-27 2021-10-26 Cilag Gmbh International Modular stapling assembly
US9993258B2 (en) 2015-02-27 2018-06-12 Ethicon Llc Adaptable surgical instrument handle
US10321907B2 (en) 2015-02-27 2019-06-18 Ethicon Llc System for monitoring whether a surgical instrument needs to be serviced
US10180463B2 (en) 2015-02-27 2019-01-15 Ethicon Llc Surgical apparatus configured to assess whether a performance parameter of the surgical apparatus is within an acceptable performance band
US10245033B2 (en) 2015-03-06 2019-04-02 Ethicon Llc Surgical instrument comprising a lockable battery housing
JP2020121162A (ja) 2015-03-06 2020-08-13 エシコン エルエルシーＥｔｈｉｃｏｎ ＬＬＣ 測定の安定性要素、クリープ要素、及び粘弾性要素を決定するためのセンサデータの時間依存性評価
US10441279B2 (en) 2015-03-06 2019-10-15 Ethicon Llc Multiple level thresholds to modify operation of powered surgical instruments
US9895148B2 (en) 2015-03-06 2018-02-20 Ethicon Endo-Surgery, Llc Monitoring speed control and precision incrementing of motor for powered surgical instruments
US9901342B2 (en) 2015-03-06 2018-02-27 Ethicon Endo-Surgery, Llc Signal and power communication system positioned on a rotatable shaft
US10687806B2 (en) 2015-03-06 2020-06-23 Ethicon Llc Adaptive tissue compression techniques to adjust closure rates for multiple tissue types
US9924961B2 (en) 2015-03-06 2018-03-27 Ethicon Endo-Surgery, Llc Interactive feedback system for powered surgical instruments
US9993248B2 (en) 2015-03-06 2018-06-12 Ethicon Endo-Surgery, Llc Smart sensors with local signal processing
US9808246B2 (en) 2015-03-06 2017-11-07 Ethicon Endo-Surgery, Llc Method of operating a powered surgical instrument
US10617412B2 (en) 2015-03-06 2020-04-14 Ethicon Llc System for detecting the mis-insertion of a staple cartridge into a surgical stapler
US10548504B2 (en) 2015-03-06 2020-02-04 Ethicon Llc Overlaid multi sensor radio frequency (RF) electrode system to measure tissue compression
US10045776B2 (en) 2015-03-06 2018-08-14 Ethicon Llc Control techniques and sub-processor contained within modular shaft with select control processing from handle
US10433844B2 (en) 2015-03-31 2019-10-08 Ethicon Llc Surgical instrument with selectively disengageable threaded drive systems
WO2016176484A1 (en) 2015-04-28 2016-11-03 Children's Hospital Medical Center Use of oligosaccharide compositions to enhance weight gain
US10184006B2 (en) 2015-06-04 2019-01-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for predicting outcomes of cancer therapy with ErbB3 inhibitors
US10405863B2 (en) 2015-06-18 2019-09-10 Ethicon Llc Movable firing beam support arrangements for articulatable surgical instruments
US10617418B2 (en) 2015-08-17 2020-04-14 Ethicon Llc Implantable layers for a surgical instrument
JP6828018B2 (ja) 2015-08-26 2021-02-10 エシコン エルエルシーＥｔｈｉｃｏｎ ＬＬＣ ステープルの特性変更を可能にし、カートリッジへの充填を容易にする外科用ステープルストリップ
MX2022009705A (es) 2015-08-26 2022-11-07 Ethicon Llc Metodo para formar una grapa contra un yunque de un instrumento de engrapado quirurgico.
BR112018003707B8 (pt) 2015-08-26 2023-05-16 Ethicon Llc Conjunto de cartucho de grampos
US10390829B2 (en) 2015-08-26 2019-08-27 Ethicon Llc Staples comprising a cover
MX2022006192A (es) 2015-09-02 2022-06-16 Ethicon Llc Configuraciones de grapas quirurgicas con superficies de leva situadas entre porciones que soportan grapas quirurgicas.
US10357252B2 (en) 2015-09-02 2019-07-23 Ethicon Llc Surgical staple configurations with camming surfaces located between portions supporting surgical staples
US10085751B2 (en) 2015-09-23 2018-10-02 Ethicon Llc Surgical stapler having temperature-based motor control
US10238386B2 (en) 2015-09-23 2019-03-26 Ethicon Llc Surgical stapler having motor control based on an electrical parameter related to a motor current
US10327769B2 (en) 2015-09-23 2019-06-25 Ethicon Llc Surgical stapler having motor control based on a drive system component
US10076326B2 (en) 2015-09-23 2018-09-18 Ethicon Llc Surgical stapler having current mirror-based motor control
US10363036B2 (en) 2015-09-23 2019-07-30 Ethicon Llc Surgical stapler having force-based motor control
US10105139B2 (en) 2015-09-23 2018-10-23 Ethicon Llc Surgical stapler having downstream current-based motor control
US10299878B2 (en) 2015-09-25 2019-05-28 Ethicon Llc Implantable adjunct systems for determining adjunct skew
US10433846B2 (en) 2015-09-30 2019-10-08 Ethicon Llc Compressible adjunct with crossing spacer fibers
US10980539B2 (en) 2015-09-30 2021-04-20 Ethicon Llc Implantable adjunct comprising bonded layers
US11890015B2 (en) 2015-09-30 2024-02-06 Cilag Gmbh International Compressible adjunct with crossing spacer fibers
US10478188B2 (en) 2015-09-30 2019-11-19 Ethicon Llc Implantable layer comprising a constricted configuration
US10265068B2 (en) 2015-12-30 2019-04-23 Ethicon Llc Surgical instruments with separable motors and motor control circuits
