ES2364010A1 - Mutantes de la adn polimerasa mu. - Google Patents
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Abstract
Mutantes de la ADN polimerasa MU.Se describen mutantes de la ADN polimerasa mu (Pol{mu}) que presentan una mayor actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal que la enzima silvestre (wt) y mejoran su potencialidad como herramienta molecular. Dichos mutantes pueden ser utilizados, entre otras aplicaciones, en técnicas de marcaje de polinucleótidos o de reunión de extremos protuberantes y romos.
Description
Mutantes de la ADN polimerasa mu.
La presente invención se refiere a la
identificación de mutantes de la ADN polimerasa mu humana (Pol\mu)
y a los usos de los mismos. Estos mutantes presentan características
mejoradas respecto a la versión silvestre de dicha polimerasa que
mejoran su potencialidad como herramienta molecular.
La estabilidad de la información genética no
sólo depende de la fiabilidad de los sistemas de replicación sino
también de la existencia de múltiples sistemas de reparación, que
corrigen la mayoría de los tipos de daños que se producen en el ADN.
Además de estos sistemas de reparación, es evidente la existencia de
reacciones enzimáticas alternativas que de algún modo contrarrestan
los efectos de los primeros, generando variabilidad en el ADN. Una
de las enzimas implicadas en este tipo de procesos es la
desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT)
involucrada en los procesos de generación de diversidad y que
selectivamente actúa sobre aquellos genes codificantes de receptores
de antígenos (Komori et al. (1993). Science, 261,
1171-1175).
La TdT es una enzima de 58 kDa que normalmente
sólo se encuentra presente en linfocitos B y T inmaduros. Esta
enzima cataliza la adición de desoxinucleótidos en el extremo 3'OH
terminal de las cadenas de oligonucleótidos sin necesidad de una
hebra de ADN molde (actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal), generando
así diversidad en los receptores de antígenos de las referidas
células de defensa del sistema inmune. Esta actividad de TdT ha
permitido que esta polimerasa haya sido ampliamente utilizada como
herramienta molecular, especialmente, en técnicas de mareaje de
ADN.
Una de estas técnicas de mareaje es el ensayo
TUNEL que se basa en el principio de que la TdT incorpora
desoxiuridina marcada (e.g. dUTP-biotina) en los
extremos 3'OH de roturas de cadenas dobles y simples del ADN. La
incorporación de dUTP marcada actúa como una señal que puede ser
detectada fácilmente, por ejemplo, a través de técnicas de
fluorescencia. Cuantas más roturas tenga el ADN mayor será la señal
resultante. Esta técnica permite, entre otras aplicaciones,
identificar muestras que están sufriendo procesos apoptóticos o
medir la calidad de una muestra biológica.
Desde el descubrimiento de la TdT, han sido
pocas las enzimas con actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal encontradas en
la naturaleza y, actualmente, ésta es la única que se comercializa a
gran escala (e.g. Roche Applied Science, Promega,
Invitrogen).
En el año 2000, una nueva polimerasa con
actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal y
perteneciente a la familia X de las ADN polimerasas, la
polimerasa mu (Pol\mu), fue identificada y secuenciada por
primera vez (Domínguez et al, (2000) Embo J, 19,
1731-1742). Sin embargo, aunque se puede decir
que existe una amplia similitud estructural entre Pol\mu y TdT, la
actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal de
esta nueva enzima es comparativamente muy inferior a la de la TdT.
Este hecho ha imposibilitado su incorporación al mercado como una
alternativa viable a la TdT, siendo todavía necesario el
descubrimiento o desarrollo de nuevas enzimas que presenten esta
actividad mejorada o incrementada. Hasta la fecha, únicamente el
mutante simple de Pol\mu humana, R387K, presenta una actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal superior a la
polimerasa silvestre y similar a la de la TdT (María José
Martín et al. Gordon Research Conference on
Mutagenesis 07/20/2008 - 07/25/2008 at Magdalen College in
Oxford. "Rate limited terminal transferase activity of
human Pol \mu: contribution to imprecise
end-joining of non-complementary
ends").
Los autores de la presente invención han
desarrollado mutantes de Pol\mu que presentan una mayor actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal que la enzima
silvestre o wildtype (Pol\mu wt:
UniProtKB/Swiss-Prot Q9NP87: SEQ ID NO: 17) e
incluso que la propia TdT. Concretamente, la invención proporciona
varios mutantes de Pol\mu con una elevada actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal, superior a la
de la Pol\mu wt, que pueden ser empleados, entre otras, en
técnicas de mareaje de polinucleótidos o de reunión de extremos
protuberantes y romos (End joining).
Así, en un primer aspecto de la presente
invención, se proporcionan mutantes de Pol\mu (en adelante,
mutantes de la invención) que tienen al menos alrededor de un 10%
más de actividad desoxinucleotidil-transferasa
terminal que la Pol\mu wt, preferentemente la Pol\mu humana.
Preferentemente, dicha actividad es al menos alrededor de un 25%,
50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% superior a la de la Pol\mu
wt. Del mismo modo, los mutantes de la invención también tienen una
actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal
igual o superior a la del mutante R387K (en adelante, también
referido como mutante R), preferentemente dicha actividad es
al menos alrededor de un 10% superior y, más preferentemente, al
menos alrededor de un 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300% superior.
Estos mutantes en combinación o individualmente son susceptibles de
ser empleados como herramientas moleculares, preferentemente, en
cualquiera de las técnicas en que se utiliza la TdT, bien como
sustitutivos de ésta o en combinación con la
misma.
misma.
En un segundo aspecto de la invención se
proporciona una secuencia polinucleotídica (en adelante, secuencia
polinucleotídica o polinucleótido de la invención) que codifica-
cualquiera de los mutantes de la invención. Del mismo modo, también
forman de parte de la invención cualquier: i) vector que comprenda
al polinucleótido de la invención o ii) célula huésped que comprenda
la secuencia polinucleotídica de la invención o un vector de acuerdo
con la invención.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a
un método para la producción de los mutantes de la invención que
preferentemente comprende: i) el cultivo de una célula huésped de
acuerdo con la invención y ii) el aislamiento del mutante
producido.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al
empleo de los mutantes de la invención como herramienta molecular,
preferentemente, en todas aquellas técnicas donde participa la TdT,
bien como sustitutivos de ésta o en combinación con la misma. Más
concretamente, los mutantes de la invención en combinación o
individualmente son susceptibles de ser empleados en ensayos de: i)
mareaje de extremos de polinucleótidos de cadena simple
(heteropolímeros u homopolímeros) y cadena doble (extremos
protuberantes o romos), ii) reunión de extremos protuberantes y
romos, iii) polimerización dependiente o independiente de molde, iv)
rellenado de gaps o huecos (gap-filling), v)
detección de roturas de ADN (mismatch detection; e.g. TUNEL),
vi) mutagénesis o generación de variabilidad, etc.
Un quinto aspecto de la invención proporciona
kits que comprenden cualquiera de los mutantes de la invención,
preferentemente, para llevar a cabo cualquiera de los ensayos
referidos en el párrafo anterior. Adicionalmente, además de los
componentes necesarios para poner en marcha el correspondiente
ensayo (e.g. tampones, cebadores, dNTPs, ddNTPs, marcadores, etc.),
los kits pueden comprender TdT o mutantes de la misma. El empleo de
dichos kits para las aplicaciones previamente mencionadas, por
ejemplo, en ensayos de: i) mareaje de extremos de polinucleótidos de
cadena simple (heteropolímeros u homopolímeros) y cadena doble
(extremos protuberantes o romos), ii) reunión de extremos
protuberantes y romos, iii) polimerización dependiente o
independiente de molde, iv) rellenado de gaps o huecos
(gap-filling), v) detección de roturas de ADN
(mismatch detection; e.g. TUNEL), vi) mutagénesis o
generación de variabilidad, etc., constituye un aspecto adicional de
esta invención.
El término "actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal" o
"actividad transferasa terminal" se define como la capacidad de
llevar a cabo reacciones de polimerización independiente de molde,
añadiendo nucleótidos a un extremo 3'OH sin ser éstos seleccionados
por ningún criterio de complementariedad de bases. Esta actividad
puede ser medida mediante diferentes ensayos sobre diferentes tipos
de sustratos, preferentemente, sobre ADN de cadena simple
homopoliméricas (ver Ejemplos 1 y 3). A lo largo de la descripción,
cuando se indica que esta actividad se encuentra incrementada o
mejorada implica que ésta es al menos un 10% más elevada que la de
la Pol\mu wt, preferentemente que la de la Pol\mu humana.
Preferentemente, dicha actividad es al menos alrededor de un 25%,
50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% superior a la de Pol\mu wt,
preferentemente que la de la Pol\mu humana.
