ES2363622T3 - Moléculas de enlace de lingo y el uso farmacéutico de estas. - Google Patents

Abstract

Una molécula de enlace que es capaz de unirse a la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, con una constante de disociación <1000nM, y que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia las siguientes CDRs: cualquiera de las dos, (i) CDR-H1 de SEQ ID NO:12, CDR-H2 de SEQ ID NO:13, CDR-H3 de SEQ ID NO:14, CDR-L1 de SEQ ID NO: 15, CDR-L2 de SEQ ID NO:16 y CDR-L3 de SEQ ID NO:17, o, (ii) CDR'-H1 de SEQ ID NO:18, CDR'-H2 de SEQ ID NO:19, CDR'-H3 de SEQ ID NO:20, CDR'-L1 de SEQ ID NO:21, CDR'-L2 de SEQ ID NO:22 y CDR'-L3 de SEQ ID NO:23.

Description

La presente invención se relaciona con las moléculas de enlace de LINGO, tales como por ejemplo anticuerpos monoclonales o fragmentos Fab de estos, y el uso de tales moléculas de enlace para tratar pacientes con lesiones a su sistema central nervioso.

Antecedentes de la invención

La recuperación funcional después de una lesión al sistema nervioso central (SNC) de los vertebrados superiores adultos se limita excepcionalmente, resultando en déficits neurológicos persistentes tales como pérdida del movimiento de las extremidades y sensación. Hasta ahora, existe una carencia de una terapia efectiva para tratar humanos con lesiones del SNC tales como lesión de la médula espinal (LME) y lesión cortical cerebral. Aunque las neuronas del SNC adultas generalmente sobreviven a la axotomía, la regeneración axonal es transitoria y sólo ocurre sobre una zona confinada, por lo tanto retardando la re-formación de contactos sinápticos relevantes funcionalmente. Adicionalmente, la capacidad plástica del SNC de adulto también se restringe, lo que dificulta la reorganización de rutas ilesas para compensar funcionalmente aquellas eliminadas por la lesión. Paradójicamente, los axones axotomizados en el sistema nervioso periférico (SNP) tienen una alta capacidad para regenerarse a grandes distancias y con frecuencia establecen conexiones funcionalmente significativas (Schwab (2004) Curr Opin Neurobiol 14,118-124). Esta restricción en regeneración axonal/plasticidad, se debe en parte a que la expresión en oligodendrocitos mielinizantes de varias proteínas han demostrado ser potentes inhibidores del crecimiento neurítico, a saber Nogo-A (Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre et al. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384), glicoproteína asociada a la mielina (MAG), y glicoproteína de la mielina del oligodendrocito (OMgp) (McKerracher et al. (1994) Neuron 13, 805-811; Wang et al. (2002) Nature 417:941-944) (Fig. 1A). Nogo-A contiene dominios inhibidores del crecimiento neurítico múltiple expuestos en la superficie de los oligodendrocitos: dos se localizan dentro de la región amino-terminal (amino-Nogo-A) y uno en la región C-terminal (Nogo-66) (Oertle et al. (2003) J Neurosci 23, 5393-5406). Nogo-66 se une y da la señal a través de un receptor que contiene repeticiones ricas en leucina (LRR) ancladas a glicosil-fosfatidilinositol (GPI) en la superficie neuronal conocida como el receptor Nogo-66 (NgR) (Fournier et al. (2001) Nature 409, 341-346). Aunque MAG y OMgp, estructuralmente no relacionadas, también se unen y dan la señal a NgR (Domeniconi et al. (2002) Neuron 35, 283290; Liu et al. (2002) Science 297, 1190-1193; Wang et al. (2002) Nature 417:941-944). La señalización a NgR lleva a la activación de la GTPasa RhoA pequeña, que a su vez activa la quinasa asociada con Rho (ROCK) que conduce a una rigidización del citoesqueleto de la actina y la inhibición de la extensión axonal (Niederöst et al. (2002) J Neurosci 22, 10368-10376; Schweigreiter et al. (2004) Mol Cell Neurosci 27:163-174). Los tres ligandos se unen en la región LRR de NgR y tienen sitios de enlace parcialmente solapantes (Fournier et al. (2002) J Neurosci 22, 88768883; Liu et al. (2002) Science 297, 1190-1193; Wang et al. (2002) Nature 417:941-944; Barton et al. (2003) EMBO J 22, 3291-3302). El o los receptores de los dominios inhibidores dentro del amino-Nogo-A son desconocidos pero se ha demostrado que es distinto de NgR (Schweigreiter et al. (2004) Mol Cell Neurosci 27:163-174). También se ha encontrado que MAG da la señal a través de un homólogo cercano de NgR conocido como NgR2 (Pignot et al. (2003) J Neurochem 85, 717-728; Venkatesh et al. (2005) J Neurosci 25, 808-822).

Como NgR carece de un dominio citoplásmico, utiliza varias proteínas transmembrana de la transducción de la señal, a saber el receptor de la neurotrofina de baja afinidad p75NTR, TROY (a.k.a. TAJ) y LINGO-1 (LRR y proteína que interactúa con el receptor Nogo, que contiene el dominio Ig a.k.a LRRN6A o LERN1) (Wang et al. (2002) Nature 420, 74-78; Carim-Todd et al. (2003) Eur J Neurosci 18, 3167-3182; Mi et al. (2004) Nat Neurosci 7, 221-228; Park et al. (2005) Neuron 45:345-351; Shao et al. (2005) Neuron 45, 353-359). TROY y p75NTR se pueden reemplazar uno por el otro en el complejo del receptor NgR, mientras que la presencia de LINGO-1 es un prerequisito absoluto para que la señalización se produzca. El complejo del receptor NgR, por lo tanto se ve como un completo ternario que comprende NgR como la subunidad de enlace del ligando y LINGO-1 como la subunidad de transducción de la señal común que actúa en combinación con cualquiera p75NTR o TROY.

LINGO-1 es una proteína transmembrana única expresada exclusivamente dentro del SNC predominantemente en las neuronas y oligodendrocitos. La expresión de picos de LINGO-1 en el periodo postnatal temprano y se favorece la expresión en la médula espinal adulta después de la lesión. El ectodominio de LINGO-1 contiene doce LRRs en tándem flanqueadas por los subdominios N-y C-terminal seguidos por una región básica y un dominio Ig (Fig. 1B). Teniendo en cuenta que una fusión AP del Ectodominio LINGO-1 unida a las células COS-7 que expresan NgR o p75NTR o ambas y, de manera análoga, LINGO-1 se co-precipita con NgR o p75NTR en las células que expresan las tres proteínas, LINGO-1 más probablemente forma un complejo ternario con NgR y p75NTR mediante la interacción con ambas simultáneamente.

Además de ser expresada en neuronas, LINGO-1 también se expresa en oligodendrocitos en el SNC de adulto (Mi et al. (2005) Nat Neurosci 8, 745-751). Inhibiendo la señalización de LINGO-1 en cultivos de oligodendrocitos mediante ya sea el tratamiento con LINGO-1-Fc, se reduce la expresión de la proteína con ARNi o por la sobreexpresión de DN-LINGO-1 aumentó la diferenciación de OPCs con oligodendrocitos mielinizantes. Adicionalmente, la ablación genética de LINGO-1 en ratones aumenta el número de oligodendrocitos maduros y, según el caso, los axones mielinizados en la médula espinal. La inhibición de señalización de LINGO-1 redujo la activación de RhoA y aumentó la actividad de Fyn quinasa, de las cuales ambas se reportan por promover la diferenciación de oligodendrocitos, aunque los ligandos/interacciones actuales responsables para activar la señalización de LINGO-1 aún no se han ejemplificado. Esto ha llevado a la conclusión de que LINGO-1 es un regulador negativo de mielinización.

La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria crónica del SNC caracterizada por la desmielinización y degeneración axonal que conduce a déficits neurológicos múltiples. Aunque la remielinización de los axones puede ocurrir temprano en la enfermedad, en algún punto la remielinización cae completamente, lo que conduce a la degeneración axonal acelerada y a un daño irreversible. La remielinización más probablemente se origina de la diferenciación de células precursoras de oligodendrocito adultas (OPCs) que migran a las márgenes de lesiones activas. Como LINGO-1 regula negativamente la mielinización, el bloqueo de LINGO-1 puede aumentar la remielinización, atenuar la degeneración axonal, promover la regeneración axonal y de esta manera atenuar, detener o incluso revertir el progreso de enfermedades desmielinizantes tales como MS.

También se ha demostrado que el bloqueo de LINGO-1 mejora la supervivencia de neuronas dopaminérgicas y reduce las anormalidades del comportamiento en modelos de roedores de la enfermedad de Parkinson (Inoue et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104, 14430-14435). También se ha demostrado que los antagonistas de LINGO-1 promueven la recuperación funcional y el brote axonal después de la lesión de la médula espinal (Ji et al., 2006, Mol. Cell Neurosc. 33: 311-320). WO 2006/00247 además revela métodos para tratar enfermedades incluyendo la esclerosis múltiple utilizando antagonistas de LINGO-1. Los anticuerpos contra NogoR se describen en US 2005/0214288.

Resumen de la invención

En la actualidad se ha encontrado sorprendentemente que novedosos anticuerpos humanos monoclonales contra LINGO-1 (conocidos como anticuerpo 4784, y anticuerpo 4785 de ahora en adelante) inhiben significantemente la asociación de LINGO-1 con NgR y atenúan significantemente la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal de rata adulta a concentraciones sub-nM in vitro. Además, los citados anticuerpos aumentan significantemente la diferenciación de oligodendrocitos primarios in vitro y se ha demostrado que inhibe la expresión significantemente de la superficie celular de la LINGO-1 en células vivas. Se espera que el tratamiento con estos anticuerpos aumente la regeneración axonal/plasticidad y mejore la recuperación funcional después de las lesiones agudas del SNC tales como LME y la lesión cortical cerebral. Adicionalmente, el bloqueo de la señalización de LINGO-1 utilizando los citados anticuerpos en las células oligodendrogliales tiene el potencial para aumentar la remielinización de axones en enfermedades desmielinizantes tales como MS que conduce a una atenuación de progreso de la enfermedad. En concierto, se puede esperar que la inhibición de la señalización de LINGO-1 en neuronas con los citados anticuerpos mejore la regeneración axonal y neuroplasticidad y promueva la recuperación de función neurológica perdida durante el curso de la enfermedad. Finalmente, se puede esperar que el bloqueo de LINGO-1 con los citados anticuerpos atenúe la patogénesis de la enfermedad de Parkinson.

Adicionalmente, la invención proporciona moléculas de enlace que se unen a epitopes específicos de LINGO-1.

Los anticuerpos tienen KDs sub-nM contra el ectodominio LINGO-1 de rata, mono cynomolgus y humano, atenúan significantemente la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal de rata adulta a concentraciones sub-nM y aumentan significantemente la diferenciación de oligodendrocitos in vitro. Además, ahora es posible construir otras moléculas de enlace LINGO-1 que tienen las mismas regiones variables como los citados anticuerpos.

Descripción detallada de la invención

En consecuencia, la invención proporciona las moléculas de enlace con una región particular o epitope de LINGO-1 (de ahora en adelante denominadas como "las moléculas de enlace de la invención" o simplemente "moléculas de enlace").

Las moléculas de enlace de la invención se unen al ectodominio maduro (residuos 34-550) de LINGO-1 de rata (SEQ ID NO: 1), LINGO-1 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 2) y LINGO-1 humano (SEQ ID NO: 3) con una constante de disociación (KD) < 1000nM, más preferiblemente con una KD < 100 nM, más preferiblemente con una KD < 10 nM. La reacción de enlace se puede mostrar por métodos estándar (ensayos cualitativos) incluyendo, por ejemplo, el método FACS descrito en los Ejemplos. Además, el enlace con LINGO-1 de rata, mono cynomolgus y humano, y también la eficiencia, se puede mostrar en un ensayo de crecimiento neurítico y ensayo de oligodendrocito como se describe a continuación.

De esta manera, en otra modalidad preferida las moléculas de enlace (a una concentración de 100 nM, preferiblemente 10 nM, más preferiblemente a 1 nM aún más preferiblemente a 0.1 nM) aumentan la media de la longitud de neuritas por célula de células granulares de cerebelo de ratas cultivadas sobre un sustrato de mielina de la médula espinal de rata adulta por al menos 20%, preferiblemente 50%, más preferido 60% en comparación con la

5 media de la longitud de neuritas por célula de células granulares de cerebelo de rata que se tratan con un anticuerpo control que no se une al Ectodominio LINGO-1 de rata, mono cynomolgous y humano.

Mediante el uso de microarreglos de péptidos, el epitope específico al cual las moléculas de enlace de la invención se unen se determina de acuerdo con métodos bien conocidos en el oficio. Por lo tanto, en otra modalidad la invención se proporcionan las moléculas de enlace que se unen a al menos uno de los epitopes de LINGO-1 según 10 se define por SEQ ID NO: 46-51. SEQ ID NO:46: KIVILLDYMFQD, SEQ ID NO: 47: AIRDYSFKRLYR, SEQ ID NO:

48: LKVLEISHWPYL, SEQ ID NO: 49: NLTAVPYLAVRHLVY, SEQ ID NO: 50: YFTCRRARI, o SEQ ID NO: 51:

DVLLPNYFTCRRARI. En otra modalidad, las moléculas de enlace de la invención comprenden una o más, de las siguientes secuencias de CDR, por ejemplo todas las secuencias del Anticuerpo 4784 o todas las del Anticuerpo 4785 mencionados aquí:

15 SEQ ID NO: 12 (Anticuerpo 4784 CDR-H1) SSGVGVG SEQ ID NO: 13 (Anticuerpo 4784 CDR-H2)

20 HIGSDDDKYYSTSLKT SEQ ID NO: 14 (Anticuerpo 4784 CDR-H3) NQQYGDGYPGYFDY SEQ ID NO: 15

25 (Anticuerpo 4784 CDR-L1) SGDNIGNYYVY SEQ ID NO: 16 (Anticuerpo 4784 CDR-L2) EDTNRPS

30 SEQ ID NO: 17 (Anticuerpo 4784 CDR-L3) QSYDNLHEQV SEQ ID NO: 18 (Anticuerpo 4785 COR’-H1)

35 DNSAAWS SEQ ID NO: 19 (Anticuerpo 4785 CDR’-H2)

5

10

15

20

25

30

35

40

LIYLRSKWDNDYAVSVKS SEQ ID NO: 20 (Anticuerpo 4785 CDR’-H3) TGRADEFDV SEQ ID NO: 21 (Anticuerpo 4785 CDR’-L1) SGSSSNIGNNYVS SEQ ID NO: 22 (Anticuerpo 4785 CDR’-L2) RNSKRPS SEQ ID NO: 23 (Anticuerpo 4785 CDR’-L3) STYDTFSIV Más preferiblemente, las moléculas de enlace comprenden las secuencias dadas anteriormente para el Anticuerpo

4784 con la SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 y/o 17; o para el Anticuerpo 4785 con la SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22

y/o 23. Aquellos de habilidad en el oficio entienden que pueden hacer cambios con 4784 o 4785 que, a pesar de que el cambio de varios, más preferiblemente uno o más aminoácidos, preferiblemente hasta tres, por ejemplo una o dos, de las SDRs dadas anteriormente, especialmente en una o más o todas ellas, por ejemplo una o dos de ellas, o proporcionar la modificación post-translacional alternativa de formatos de producto, dando lugar a un agente terapéutico demostrando el mismo o sustancialmente similar comportamiento de enlace anti-Lingo-1.

