ES2363551B2 - Método histológico optimizado para la preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de tejidos de vertebrados. - Google Patents
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Abstract
Método histológico optimizado para la
preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de
tejidos de vertebrados, caracterizado porque combina la fijación por
criosustitución y la inclusión en una cera o parafina de baja
temperatura de fusión. El método objeto de la presente invención
mejora la mayoría de los métodos histológicos actuales diseñados
para microscopía óptica. Dicho método también mejora las propiedades
antigénicas de tejidos embrionarios y adultos de anfioxo, Danio
rerio y ratón, preservando su estructura y previniendo la
degradación de ARN. Este método constituye una buena alternativa los
métodos de histología clásica utilizados normalmente en estudios de
embriogénesis de vertebrados frente a problemas tan comunes como la
labilidad de epítopos o la intercalación de tejidos rígidos en
tejidos blandos.
Description
Método histológico optimizado para la
preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de
tejidos de vertebrados.
La presente invención se encuadra en el ámbito
de la Histología, y más concretamente en el contexto de los métodos
para la preservación y el mantenimiento de muestras histológicas de
vertebrados.
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La preservación y el mantenimiento de la
arquitectura celular y de la antigenicidad nativa durante el
procesado histológico es un reto continuo de la Biología Celular.
Durante los últimos diez años, se ha desarrollado el estudio de un
buen número de organismos modelos útiles para el análisis
experimental de muchos aspectos de la biología de los vertebrados,
incluido su desarrollo (Haffter et al. 1996; Capdevila et
al. 2000). La Biología del Desarrollo y otras disciplinas
también requieren técnicas histológicas que permitan localizar tanto
ARN mensajeros como proteínas en experimentos dirigidos a conocer la
regulación y función génicas.
Las técnicas actuales más usadas son la fijación
mediante paraformaldehído (PFA) seguida de crioprotección y
secciones al criostato (Westerfield 2000) o inclusión en parafina y
secciones al microtomo. Sin embargo, el PFA es mal un fijador de las
propiedades reactivas de los tejidos, tales como la antigenicidad o
la actividad enzimática.
En los casos de epítopos sensibles a los métodos
más comunes de fijación se suelen usar fijadores de naturaleza
alcohólica o de sales como el Zn. Estos, sin embargo, no ofrecen una
apropiada preservación tisular y consecuentemente no permiten la
obtención de secciones histológicas de buena calidad.
La presente invención supone una optimización de
los métodos y técnicas conocidos en la actualidad, lo que se
consigue mediante la combinación de la fijación por criosustitución
(Hippe et al. 1989, Monaghan and Robertson. 1990, Quintana
1994 and Usuda et al. 1990) y la inclusión en una cera o
parafina de baja temperatura de fusión, en torno a 40ºC, como por
ejemplo la cera Polyester Wax (Steedman, 1957). La invención
consiste en un método nuevo con el cual se logra una preservación
óptima de la morfología y de las propiedades reactivas del tejido.
Este método respeta la forma general de la muestra, eliminando los
artefactos debidos a la retracción tisular.
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El objeto de la presente invención es un nuevo
método optimizado de preservación histológica e histoquímica que
mejora las técnicas más utilizadas actualmente y ofrece una
alternativa a los métodos clásicos. El método en cuestión es
compatible con cualquier método de tinción de secciones
histológicas, como la inmunolocalización o la hibridación in
situ.
Por último, el proceso de fijación se combina
con materiales de inclusión óptimos para la integridad tisular a la
vez que sigue preservando la antigenicidad natural del tejido y
reduce pasos del protocolo que aumentan la eficacia del proceso: La
criosustitución implica la deshidratación inmediata de las muestras,
lo que permite la eliminación de numerosos pasos de deshidratación
que pueden alterar la integridad de las muestras; la cera o parafina
de poliéster es soluble en alcoholes, lo que permite evitar el uso
de solventes agresivos (por ejemplo, xileno) durante los pasos de
desparafinado, siendo sustituibles por etanol 100º 0 ó 96º.
