ES2354781B2 - Dispositivo y método para el estudio dinámico de biocapas sobre catéteres de uso médico. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo y método para el estudio dinámico de
biocapas sobre catéteres de uso médico. El dispositivo permite la
introducción de múltiples muestras para ser evaluadas a la vez, por
lo que se pueden analizar varios biomateriales en un mismo
experimento. El flujo de líquido sobre todas las muestras es
paralelo al eje de todo el segmento de catéter, recreando
correctamente el flujo tal como se presenta en la realidad cuando
los catéteres son implantados. La extracción de las muestras es
individual, evitando la exposición de las demás muestras al
ambiente, disminuyendo el riesgo de introducir perturbaciones en el
análisis o provocar la contaminación del sistema.
Description
Dispositivo y método para el estudio dinámico de
biocapas sobre catéteres de uso médico.
El objeto principal de la presente invención es
un dispositivo que permite el estudio dinámico de biocapas
microbianas sobre la superficie de materiales tubulares expuestos a
un fluido en movimiento así como su método de utilización para la
realización de dicho estudio dinámico.
Diversos estudios realizados en años recientes
muestran que los microorganismos son capaces de crecer dando lugar a
unas estructuras complejas conocidas como biocapas. Las biocapas
bacterianas son el origen de problemas en diversos ámbitos,
incluyendo salud y medicina, procesos alimentarios, tratamiento de
aguas y otros sectores industriales.
Los microorganismos presentes en las biocapas
son más resistentes a la acción de los antimicrobianos, antisépticos
y desinfectantes que cuando se encuentran en forma planctónica.
Tradicionalmente las pruebas de sensibilidad antimicrobiana o a
otros agentes biocidas se realizan sobre bacterias en forma
planctónica, con lo que sus resultados no son extrapolares al
crecimiento en forma de biocapa.
La formación y desarrollo de las biocapas es un
proceso muy complejo, en el que influyen muchas variables, entre las
que son fundamentales el sustrato o superficie a colonizar
(rugosidad, hidrofobicidad, presencia de película adherida),
hidrodinámica del fluido (velocidad, flujo laminar o turbulento),
características del fluido (pH, nutrientes, temperatura, carga
iónica), así como las propiedades bacterianas.
En el sector de la salud y medicina, el amplio
uso de dispositivos protésicos ha determinado un incremento en el
riesgo de padecer infecciones asociadas a la presencia de biocapas
microbianas. Los resultados obtenidos en un antibiograma
convencional no son aplicables a las biocapas, siendo el tratamiento
de estas infecciones muy complicado y requiere, en la mayoría de los
casos, la retirada del material protésico para erradicar la
infección. Existen dos tipos de análisis para caracterizar la acción
de un agente biocida (antimicrobiano o desinfectante) sobre el
crecimiento de una biocapa. El primero se conoce como análisis
estático, y consiste en estudiar el crecimiento de la biocapa sobre
el material sumergido en un líquido que permanece en reposo. El
segundo tipo se conoce como análisis dinámico y se caracteriza
porque el material se expone a un líquido en movimiento. El hecho es
que existen diferencias en el crecimiento de la biocapa en función
del tipo de análisis. Para el análisis dinámico se necesitan
dispositivos específicos y el material sobre el que se forma la
biocapa tiene que tener una forma determinada para poder adaptarse a
los mismos.
Existe un constante avance tecnológico en cuanto
al desarrollo de nuevos biomateriales con propiedades antiadhesivas,
ya sea mediante algún recubrimiento superficial o por la propia
naturaleza del material. La composición de estos nuevos materiales
es objeto de patentes y a menudo es difícil disponer de muestras que
se adapten a los dispositivos que permiten realizar análisis
dinámicos.