La presente aplicación además describe las moléculas de enlace que comprenden al menos un sitio de enlace de antígeno seleccionado del grupo que consiste de; una secuencia que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99% homóloga a la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7, y;

una secuencia que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%,

al menos 97%, o al menos 99% homóloga a la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6, o una equivalente directa de esta. En una modalidad, la molécula de enlace comprende al menos un sitio de enlace seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7, y;

SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. La presente especificación además describe una molécula de enlace que comprende una primera secuencia que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99% homóloga a la SEQ ID NO: 5, y una segunda secuencia que es al menos 50% al menos 60%, al menos

70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99% homóloga a la SEQ ID NO: 4, o una equivalente directa de esta. La presente especificación además describe una molécula de enlace que comprende una primera secuencia que es

al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99% homóloga a la SEQ ID NO: 7, y una segunda secuencia que es al menos 50% al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99% homóloga a la SEQ ID NO: 6, o una equivalente directa de esta.

En una modalidad, la invención proporciona una molécula de enlace que comprende al menos

a) una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de esta que comprende

(i)

un dominio variable que comprende la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7, y

(ii)

la parte constante o fragmento de esta de una cadena pesada humana; y b) una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de esta que comprende

(i)

un dominio variable que comprende la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6, y

(ii)

la parte constante o fragmento de esta de una cadena ligera humana.

La presente especificación además enumera las secuencias que pueden ser al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99% homólogas a la SEQ ID NO: 4-7. El factor importante es que tales variantes conserven la capacidad de enlace con LINGO-1, el efecto de desinhibición (especialmente la capacidad de atenuar la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal de rata adulta a las concentraciones sub-nM), y/o para mejorar la recuperación funcional de LME (especialmente en un modelo de rata), en cada caso preferiblemente como se describe en los Ejemplos o el resto de la descripción.

En una modalidad, la invención proporciona una molécula de enlace que es un anticuerpo que comprende una o más de las secuencias de acuerdo con SEQ ID NO: 4-7 o SEQ ID NO: 12-23.

En otra modalidad, la molécula de enlace, como un anticuerpo, tiene una parte constante o fragmento de esta de la cadena pesada humana del tipo 4 y la parte constante o fragmento de esta de la cadena ligera humana es del tipo .

En otra modalidad, la molécula de enlace, como un anticuerpo, tiene una parte constante o fragmento de esta de la cadena pesada humana del tipo 4 y la parte constante o fragmento de esta de la cadena ligera humana es del tipo .

En otra modalidad, la molécula de enlace es un anticuerpo monoclonal humano o quimérico o humanizado.

En otra modalidad, la molécula de enlace es un anticuerpo humanizados.

La invención también proporciona un polinucleótido que codifica una molécula de enlace como se define anteriormente.

El polinucleótido se puede seleccionar del grupo que consiste de SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9; o del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO:8-11.

Adicionalmente, la invención proporciona un sistema de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con SEQ ID NO:8-11, en donde dicho sistema de expresión o parte de este es capaz de producir una molécula de enlace en los términos indicados, cuando dicho sistema de expresión o parte de este, está presente en una célula huésped compatible. La invención también proporciona una célula huésped aislada que comprende dicho sistema de expresión.

La invención también proporciona el uso de una molécula de enlace en los términos indicados, como un medicamento.

La invención también proporciona el uso de una molécula de enlace en los términos indicados, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión del SNC.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de enlace en los términos indicados junto con al menos un portador o diluente farmacéuticamente aceptable.

Adicionalmente, la invención proporciona un método de tratamiento de enfermedades asociadas con la promoción de regeneración axonal/plasticidad que comprende la administración a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento de una cantidad efectiva de una molécula de enlace en los términos indicados.

La invención también proporciona un método de tratamiento de enfermedades asociadas con la promoción de regeneración axonal/plasticidad que comprende la administración a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento de una cantidad efectiva de una molécula de enlace de acuerdo con la invención.

Cuando el sitio de enlace de antígeno comprende ambos el primer y segundo dominios, estos se pueden localizar en la misma molécula de polipéptido o, preferiblemente, cada dominio puede estar en una cadena diferente, el primer dominio que es parte de una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de esta y el segundo dominio que es parte de una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de esta.

Ejemplos de moléculas de enlace de la invención incluyen anticuerpos como se produce por expresión en fago y anticuerpos humanos o humanizados quiméricos, u otros anticuerpos humanizados, o cualquier fragmento de estos, por ejemplo F(ab’)2; y fragmentos Fab, así como anticuerpos de dominio sencillo o de cadena simple. El término "anticuerpo" se entiende para incluir dichas moléculas de enlace.

Un anticuerpo de cadena simple consiste de los dominios variables de un anticuerpo de cadenas pesada y ligera covalentemente unidas por un ligador de péptido que usualmente consiste de 10 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 15 a 25 aminoácidos. Por consiguiente, dicha estructura no incluye la parte constante de las cadenas pesada y ligera y se cree que el espaciador del péptido pequeño debería ser menos antigénico que una parte constante completa. Por "anticuerpo quimérico" se entiende un anticuerpo en el que las regiones constantes de cadenas pesada o ligera o ambas son de origen humano mientras que los dominios variables de ambas cadenas pesada y ligera son de origen no- humano (por ejemplo murina). Por "anticuerpo humanizado" se entiende un anticuerpo en el que las regiones hipervariables (CDRs) son de origen no-humano (por ejemplo murina), mientras que todas o sustancialmente todas las otras partes de la inmunoglobulina por ejemplo las regiones constantes y las partes altamente conservadas de los dominios variables, i.e. las regiones marco, son de origen humano. Un anticuerpo humanizado puede sin embargo conservar unos pocos aminoácidos de la secuencia de murina en las partes de las regiones framework adyacentes a las regiones hipervariables.

Las regiones hipervariables se pueden asociar con cualquier clase de regiones framework, preferiblemente de origen murina o humano. Apropiadas regiones framework se describen en "Secuencias de proteínas de interés inmunológico" (Kabat E.A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health). Preferiblemente la parte constante de una cadena pesada humana de las moléculas de enlace pueden ser del tipo 4, incluyendo subtipos, preferiblemente la parte constante de una cadena ligera humana puede ser del tipo  o , más preferiblemente del tipo .

Un "anticuerpo" que ocurre naturalmente es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL además pueden ser subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones framework (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs dispuestas de amino-terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina con tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.

El término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de antígeno"), como se utiliza en este documento, se refiere a longitud completa o uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserven la capacidad para unir específicamente a un antígeno (por ejemplo, LINGO-1 y/o LINGO-2). Se ha demostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo se puede llevar a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace comprendidos dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo solo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y una región determinante de complementariedad aislada (CDR).

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se utiliza en este documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única (es decir, que son idénticas porque se producen por un tipo de célula inmune que son todos clones de un célula madre única). Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una (esencialmente) especificidad y afinidad de enlace único de un epitope particular.

El término "anticuerpo humano", como se utiliza en este documento, tiene la intención de incluir los anticuerpos que tienen regiones variables en el que ambas las regiones framework y CDR se derivan a partir de las secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de tales secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir los residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, las mutaciones introducidas por mutagénesis de sitio específico o al azar in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se utiliza en este documento, no tiene la intención de incluir los anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, se han injertado en las secuencias framework humanas.

El término "anticuerpo humano monoclonal" se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad (esencialmente) de enlace única que tienen regiones variables en las que ambas las regiones framework y CDR se derivan a partir de secuencias humanas. En una modalidad, los anticuerpos humanos monoclonales se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no-humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende una cadena pesada humana transgen y un transgen de cadena ligera fusionada a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo recombinante humano", como se utiliza en este documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) es decir transgénico o transcromosomal de genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado de los mismos, los anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano combinatoria, recombinante, y los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre el corte y empalme de todo o una porción de un gen de inmunoglobulina humano, secuencias para otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos recombinantes humanos tienen regiones variables en las que las regiones framework y CDR se derivan a partir de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos recombinantes humanos se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias de Ig humanas se utiliza, mutagénesis somática in vivo) y de tal manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras que se derivan y se relacionan con secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, no puede existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo.

Como se utiliza en este documento, "isotipo" se refiere a la clase del anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG tales como IgG1 o IgG4) que se proporciona por los genes de la región constante de cadena pesada.

Como se utiliza en este documento, el término "Afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre anticuerpo y antígeno en los sitios antigénicos únicos. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del anticuerpo "brazo" interactúa a través de fuerzas no-covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; más interacciones, más fuerte afinidad.

El término "KD", como se utiliza en este documento, tiene la intención de referirse a la constante de disociación, que se obtiene de la proporción de Kd con Ka (velocidad de disociación con velocidad de asociación) (i.e. Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para los anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos bien establecidos en el oficio. Un método para determinar la KD de un anticuerpo es utilizando la resonancia de plasmones superficiales, o utilizando un sistema biosensor tales como un sistema Biacore®.

Una molécula de enlace de acuerdo con la invención es preferiblemente un "anticuerpo aislado", que, como se utiliza en este documento, se refiere a un anticuerpo es decir sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a LINGO-1, LINGO-2 o LINGO-1 y LINGO-2 es sustancialmente libre de anticuerpos que específicamente unen los antígenos diferentes de aquellos mencionados). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a, sin embargo, puede tener reactividad en cruz con otros antígenos, tales como moléculas LINGO-1 o LINGO-2 a partir de otras especies. Además, se prefiere un anticuerpo aislado sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

La invención también proporciona una molécula de enlace de la invención que se puede seleccionar de una molécula de enlace de cadena simple que comprende un sitio de enlace de antígeno (especialmente con las CDRs descritas anteriormente del Anticuerpo 4784), del anticuerpo 4784 que comprende

a) un primer dominio que comprende la secuencia variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 5)

b) un segundo dominio que comprende la secuencia variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 4)

c) un ligador del péptido que se une ya sea con el extremo N- terminal del primer dominio y con el extremo C-terminal del segundo dominio o con el extremo C-terminal del primer dominio y con el extremo N-terminal del segundo dominio;

o equivalentes directos de estos.

Una molécula de enlace de la invención se puede seleccionar de una molécula de enlace de cadena simple que comprende un sitio de enlace de antígeno (especialmente con las CDRs descritas anteriormente para el Anticuerpo 4785) del anticuerpo 4785, que comprende

a) un primer dominio que comprende la secuencia variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 7)

b) un segundo dominio que comprende la secuencia variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 6)

c) un ligador de péptido que se une a cualquiera con el extremo N- terminal del primer dominio y con el extremo C-terminal del segundo dominio o con el extremo C-terminal del primer dominio y con el extremo N-terminal de segundo dominio;

o equivalentes directos de estos.

Como es bien conocido, cambios menores en una secuencia de aminoácido, tales como deleción, adición o sustitución de uno o varios aminoácidos pueden conducir a una forma alélica de la proteína original, que tiene propiedades sustancialmente idénticas. De esta manera, por el término “equivalentes directas de esta” se entiende cualquier molécula de enlace de dominio único (molécula X)

(i)

en la que la región variable de la molécula de enlace (por ejemplo SEQ ID NO: 4, 5, 6 o 7) es al menos 50 o 80% homóloga, preferiblemente al menos 90% homóloga, más preferiblemente al menos 95, 96, 97, 98, 99% homóloga a las regiones variables equivalentes de las cadenas ligera y pesada que comprenden el equivalente directo de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO:5, respectivamente o cadenas ligera y pesada que comprenden las equivalentes directas de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente).

(ii)

que es capaz de unirse al ectodominio (residuos 34-550) de LINGO-1 de rata (SEQ ID NO: 1), LINGO-1 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 2) y LINGO-1 humano (SEQ ID NO: 3), preferiblemente con una constante de disociación (KD) < 1000nM, más preferiblemente con una KD < 100 nM, más preferiblemente con una KD < 10 nM, o cualquier molécula de enlace de la invención que tiene al menos dos dominios por sitio de enlace (molécula X’).

De esta manera, la presente especificación además describe por ejemplo una molécula de enlace que es capaz de unirse al ectodominio de rata, mono cynomolgus y/o LINGO-1 humano con una constante de disociación < 1000nM y comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia la región variable que es al menos 50%, preferiblemente 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homóloga a las regiones variables equivalentes de las cadenas ligera y pesada de 4784 (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente) o cadenas ligera y pesada de 4785 (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente).

En otro aspecto, la molécula de enlace comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12-23, o una secuencia que es al menos 50%, preferiblemente 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homóloga a estas secuencias.

Esta constante de disociación se puede probar convenientemente en varios ensayos incluyendo, por ejemplo, el método FACS descrito en los ejemplos. Además, el enlace y efecto funcional de las moléculas de enlace se puede mostrar en un bioensayo, por ejemplo el ensayo de crecimiento neurítico como se describe a continuación.

La parte constante de una cadena pesada humana puede ser del tipo 1; 2; 3; 4; 1; 2;  o , preferiblemente del tipo , más preferiblemente del tipo 4, mientras que la parte constante de una cadena ligera humana puede ser del tipo  o A (que incluye los subtipos 1; 2; y 3) pero es preferiblemente del tipo . Las secuencias de aminoácido de todas estas partes constantes se dan en Kabat et al (Supra).

Los conjugados de las moléculas de enlace de la invención, por ejemplo conjugados de enzima o toxina o radioisótopo, también se incluyen dentro del alcance de la invención.

"Polipéptido", si no se especifica de otra manera en este documento, incluye cualquier péptido o proteína que comprende aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos, que tienen una secuencia de aminoácido que inicia en el extremo N-terminal y que termina en el extremo C-terminal. Preferiblemente, el polipéptido de la presente invención es un anticuerpo monoclonal, más preferido es un anticuerpo monoclonal quimérico (también llamado injerto-V) o humanizado (también llamado injerto-CDR). El anticuerpo monoclonal humanizado (injerto-CDR) puede

o no incluir otras mutaciones introducidas en las secuencias framework (FR) del anticuerpo aceptor.

Un derivado funcional de un polipéptido como se utiliza en este documento incluye una molécula que tiene una actividad biológica cualitativa en común con un polipéptido de la presente invención, i.e. que tiene la capacidad de unirse al ectodominio de LINGO-1 de rata, mono cynomolgus y humano.

Un derivado funcional incluye fragmentos y análogos peptídicos de un polipéptido de acuerdo con la presente invención. También incluye el término "derivados directos".

Los fragmentos comprenden regiones dentro de la secuencia de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Los fragmentos de moléculas de enlace, especialmente de anticuerpos, son fragmentos funcionales, i.e. comprenden al menos una porción capaz de unirse a LINGO-1 y/o LINGO-2, especialmente con al menos uno de los epitopes dados por SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50 y 51, preferiblemente con las afinidades de enlace (KD) mencionadas anteriormente o en los Ejemplos, especialmente como preferidos.

El término "derivado" se utiliza para definir variantes de la secuencia de aminoácido, y modificaciones covalentes de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Los derivados funcionales de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, por ejemplo de la región hipervariable de la cadena ligera y pesada, preferiblemente tiene al menos aproximadamente 65%, más preferiblemente al menos aproximadamente 75%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95, 96, 97, 98, 99% de homología de secuencia completa con la secuencia de aminoácido de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, y sustancialmente conservan la capacidad de unirse al ectodominio LINGO-1 de rata, mono cynomolgus y humano (y opcionalmente en adición con LINGO-2).

El término "modificación covalente" incluye modificaciones de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica; o un fragmento de esta con un agente de derivatización proteináceo o noproteináceo orgánico, las fusiones con secuencias de polipéptido heterólogo, y modificaciones post-translacionales. Los polipéptidos modificados covalentes, por ejemplo de una secuencia específica, aún tiene la capacidad de unirse al ectodominio LINGO-1 de rata, mono cynomolgus y humano. Las modificaciones se introducen tradicionalmente por reacción dirigida de los residuos de aminoácidos con un agente de derivatización orgánico es decir capaz de reaccionar con lados seleccionados o residuos terminales, o por mecanismos de aprovechamiento de modificaciones post-translacionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Ciertas modificaciones post-translacionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes en el polipéptido expresado. Los residuos glutaminil y aspariginil son desamidados con frecuencia post-translacionalmente a los correspondientes residuos glutamil y aspartil. Por otra parte, estos residuos se desaminaron bajo condiciones ligeramente ácidas. Otras modificaciones post-translacionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril, tirosina o treonil, metilación de los grupos α-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina, ver por ejemplo T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983). Las modificaciones covalentes por ejemplo incluyen proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica y sus variantes de la secuencia de aminoácido, tales como inmunoadhesinas, y las fusiones N-terminal con secuencias señal heterólogas.