El método reivindicado comprende las siguientes
fases o etapas:
El método objeto de la presente invención
comprende el uso de fijación alcohólica (criosustitución en metanol)
efectuada a bajas temperaturas, muy efectivo para el mantenimiento
de la antigenicidad. La fijación comprende el tratamiento de las
muestras, adecuadamente preparadas, con isopentano y metanol.
La realización de dicho método comprende un
soporte en columnas diseñado para la optimización del proceso y que
son reivindicadas dentro de la misma invención. El solicitante no
conoce la descripción de ningún mecanismo para preservar la forma de
muestras criosustituidas. Las columnas reivindicadas, formadas por
dos tubos de un material resistente a bajas temperaturas, permiten
una sustitución sin contacto con objetos que evita que muestras
blandas o con disposición definida se deformen por el soporte. Las
columnas contienen, una de ellas, isopentano y, la otra, metanol,
siendo el volumen de isopentano y de metanol preferentemente
proporcional al volumen de la muestra. Las columnas son de tamaño
variable, condicionado por el tamaño de la muestra. La longitud de
la columna que contiene isopentano es proporcional el tiempo de
sustitución en caída libre. Durante el hundimiento de la muestra,
todo el contenido hídrico es sustituido por isopentano y,
paralelamente, la muestra se congela. Por ello, el que este proceso
ocurra durante la caída sin contacto con ningún instrumento, permite
que la sustitución sea homogénea a través de toda su superficie y no
se pierda la forma. Finalmente, la muestra llega al fondo, rígida
por la congelación y deshidratada. Tras el tiempo requerido, la
muestra es trasladada a la segunda columna, con metanol.
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Comprende la incubación de las muestras fijadas
en diferentes soluciones (metanol:butanol 1:1, butanol, butanol:cera
poliéster 1:1) a diferentes temperaturas, que van desde temperatura
ambiente hasta 40ºC; y su solidificación en parafina poliéster.
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Comprende el uso de microtomo.
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Comprende el uso de agua destilada estéril.
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Figura 1. Efectos de varios fijadores en la
preservación morfológica de los tejidos. Los tejidos fueron fijados,
incluidos en Polyester Wax, y teñidos con la
hematoxilina-picrosirio. A - H Secciones
transversales de un embrión de Danio rerio de 72 h teñidas
tras fijación por criosustitución (A), con PFA (B), con Bouin (C),
con fijador de Zinc (D) y con MAA (E). F-H muestran
respectivamente una ampliación de la región cuadrada de
A-C. Las puntas de flecha (F) muestran el mesénquima
subyacente al pliegue de la aleta. I-J: Secciones
transversales de un adulto de anfioxo fijado por criosustitución (I)
y PFA (J). La barra mide 50 \mum.
Figura 2. Efecto de la fijación en la
preservación antigénica. A y B: Secciones del músculo liso del
esófago del ratón fijadas con PFA (C) o por criosustitución (D).
Ambas secciones se tiñeron con el anticuerpo contra
Mimecán-Osteoglicina. Las áreas positivas se
muestran teñidas de rojo debido al fluorocromo Alexa Fluor 594
(inmunoflurorescencia indirecta). Los núcleos se muestran teñidos de
azul debido a la tinción Hoescht. La punta de flecha señala un vaso
sanguíneo. El asterisco señala una fibra muscular. Las barras miden
10 (C-D) y 20 \mum (A-B). C y D:
Uso de secciones obtenidas por nuestro método para diferentes
metodología como la inmunolocalización e hibridación in situ.
Secciones transversales de aleta regenerante (4 dpa). Tinción con
anti-Zns-5, marcando escleroblastos
o células sintetizadoras de lepidotriquias en rojo (Alexa Fluor 594;
C). Hibridación in situ de una sección paralela marcando
células que expresan colágeno 10 (D).
Figura 3. Representación esquemática de un
protocolo de criosustitución diseñado para la preservación de la
forma tridimensional. 1: Método para muestras grandes. 2: Método
para muestras de tamaño pequeño, como podría ser un embrión de
Danio rerio.
