ES2362021B1

ES2362021B1 - Procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso.

Info

Publication number: ES2362021B1
Application number: ES201130871A
Authority: ES
Inventors: Pablo Arnau Pla Calvet; Marta Caminal Bobet; Joaquim Vives Armengol; Irene Oliver Vila; Juan Garcia Lopez
Original assignee: Banc de Sang i Teixits
Current assignee: Banc de Sang i Teixits
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: ES2362021A1; MX2013013596A; US20140099694A1; WO2012164121A1

Abstract

Procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso, comprendiendo dicho producto células mesenquimales expandidas de médula ósea, una matriz no celular y un gel de fibrina, comprendiendo procedimiento las etapas de: (a) expandir las células mesenquimales; (b) conjugar las células mesenquimales a la matriz; (c) lavar el producto obtenido en la etapa (b); y (d) mezclar el producto obtenido en la etapa (c) con un gel de fibrina.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso articular. Más en particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un producto que comprende principalmente células mesenquimales, de origen óseo, expandidas, inmovilizadas sobre soportes y copolimerizadas y fijadas en la zona de implantación mediante geles de fibrina y/o encaje mecánico. El procedimiento de la presente invención puede comprender además una etapa de congelación del producto de ingeniería tisular obtenido, con el objetivo de disponer de copias de seguridad del mismo.

Debido a la limitada capacidad de regeneración del cartílago articular, los defectos causados por enfermedades degenerativas o traumatismos representan un problema clínico no resuelto. En este tipo de patologías, la aparición de las lesiones está asociada a dolor, pérdida de movilidad y discapacidad progresiva asociada a la aparición de artritis o artrosis. Estas circunstancias inciden de forma grave en la calidad de vida de las personas afectadas.

Los tratamientos más comunes de este tipo de lesiones son la mosaicoplastia, el trasplante autólogo de condrocitos, el trasplante heterólogo de tejido osteocondral, y la artroplastia de abrasión o perforaciones. Estas técnicas, muestran como factor común el aporte de células especializadas a la zona lesionada para favorecer la regeneración/substitución del tejido dañado.

Entre los tratamientos con mayores Indices de éxito se encuentra la artroplastia de abrasión o perforaciones. Esta aproximación se basa en inducir mediante sangrado la invasión de células mesenquimales de médula ósea desde el hueso subcondral hacia la zona lesionada, con el objetivo que reparen la lesión (Mitchell N y otros. The resurfacing of adult rabbit articular cartilage by múltiple perforations through the subchondral bone. J Bone Joint Surg Am. 1976; 58(2): 230-3.24, Levy A y otros. Chondral delamination of the knee in soccer players. Am J Sports Med. 1996; 24). El éxito de esta técnica depende de la correcta integración, proliferación y diferenciación de las células mesenquimales en la zona a reparar. Debido a la gran variabilidad inherente a la técnica, el resultado de este tipo de tratamientos es poco previsible. En consecuencia, frecuentemente se obtiene una reparación en base a fibrocartilago en lugar de cartílago hialino, lo que conlleva limitaciones en la calidad y durabilidad de la terapia (Pelmari K y otros. Do we really need cartilage tissue engineering?. Swiss Med WKLY 2009; 139:41-42; Kreuz PC y otros. Results after microfracture of full-thickness chondral defects in different compartments in the knee. Osteoarthritis. Cartilage. 2006; 14(11):1119-25; Temenoff JS y otros. Review: tissue engineering for regeneration of articular cartilage. Biomaterials. 2000; 431-40.

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías que resuelvan los problemas de la técnica anterior. La presente invención da conocer una nueva alternativa terapéutica basada en la ingeniería tisular. Esta aproximación se fundamenta en la utilización de un producto que comprende una matriz, en base a materiales sintéticos o biomateriales, combinadas con células e hidrogeles que induce la regeneración de los tejidos cartilaginosos dañados.

Las matrices empleadas en la presente invención deben mostrar características particulares que les permitan realizar su función de soporte para la reconstrucción del tejido diana. Estas deben ser biocompatibles, con adecuadas propiedades mecánicas con respecto a la zona de implantación, con integridad estructural y deben ser bioabsorbibles. Por otro lado, estas matrices, deben ser capaces de generar un entorno biológico que garantice el aporte de nutrientes a las células para asegurar que estas puedan realizar su función regeneradora. A las anteriores características debe añadirse que una matriz orientada a la regeneración de tejidos cartilaginosos debería poseer capacidad de inducir la diferenciación de las células madre hacia condrocitos y que en esta matriz esta especie celular se vea inducida a fabricar tejido
cartilaginoso.