"Homología" (o "identidad”) con respecto a un polipéptido nativo y su derivado funcional se define en este documento como el porcentaje de residuos de aminoácidos en las secuencias candidato que son idénticas con los residuos de un polipéptido nativo correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir los gaps, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de homología, y no considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de la secuencia. Ni las extensiones N- o C-terminal ni las inserciones serán interpretadas como identidad u homología reducida. Los métodos y programas de ordenador para la alineación son bien conocidos.

Preferiblemente, como se utiliza en este documento, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (i. e., % homología = # de posiciones idénticas/total # de posiciones x 100), teniendo en cuenta los número de gaps, y la longitud de cada gap, que necesiten ser introducidos para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no-limitantes a continuación: El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud del gap de 12 y una penalización del gap de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido se pueden determinar utilizando el algoritmo Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando cualquiera, una matriz 62 Blossom o una matriz PAM250, y un peso del gap de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.

Adicional o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente invención además pueden ser utilizados como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de la palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones gapped para propósitos de comparación, Gapped BLAST pueden ser utilizados como se describe en Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden ser utilizados. Ver http:www.ncbi.nhn.nih.gov.

"Aminoácido(s)" se refiere a todos los L-α-aminoácidos que ocurren naturalmente, por ejemplo e incluyendo Daminoácidos. Los aminoácidos se identifican por cualquier letra única bien conocida o designaciones de tres letras.

El término "variante de secuencia de aminoácido" se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos como en comparación con un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, incluso tienen la capacidad de unirse al ectodominio LINGO-1 de rata, mono cynomolgus y humano. Las variantes sustitucionales son aquellas que tienen al menos un residuo de aminoácido retirado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Estas sustituciones pueden ser únicas, donde sólo un aminoácido en la molécula ha sido sustituido, o pueden ser múltiples, donde dos o más, por ejemplo 1 a 10, preferiblemente 1 a 5, más preferiblemente 1 a 3, aminoácidos han sido sustituidos en la misma molécula. Las variantes de inserción son aquellas con uno o más, por ejemplo 1 a 100, tales como 1 a 10, aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Inmediatamente adyacentes a un aminoácido significa conectado a cualquier grupo funcional α-carboxi o α-amino del aminoácido. Las variantes de deleción son aquellas con uno o más, por ejemplo 1 a 100, tales como 1 a 10 o 1 a 5, aminoácidos en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, retirada. Por lo general, las variantes de deleción tendrán uno o dos aminoácidos suprimidos en una región particular de la molécula.

Una molécula de enlace de la invención se puede producir por técnicas de ADN recombinante. En vista de esto, una

o más moléculas de ADN que codifican la molécula de enlace se deben construir, colocar bajo las secuencias de control apropiadas y transferir en un organismo huésped apropiado para la expresión.

De una manera muy general, en consecuencia se proporcionan

(i)

moléculas de ADN que codifican una molécula de enlace de dominio único de la invención, una molécula de enlace de cadena simple de la invención, una cadena pesada o ligera o fragmentos de esta de una molécula de enlace de la invención; y

(ii)

el uso de las moléculas de ADN de la invención para la producción de unas moléculas de enlace de la invención por medios recombinantes.

El estado actual del oficio es tal que el experto será capaz de sintetizar las moléculas de ADN de la invención dada la información proporcionada en este documento i.e. las secuencias de aminoácidos de las regiones hipervariables y las secuencias de ADN codificantes de estas. Un método para construir un gen de dominio variable, por ejemplo se describe en EP 239 400 y se puede resumir brevemente de la siguiente manera: Un gen que codifica un dominio variable de un anticuerpo monoclonal de cualquier especificidad se clona. Los segmentos de ADN que codifican las regiones framework y las hipervariables se determinan y los segmentos de ADN que codifican las regiones hipervariables se retiran de tal manera que los segmentos de ADN codifican las regiones framework se fusionan junto con sitios de restricción apropiadas en los empalmes. Los sitios de restricción se pueden generar en las posiciones apropiadas por mutagénesis de la molécula de ADN por procedimientos estándar. Los casetes de región variable sintética de doble cadena se preparan por síntesis de ADN de acuerdo con las secuencias dadas anteriormente. Estos casetes se proporcionan con terminales pegajosos de tal manera que se pueden ligar en los empalmes con el framework mediante el protocolo estándar para lograr una molécula de ADN que codifica un dominio variable de inmunoglobulina.

Adicionalmente, no es necesario tener acceso al ARNm a partir de una producción de la línea celular de hibridoma con el fin de obtener una construcción de ADN codificante de los anticuerpos monoclonales de la invención. De esta manera, la aplicación PCT W0 90/07861 da instrucciones completas para la producción de un anticuerpo monoclonal por técnicas de ADN recombinante dando sólo información escrita en cuanto a la secuencia de nucleótidos del gen.

El método comprende la síntesis de un número de oligonucleótidos, su amplificación por el método PCR, y su corte y empalme para proporcionar la secuencia de ADN deseada.

Los vectores de expresión que comprenden un promotor o genes apropiados que codifican partes constantes de cadena pesada y ligera están disponibles al público. De esta manera, una vez una molécula de ADN de la invención se prepara, esta se puede transferir convenientemente en un vector de expresión apropiado.

Las moléculas de ADN que codifican los anticuerpos de cadena simple también se pueden preparar por métodos estándar, por ejemplo, como se describe en W0 88/1649.

En una modalidad particular de la invención, los medios recombinantes para la producción de algunas de las moléculas de enlace de la invención incluyen la primera y segunda construcciones de ADN, como se describe a continuación:

La primera construcción de ADN codifica una cadena pesada o fragmento de esta y comprende

a) una primera parte que codifica el dominio variable de la cadena pesada de cualquier anticuerpo 4784, ADN-4784 VH (SEQ ID NO: 8), o anticuerpo 4785, ADN-4785 VH (SEQ ID NO: 9); esta primera parte que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y que termina con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable, y

b) una segunda parte que codifica una parte constante de cadena pesada o fragmento de esta que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de la cadena pesada y los terminales con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o fragmento de este, seguido por un codón sin sentido.

Preferiblemente, la segunda parte codifica la parte constante de una cadena pesada humana, más preferiblemente la parte constante de la cadena 4 humana. Esta segunda parte puede ser un fragmento de ADN de origen genómico (que comprende intrones) o un fragmento de ADN (sin intrones).

La segunda construcción de ADN codifica una cadena ligera o fragmento de esta y comprende

a) una primera parte que codifica el dominio variable de la cadena ligera de cualquier anticuerpo 4784, ADN-4784 VL (SEQ ID NO: 10), o anticuerpo 4785, ADN-4785 VL (SEQ ID NO: 11); esta primera parte que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y que termina con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable, y

b) una segunda parte que codifica una parte constante de la cadena ligera o fragmento de esta que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de la cadena ligera y los terminales con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o fragmento de esta seguidos por un codón sin sentido.

Preferiblemente, la segunda parte codifica la parte constante de una cadena ligera humana, más preferiblemente la parte constante de la cadena  humana.

Cada una de las construcciones de ADN se coloca bajo el control de apropiadas secuencias control, en particular bajo el control de un promotor apropiado. Cualquier clase de promotor se puede utilizar, a condición de que se adapte al organismo huésped en el que las construcciones de ADN serán transferidas para la expresión. Sin embargo, si la expresión ha de tener lugar en una célula de mamífero, se prefiere particularmente utilizar el promotor de un gen de inmunoglobulina.

El anticuerpo deseado se puede producir en un cultivo celular o en un animal transgénico: Un animal transgénico apropiado se puede obtener de acuerdo con métodos estándar que incluyen micro inyección en huevos de la primera y segunda construcciones de ADN colocadas bajo apropiadas secuencias control que transfieren los huevos así preparados en apropiadas mujeres pseudo-embarazadas y la selección de un descendiente que expresa el anticuerpo deseado.

Cuando las cadenas del anticuerpo tienen que ser producidas en un cultivo celular, las construcciones de ADN primero se deben insertar en cualquiera un vector de expresión único o en dos vectores de expresión separados pero compatibles, siendo la última posibilidad la preferida.

En consecuencia, la invención también proporciona un vector de expresión capaz de replicar en un línea celular procariota o eucariota que comprende al menos una de las construcciones de ADN descritas anteriormente.

Cada vector de expresión que contiene una construcción de ADN, luego se transfiere en un organismo huésped apropiado. Cuando las construcciones de ADN se insertan por separado en dos vectores de expresión, pueden ser transferidos por separado, i.e. un tipo de vector por célula, o co-transferida, siendo esta última posibilidad la preferida. Un organismo huésped apropiado puede ser una bacteria, una levadura o una línea celular de mamífero, siendo esta última la preferida. Más preferiblemente, la línea celular de mamífero es de origen linfoide por ejemplo un mieloma, hibridoma o una célula B inmortalizada normal, pero no expresa ninguna cadena pesada o ligera endógena del anticuerpo.

También se prefiere que el organismo huésped contenga un gran número de copias de los vectores por célula. Si el organismo huésped es una línea celular de mamífero, este objetivo deseable se puede alcanzar mediante la amplificación del número de copias de acuerdo con métodos estándar. Los métodos de amplificación por lo general consisten en la selección de una resistencia mayor a un fármaco, siendo dicha resistencia codificada por el vector de expresión.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para producir una molécula de enlace multi-cadena de la invención, que comprende (i) cultivo de un organismo que se transforma con la primera y la segunda construcción de ADN de la invención y (ii) recuperación de una molécula de enlace activa de la invención a partir del cultivo.

Por otra parte, las cadenas pesadas y ligeras se pueden recuperar por separado y reconstituir en una molécula de enlace activa después del plegamiento de las proteínas in vitro. Los métodos de reconstitución son bien conocidos en el oficio; Ejemplos de métodos en particular se proporcionan en EP 120 674 o in EP 125 023. Por consiguiente un proceso también puede comprender

(i)

cultivo de un primer organismo que se transforma con una primera construcción de ADN de la invención y la recuperación de dicha cadena pesada o fragmento de esta a partir del cultivo y

(ii)

cultivo de un segundo organismo que se transforma con una segunda construcción de ADN de la invención y recuperación de dicha cadena ligera o fragmento de esta a partir del cultivo y

(iii) reconstitución in vitro de una molécula de enlace activa de la invención a partir de la cadena pesada o fragmento de esta obtenida en (i) y la cadena ligera o fragmento de esta obtenida en (ii).

De una manera similar, también se proporciona un proceso para producir una cadena simple o molécula de enlace de dominio único de la invención que comprende

(i)

cultivo de un organismo que se transforma con una construcción de ADN respectivamente que codifica una cadena simple o molécula de enlace de dominio único de la invención y

(ii)

recuperación de dicha molécula a partir del cultivo.

Las moléculas de enlace de la invención inhiben significantemente el enlace de LINGO-1 con NgR, atenúan significantemente la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal de rata adulta a concentraciones sub-nM y aumentan significantemente la diferenciación de oligodendrocitos in vitro como se ejemplifica a continuación:

Leyendas de las figuras

Figura 1. Efecto de Fabs 4784 y 4785 sobre AP-LINGO-1 unido a las células NgR:SH-SY5Y

Las células NgR:SH-SY5Y en suspensión se incuban con cualquiera AP o AP-LINGO-1 1 nM en la ausencia o presencia de 2 µM del indicado anti-LINGO-1 Fab o anti-hen lisozima Fab 3207. La actividad de AP unida en las células se mide como absorbancia a 405 nm después de unos 30 min de incubación con 1-StepTM PNPP. El enlace específico de AP-LINGO-1 se calcula como la diferencia entre la cantidad total de enlace de AP-LINGO-1 y la cantidad de enlace con AP sola. La media de porcentaje de inhibición de enlace específico (n=3, ±STD) se calcula como la diferencia porcentual entre la cantidad de enlace específico de AP-LINGO-1 en la presencia de Fab 3207 y la presencia de un anti-LINGO-1 Fab.

Figura 2. La desinhibición de mielina de la médula espinal por anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 4784 y 4785

A) células P7 CGN se incuban durante 16 hr en pozos cubiertos sin mielina de la médula espinal (sin SC, barras blancas) o pozos cubiertos con mielina de la médula espinal en la ausencia (SC, barras rojas) o presencia de anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1, un anticuerpo IgG4 anti-lisozima 3207 control (barras verdes) o 1 µm del inhibidor ROCK Y27632 (barra amarilla). ROCK es el mensajero secundario en la ruta de señalización de la mayoría, no todos, los inhibidores de crecimiento neurítico asociados con la mielina, incluyendo aquellos que no dan señal a través del complejo del receptor NgR y el tratamiento Y27632 como tal se utiliza como un control positivo de la atenuación de la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal (Fig. 1). El experimento se realiza en tres placas de 96 pozos con una condición SC y sin SC por placa a la cual los efectos de los anticuerpos en esta placa se comparan y la longitud media de neuritas por neurona (µm) se calcula de 500 neuronas por pozo en replicas de 10. El porcentaje de inhibición (texto de color blanco) se calcula como la diferencia porcentual en la longitud media de neuritas/neurona entre células sembradas en placas en pozos cubiertos con y sin SC. El porcentaje de desinhibición (texto en cursiva negro) se calcula como la diferencia en la longitud media de neuritas entre células sembradas en placas en SC en la presencia y ausencia de anticuerpo anti-LINGO-1 como un percentil de la diferencia entre células sembradas en placas en pozos cubiertos con y sin SC. *p<0.05, **p<0.01 (ANOVA de una vía, comparación Holm-Sidak con la longitud media de neuritas/neurona de células sembradas en placas en mielina de la médula espinal en la ausencia de anticuerpo).

B) Imágenes fluorescentes de un campo representativo de vista de células incubadas en pozos cubiertos sin mielina de la médula espinal (sin SC) y en pozos cubiertos con mielina de la médula espinal en la ausencia (SC) o presencia de 1 nM IgG4 control 3207 o IgG4 anti-LINGO-1 4784. El cultivo de células en mielina de la médula espinal en la presencia de 4784 tiene neuritas visiblemente más grandes y más neuritas por célula, que aquellas cultivadas en la ausencia del anticuerpo o presencia del anticuerpo control 3207.

Figura 3. Desinhibición de mielina de la médula espinal mediante anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 II

A) células P7 CGN se incuban durante 8 hr en pozos cubiertos sin mielina de la médula espinal (sin SC, barras blancas) o pozos cubiertos con mielina de la médula espinal en la ausencia (SC, barras rojas) o presencia de anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 o un anticuerpo IgG4 control anti-lisozima 3207. El experimento se realiza en tres placas de 96 pozos con una condición SC y sin SC por placa para la cual los efectos de los anticuerpos en esta placa se comparan y la longitud media de neuritas por neurona (µm) se calcula para 500 neuronas por pozo en replicas de 10. El porcentaje de inhibición (texto de color blanco) y de desinhibición (texto en cursiva negro) se calcula como arriba. **p<0.01 (ANOVA de una vía, comparación Holm-Sidak con la longitud media de neuritas/neurona para células sembradas en placas en mielina de la médula espinal en la ausencia de anticuerpo).

Figura 4. Desinhibición de mielina de la médula espinal mediante anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 III

Células P7 CGN se incuban durante 8 hr en pozos cubiertos sin mielina de la médula espinal (sin SC) o pozos cubiertos con mielina de la médula espinal en la ausencia (SC) o presencia de las concentraciones indicadas de anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 4784 o 4785, un anticuerpo IgG4 control anti-lisozima 3207 o 1 µM Y27632 (ROCK). El experimento se realiza en tres placas de 96 pozos con una condición SC y sin SC por placa para lo cual los efectos de los anticuerpos en esta placa se comparan y la longitud media de neuritas por neurona (µm) se calcula para 500 neuronas por pozo en replicas de 10. El porcentaje de inhibición (texto de color blanco) y de desinhibición (texto en cursiva negro) se calcula como arriba. *p<0.05, **p<0.01 (ANOVA de una vía, comparación Holm-Sidak con la longitud media de neuritas/neurona para células sembradas en placas en mielina de la médula espinal en la ausencia de anticuerpo).