El término "identidad" o "tanto por
ciento (%) de identidad" hace referencia a dos o más secuencias o
subsecuencias que tienen en común un porcentaje específico de
aminoácidos o nucleótidos, cuando éstas son comparadas y alineadas
para encontrar la máxima correspondencia entre ambas. Este parámetro
puede ser medido mediante técnicas de comparación de secuencia
sobradamente conocidas en el estado de la técnica, preferentemente
mediante los algoritmos BLAST o FASTA, empleando los parámetros
cargados por defecto.
El término "vector" hace referencia a un
polinucleótido lineal o circular (e.g. plásmidos, cromosoma
bacteriano) que comprende una secuencia polinucleotídica, donde
preferentemente dicho vector está adaptado para la amplificación,
replicación y/o expresión de dicho polinucleótido. Además, estos
vectores pueden contener regiones que permitan controlar o potencien
la amplificación, expresión y/o replicación del polinucleótido, así
como otras que faciliten o promuevan la excreción o captura de los
polipéptidos resultantes de la expresión del polinucleótido.
El término "célula huésped" hace referencia
a una célula o grupo de células (eucariota o procariota) que
contiene un vector o polinucleótido según la presente invención.
El término "polinucleótidos" hace
referencia tanto a polímeros de ADN como de ARN de cadena doble o
simple. Ambos polímeros cuando están en forma de cadena doble pueden
tener extremos romos o protuberantes.
El término "nucleótidos" hace referencia a
ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos (dNTPs) o
didesoxinucleótidos (ddNTPs) que, preferentemente, se encuentran
marcados o modificados para permitir su identificación y/o
seguimiento. Preferentemente, el mareaje de los nucleótidos es
realizado con fluoróforos (e.g. Cy3, Cy5, fluoresceína) o biotina. A
lo largo de la descripción cuando los nucleótidos están marcados con
fluoróforos, éstos son referidos como nucleótidos fluorescentes.
El término "análogos de nucleótido" hace
referencia a compuestos o moléculas que, para una aplicación
concreta, se comportan de una manera similar o análoga a un
nucleótido y que no tienen una estructura particular o específica,
aunque preferentemente su estructura permite la detección de su
incorporación a polinucleótidos y/o la parada de la reacción de
polimerización. Ejemplos de estos compuestos pueden ser encontrados
en otras solicitudes como WO95/07920, WO2005/051530,
WO2008/016909.
El término "ortólogo" hace referencia a
proteínas o genes que codifican para dichas proteínas, con actividad
transferasa terminal, que comparten al menos alrededor de un 40% de
identidad con la Pol\mu wt, preferentemente con la Pol\mu
humana, y en realizaciones sucesivamente más preferidas al menos
alrededor de un 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%.
El término "mutación" preferentemente hace
referencia a sustituciones, inserciones o deleciones que se producen
a nivel de polipéptidos o polinucleótidos que expresan dichos
polipéptidos. Estas mutaciones cuando se producen a nivel de un
único aminoácido o triplete que lo codifica son denominadas como
puntuales. Dentro las mutaciones puntuales se puede diferenciar
entre las conservativas y las no conservativas, entendiéndose a las
primeras como aquéllas que se producen cuando un aminoácido es
sustituido por otro de similares características, según la Tabla
1.
La expresión "alrededor de", tal y como se
usa a lo largo de la descripción, hace referencia a la variación de
entre el \pm 5% que puede presentar un valor dado (e.g., identidad
o actividad), preferentemente entre el \pm 3% y más
preferentemente \pm1%.
El término "sustancialmente", tal y como se
usa a lo largo de la descripción, hace referencia a la variación de
entre el \pm 10% que puede presentar un valor dado (e.g.
actividad), preferentemente entre el \pm 5% y más preferentemente
\pm 1%.
Los términos "fragmentos" o
"subsecuencias" hacen referencia porciones de polipéptidos o
polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos, que
mantienen la actividad transferasa terminal incrementada o
sustancialmente incrementada.
La figura 1 muestra la actividad transferasa
terminal de cada uno de los mutantes
[\mu-R387K-F389G, \muQ275M,
\muR387K-Q275M,
\muR387K-Chloop1, \mu-N457D,
\mu-S458N y
\mu-N457D-S458N (Ejemplo 1)], en
comparación con la de la Pol\mu wt y la de la TdT comercial.
La figura 2 muestra la actividad transferasa
terminal de los mutantes dobles (\mu-R387K/Q275M y
\mu-R387K/
Chloop1) a dosis decrecientes de polimerasa (400 nM, 200 nM y 100 nM).
Chloop1) a dosis decrecientes de polimerasa (400 nM, 200 nM y 100 nM).
La figura 3 muestra la actividad transferasa
terminal de los mutantes dobles (\mu-R387K/Q275M y
\mu-R3 87K/
Chloop1) y de los mutantes simples (\mu-R387K, \mu-Chloop1 y \mu-Q275M y en comparación con la de la Pol\mu wt, con cada uno de los 4 dNTPs por separado.
Chloop1) y de los mutantes simples (\mu-R387K, \mu-Chloop1 y \mu-Q275M y en comparación con la de la Pol\mu wt, con cada uno de los 4 dNTPs por separado.
La figura 4 muestra la actividad transferasa
terminal de los mutantes dobles (\mu-R387K/F389G,
\mu-R387K/Q275M y
\mu-R387K/Chloop1) y de los mutantes simples
(\mu-R387K y \mu-Q275M), en
comparación con la de la Pol\mu wt, con cada uno los 4 dNTPS en
presencia de Co^{2+} como metal activador.
La figura 5 muestra los resultados del ensayo
realizado para comparar si los mutantes dobles
(M3=\mu-R387K/
Q275M; M7=\mu-R387K/Chloop1) y simples (R= \mu-R387K; Ch=\mu-Chloop1; M2= \mu-Q275M) tienen afectada su capacidad de polimerización dependiente de molde respecto a la de Pol\mu wt.
Q275M; M7=\mu-R387K/Chloop1) y simples (R= \mu-R387K; Ch=\mu-Chloop1; M2= \mu-Q275M) tienen afectada su capacidad de polimerización dependiente de molde respecto a la de Pol\mu wt.
La figura 6 muestra la dependencia de molde de
los mutantes dobles (M3 y M7) y de los mutantes simples (R, Ch y M2)
en el contexto de un gap de ADN de 1 nucleótido con
fosfato.
La figura 7 muestra los resultados del ensayo de
mareaje con derivados fluorescentes del DNA o de ddNTPs, con los
mutantes indicados de Pol\mu (M1-M7), junto con
Pol\mu wt y TdT sobre polinucleótidos de cadena sencilla.
La figura 8 muestra los resultados del ensayo de
mareaje con derivados fluorescentes del DNA o de ddNTPs, con los
mutantes indicados de Pol\mu (R, Ch, M2, M3 y M7), sobre
polinucleótidos de cadena sencilla.
La figura 9 muestra los resultados del ensayo de
mareaje con derivados fluorescentes del DNA o de ddNTPs, con los
mutantes indicados de Pol\mu (R, Ch, M2, M3 y M7), sobre
polinucleótidos de cadena sencilla.
La figura 10 muestra los resultados del ensayo
de mareaje con derivados fluorescentes del DNA o de ddNTPs, con los
mutantes indicados de Pol\mu (R, Ch, M2, M3 y M7), sobre
polinucleótidos de cadena sencilla.
La figura 11 muestra cómo la reacción de mareaje
con M3 y M7 es altamente eficaz con los 4 ddNTPs fluorescentes,
tanto en presencia de Mn^{2+} como de Co^{2+}.
La figura 12 muestra el alineamiento de las
secuencias polipeptídicas de Pol\mu wt de Mus musculus, Rattus
norvegicus y Bos taurus con el mutante M3. En la parte
superior, la flecha indica el aminoácido 275 de Pol\mu wt humana.
En la parte inferior, la flecha indica el aminoácido 387 de Pol\mu
wt humana.
La figura 13 muestra el alineamiento de las
secuencias polipeptídicas de Pol\mu wt humana y la TdT de origen
humano, murino y bovino. Las flechas muestran la posición de los
aminoácidos 275, 387, 457 y 458 en la Pol\mu wt humana.
La figura 14 muestra la estructura
tridimensional de la Pol\mu wt humana. A) la flecha indica la
posición del aminoácido R387, B) la flecha indica la posición del
aminoácido Q275, C) la flecha indica la posición del aminoácido N457
y D) la flecha indica la posición del aminoácido S458.
La enzima TdT, también conocida como
deoxinucleotidil-transferasa terminal o transferasa
terminal, es una ADN polimerasa especializada que se expresa
fundamentalmente en linfocitos B y T inmaduros, además de en
determinados tipos de tumores. Hasta el descubrimiento de la
Pol\mu en el año 2000 por el laboratorio del Dr. Luis Blanco
(Domínguez et al, (2000)), la TdT era la única
polimerasa conocida con capacidad de adicionar o unir nucleótidos a
un extremo 3 'OH de polinucleótidos sin requerir una cadena molde.