Figura 4. Sección de la extremidad anterior de
un embrión de ratón (estadio E15.5) fijado por criosustitución e
incluido en Polyester Wax. La sección fue teñida con el
anticuerpo contra la PCNA y el Pro-colágeno. Los
núcleos se tiñeron con Hoescht.
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Para validar el método objeto de la presente
invención se han utilizado embriones y tejidos adultos de varias
especies de cordados, numerosos anticuerpos primarios diferentes,
específicos de diversos epítopos, y varias sondas génicas que han
permitido conocer la localización de diversos ARN mensajeros de las
distintas especies utilizadas. Los anticuerpos usados en las pruebas
de optimización fueron marcados tanto con marcadores fluorescentes
como con enzimas. Algunos anticuerpos específicos de epítopos muy
lábiles, y que habían dado muchos problemas con las técnicas
anteriores, ahora se muestran eficaces a la hora de detectar la
localización de los antígenos.
A continuación se procede a describir, sin
carácter limitativo, condiciones y variables que permiten una
realización preferida y óptima del método objeto de la presente
invención.
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Dichas columnas están preferentemente formadas
por dos tubos externos de vidrio o material plástico resistente a
bajas temperaturas. Su tamaño es variable, aunque preferentemente
presentan una altura mínima dependiente del tamaño de las muestras.
Por otra parte, el volumen de isopentano y de metanol que contienen
es preferentemente de al menos 10 veces el volumen de la muestra. En
una realización preferida las columnas presentan un mecanismo de
cierre para evitar la evaporación del isopentano y del metanol.
Para el traspaso de la/s muestra/s de una
columna a otra, se usa un recipiente intercambiable, preferentemente
un recipiente de fondo mallado. El objeto de este recipiente es el
de sacar la/s muestras del isopentano sin restos de éste y poder
pasarlo rápidamente a la columna de metanol. El tamaño del poro
puede ser variable, siempre que cumpla con el objetivo de retener
la/s muestra/s mientras se escurre el isopentano. En otra
realización preferida, el recipiente intercambiable se complementa
con un portaobjetos o equivalente donde se coloca/n la/s muestra/s
cuando se pretenda criosustituir tejidos manteniendo una forma plana
(figura 3.1). En otra realización preferida, la/s muestra/s se
introduce/n en la columna que contiene isopentano en suspensión en
una gota de metanol al 70% (figura 3.2).
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El tamaño admisible de las muestras a fijar
mediante criosustitución viene determinado por su permeabilidad. De
este modo, es recomendable que las muestras con piel o epitelios
(por ejemplo, cuerpo de anfioxo, embrión de ratón, u órganos
completos) tengan preferentemente un grosor en la escala de
milímetros, y más preferentemente un grosor menor o igual a 5 mm;
mientras que en el caso de tejidos seccionados (por ejemplo,
secciones de corazón o cerebro), con mayor permeabilidad debido a la
inexistencia de epitelios en sus superficie, son aceptables grosores
mayores (por ejemplo, 1 cm).
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Dichos tiempos dependen del tamaño y de la
permeabilidad de las muestras. La incubación en la columna de
isopentano es preferentemente en la escala de minutos, y más
preferentemente en el rango de 1 a 10 minutos, pudiendo ser 1 minuto
suficiente para muestras muy pequeñas y permeables (por ejemplo,
embriones de Danio rerio), y siendo 2 minutos un tiempo
válido para una gran variedad de muestras. En el caso de la columna
de metanol, la incubación es preferentemente en la escala de horas,
y más preferentemente en el rango de 24 (muestras muy pequeñas y
permeables) a 48 horas (tiempo válido para una gran variedad de
muestras), aunque no existe un tiempo máximo de incubación, pudiendo
ser almacenadas las muestras en metanol a -80ºC, e incluso a -20ºC,
durante meses.
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El método se ha aplicado a embriones y tejidos
adultos de anfioxo, de Danio rerio, y ratón. Los embriones de
pez (D. rerio) se obtuvieron a través de cruces entre
individuos comprados en tiendas de la ciudad y mantenidos a 25ºC en
acuarios con aireación. Los embriones de ratón se obtuvieron
mediante cruzamiento de adultos del Estabulario de la Universidad de
Málaga. Los especímenes adultos del anfioxo se obtuvieron en la
localidad francesa de Banyuls. La manipulación animal respetó la
normativa establecida en el B.O.E. 67, 1988.
