ES2356053T3 - Plantas de caña de azucar con un mayor contenido de hidratos de carbono de reserva. - Google Patents
Plantas de caña de azucar con un mayor contenido de hidratos de carbono de reserva. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para aumentar el contenido de hidratos de carbono de reserva de una planta de caña de azúcar, que comprende: (a) la modificación genética de una planta de caña de azúcar introduciendo al menos una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST) (b) teniendo la planta de caña de azúcar genéticamente modificada de acuerdo con (a) un contenido de hidratos de carbono de reserva mayor en al menos 5% comparado con las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente entre los entrenudos 10-18.
Description
La presente invención se refiere a un procedimiento para aumentar el contenido de hidratos de carbono de reserva de plantas de caña de azúcar.
Los expertos en los campos de la agricultura y silvicultura hacen un esfuerzo constante para proporcionar plantas con rendimientos más altos, en particular para salvaguardar el suministro de alimentos de la población mundial que crece continuamente y asegurar el suministro de materias primas renovables. Un intento tradicional es mantener plantas de alto rendimiento mediante la cría de plantas. Sin embargo, este procedimiento requiere tiempo y es trabajoso. En algunos casos, también se ha avanzado sometiendo a las plantas a manipulación genética, es decir, mediante la introducción dirigida y la expresión de moléculas de ácido nucleico extrañas (recombinantes) en las plantas.
Además de la remolacha azucarera, la caña de azúcar es la planta más importante usada para la producción de azúcar (sacarosa). Para obtener el azúcar de caña, se recolecta la caña de azúcar en un procedimiento de fabricación caro y después se transporta a la fábrica. Antes de extraer el azúcar, la caña de azúcar se limpia. En el procedimiento tradicional, la caña de azúcar posteriormente se muele y después se pasa por 4-6 rodillos compactadores para separar el jugo de la fibra (bagazo). El azúcar (sacarosa) cristalizado y centrifugado se obtiene por clarificación, evaporación, cristalización fraccionada y separación de las aguas madre (melaza) de los cristales por centrifugación. La melaza, actualmente es el subproducto económicamente más importante en la obtención del azúcar a partir de la caña de azúcar, y comprende aproximadamente 50% de azúcares (sacarosa y monosacáridos). Se usa como material de partida para la fermentación de productos, de los cuales el etanol es el más importante, y además como alimento para animales y, en algunos países, también para la nutrición humana (“miel negra” en Egipto).
Los procedimientos biotecnológicos actuales permiten la generación de plantas de caña de azúcar que, además de azúcar de caña (sacarosa) y melaza, sintetizan valiosos hidratos de carbono de reserva tales como, por ejemplo fructanos, los cuales posteriormente se pueden usar para propósitos industriales, cosméticos o farmacéuticos y en la industria de alimentos.
Así, por ejemplo las solicitudes de patente internacional WO96/01904, WO96/21023, WO98/39460 y WO99/24593 proponen expresar genes 1-SST solos o en combinación con genes 1-FFT en la caña de azúcar con el fin de producir fructanos en caña de azúcar transgénica.
La obtención de hidratos de carbono de reserva (sacarosa y fructanos) a partir de plantas de caña de azúcar de una forma eficaz requiere procedimientos que conduzcan al aumento del contenido de hidratos de carbono de reserva en plantas de caña de azúcar.
Por lo tanto, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar procedimientos que conduzcan a un mayor contenido de hidratos de carbono de reserva en plantas de caña de azúcar en comparación con plantas de caña de azúcar convencionales.
Este objetivo se logra proporcionando las realizaciones especificadas en las reivindicaciones de la patente.
La presente invención se refiere, por lo tanto, a un procedimiento para aumentar el contenido de hidratos de carbono de reserva de una planta de caña de azúcar, que comprende
- (a)
- la modificación genética de una planta de caña de azúcar introduciendo al menos una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST)
- (b)
- teniendo la planta de caña de azúcar genéticamente modificada de acuerdo con (a) un contenido de hidratos de carbono de reserva mayor en al menos 5% comparado con las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente entre los entrenudos 10-18.
Para los propósitos de la presente invención, la expresión “contenido de hidratos de carbono de reserva” se entiende que significa el total del contenido de sacarosa y fructano por gramo de peso fresco.
Para los propósitos de la presente invención, las expresiones “aumentar el contenido de hidratos de carbono de reserva” o “mayor contenido de hidratos de carbono de reserva” significa aumentar el contenido total de sacarosa y fructano por gramo de peso fresco en un total de 2-100%, preferiblemente 580% y en especial preferiblemente 10-65%.
En el contexto de la presente invención, el contenido de sacarosa o fructano se determina preferiblemente por los procedimientos descritos a continuación en la sección de metodología.
En el contexto de la presente invención, el contenido de sacarosa o fructano se determina preferiblemente por los procedimientos descritos a continuación en la sección de metodología.
En el contexto de la presente invención, el peso fresco de las plantas de caña de azúcar se determina usando balanzas convencionales, midiendo el peso de todo el tallo por encima de la tierra de una planta de caña de azúcar después de haber quitado completamente las hojas.
Era sorprendente para el experto en la materia que la expresión de un gen de fructosiltransferasa vegetal en las plantas de caña de azúcar no sólo condujera a la síntesis de fructano, sino que también aumentara simultáneamente el contenido de hidratos de carbono de reserva (sacarosa + fructano).