Sin embargo, tal y como se ha mencionado anteriormente, la baja
actividad deoxinucleotidil transferasa terminal de Pol\mu wt en
comparación con la TdT ha imposibilitado que, hasta la fecha, esta
enzima haya podido convertirse en una alternativa viable a la
TdT.
En la presente invención se presentan una serie
de mutantes de Pol\mu wt que aumentan la actividad
deoxinucleotidil transferasa terminal de la Pol\mu silvestre e
incluso de la TdT. Preferentemente, dichos mutantes proceden o se
derivan de la Pol\mu wt humana, aunque también pueden ser
obtenidos a partir de la Pol\mu de otros vertebrados (polimerasas
ortólogas de Pol\mu), preferentemente mamíferos, tales como Mus
musculus, Rattus norvegicus, Bos taurus, entre
otros.
otros.
La obtención de mutantes, a partir de
polimerasas ortólogas a la Pol\mu wt humana (o del gen que las
codifica) y la enseñaza de la presente invención, puede ser llevada
a cabo de manera simple por un experto en la materia, tal y como se
explica en el Ejemplo 12. Del mismo modo, nuevos mutantes con la
actividad transferasa terminal incrementada, tal como sucede con los
mutantes de la presente invención, pueden ser también obtenidos
fácilmente, tal y como se muestra en el Ejemplo 13.
TdT y Pol\mu wt son dos enzimas que pertenecen
a la familia X de ADN polimerasa que se caracterizan por ser de
pequeño tamaño (entre 39 y 66 KDa), siendo ambas en general bastante
imprecisas durante la síntesis de ADN. Son enzimas distributivas con
poca capacidad para sintetizar más que unas pocas bases antes de
disociarse del ADN. Además de pertenecer a la misma familia y tener
actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal,
estas polimerasas presentan un dominio BRCT (Dominio
C-terminal de BRCA1), implicado en la interacción
proteína-proteína, que no se encuentra presente en
otros miembros de la familia X como la polimerasa beta (Pol\beta).
Cuando este dominio es eliminado junto con el resto del extremo
amino (NH2- BRCT-) e incluso con parte del dominio 8 KDa (NH2- BRCT-
KDa-) la actividad TdT de estas enzimas no se ve afectada (ver tabla
2).
El dominio de 8 KDa es también característico de
las enzimas de esta familia, encontrándose presente tanto en
Pol\mu wt como en TdT. Este dominio confiere a estas polimerasas
la capacidad de anclaje a los gaps que se producen en el ADN,
permitiéndoles realizar de manera efectiva su actividad biológica.
Incluso, la distribución de aminoácidos entre los diferentes
dominios de estas dos enzimas es bastante similar, tal y como se
puede ver en la Tabla 2.
A pesar de las claras similitudes estructurales
existentes entre ambas proteínas, el grado de identidad que
comparten se encuentra en torno al 40% y, por tanto, presentan un
gran número de aminoácidos diferentes o no conservados
(aproximadamente 300). Mediante alineamiento y comparación de
secuencias entre TdT y Pol\mu wt, los autores de la presente
invención identificaron y seleccionaron un grupo de aminoácidos
conservados en Pol\mu wt y TdT, pero diferentes entre ambas
enzimas. Dichos aminoácidos se revertieron en Pol\mu wt hacia el
aminoácido de TdT para así obtener una serie de mutantes simples y
dobles con una potencial mejor actividad
desoxinucleotidil-transferasa terminal. Además de
estos mutantes puntuales, se generó otro mutante que comprendía una
mutación puntual y la sustitución del subdominio
loop-1 por el mismo subdominio de TdT (ver Tabla 2).
El ensayo de estos mutantes ha ofrecido resultados sorprendentes en
cuanto a su actividad desoxinucleotidil-transferasa
terminal, de tal modo que la presente invención aporta una serie de
mutantes de Pol\mu que presentan una mayor actividad transferasa
terminal que Pol\mu wt e incluso que la propia TdT.
Así en un primer aspecto de la presente
invención, los mutantes de la invención tienen al menos alrededor de
un 10% más de actividad
desoxinucleotidil-transferasa terminal que la
Pol\mu wt, preferentemente que la Pol\mu wt humana.
Preferentemente, dicha actividad es al menos alrededor de un 25%,
50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% superior a la de la Pol\mu
wt. Del mismo modo, los mutantes de la invención también tienen una
actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal
igual o superior a la del mutante R, preferentemente dicha
actividad es al menos alrededor de un 10% superior y, más
preferentemente, al menos alrededor de un 25%, 50%, 75%, 100%, 200%,
300% superior. Estos mutantes, en combinación o individualmente, son
susceptibles de ser empleados como herramientas moleculares,
preferentemente, en cualquiera de las técnicas en las que se utiliza
TdT, como sustitutivos de ésta o en combinación con la misma. En una
realización preferida de este aspecto de la invención los mutantes
comprenden al menos dos mutaciones.
En una realización preferida, los mutantes de
Pol\mu comprenden una secuencia polipeptídica con al menos un 60%
de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 17 (Pol\mu wt:
UniProtKB/Swiss-Prot Q9NP87), o con cualquiera de
sus subsecuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, o con fragmentos de las
mismas, donde dichos mutantes comprenden al menos dos mutaciones y
mantienen una actividad transferasa terminal incrementada.
Preferentemente, dichas mutaciones son (i) una primera mutación
puntual en la posición 387 y (ii) una segunda mutación que consiste
en:
- a)
- una mutación puntual en un aminoácido conservado de Pol\mu, donde preferentemente dicha mutación puntual consiste en una reversión hacia el aminoácido homólogo presente en TdT, o
- b)
- una mutación en el subdominio loop-1.
En realizaciones más preferidas el grado de
identidad de los mutantes de Pol\mu con la secuencia Q9NP87,
cualquiera de sus subsecuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, o
fragmentos de las mismas es alrededor de al menos un 65,% 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,
100%.
También, preferentemente, la primera mutación
puntual (i) de los mutantes de Pol\mu consiste en la sustitución
del aminoácido que se encuentra en la posición 387 por cualquiera de
los aminoácidos seleccionados del grupo que comprende: Glutamina,
Asparragina, Cisteína, Treonina, Serina, Metionina, Lisina,
Arginina, Histidina o análogos de los mismos, aunque todavía más
preferentemente dicha mutación puntual consiste en la sustitución o
reversión R387K (mutación no conservativa).
Preferentemente, la segunda mutación (ii)
correspondiente a la mutación puntual (a) se localiza en la posición
275. Preferentemente, esta mutación consiste en la sustitución del
aminoácido que se encuentra en dicha posición (275) por cualquiera
de los aminoácidos seleccionados del grupo que comprende: Glutamina,
Asparragina, Cisteína, Treonina, Serina, Metionina o análogos de los
mismos, aunque todavía más preferentemente dicha mutación puntual
consiste en la sustitución Q275M (mutación conservativa).
En otra realización también preferida, la
segunda mutación (ii) consiste en (b) una mutación en el subdominio
loop-1, tal como la sustitución o modificación del
subdominio loop-1 o fragmentos del mismo por: i) una
secuencia con al menos alrededor de un 10% de identidad con la SEQ
ID NO: 3 (loop-1 de Pol\mu), preferentemente, con
al menos alrededor de un 15%, 20%, 25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%,
85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o ii) por una secuencia con al
menos alrededor de un 10% de identidad con la SEQ ID NO: 4
(loop-1 de TdT), preferentemente, con al menos
alrededor de un 15%, 20%, 25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99%. En una realización particular, dicha
secuencia es la SEQ ID NO:4, la cual comparte alrededor de un 20% de
identidad con la SEQ ID NO:3.
Más específicamente, los mutantes de la
invención tienen las secuencias SEQ ID NO:5, que comprende las
mutaciones puntuales R387K y Q275M (en adelante, mutante M3),
o SEQ ID NO:6, que comprende la mutación puntual R387K y la
inserción del loop-1 de TdT en el lugar del
loop-1 de Pol\mu (en adelante, mutante M7).
Del mismo modo, la invención también comprende fragmentos o
subsecuencias de las secuencias SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 que
comprendan las referidas mutaciones y, preferentemente, mantengan
sustancialmente su actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal incrementada.
Preferentemente dichos fragmentos tienen las secuencias SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO:10.