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A continuación se refiere un ejemplo, en forma
de protocolo, de realización preferida del método objeto de la
invención.
Previo a la aplicación del método, las columnas
de isopentano y de metanol deben ser enfriadas a -80ºC, y las
muestras a tratar deben ser adecuadamente preparadas (por ejemplo,
decorionación en el caso de embriones, o disecado en el caso de
órganos).
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- 1.
- Transferir las muestras al recipiente intercambiable introducido en la columna de criosustitución que contiene isopentano enfriado a -80ºC (figura 3A). Dicha transferencia puede realizarse con la ayuda de un portaobjetos o equivalente en el que se ha colocado la muestra (figura 3.1), en suspensión en metanol al 70%, o simplemente dejando caer la muestra en su interior (figura 3.2).
- 2.
- Incubar las muestras en isopentano (figura 3A) durante un tiempo determinado en función del tamaño y de la permeabilidad de la muestras.
- 3.
- Transferir el recipiente intercambiable con las muestras a la columna de metanol enfriado a -80ºC (figura 3B).
- 4.
- Incubar las muestras en metanol (figura 3B) durante un tiempo determinado en función del tamaño y de la permeabilidad de la muestras y continuar con la inclusión en cera o parafina de temperatura de fusión baja, o directamente almacenar las muestras en metanol a -80ºC o a -20ºC (continuar con la inclusión requerirá, en el caso de que las muestras sean almacenadas, su recuperación mediante la incubación de las muestras en un gradiente de temperaturas desde -80ºC ó -20ºC hasta temperatura ambiente).
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- 1.
- Incubar las muestras a temperatura ambiente en una mezcla 1:1 de metanol y butanol durante 15-45 minutos, en función del tipo de muestra; durante 30 minutos en una realización más preferida, apta para una gran variedad de muestras.
- 2.
- Incubar en butanol a temperatura ambiente durante 5-20 minutos, en función del tipo de muestra; durante 10 minutos en una realización más preferida, apta para una gran variedad de muestras.
- 3.
- Incubar en butanol a 40ºC durante 10 minutos.
- 4.
- Incubar en una mezcla de butanol y cera o parafina poliéster (1:1) durante 30 minutos a 40ºC.
- 5.
- Incubar en cera o parafina poliéster tres veces a 40ºC durante 30 minutos cada vez.
- 6.
- Colocar la cera o parafina poliéster sobre el molde.
- 7.
- Solidificar completamente el bloque de cera o parafina, con la muestra en su interior, a 4ºC.
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Cortar las secciones al microtomo,
preferentemente en un lugar climatizado, y almacenar las mismas a
4ºC hasta su montaje.
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Usar agua destilada estéril, preferentemente
agua bidestilada estéril enfriada a 4ºC.
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Como métodos de control y validación del método
se han utilizado paraformaldehído (Akimenko et al. 1995),
fijador de Bouin (Marí-Beffa et al. 1996), fijador de Zn
(Beckstead 1994), fijador MAA (metanol:acetona:agua 1:1:8;
Muñoz-Chápuli et al. 1997); y la inclusión en
parafina Histosec (Murciano et al. 2002). El resultado de la
comparación entre el método objeto de la presente invención y los
métodos de referencia antes citados es el siguiente (tabla 1):
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Los anticuerpos primarios utilizados permiten la
detección de epítopos de membrana citoplasmática, matriz
extracelular y orgánulos intracelulares que suelen presentar
dificultad depreservación antigénica. Los anticuerpos utilizados
para la validación del método objeto de la invención son:
- 1.
- Flg (anticuerpo policlonal contra el dominio intra-membrana del FGFR1),
- 2.
- Bek C17 (anticuerpo policlonal contra el dominio intra-membrana del FGFR2),
- 3.
- C15 (anticuerpo policlonal contra el dominio intra-membrana del FGFR3) y
\newpage
- 4.