Basándose en los datos relacionados con la expresión de un gen 1-SST en la remolacha azucarera (Severiier y col., Nature Biotechnology 16, (1998), 843), que muestran que las plantas de remolacha azucarera transgénicas presentan un contenido menor de hidratos de carbono de reserva (sacarosa + fructano), un contenido menor de hidratos de carbono totales (sacarosa + fructano + glucosa
+ fructosa) y un contenido significativamente menor de sacarosa (<10% del tipo silvestre) comparado con las correspondientes plantas silvestres de remolacha azucarera, el experto en la materia esperaría que el procedimiento correspondiente en la caña de azúcar condujera igualmente a un menor contenido de hidratos de carbono de reserva y de hidratos de carbono totales y a un contenido significativamente menor de sacarosa. Sin embargo, sorprendentemente, estos efectos (menor contenido de hidratos de carbono de reserva y de hidratos de carbono totales) no se observan en la caña de azúcar. En cambio, los contenidos de hidratos de carbono de reserva y de hidratos de carbono totales de las plantas de caña de azúcar transgénica superan incluso los de las correspondientes plantas silvestres. Además, las plantas de caña de azúcar genéticamente modificadas del procedimiento de acuerdo con la invención no presentan un contenido menor de sacarosa de hasta 10% el nivel natural en comparación con las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente.
Este sorprendente efecto tiene una gran importancia comercial, puesto que el procedimiento de acuerdo con la invención permitiría usar las plantas de caña de azúcar en el futuro para obtener dos materias primas, a saber, azúcar de caña y fructano, sin reducir significativamente el rendimiento del azúcar de caña.
En una realización adicional del procedimiento de acuerdo con la invención, las plantas de caña de azúcar genéticamente modificadas tienen un mayor contenido de reserva comparado con las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente, y el contenido de sacarosa de las plantas de caña de azúcar genéticamente modificadas en comparación con el contenido de sacarosa de las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente aumenta en más de 15% del contenido de sacarosa de las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente, preferiblemente hasta 20-130% y en especial preferiblemente hasta 30-100%.
En una realización adicional, la presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento para aumentar el contenido de hidratos de carbono de reserva de una planta de caña de azúcar, que comprende
- (a)
- la modificación genética de una planta de caña de azúcar introduciendo al menos una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST)
- (b)
- teniendo la planta de caña de azúcar genéticamente modificada de acuerdo con (a) un contenido de hidratos de carbono de reserva mayor en comparación con las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente entre los entrenudos 10-18.
En el contexto de la presente invención, la expresión “mayor contenido de hidratos de carbono de reserva entre los entrenudos 10-18” significa que el contenido de sacarosa y fructano por gramo de peso fresco en la zona entre los entrenudos 10 y 18 aumenta en total al menos en 5%, en particular en 5-90%, preferiblemente en 10-80% y en especial preferiblemente en 15-75%.
En el contexto de la presente invención, los entrenudos del tronco se numeran desde la parte superior (= 1) a la parte inferior (por ejemplo = 36). En el contexto de la presente invención, un “entrenudo” se refiere, en una planta de caña de azúcar, a la parte del eje del vástago entre dos nudos (de los cuales crecen las hojas).
En este contexto, la expresión “contenido de sacarosa y fructano por gramo de peso fresco en la zona entre los entrenudos 10-18” se entiende que significa que el total de los contenidos de sacarosa y de fructano del peso fresco del tallo después de quitar las hojas, se determina en la región del tallo entre el entrenudo 10 y el entrenudo 18.
En el contexto de la presente invención, la expresión “planta de caña de azúcar” se entiende que significa una planta del género Saccharum, preferiblemente la especie Saccharum officinarum.
En el contexto de la presente invención, la expresión “modificación genética” o “genéticamente modificado” significa la introducción de al menos una “molécula de ácido nucleico extraña” que codifica una sacarosa 1-fructosiltransferasa en el genoma de una célula de planta de caña de azúcar o genoma de una planta de caña de azúcar, en la que dicha introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña da como resultado que la planta de caña de azúcar sintetice fructano. Las plantas de caña de azúcar que no tienen esta modificación genética no almacenan fructano, o al menos en cantidades que son tan pequeñas que el fructano no es detectable, preferiblemente por el procedimiento descrito a continuación en la sección de metodología (“determinación de fructano”).
En el contexto de la presente invención, la determinación del contenido de hidratos de carbono de reserva debe llevarse a cabo en plantas de caña de azúcar que tengan al menos 10 entrenudos y que tengan al menos 6, preferiblemente 10-18, en especial preferiblemente 15 meses de edad.
En el contexto de la presente invención, la expresión “molécula de ácido nucleico extraña” se entiende que significa una molécula, preferiblemente una molécula heteróloga, que no se encuentra de forma natural en las correspondientes plantas/células de plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente, o que no se encuentra de forma natural en las plantas/células de plantas silvestres de caña de azúcar en esta disposición espacial específica, o que está ubicada en un lugar en el genoma de las plantas/célula de las plantas silvestres de caña de azúcar donde no se encuentra de forma natural.
Además, las plantas/células de plantas de caña de azúcar usadas en el procedimiento de acuerdo con la invención se diferencian de las plantas/células de plantas silvestres de caña de azúcar por el hecho de que comprenden al menos una copia de la molécula de ácido nucleico extraña integrada de forma estable en su genoma, si procede además de las copias de dicha molécula que se encuentran de forma natural en las plantas/células de plantas silvestres de caña de azúcar. En este caso, las plantas/células de plantas de caña de azúcar del procedimiento de acuerdo con la invención se pueden distinguir de las plantas/células de plantas silvestres de caña de azúcar en particular por el hecho de que esta copia adicional, o estas copias adicionales, está/están localizadas en lugares en el genoma donde no se encuentra o encuentran en las plantas/células de plantas silvestres de caña de azúcar. Esto se puede probar, por ejemplo, con ayuda de un análisis de transferencia Southern.
Además, las plantas/células de plantas de caña de azúcar usadas en el procedimiento de acuerdo con la invención se pueden distinguir de las plantas/células de plantas silvestres de caña de azúcar preferiblemente por al menos una de las siguientes características: si la molécula de ácido nucleico extraña que se ha introducido es heteróloga con respecto a la célula de la planta o la planta, los transcritos de las moléculas de ácido nucleico que se han introducido están presentes en las plantas/células de plantas de caña de azúcar usadas en el procedimiento de acuerdo con la invención.