De acuerdo con la invención, ésta también
proporciona un mutante que comprende una secuencia polipeptídica con
al menos un 60% de identidad con la secuencia Q9NP87 (Pol\mu wt
humana: SEQ ID NO: 17) y al menos una mutación puntual en la
posición 275, donde dicho mutante presenta una actividad
deoxinucleotidil-transferasa terminal mejorada o
incrementada. Esta actividad es al menos alrededor de un 10%, 25%,
50%, 75%, 100%, 200%, 300% superior a la de la Pol\mu wt.
Preferentemente, dicha mutación en la posición 275 consiste en la
sustitución del aminoácido que se encuentra en dicha posición por
Glutamina, Asparragina, Cisteína, Treonina, Serina, Glicina,
Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Metionina, Prolina,
Fenilalanina y Triptófano, aunque todavía más preferentemente dicha
mutación puntual consiste en la sustitución Q275M. Más
específicamente, este mutante tiene la secuencia SEQ ID NO:11 (en
adelante, mutante M2) o fragmentos de la misma que comprendan
la mutación en la posición 275 y, preferentemente, mantengan
sustancialmente su actividad transferasa terminal incrementada.
Ejemplos de estos fragmentos o subsecuencias son las secuencias SEQ
ID NO:12 y la SEQ ID NO: 13.
Un segundo aspecto de la invención proporciona
una secuencia polinucleotídica que codifica cualquiera de los
mutantes de la invención. Del mismo modo, también forman parte de la
invención: (i) un vector, que comprende cualquiera de las secuencias
polinucleotídicas de acuerdo con la invención, y (ii) una célula
huésped que comprende cualquiera de las secuencias polinucleótidicas
o vectores de la invención.
Más concretamente, la secuencia polinucleotídica
de la invención comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:15, o SEQ ID NO:16, las cuales codifican respectivamente
para los mutantes M3, M7 y M2. También forman parte de la invención
las subsecuencias o fragmentos de la secuencia polinucleotídica de
la invención que codifique para cualquiera de las subsecuencias o
fragmentos de los mutantes de la invención. Todas estas secuencias y
subsecuencias pueden ser modificadas mediante mutaciones silenciosas
(e.g. mutaciones puntuales, deleciones, inserciones o sustituciones)
que no tengan efecto sobre la actividad del mutante en cuestión o no
modifiquen su actividad sustancialmente o que, simplemente, debido a
la degeneración del código genético, no modifiquen su secuencia y
consecuentemente tampoco su actividad. De este modo, también forman
parte de la presente invención cualquier secuencia con al menos
alrededor de un 40% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO.16 que, preferentemente, no modifique
su actividad o no la modifiquen sustancialmente. Preferentemente,
dicha identidad es de al menos alrededor de un 45%, 50%, 55%, 60%,
65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.
Con el objeto de producir los mutantes de la
invención, las secuencias polinucleotídicas de la invención son
preferentemente incorporadas en un vector que comprende una
secuencia promotora o reguladora operativamente relacionada con la
secuencia que codifica para el mutante de la invención. De este
modo, un tercer aspecto de la invención también se refiere a un
método para la producción de los mutantes de la invención que
comprende: i) el cultivo de una célula huésped que comprende
cualquiera de los polinucleótidos o vectores de la invención y ii)
el aislamiento del mutante producido. Preferentemente, el cultivo de
la célula es realizado bajo condiciones que promuevan el crecimiento
de la célula huésped y/o la expresión del polinucleótido de la
invención. Prácticamente cualquier célula huésped que permita la
expresión del polinucleótido de la invención puede ser utilizada
(e.g., bacterias, levaduras, etc.). Del mismo modo, la invención
también comprende la expresión o producción de los mutantes de la
invención mediante síntesis química u otros sistemas de expresión
in vitro libres de células ("Cell-Free
Expression Systems") sobradamente conocidos en el estado de
la técnica.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al
empleo de los mutantes de la invención como herramienta molecular,
preferentemente, en todas aquellas técnicas donde se emplea la TdT.
Los mutantes pueden ser empleados en este tipo de técnicas, como
sustitutivos de la TdT o en combinación con la misma. Más
concretamente, los mutantes de la invención en combinación o
individualmente son susceptibles de ser empleados preferentemente
en: i) ensayos de mareaje de extremos de polinucleótidos de cadena
simple (heteropolímeros u homopolímeros) y cadena doble (extremos
protuberantes o romos), ii) reunión de extremos protuberantes y
romos, iii) polimerización dependiente o independiente de molde, iv)
rellenado de gaps (gap-filling), v) detección
de roturas de ADN (mismatch detection; e.g. TUNEL), vi)
mutagénesis, etc.
De este modo, este aspecto proporciona un método
para la elongación de un polinucleótido diana que comprende: i)
poner en contacto a un polinucleótido diana con el mutante de la
invención y nucleótidos o análogos de nucleótidos (mezcla de
reacción) y ii) someter la mezcla de reacción a condiciones que
favorezcan la inserción de al menos un nucleótido o análogos de
nucleótidos en el extremo 3'OH del polinucleótido diana. En una
realización preferida el número de nucleótidos o análogos de
nucleótidos insertado es de al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos y en
realizaciones sucesivamente más preferidas entre 1 y 20, 3 y 20, 5 y
20, 1 y 10, 3 y 10, 5 y 10.
La invención también proporciona métodos para el
mareaje de polinucleótidos que comprende i) poner en contacto a un
polinucleótido diana con el mutante de la invención y nucleótidos o
análogos de nucleótidos marcados (mezcla de reacción), ii) someter
la mezcla de reacción a condiciones que favorezcan la inserción de
al menos un nucleótido o análogo del mismo en el extremo 3'OH del
polinucleótido diana, y iii) detectar la presencia o no de
inserción. En una realización preferida el número de nucleótidos o
análogos de nucleótidos marcados insertado es de al menos 1, 2, 3, 4
ó 5 nucleótidos y en realizaciones sucesivamente más preferidas
entre 1 y 20, 3 y 20, 5 y 20, 1 y 10, 3 y 10, 5 y 10.
Los mutantes de la invención también son
susceptibles de ser empleados en métodos o técnicas de gap
filing que comprenden: i) poner en contacto a un polinucleótido
diana, que comprende al menos un gap o hueco de al menos un
nucleótido, con el mutante de la invención y nucleótidos o análogos
de nucleótidos (mezcla de reacción), y ii) someter la mezcla de
reacción a condiciones que favorezcan la inserción de al menos un
nucleótido o análogo de nucleótido en el extremo 3'OH del
gap. Adicionalmente, este método comprende iii) detectar si
se ha producido o no el rellenado del gap y/o iv) la adición
de enzimas (e.g. nucleasas, ligasas), que liguen a los nucleótidos o
análogos de nucleótidos introducidos en el polinucleótido diana, o
hidrolicen al polinucleótido diana. En una realización más preferida
el tamaño del gap es de al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos y, más
preferentemente, entre 1 y 10 nucleótidos. Estas reacciones pueden
favorecerse además mediante la presencia de un grupo fosfato en las
regiones 5'P del polinucleótido diana.
Debido a que los mutantes de la invención tienen
la capacidad de incorporar nucleótidos independientemente de molde
son excelentes candidatos para ser empleados en técnicas de reunión
de extremos, tanto si estos son protuberantes como si son romos.
Así, la invención también proporciona un método para la reunión de
extremos de polinucleótidos de doble cadena que comprende: i) poner
en contacto a un polinucleótido diana de doble cadena con el mutante
de la invención y al menos dos nucleótidos o análogos de nucleótidos
complementarios (mezcla de reacción), y ii) poner la mezcla de
reacción bajo condiciones que favorezcan la introducción de un
número suficiente de nucleótidos o análogos de nucleótido en cada
uno de los extremos del polinucleótido diana para que se produzca la
reunión. Adicionalmente, este método comprende iii) la adición de
enzimas (e.g. ligasas) que liguen los extremos una vez están
reunidos. En una realización preferida el número de nucleótidos o
análogos de nucleótidos insertado es de al menos 1, 2, 3, 4 ó 5
nucleótidos y en realizaciones sucesivamente más preferidas entre 1
y 20, 3 y 20, 5 y 20, 1 y 10, 3 y 10, 5 y 10.
Otra de las importantes aplicaciones de la
actividad TdT es su uso en los ensayos TUNEL
(TdT-mediated dUTP-biotin nick
end labeling) que permiten la detección de muestras biológicas
que están sufriendo apoptosis (Gavrieli, Y. et al.
(1992) Identification of programmed cell death in situ via
specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell. Biol. 119,
493.501). Cuando las señales de apoptosis se disparan en la
célula se produce un proceso de rotura o fragmentación del ADN. Una
polimerasa con actividad deoxinucleotidil transferasa terminal tiene
la capacidad de introducir nucleótidos o análogos de nucleótidos en
dichas roturas haciendo así visible el proceso apoptótico. Así, la
presente invención proporciona un método para la detección de
muestras apoptóticas, preferentemente en sus estadios tempranos.