- C16 (anticuerpo policlonal contra el dominio intra-membrana del FGFR4; los cuatro obtenidos por Santa Cruz Biotechnology, Inc. Heidelberg, Alemania);
- 5.
- Anti-mimecán (anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína mimecán de ratón (Fernández et al. 2003);
- 6.
- Ki-S5 (Ki-67; un anticuerpo policlonal de ratón, Roche);
- 7.
- Pro-colágeno I (M-38; un anticuerpo monoclonal de ratón, Developmental Studies Hybridoma Bank);
- 8.
- C20 TRT (un anticuerpo policlonal de cabra, Santa Cruz Biotechnology).
- 9.
- Anti-PCNA (anticuerpo monoclonal de ratón, SIGMA).
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Asimismo se han utilizado anticuerpos
secundarios marcados con Alexa Fluor 594 (Invitrogen. Molecular
Probes) o biotinilados (a una concentración 1:2000). Estos últimos
fueron detectados con la peroxidasa ExtrAvidina (Sigma) y la
reacción de la peroxidasa revelada con
diamino-bencidina (DAB; Beckstead 1994). Las
tinciones hematoxilina-picrosirio (HP) y Hoescht se
utilizaron como técnicas histoquímicas de modo simple o acompañando
las tinciones con anticuerpos (Bechara et al. 2000).
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La hibridación in situ se realizó según
Akimenko et al. (1994) usando sondas de RNA para el gen
col10a1 marcadas con digoxigenina. Brevemente, las secciones
fueron desparafinadas y rehidratadas en pasos sucesivos de alcoholes
de menor graduación (libre de RNAsa). Se prehibridaron en tampón de
hibridación durante 1 hora a 70ºC. Posteriormente se hibridó a la
misma temperatura durante toda la noche. Tras los lavados, las
secciones se bloquearon durante 4 horas en Western Bloking
Reagent (Roche) según las instrucciones del fabricante y se
incubaron en anti-digoxigenina toda la noche. El
revelado se llevo a cabo mediante NBT/BCIP.
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La criosustitución en metanol, combinada con
inclusión en cera o parafina de bajo punto de fusión y corte de
secciones al micrótomo, parece ser una buena alternativa a la
fijación con paraformaldehído (PFA), y secciones al criostato o tras
inclusión en parafina tradicional. La preservación de la
antigenicidad y morfología tisular se muestran excluyentes en los
protocolos histológicos rutinarios. En un primer experimento, se
tiñeron secciones de la región caudal de embriones de Danio
rerio con hematoxilina-picrosirio. En estos
estadios, los miotomos y los pliegues de aletas dorsal y anal están
bien desarrollados. Los pliegues de la aleta son particularmente
sensibles a los métodos histológicos, mostrando normalmente rupturas
entre el mesénquima y el ectodermo en la mayoría de los métodos
estudiados. En las tinciones realizadas se obtuvo siempre una
preservación óptima tras la fijación por criosustitución (figura
1A). Las fijaciones con Bouin (figura 1B), PFA (figura 1C), fijador
de Zn (figura 1D) o MAA (figura 1E; tabla 1) mostraron resultados de
peor calidad. La fijación PFA generó artefactos de ruptura del
mesénquima. Sin embargo, la aplicación de la criosustitución reduce
significativamente la aparición de dichos artefactos (figuras 1F, 1G
y 1H).
Estos métodos también se han aplicado a los
tejidos del anfioxo, que presentan una histología muy difícil. Las
figuras 1I y 1J muestran claras diferencias histológicas entre los
métodos de criosustitución (figura 1I) y fijación con PFA (figura
1J) aplicados al anfioxo. Mientras que en las muestras fijadas con
PFA se observan discontinuidades abundantes en las masas musculares
y pérdida de integridad del conectivo, las muestras criosustituidas
no presentan ningún defecto morfológico.