Figura 5. Los anticuerpos Anti-LINGO-1 aumentan significantemente la diferenciación de oligodendrocitos inmaduros

A) OPCs recién aisladas se tratan con 100 nM de 4784, 4785 o control IgG4 3207 durante 3 días en medio DMEM/CNTF/T3 seguido por la tinción con el anticuerpo anti-04 para visualizar oligodendrocitos maduros e inmaduros (más grande, marcación más difusa) y la coloración del ácido nucleico DAPI (4’,6-diamidin-2’-fenil-indoldihidrocloruro) para visualizar los núcleos celulares (puntos circulares más pequeños). Los oligodendrocitos que portan procesos altamente ramificados y ampliados y estructuras similares a láminas se consideran por tener una morfología madura y se indican con flechas blancas. El tratamiento con anticuerpo Anti-LINGO-1 resulta en un aumento en la proporción de células O4-postivas con una morfología madura mientras que el tratamiento con IgG4control 3207 no tiene efecto.

B) La proporción de oligodendrocitos totales (gráfico izquierdo) y maduros (gráfico derecho) se cuantifican en tres experimentos independientes (1,2,3). La gráfica de la barra izquierda describe el porcentaje de núcleos teñidos con DAPI asociado con tinción-O4 y la gráfica de la barra derecha describe el porcentaje de células O4-positivas con una morfología madura (media de triplicados + STD). En cada gráfico de barras, la barra más a la izquierda no está con ningún tratamiento, el segundo a la barra izquierda Control con IgG Control, el siguiente representa el tratamiento con 4784 y más a la derecha el tratamiento con 4785. Los anticuerpos anti-LINGO-1 no tienen efecto en la proporción de células que son oligodendrocitos pero aumentan significantemente la proporción de oligodendrocitos con una morfología madura. * p<0.05, ** p<0.01, ANOVA de una vía con una comparación Holm-Sidak con la proporción de oligodendrocitos maduros en la presencia del IgG4 control 3207.

Figura 6. Los anticuerpos anti-LINGO-1 inhiben la expresión de la superficie celular de LINGO-1

A) Las células CHO-K1-hLINGO-1 o CHO-K1 no transfectadas se incuban a 37°C durante 24 hrs con 100 nM de 4784, 4785 y 3207 y LINGO-1 detectado a la superficie celular por otra incubación a temperatura ambiente durante 30 min con el anticuerpo anti-V5. Las células se fijan con 4% de PFA, se bloquean con BSA y se unen al anticuerpo anti-V5 detectado utilizando un conjugado anti-ratón-IgG (Fc específico)-POD es decir se desarrolla posteriormente utilizando un kit de ELISA 1-Step™ Turbo TMB. La absorbancia a 450 nm se toma como una medida de la cantidad de LINGO-1 en la superficie celular (media de triplicados ± STD). Un nivel muy bajo de enlace de anticuerpo anti-V5 se observa con células CHO-K1 no transfectadas. La incubación de células CHO-K1-hLINGO-1 con anticuerpos antiLINGO-1 pero no el IgG4 control 3207 resulta en una reducción significante en la cantidad de LINGO-1 en la superficie celular ** p<0.01, ANOVA de una vía con una comparación Holm-Sidak con la absorbancia después de la incubación con el IgG4 control 3207.

B) Las proteínas de superficie celular en células CHO-K1 o CHO-K1-hLINGO-1 no transfectadas son biotiniladas a 4°C y las células se incuban a 37°C durante los tiempos indicados con o sin 100 nM de 4784, 4785 y 3207. En el final del periodo de incubación, LINGO-1 se precipita a partir del lisado celular utilizando el anticuerpo anti-V5 acoplado a perlas de agarosa y LINGO-1 biotinilado (superficie celular) detectado por análisis de Western blot utilizando un anticuerpo anti-biotina. Ninguna señal se detecta para LINGO-1 biotinilado en células CHO-K1 no transfectadas. La incubación de células CHO-K1-hLINGO-1 con anticuerpos anti-LINGO-1 aumenta la velocidad de degradación de la superficie celular de LINGO-1.

Figura 7. Caracterización de Fabs anti-LINGO-1 por ELISA

Los valores de los análisis de ELISA se dan como los valores medios de unidades de fluorescencia relativa (RFU). Las afinidades de enlace de estos clones se caracterizan por ensayos de saturación FACS.

La presente invención también proporciona el uso de las moléculas de enlace de la invención en la promoción de regeneración axonal/plasticidad de un sistema nervioso de mamífero, en particular el sistema nervioso humano.

La invención también proporciona un método para promover la regeneración axonal/plasticidad de un sistema nervioso de mamífero, en particular sistema nervioso humano que comprende la administración de una cantidad efectiva de las moléculas de enlace de la invención a un paciente con necesidad de dicho tratamiento.

La invención también proporciona una composición farmacéutica para promover la regeneración axonal/plasticidad de un sistema nervioso de mamífero, en particular sistema nervioso humano que comprende las moléculas de enlace de la invención y un portador o diluente farmacéuticamente aceptable.

En particular, las moléculas de enlace de la invención son útiles para promover la regeneración axonal y plasticidad después de la lesión del SNC (el término lesión, en la presente aplicación, se refiere especialmente a la lesión causada por efectos mecánicos o químicos o debido a enfermedades o trastornos que por ejemplo conducen a la degeneración de neuronas, especialmente su estructura o forma, por ejemplo en enfermedades neurológicas tales como Enfermedad de Alzheimer o Parkinson u otros trastornos o enfermedades mencionados a continuación). De esta manera las moléculas de la invención tienen una amplia utilidad en particular para sujetos humanos. Por ejemplo las moléculas de enlace de la invención son útiles en el tratamiento de varias enfermedades del sistema nervioso periférico (SNP) y central (SNC), i.e. más particularmente en enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral Amiotrófica (ALS), patologías similares a demencia por cuerpos de Lewy u otras demencias en general, enfermedades después de un trauma craneal, cerebral o espinal y accidente cerebrovascular. Adicionalmente, dado que LINGO-1 es un regulador negativo de mielinización, las moléculas de enlace de la invención son útiles para promover la remielinización en combinación con la promoción de la regeneración axonal/plasticidad en enfermedades desmielinizantes que incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, desmielinización monofásica, encefalomielitis, leukoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielmolisis pontina, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, degeneración de Spongy, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática y enfermedad de Krabbe. En un ejemplo, las células que expresan las moléculas de enlace de la invención se pueden trasplantar a un sitio de la lesión de la médula espinal para facilitar el crecimiento axonal en todo el sitio de la lesión. Tales células trasplantadas proporcionarían un medio para recuperar la función de la médula espinal después de una lesión o trauma. Tales células podrían incluir células olfativas envainadas y células madre de diferentes linajes de injertos de tejidos o nervios fetales.

Además, las moléculas de enlace de la invención son útiles para el tratamiento de trastornos oculares degenerativos que pueden directa o indirectamente involucrar la degeneración de las células de la retina o de la córnea incluyendo retinopatías isquémicas en general, neuropatía óptica isquémica anterior, todas las formas de neuritis óptica, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular cistoide (EMC), retinitis pigmentosa, enfermedad de Stargardt, degeneración retinal viteliforme de Best, amaurosis congénita de Leber y otras degeneraciones retinales hereditarias, miopia patológica, retinopatía del prematuro, y neuropatía óptica hereditaria de Leber, los efectos después del trasplante de córneas o de cirugía corneal refractiva, y queratitis por herpes.

Adicionalmente, las moléculas de enlace de la invención son útiles para el tratamiento de condiciones psiquiátricas, particularmente esquizofrenia y depresión.

Para estas indicaciones, la dosificación apropiada, por supuesto, variará dependiendo de, por ejemplo, la molécula particular de la invención que será empleada, el modo de administración y la naturaleza y severidad de la condición que se trata. En general, la dosificación preferiblemente estará en el rango de 1 µg/kg/día a 1 mg/kg/día. Las moléculas de enlace de la invención se administran convenientemente por bombas o se inyectan como terapéuticos en el sitio lesionado o cerca de este, por ejemplo pueden ser administrados directamente en el SNC intracranealmente o en la espina por vía intratecal al sitio lesionado. Sin embargo, la administración sistémica no se excluye en este documento. Las moléculas de enlace de la invención se pueden proporcionar solas, o en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes. Por ejemplo, las moléculas de enlace de la invención se pueden administrar en combinación con anticuerpos anti-Nogo-A o agentes antiinflamatorios tales como, pero no limitados a, corticosteroides después del accidente cerebrovascular o lesión de la médula espinal como un medio para el bloqueo de otro daño neuronal y la inhibición de regeneración axonal, factores neurotróficos tales como NGF, BDNF u otros fármacos para enfermedades neurodegenerativas tales como Exelon™ o Levodopa. Otros socios de combinación apropiados para el tratamiento de accidente cerebrovascular son Alteplasa y Desmoteplasa (DSPA, por ejemplo revelados en WO90/09438). En una modalidad, la presente invención proporciona una combinación que comprende una molécula de enlace de la invención y la Desmoteplasa, en particular para el tratamiento de accidente cerebrovascular así como composiciones farmacéuticas que comprenden dicha combinación. Como se utiliza en este documento, se dice que dos agentes se administran en combinación cuando los dos agentes se administran de manera simultánea o se administran de forma independiente de un modo tal que los agentes actuarán en el mismo tiempo.

La estructura de los ingredientes activos identificados por números de códigos, nombres genéricos o comerciales se pueden tomar de la edición actual del compendio estándar "The Merck Index" o a partir de las bases de datos, por ejemplo Patents International (por ejemplo IMS World Publications) u otras bases de datos proporcionadas por IMS Health. Alguien de habilidad en el oficio está totalmente habilitado para identificar los ingredientes activos y, con base en estas referencias, también capacitado para fabricar y probar las indicaciones y propiedades farmacéuticas en modelos de prueba estándar, tanto in vitro como in vivo.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden fabricar de manera convencional. Por ejemplo, una composición de acuerdo con la invención que comprende las moléculas de la invención preferiblemente se proporciona en forma liofilizada. Para la administración inmediata se disuelve en un portador acuoso apropiado, por ejemplo agua estéril de inyección o solución salina fisiológica reguladora estéril.

Para ayudar en la fabricación de composiciones apropiadas, las moléculas de enlace de la invención y opcionalmente un segundo fármaco que realce el efecto de las moléculas de enlace de la invención, se pueden empacar por separado dentro el mismo contenedor, con las instrucciones para el mezclado o la administración concomitante. Candidatos opcionales de segundos fármacos se proporcionan anteriormente.

El efecto sinérgico de una combinación de las moléculas de enlace de la invención y los factores de crecimiento tales como NGF se puede demostrar in vivo mediante los modelos de lesión de la médula espinal.

La invención se entenderá más plenamente por referencia a los siguientes ejemplos. No deben, sin embargo, ser construidos como limitantes del alcance de la invención.

Los anticuerpos monoclonales de atención en los Ejemplos son moléculas de enlace de acuerdo con la presente invención que contienen para el anticuerpo 4784 la parte variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 4) y la parte variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 5) y que comprende para 4785 la parte variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 6) y la parte variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 7).

Se utilizan las siguientes abreviaturas:

AP fosfatasa alcalina de placenta humana

CDR región determinante complementaria ADNc ADN complementario

ELISA ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas

FACS selección de células por fluorescencia activada

FBS suero fetal bovino

5 HCMV promotor de citomegalovirus humano

IgG inmunoglobulina del isotipo G

PBS solución salina reguladora de fosfato

PCR reacción en cadena de la polimerasa

PFA paraformaldehido

10 PNPP para-nitrofenil fosfato

Ejemplo 1: Generación de células CHO-K1 que expresan LINGO-1 de longitud completa de rata, mono cynomolgus o humano y LINGO-2 humano

Una biblioteca de ADNc humana se genera por RT-PCR de ARN de referencia humano universal (Stratagene) utilizando cebadores al azar y oligo dT. Una biblioteca de ADNc de cerebro de mono cynomolgus se genera por RT15 PCR de ARN polyA aislado a partir de cerebro congelado de mono cynomolgus utilizando cebadores al azar y oligo dT. Una biblioteca de ADNc de cerebro de rata de Marathon-ready se obtiene de Clontech. ADNc que codifica la secuencia madura (residuos 34-614) de LINGO-1 humano (SEQ ID NO: 27), LINGO-1 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 28) y LINGO-1 de rata (SEQ ID NO: 29) flanqueada por los sitios 5’-XbaI y 3’-XhoI es amplificada por PCR a partir de la biblioteca respectiva utilizando el cebador hacia adelante DM14, 5’20 CTACGTCTAGAACGGGCTGCCCGCCCCGCT-3’ (SEQ ID NO: 30), y el cebador reverso DM15, 5’GGTTTCTCGAGTCATATCATCTTCATGTTGAACTTGCGG-3’ (SEQ ID NO: 31). El producto de PCR se divide con Xbal y Xhol y se inserta en los sitios respectivos del vector pSecTag2- V5 (SEQ ID NO: 32) para generar hLINGO-1pSecTag2-V5, cmLINGO-1-pSecTag2-V5 y rLINGO-1-pSecTag2-V5, respectivamente. El producto de proteína pronosticado es la secuencia madura de LINGO-1 fusionada al N-terminal con un residuo de 14 aminoácidos de V5 25 epitope tag vía un ligador de residuo de 2 aminoácidos. ADNc que codifica la secuencia madura (residuos 26-606) de LINGO-2 humano (SEQ ID NO: 33) flanqueada por los sitios 5’-Xbal y 3’-Xhol es amplificada por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro humano de Marathon-ready (Clontech) utilizando el cebador hacia adelante DM16, 5’-CTACGTCTAGAATTGGCTGCCCCGCTCGCT-3’ (SEQ ID NO: 34), y el cebador reverso DM17, 5’GGTTTCTCGAGTCAAATCATTTTCATGTTGAACCTCCTG-3’ (SEQ ID NO: 35). El producto de PCR se divide con 30 Xbal y Xhol y se inserta en los sitios respectivos del vector pSecTag2- V5 para generar hLINGO-2-pSecTag2-V5. El producto de proteína pronosticado es la secuencia madura de LINGO-2 fusionada al N-terminal con un residuo de 14 aminoácidos de V5 epitope tag vía un ligador de residuo de 2 aminoácidos. Las células CHO-K1 que expresan establemente LINGO-1 humano (CHO-K1-hLINGO-1), LINGO-1 de cynomolgous (CHO-K1-cmLINGO-1), LINGO-1 de rata (CHO-K1-rLINGO-1) y LINGO-2 humano (CHO-K1-hLINGO-2) se generan mediante la transfección de 35 células con hLINGO-1-pSecTag2-V5, cmLINGO-1-pSecTag2-V5, rLINGO-1-pSecTag2-V5 y hLINGO-2-pSecTag2V5, respectivamente, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transfectantes que expresan establemente se seleccionan con 1 mg/ml de zeocina (Invivogen) y clones aislados únicos ya sea por dilución en serie en placas de 96-pozos o por el uso de anillos clonales. La expresión de las construcciones en la superficie celular se confirma por análisis inmunofluorescentes utilizando un anticuerpo anti-V5

40 (InvitroGen).