El crecimiento de biocapas sobre superficies de
algún material suele constituir una consecuencia indeseable de la
exposición de dichas superficies al contacto con fluidos en los que
las bacterias se encuentran en forma planctónica. Así mismo, el
desarrollo de la biocapa suele ir acompañado de la deposición de
material inerte que se adhiere a la superficie creando un
ensuciamiento y degradación de la misma. Por ello se estudian
métodos para evitar la formación de las biocapas mediante el empleo
de agentes biocidas que disminuyan o regulen su formación. A menudo
la concentración adecuada del agente biocida está sujeta a no
exceder ciertos límites para no afectar al proceso o función
principal según el sector de que se trate. En la industria de la
alimentación, por ejemplo, es común la formación de biocapas sobre
los conductos y paredes de equipos. Su tratamiento mediante biocidas
debe ser estimado adecuadamente, no rebasando ciertos límites que
pudieran resultar tóxicos.
Los estudios de actividad antimicrobiana o de
biocidas sobre biocapas tienen importantes limitaciones
metodológicas. Muchos de ellos utilizan ensayos estáticos, donde el
fluido permanece en reposo, con lo que no representan de modo
adecuado las condiciones reales del flujo del fluido sobre la
superficie donde crece la biocapa. Existen otros ensayos, conocidos
como ensayos dinámicos, en los que se recrean las condiciones del
flujo del fluido sobre la superficie en la que crece la biocapa.
En el documento US6361963 de 03/06/2002 de Smith
et al. se describe un dispositivo para analizar de modo
dinámico el efecto de agentes biocidas sobre las biocapas formadas
en los equipos utilizados en la industria de la pulpa y fabricación
del papel. En este caso las bacterias son el origen de la corrosión
indeseada de las superficies de estos equipos. El dispositivo consta
de una bandeja con varias cámaras donde se alojan unas piezas
rectangulares de acero, sobre las que se forma la biocapa. Cada
habitáculo posee un orificio para la entrada del fluido y otro para
la salida. De este modo se puede realizar simultáneamente un estudio
dinámico sobre varias piezas en paralelo, empleando una
concentración diferente del agente biocida en cada habitáculo. La
bandeja se cubre con una tapa transparente que permite la
visibilidad de los habitáculos. Este método tiene el inconveniente
de que se necesita un efluente diferente para cada habitáculo.
Además, la extracción de una única pieza implica desmontar todo el
conjunto, exponiendo todas las piezas al ambiente, lo que puede
introducir errores en el análisis y aumenta la posibilidad de
contaminaciones. Por otro lado no se recrean apropiadamente las
condiciones de flujo del fluido en los equipos industriales.
Otro tipo de dispositivo para estudiar de modo
dinámico las biocapas microbianas, el dispositivo de Robbins, se
describe por McCoy et al. en la revista Canadian Journal of
Microbiology (1981), Volumen 27, páginas 910-92.
Este dispositivo contiene un canal por el cual el líquido puede
circular. El canal dispone de varios puertos u orificios
equidistantes donde se alojan unos tapones, que una vez situados en
los puertos, forman parte de la pared del canal. En la base de los
tapones, en la zona que queda formando parte de las paredes del
canal, existe un hueco donde se puede alojar una muestra de un
determinado material en forma de disco. Sobre la cara del disco que
queda expuesta al canal se forma la biocapa microbiana. Los tapones
se pueden extraer independientemente a diferentes tiempos, y
desencajar el disco para estudiar la biocapa formada sobre éste.
Este dispositivo presenta una importante limitación, sólo permite el
estudio de biocapas formadas sobre un material con forma y tamaño
determinados por el hueco del tapón: forma de disco con un diámetro
idéntico al del hueco. Los fabricantes de dispositivos de uso médico
difícilmente suministran muestras de los materiales usados en su
fabricación que tengan forma de disco y con esas dimensiones
concretas. Además, se reservan el conocimiento de la composición
química completa de los biomateriales. Al biomaterial base, plástico
o metal, suelen añadirle una serie de compuestos químicos con
distintos fines, entre ellos mejorar su biocompatibilidad. Se ha
comprobado que estos aditivos pueden influir sobre la biocapa
microbiana y por tanto deben estar presentes cuando el biomaterial
se evalúa in vitro... En consecuencia, el dispositivo de
Robbins tiene una limitación muy importante: no permite utilizar
como sustrato sobre el que se forma la biocapa biomateriales de
composición química idéntica a la de los que se utilizan en los
dispositivos de uso médico.