El otro componente del producto de ingeniería tisular de la presente invención, las células, también debe presentar una serie de características particulares tales como facilidad y seguridad en su obtención, provenir de una fuente segura desde el punto de vista citogenético y tener propiedades de multipotencialidad, que permitan su diferenciación hacia las células responsables de la producción de tejido cartilaginoso, los condrocitos.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer un procedimiento de preparación de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de cartílago. Dicho procedimiento se fundamenta en la obtención y utilización de células mesenquimales expandidas, de origen autólogo, procedentes de médula ósea. Estas células se expanden y se inmovilizan sobre soportes en base a polímeros sintéticos o biomateriales. y el conjunto obtenido se implanta y fija en la zona de lesión mediante geles de fibrina y/o encaje mecánico.

Una de las ventajas con respecto a los tratamientos basados en el autoinjerto, tales como la condroplastia o el sangrado subcondral, es que utilizando el producto preparado mediante el procedimiento de la presente invención no es necesario someter al receptor de la terapia a una o varias intervenciones de cirugía artroscópica para la extracción del material biológico necesario para la regeneración de la articulación dañada. El material celular necesario se obtiene mediante la extracción de médula ósea, que se realiza de forma ambulatoria. Esta aproximación, por lo tanto, evita las complicaciones potenciales derivadas de la obtención de material condral autólogo tales como los dolores, sangrados, molestias o complicaciones debido a infecciones.

Otra ventaja respecto a la técnica de artroplastia de abrasión o perforaciones aplicada en lesiones de pequeño tamaño, que consistente en lesionar el hueso subcondral para facilitar el aporte de células regenereradoras, es que utilizando el producto preparado mediante el procedimiento de la presente invención se puede aplicar una dosis celular conocida y perfectamente caracterizada, lo que permite realizar un tratamiento reproducible a los pacientes sometidos a esta terapia.

Otra ventaja adicional es que es posible implantar un producto totalmente adaptado a la topología de la lesión.

En este aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento mediante el que las matrices se conjugan mediante un proceso de inmovilización a un producto celular enriquecido en células mesenquimales. Dicho producto celular con reconocida capacidad condroinductora, se obtiene mediante una selección y posterior expansión in vitro de estas células. Con el procedimiento de la presente invención es posible, mediante la manipulación del proceso de expansión de las células, generar un amplio intervalo de cantidades de injerto cartilaginoso que facilita el tratamiento de lesiones de diverso tamaño y origen. Esto hace que sea aplicable en un amplio abanico de aplicaciones terapéuticas, cuyo objetivo es la recuperación del cartílago dañado.

Otra de las características del procedimiento de la presente invención es que el crecimiento de las células se lleva a cabo con suplementos de medios de cultivo de origen humano, lo que facilita la expansión rápida de dichas células, y evita posibles efectos adversos derivados del contacto de las células con componentes no humanos (o humanizados). Una ventaja del procedimiento de la presente invención es que, una vez finalizada la expansión, se lleva a cabo una criopreservación de parte de las células con el objetivo de reservar dosis para ser utilizadas en futuros tratamientos.

Por otra parte, la conjugación de las células mesenquimales a las biomatrices mediante un proceso de colonización permite la localización de las células con potencial condrogénico en la zona a regenerar. Esta característica, diferente a otras aplicaciones tales como la artroplastia de abrasión o perforaciones, asegura la actividad celular reparadora en la zona a tratar y, a diferencia de otras aproximaciones de ingeniería tisular, garantiza la permanencia de las células madre en la zona de la lesión donde deben realizar la labor reparadora. Finalmente, el amalgamado de estas partículas con células mesenquimales mediante geles de fibrina permite dotar al conjunto de plasticidad y capacidad de manipulación facilitando a su vez la inmovilización de la mezcla en la zona a tratar evitando así la falta de coherencia estructural con el entorno a regenerar.

La presente invención da a conocer un procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso, comprendiendo dicho producto células mesenquimales expandidas de médula ósea, una matriz no celular y un componente en base a hidrogeles. Dicho procedimiento comprende las etapas de:

(a): expandir las células mesenquimales;

(b): conjugar las células mesenquimales a la matriz;

(c): lavar el producto obtenido en la etapa (b); y

(d): mezclar con un gel de fibrina.

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La expansión de las células mesenquimales se realiza de una forma conocida por los expertos en la materia, con el objetivo de obtener la cantidad de células necesarias para realizar la conjugación a la matriz, que dependerá del tamaño de la lesión a tratar. Una vez obtenida dicha cantidad necesaria, se inicia la etapa de conjugación de dichas células a la matriz. Esta conjugación se puede realizar mediante sistemas agitados o no agitados.

Las células mesenquimales obtenidas en la etapa de expansión se resuspenden en medio de cultivo DMEM complementado con suero a una concentración en el intervalo de 1x10^{3} a 1x10^{7} células por mililitro. Si es necesario se pueden conservan dichas células mediante criopreservación para ser utilizadas en el futuro.