Estas moléculas de ácido nucleico se pueden detectar por ejemplo, por análisis de transferencia Northern o por RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa).
Además, las plantas/células de plantas de caña de azúcar usadas en el procedimiento de acuerdo con la invención forman una proteína que es codificada por una molécula de ácido nucleico extraña que se ha introducido. Esta proteína se puede detectar, por ejemplo, por procedimientos inmunológicos, en particular por un análisis de transferencia Western.
En el contexto de la presente invención, el término “genoma” debe entenderse que significa la totalidad del material hereditario presente en una célula vegetal. El experto en la materia sabe que no sólo el núcleo, sino también otros compartimentos celulares (por ejemplo plástidos, mitocondrias) comprenden material hereditario.
La molécula de ácido nucleico extraña es preferiblemente una molécula recombinante que consiste en una variedad de elementos cuya combinación, o disposición espacial específica, no se encuentra de forma natural en las células de la planta.
En principio, la molécula de ácido nucleico extraña puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que codifique al menos una fructosiltransferasa y que, en la célula de la planta de caña de azúcar
o la planta de caña de azúcar, conduzca a que la planta de caña de azúcar sintetice fructano.
En el contexto de la presente invención, la expresión “célula de planta silvestre de caña de azúcar” significa células de plantas de caña de azúcar que han actuado como material de partida para el procedimiento de acuerdo con la invención, es decir, cuyo genoma no está modificado por la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña que codifica al menos una fructosiltransferasa.
En el contexto de la presente invención, la expresión “planta silvestre de caña de azúcar” significa plantas que han actuado como material de partida para el procedimiento de acuerdo con la invención, es decir, cuyo genoma no está modificado por la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña que codifica al menos una fructosiltransferasa.
En el contexto de la presente invención, el término “correspondiente” significa que, cuando se compara una pluralidad de objetos, los objetos en cuestión que se comparan entre sí se mantienen en condiciones idénticas. En el contexto de la presente invención, el término “correspondiente” en el contexto de célula de planta silvestre de caña de azúcar o planta silvestre de caña de azúcar significa que las células de planta de caña de azúcar o plantas de caña de azúcar que se comparan entre sí, se cultivaron en condiciones de cultivo idénticas y tienen la misma edad, o están el mismo tiempo en cultivo.
En el contexto de la presente invención, el grupo de las fructosiltransferasas vegetales incluye:
sacarosa:sacarosa 1-fructosil transferasas (1-SST) (EC 2.4.1.99),
Las 1-SST catalizan la síntesis de oligofructanos (DP3-DP8) con enlaces beta-2,1-glucosídicos empezando en el sustrato de sacarosa. Las 1-SST catalizan la siguiente reacción:
2 sacarosa = glucosa + -D-fructofuranosil-(21)--D-fructofuranosil--D-glucopiranósido
La 1-SST tiene secuencias codificantes de diferentes organismos conocidos para el experto en la materia y disponibles, por ejemplo, con los siguientes números de referencia en NCBI GenBank:
Allium cepa AJ006066.1 (Vijn, I. y col., Plant Physiol. 117(4), (1998), 1507-1513); Triticum aestivum AB029888.1 (Kawakami, A. y Yoshida, M., Biosci. Biotechnol. Biochem. 66 (11), (2002), 22972305); Allium sativum AY098442.1; Lolium perenne AY245431.1 (Chalmers y col., J Plant Physiol. 160(11), (2003), 1385-91); Festuca arundinacea AJ297369.1, Luescher y col., Plant Physiol. 124 (3), (2000), 1217-1228); Hordeum vulgare AJ567377.2, Nagaraj y col., New Phytologist. 161(3), (2004), 735748); Taraxacum officinale AS250634.1, van den Ende y col., Plant Physiol. 123, (2000), 71-80.
Se prefiere en especial en el contexto de la presente invención la 1-SST de Cynara scolymus (SEQ ID No. 1) o de Helianthus tuberosus (véase el documento WO96/21023, Fig. 4 (A), nº de acceso en GenBank AJ009757.1, van der Meer y col., Plant J. 15(4), (1998), 489-500).
Las 1-SST, proteínas que son codificadas por las moléculas de ácido nucleico extrañas, comparten en cada caso determinadas características. Éstas pueden incluir por ejemplo, la actividad biológica, peso molecular, reactividad inmunológica, conformación, la presencia de dominios estructurales y/o funcionales o similares, y propiedades físicas tales como, por ejemplo, el comportamiento de migración cuando se lleva a cabo la electroforesis en gel, el comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima o similares.
En una realización adicional del procedimiento de acuerdo con la invención, la proteína 1-SST que es codificada por la molécula de ácido nucleico extraña usada, tiene una identidad de al menos 40%, preferiblemente al menos 60%, en especial preferiblemente al menos 80% y en particular preferiblemente al menos 90%, con la proteína 1-SST mostrada en el SEQ ID No. 1.
Usando la información de la secuencia presentada en el SEQ ID No. 1, el experto en la materia puede ahora aislar secuencias homólogas de otras especies de plantas. Esto se puede hacer por ejemplo, con ayuda de procedimientos convencionales tales como el cribado de bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas con sondas de hibridación adecuadas. El experto en la materia sabe que también se pueden aislar secuencias homólogas con la ayuda de oligonucleótidos (degenerados) y usando procedimientos basados en la PCR.
También se pueden usar las bases de datos de cribado proporcionadas por ejemplo por EMBL (http:/lwww.ebi.ac.uk/Tools/index.htm) o NCBI (National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para la información biotecnológica), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para identificar secuencias homólogas. Aquí, se presentan para consultar una o más secuencias. Después, esta secuencia de búsqueda se compara por programas de ordenador frente a secuencias conocidas que se describen en las bases de datos seleccionadas. Dichos buscadores de bases de datos (por ejemplo buscadores Blast o Fasta) son conocidos para el experto en la materia.