Dicho método comprende i) poner en contacto una muestra, que
contiene material genético de células potencialmente apoptóticas,
con el mutante de la invención y al menos un nucleótido o análogo de
nucleótido (mezcla de reacción), ii) someter la mezcla de reacción a
condiciones que favorezcan la inserción de nucleótidos o análogos de
los mismos, y iii) detectar la presencia o no de inserción,
preferentemente mediante fluorescencia, donde la detección de
inserción es indicativa de la presencia de material genético
fragmentado y, consecuentemente, del comienzo del proceso apoptótico
en la muestra. Este mismo método puede emplearse también en técnicas
destinadas a comprobar la viabilidad de una muestra biológica, como
es el caso de los análisis de esperma en técnicas de reproducción
asistida, donde en los espermatozoides con ADN normal sólo se
detecta fluorescencia de fondo, mientras que los espermatozoides con
ADN fragmentado (múltiples 3'OH terminales) se tiñen con una
fluorescencia intensa. La fluorescencia puede detectarse,
preferentemente, tanto por citometría de flujo como a través de
microscopía fluorescente.
En cualquiera de los métodos mencionados en los
que es necesario detectar la presencia o ausencia de inserción de
nucleótidos o análogos de los mismos, esta detección se puede hacer
por múltiples metodologías sobradamente conocidas en el estado de la
técnica, como puede ser la fluorescencia. Preferentemente, las
muestras a marcar o detectar son comparadas con muestras control, de
tal forma que la muestra problema es considerada positiva cuando
presenta al menos alrededor de un 5% más de inserción que la muestra
control y en realizaciones sucesivamente más preferidas al menos
alrededor de un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
100%.
Tal y como se ha mencionado anteriormente, en
cualquiera de los métodos descritos los mutantes de la invención
pueden encontrarse en combinación con TdT o mutantes de la misma,
como una forma de mejorar la eficiencia de las técnicas. Incluso
varios mutantes de la invención pueden ser combinados con TdT con la
misma finalidad. Otra forma de aumentar la eficiencia de los métodos
mencionados comprende la adición de iones, preferentemente Mn^{2+}
o Co^{2+}, a las mezclas de reacción, ya que éstos son capaces de
aumentar la eficiencia catalítica de los mutantes de la
invención.
Un quinto aspecto de la invención se relaciona
con kits que incorporan cualquiera de los mutantes de la invención,
preferentemente, para llevar a cabo cualquiera de los métodos
mencionados anteriormente. Adicionalmente, además de los componentes
necesarios para poner en marcha el correspondiente ensayo (e.g.
tampones, cebadores, dNTPs, ddNTPs, hNTPs, análogos de nucleótidos,
iones, etc.), los kits pueden también comprender la TdT o mutantes
de la misma como una forma de mejorar así la eficiencia de dichos
ensayos.
El empleo de dichos kits para las aplicaciones
previamente mencionadas, por ejemplo, en ensayos de: i) mareaje de
extremos de polinucleótidos de cadena simple (heteropolímeros u
homopolímeros) y cadena doble (extremos protuberantes o romos), ii)
reunión de extremos protuberantes y romos, iii) polimerización
dependiente o independiente de molde, iv) rellenado de gaps o huecos
(gap-filling), v) detección de roturas de ADN
(mismatch detection; e.g. TUNEL), vi) mutagénesis o
generación de variabilidad, etc., constituye un aspecto adicional de
esta invención.
Ejemplo
1
Este ensayo muestra la actividad transferasa
terminal de cada uno de los mutantes, en comparación con la Pol\mu
humana wt [SEQ ID NO: 17] y la TdT comercial de Promega (Fig. 1). Se
analiza la extensión máxima con cada uno de los 4 dNTPS por
separado, sobre un extremo 3'OH de ADN homopolimérico de cadena
sencilla (PoliT). En un primer momento, se seleccionaron aquéllos
mutantes que produjeron una estimulación llamativa de la actividad
transferasa terminal respecto a Pol\mu wt, para la realización de
ensayos de mareaje del extremo 3'OH del ADN.
El oligonueleótido fluorescente utilizado para
evaluar la actividad transferasa terminal fue
PoliT-Cy5 (PoliT15-CY5), que fue
comprado a Sigma. Los dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) fueron
comprados a GE Healthcare. Las reacciones de polimerización se
llevaron a cabo en un volumen de 10 \mul, en presencia de 1 mM
MnCl_{2}, 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 1 mM ditiotreitol (DTT), 4%
glicerol, 0.1 mg/ml seroalbúmina bovina (BSA), 20 nM del
oligonueleótido fluorescente indicado en cada caso, 100 \muM del
dNTP indicado en cada caso, y 600 nM de la proteína indicada en cada
caso, a excepción de la TdT comercial de Promega (1 unidad). Tras
una incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones se pararon añadiendo
5,6 \mul de tampón de carga (95% formamida, 10 mM EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético)). Estas muestras se analizaron mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M y
posterior lectura de señal fluorescente utilizando un equipo Typhoon
9410 (GE Healthcare).
- -
- El mutante combinado R387K-F389G (M1) tiene muy reducida la actividad transferasa terminal intrínseca de Pol\mu wt.
- -
- La mutación Q275M (M2) por sí sola parece estimular ligeramente la transferasa terminal respecto a Pol\mu wt.
- -
- Los cambios R387K-Q275M (M3) y R387K-Chloop1 (M7) son los verdaderamente espectaculares, ya que consumen todo el sustrato de partida (lo cual es muy aplicable a mareaje del extremo 3'OH ya que puede suponer una eficiencia de mareaje cercana al 100%) y elongan hasta grandes tamaños (lo cual puede tener aplicación en reacciones de "tailing").
- -
- Los cambios N457D (M4), S458N (M5) y su combinación también logra estimular la actividad transferasa terminal.
Las mutaciones puntuales Q275M, N457D, S458N y
R387K se corresponden a reversiones (sustituciones) hacia el
aminoácido que se encuentra conservado en TdT tal como se puede
apreciar en la Figura 13. Las tres primeras mutaciones son
mutaciones conservativas, puesto que el aminoácido al que se
revierte pertenece al mismo grupo (ver Tabla 1), y en cambio la
mutación R387K es no conservativa.
Ejemplo
2
Se llevó a cabo una reacción similar a la del
Ejemplo 1, pero a dosis decrecientes de polimerasa (400 nM, 200 nM y
100 nM). A 400 nM de proteína se mantuvo la extensión de cerca del
100% del sustrato original de partida. A dosis inferiores de
proteína, si bien la actividad transferasa terminal siguió estando
fuertemente estimulada, la extensión del sustrato original de
partida no fue tan eficaz (Figura 2).
El oligonucleótido fluorescente utilizado para
evaluar la actividad transferasa terminal fue
PoliT-Cy5 (PoliT15-CY5), que fue
comprado a Sigma. Los dNTPs fueron comprados a GE Healthcare. Las
reacciones de polimerización se llevaron a cabo en un volumen de 10
\mul, en presencia de 1 mM MnCl_{2}, 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 1
mM DTT, 4% glicerol, 0,1 mg/ml BSA, 20 nM del oligonucleótido
fluorescente indicado en cada caso, 100 \muM del dNTP indicado en
cada caso, y la dosis de proteína indicada en cada caso. Tras una
incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones se pararon añadiendo 5,6
\mul de tampón de carga (95% formamida, 10 mM EDTA). Estas
muestras se analizaron mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida al 20% y urea 8 M y posterior lectura de señal
fluorescente utilizando un equipo Typhoon 9410 (GE Healthcare).
Ejemplo
3
Se analiza la extensión máxima con cada uno de
los 4 dNTPS por separado sobre un extremo 3'OH de ADN homopolimérico
de cadena sencilla (Poli T). Se determina si las mutaciones
sencillas son suficientes por sí solas para estimular la actividad
transferasa terminal en la medida en que se ha comprobado, o bien es
necesaria la combinación de varias mutaciones para lograr la potente
actividad alcanzada en los ensayos anteriores.
El oligonueleótido fluorescente utilizado para
evaluar la actividad transferasa terminal fue
PoliT-Cy5 (PoliT15-CY5), que fue
comprado a Sigma. Los dNTPs fueron comprados a GE Healthcare. Las
reacciones de polimerización se llevaron a cabo en un volumen de 10
\mul, en presencia de 1 mM MnCl_{2}, 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 1
mM DTT, 4% glicerol, 0,1 mg/ml BSA, 20 nM del oligonueleótido
fluorescente indicado en cada caso, 100 \muM del dNTP indicado en
cada caso, y 600 nM de la proteína indicada en cada caso, a
excepción de la TdT comercial de Promega (1 unidad). Tras una
incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones se pararon añadiendo 5,6
\mul de tampón de carga (95% formamida, 10 mM EDTA). Estas
muestras se analizaron mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida al 20% y urea 8 M y posterior lectura de señal
fluorescente utilizando un equipo Typhoon 9410 (GE Healthcare).