US10368865B2 (en) 2015-12-30 2019-08-06 Ethicon Llc Mechanisms for compensating for drivetrain failure in powered surgical instruments
US10292704B2 (en) 2015-12-30 2019-05-21 Ethicon Llc Mechanisms for compensating for battery pack failure in powered surgical instruments
US10653413B2 (en) 2016-02-09 2020-05-19 Ethicon Llc Surgical instruments with an end effector that is highly articulatable relative to an elongate shaft assembly
CN108882932B (zh) 2016-02-09 2021-07-23 伊西康有限责任公司 具有非对称关节运动构造的外科器械
US11213293B2 (en) 2016-02-09 2022-01-04 Cilag Gmbh International Articulatable surgical instruments with single articulation link arrangements
US10258331B2 (en) 2016-02-12 2019-04-16 Ethicon Llc Mechanisms for compensating for drivetrain failure in powered surgical instruments
US10448948B2 (en) 2016-02-12 2019-10-22 Ethicon Llc Mechanisms for compensating for drivetrain failure in powered surgical instruments
US11224426B2 (en) 2016-02-12 2022-01-18 Cilag Gmbh International Mechanisms for compensating for drivetrain failure in powered surgical instruments
US10413293B2 (en) 2016-04-01 2019-09-17 Ethicon Llc Interchangeable surgical tool assembly with a surgical end effector that is selectively rotatable about a shaft axis
CN109219399B (zh) 2016-04-01 2022-05-03 伊西康有限责任公司 外科缝合器械
US10376263B2 (en) 2016-04-01 2019-08-13 Ethicon Llc Anvil modification members for surgical staplers
US10675021B2 (en) 2016-04-01 2020-06-09 Ethicon Llc Circular stapling system comprising rotary firing system
US11284890B2 (en) 2016-04-01 2022-03-29 Cilag Gmbh International Circular stapling system comprising an incisable tissue support
US10617413B2 (en) 2016-04-01 2020-04-14 Ethicon Llc Closure system arrangements for surgical cutting and stapling devices with separate and distinct firing shafts
US10335145B2 (en) 2016-04-15 2019-07-02 Ethicon Llc Modular surgical instrument with configurable operating mode
US10426467B2 (en) 2016-04-15 2019-10-01 Ethicon Llc Surgical instrument with detection sensors
US11607239B2 (en) 2016-04-15 2023-03-21 Cilag Gmbh International Systems and methods for controlling a surgical stapling and cutting instrument
US10492783B2 (en) 2016-04-15 2019-12-03 Ethicon, Llc Surgical instrument with improved stop/start control during a firing motion
US10828028B2 (en) 2016-04-15 2020-11-10 Ethicon Llc Surgical instrument with multiple program responses during a firing motion
US10405859B2 (en) 2016-04-15 2019-09-10 Ethicon Llc Surgical instrument with adjustable stop/start control during a firing motion
US10357247B2 (en) 2016-04-15 2019-07-23 Ethicon Llc Surgical instrument with multiple program responses during a firing motion
US10456137B2 (en) 2016-04-15 2019-10-29 Ethicon Llc Staple formation detection mechanisms
US11179150B2 (en) 2016-04-15 2021-11-23 Cilag Gmbh International Systems and methods for controlling a surgical stapling and cutting instrument
US20170296173A1 (en) 2016-04-18 2017-10-19 Ethicon Endo-Surgery, Llc Method for operating a surgical instrument
US11317917B2 (en) 2016-04-18 2022-05-03 Cilag Gmbh International Surgical stapling system comprising a lockable firing assembly
US10426469B2 (en) 2016-04-18 2019-10-01 Ethicon Llc Surgical instrument comprising a primary firing lockout and a secondary firing lockout
USD826405S1 (en) 2016-06-24 2018-08-21 Ethicon Llc Surgical fastener
USD850617S1 (en) 2016-06-24 2019-06-04 Ethicon Llc Surgical fastener cartridge
USD847989S1 (en) 2016-06-24 2019-05-07 Ethicon Llc Surgical fastener cartridge
CN109310431B (zh) 2016-06-24 2022-03-04 伊西康有限责任公司 包括线材钉和冲压钉的钉仓
JP6980705B2 (ja) 2016-06-24 2021-12-15 エシコン エルエルシーEthicon LLC ワイヤステープル及び打ち抜かれたステープルで使用するためのステープリングシステム
US10675024B2 (en) 2016-06-24 2020-06-09 Ethicon Llc Staple cartridge comprising overdriven staples
US10500000B2 (en) 2016-08-16 2019-12-10 Ethicon Llc Surgical tool with manual control of end effector jaws
US20180168633A1 (en) 2016-12-21 2018-06-21 Ethicon Endo-Surgery, Llc Surgical stapling instruments and staple-forming anvils
US10603036B2 (en) 2016-12-21 2020-03-31 Ethicon Llc Articulatable surgical instrument with independent pivotable linkage distal of an articulation lock
US20180168648A1 (en) 2016-12-21 2018-06-21 Ethicon Endo-Surgery, Llc Durability features for end effectors and firing assemblies of surgical stapling instruments
US10426471B2 (en) 2016-12-21 2019-10-01 Ethicon Llc Surgical instrument with multiple failure response modes
US10588630B2 (en) 2016-12-21 2020-03-17 Ethicon Llc Surgical tool assemblies with closure stroke reduction features
US10945727B2 (en) 2016-12-21 2021-03-16 Ethicon Llc Staple cartridge with deformable driver retention features
MX2019007311A (es) 2016-12-21 2019-11-18 Ethicon Llc Sistemas de engrapado quirurgico.