Si se lleva a cabo dicha búsqueda en bases de datos, por ejemplo en el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, National Center for Biotechnology Information National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, EE.UU.), deben usarse los parámetros estándar que se ajustan para la búsqueda en cuestión en la base de datos.
Para los alineamientos de secuencias de proteínas (blastp), estos parámetros son los siguientes: límite Entrez = no activado; filtro = activada complejidad baja; valor esperado = 10; tamaño de palabra = 3; matriz = BLOSUM62; costes de los huecos: existencia = 11, extensión = 1.
Para alineamientos de secuencias de ácidos nucleicos (blastn), deben ajustarse los siguientes parámetros: límite Entrez = no activado; filtro = activada complejidad baja; valor esperado = 10, tamaño de palabra = 11.
En dicha búsqueda en bases de datos se pueden usar, por ejemplo, las secuencias descritas en el SEQ ID No 1, como secuencia a consultar con el fin de identificar proteínas homólogas que codifican una 1-SST (SEQ ID No 1).
En el contexto de la presente invención, el término “identidad” se pretende que signifique el número de aminoácidos idénticos (identidad) con los aminoácidos de otras proteínas, expresado como porcentaje. La identidad se determina preferiblemente con la ayuda de programas de ordenador. Si las secuencias que se comparan ente sí tienen diferente longitud, la identidad debe determinarse de forma que el número de aminoácidos que la secuencia más corta comparte con la secuencia más larga determine el porcentaje de identidad. Preferiblemente, la identidad se determina mediante los programas de ordenador conocidos y de uso público ClustalW (Thompson y col., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680).
ClustalW lo tienen disponible al público en general Julie Thompson (Thompson@EMBLHeidelberg.DE) y Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemania. Igualmente, ClustalW se puede descargar de diferentes sitios de internet, entre otros en el IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, Francia; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) y el EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/gub/software/), y todos los sitios espejo de internet del EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, Reino Unido). Preferiblemente se usa la versión 1.8 del programa de ordenador ClustalW para determinar la identidad. Deben ajustarse los siguientes parámetros: KTUPLE = 1, TOPDIAG = 5, WINDOW = 5, PAIRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0,05, GAPDIST = 8, MAXDIV = 40, MATRIX = GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.
La identidad significa además que existe equivalencia funcional y/o estructural entre las respectivas proteínas que son codificadas por las moléculas de ácido nucleico extrañas. Las proteínas que son homólogas a las proteínas detalladas en el SEQ ID No. 1, y que por lo tanto constituyen derivados de estas moléculas que catalizan la misma reacción enzimática, pueden tener la forma de variaciones que ocurren naturalmente, por ejemplo, proteínas de otras especies de plantas, o de mutaciones, pudiendo haber surgido estas mutaciones de forma natural o por mutagénesis dirigida. Estos derivados pueden tener además la forma de secuencias sintéticas.
Las moléculas de ácido nucleico extrañas pueden ser cualesquiera moléculas de ácido nucleico, en particular moléculas de ADN o ARN, por ejemplo ADNc, ADN genómico, ARNm y similares. Pueden ser moléculas naturales o moléculas generadas por procedimientos sintéticos químicos o recombinantes. Pueden ser moléculas monocatenarias que comprenden la cadena codificante o la no codificante, o moléculas bicatenarias.
La caña de azúcar se puede transformar mediante la pistola génica (bombardeo de partículas) (Bower y Birch, Plant Journal 2(3), (1992), 409-416; Franks y Birch, Aust. J. Plant Physiol. 18, (1991), 471480; Gallo-Meagher e Irvine, Crop Science 36(5), (1996), 1367-1374; Bower y col., Molecular Breeding 2(3), (1996), 239-249; Snyman y col., S. Afr. J. Bot. 62(3), (1996), 151-154) o por transferencia de genes mediada por agrobacterias (Arencibia y col., Transgenic Research 7, (1998), An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens, 213-222).
La regeneración de las plantas de caña de azúcar también es conocida para los expertos en la materia Bower y Birch, Plant Journal 2(3), (1992), 409-416; Gallo-Meagher e Irvine, Crop Science 36(5), (1996), 1367-1374; Bower y col., Molecular Breeding 2(3), (1996), 239-249; Ho y Vasil, Ann. Bot. 51, (1983), 719-726).
Para expresar las moléculas de ácido nucleico extrañas que codifican una fructosiltransferasa en plantas de caña de azúcar, estas moléculas se unen preferiblemente con secuencias de ADN reguladoras que aseguran la transcripción en las células de la planta. Estas incluyen en particular promotores. En principio, cualquier promotor que sea activo en las plantas/células de planta de caña de azúcar es adecuado para la expresión.
El promotor se puede elegir de forma que la expresión se produzca de forma constitutiva o solo en un tejido particular, un momento particular del desarrollo de la planta o en un momento que está determinado por factores externos. El promotor puede ser homólogo o heterólogo, tanto con respecto a la planta como con respecto a la molécula de ácido nucleico extraña.
Los ejemplos de promotores constitutivos adecuados son los promotores de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, conocidos como el promotor 35S (Odell y col., 1985, Nature, 313, 810-812) y el promotor ubiquitina del maíz (Christensen y col., Plant Mol. Biol. 18, (1992), 675-689) o el promotor ubiquitina del arroz (Liu y col., Plant Science 165, (2003), “High transgene expression levels in sugarcane (Saccharum officinarum L.) driven by the rice ubiquitin promoter RUBQ2”, 743-750).
Además, se pueden usar promotores que pueden mediar la expresión génica en el tallo de la caña de azúcar, tal como, por ejemplo, el promotor del virus del rayado del banano (Schenk y col., Plant Mol. Biol. 47, (2001), 399-412).