A continuación, se dispensa la suspensión celular de forma estéril en una bolsa o frasco de cultivo previamente cargada con la matriz, que puede estar dotado de un agitador pendular, conjugar las células mesenquimales a la matriz. La relación entre el número de células por centímetro cúbico está en el intervalo de 1x10^{2} a 1x10^{8} células por centímetro cúbico de matriz. Posteriormente, se deja incubar durante 1 a 24 horas a una temperatura de 35-38ºC, saturación de CO_{2} del 2,5-7,5%, y humedad relativa superior al 90%. En el caso de emplear agitación, las condiciones de agitación empleadas para garantizar el anclaje de las células son de 1 a 120 revoluciones por minuto.

A continuación, la suspensión de células mesenquimales inmovilizadas sobre la matriz, obtenida en la etapa (b) se lava varias veces utilizando una solución salina fisiológica y se dispensa de forma estéril en una bolsa de conservación.

En la etapa (d) del procedimiento de la presente invención el producto obtenido en la etapa (c) se mezcla de forma estéril con un gel de fibrina en una relación de 0,1 a 10 unidades volumétricas de solución de fibrinógeno por cada 0,1-10 unidades volumétricas de solución de trombina y 0,1-10 unidades volumétricas de matriz colonizada, obtenida en la etapa (c).

La presente invención se describirá a continuación con más detalles en referencia a ejemplos de realización. Estos ejemplos, sin embargo, no están destinados a limitar el alcance técnico de la presente invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Procedimiento de preparación de un centímetro cúbico del producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de cartílago según la presente invención

Se obtuvieron 12x10^{6} células mesenquimales de médula ósea mediante expansión utilizando un medio de cultivo libre de suero animal y se inocularon en un frasco de cultivo. Se utilizó un medio en base a DMEM suplementado con suero humano al 10% (v/v). Se fijó la concentración celular a 6x10^{5} células por mililitro. La suspensión celular se añadió de forma estéril a un segundo frasco de material plástico dotado de agitador pendular, donde previamente se añadió 1 centímetro cúbico de matriz. Las 6x10^{6} células restantes se criopreservaron con el objetivo de poder realizar nuevos tratamientos, en caso que sea necesario.

La incubación se realizó en las siguientes condiciones: temperatura de 37ºC, saturación de CO_{2} del 5%, y humedad relativa del 95%; a continuación se inició un ciclo de agitación de 24 horas de duración a una velocidad de entre 120-200 rpm. Transcurrido este tiempo, el producto obtenido se lavó con el objetivo de eliminar restos celulares y el medio de cultivo. Esta operación se llevó a cabo empleando una solución salina fisiológica y se envasó el producto obtenido en una bolsa estéril.

En el momento previo de la aplicación del producto al paciente, se realiza un amalgamado de las matrices con un gel de fibrina. Para realizar esta operación se emplea una relación volumétrica consistente en una unidad de solución de fibrinógeno por una unidad volumétrica de solución de trombina y una unidad volumétrica de matriz ósea colonizada. Realizado el amalgamado se dota al conjunto de la forma que le permite adaptarse a la distribución espacial de la lesión y se emplaza en la misma.

Si bien la invención se ha descrito con respecto a un ejemplo de realización preferente, éste no se debe considerar limitativo de la presente invención, que se definirá por la interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso, comprendiendo dicho producto células mesenquimales expandidas de médula ósea, una matriz no celular y un gel de fibrina, comprendiendo procedimiento las etapas de:

(a): expandir las células mesenquimales;

(b): conjugar las células mesenquimales a la matriz;

(c): lavar el producto obtenido en la etapa (b); y

(d): mezclar el producto obtenido en la etapa (c) con un gel de fibrina;

caracterizado porque dicha matriz es un biomaterial.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (b) se realiza mediante un sistema agitado o no agitado.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque además comprende una etapa de criopreservación de las células mesenquimales expandidas para ser utilizadas en el futuro.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la relación entre el número de células por centímetro cúbico de matriz en la etapa (b) está en el intervalo de 1x10^{2} a 1x10^{8} células por centímetro cúbico de matriz.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa (b) se realiza durante 1 a 24 horas, a una temperatura de 35-38ºC, una saturación de CO_{2} de 2,5-7,5%, y una humedad relativa superior al 90%.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa (c) se lava varias veces utilizando una solución salina fisiológica.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el mezclado con un gel de fibrina de la etapa (d) se realiza en una relación de 0,1 a 10 unidades volumétricas de solución de fibrinógeno por cada 0,1-10 unidades volumétricas de solución de trombina y 0,1-10 unidades volumétricas de matriz colonizada, obtenida en la etapa (c) .