La combinación entre la criosustitución y la
cera o parafina de baja temperatura de fusión mejora la preservación
histológica de los tejidos. Las figuras 2A y B muestran tinciones
con un anticuerpo contra mimecán del músculo liso de la pared del
esófago del ratón fijados con PFA (figura 2A) o por criosustitución
(figura 2B). Mientras que la sección fijada con paraformaldehídos
muestra una inmuno-reactividad muy escasa, la
sección obtenida tras la criosustitución muestra una
inmuno-tinción muy fuerte y específica de las fibras
musculares y vasos sanguíneos. Las figuras 2C y D muestran
secciones transversales paralelas de aleta regenerante de 4 días
post-amputación (dpa) obtenidas mediante nuestro
método. En la figura 2C se observan una tinción por
inmunofluorescencia de Zns-5. Este anticuerpo marca
específicamente células sintetizadoras de lepidotriquia o
escleroblastos. La lepidotriquia es una estructura esquelética de
la aleta que presenta marcadores tanto de hueso como de cartílago.
Esto se puede demostrar mediante hibridación in situ del ARN
mensajero del colágeno 10 (figura 2D). En este caso, las secciones
paralelas permiten localizar ambos marcadores en las misma células
usando metodologías tan diferentes. Por lo tanto, esta metodología
permite la preservación de la antigenicidad de epitopos a la vez
que mantiene la integridad de los ARN mensajeros tan sensibles a la
degradación por ARNasas.
El uso de columnas de gravedad durante la
criosustitución (columnas de criosustitución) también permite
preservar la forma y posición relativa de los diversos tejidos en el
interior de las muestras. Este método permite preservar el tejido
de posibles plegamientos por manipulación (por ejemplo, mantener una
aleta extendida; figura 3.1). Otro problema común en las muestras de
tamaño pequeño son las transformaciones significativas de forma tras
los métodos clásicos de criosustitución. Un ejemplo de ello son los
embriones de Danio rerio, que, cuando se criosustituyen sobre
una superficie, sufren deformaciones debida a la compresión de los
tejidos contra el soporte. La caída de una gota de alcohol diluido
en la columna de isopentano permite la sustitución homogénea por
toda la superficie de la muestra evitando la deformación (figura
3.2).
El método objeto de la presente invención
también ha demostrado ser muy útil para la obtención de secciones
histológicas de muestras que intercalan tejidos blandos y duros. En
estos casos, la separación de ambos suele ocurrir como artefacto
durante los fenómenos de
deshidratación-rehidratación o mientras es cortado
al criostato o al microtomo. La sustitución directa y rápida del
contenido hídrico durante criosustitución y la rigidez que esta cera
o parafina aporta a los tejidos blandos solucionan estos problemas.
Un ejemplo se representa en las muestras de cartílago, que se rodean
de tejidos conectivos como la traquea, o de la extremidad de ratón
durante el desarrollo (figura 4).
El método reivindicado es útil para analizar
muestras teñidas con métodos histoquímicos, o con marcas
fluorescentes tales como la fluorescencia endógena de organismos
transgénicos. Las propiedades fluorescentes de los tejidos se
mantienen durante todo el procesado histológico debido a la baja
temperatura utilizada durante la fijación e inclusión.
En conclusión, el método objeto de la presente
invención mejora la mayoría de los métodos histológicos actuales
diseñados para microscopía óptica. Dicho método también mejora las
propiedades antigénicas de tejidos embrionarios y adultos de
anfioxo, Danio rerio y ratón, preservando su estructura y
previniendo la degradación de ARN. Este método constituye una buena
alternativa los métodos de histología clásica utilizados normalmente
en estudios de embriogénesis de vertebrados frente a problemas tan
comunes como la labilidad de epítopos o la intercalación de tejidos
rígidos en tejidos blandos.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (23)
1. Método histológico optimizado para la
preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de
tejidos de vertebrados que combina la fijación por criosustitución y
la inclusión en una cera o parafina de baja temperatura de fusión
caracterizado porque comprende las siguientes fases o
etapas:
- a.
- Fijación por criosustitución, que comprende el uso de fijación alcohólica (criosustitución en metanol) efectuada a bajas temperaturas, mediante el tratamiento de las muestras, adecuadamente preparadas, con isopentano y metanol;
- b.