Además, puede estar presente una secuencia de terminación (señal de poliadenilación), que sirve para añadir una cola de poli-A al transcrito. Se cree que la cola de poli-A tiene una función en la estabilización del transcrito. Dichos elementos se describen en la bibliografía (véase, Gielen y col., EMBO
J. 8 (1989), 23-29) y se pueden sustituir según se desee.
También pueden estar presentes secuencias de intrones entre el promotor y la región codificante. Dichas secuencias de intrones pueden conducir a la estabilidad de la expresión y a una expresión alta en plantas (Callis y col., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, y Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, y col., 1997; Plant Journal. 12(4):895-899; Rose y Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122(2), 535-542; Vasil y col., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU y col., 2003, Science in China Series C Vol. 46 No. 6, 561-569). Los ejemplos de secuencias de intrones adecuadas son el primer intrón del gen sh-1 del maíz (Werr y col., EMBO J. 4, (1985), 1373-1380), el primer intrón del gen 1 de poliubiquitina del maíz (Christensen y col., Plant Mol. Biol. 18, (1992), 675-689), el intrón del gen de actina del arroz (McElroy y col., Plant Cell 2, (1990), “Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation”, 163-172), o uno de los dos primeros intrones del gen PAT1 de Arabidopsis (Rose y Last, Plant J. 11, (1997), “Introns act post-transcriptionally to increase expression of the Arabidopsis thaliana tryptophan pathway gene PAT1”, 455-464).
Procedimientos para usar en el contexto de la presente invención:
1. Toma de muestra para la determinación de fructano y azúcares
Se recogen los troncos de las plantas de caña de azúcar que tienen de 12 a 15 meses de edad y tienen más de 10 entrenudos. Después de quitar todas las hojas, se numeran los entrenudos del tronco desde la parte superior (=1) a la parte inferior (por ejemplo = 36). Se corta un disco del tronco de aproximadamente 1-2 g de peso del medio de cada entrenudo. Después se combinan los discos de tronco de 3 entrenudos para dar una muestra y se congela en nitrógeno líquido.
Para la extracción del azúcar y fructano, los discos de tronco primero se muelen en una mezcladora Waring (de Waring, New Hartford, Connecticut, EE.UU.). Los azúcares y el fructano se extraen agitando durante 1 hora a 95ºC en tampón de fosfato sódico 10 mM pH 7,0. Después, se separan los sólidos por filtración a través de tamices de 30 m. La disolución resultante después se usa para la determinación de fructano y azúcar (véase a continuación).
2. Determinación de fructano
El contenido de fructano de la disolución obtenida por extracción de azúcares y fructanos (véase el procedimiento 1) se determinó mediante el kit de “Procedimiento de ensayo de fructanos” de Megazyme. El principio de este ensayo se basa en la hidrólisis del fructano en sus monómeros reductores glucosa y fructosa y la posterior determinación fotométrica (longitud de nm) del contenido de estos azúcares reductores (glucosa, fructosa) después de tinción con el que se conoce como “Procedimiento PAHBAH” (para detalles sobre este procedimiento, véase a continuación).
En una primera etapa, la sacarosa presente en el extracto se hidroliza mediante la enzima sacarasa específica para dar glucosa y fructosa. Además, los almidones y mantodextrinas presentes en el extracto se degradan con una mezcla de enzimas -amilasa, pululanasa y maltasa altamente purificadas, para dar igualmente glucosa. Después, los azúcares reductores resultantes se reducen a alcoholes de azúcares por tratamiento con disolución de borohidruro alcalino y después se separan de la disolución. La disolución se neutraliza y el exceso de borohidruro se separa por adición de ácido acético diluido.
Después, el fructano se hidroliza con fructanasa (exo-inulinasa) purificada para dar fructosa y glucosa, y se determina el contenido de los monosacáridos resultantes por el procedimiento PAHBAH.
Productos químicos y disoluciones en el kit:
- 1.
- Están presentes 50 U de sacarasa (levadura), 500 U de -amilasa (B. cereus), 100 U de pululanasa (K. pneumoniae) y 1000 U de maltasa (levadura) en forma de un polvo liofilizado; para la medición se disuelven en 22 ml de tampón de maleato sódico 0,1 M pH 6,5 (en lo sucesivo denominado “enzimas 1”).
- 2.
- Están presentes 8000 U de fructanasa en forma de un polvo liofilizado; para la medición, se disuelven en 22 ml de tampón de acetato sódico 0,1 M pH 4,5 (en lo sucesivo denominado “enzimas 2”).
- 3.
- Disolución estándar de fructosa (1,5 mg de fructosa/ml), disuelta en ácido benzoico al 0,2%.
- 4.
- Control de fructano
polvo de tupinambo (Helianthus tuberosus) lavado con cloroformo con un contenido de fructano conocido.
Disoluciones que no están presentes en el kit:
I. Reactivo PAHBAH
Disolución A: Se añaden 10 g de PAHBAH (hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico, Sigma Bestell Nº H-9882) a 60 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml, y se añaden 10 ml de ácido clorhídrico concentrado a la suspensión, con agitación. La disolución se completa hasta 200 ml y se almacena a temperatura ambiente.
Disolución B: Primero se disuelven 24,9 g de citrato trisódico, después 2,20 g de cloruro de calcio y finalmente 40 g de hidróxido sódico en 500 ml de agua destilada, con agitación. Después de la adición del hidróxido sódico, la disolución puede ser opaca, pero se vuelve transparente cuando la disolución se completa hasta 2 litros con agua. La disolución se almacena a temperatura ambiente.
Poco antes de usarla, se añaden 20 ml de disolución A a 180 ml de disolución B y se mezcla bien (= reactivo PAHBAH). La disolución se debe almacenar en hielo y se puede usar en 4 horas.
II. Disolución de hidróxido sódico 50 mM.
III. Disolución alcalina de borohidruro sódico
Borohidruro sódico 10 mg/ml (Sigma, Bestell Nº S-9125) en hidróxido sódico 50 mM.
IV. Ácido acético 100 mM.
Procedimiento de detección:
- 1.