BR112019012227B1 (pt) 2016-12-21 2023-12-19 Ethicon Llc Instrumento cirúrgico
US10682138B2 (en) 2016-12-21 2020-06-16 Ethicon Llc Bilaterally asymmetric staple forming pocket pairs
US10993715B2 (en) 2016-12-21 2021-05-04 Ethicon Llc Staple cartridge comprising staples with different clamping breadths
US10687810B2 (en) 2016-12-21 2020-06-23 Ethicon Llc Stepped staple cartridge with tissue retention and gap setting features
US10448950B2 (en) 2016-12-21 2019-10-22 Ethicon Llc Surgical staplers with independently actuatable closing and firing systems
US11090048B2 (en) 2016-12-21 2021-08-17 Cilag Gmbh International Method for resetting a fuse of a surgical instrument shaft
CN110114014B (zh) 2016-12-21 2022-08-09 爱惜康有限责任公司 包括端部执行器闭锁件和击发组件闭锁件的外科器械系统
US11419606B2 (en) 2016-12-21 2022-08-23 Cilag Gmbh International Shaft assembly comprising a clutch configured to adapt the output of a rotary firing member to two different systems
US11134942B2 (en) 2016-12-21 2021-10-05 Cilag Gmbh International Surgical stapling instruments and staple-forming anvils
US10675025B2 (en) 2016-12-21 2020-06-09 Ethicon Llc Shaft assembly comprising separately actuatable and retractable systems
US10758229B2 (en) 2016-12-21 2020-09-01 Ethicon Llc Surgical instrument comprising improved jaw control
US10856868B2 (en) 2016-12-21 2020-12-08 Ethicon Llc Firing member pin configurations
CN110099619B (zh) 2016-12-21 2022-07-15 爱惜康有限责任公司 用于外科端部执行器和可替换工具组件的闭锁装置
US10588632B2 (en) 2016-12-21 2020-03-17 Ethicon Llc Surgical end effectors and firing members thereof
JP7010957B2 (ja) 2016-12-21 2022-01-26 エシコン エルエルシー ロックアウトを備えるシャフトアセンブリ
JP7010956B2 (ja) 2016-12-21 2022-01-26 エシコン エルエルシー 組織をステープル留めする方法
US10758230B2 (en) 2016-12-21 2020-09-01 Ethicon Llc Surgical instrument with primary and safety processors
US20180168615A1 (en) 2016-12-21 2018-06-21 Ethicon Endo-Surgery, Llc Method of deforming staples from two different types of staple cartridges with the same surgical stapling instrument
US20180168609A1 (en) 2016-12-21 2018-06-21 Ethicon Endo-Surgery, Llc Firing assembly comprising a fuse
US11684367B2 (en) 2016-12-21 2023-06-27 Cilag Gmbh International Stepped assembly having and end-of-life indicator
US10888321B2 (en) 2017-06-20 2021-01-12 Ethicon Llc Systems and methods for controlling velocity of a displacement member of a surgical stapling and cutting instrument
US10368864B2 (en) 2017-06-20 2019-08-06 Ethicon Llc Systems and methods for controlling displaying motor velocity for a surgical instrument
US10779820B2 (en) 2017-06-20 2020-09-22 Ethicon Llc Systems and methods for controlling motor speed according to user input for a surgical instrument
US10980537B2 (en) 2017-06-20 2021-04-20 Ethicon Llc Closed loop feedback control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument based on measured time over a specified number of shaft rotations
US10881399B2 (en) 2017-06-20 2021-01-05 Ethicon Llc Techniques for adaptive control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument
US11071554B2 (en) 2017-06-20 2021-07-27 Cilag Gmbh International Closed loop feedback control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument based on magnitude of velocity error measurements
US10646220B2 (en) 2017-06-20 2020-05-12 Ethicon Llc Systems and methods for controlling displacement member velocity for a surgical instrument
US11090046B2 (en) 2017-06-20 2021-08-17 Cilag Gmbh International Systems and methods for controlling displacement member motion of a surgical stapling and cutting instrument
US10813639B2 (en) 2017-06-20 2020-10-27 Ethicon Llc Closed loop feedback control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument based on system conditions
US10390841B2 (en) 2017-06-20 2019-08-27 Ethicon Llc Control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument based on angle of articulation
US11653914B2 (en) 2017-06-20 2023-05-23 Cilag Gmbh International Systems and methods for controlling motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument according to articulation angle of end effector
US10881396B2 (en) 2017-06-20 2021-01-05 Ethicon Llc Surgical instrument with variable duration trigger arrangement
US11517325B2 (en) 2017-06-20 2022-12-06 Cilag Gmbh International Closed loop feedback control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument based on measured displacement distance traveled over a specified time interval
USD890784S1 (en) 2017-06-20 2020-07-21 Ethicon Llc Display panel with changeable graphical user interface
US10327767B2 (en) 2017-06-20 2019-06-25 Ethicon Llc Control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument based on angle of articulation
US10307170B2 (en) 2017-06-20 2019-06-04 Ethicon Llc Method for closed loop control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument
USD879809S1 (en) 2017-06-20 2020-03-31 Ethicon Llc Display panel with changeable graphical user interface
USD879808S1 (en) 2017-06-20 2020-03-31 Ethicon Llc Display panel with graphical user interface
US11382638B2 (en) 2017-06-20 2022-07-12 Cilag Gmbh International Closed loop feedback control of motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument based on measured time over a specified displacement distance
US10624633B2 (en) 2017-06-20 2020-04-21 Ethicon Llc Systems and methods for controlling motor velocity of a surgical stapling and cutting instrument
US10993716B2 (en) 2017-06-27 2021-05-04 Ethicon Llc Surgical anvil arrangements
US11141154B2 (en) 2017-06-27 2021-10-12 Cilag Gmbh International Surgical end effectors and anvils
US11324503B2 (en) 2017-06-27 2022-05-10 Cilag Gmbh International Surgical firing member arrangements
US10772629B2 (en) 2017-06-27 2020-09-15 Ethicon Llc Surgical anvil arrangements
US10856869B2 (en) 2017-06-27 2020-12-08 Ethicon Llc Surgical anvil arrangements
US11266405B2 (en) 2017-06-27 2022-03-08 Cilag Gmbh International Surgical anvil manufacturing methods