Ejemplo 2: Generación y expresión de LINGO-1 humano-Fc y LINGO-1 humanoLRR-Fc

Un ARNm de MGC codificante de LINGO-1 humano (clon MGC:17422 IMAGE:4214343) se utiliza como plantilla de amplificación de PCR. El dominio extracelular (ECD) precedido por la secuencia señal natural (aa1-550) de LINGO-1 humano es amplificada por PCR con la polimerasa Pwo1 (Roche Diagnostics) y con cebadores que se adicionan a 45 un sitio de restricción Hindlll y una secuencia consenso Kozak en el terminal 5’ de la secuencia diana y un sitio de restricción Xhol inmediatamente después del último codón de la secuencia diana en el terminal 3’. El producto de PCR se digiere con HindIII y XhoI, se purifica en gel y se inserta en el plásmido pRS5a-IgG (SEQ ID NO: 36) previamente digerido con las mismas enzimas. La exactitud de la secuencia insertada, Fc completo y regiones flanqueantes en el clon de expresión resultante (natleader-hsLINGO-1-Fc/pRS5a, SEQ ID NO: 37) se confirma

50 mediante la secuenciación de ADN.

El mismo clon de MGC sirve como plantilla para la construcción mediante el gen SOEing del plásmido de expresión de LINGO-1 humano que carece del dominio LRR (aa34-65 + aa354-550). La región N-terminal de LINGO-1 ECD humano (aa34-65) es amplificado por PCR con cebadores que extienden el terminal 5’ con una secuencia codificante parcial de una señal de secreción heteróloga fusionada a LINGO-1 madura y la adición, en el terminal 3’, una secuencia codificante de los primeros siete aminoácidos del fragmento C-terminal. La región C-terminal de LINGO-1 ECD humano (aa354-550) es amplificado por PCR con cebadores que extienden el terminal 5’ con una secuencia codificante de los últimos siete aminoácidos del fragmento N-terminal y la adición, en el terminal 3’, un sitio Xhol inmediatamente después del último codón de la secuencia diana. Los dos productos de PCR se purifican en gel, se mezclan y sirven como plantilla de una segunda amplificación por PCR utilizando en el terminal 5’ un cebador que adiciona un sitio de restricción HindIII, una secuencia consenso Kozak y completa la secuencia señal de secreción heteróloga y, en el terminal 3’, el cebador externo previamente utilizado para amplificar el fragmento C-terminal. El producto de PCR se digiere con HindIII y XhoI, se purifica en gel y se inserta en el plásmido pRS5a-IgG previamente digerido con las mismas enzimas. La exactitud de la secuencia insertada, Fc completo y las regiones flanqueantes en el clon de expresión resultante (Igleader-hsLINGO-1-LRRFc/pRS5a, SEQ ID NO: 38) se confirma mediante la secuenciación de ADN.

Como una evaluación de expresión inicial ambas construcciones se probaron en experimentos a pequeña escala. Las células HEK.EBNA (Invitrogen, cat. no. previo R620-07) se cultivan de modo conectado en matraces de cultivo de tejido en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) estandarizado con Hepes 25 mM (Gibco/Life Technologies cat. no. 42430-025) y adicionalmente enriquecido con 10% de suero fetal bovino; los cultivos se conservaron a 37°C y 5% de CO2 en atmósfera humidificada. Para los experimentos de transfección a pequeña escala, 4x105 células se sembraron un día antes de la transfección en (placas) de 6-pozos cubiertos con poli-Dlisina. Las transfecciones se realizaron utilizando 3 µg de ADN de plásmido y 6 µl de reactivo de Lipofectamina2000 (Invitrogen cat.no. 11668-019) por pozo, esencialmente como se describe por el vendedor. Tres días después de la transfección los sobrenadantes celulares se cultivan y el sobrenadante libre de células se somete al análisis de proteínas, i.e. para análisis de HPLC de inmunoafinidad en columnas de Proteína G. Los títulos que oscilan entre 8 mg/l para la construcción natleader-hsLINGO-1-Fc/pRS5a y 40 mg/l para la construcción Igleader-hsLINGO-1-LRRFc/pRS5a se determinan. Posteriormente, para ambos plásmidos preparaciones de plásmidos a gran escala se preparan para permitir transfecciones transitorias en la escala multi-litros en cultivos de suspensión HEK.EBNA.

Para la producción de natleader-hsLINGO-1-Fc en escala ampliada, 2.9 L de cultivo celular HEK.EBNA a una densidad de 1.4x106 células/ml se mezcla con 1.1 L de solución ADN:PEI (1 µg de ADN:2 µg de PEI por ml). Después de la incubación de células durante 4 hrs, el cultivo se alimenta con 4 L de medio ExCell VPRO (SAFC, previamente JRH, Lenexa, KS). El sobrenadante del cultivo celular se cultiva después de 6 días del cultivo y se concentra por diafiltración a 1-L utilizando un filtro desechable Hemoflow F10HPS con un corte de 10 kDa (Fresenius Medical Care, Germany).

La segunda producción de proteína relevante corre para generar la proteína Igleader-hsLINGO-1-LRR-Fc se hace de una manera similar. Los detalles de una transfección a gran escala, la proporción ADN:PEI, las densidades celulares, la alimentación y cultivo son exactamente las mismas como se describe anteriormente.

a) natleader-hsLINGO-1-Fc

1 L concentrado (a partir de 8 L de sobrenadante de cultivo) se somete a cromatografía en 20 ml de Proteína A Sefarosa. Después del lavado de la línea base con NaPi 100 mM, pH 7.3, el material unido se eluye con citrato 50 mM, NaCl 140 mM, pH 2.7, se neutraliza y se filtra estéril. La fracción eluida además se concentra y se filtra con gel en Superdex 75 en PBS produciendo 8.2 mg del producto a una concentración de 1.2 mg/ml.

b) Igleader-hsLINGO-1-LRR-Fc

1 L de concentrado (a partir de 8 L de sobrenadante de cultivo) se somete a cromatografía en 20 ml de Proteína A Sefarosa. Después del lavado de la línea base con NaPi 100 mM, pH 7.3, el material unido se eluye con citrato 50 mM, NaCl 140 mM, pH 2.7, se neutraliza y se filtra estéril produciendo 52.5 mg del producto a una concentración de

1.5 mg/ml.

Las proteínas purificadas se caracterizan extensamente por secuenciación del N-terminal y por el análisis de masas del péptido MALDI después de la reducción/alquilación y digestión con tripsina.

Ejemplo 3: ensayo del enlace de AP-LINGO-1

Se espera que el bloqueo del enlace de LINGO-1 con NgR evite la señalización de tres inhibidores de crecimiento neurítico asociados con la mielina, a saber Nogo-66, MAG y OMgp, y por lo tanto atenúe la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de la mielina del SNC de tal manera que conduce a un aumento de la regeneración axonal/plasticidad y se mejora la recuperación funcional después de la lesión aguda del SNC. Para demostrar que

5

15

25

35

45

un anticuerpo anti-LINGO-1 bloquea el enlace de LINGO-1 con NgR, un ensayo puede ser utilizado que mide el enlace de fosfatasa alcalina de placenta humana (AP)- Ectodominio LINGO-1 de rata tagged (APLINGO-1) con las células SH-SY5Y que expresan establemente NgR (NgR-SH-SY5Y, Walmsley et. al. (2004) J Cell Sci 117, 45914602).

ADNc que codifica la mayoría del Ectodominio LINGO-1 de rata (residuos 34-532) flanqueado por los sitios 5’-Xho I y 3’-Xba I es amplificado por PCR a partir de rLINGO-1-pSecTag2-V5 utilizando el cebador hacia adelante DM22, 5’GGTTATCTCGAGACCGGCTGCCCGCCCC-3’ (SEQ ID NO: 24), y el cebador reverso DM23, 5’GGCCCTTCTAGATCACTCGCCTGGCTGGTTGGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 25). El producto de PCR se divide con Xhol y Xbal y se inserta en los sitios respectivos del vector APtag-5-NHIS (SEQ ID NO: 26) para generar APtag-5NHIS-solrLINGO-1. El producto de proteína pronosticado es la mayoría del Ectodominio LINGO-1 de rata fusionado al N-terminal con los residuos 23-511 de fosfatasa alcalina de placenta humana vía un ligador de residuos de 3 aminoácidos. Las células HEK293T se transfectan con APtag-5-NHIS-solrLINGO-1 utilizando lipofectamina2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El medio de transfección se retira 4 hrs después de la transfección y se reemplaza con OptiMEM I sin fenol rojo (Invitrogen). El medio se cultiva después de 24 hrs, se reemplaza y se cultiva otra vez después de otras 24 hrs. El medio se clarifica por centrifugación a 13000xg durante 5 min y el sobrenadante se concentra alrededor de 15-veces utilizando un dispositivo de filtro Centriprep (Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad AP del sobrenadante concentrado se mide utilizando 1-Step™ PNPP (Pierce) como cambio en la absorbancia a 405 nm en el tiempo y se transforma a una concentración utilizando la siguiente ecuación (aplica para un formato de placa de 96 pozos con 200 µl PNPP/pozo):

imagen1

El sobrenadante concentrado se somete a electroforesis en gel de SDS-PAGE y Western blotted como se describe (Walmsley et. al. (2004) J Cell Sci 117, 4591-4602). AP-LINGO-1 se detecta con 0.1 % (v/v) de anticuerpo antipenta-histidina (Qiagen) seguido por 0.02% (v/v) de anticuerpo anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa (Sigma) utilizando el sistema ECL™ (GE Healthcare). AP-LINGO-1 se visualiza como una banda de aproximadamente 110 kDa, similar a su peso molecular previsto de 112kDa. Ningún producto de degradación N-terminal se observa. Las células NgR:SH-SY5Y a 50% de confluencia se cultivan con solución reguladora de disociación libre de enzimas (Invitrogen) para preservar la superficie celular de las proteínas tales como NgR. AP 1 nM, AP-LINGO-1 1 nM o APLINGO-1 1 nM en la presencia de anti-LINGO-1 Fab 2 µM o un Fab 3207 control contra lisozima a partir de huevo de color blanco de gallina, se pre-incuban durante 30 min en OptiMEM (Invitrogen) y posteriormente se incuban con agitación constante durante 1.5 hr con células NgR:SH-SY5Y en suspensión. Las células se lavan 6 veces en HBH (HEPES 20 mM pH 7.4/1% de albúmina de suero de bovino en solución salina balanceada de Hanks) y se fijan en 4% de paraformaldehido (PFA)/5% de sacarosa en PBS durante 15 min. Después de la inactivación de la actividad AP endógena por incubación a 65°C durante 1 hr en HEPES 20 mM pH 7.4, en solución salina balanceada de Hanks, la actividad AP de célula-unida se cuantifica como absorbancia a 405 nm después de unos 30 min de incubación con 1-Step™ PNPP (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los Fabs se utilizan a una concentración de 2 µM, con el fin de saturar AP-LINGO-1 con Fab unido y de tal manera minimizar la influencia de sus afinidades en su capacidad para inhibir el enlace. La razón de esto es excluir la posibilidad de descartar prematuramente los Fabs a partir de otros estudios que fallan para inhibir el enlace debido a su baja afinidad en lugar de la posición de su sitio de enlace como la afinidad de tales Fabs se podría aumentar en las últimas etapas por maduración de afinidad y la conversión de IgG4. AP-LINGO-1 1 nM se pre-incuba con cualquiera el Fab 3207 control o Fabs 4784 y 4785 anti-LINGO-1 y luego permitir la unión en la presencia del Fab con las células NgR:SH-SY5Y en suspensión (Fig. 1). El porcentaje de inhibición en el enlace específico de APLINGO-1 en la presencia de los Fabs anti-LINGO-1 se normaliza a aquella de Fab 3207. 4784 y 4785 da una inhibición significante (p<0.01, ANOVA de una vía, comparación Holm-Sidak con el enlace específico de APLINGO-1 en presencia de control Fab 3207) de AP-LINGO-1 unido a las células.

El bloqueo del enlace de LINGO-1 con NgR se prevé para prevenir la señalización de los inhibidores asociados con la mielina Nogo-66, MAG y OMgp que conduce a una reducción en la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de la mielina del SNC. A este respecto, los Fabs 4784 y 4785 se convierten con el formato de IgG4 final (ver Ejemplo 8) y se valoró por su capacidad de atenuar la inhibición de crecimiento neurítico a partir de neuronas granulosas de cerebelo de ratas 7 días postnatales cultivadas en mielina de la médula espinal de rata adulta.

Ejemplo 4: ensayo de inhibición del crecimiento de neuritas

El ensayo in vitro más relevante para predecir el efecto de anticuerpos anti-LINGO-1 en la regeneración axonal/plasticidad in vivo es su capacidad de atenuar la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de la mielina del SNC. En este ensayo, neuronas granulosas de cerebelo de ratas de 7 días postnatales (CGN) se cultivan en pozos cubiertos con mielina de la médula espinal completa extraída de ratas adultas y el crecimiento neurítico se cuantifica mediante un Lector automatizado ArrayScan® HCS (Cellomics).

La actividad desinhibidora de anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 4784 y 4785 se valoró en el citado ensayo de crecimiento neurítico (Fig 2).

Tejido de médula espinal de rata fresco a partir de ratas adultas se homogeniza en 3 volúmenes (peso/v) solución reguladora de extracción (Chaps 60 mM, Tris 20 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, cóctel inhibidor de la proteasa), se incubada durante 30 min a 4°C y se clarifica por centrifugación a 170000xg durante 30 min a 4°C. Cada pozo en una placa de 96 pozos se cubre con 5 µl de nitrocelulosa en MeOH (5 cm2 de nitrocelulosa en 12 ml de MeOH), se seca al aire y se cubre con 100 µl de 5 µg/ml de poli-D-lisina por incubación durante 4 hr a 37°C. Después de tres lavados en agua, las placas se secaron al aire durante 1 hr y luego se cubren con 60 µg/cm2 de extracto de médula espinal mediante la incubación durante la noche a 37°C. Las células de CGN se purificaron recién preparadas a partir de la tripsina disociada de tejido de cerebelo de rata de 7 días postnatales como se describe previamente (Schweigreiter et al., 2004). El análisis de Western blot para detectar LINGO-1 se realiza en lisados a partir de las células CHO-K1 que expresan V5-tagged LINGO-1 de rata o Células P7 CGN utilizando 2µg/ml (o 13.3 nM) de anticuerpo policlonal anti-LINGO-1 (Upstate) seguido por 0.02 % (v/v) de conjugado con peroxidasa anticuerpo IgG anti-conejo (Sigma). Las células de CGN (35000 células/pozo) se incuban durante 30 min a 37°C en pozos cubiertos sin o con mielina de la médula espinal antes de la adición de cualquiera 0-100 nM anticuerpo IgG4 anti-LINGO-1 o el anticuerpo IgG4 3207 control. Después de una incubación durante 8-16 hr a 37°C, las células se fijan con 4% de PFA y se tiñen con Hoechst 3342 (Invitrogen) para la visualización del núcleo y el anticuerpo anti-β-tubulina III (R&D Systems) seguido por un anticuerpo IgG anti-ratón Alexa Fluor 546-conjugado (Invitrogen) para visualizar específicamente las neuronas. Los parámetros de crecimiento neurítico se determinan utilizando un Lector ArrayScan® HCS (Cellomics). ArrayScan® II automáticamente localiza, enfoca y expone los campos de células dentro una placa de microtitulación de 96-pozos. ArrayScan® consiste de un sistema óptico de alta resolución, un filtro de emisión de paso de bandas múltiples con filtro de excitación de banda única correspondiente (XF100), una cámara CCD con capturador, y software de aplicaciones del propietario. En este ensayo, se utiliza Extended Neurite Outgrowth Bioapplication. Una rueda de filtro de excitación y filtros de emisión de paso de bandas múltiples se utilizan para permitir la formación de imágenes multicanales de fluorescencia a partir de dos fluoróforos en las mismas células. Las imágenes de paso de bandas de núcleos 33342-etiquetados de Hoechst se adquieren para identificar células discretas, y las imágenes de paso de bandas de Alexa Fluor 488 luego se adquieren para identificar la extensión de las células marcadas con anticuerpo anti-tubulina (utilizando un conjugado secundario con Alexa Fluor 488). Los cuerpos inapropiados dentro de las células se excluyen automáticamente a partir del análisis, de tal manera que sólo cuerpos celulares de betatubulina y Hoechst solapados se analizan. Las imágenes de emisión dual se adquieren para 5 campos de 350 µm2 discretos en cada pozo de la placa. Utilizando un objetivo de 10-x, esto resulta en 400-500 células por pozo analizadas. La Extended Neurite Outgrowth Bioapplication luego reporta varias mediciones cuantitativas de morfología neuronal de células únicas, incluyendo longitud de neuritas, número de neuritas por célula, área del cuerpo celular, y puntos transversales y ramificados. La longitud media de neuritas por neurona (µm) se calcula para 500 neuronas por pozo en replicas de 10.