- Se extraen 20 mg de muestra de control de fructano en 1 ml de agua destilada durante 1 hora en un bloque térmico a 95ºC. Después de centrifugación (5 minutos a 13000xg), el líquido sobrenadante se transfiere a un nuevo recipiente de reacción y el precipitado se suspende otra vez en 1 ml de agua destilada y se extrae durante 1 hora en un bloque térmico a 5ºC. Después de centrifugación otra vez (véase antes), se separa el líquido sobrenadante y se combina con el primer líquido sobrenadante.
- 2.
- Se mezclan 200 l de muestra (extracto, referencia de fructano y control de fructano) con 200 l de enzima 1, y se incuban durante 40 minutos a 40ºC (tiempo de incubación 10 minutos más que el establecido en el protocolo de Megazyme).
- 3.
- Se añaden 200 l de disolución alcalina de borohidruro sódico, y la disolución se mezcla bien y se incuba durante 30 minutos a 40ºC para lograr la conversión completa de los azúcares reductores en alcoholes de azúcares.
- 4.
- Mediante adición de 500 l de ácido acético 100 mM y mezclamiento completo, se elimina el exceso de borohidruro y la disolución se lleva a pH = 4,5.
- 5.
- Se mezclan partes alícuotas de 200 l de la disolución con 100 l de enzimas 2 y se incuban durante 60 minutos a 40ºC (40 minutos más que el tiempo de incubación establecido en el kit de Megazyme, para lograr la hidrólisis completa del fructano)
- 6.
- Se ensaya una referencia de fructosa simultáneamente como muestra adicional. Se tratan 200 l de la disolución de la referencia de fructosa presente en el kit con 900 l de tampón de acetato sódico 100 mM pH 4,5 y se mezclan. Se separan 4 x 200 l de esta mezcla y se tratan con 100 l adicionales de acetato sódico 100 mM pH 4,5.
- 7.
- Se mezclaron todas las muestras y una muestra adicional de un blanco (300 l de acetato sódico 100 mM pH 4,5) con 5 ml de reactivo PAHBAH y la mezcla se incubó durante exactamente 6 minutos en un baño de agua hirviendo.
- 8.
- Después, las muestras se enfrían inmediatamente durante aproximadamente 5 minutos en agua fría (10-15ºC).
- 9.
- Se mide la absorción de todas las disoluciones en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 410 nm frente a la muestra del blanco.
Se usa la siguiente ecuación para el cálculo:
fructano (% p/p) = E x F x 5 x VEx x 1,1/0,2 x 100/W x 1/1000 x 162/180
E = la absorción de PAHBAH de la muestra se mide frente a la muestra del blanco
F = factor para convertir la absorción de fructosa en g de fructosa (54,5 g fructosa/absorción)
5 = factor para la conversión de 200 l a 1 ml de volumen de incubación
VEx = volumen del extracto
1,1/0,2 = se usaron para el análisis 0,2 ml del total de 1,1 ml de digestión enzimática
100/W = factor que indica el fructano en % del peso (W)
1/1000 = conversión de g en mg
162/180 = factor para convertir la fructosa libre medida en fructosa unida en el fructano
- 3.
- Determinación de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa)
Los contenido de glucosa, fructosa y sacarosa en el extracto obtenido de acuerdo con el procedimiento 1, se determinaron por fotometría en un ensayo enzimático por conversión del NAD+ (dinucleótido de nicotinamida y adenina) en NADH (dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido). Durante la reducción, se pierde el carácter aromático del anillo de nicotinamida, y por lo tanto cambia el espectro de absorción. Este cambio en el espectro de absorción se puede detectar por fotometría. La glucosa y fructosa presentes en el extracto se convierten en glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato mediante la enzima hexoquinasa y el trifosfato de adenosina (ATP). La glucosa-6-fosfato posteriormente es oxidada por la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para dar el 6-fosfogluconato. En esta reacción, el NAD+ se reduce para dar NADH, y se determina por fotometría la cantidad de NADH formada. La relación entre el NADH formado y la glucosa presente en el extracto es 1:1, de modo que se puede calcular el contenido de glucosa a partir del contenido de NADH usando el coeficiente de absorción molar del NADH (6,31 mmol-1.cm-1). Después de la oxidación completa de la glucosa-6-fosfato, la fructosa-6fosfato, que se habían formado igualmente en la disolución, es convertida por la enzima fosfoglucoisomerasa para dar glucosa-6-fosfato que, a su vez, es oxidada a 6-fosfogluconato. Otra vez, la relación entre la fructosa y la cantidad de NADH formado es 1:1. Después, la sacarosa presente en el extracto es escindida por la enzima sacarasa (MEgazyme) para dar glucosa y fructosa. Las moléculas de fructosa y glucosa liberadas después se convierten con las enzimas mencionadas antes en la reacción dependiente de NAD+, para dar 6-fosfogluconato. La conversión es una molécula de sacarosa en 6fosfogluconato da como resultado 2 moléculas de NADH. La cantidad de NADH formado se determina igualmente por fotometría y se usa para calcular el contenido de sacarosa, usando el coeficiente de absorción molar del NADH.
- 4.
- Determinación del contenido de hidratos de carbono totales
- 5.
- Determinación del contenido de hidratos de carbono de reserva
El contenido de hidratos de carbono totales se determina sumando el contenido de glucosa, fructosa, sacarosa y fructano.
El contenido de hidratos de carbono de reserva se determina sumando el contenido de sacarosa y fructano.