US11246592B2 (en) 2017-06-28 2022-02-15 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising an articulation system lockable to a frame
US10903685B2 (en) 2017-06-28 2021-01-26 Ethicon Llc Surgical shaft assemblies with slip ring assemblies forming capacitive channels
USD906355S1 (en) 2017-06-28 2020-12-29 Ethicon Llc Display screen or portion thereof with a graphical user interface for a surgical instrument
US11484310B2 (en) 2017-06-28 2022-11-01 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a shaft including a closure tube profile
US11564686B2 (en) 2017-06-28 2023-01-31 Cilag Gmbh International Surgical shaft assemblies with flexible interfaces
US10211586B2 (en) 2017-06-28 2019-02-19 Ethicon Llc Surgical shaft assemblies with watertight housings
USD869655S1 (en) 2017-06-28 2019-12-10 Ethicon Llc Surgical fastener cartridge
US11259805B2 (en) 2017-06-28 2022-03-01 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising firing member supports
USD854151S1 (en) 2017-06-28 2019-07-16 Ethicon Llc Surgical instrument shaft
US10765427B2 (en) 2017-06-28 2020-09-08 Ethicon Llc Method for articulating a surgical instrument
US10716614B2 (en) 2017-06-28 2020-07-21 Ethicon Llc Surgical shaft assemblies with slip ring assemblies with increased contact pressure
USD851762S1 (en) 2017-06-28 2019-06-18 Ethicon Llc Anvil
EP3420947B1 (en) 2017-06-28 2022-05-25 Cilag GmbH International Surgical instrument comprising selectively actuatable rotatable couplers
US11478242B2 (en) 2017-06-28 2022-10-25 Cilag Gmbh International Jaw retainer arrangement for retaining a pivotable surgical instrument jaw in pivotable retaining engagement with a second surgical instrument jaw
US10398434B2 (en) 2017-06-29 2019-09-03 Ethicon Llc Closed loop velocity control of closure member for robotic surgical instrument
US10898183B2 (en) 2017-06-29 2021-01-26 Ethicon Llc Robotic surgical instrument with closed loop feedback techniques for advancement of closure member during firing
US10258418B2 (en) 2017-06-29 2019-04-16 Ethicon Llc System for controlling articulation forces
US10932772B2 (en) 2017-06-29 2021-03-02 Ethicon Llc Methods for closed loop velocity control for robotic surgical instrument
US11007022B2 (en) 2017-06-29 2021-05-18 Ethicon Llc Closed loop velocity control techniques based on sensed tissue parameters for robotic surgical instrument
US11944300B2 (en) 2017-08-03 2024-04-02 Cilag Gmbh International Method for operating a surgical system bailout
US11304695B2 (en) 2017-08-03 2022-04-19 Cilag Gmbh International Surgical system shaft interconnection
US11974742B2 (en) 2017-08-03 2024-05-07 Cilag Gmbh International Surgical system comprising an articulation bailout
US11471155B2 (en) 2017-08-03 2022-10-18 Cilag Gmbh International Surgical system bailout
US11399829B2 (en) 2017-09-29 2022-08-02 Cilag Gmbh International Systems and methods of initiating a power shutdown mode for a surgical instrument
US10765429B2 (en) 2017-09-29 2020-09-08 Ethicon Llc Systems and methods for providing alerts according to the operational state of a surgical instrument
US10743872B2 (en) 2017-09-29 2020-08-18 Ethicon Llc System and methods for controlling a display of a surgical instrument
US10796471B2 (en) 2017-09-29 2020-10-06 Ethicon Llc Systems and methods of displaying a knife position for a surgical instrument
USD907647S1 (en) 2017-09-29 2021-01-12 Ethicon Llc Display screen or portion thereof with animated graphical user interface
USD917500S1 (en) 2017-09-29 2021-04-27 Ethicon Llc Display screen or portion thereof with graphical user interface
USD907648S1 (en) 2017-09-29 2021-01-12 Ethicon Llc Display screen or portion thereof with animated graphical user interface
US11134944B2 (en) 2017-10-30 2021-10-05 Cilag Gmbh International Surgical stapler knife motion controls
US11090075B2 (en) 2017-10-30 2021-08-17 Cilag Gmbh International Articulation features for surgical end effector
US10779903B2 (en) 2017-10-31 2020-09-22 Ethicon Llc Positive shaft rotation lock activated by jaw closure
US10842490B2 (en) 2017-10-31 2020-11-24 Ethicon Llc Cartridge body design with force reduction based on firing completion
US10779826B2 (en) 2017-12-15 2020-09-22 Ethicon Llc Methods of operating surgical end effectors
US10687813B2 (en) 2017-12-15 2020-06-23 Ethicon Llc Adapters with firing stroke sensing arrangements for use in connection with electromechanical surgical instruments
US11197670B2 (en) 2017-12-15 2021-12-14 Cilag Gmbh International Surgical end effectors with pivotal jaws configured to touch at their respective distal ends when fully closed
US10743874B2 (en) 2017-12-15 2020-08-18 Ethicon Llc Sealed adapters for use with electromechanical surgical instruments
US11071543B2 (en) 2017-12-15 2021-07-27 Cilag Gmbh International Surgical end effectors with clamping assemblies configured to increase jaw aperture ranges
US11033267B2 (en) 2017-12-15 2021-06-15 Ethicon Llc Systems and methods of controlling a clamping member firing rate of a surgical instrument
US10828033B2 (en) 2017-12-15 2020-11-10 Ethicon Llc Handheld electromechanical surgical instruments with improved motor control arrangements for positioning components of an adapter coupled thereto
US10779825B2 (en) 2017-12-15 2020-09-22 Ethicon Llc Adapters with end effector position sensing and control arrangements for use in connection with electromechanical surgical instruments
US11006955B2 (en) 2017-12-15 2021-05-18 Ethicon Llc End effectors with positive jaw opening features for use with adapters for electromechanical surgical instruments
US10869666B2 (en) 2017-12-15 2020-12-22 Ethicon Llc Adapters with control systems for controlling multiple motors of an electromechanical surgical instrument
US10743875B2 (en) 2017-12-15 2020-08-18 Ethicon Llc Surgical end effectors with jaw stiffener arrangements configured to permit monitoring of firing member