En el ensayo de crecimiento neurítico anterior, los anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 4784 y 4785 son desinhibidores a 1 y 10 nM, mientras que el IgG4 control contra lisozima no proporciona desinhibición a ambas concentraciones (Fig. 2). La longitud media de neuritas por neurona en mielina de la médula espinal en la presencia de 4784 y 4785 a ambas concentraciones es estadísticamente superior que aquella en la ausencia de anticuerpo. El nivel más grande de desinhibición logrado con el inhibidor ROCK Y27632 en comparación con los anticuerpos anti-LINGO-1 4784 y 4785 se espera que este compuesto inhiba las rutas de señalización de adicionales inhibidores de crecimiento neurítico asociados con la mielina, diferentes de aquellos de la señal a través del complejo del receptor NgR.

Para confirmar los resultados anteriores, el ensayo de crecimiento neurítico se repite (Fig. 3). De nuevo, los anticuerpos anti-LINGO-1 4784 y 4785 son desinhibidores a 1 nM y 10 nM, mientras que el IgG4 control contra el lisozima no proporciona la desinhibición a ambas concentraciones. La longitud media de neuritas por neurona en mielina de la médula espinal en la presencia de 4784 y 4785 a ambas concentraciones es estadísticamente superior que aquella en la ausencia de anticuerpo.

Para adicionalmente establecer la potencia de los anticuerpos anti-LINGO-1 4784 y 4785, el efecto en la inhibición del crecimiento neurítico de concentraciones sub-nM del anticuerpo se valoró (Fig. 4). 4784 y 4785 dieron una desinhibición significante (38-51% y 51-57%, respectivamente) de mielina de la médula espinal a concentraciones tan bajas como 0.1 nM, mientras que el anticuerpo antilisozima control no tiene efecto. De nuevo, el inhibidor ROCK Y27632 da un grado superior de desinhibición (65-74%) que los anticuerpos IgG4 anti-LINGO-1 como se espera.

Ejemplo 5: Ensayo de diferenciación primaria de oligodendrocitos

Se ha reportado que el bloqueo de la función de LINGO-1 por medio genético o por tratamiento con un antagonista de cuerpo-receptor, aumenta la proporción de oligodendrocitos maduros derivados de los cultivos de OPC purificados (Mi et al. (2005) Nat Neurosci 8, 745-751). Para evaluar la capacidad de anticuerpos anti-LINGO-1 para bloquear la función de LINGO-1 en cultivos OPC y promover la maduración de oligodendrocitos, OPCs de rata aislados recientemente se incuban con 4784, 4785 o IgG4 control 3207 durante 3 días en medio DMEM/CNTF/T3 seguido por la tinción con el anticuerpo anti-O4 para marcar tanto los oligodendrocitos maduros como inmaduros (Fig 5). El grado de maduración de oligodendrocitos se mide como la proporción de células O4-positivas que muestran una morfología madura.

Las poblaciones enriquecidas de OPCs se aíslan de ratas OFA P3. En resumen, el cerebro se diseca y los telencéfalos se colocan en solución salina reguladora de Hank congelada (HBSS, Invitrogen) que contiene 0.15% de MgSO4. El tejido se incuba con 1:1 HBBS/tripsina-EDTA (Invitrogen) y 100 µg/ml de ADNsa I (Roche) durante 10 min a 37°C y la tripsina se inactiva por la adición de FCS (Invitrogen) a una concentración final de 10%. La suspensión del tejido se centrifuga a 890 rpm durante 10 min y el pellet se re suspende en medio Basal de Eagle (BME, Invitrogen) con 10% de suero de caballo (Invitrogen). La suspensión se filtra a través de un filtro de células de 40 µm (BD Falcon) y las células se siembran en placas, en matraces para cultivo de tejidos de 80 cm2 pre-cubiertos con poli-D-lisina (BD Falcon), a 1 cerebro por matraz. Las células se cultivan a 37°C durante 11 días en BME/10% de suero de caballo. Las células microgliales se matan por la adición de L-leucina-metil éster 5 mM y los matraces se agitan mediante la agitación a 140 rpm durante 2 hrs. Las OPCs se cultivan mediante la agitación de los matraces durante la noche a 200 rpm a 37°C y cualquiera de los astrocitos que permanecen en el sobrenadante además se separan de las OPCs mediante el pre-adherencia durante 2 hrs a 37°C en cajas de cultivo bacteriano de 10 cm. Las células no-adherentes se recolectaron, se centrifugaron durante 10 minutos a 890 rpm y se sembraron en placas a aproximadamente 3 x 104 células/pozo en portaobjetos de cámara de 8 pozos cubiertos con poli-D-lisina (BD Falcon). Los cultivos se conservaron durante 3 días, ya sea en medio DMEM/T3/CNTF que consiste de DMEM (Invitrogen) que contiene 10 ng/ml de Factor Neurotrófico Ciliar (R&D Systems) y Triiodotironina 15 nM (Sigma) o en medio SATO que consiste de DMEM (Invitrogen) que contiene 10 µg/ml de transferrina (Sigma), 10 µg/ml de insulina (Sigma), putrescina 100 µM (Sigma), progesterona 200 nM (Sigma), tiroxina 520 nM (Sigma), Triiodotironina 500 pM (Sigma), selenito de sodio 220 nM (Sigma), 25 µg/ml de gentamicina (Sigma) y 1% de HS (Invitrogen). Para evaluar la pureza de los cultivos con respecto al linaje de oligodendrocitos, el porcentaje de células que se tiñen con el anticuerpo anti-04, se cuantifica después de 7 días de cultivo en medio SATO. Por lo general, 80-95% de las células se tiñen con el anticuerpo anti-04 demostrando que la mayoría de las células en el cultivo son del linaje de oligodendrocitos. Para evaluar la maduración de oligodendrocitos basándose en la morfología de oligodendrocitos, cultivos de OPC recién aisladas se incuban en medio DMEM/T3/CNTF durante 3 días en la ausencia o presencia de 4784, 4785 o IgG4 control 3207 100 nM, seguido por la tinción con el anticuerpo anti-04 para marcar tanto los oligodendrocitos maduros como los inmaduros y DAPI para marcar los núcleos celulares. Se considera que las células O4-positivas con procesos cortos claramente definidos, representan los oligodendrocitos inmaduros mientras que las células O4-positivas que portan proceso extendido y altamente ramificado con estructuras similares a láminas, se considera que representan oligodendrocitos maduros. La proporción de células O4-positivas con una morfología madura se cuantifica por alrededor de 300-1300 células por triplicado por el tratamiento y la importancia determinada utilizando ANOVA de una vía con una comparación Holm-Sidak con la proporción de oligodendrocitos maduros en la presencia del IgG4 control 3207. Para evaluar el efecto del tratamiento con anticuerpos en la proporción de oligodendrocitos totales (inmaduros y maduros) en el cultivo, la proporción de núcleos DAPI asociados con tinción-04 se cuantifica.

En tres experimentos independientes, el tratamiento con los anticuerpos anti-LINGO-1 4784 y 4785 aumentan significantemente la proporción de oligodendrocitos con una morfología madura como se representa por las células que portan procesos altamente ramificados que se extienden sobre un área amplia y estructuras similares a láminas (Fig 5). El tratamiento con el anticuerpo IgG4 control 3207 no tiene efecto en la proporción de oligodendrocitos maduros en el cultivo. La proporción de núcleos teñidos con DAPI asociados con tinción-04 es similar para todos los tratamientos, demostrando que los anticuerpos anti-LINGO-1 no tienen efecto en la proporción de células correspondiente para ambos oligodendrocitos maduros e inmaduros.

Como el tratamiento con anticuerpo anti-LINGO-1 no tiene efecto en la proporción de oligodendrocitos totales, el incremento en la proporción de oligodendrocitos maduros más probablemente se origina debido a un aumento en la velocidad de diferenciación de oligodendrocitos inmaduros con los oligodendrocitos maduros en lugar de un incremento en la velocidad de diferenciación de OPCs con los oligodendrocitos inmaduros.

Ejemplo 6: Inhibición de la expresión mediada con el anticuerpo anti-LINGO-1 de superficie celular de LINGO-1

El enlace de anticuerpos multi-valentes con objetivos de superficie celular puede conducir a la incorporación del anticuerpo: complejo diana y posterior degradación del objetivo dentro de la ruta endocítica (Weinmann et al. (2006) Mol Cell Neurosci 32, 161-173).

Para determinar el efecto de los anticuerpos anti-LINGO-1 en la cantidad de superficie celular de LINGO-1, las células CHOK1 o CHO-K1-hLINGO-1 no transfectadas (ver Ejemplo 1) se incuban a 37°C durante 24 hrs con 4784, 4785 o 3207 100 nM y la superficie celular de LINGO-1, posteriormente se detecta con un anticuerpo anti-V5 seguido por un conjugado IgG anti-ratón (Fc específico)-POD desarrollado con un kit 1-Step™ Turbo TMB-ELISA (Pierce) (Fig 6A).

La cantidad de superficie celular de LINGO-1 en células CHO-K1-hLINGO-1, se redujo significantemente después de una incubación por 24 hr con anticuerpos anti-LINGO-1 4784 y 4785, mientras que la incubación con el IgG4 control 3207 no tiene efecto. Además, la incubación con 4785 reduce la superficie celular de LINGO-1 a un grado mayor que el de 4784.

Para evaluar el efecto de anticuerpos anti-LINGO-1 en la degradación de la superficie celular de LINGO-1, proteínas de la superficie celular de en células CHO-K1 o CHO-K1-hLINGO-1 no transfectadas, son biotinilados a 4°C como se describe (Walmsley et al. (2004) J Cell Sci 117, 4591-4602) y las células se incuban a 37°C por varias veces durante un periodo de 180 min con o sin 100 nM 4784, 4785 o 3207 (Fig 6B). En el final del periodo de incubación, LINGO-1 se inmunoprecipita a partir del lisado celular utilizando el anticuerpo anti-V5 acoplado a perlas de agarosa y el LINGO-1 biotinilado se detecta en el precipitado por análisis de Western blot utilizando un anticuerpo anti-biotina (Sigma). La intensidad de la banda correspondiente a LINGO-1 biotinilado (y por lo tanto la superficie celular) aminora más rápidamente en las células CHO-K1-hLINGO-1 incubadas con los anticuerpos anti-LINGO-1 4784 y 4785 que en las células incubadas sin anticuerpo o con el IgG4 control 3207. Además, la incubación con 4785 aumenta la velocidad de degradación de superficie celular de LINGO-1 a un grado mayor que el de 4784.

Estos resultados muestran de forma acumulativa que los anticuerpos anti-LINGO-1 4784 y 4785 inhiben significantemente la expresión de LINGO-1 en la superficie celular más probablemente por el aumento de la incorporación y degradación de la proteína. Esta propiedad se espera que contribuya a la eficacia de estos anticuerpos en el bloqueo de la función de LINGO-1.

Ejemplo 7: Técnicas de Ensayo Inmunoabsorbente de Enzima Ligada (ELISA) y FACS

La proteína de fusión de LINGO-1-Fc recombinante humana se inmoviliza en placas Maxisorp de 96 o 384 pozos durante 1h a RT indirectamente por la captura de la parte Fc vía un anticuerpo Fc IgG anti-humano de cabra directamente inmovilizado (100µl o 20µl cubiertos a 10 µg/ml en PBS).

Después de recubrir de 20µl del antígeno a 5µg/ml en PBS, los pozos se bloquean con PBS / 0.05% de Tween (PBS-T) / 5% de leche en polvo durante 1 h a RT. Después del lavado los pozos con extractos de BEL PBS-T, Fabs purificados o IgGs control se diluyen en PBS, se adicionan a los pozos y se incuban durante 1 h a RT. Para detectar los anticuerpos primarios, los siguientes anticuerpos secundarios se aplican: conjugado de fosfatasa alcalina (AP) IgG anti-humano fragmento F(ab’)2 cabra AffiniPure o IgG anti-ratón (Jackson ImmunoResearch). Para la detección de conjugados – AP, sustratos fluorogénicos como AttoPhos (Roche) se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entre todas las etapas de incubación, los pozos de la placa de microtitulación se lavaron cinco veces con PBS-T y cinco veces después de la incubación final con anticuerpo secundario. La fluorescencia se mide en un lector de placa TECAN Spectrafluor.

Análisis FACS de anticuerpo unido a LINGO-1 expresado en la superficie celular de células transfectadas de CHOK1

Todas las tinciones se realizaron en placas de microtitulación de fondo redondo de 96-pozos (NUNC™, Wesbaden, Germany) con 2x105 células por pozo. Las células de la línea celular respectiva se resuspenden en PBS/ 3% de FCS / 0.02% de NaN3 (solución reguladora FACS) y se mezcla con a) anticuerpo de extractos periplásmicos o BEL lisados o b) fragmentos Fab purificados o c) IgG purificado diluido en solución reguladora FACS y se incuban a 4°C durante 30-60 min. Las células luego se lavan una vez con 150µl de solución reguladora FACS/pozo y se toman en 100 µl de anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (IgG anti-humano cabra conjugado R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que ha sido diluido 1:200 en solución reguladora FACS. Después de la incubación durante 30-60 min a 4°C, las células se lavaron una vez con solución reguladora FACS, se resuspenden en 100µl de solución reguladora FACS y enlace de anticuerpos específicos de LINGO-1 se mide vía intensidad de fluorescencia FL2 de células en FACSCalibur™ o FACSArray™ (Becton Dickinson). Para la identificación de los anticuerpos específicos de LINGO-1, se hicieron tinciones en paralelo utilizando CHO-K1-cmLINGO-1 o CHO-K1-rLINGO-1. Las células CHO-K1 no transfectadas sirven como un control adicional. LINGO-1 de mono cynomolgus y de rata que expresan las células se seleccionan para detectar como estas especies ortólogas difieren sólo en unos pocos aminoácidos a partir de la proteína de LINGO-1 humano. Se considera que solo estos clones son específicos de LINGO-1, los cuales son negativos en células CHO-K1 no transfectadas y ≥5x por encima del fondo de líneas celulares que expresan LINGO-1. La reactividad en cruz con LINGO-1 humano y otros ortólogos (LINGO-1 de cynomolgus, LINGO-1 de rata) y con el parálogo de LINGO-2 humano se prueba secuencialmente.

Después del análisis de secuencias se identifican treinta y uno (31) clones únicos, que muestran un fuerte enlace con la superficie celular expresada de LINGO-1 humano en el análisis FACS. Doce (12) ligantes muestran un fuerte enlace con LINGO-1 humano- Fc capturado en ELISA (señal: proporción de ruido mayor de 10:1) y siete (7)

mostraron enlace intermedio en ELISA (señal: proporción de ruido mayor de 5:1). Cuatro (4) de los ligantes mostraron un fuerte enlace de una proteína de fusión NgR-Fc humana capturada (R&D Systems) en ELISA y se suspenden. Otros tres (3) de los ligantes no reaccionan en cruz con todas las tres especies de LINGO-1 y se suspenden. Los restantes 24 clones que son reactivos en cruz con LINGO-1 humano/mono cynomolgus/rata pero no 5 con NgR-Fc humano se expresan, purifican y prueban por su capacidad para inhibir significantemente el enlace de LINGO-1 con NgR (ver Fig 1) y desinhibir la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal in vitro (ver Figs 2-4) que conduce a la selección de Fabs 4784 y 4785 para otros análisis. En un ELISA, 4784 y 4785 unido a LINGO-1-Fc humano capturado pero no se observa enlace con LINGO-1 humano-LRR-Fc o NgR-Fc humano en comparación con un Fc control no relacionado (ver Tabla 1 y Fig. 7). Esto indica que 4784 y

10 4785 tienen epitopes que están dentro la región LRR (residuos 66-353) de LINGO-1.