- -
- El mutante simple R387K (R) logra un aumento eficaz de la actividad transferasa terminal intrínseca de Pol\mu wt, especialmente con dT y dC. Sin embargo dista mucho de llegar a los niveles alcanzados por cualquiera de los mutantes combinados (M3 y M7).
- -
- El mutante simple \mu-Chloop1 (Ch) logra un cambio en el patrón de inserción de dNTPs respecto a Pol\mu wt, pero no supone un estímulo especialmente llamativo de su actividad transferasa terminal.
- -
- El mutante Q275M (M2) logra un cierto estímulo de la actividad transferasa terminal en comparación con Pol\mu wt.
La combinación de las dos mutaciones que
componen cada mutante seleccionado
(\mu-R387K/Q275M y
\mu-R387K/
Chloop1) da lugar a niveles espectaculares de actividad transferasa terminal. Cada una de las mutaciones simples por separado supone una cierta mejora respecto a Pol\mu wt en este sentido.
Chloop1) da lugar a niveles espectaculares de actividad transferasa terminal. Cada una de las mutaciones simples por separado supone una cierta mejora respecto a Pol\mu wt en este sentido.
Ejemplo
4
En este caso, aunque el patrón de inserción de
dNTPs es algo diferente respecto al de Mn^{2+}, y en general está
menos avanzado, resulta evidente que los mutantes dobles
(\mu-R387K/Q275M y
\mu-R387K/Chloop1) destacan claramente respecto a
los mutantes simples en cuanto a actividad transferasa terminal.
El oligonucleótido fluorescente utilizado para
evaluar la actividad transferasa terminal fue
PoliT-Cy5 (PoliT15-CY5), que fue
comprado a Sigma. Los dNTPs fueron comprados a GE Healthcare. Las
reacciones de polimerización se llevaron a cabo en un volumen de 10
\mul, en presencia de 100 mM de tampón cacodilato (pH 6,8), 1 mM
CoCl_{2}, 0.1 mM DTT, 20 nM del oligonucleótido fluorescente
indicado en cada caso, 100 \muM del dNTP indicado en cada caso, y
600 nM de la proteína indicada en cada caso, a excepción de la TdT
comercial de Promega (1 unidad). Tras una incubación de 30 min a
37ºC, las reacciones se pararon añadiendo 5,6 \mul de tampón de
carga (95% formamida, 10 mM EDTA). Estas muestras se analizaron
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M
y posterior lectura de señal fluorescente utilizando un equipo
Typhoon 9410 (GE Healthcare).
La combinación de las dos mutaciones que
componen cada mutante seleccionado
(\mu-R387K/Q275M y
\mu-R387K/
Chloop1) logra niveles espectaculares de actividad transferasa terminal. Cada una de las mutaciones simples por separado supone una cierta mejora respecto a Pol\mu wt en este sentido.
Chloop1) logra niveles espectaculares de actividad transferasa terminal. Cada una de las mutaciones simples por separado supone una cierta mejora respecto a Pol\mu wt en este sentido.
Ejemplo
5
Con este ensayo se comprueba si los mutantes
dobles han visto afectada su capacidad de polimerización dependiente
de molde respecto a Pol\mu wt. Resulta conveniente que esta
actividad se mantenga dentro de unos determinados niveles, ya que
esto permitiría su aplicación en reacciones de mareaje con sustratos
de ADN de cadena doble o con molde.
El oligonucleótido fluorescente
SP1C-FLO (GATCACAGTGAGTAC-FLO) fue
hibridado con el oligonucleótido T13(G)
(AGAAGTGTATCTGGTACTCACTGTGATC) para generar el sustrato de ADN
indicado en la parte superior de la Figura 5. Ambos oligonucleótidos
fueron comprados a Sigma. Los dNTPs fueron comprados a GE
Healthcare. Las reacciones de polimerización se llevaron a cabo en
un volumen de 10 \mul, en presencia de 2,5 mM MgCl_{2}, 50 mM
TrisHCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 4% glicerol, 0,1 mg/ml BSA, 10 nM del
híbrido fluorescente de ADN, la dosis de dNTP/dNTPs indicada en cada
caso, y 100 nM de la proteína indicada en cada caso. Tras una
incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones se pararon añadiendo 5,6
\mul de tampón de carga (95% formamida, 10 mM EDTA). Estas
muestras se analizaron mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida al 20% y urea 8 M y posterior lectura de señal
fluorescente utilizando un equipo Typhoon 9410 (GE Healthcare).
Tal y como se aprecia en la parte izquierda de
la Figura 5 se suministran los 4 dNTPs, para tratar de comprobar la
extensión máxima que puede llevar a cabo la proteína sobre el
sustrato de ADN indicado en la parte superior. Únicamente la
mutación simple Chloop1 parece producir una pequeña disminución en
la elongación, sin que desaparezca la capacidad de polimerización.
El mutante M7, que contiene la mutación Chloop1 también se ve
afectado en el mismo grado. Los mutantes M2 y M3 incluso parecen
mejorar la propia capacidad de elongación de Pol\mu wt, lo cual
resulta muy positivo.
En la parte derecha de la Figura 5 se lleva a
cabo una reacción similar, pero suministrando sólo el nucleótido
complementario a la primera posición en el molde. El paso a +1 se
realiza de modo muy eficiente con todos los
casos.
casos.
Ejemplo
6
En este ensayo se comprobó la dependencia de
molde con los mutantes de dobles (M3 y M7) (ver Figura 6) y los
mutantes simples en el contexto de un gap de ADN de 1 nucleótido con
fosfato.
El oligonueleótido fluorescente
SP1C-FLO (GATCACAGTGAGTAC-FLO) fue
hibridado con el oligonueleótido T13(G)
(AGAAGTGTATCTGGTACTCACTGTGATC) y Dgl-P
(AGATACACTTCT-P) para generar el sustrato de ADN
indicado en la parte superior de la Figura 6. Los oligonucleótidos
fueron comprados a Sigma. El dNTP fue comprado a GE Healthcare. Las
reacciones de polimerización se llevaron a cabo en un volumen de 10
\mul, en presencia de 2,5 mM MgCl_{2}, 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 1
mM DTT, 4% glicerol, 0,1 mg/ml BSA, 10 nM del híbrido fluorescente
de ADN, la dosis de dNTP/dNTPs indicada en cada caso, y 100 nM de la
proteína indicada en cada caso. Tras una incubación de 30 min a
37ºC, las reacciones se pararon añadiendo 5,6 \mul de tampón de
carga (95% formamida, 10 mM EDTA). Estas muestras se analizaron
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M
y posterior lectura de señal fluorescente utilizando un equipo
Typhoon 9410 (GE
Healthcare).
Healthcare).
Tal y como se puede apreciar en la Figura 6, en
este tipo de contexto de ADN todos los mutantes muestran una
eficiencia de inserción similar.
\newpage
Ejemplo
7
Se probó la serie completa de mutantes de
Pol\mu, junto con Pol\mu wt y TdT en una reacción de mareaje en
el extremo 3'OH de un oligonucleótido de cadena sencilla. Se utilizó
como sustrato un oligonucleótido de cadena sencilla marcado con Cy5
en su extremo 5' para su seguimiento. Se suministró ddATP marcado
con fluoresceína (FLO) susceptible de ser incorporado por la
polimerasa en el extremo 3OH' del ADN. El canal ADN permite realizar
el seguimiento del ADN original, y comprobar la proporción de oligo
que ha sido marcada (posición +1) frente al resto no marcado
(posición 0). El canal del ddNTP permite comprobar la entrada en la
posición +1 del ddNTP marcado con
FLO.
FLO.
El oligonucleótido fluorescente utilizado fue:
SP1C-Cy5 (GATCACAGTGAGTAC-Cy5), que
fue comprado a Sigma. El ddATP-Cy5 fue comprado a
Perkin-Elmer. Las reacciones se llevaron a cabo en
un volumen de 10 \mul, en presencia de 1 mM MnCl_{2}, 50 mM
TrisHCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 4% glicerol y 0,1 mg/ml BSA (excepto el
canal de TdT, que llevaba 100 mM de tampón cacodilato, 1 mM
CoCl_{2} y 0,1 mM DTT), 10 nM del oligo fluorescente de ADN, 1
\muM ddATP-FLO, y 600 nM de la proteína indicada
en cada caso. Tras una incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones
se pararon añadiendo 5,6 \mul de tampón de carga (95% formamida,
10 mM EDTA). Estas muestras se analizaron mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M y posterior lectura de
señal fluorescente utilizando un equipo Typhoon 9410 (GE
Healthcare).