Generación de plantas de caña de azúcar transgénicas que expresan el gen 1-sst de alcachofa (Cynara scolymus) (plantas pML1)
Usando los cebadores para la PCR P5 (5’-aattcagctgttatccctaggcggacc-3’) (SEQ ID No. 5) y P7 (5’-agtcagctgggaatttaaatttaattaaggcg- 3’) (SEQ ID No. 6), se amplificó un fragmento de 262 pb en el vector pMCS5 (MoBiTec GmbH, Göttingen, Alemania) (MgCl2 1,5 mM, 25 ciclos en cada caso de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 58°C, 30 segundos a 72°C, 1 U de polimerasa TaqI/50 µl), y el producto de la PCR se cortó con PvuII y se clonó en el vector cortado con PvuII pSK(-) (Stratagene). El vector resultante se denominó pSK(-)-MCS. Se combinaron dos productos de la PCR para dar el vector acabado. El primer fragmento se obtuvo por amplificación de un fragmento de 1266 pb en pSK(-)-MCS usando los cebadores P5 (véase antes) y P6 (5’-ggtaactgtcagaccaagtttac-3’) (MgCl2 1,5 mM, 30 ciclos en cada caso de 15 segundos a 94°C, 15 segundos a 60°C, 15 segundos a 72°C, 1 U de polimerasa Pwol/50 µl). El segundo producto de la PCR, que comprendía el gen asd (Haziza y col. EMBO J. 1, 1982, 379-384; nº de acceso en GenBank V00262.1), se amplificó en el ADN de E. coli usando los cebadores Asd1 (AAA ATT TAA ACA TAA TCA ggA TCA ATA AAA C) (SEQ ID No. 7) y Asd2 (AAA ATT TAA ACA TCT gCg CTT ACT CCT) (SEQ ID No. 8) (MgCl2 1,5 mM, 25 ciclos cada uno de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, 1 minuto a 72°C, 1 U de polimerasa TaqI/50 µl) y se volvió a cortar con DraI. Los dos fragmentos se ligaron. El plásmido resultante se denominó pML11. Todos los plásmidos que llevan el gen asd como marcador de selección se propagaron en células G6MD2 (Schwartz, M., J. Biol. Chem. 92, (1966), 1083-1089) y se seleccionaron en medio sin ácido diaminopimélico.
Se ligaron dos fragmentos simultáneamente en el vector pMCS5 abierto con BgIII. El fragmento 1 comprendía el terminador nos de Agrobacterium tumefaciens (Depicker y col., 1982, Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561-573) y se amplificó en pBinAR usando los cebadores P9 (ACT TCT gCA gCg gCC gCg ATC gTT CAA ACA TTT ggC AAT AAA gTT TC) (SEQ ID No. 9) y P10 (TCT AAg CTT ggC gCC gCT AgC AgA TCT gAT CTA gTA ACA TAg ATg ACA CC) (SEQ ID No. 10) (MgCl2 1,5 mM, 25 ciclos en cada caso de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, 30 segundos a 72°C, 1 U de polimerasa PwoI/50 µl) y se volvió a cortar con BglII y PvuI. El fragmento 2 se obtuvo del plásmido pBinAR por digestión con BglII y PvuI. El fragmento de 2674 pb comprendía el promotor nos de Agrobacterium tumefaciens (Depicker y col., Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 1982, 561-573) y el marco de lectura abierto del gen nptII de E. coli (Beck y col. Gene 19, 1982, 327-336; nº de acceso en Gen-Bank V00618). Los dos fragmentos se clonaron simultáneamente en pMCS5 cortado con BgIII (MoBiTec), y se seleccionó un plásmido que comprendía en cada caso uno de los dos fragmentos. El plásmido resultante se denominó pML7. Para eliminar el sitio de escisión NotI en el vector pMCS5 (MoBiTec GmbH, Göttingen, Alemania), el vector se cortó con las enzimas de restricción BamHI y BglII y el vector se religó. El plásmido resultante se denominó pML4. El terminador nos de Agrobacterium tumefaciens (véase antes en el presente documento) se clonó en el vector resultante entre los sitios de escisión de restricción HindIII y PstI. Para este fin, se amplificó un fragmento de ADN correspondiente en pBinAR (véase antes en el presente documento) usando los cebadores P9 (ACT TCT gCA gCg gCC gCg ATC gTT CAA ACA TTT ggC AAT AAA gTT TC) y P10 (TCT AAg CTT ggC gCC gCT AgC AgA TCT gAT CTA gTA ACA TAg ATg ACA CC) y se volvió a cortar con HindIII y PstI. El vector resultante se denominó pML54-nos. Un fragmento PstI de 1986 pb que comprendía el promotor ubiquitina de Zea mays (nº de acceso en Gen-Bank 94464, Christensen y col., Plant Mol. Biol. 18, 1992, 675) y el primer intrón del mismo gen, cuyo intrón se había truncado por digestión con Clal y religado, se clonó en el sitio de escisión PstI de pML54-nos. El extremo 3’ de este fragmento se orientó en la dirección del terminador nos en el vector resultante. El plásmido resultante se denominó pML8.
Se clonó un fragmento NotI del vector pCy21 en pML8, fragmento que comprendía el marco de lectura abierto de la sacarosa-sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST) de Cynara scolymus (Hellwege y col., Plant Journal 12, 1997, 1057-1065; nº de acceso en Genbank Y09662.1). El plásmido resultante se denominó pML10.
El vector pML11 se cortó con NarI y se ligó con un fragmento NarI de 4048 pb de pML10. El plásmido resultante se denomina pML11-SST. Se cortó con AvrII y se clonó un fragmento de 2068 pb de pML7, cuyo fragmento se había obtenido por digestión de restricción con XbaI y SpeI. El vector resultante se denominó pML1.
Transformación de plantas de caña de azúcar con la construcción de 1-sst (pML1)
La inducción de callo y la transformación de la caña de azúcar se llevaron a cabo por el procedimiento de Snyman y col. (Snyman y col., 1996, S. Afr. J. Bot. 62, 151-154). La construcción pML1 se cotransformó con el vector pEmuKN, que expresaba el gen nptII (Beck y col. Gene 19, 1982, 327-336; nº de acceso en Gen-Bank No. V00618) bajo el control del promotor pEmu (Last y col. (1991) Theor.