Tabla 1: Caracterización de anti-LINGO-1 Fabs por ELISA

LINGO-1 Humano

LINGO-1 Humano Fc LINGO-1 LRR-Fc Humana NgR-Fc Humana Fc no relacionado

4784

98 49 68 52

4785

113 8 7 6

Los valores del análisis de ELISA se proporcionan como valores medios de unidades de fluorescencia relativa.

Determinación de la afinidad de Fabs de anti-LINGO-1 seleccionados, utilizando análisis de saturación FACS

La afinidad basada en células de anti-anticuerpos específicos de LINGO-1 se determina por experimentos de enlace

15 de saturación FACS. Como la concentración del antígeno presente en la muestra para teñir las influencias los valores KD aparentes, sólo 1.25x104 células/pozo en contraste con 2x105 células/pozo se utilizan con el fin de reducir la concentración del antígeno en experimentos de saturación FACS. Por otra parte el procedimiento de tinción se hace idéntico al procedimiento de tinción FACS descrito anteriormente.

En detalle, CHO-K1-hLINGO-1, CHO-KI-cmLINGO-1 o CHO-K1-rLINGO-1 se separan a partir de matraces de cultivo

20 por verseno, se lavan con solución reguladora FACS y se resuspende en solución reguladora FACS. Los antiLINGO-1 Fabs purificados, se diluyen en serie en solución reguladora FACS y se dispersaron en placa de microtitulación de fondo redondo de 96-pozoss (NUNC™, Wiesbaden, Germany). Para cada concentración, pozos por duplicado se incuban con 1.25x104 células durante 30-60 min en hielo en un volumen total de 100µl. Después de una etapa de lavado por la aplicación de 150µl de solución reguladora FACS y la centrifugación durante 5 min a

25 400xg, los pellets celulares se resuspenden en 100µl de anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (IgG antihumano cabra conjugado R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que ha sido diluido 1:200 en solución reguladora FACS. Después de la incubación durante 30-60 min a 4°C, las células se lavaron una vez con solución reguladora FACS, se resuspenden en 100µl de solución reguladora FACS y el enlace de anticuerpos específicos de LINGO-1 se mide vía intensidad de fluorescencia FL2 de células en FACSArray™ (Becton Dickinson). Los valores KD

30 aparentes/valores EC50 se determinan a partir de las curvas de enlace de saturación utilizando software GraphPad Prism v3.03 o GraphPad Prism v4.03 que aplica un ajuste de la curva de regresión no-lineal.

Utilizando este ensayo los siguientes valores KD aparentes se pueden determinar (Tabla 2). En el formato Fab, el clon 4784 tiene afinidades más débiles para LINGO-1 humano, LINGO-1 de mono cynomolgus y LINGO-1 de rata (14.07nM, 27.11, y 24.03nM respectivamente). Sin embargo, el clon 4784 no se une a LINGO-2 humano en el 35 formato Fab. En el formato Fab el clon 4785 muestra afinidades de enlace subnanomolares (i.e. los valores KD aparentes que son menos de 1x10-9 M) con LINGO-1 humano, LINGO-1 de mono cynomolgus y LINGO-1 de rata. El clon 4785 muestra reactividad en cruz con LINGO-2 humano en formato Fab con afinidad baja nanomolar a subnanomolar. La consecuencia de reactividad en cruz con LINGO-2 no se puede valorar en el tiempo de la escritura como la función de LINGO-2 y la distribución son aún desconocidas. Sin embargo, los efectos benéficos no

40 se pueden excluir.

Tabla 2: Los valores KD aparentes de Fabs anti-LINGO-1 para LINGO-1 o LINGO-2 expresados por las células CHO-K1

LINGO-1 Humano

LINGO-2 Humana LINGO-1 de Cynomolgus LINGO-1 de Rata

4784

14.07 nb 27.11 24.03

4785

0.35 1.21 0.26 0.260

Los valores dados son valores medios de KDs aparentes en nM. nb, sin enlace.

Ejemplo 8: Clonación, expresión y purificación de HuCAL®IgG4

5 Conversión en el Formato IgG

Con el fin de expresar inmunoglobulina (Ig) de longitud completa, fragmentos de dominio variable de cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se subclonan a partir de los vectores de expresión pMORPH®X9_MH (SEQ ID NO: 39) Fab ya sea en la serie del vector pMORPH®_h_Ig (SEQ ID NOS: 40-42) o el pMORPH®2_h_Ig (SEQ ID NOS: 4345) para IgG4 humano.

10 Las enzimas de restricción EcoRI, Mfel, y BlpI se utilizan para subclonar del fragmento de dominio VH en pMORPH®_h_IgG4 (SEQ ID NO: 40): el esqueleto del vector se genera por digestión de EcoRI/BlpI y la extracción del fragmento de 6400 bp mientras que el fragmento VH (350 bp) se produce por la digestión con Mfel y BlpI y la posterior purificación. El vector e inserto se ligan a través de lanzamientos compatibles generados por los digeridos EcoRI y Mfel, respectivamente, y vía el sitio BlpI. Por consiguiente, ambos el sitio de restricción EcoRI y el Mfel se

15 destruyen.

Las enzimas de restricción Mfel y BlpI se utilizan para la subclonación del fragmento de dominio VH en pMORPH®2_h_IgG4 (SEQ ID NO: 43). En esta nueva generación de los vectores de IgG, bajo otras modificaciones, el sitio EcoRI (que permite sólo la subclonación a través de lanzamientos compatibles) se reemplaza por el sitio Mfel de tal manera permitiendo la digestión MfeI/BlpI de ambos, vector e inserto. La subclonación del fragmento del

20 dominio VL en pMORPH®_h_Igk (SEQ ID NO: 42) y pMORPH®2_h_Igk (SEQ ID NO: 45), se realiza vía los sitios EcoRV y BsiWI, mientras que la subclonación en pMORPH®_h_Ig(SEQ ID NO: 41) y pMORPH®2_h_Ig2 (SEQ ID NO: 43) se hace utilizando EcoRV y Hpal.

La expresión transitoria y la Purificación de IgG Humana

Las células HEK293 se transfectan con una cantidad equimolar de vectores de expresión de cadena pesada y ligera

25 de IgG. En los días 4 o 5 post-transfección el sobrenadante del cultivo celular se cultiva. Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8.0 y la filtración estéril, la solución se somete a cromatografía de columna de proteína A estándar (Poros 20A, PE Biosystems).

Ejemplo 9: Determinación de la afinidad de IgG4s anti-LINGO-1 seleccionado utilizando análisis de saturación FACS

30 La afinidad basada en células de anti-anticuerpos específicos de LINGO-1 se determina por experimentos de enlace de saturación FACS. La determinación de los valores KD aparentes, se lleva a cabo de la misma manera al procedimiento descrito anteriormente utilizando anticuerpos anti-LINGO-1 Fab.

En detalle, CHO-K1-hLINGO-1, CHO-K1-cmLINGO-1 o CHO-K1-rLINGO-1 se separan de matraces de cultivo por verseno, se lavan con solución reguladora FACS y se resuspenden en solución reguladora FACS. Anti-LINGO-1 35 IgG4s purificado se diluye en serie en solución reguladora FACS y se dispersaron en placas de microtitulación de fondo redondo de 96-pozos (NUNC™, Wiesbaden, Germany). Para cada concentración, los pozos por duplicado se incuban con 1.25x104 células durante 30-60 min en hielo en un volumen total de 100µl. Después de una etapa de lavado por la aplicación de 150µl de solución reguladora FACS y centrifugación durante 5 min a 400xg, los pellets celulares se resuspenden en 100µl de anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (IgG anti-humano cabra 40 conjugado R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que ha sido diluido 1:200 en solución reguladora FACS. Después de la incubación durante 30-60 min a 4°C, las células se lavaron una vez con solución reguladora FACS, se resuspende en 100µl de solución reguladora FACS y el enlace de anticuerpos específicos de LINGO-1 se mide a través de la intensidad de fluorescencia FL2 de células en FACSArray™ (Becton Dickinson). Los valores KD aparentes / valores EC50 se determinan a partir de las curvas de enlace de saturación utilizando software GraphPad

Prism v3.03 o GraphPad Prism v4.03 aplicando un ajuste de curva de regresión no-lineal. Utilizando este ensayo los siguientes valores KD aparentes se pueden determinar (Tabla 3).

La afinidad de anticuerpos IgG4 4784 y 4785 producidos utilizando la serie del vector pMORPH®2_h_Ig se muestran en la Tabla 3. 4784 y 4785 en el formato IgG4 tienen valores KD aparentes claramente por debajo de 1 nM para LINGO-1 humano, de cynomolgus y de rata. 4784 tiene una reactividad en cruz mucho menor para LINGO-2 humano que la de 4785.

Tabla 3: Los valores KD aparentes de anti-LINGO-1 IgG4s con LINGO-1 o LINGO-2 expresados por células CHO-K1

LINGO-1 Humano

LINGO-2 Humano LINGO-2 de Cynomolgus LINGO-1 de Rata

4784

0.29 25.94 0.62 0.98

4785

0.07 0.95 0.18 0.07

Los valores dados son valores medios de KDs aparentes en nM.

10 Ejemplo 10: Influencia de Fluido Cerebro-espinal humano sobre el Enlace de anti-LINGO-1 IG4s con LINGO-1 humano seleccionado, utilizando análisis FACS

Influencia de fluido cerebro-espinal humano sobre el enlace de anti-LINGO-1 IgG4s con LINGO-1 humano se prueba mediante experimentos de enlace de saturación FACS. Las diluciones en serie del 4784 y el 4785 se preparan. El enlace con CHO-K1-hLINGO-1 se prueba en la presencia de 50% de fluido cerebro-espinal humano. Las células se

15 tiñen en la presencia de CSF humano con estos anticuerpos IgG4 de acuerdo con las tinciones de FACS descritas anteriormente.

En detalle, CHO-K1-hLINGO-1 se separan a partir de matraces de cultivo por verseno, se lavan con solución reguladora FACS y se resuspenden en solución reguladora FACS. El anti-LINGO-1 IgG4s purificado se diluye en serie en solución reguladora FACS más 50% de suero humano y se incuba durante 60 min a 4°C. Como controles, 20 diluciones en serie de los ligantes candidatos en formato IgG4 se incuban en solución reguladora FACS con 2.6% de BSA que se asemeja al contenido de proteína de fluido cerebro-espinal humano durante 60min a 4°C. Después de la incubación las diluciones en serie se dispersaron en placa de microtitulación de fondo redondo de 96-pozoss (NUNC™, Wiesbaden, Germany). Para cada concentración, los pozos por duplicado se incuban con 1.25x104 células durante 30-60 min en hielo en un volumen total de 100µl. Después de tres etapas de lavado por la aplicación 25 de 150µl de solución reguladora FACS y la centrifugación durante 5 min a 400xg, los pellets celulares se resuspenden en 100µl de anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (IgG anti-humano cabra conjugado R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que ha sido diluido 1:200 en solución reguladora FACS. Después de la incubación durante 30-60 min a 4°C, las células se lavaron una vez con solución reguladora FACS, se resuspenden en 100µl de solución reguladora FACS y el enlace de anticuerpos específicos de LINGO-1 se mide vía intensidad de 30 fluorescencia FL2 de células en FACSArray™ (Becton Dickinson). Los valores KD aparentes/valores EC50 se determinan a partir de las curvas de enlace de saturación utilizando GraphPad Prism v3.03. Utilizando este ensayo la influencia de 50% de fluido cerebroespinal humano podría ser en comparación con los controles (Tabla 4). La incubación en 50% de fluido cerebro-espinal humano conduce a una disminución en la afinidad de enlace con todos los ligantes que se afectan de manera diferente. El impacto más fuerte en la afinidad de enlace por la presencia de

35 fluido cerebro-espinal humano se ve para 4784 que muestra una reducción en la afinidad por el 73% a partir de 0.43nM a 1.57nM.

Tabla 4: Influencia de Fluido Cerebro-espinal Humano sobre los valores KD aparentes de anti-LINGO-1 IgG4s con LINGO-1 expresados por las células CHO-K1

App. KD w/o 50% de CSF

App. KD w/CSF App. KD proporción w/o CSF: w/CSF

4784

0.43 1.57 0.27

4785

0.19 0.25 0.76

Los valores dados son valores medios de KDs aparentes en nM.

Ejemplo 11: Influencia de Suero Humano en el Enlace de IgG4s anti-LINGO-1 con LINGO-1 humano seleccionado utilizando un análisis FACS

La influencia de suero humano sobre el enlace de anti-LINGO-1 IgG4s con LINGO-1 humano se prueba mediante experimentos de enlace de saturación FACS. Las diluciones en serie de 4784 y 4785 se preparan en la presencia de 5 50% v/v de suero humano. Después de la incubación durante 60 min, las células se tiñen con estos anticuerpos IgG4 preincubados de acuerdo con las tinciones de FACS descritas anteriormente.

En detalle, CHO-K1-hLINGO-1 se separan a partir de matraces de cultivo por verseno, se lavan con solución reguladora FACS y se resuspende en solución reguladora FACS. Anti-LINGO-1 IgG4s purificado se diluyen en serie en solución reguladora FACS más 50% de suero humano y se incuba durante 60 min a 4°C. Como controles, las 10 diluciones en serie de los ligantes candidatos en IgG4 formato se incuban en solución reguladora FACS más 2.6% de BSA que se asemeja el contenido de proteína de suero humano o se incuban en solución reguladora FACS sola durante 60 min a 4°C. Después de la incubación las diluciones en serie se dispersaron en placas de microtitulación de fondo redondo de 96-pozos (NUNC™, Wiesbaden, Germany). Para cada concentración, los pozos por duplicado se incuban con 1.25x104 células durante 30-60min en hielo en un volumen total de 100µl. Después de tres etapas de 15 lavado por la aplicación de 150µl de solución reguladora FACS y la centrifugación durante 5 min a 400xg, los pellets celulares se resuspenden en 100µl de anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (IgG anti-humano cabra conjugado R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que ha sido diluido 1:200 en solución reguladora FACS. Después de la incubación durante 30-60 min a 4°C, las células se lavaron una vez con solución reguladora FACS, se resuspenden en 100µl de solución reguladora FACS y el enlace de anticuerpos específicos de LINGO-1 se mide

20 vía intensidad de fluorescencia FL2 de células en FACSArray™ (Becton Dickinson). Los valores KD aparentes/valores EC50 se determinan a partir de las curvas de enlace de saturación utilizando software GraphPad Prism v3.03 o GraphPad Prism v4.03 aplicando un ajuste de la curva de regresión no-lineal.

Utilizando este ensayo la influencia de preincubación en 50% de suero humano puede ser en comparación con los controles (Tabla 5). La incubación durante 1 hr en la presencia de suero humano no tiene efecto en los valores KD de

25 4784 y 4785. Estos anticuerpos son por lo tanto estables en suero humano durante este periodo de tiempo y, adicionalmente, como sus KDs no se modifican, no parecen reaccionar en cruz con los componentes de suero.

Tabla 5: Influencia de Suero Humano en los valores KD aparentes de anti-LINGO-1 IgG4s con LINGO-1, expresados por las células CHO-K1

Solución Reguladora FACS (FB)

FB+2.6% BSA FB + 50 % HS

4784

0.28 0.19 0.27

4785

0.08 0.05 0.06

Los valores dados son valores medios de KDs aparentes en nM.