- Inclusión en cera o parafina de temperatura de fusión baja, que comprende la incubación de las muestras fijadas en diferentes soluciones (metanol:butanol 1:1, butanol, butanol:cera poliéster 1:1) a diferentes temperaturas, que van desde temperatura ambiente hasta 40ºC; y su solidificación en cera o parafina poliéster.
- c.
- Obtención de secciones; y
- d.
- Montaje de secciones.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque la fijación por criosustitución
comprende el uso de "columnas de criosustitución", formadas por
dos tubos de un material resistente a bajas temperaturas, de tamaño
variable, que permiten una sustitución sin contacto con objetos que
evita que muestras blandas o con disposición definida se deformen
por el soporte; así como de un recipiente intercambiable para el
traspaso de las muestras de una columna de criosustitución a la
otra.
3. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque el recipiente intercambiable presenta un
fondo mallado.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3 caracterizado porque las "columnas
de criosustitución" contienen, una de ellas, isopentano y, la
otra, metanol, siendo el volumen de isopentano y de metanol
preferentemente proporcional al volumen de la muestra.
5. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque las muestras a fijar son transferidas a
la columna de criosustitución que contiene isopentano enfriado a
-80ºC.
6. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque la transferencia se realiza con la ayuda
de un portaobjetos o equivalente en el que se ha colocado la
muestra, en suspensión en metanol al 70%, o simplemente dejando caer
la muestra en su interior.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6 caracterizado porque las muestras se
incuban en isopentano durante un tiempo determinado en función del
tamaño y de la permeabilidad de la muestras.
8. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque dicha incubación se realiza en el rango
de 1 a 10 minutos.
9. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque dicha incubación es de 2 minutos, tiempo
válido para una gran variedad de muestras.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9 caracterizado porque el recipiente
intercambiable con las muestras es transferido a la columna de
metanol enfriado a -80ºC.
11. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque las muestras se incuban en metanol
durante un tiempo determinado en función del tamaño y de la
permeabilidad de la muestras.
12. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque dicha incubación se realiza en el rango
de 24 a 48 horas.
13. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque dicha incubación es de 48 horas, tiempo
válido para una gran variedad de muestras.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque la inclusión
en cera o parafina de temperatura de fusión baja comprende la
incubación de las muestras fijadas a temperatura ambiente en una
mezcla 1:1 de metanol y butanol durante 15-45
minutos, en función del tipo de muestra.
15. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque la incubación en la mezcla 1:1 de
metanol y butanol es de 30 minutos, tiempo apto para una gran
variedad de muestras.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15 caracterizado porque las muestras,
tras la incubación en la mezcla metanol:butanol 1:1, se incuban en
butanol a temperatura ambiente durante 5-20 minutos,
en función del tipo de muestra.
17. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque la incubación en butanol a temperatura
ambiente es de 10 minutos, tiempo apto para una gran variedad de
muestras.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 ó 17 caracterizado porque, tras la
incubación en butanol a temperatura ambiente, las muestras son
incubadas Incubar en butanol a 40ºC durante 10 minutos.
19. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque, tras la incubación en butanol a 40ºC,
las muestras son incubadas en una mezcla de butanol y cera o
parafina poliéster (1:1) durante 30 minutos a 40ºC.
20. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque, tras la incubación en la mezcla de
butanol:parafina poliéster 1:1, las muestras se incuban en cera o
parafina poliéster tres veces a 40ºC durante 30 minutos cada
vez.
21. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque la inclusión en cera o parafina de
temperatura de fusión baja finaliza colocando la cera o parafina
poliéster sobre un molde y dejándolo, en última instancia,
solidificar completamente a 4ºC.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque la obtención
de secciones se realiza utilizando un microtomo, preferentemente en
un lugar climatizado.
23. Método según la reivindicación anterior
caracterizado porque el montaje de las secciones obtenidas
comprende el uso agua destilada estéril, preferentemente agua
bidestilada estéril enfriada a 4ºC.
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|---|---|---|---|
| ES201000096A ES2363551B2 (es) | 2010-01-25 | 2010-01-25 | Método histológico optimizado para la preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de tejidos de vertebrados. |
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