En el documento US6596505 de 22/07/2003 de
Howard Ceri et al. se describe un método y aparato para
estudiar dinámicamente el efecto de antimicrobianos sobre biocapas
formadas en catéteres de uso clínico. El aparato consta de una
bandeja con varios canales paralelos donde se aloja el líquido. La
tapa de la bandeja posee parejas de insertos donde se sujetan los
segmentos de catéteres. El modo de sujeción consiste en introducir
un extremo del catéter en un inserto, y el otro extremo en el
inserto adyacente, de modo que el segmento de catéter queda sujeto
doblado en forma de U. Al colocarse la tapa sobre la bandeja se
introducen los segmentos de catéteres en el líquido. Para permitir
el flujo de líquido se dispone el conjunto sobre un dispositivo que
lo balancea, moviéndose de un lado hacía el otro, permitiendo que el
líquido fluya a través de los canales. Uno de los inconvenientes de
este sistema reside en que no todo el catéter queda inundado por el
líquido, de modo que se deben cortar los extremos por donde se
sujetan cuando se realiza el recuento bacteriano. También se
introducen perturbaciones en el ensayo cuando se extrae una única
muestra, ya que se debe desmontar toda la tapa, exponiendo al
ambiente todo el conjunto de catéteres. Por otro lado, el flujo de
líquido circulante no recrea de modo adecuado el flujo real
existente en los catéteres implantados en pacientes.
En la invención WO 2005/054820 A1 de 16/06/2005
de Cloete et al. se presenta un dispositivo y método para
monitorizar el crecimiento de biopelículas de un modo dinámico. El
dispositivo consta de una noria que aloja las muestras de material
donde crece la biocapa. La noria se inunda parcialmente en el
líquido. Al girar la noria, las muestras se sumergen y emergen
sucesivamente. Además se dispone de un sensor que mide el
crecimiento de la biocapa. Este dispositivo posee el inconveniente
de no recrear claramente las condiciones exactas de flujo cuando se
pretende estudiar la formación de biocapas en catéteres.
Existen dispositivos que permiten simular las
condiciones de flujo del fluido a través de la superficie de un
biomaterial con una forma determinada, permitiendo estudiar la
actividad de agentes biocidas (antimicrobianos, desinfectantes, etc)
sobre biocapas desarrolladas en el mismo. El hecho de que la
composición de los catéteres sea objeto de derechos que se reservan
los fabricantes impide obtener muestras de los mismos con las formas
adecuadas para ser adaptadas a los dispositivos existentes para
estudios dinámicos. Por ello, la investigación actual se suele
realizar utilizando segmentos de catéteres que se introducen en un
líquido sin velocidad (análisis estáticos).
El objeto de la presente invención es un
dispositivo y un método que permite estudiar la actividad de agentes
antimicrobianos en biocapas bacterianas formadas sobre segmentos de
catéteres de uso médico de forma dinámica, recreando las condiciones
de flujo a las que están expuestos los catéteres cuando son
implantados. El dispositivo permite la introducción de múltiples
muestras para ser evaluadas a la vez, por lo que se pueden analizar
varios biomateriales. El flujo es paralelo al eje de todas las
muestras (segmentos de catéter), recreando correctamente las
condiciones reales. La extracción de cada muestra es individual,
evitando la exposición de las restantes al ambiente, disminuyendo el
riesgo de introducir perturbaciones en el análisis y de
contaminaciones.
Más concretamente, la presente invención
constituye un dispositivo y método para el estudio dinámico de
biocapas microbianas sobre la superficie de materiales tubulares
expuestos a un fluido en movimiento.
Este es un dispositivo muy conveniente para
realizar el análisis dinámico para el estudio de biocapas cuando
éstas crecen sobre superficies de materiales u objetos con forma
tubular, como catéteres intravasculares, sondas urinarias, conductos
de un equipo intercambiador de calor, un tejido, etcétera, cuando el
flujo al que están expuestas es normalmente tubular. Por lo tanto no
es necesario disponer de una muestra del material con una forma
determinada para ser adaptada al dispositivo, ya que se pueden
emplear segmentos del mismo material u objeto como muestras.