30 Lista de Secuencias con descripción corta

SEQ ID NO: 1

Ectodominio LINGO-1 maduro de rata (residuos 34-550)

imagen1

SEQ ID NO: 2

Ectodominio LINGO-1 maduro de Cynomologus (residuos 34-550)

imagen1

SEQ ID NO: 3

Ectodominio LINGO-1 maduro humano (residuos 34-550)

imagen1

imagen1

SEQ ID NO: 4

4784 VL

imagen1

SEQ ID NO: 5

4784 VH

imagen1

SEQ ID NO: 6

4785 VL

imagen2

SEQ ID NO: 7

4785 VH

imagen1

SEQ ID NO: 8

15 ADN-4784 VH

imagen1

SEQ ID NO: 9

ADN-4785 VH

imagen1

SEQ ID NO: 10

ADN-4784 VL

imagen1

SEQ ID NO: 11

ADN-4785 VL

imagen1

10 SEQ ID NO: 12

Anticuerpo 4784 CDR-H1 SSGVGVG

SEQ ID NO: 13

Anticuerpo 4784 CDR-H2 15 HIGSDDDKYYSTSLKT

SEQ ID NO: 14

Anticuerpo 4784 CDR-H3 NQQYGDGYPGYFDY

SEQ ID NO: 15

20 Anticuerpo 4784 CDR-L1 SGDNIGNYYVY

SEQ ID NO: 16

Anticuerpo 4784 CDR-L2 EDTNRPS

SEQ ID NO: 17

Anticuerpo 4784 CDR-L3 QSYDNLHEQV

SEQ ID NO: 18

Anticuerpo 4785 CDR’-H1 DNSAAWS

SEQ ID NO: 19

Anticuerpo 4785 CDR’-H2 LIYLRSKWDNDYAVSVKS

SEQ ID NO: 20

Anticuerpo 4785 CDR’-H3 TGRADEFDV

SEQ ID NO: 21

Anticuerpo 4785 CDR’-L1 SGSSSNIGNNYVS

SEQ ID NO: 22

Anticuerpo 4785 CDR’-L2 RNSKRPS

SEQ ID NO: 23

Anticuerpo 4785 CDR’-L3 STYDTFSIV

SEQ ID NO: 24

Cebador hacia adelante DM22 GGTTATCTCGAGACCGGCTGCCCGCCCC

SEQ ID NO: 25

Cebador reverso DM23

GGCCCTTCTAGATCACTCGCCTGGCTGGTTGGAGATG

SEQ ID NO: 26

Vector APtag-5-NHIS

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imagen1

imagen1

SEQ ID NO: 27

Secuencia de ADN maduro de LINGO-1 humano

imagen1

SEQ ID NO: 28

Secuencia de ADN maduro de LINGO-1 de macacos Cynomolgus

imagen1

SEQ ID NO: 29

Secuencia de ADN maduro de LINGO-1 de rata

imagen1

imagen1

SEQ ID NO: 30

Cebador hacia adelante DM14 CTACGTCTAGAACGGGCTGCCCGCCCCGCT

SEQ ID NO: 31

Cebador reverso DM15 GGTTTCTCGAGTCATATCATCTTCATGTTGAACTTGCGG

SEQ ID NO: 32

Vector pSecTag2-V5

imagen1

imagen1

SEQ ID NO: 33

Secuencia de ADN maduro de LINGO-2 humano

imagen1

imagen1

SEQ ID NO: 34

Cebador hacia adelante DM16 CTACGTCTAGAATTGGCTGCCCCGCTCGCT

SEQ ID NO: 35

Cebador reverso DM17 GGTTTCTCGAGTCAAATCATTTTCATGTTGAACCTCCTG

SEQ ID NO: 36

pRS5a-IgG

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SEQ ID NO: 37

natleader-hsLINGO-1-Fc/pRS5a

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SEQ ID NO: 38

Igleader-hsLINGO-1-LRR-Fc/pRS5a

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SEQ ID NO: 39

Vector de Expresión Fab pMORPH®X9_MH

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SEQ ID NO: 40

Vector de Expresión IgG4pMORPH®_h_Ig4

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SEQ ID NO: 41

Vector de Expresión de Cadena Lambda IgG pMORPH®_h_Ig lambda

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SEQ ID NO: 42

Vector de Expresión de Cadena kappa IgG pMORPH®_h_Ig_kappa

58

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SEQ ID NO: 43

Vector de Expresión IgG4pMORPH2®_h_Ig4

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SEQ ID NO: 44

Vector de Expresión de Cadena Lambda IgG pMORPH®2_h_Ig_lambda2

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SEQ ID NO: 45

IgG kappa Chain Expression Vector pMORPH®2_h_Ig_kappa

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> Novartis AG

<120> anticuerpos lingo <130> 50515A 5 <160> 51

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 517

<212> PRT 10 <213> Rattus sp.

<400> 1

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imagen1

imagen1

<210> 2

<211> 517

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 2

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imagen1

imagen1

imagen1

<210> 3

<211> 517

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 4784 VL

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 4784 VH

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 4785 VL

<400> 6

imagen1

<210> 7 <211> 121

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 4785 VH

<400> 7

imagen1

imagen1

<210> 8

<211> 372

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> ADN 4784 VH

<400> 8

imagen1

<210> 9 5 <211> 363

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> ADN 4785 VH 10 <400> 9

imagen1

<210> 10

<211> 327

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> ADN 4784 VL

<400> 10

imagen1

<210> 11 10 <211> 330

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> ADN 4785 VL 15 <400> 11

imagen1

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4784 CDR-H1

<400> 12

imagen1

10 <210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial

<220> 15 <223> Anticuerpo 4784 CDR-H2

<400> 13

imagen1

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4784 CDR-H3

<400> 14

imagen1

<210> 15 10 <211> 11

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4784 CDR-L1 15 <400> 15

imagen1

<210> 16

<211> 7

<212> PRT 20 <213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4784 CDR-L2

<400> 16

imagen1

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4784 CDR-L3

<400> 17

imagen1

10 <210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220> 15 <223> Anticuerpo 4785 CDR’-H1

<400> 18

<210> 19

<211> 18 20 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4785 CDR’-H2

<400> 19

imagen1

imagen1

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4785 CDR’-H3

<400> 20

imagen1

10 <210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220> 15 <223> Anticuerpo 4785 CDR’-L1

<400> 21

imagen1

<210> 22

<211> 7 20 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4785 CDR’-L2

<400> 22

imagen1

<210> 23 5 <211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Anticuerpo 4785 CDR’-L3 10 <400> 23

imagen1

<210> 24

<211> 28

<212> ADN 15 <213> artificial

<220>

<223> DM22

<400> 24

ggttatctcg agaccggctg cccgcccc 28 20 <210> 25

<211> 37

<212> ADN

<213> artificial

<220> 25 <223> DM23

<400> 25 ggcccttcta gatcactcgc ctggctggtt ggagatg 37

<210> 26

<211> 6602

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> vector APtag-5-NHIS

<400> 26

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 27

<211> 1743

<212> ADN

<213> Homo sapiens <400> 27

imagen1

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imagen1

<210> 28

<211> 1743

<212> ADN

<213> Macaca fascicularis

<400> 28

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 29

<211> 1743

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<400> 29 <210> 30

imagen1

<211> 30

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> DM14

<400> 30 ctacgtctag aacgggctgc ccgccccgct 30

<210> 31

<211> 30 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> DM15

<400> 31 10 ctacgtctag aacgggctgc ccgccccgct 30

<210> 32

<211> 5045

<212> ADN

<213> artificial 15 <220>

<223> vector pSecTag2-V5

<400> 32

imagen1

imagen1

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imagen1

imagen1

<210> 33

<211> 1743

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

imagen1

imagen1

<210> 34

<211> 30

<212> ADN 5 <213> artificial

<220>

<223> DM16

<400> 34

ctacgtctag aattggctgc cccgctcgct 30 10 <210> 35

<211> 39

<212> ADN

<213> artificial

<220> 15 <223> DM17 <400> 35 ggtttctcga gtcaaatcat tttcatgttg aacctcctg 39

<210> 36

<211> 7086

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> pRS5a-IgG

<400> 36

imagen2

imagen1

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imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 37

<211> 8751

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> natleader-hsLINGO-1-Fc/pRS5a

<400> 37

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 38

<211> 7830

<212> ADN <213> artificial

<220>

<223> Igleader-hsLINGO-1-?LRR-Fc/pRS5a

<400> 38

imagen1

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imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 39

<211> 5025

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector de Expresión Fab pMORPH®X9_MH

<400> 39

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 40

<211> 6746

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector de Expresión IgG4pMORPH®_h_Ig 4

<400> 40

imagen1

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imagen1

imagen1

imagen1

<210> 41

<211> 5627

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector de Expresión de Cadena Lambda IgG pMORPH®_h_Ig_lambda

<400> 41

imagen1

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imagen1

<210> 42

<211> 5629

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector de Expresión de Cadena kappa IgG pMORPH®_h_Ig_kappa

<400> 42

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<210> 43 <211> 7101

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector de Expresión IgG4pMORPH2®_h_Ig 4

<400> 43

imagen1

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imagen1

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imagen1

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<210> 44

<211> 5983

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector de Expresión de Cadena Lambda IgG pMORPH®2_h_Ig_lambda2

<400> 44

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imagen1

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<210> 45

<211> 5986

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector de Expresión de Cadena kappa IgG pMORPH®2_h_Ig_kappa

<400> 45

imagen1

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imagen1

imagen1

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

imagen1

<210> 47

<211> 12 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

imagen1

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

imagen1

10 <210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

imagen3

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 50

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<210> 51

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citadas en la descripción

•

WO 200600247 A [0007]

•

US 20050214288 A [0007]

•

EP 239400 A [0072]

•

WO 9007861 A [0073]

•

WO 881649 A [0076]

•

EP 120674 A [0089]

•

EP 125023 A [0089]

•

WO 9009438 A [0099] Literatura no-patente citada en la descripción

•

Schwab. Curr Opin Neurobiol, 2004, vol. 14, 118-124 [0002]

•

Chen et al. Nature, 2000, vol. 403, 434-439 [0002]

•

GrandPre et al. Nature, 2000, vol. 403, 439-444 [0002]

•

Prinjha et al. Nature, 2000, vol. 403, 383-384 [0002]

•

McKerracher et al. Neuron, 1994, vol. 13, 805-811 [0002]

•

Wang et al. Nature, 2002, vol. 417, 941-944 [0002]

•

Oertle et al. J Neurosci, 2003, vol. 23, 5393-5406 [0002]

•

Fournier et al. Nature, 2001, vol. 409, 341-346 [0002]

•

Domeniconi et al. Neuron, 2002, vol. 35, 283-290 [0002]

•

Liu et al. Science, 2002, vol. 297, 1190-1193 [0002]

•

Niederöst et al. J Neurosci, 2002, vol. 22, 10368-10376 [0002]

•

Schweigreiter et al. Mol Cell Neurosci, 2004, vol. 27, 163-174 [0002]

•

Fournier et al. J Neurosci, 2002, vol. 22, 8876-8883 [0002]

•

Barton et al. EMBO J, 2003, vol. 22, 3291-3302 [0002]

•

Pignot et al. J Neurochem, 2003, vol. 85, 717-728 [0002]

•

Venkatesh et al. J Neurosci, 2005, vol. 25, 808-822 [0002]

•

Wang et al. Nature, 2002, vol. 420, 74-78 [0003]

•

Carim-Todd et al. Eur J Neurosci, 2003, vol. 18, 3167-3182 [0003]

•

Mi et al. Nat Neurosci, 2004, vol. 7, 221-228 [0003]

•

Park et al. Neuron, 2005, vol. 45, 345-351 [0003]

•

Shao et al. Neuron, 2005, vol. 45, 353-359 [0003]

•

Mi et al. Nat Neurosci, 2005, vol. 8, 745-751 [0005] [0127] 5 • Inoue et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, vol. 104, 14430-14435 [0007]

•

Ji et al. Mol. Cell Neurosc., 2006, vol. 33, 311-320 [0007]

•

Ward et al. Nature, 1989, vol. 341, 544-546 [0043]

•

T. E. Creighton. Proteins: Structure and Molecular Properties. W. H. Freeman & Co, 1983, 79-86 [0064]

•

E. Meyers ; W. Miller. Comput. Appl. Biosci., 1988, vol. 4, 11-17 [0066] 10 • Needleman ; Wunsch. J. Mol, Biol., 1970, vol. 48, 444-453 [0066]

•

Altschul et al. J.Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-10 [0067]

•

Altschul et al. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 25 (17), 3389-3402 [0067]

•

Walmsley. J Cell Sci, 2004, vol. 117, 4591-4602 [0116] [0118]

•

Weinmann et al. Mol Cell Neurosci, 2006, vol. 32, 161-173 [0131] 15 • Walmsley et al. J Cell Sci, 2004, vol. 117, 4591-4602 [0134]

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula de enlace que es capaz de unirse a la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, con una constante de disociación <1000nM, y que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia las siguientes CDRs: cualquiera de las dos,

   (i)

   CDR-H1 de SEQ ID NO:12, CDR-H2 de SEQ ID NO:13, CDR-H3 de SEQ ID NO:14, CDR-L1 de SEQ ID NO: 15, CDR-L2 de SEQ ID NO:16 y CDR-L3 de SEQ ID NO:17, o,

   (ii)

   CDR’-H1 de SEQ ID NO:18, CDR’-H2 de SEQ ID NO:19, CDR’-H3 de SEQ ID NO:20, CDR’-L1 de SEQ ID NO:21, CDR’-L2 de SEQ ID NO:22 y CDR’-L3 de SEQ ID NO:23.

2. 2. Una molécula de enlace que es capaz de unirse a la proteína de acuerdo con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, o SEQ ID NO:3, con una constante de disociación <1000nM, y que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia las regiones variables de cadena pesada y ligera que son cualquiera

   (i)

   al menos 50% idénticas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5 respectivamente, o,

   (ii)

   al menos 50% idénticas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7 respectivamente.

3. 3.

   La molécula de enlace de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que es capaz de atenuar la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal a una concentración de menos de 20nM.

4. 4.

   La molécula de enlace de acuerdo con la reivindicación 1, 2, o 3, que es capaz de aumentar la longitud media de las neuritas por célula de las células granulares de cerebelo de rata, cultivadas sobre un sustrato de mielina de la médula espinal de rata adulta, por al menos 20%.

5. 5.

   La molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es un anticuerpo o un fragmento de esta.

6. 6.

   La molécula de enlace de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que es un anticuerpo monoclonal humano o quimérico o humanizado.

7. 7.

   La molécula de enlace de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que la parte constante o el fragmento de esta de la cadena pesada humana es del tipo 4 y la parte constante o el fragmento de esta de la cadena ligera humana es del tipo .

8. 8.

   La molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5-7, seleccionada del grupo que consiste de: cualquiera,

   (i)

   un anticuerpo que comprende la parte variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:4 y la parte variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:5, o

   (ii)

   un anticuerpo que comprende la parte variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:6 y la parte variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:7

9. 9.

   Un polinucleótido que codifica una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. 10.

    Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9; o del grupo que consiste de SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

11. 11.

    Un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10.

12. 12.

    Un sistema de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en donde dicho sistema de expresión o parte de esta es capaz de producir una molécula de enlace de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, cuando dicho sistema de expresión o parte de esta, está presente en una célula huésped compatible.

13. 13.

    Una célula huésped aislada que comprende un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 12.

14. 14.

    Una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para utilizar como un medicamento.

15. 15. Una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para utilizar en el tratamiento 5 de una lesión del SNC.

16. 16.

    El uso de una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión del SNC.

17. 17.

    Una composición farmacéutica que comprende una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con al menos un portador o diluente farmacéuticamente aceptable.

    10 18. Una composición farmacéutica de la reivindicación 17, que comprende un anticuerpo de la Reivindicación 8.