US10966718B2 (en) 2017-12-15 2021-04-06 Ethicon Llc Dynamic clamping assemblies with improved wear characteristics for use in connection with electromechanical surgical instruments
US11045270B2 (en) 2017-12-19 2021-06-29 Cilag Gmbh International Robotic attachment comprising exterior drive actuator
US10729509B2 (en) 2017-12-19 2020-08-04 Ethicon Llc Surgical instrument comprising closure and firing locking mechanism
US10835330B2 (en) 2017-12-19 2020-11-17 Ethicon Llc Method for determining the position of a rotatable jaw of a surgical instrument attachment assembly
US10716565B2 (en) 2017-12-19 2020-07-21 Ethicon Llc Surgical instruments with dual articulation drivers
US11020112B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Ethicon Llc Surgical tools configured for interchangeable use with different controller interfaces
USD910847S1 (en) 2017-12-19 2021-02-16 Ethicon Llc Surgical instrument assembly
US20190192151A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Ethicon Llc Surgical instrument having a display comprising image layers
US11129680B2 (en) 2017-12-21 2021-09-28 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a projector
US11076853B2 (en) 2017-12-21 2021-08-03 Cilag Gmbh International Systems and methods of displaying a knife position during transection for a surgical instrument
US12336705B2 (en) 2017-12-21 2025-06-24 Cilag Gmbh International Continuous use self-propelled stapling instrument
US11311290B2 (en) 2017-12-21 2022-04-26 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising an end effector dampener
US11045192B2 (en) 2018-08-20 2021-06-29 Cilag Gmbh International Fabricating techniques for surgical stapler anvils
US11207065B2 (en) 2018-08-20 2021-12-28 Cilag Gmbh International Method for fabricating surgical stapler anvils
US10779821B2 (en) 2018-08-20 2020-09-22 Ethicon Llc Surgical stapler anvils with tissue stop features configured to avoid tissue pinch
USD914878S1 (en) 2018-08-20 2021-03-30 Ethicon Llc Surgical instrument anvil
US10842492B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ethicon Llc Powered articulatable surgical instruments with clutching and locking arrangements for linking an articulation drive system to a firing drive system
US11039834B2 (en) 2018-08-20 2021-06-22 Cilag Gmbh International Surgical stapler anvils with staple directing protrusions and tissue stability features
US10912559B2 (en) 2018-08-20 2021-02-09 Ethicon Llc Reinforced deformable anvil tip for surgical stapler anvil
US11253256B2 (en) 2018-08-20 2022-02-22 Cilag Gmbh International Articulatable motor powered surgical instruments with dedicated articulation motor arrangements
US20200054321A1 (en) 2018-08-20 2020-02-20 Ethicon Llc Surgical instruments with progressive jaw closure arrangements
US10856870B2 (en) 2018-08-20 2020-12-08 Ethicon Llc Switching arrangements for motor powered articulatable surgical instruments
US11083458B2 (en) 2018-08-20 2021-08-10 Cilag Gmbh International Powered surgical instruments with clutching arrangements to convert linear drive motions to rotary drive motions
US11324501B2 (en) 2018-08-20 2022-05-10 Cilag Gmbh International Surgical stapling devices with improved closure members
US11291440B2 (en) 2018-08-20 2022-04-05 Cilag Gmbh International Method for operating a powered articulatable surgical instrument
US11147551B2 (en) 2019-03-25 2021-10-19 Cilag Gmbh International Firing drive arrangements for surgical systems
US11147553B2 (en) 2019-03-25 2021-10-19 Cilag Gmbh International Firing drive arrangements for surgical systems
US11696761B2 (en) 2019-03-25 2023-07-11 Cilag Gmbh International Firing drive arrangements for surgical systems
US11172929B2 (en) 2019-03-25 2021-11-16 Cilag Gmbh International Articulation drive arrangements for surgical systems
US11452528B2 (en) 2019-04-30 2022-09-27 Cilag Gmbh International Articulation actuators for a surgical instrument
US11471157B2 (en) 2019-04-30 2022-10-18 Cilag Gmbh International Articulation control mapping for a surgical instrument
US11426251B2 (en) 2019-04-30 2022-08-30 Cilag Gmbh International Articulation directional lights on a surgical instrument
US11903581B2 (en) 2019-04-30 2024-02-20 Cilag Gmbh International Methods for stapling tissue using a surgical instrument
US11253254B2 (en) 2019-04-30 2022-02-22 Cilag Gmbh International Shaft rotation actuator on a surgical instrument
US11648009B2 (en) 2019-04-30 2023-05-16 Cilag Gmbh International Rotatable jaw tip for a surgical instrument
US11432816B2 (en) 2019-04-30 2022-09-06 Cilag Gmbh International Articulation pin for a surgical instrument
US11219455B2 (en) 2019-06-28 2022-01-11 Cilag Gmbh International Surgical instrument including a lockout key
US12004740B2 (en) 2019-06-28 2024-06-11 Cilag Gmbh International Surgical stapling system having an information decryption protocol
US11350938B2 (en) 2019-06-28 2022-06-07 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising an aligned rfid sensor
US11684434B2 (en) 2019-06-28 2023-06-27 Cilag Gmbh International Surgical RFID assemblies for instrument operational setting control
US11051807B2 (en) 2019-06-28 2021-07-06 Cilag Gmbh International Packaging assembly including a particulate trap
US11464601B2 (en) 2019-06-28 2022-10-11 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising an RFID system for tracking a movable component
US11298127B2 (en) 2019-06-28 2022-04-12 Cilag GmbH Interational Surgical stapling system having a lockout mechanism for an incompatible cartridge
US11298132B2 (en) 2019-06-28 2022-04-12 Cilag GmbH Inlernational Staple cartridge including a honeycomb extension
US11399837B2 (en) 2019-06-28 2022-08-02 Cilag Gmbh International Mechanisms for motor control adjustments of a motorized surgical instrument
US11426167B2 (en) 2019-06-28 2022-08-30 Cilag Gmbh International Mechanisms for proper anvil attachment surgical stapling head assembly