Tal y como puede apreciarse en la Figura 7,
Pol\mu wt es capaz de marcar en torno al 50% del oligo
suministrado. Los mutantes M4, M5 y M6
(\mu-N457D-S458N) presentan un
comportamiento similar. El mutante MI ve muy reducida su capacidad
de mareaje respecto a Pol\mu wt. El mutante M2 supone una mejora
respecto a Pol\mu wt aunque no llega a marcar el 100% del sustrato
de partida. Los M3 y M7 son capaces de marcar el 100% del sustrato
original de partida, superando incluso los niveles logrados con la
TdT comercial de Promega.
Ejemplo
8
Ensayo similar al realizado en el Ejemplo 7, en
el que se compara la eficacia de los mutantes M3 y M7 en reacciones
de mareaje, respecto a las mutaciones simples que componen cada uno
de los mutantes.
El oligonueleótido fluorescente utilizado fue:
SP1C-Cy5 (GATCACAGTGAGTAC-Cy5), que
fue comprado a Sigma. El ddATP-Cy5 fue comprado a
Perkin-Elmer. Las reacciones se llevaron a cabo en
un volumen de 10 \mul, en presencia de 1 mM MnCl_{2}, 50 mM
TrisHCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 4% glicerol y 0,1 mg/ml BSA (excepto el
canal de TdT, que llevaba 100 mM de tampón cacodilato, 1 mM
CoCl_{2} y 0,1 mM DTT), 10 nM del oligo fluorescente de ADN, 1
\muM ddATP-FLO, y 600 nM de la proteína indicada
en cada caso. Tras una incubación de 30 minutos a 37ºC, las
reacciones se pararon añadiendo 5,6 \mul de tampón de carga (95%
formamida, 10 mM EDTA). Estas muestras se analizaron mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M y
posterior lectura de señal fluorescente utilizando un equipo Typhoon
9410 (GE Healthcare).
- -
- Las mutaciones simples R387K (R) y Ch-loop-1 (Ch) no logran ninguna mejora respecto a Pol\mu wt en ese tipo de reacciones.
- -
- El mutante M2, como ya se vio en la figura 7, sí supone una mejora puesto que es capaz de acabar con casi todo el sustrato de partida, aunque no con el 100%.
- -
- M3 y M7 no logran el mareaje del 100% del sustrato de partida.
Ejemplo
9
Ensayo similar al realizado en el ejemplo 8, en
el que se compara la eficacia de los mutantes M3 y M7 en reacciones
de mareaje, respecto a las mutaciones simples que componen cada uno
de los mutantes. En este caso se utiliza un sustrato de ADN de
cadena sencilla diferente (PoliT) para descartar que el resultado
sea dependiente de secuencia.
El oligonucleótido fluorescente utilizado fue:
PoliT-Cy5 (PoliT 15-Cy5), que fue
comprado a Sigma. El ddATP-Cy5 fue comprado a
Perkin-Elmer. Las reacciones se llevaron a cabo en
un volumen de 10 \mul, en presencia de 1 mM MnCl_{2}, 50 mM
TrisHCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 4% glicerol y 0,1 mg/ml BSA (excepto el
canal de TdT, que llevaba 100 mM de tampón cacodilato, 1 mM
CoCl_{2} y 0,1 mM DTT), 10 nM del oligo fluorescente de ADN, 1
\muM ddATP-FLO, y 600 nM de la proteína indicada
en cada caso. Tras una incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones
se pararon añadiendo 5,6 \mul de tampón de carga (95% formamida,
10 mM EDTA). Estas muestras se analizaron mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M y posterior lectura de
señal fluorescente utilizando un equipo Typhoon 9410 (GE
Healthcare).
- -
- El mutante simple Ch no logra ninguna mejora respecto a Pol\mu wt en ese tipo de reacciones.
- -
- El mutante R en este caso particular mejora levemente respecto a Pol\mu wt, lo cual puede deberse a un efecto de secuencia.
- -
- El mutante M2, como ya se vio en la figura 8, sí supone una mejora, pero no logra el mareaje del 100% del sustrato de partida, como sí ocurre en los casos de M3 y M7.
Ejemplo
10
En este ensayo, similar al mostrado en el
Ejemplo 9, se compara la eficacia de los mutantes M3 y M7 en
reacciones de mareaje, respecto a las mutaciones simples que
componen cada uno de los mutantes. En este caso se utiliza un
sustrato de ADN de cadena sencilla diferente (PoliA) para contrastar
con los anteriores.
El oligonueleótido fluorescente utilizado fue:
PoliA-Cy5 (PoliA15-Cy5), que fue
comprado a Sigma. El ddATP-Cy5 fue comprado a
Perkin-Elmer. Las reacciones se llevaron a cabo en
un volumen de 10 \mul, en presencia de 1 mM MnCl_{2}, 50 mM
TrisHCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 4% glicerol y 0,1 mg/ml BSA (excepto el
canal de TdT, que llevaba 100 mM de tampón cacodilato, 1 mM
CoCl_{2} y 0,1 mM DTT), 10 nM del oligo fluorescente de ADN, 1
\muM ddATP-FLO, y 600 nM de la proteína indicada
en cada caso. Tras una incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones
se pararon añadiendo 5,6 \mul de tampón de carga (95% formamida,
10 mM EDTA). Estas muestras se analizaron mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M y posterior lectura de
señal fluorescente utilizando un equipo Typhoon 9410 (GE
Healthcare).
- -
- Los mutantes simples R y Ch no logran ninguna mejora respecto a Pol\mu wt en ese tipo de reacciones. Parece confirmarse que el efecto de mejora con R que se veía en la figura anterior era dependiente de secuencia.
- -
- El mutante M2, como ya se vio en ejemplos anteriores, sí supone una mejora, pero no logra el mareaje del 100% del sustrato de partida, como sí ocurre en los casos de M3 y M7.
Ejemplo
11
Este ensayo muestra que la reacción de mareaje
con M3 y M7 es altamente eficaz con los 4 ddNTPs fluorescentes,
tanto en presencia de Mn^{2+} como de Co^{2+} (Fig. 11).
El oligonueleótido fluorescente utilizado fue:
SP1C-Cy5 (GATCACAGTGAGTAC-Cy5), que
fue comprado a Sigma. Los dideoxinucleótidos fluorescentes
(ddATP-FLO, ddUTP-FLO,
ddCTP-FLO, ddGTP-FLO) fueron
comprados a Perkin-Elmer. Las reacciones se llevaron
a cabo en un volumen de 10 \mul, en presencia de 1 mM MnCl_{2},
50 mM TrisHCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 4% glicerol y 0,1 mg/ml BSA (en el
caso de reacciones con 1 mM Mn^{2+}) y 100 mM de tampón
cacodilato, 1 mM CoCl_{2} y 0,1 mM DTT (en el caso de reacciones
con 1 mM Co^{2+}), 10 nM del oligo fluorescente de ADN, 1 \muM
ddATP-FLO, y 600 nM de la proteína indicada en cada
caso. Tras una incubación de 30 min a 37ºC, las reacciones se
pararon añadiendo 5,6 \mul de tampón de carga (95% formamida, 10
mM EDTA). Estas muestras se analizaron mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida al 20% y urea 8 M y posterior lectura de
señal fluorescente utilizando un equipo Typhoon 9410 (GE
Healthcare).
\newpage
Ejemplo
12
Tal y como se muestra en la Figura 12, el
alineamiento por FASTA, empleando los parámetros establecidos por
defecto, de las secuencias correspondientes a las Pol\mu wt de
diferentes mamíferos, más concretamente, Mus musculus, Rattus
norvegicu y Bos taurus con el mutante M3, proporciona
aquellos aminoácidos homólogos al 275 y 387 de M3 (o Pol\mu wt
humana).
La mutación de los aminoácidos homólogos de la
Pol\mu wt de Mus musculus, Rattus norvegicu y Bos
taurus correspondientes a las posiciones 275 y 387 de M3, daría
lugar a la obtención de nuevos mutantes, que potencialmente tendrían
la actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal
mejorada debido al elevado grado de identidad existente entre las
diferentes polimerasas (Tabla 3). Tal y como se puede comprobar a
partir de la Figura 12, los aminoácidos homólogos no necesariamente
se encuentran en la misma posición en relación con su secuencia.
Ejemplo
13
Los datos estructurales de Pol\mu wt
utilizados convenientemente pueden ser empleados para la obtención
de nuevos mutantes con actividad transferasa terminal incrementada,
mediante la identificación y mutación de aminoácidos que se
encuentren en el sitio catalítico de la enzima o cercanos a éste,
preferentemente en superficie, esto es, en interacción directa con
el ADN. Así por ejemplo, el análisis tridimensional de la estructura
de la polimerasa puede dar lugar a la identificación de residuos que
permitan la creación de un puente salino, la introducción de un
grupo hidrofóbico o la creación de cualquier otro tipo de
interacción que posibilite una mejor interacción con el ADN con el
objetivo de obtener mutantes con actividad transferasa terminal
incrementada.