App1. Genet. 81, 581-588). Las plantas se regeneraron por el procedimiento de Snyman y col. 2001 (Acta Horticulturae 560, (2001), 105-108).
Ejemplo 2
Plantas de caña de azúcar transgénicas transformadas con el gen 1-sst de alcachofa (Cynara5 scolymus) (plantas pML1)
Se transformaron plantas de caña de azúcar de la línea NCo310 con el gen sst de alcachofa como se describe en el ejemplo 1, mediante bombardeo con pistola de partículas. Las plantas de caña de azúcar transgénicas de la línea 2-1-5-3 que sintetizan oligofructanos y la línea silvestre NCo310 se
10 cultivaron en invernadero. Se recogieron los troncos de las plantas de aproximadamente 12 meses de edad. Después de quitar las hojas, se numeraron los entrenudos de los troncos desde la parte superior (= 1) a la parte inferior (por ejemplo = 36). Se cortó un disco de tronco de aproximadamente 1-2 g de peso del medio de cada entrenudo. Los discos de tronco de 3 entrenudos se combinaron para dar una muestra y se congeló.
15 Se usó el procedimiento descrito con más detalle en la sección de metodología para la extracción del azúcar y fructano.
Las plantas de caña de azúcar cv. NCo310 que se habían transformado con el gen sst de alcachofa y almacenan los oligofructanos kestosa y nistosa además de sacarosa tienen un contenido 20 mayor de hidratos de carbono de reserva y un contenido mayor de hidratos de carbono totales en los
troncos en comparación con las plantas de control NCo310 (véase la tabla 1).
Tabla 1: Determinación del contenido de hidratos de carbono totales (glucosa + fructosa + sacarosa + fructano) en los troncos de las plantas de caña de azúcar; NCo310 = control silvestre; 2-1-5-3 = planta de caña de azúcar NCo310 transformada con el gen sst de alcachofa (Cynara scolymus); la numeración “1”,
25 “2”, “3” y “4” se refiere a muestras tomadas de cuatro troncos diferentes del caso transgénico 2-1-5-3
- Muestra
- Peso fresco (PF) [g] Sac. + fructano [mg/g de PF] Hidratos de carbono totales [mg/g de PF]
- NCo310
- 1008 105 109
- 2-1-5-3
- 1 1134 170 175
- 2
- 945 116 124
- 3
- 1069 170 175
- 4
- 920 173 180
Se puede observar un aumento del contenido de sacarosa de los entrenudos 1-3 a 10-12 en los entrenudos más superiores del tronco de la planta silvestre NCo310. El almacenamiento de sacarosa es máximo en los siguientes entrenudos (>12). En estos segmentos del tronco el contenido de sacarosa varía
5 entre 10-14% del peso fresco. Los fructanos no se pueden detectar en las plantas silvestres de caña de azúcar.
En los troncos de las plantas 2-1-5-3 transgénicas, el contenido de hidratos de carbono de reserva (sacarosa y fructano) también aumenta desde los entrenudos 1-3 a los entrenudos 7-9 y después alcanza la saturación. Sorprendentemente, se obtiene un contenido de hidratos de carbono de reserva
10 notablemente superior que en las correspondientes plantas silvestres, en concreto 15-26% del peso fresco, en los segmentos inferiores de los troncos transgénicos.
Por lo tanto, la expresión de gen sst de alcachofa en la caña de azúcar conduce en total a un aumento significativo de los hidratos de carbono de reserva en las plantas de caña de azúcar. Si el contenido de sacarosa de las plantas silvestres (NCo310) se compara con el de las plantas de caña de
15 azúcar transgénicas (2-1-5-3) que expresan 1-SST, se obtienen los siguientes resultados:
Tabla 2. Contenido de sacarosa en troncos de caña de azúcar de tipo silvestre NCo310 y de la línea 2-1-5-3 transgénica que sintetiza oligofructanos; la numeración “1”, “2”, “3” y “4” se refiere a muestras tomadas de cuatro troncos diferentes del caso transgénico 2-1-5-3. Se determinó la media del contenido de sacarosa determinado para las secciones entrenudos individuales. El contenido de sacarosa
20 en el tipo silvestre se ajustó como 100% y el contenido de sacarosa en la línea transgénica está en relación con el tipo silvestre.
- Muestra
- Contenido de sacarosa [mg/g de PF] Sacarosa [% del tipo silvestre]
- NCo310
- 105 100
- 2-1-5-3
- 1 126 120
- 2
- 86 82
- 3
- 122 116
- 4
- 123 113
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- <313>
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- <313>
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<213> Cebador de PCR
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<212> ADN
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<213> Cebador de PCR
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<212> ADN
<213> Cebador de PCR
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Claims (4)
- REIVINDICACIONES1.- Un procedimiento para aumentar el contenido de hidratos de carbono de reserva de una planta de caña de azúcar, que comprende:(a) la modificación genética de una planta de caña de azúcar introduciendo al menos una 5 molécula de ácido nucleico extraña que codifica una sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST)(b) teniendo la planta de caña de azúcar genéticamente modificada de acuerdo con (a) un contenido de hidratos de carbono de reserva mayor en al menos 5% comparado con las correspondientes plantas silvestres de caña de azúcar no modificadas genéticamente entre los entrenudos 10-18.
- 2.- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico extraña que10 codifica una 1-SST codifica una 1-SST de Allium cepa, Triticum aestivum, Allium sativum, Lolium perenne, Festuca arundinacea, Hordeum vulgare, Taraxacum officinale, Cynara scolymus o de Helianthus tuberosus.
- 3.- El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la molécula de ácido nucleico extraña que codifica una 1-SST codifica una 1-SST que tiene una identidad de al menos 80% con la proteína 1-SST 15 mostrada en la SEC ID No. 1.
- 4.- El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la molécula de ácido nucleico extraña que codifica una 1-SST codifica una 1-SST que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID No. 1.
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