US11291451B2 (en) 2019-06-28 2022-04-05 Cilag Gmbh International Surgical instrument with battery compatibility verification functionality
US11224497B2 (en) 2019-06-28 2022-01-18 Cilag Gmbh International Surgical systems with multiple RFID tags
US11627959B2 (en) 2019-06-28 2023-04-18 Cilag Gmbh International Surgical instruments including manual and powered system lockouts
US11771419B2 (en) 2019-06-28 2023-10-03 Cilag Gmbh International Packaging for a replaceable component of a surgical stapling system
US11523822B2 (en) 2019-06-28 2022-12-13 Cilag Gmbh International Battery pack including a circuit interrupter
US11638587B2 (en) 2019-06-28 2023-05-02 Cilag Gmbh International RFID identification systems for surgical instruments
US11376098B2 (en) 2019-06-28 2022-07-05 Cilag Gmbh International Surgical instrument system comprising an RFID system
US11259803B2 (en) 2019-06-28 2022-03-01 Cilag Gmbh International Surgical stapling system having an information encryption protocol
US11478241B2 (en) 2019-06-28 2022-10-25 Cilag Gmbh International Staple cartridge including projections
US11497492B2 (en) 2019-06-28 2022-11-15 Cilag Gmbh International Surgical instrument including an articulation lock
US11553971B2 (en) 2019-06-28 2023-01-17 Cilag Gmbh International Surgical RFID assemblies for display and communication
US11660163B2 (en) 2019-06-28 2023-05-30 Cilag Gmbh International Surgical system with RFID tags for updating motor assembly parameters
US11246678B2 (en) 2019-06-28 2022-02-15 Cilag Gmbh International Surgical stapling system having a frangible RFID tag
US11464512B2 (en) 2019-12-19 2022-10-11 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a curved deck surface
US11291447B2 (en) 2019-12-19 2022-04-05 Cilag Gmbh International Stapling instrument comprising independent jaw closing and staple firing systems
US11529139B2 (en) 2019-12-19 2022-12-20 Cilag Gmbh International Motor driven surgical instrument
US12035913B2 (en) 2019-12-19 2024-07-16 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a deployable knife
US11529137B2 (en) 2019-12-19 2022-12-20 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising driver retention members
US11911032B2 (en) 2019-12-19 2024-02-27 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a seating cam
US11701111B2 (en) 2019-12-19 2023-07-18 Cilag Gmbh International Method for operating a surgical stapling instrument
US11304696B2 (en) 2019-12-19 2022-04-19 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a powered articulation system
US11559304B2 (en) 2019-12-19 2023-01-24 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a rapid closure mechanism
US11234698B2 (en) 2019-12-19 2022-02-01 Cilag Gmbh International Stapling system comprising a clamp lockout and a firing lockout
US11446029B2 (en) 2019-12-19 2022-09-20 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising projections extending from a curved deck surface
US11607219B2 (en) 2019-12-19 2023-03-21 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a detachable tissue cutting knife
US11931033B2 (en) 2019-12-19 2024-03-19 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a latch lockout
US11576672B2 (en) 2019-12-19 2023-02-14 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a closure system including a closure member and an opening member driven by a drive screw
US11504122B2 (en) 2019-12-19 2022-11-22 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a nested firing member
US11844520B2 (en) 2019-12-19 2023-12-19 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising driver retention members
USD967421S1 (en) 2020-06-02 2022-10-18 Cilag Gmbh International Staple cartridge
USD974560S1 (en) 2020-06-02 2023-01-03 Cilag Gmbh International Staple cartridge
USD976401S1 (en) 2020-06-02 2023-01-24 Cilag Gmbh International Staple cartridge
USD975851S1 (en) 2020-06-02 2023-01-17 Cilag Gmbh International Staple cartridge
USD975278S1 (en) 2020-06-02 2023-01-10 Cilag Gmbh International Staple cartridge
USD975850S1 (en) 2020-06-02 2023-01-17 Cilag Gmbh International Staple cartridge
USD966512S1 (en) 2020-06-02 2022-10-11 Cilag Gmbh International Staple cartridge
US11638582B2 (en) 2020-07-28 2023-05-02 Cilag Gmbh International Surgical instruments with torsion spine drive arrangements
US12053175B2 (en) 2020-10-29 2024-08-06 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a stowed closure actuator stop
US11779330B2 (en) 2020-10-29 2023-10-10 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a jaw alignment system
US11844518B2 (en) 2020-10-29 2023-12-19 Cilag Gmbh International Method for operating a surgical instrument
US11931025B2 (en) 2020-10-29 2024-03-19 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a releasable closure drive lock
USD1013170S1 (en) 2020-10-29 2024-01-30 Cilag Gmbh International Surgical instrument assembly
US11617577B2 (en) 2020-10-29 2023-04-04 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a sensor configured to sense whether an articulation drive of the surgical instrument is actuatable
US11717289B2 (en) 2020-10-29 2023-08-08 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising an indicator which indicates that an articulation drive is actuatable
US11896217B2 (en) 2020-10-29 2024-02-13 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising an articulation lock
USD980425S1 (en) 2020-10-29 2023-03-07 Cilag Gmbh International Surgical instrument assembly
US11517390B2 (en) 2020-10-29 2022-12-06 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a limited travel switch
US11534259B2 (en) 2020-10-29 2022-12-27 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising an articulation indicator
US11452526B2 (en) 2020-10-29 2022-09-27 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a staged voltage regulation start-up system
US12471982B2 (en) 2020-12-02 2025-11-18 Cilag Gmbh International Method for tissue treatment by surgical instrument