Para la identificación de los aminoácidos
candidatos son sobradamente conocidas determinadas técnicas de
laboratorio, como por ejemplo la cristalografía por rayos X y la
resonancia magnética nuclear (RMN), que permiten conocer la
estructura tridimensional de las proteínas. Además de este tipo de
técnicas, existen multitud de programas informáticos que
posibilitan, a partir de la estructura primaria de la enzima,
predecir cual es su configuración espacial (e.g. Swiss PDB Viewer).
De este modo, resulta sencillo mediante la inspección visual de las
estructuras determinar qué aminoácidos pueden ser candidatos para su
mutación.
El empleo de este tipo de técnicas en
combinación con la comparación de las estructuras primarias de
enzimas homologas y/o con actividades similares permite incluso
afinar aún más en la selección de aquellos mutantes que
potencialmente van a tener una actividad incrementada.
A modo de ejemplo, la recopilación de todas las
secuencias conocidas de Pol\mu y TdT de diferentes especies, su
alineamiento y comparación de la estructura primaria permite la
identificación de aquellos aminoácidos que se encuentran conservados
en ambas familias de polimerasas y que sean diferentes entre sí.
Cuando se realiza este proceso, algunos de los aminoácidos
candidatos de Pol\mu que podrían seleccionarse son los Q275, R387,
N457 y S458, los cuales tras un análisis visual de la estructura
tridimensional de la enzima se comprueba que se encuentran en
superficie y cercanos al centro catalítico (Figura 14). La mutación
de estos aminoácidos hacia el aminoácido homólogo de TdT (Q275M,
R387K, N457D y S458N) y, opcionalmente, la combinación de estas
mutaciones da lugar a la obtención de mutantes de Pol\mu con una
actividad transferasa terminal incrementada, tal y como se puede
comprobar a lo largo de la descripción.
<110> XPOL Biotech, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mutantes de la ADN polimerasa mu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P5299ES00 -
XPOL-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens (Pol mu NH2-
BRCT-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (Pol mu NH2-
BRCT- 8 KDa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
(Ch-loop-1 Pol mu)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
(Ch-loop-1 TdT)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (Pol mu, mutante
M3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 493
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (Pol mu, mutante
M7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (M3: NH2-
BRCT-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (M3: NH2- BRCT-
8 KDa-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens (M7: NH2-
BRCT-)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 356
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens (M7: NH2- BRCT-
8 KDa-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 494
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens (Mutante M2)
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<400> 11
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens (M2: NH2-
BRCT-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (M2: NH2- BRCT-
8 KDa-)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1485
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (Mutante M3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (Mutante M7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1485
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens (Mutante M2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 494
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (16)
1. ADN polimerasa mu (Pol\mu) mutada que
presenta una actividad desoxinucleotidil-transferasa
terminal al menos alrededor de un 10% superior a la actividad
desoxinucleotidil-transferasa terminal de la ADN
polimerasa mu mutada R387K.
2. ADN polimerasa mu mutada según la
reivindicación 1, que comprende al menos dos mutaciones.
3. ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende una secuencia con al menos
un 60% de identidad con la SEQ ID NO: 17, o con cualquiera de sus
subsecuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, o con un fragmento de
cualquiera de dichas secuencias que mantiene la actividad
transferasa terminal incrementada o sustancialmente
incrementada.
4. ADN polimerasa mu mutada según la
reivindicación 3, que comprende al menos dos mutaciones que
consisten en (i) una primera mutación puntual en la posición 387 y
(ii) una segunda mutación que consiste en:
- (a)
- una mutación puntual en un aminoácido conservado de Pol\mu wt y distinto al aminoácido homólogo presente en la enzima TdT, o
- (b)
- una mutación en el subdominio loop-1 de Pol\mu.
5. ADN polimerasa mu mutada según la
reivindicación 4, donde la primera mutación puntual (i) en la
posición 387 consiste en la sustitución del aminoácido que se
encuentra dicha posición por cualquiera de los aminoácidos
seleccionados del siguiente grupo: Glutamina, Asparragina, Cisteína,
Treonina, Serina, Metionina, Lisina, Arginina, Histidina o análogos
de los mismos.
6. ADN polimerasa mu mutada según la
reivindicación 5, donde la segunda mutación puntual (a) es una
mutación puntual en el aminoácido que se encuentra en la la posición
275 y consiste en la sustitución del aminoácido que se encuentra en
dicha posición por cualquiera de los aminoácidos seleccionados del
siguiente grupo: Glutamina, Asparragina, Cisteína, Treonina, Serina,
Metionina o análogos de los mismos.
7. ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde la segunda mutación (b)
consiste en la deleción y sustitución del loop-1 de
Pol\mu o de un fragmento del mismo por:
- i)
- una secuencia con al menos alrededor de un 10% de identidad con la SEQ ID NO: 3 (loop-1 de Pol\mu), o
- ii)
- por una secuencia con al menos alrededor de un 10% de identidad con la SEQ ID NO: 4 (loop-1 de TdT).
8. ADN polimerasa mutada según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, cuya secuencia es seleccionada el grupo
formado por SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ
ID NO:9, SEQ ID NO: 10, fragmentos o subsecuencias de las mismas que
mantengan sustancialmente su actividad transferasa terminal.
9. Polinucleótido que codifica una ADN
polimerasa mu mutada, o un fragmento o subsecuencia de la misma, de
acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Polinucleótido según la reivindicación 9,
donde su secuencia es seleccionada del grupo que comprende las
secuencias SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.
11. Vector que comprende un polinucleótido según
cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10.
12. Célula huésped que comprende un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, o un
vector según la reivindicación 11.
13. Método para la producción de una ADN
polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
que comprende: i) el cultivo de una célula huésped según la
reivindicación 12 bajo condiciones que promuevan la expresión del
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, y
ii) el aislamiento del mutante producido.
14. Método para la elongación de un
polinucleótido diana que comprende: i) poner en contacto al
polinucleótido diana con la ADN polimerasa mu mutada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y nucleótidos o análogos de
nucleótidos (mezcla de reacción), y ii) someter la mezcla de
reacción a condiciones que favorezcan la inserción de al menos un
nucleótido o un análogo del mismo en el extremo 3'OH del
polinucleótido diana.
15. Método para el rellenado de huecos que
comprende: i) poner en contacto a un polinucleótido diana, que
comprende al menos un gap o hueco de al menos un nucleótido, con la
ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 8 y nucleótidos o análogos de nucleótidos (mezcla de reacción), y
ii) someter la mezcla de reacción a condiciones que favorezcan la
inserción de al menos un nucleótido o análogo de nucleótido en el
extremo 3'OH de gap.
16. Método para la detección de muestras
apoptóticas que comprende: i) poner en contacto una muestra, que
contiene material genético de células potencialmente apoptóticas,
con la ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 y al menos un nucleótido o análogo de
nucleótido (mezcla de reacción), ii) someter la mezcla de reacción a
condiciones que favorezcan la inserción de nucleótidos o análogos de
los mismos, y iii) detectar la presencia o no de inserción, donde la
detección de inserción es indicativa de que la muestra es
apoptótica.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200901943A ES2364010B1 (es) | 2009-10-02 | 2009-10-02 | Mutantes de la adn polimerasa mu |
| PCT/ES2010/000402 WO2011039390A2 (es) | 2009-10-02 | 2010-10-02 | Mutantes de la adn polimerasa mu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200901943A ES2364010B1 (es) | 2009-10-02 | 2009-10-02 | Mutantes de la adn polimerasa mu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2364010A1 true ES2364010A1 (es) | 2011-08-23 |
| ES2364010B1 ES2364010B1 (es) | 2012-06-20 |
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ID=43826709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200901943A Withdrawn - After Issue ES2364010B1 (es) | 2009-10-02 | 2009-10-02 | Mutantes de la adn polimerasa mu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2364010B1 (es) |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2001064909A1 (en) * | 2000-03-03 | 2001-09-07 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Dna polymerase mu and uses thereof |
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2009
- 2009-10-02 ES ES200901943A patent/ES2364010B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2010
- 2010-10-02 WO PCT/ES2010/000402 patent/WO2011039390A2/es not_active Ceased
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| WO2011039390A3 (es) | 2011-07-21 |
| ES2364010B1 (es) | 2012-06-20 |
| WO2011039390A8 (es) | 2011-06-03 |
| WO2011039390A2 (es) | 2011-04-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20110105 |
|
| FG2A | Definitive protection |
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|
| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20121121 |