US11744581B2 (en) 2020-12-02 2023-09-05 Cilag Gmbh International Powered surgical instruments with multi-phase tissue treatment
US11849943B2 (en) 2020-12-02 2023-12-26 Cilag Gmbh International Surgical instrument with cartridge release mechanisms
US11944296B2 (en) 2020-12-02 2024-04-02 Cilag Gmbh International Powered surgical instruments with external connectors
US11627960B2 (en) 2020-12-02 2023-04-18 Cilag Gmbh International Powered surgical instruments with smart reload with separately attachable exteriorly mounted wiring connections
US11653915B2 (en) 2020-12-02 2023-05-23 Cilag Gmbh International Surgical instruments with sled location detection and adjustment features
US11653920B2 (en) 2020-12-02 2023-05-23 Cilag Gmbh International Powered surgical instruments with communication interfaces through sterile barrier
US11678882B2 (en) 2020-12-02 2023-06-20 Cilag Gmbh International Surgical instruments with interactive features to remedy incidental sled movements
US11890010B2 (en) 2020-12-02 2024-02-06 Cllag GmbH International Dual-sided reinforced reload for surgical instruments
US11737751B2 (en) 2020-12-02 2023-08-29 Cilag Gmbh International Devices and methods of managing energy dissipated within sterile barriers of surgical instrument housings
US11925349B2 (en) 2021-02-26 2024-03-12 Cilag Gmbh International Adjustment to transfer parameters to improve available power
US11701113B2 (en) 2021-02-26 2023-07-18 Cilag Gmbh International Stapling instrument comprising a separate power antenna and a data transfer antenna
US12324580B2 (en) 2021-02-26 2025-06-10 Cilag Gmbh International Method of powering and communicating with a staple cartridge
US12108951B2 (en) 2021-02-26 2024-10-08 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a sensing array and a temperature control system
US11950777B2 (en) 2021-02-26 2024-04-09 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising an information access control system
US11812964B2 (en) 2021-02-26 2023-11-14 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a power management circuit
US11950779B2 (en) 2021-02-26 2024-04-09 Cilag Gmbh International Method of powering and communicating with a staple cartridge
US11744583B2 (en) 2021-02-26 2023-09-05 Cilag Gmbh International Distal communication array to tune frequency of RF systems
US11723657B2 (en) 2021-02-26 2023-08-15 Cilag Gmbh International Adjustable communication based on available bandwidth and power capacity
US11730473B2 (en) 2021-02-26 2023-08-22 Cilag Gmbh International Monitoring of manufacturing life-cycle
US11749877B2 (en) 2021-02-26 2023-09-05 Cilag Gmbh International Stapling instrument comprising a signal antenna
US11751869B2 (en) 2021-02-26 2023-09-12 Cilag Gmbh International Monitoring of multiple sensors over time to detect moving characteristics of tissue
US11793514B2 (en) 2021-02-26 2023-10-24 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising sensor array which may be embedded in cartridge body
US11980362B2 (en) 2021-02-26 2024-05-14 Cilag Gmbh International Surgical instrument system comprising a power transfer coil
US11696757B2 (en) 2021-02-26 2023-07-11 Cilag Gmbh International Monitoring of internal systems to detect and track cartridge motion status
US11723658B2 (en) 2021-03-22 2023-08-15 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising a firing lockout
US11717291B2 (en) 2021-03-22 2023-08-08 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising staples configured to apply different tissue compression
US11826042B2 (en) 2021-03-22 2023-11-28 Cilag Gmbh International Surgical instrument comprising a firing drive including a selectable leverage mechanism
US11826012B2 (en) 2021-03-22 2023-11-28 Cilag Gmbh International Stapling instrument comprising a pulsed motor-driven firing rack
US11737749B2 (en) 2021-03-22 2023-08-29 Cilag Gmbh International Surgical stapling instrument comprising a retraction system
US11806011B2 (en) 2021-03-22 2023-11-07 Cilag Gmbh International Stapling instrument comprising tissue compression systems
US11759202B2 (en) 2021-03-22 2023-09-19 Cilag Gmbh International Staple cartridge comprising an implantable layer
US11896219B2 (en) 2021-03-24 2024-02-13 Cilag Gmbh International Mating features between drivers and underside of a cartridge deck
US11849944B2 (en) 2021-03-24 2023-12-26 Cilag Gmbh International Drivers for fastener cartridge assemblies having rotary drive screws
US11786243B2 (en) 2021-03-24 2023-10-17 Cilag Gmbh International Firing members having flexible portions for adapting to a load during a surgical firing stroke
US11944336B2 (en) 2021-03-24 2024-04-02 Cilag Gmbh International Joint arrangements for multi-planar alignment and support of operational drive shafts in articulatable surgical instruments
US11903582B2 (en) 2021-03-24 2024-02-20 Cilag Gmbh International Leveraging surfaces for cartridge installation
US11832816B2 (en) 2021-03-24 2023-12-05 Cilag Gmbh International Surgical stapling assembly comprising nonplanar staples and planar staples
US11857183B2 (en) 2021-03-24 2024-01-02 Cilag Gmbh International Stapling assembly components having metal substrates and plastic bodies
US11793516B2 (en) 2021-03-24 2023-10-24 Cilag Gmbh International Surgical staple cartridge comprising longitudinal support beam
US11896218B2 (en) 2021-03-24 2024-02-13 Cilag Gmbh International Method of using a powered stapling device
US11786239B2 (en) 2021-03-24 2023-10-17 Cilag Gmbh International Surgical instrument articulation joint arrangements comprising multiple moving linkage features
US12102323B2 (en) 2021-03-24 2024-10-01 Cilag Gmbh International Rotary-driven surgical stapling assembly comprising a floatable component
US11849945B2 (en) 2021-03-24 2023-12-26 Cilag Gmbh International Rotary-driven surgical stapling assembly comprising eccentrically driven firing member
US11744603B2 (en) 2021-03-24 2023-09-05 Cilag Gmbh International Multi-axis pivot joints for surgical instruments and methods for manufacturing same
US11723662B2 (en) 2021-05-28 2023-08-15 Cilag Gmbh International Stapling instrument comprising an articulation control display
US12279845B2 (en) 2021-10-18 2025-04-22 Cilag Gmbh International Cable-driven actuation system for robotic surgical tool attachment
US12239317B2 (en) 2021-10-18 2025-03-04 Cilag Gmbh International Anvil comprising an arrangement of forming pockets proximal to tissue stop
US11957337B2 (en) 2021-10-18 2024-04-16 Cilag Gmbh International Surgical stapling assembly with offset ramped drive surfaces
US11877745B2 (en) 2021-10-18 2024-01-23 Cilag Gmbh International Surgical stapling assembly having longitudinally-repeating staple leg clusters
US11980363B2 (en) 2021-10-18 2024-05-14 Cilag Gmbh International Row-to-row staple array variations
US12251105B2 (en) 2021-10-20 2025-03-18 Cilag Gmbh International Lockout arrangements for surgical instruments
US11937816B2 (en) 2021-10-28 2024-03-26 Cilag Gmbh International Electrical lead arrangements for surgical instruments
US12089841B2 (en) 2021-10-28 2024-09-17 Cilag CmbH International Staple cartridge identification systems
US12432790B2 (en) 2021-10-28 2025-09-30 Cilag Gmbh International Method and device for transmitting UART communications over a security short range wireless communication

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4018653A (en) 1971-10-29 1977-04-19 U.S. Packaging Corporation Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4424279A (en) 1982-08-12 1984-01-03 Quidel Rapid plunger immunoassay method and apparatus
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE236249T1 (de) 1989-09-12 2003-04-15 Hoffmann La Roche Tfn-bindende proteine
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
ATE285475T1 (de) 1994-02-04 2005-01-15 Bio Merieux Msrv1 virus der mit multipler sklerose verbunden ist, seine nukleären bestandteile und verwendungen
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
DE69635480T2 (de) 1995-06-29 2006-08-17 Immunex Corp., Thousand Oaks Apoptosis induzierendes cytokin
US6284236B1 (en) 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
US6030945A (en) 1996-01-09 2000-02-29 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
US6998116B1 (en) 1996-01-09 2006-02-14 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
AU731553B2 (en) 1996-10-25 2001-04-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine alpha
DE951551T1 (de) 1996-12-23 2000-09-14 Immunex Corp., Seattle Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie
EP1862548A1 (en) 1997-01-28 2007-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 4 (DR4 : death receptor 4), member of the TNF-receptor superfamily and binding to trail (APO2-L)
US6433147B1 (en) 1997-01-28 2002-08-13 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor-4
US6072047A (en) 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US20020160446A1 (en) 2000-11-14 2002-10-31 Holtzman Douglas A. Novel genes encoding proteins having prognostic diagnostic preventive therapeutic and other uses
US6313269B1 (en) 1997-03-14 2001-11-06 Smithkline Beecham Corporation Tumor necrosis factor related receptor, TR6
US20010010924A1 (en) 1997-03-14 2001-08-02 Keith Charles Deen Tumor necrosis factor related receptor, tr6 polynecleotides
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
NZ337795A (en) 1997-03-17 2001-06-29 Human Genome Sciences Inc Death domain containing receptor 5 and it's use in the treatment of DR5 related disease
ES2284203T5 (es) 1997-04-16 2016-03-11 Amgen Inc. Proteínas de unión a osteoprotegerina y sus receptores
AU7126498A (en) 1997-04-16 1998-11-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tumor necrosis factor receptor related proteins tango-63d and tango-63e
IL132067A0 (en) 1997-05-15 2001-03-19 Genentech Inc Apo-2 receptor
US6342369B1 (en) 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
JP2002508663A (ja) 1997-06-18 2002-03-19 ジェネンテク，インコーポレイテッド Ａｐｏ−２ＤｃＲ
WO1999002653A1 (en) 1997-07-11 1999-01-21 Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
CA2301202A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
ES2331900T3 (es) 1997-08-26 2010-01-19 Genentech, Inc. Receptor rtd.
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
DK1053256T3 (da) 1998-01-26 2011-10-03 Genentech Inc Antistoffer mod Dødsreceptor 4 (DR4) og anvendelser deraf
US6252050B1 (en) 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
IL146448A0 (en) 1999-05-28 2002-07-25 Genentech Inc Dr4 antibodies and uses thereof
ES2392392T3 (es) 1999-06-28 2012-12-10 Genentech, Inc. Métodos para producir ligando Apo-2 utilizando iones metálicos divalentes
AU2001235565A1 (en) * 2000-01-20 2001-07-31 Rhodia Chimie Method for obtaining slightly coloured branched polyisocyanate(s), and resultingcomposition
RU2169006C1 (ru) * 2000-02-22 2001-06-20 Московский НИИ глазных болезней имени Гельмгольца Способ лечения увеальной меланомы
AU2001249727A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for detecting and quantifying gene expression
US7279160B2 (en) * 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
WO2002097033A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
DE60232660D1 (de) * 2001-07-03 2009-07-30 Genentech Inc Humane dr4-antikörper und deren anwendungen
US6903126B2 (en) 2001-07-09 2005-06-07 Schering Ag 1-Aryl-2-N-, S- or O-substituted benzimidazole derivatives, their use for the production of pharmaceutical agents as well as pharmaceutical preparations that contain these derivatives
ES2357225T3 (es) 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
EP1506285B1 (en) 2001-11-01 2010-12-08 Uab Research Foundation Combinations of anti-dr5 antibodies and anti-dr4 antibodies and other therapeutic agents
WO2003042367A2 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors

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