Para complementar la descripción que se está
realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las
características de la invención, de acuerdo con un ejemplo
preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como
parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde
con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo
siguiente:
Figura 1.- Esta figura muestra un despiece en
perspectiva del dispositivo.
Figura 2.- Esta figura muestra una vista en
perspectiva de los tapones, receptor y portador.
Figura 3.- Esta figura muestra una vista
superior del cuerpo.
Figura 4.- Esta figura muestra una vista
inferior del cuerpo.
Figura 5.- Esta figura muestra una sección
transversal del cuerpo.
Figura 6- Esta figura muestra una perspectiva de
los componentes del dispositivo.
Figura 7.- Esta figura muestra una vista frontal
del dispositivo completo cargado.
Figura 8.- Esta figura muestra una sección del
tapón receptor.
Figura 9.- Esta figura muestra un esquema del
funcionamiento del dispositivo.
El dispositivo (1) objeto de esta invención está
constituido por varios componentes que permiten su desacople
facilitando las labores de limpieza y esterilización del mismo. El
dispositivo se caracteriza por poseer un cuerpo (2) que define una
pluralidad de cavidades (12) o compartimentos, destinadas a albergar
muestras del material objeto de estudio. En un aspecto preferido de
la presente invención, dicho cuerpo (2) es alargado con todas las
cavidades (12) definidas sobre un mismo plano.
Cada compartimiento o cavidad (12) alberga una
muestra (9), a la que es posible acceder de modo independiente, sin
implicar la exposición de las demás al ambiente exterior,
disminuyendo el riesgo de contaminación de todo el sistema. Cada
cavidad (12) es de una forma alargada y con una sección adecuada a
la muestra que se desea estudiar y/o adecuada para recrear el medio
o alojamiento real donde se encuentra el biomaterial. En un aspecto
preferido de la presente invención, la forma de la cavidad (12) es
cilíndrica, con un diámetro al menos mayor que el de la muestra (9)
de segmento de catéter.
Cada cavidad (12) esta abierta al exterior por
dos entradas definidas en las bases de la cavidad tubular. En un
aspecto preferido de la presente invención, todas las cavidades (12)
se disponen paralelamente dentro del plano que las contiene, de modo
que las entradas quedan alojadas en las dos bases del cuerpo (2) del
dispositivo (1) Al cerrarse mediante un tapón receptor (7) y un
tapón portador (8), ambos tapones (7, 8) quedan enfrentados el uno
contra el otro. Los tapones (7, 8) definen un sistema que permite
sujetar y posicionar adecuadamente la muestra (9) dentro de la
cavidad (12). En un aspecto preferido de la presente invención, el
sistema de sujeción consiste en que el tapón portador (8) posee una
varilla (13) con un diámetro que permite la inserción de la muestra
(9) de segmento de catéter portada por la varilla (13), mientras que
el otro tapón receptor (7) posee un rebaje cónico (15) acabado en un
orificio (16) cuyo diámetro es ligeramente superior al de la varilla
(13). Así mismo, la varilla (13) del tapón portador (8) tiene una
longitud ligeramente superior a la longitud de la cavidad (12), de
modo que permite atravesar la cavidad (12) e insertarse en el
orificio (16) del tapón receptor (7) del otro extremo.
Las cavidades (12) se comunican hidráulicamente
entre sí mediante unas ranuras (11) en forma de canales, definidos
sobre las bases superior e inferior del cuerpo (2) donde se
encuentran las aperturas de las cavidades (12). Cada ranura (11)
comunica una o varias aberturas de las cavidades (12), de modo que
se pueden definir circuitos hidráulicos con o sin bifurcaciones y/o
ramificaciones, describiendo el flujo una trayectoria en forma de
serpentín, zig-zag o costura a través de las
cavidades (12) y las ranuras (11), de arriba a abajo o viceversa,
por una cavidad (12), y tras rebasar las ranuras (11) de esa
abertura, de abajo arriba o viceversa en las siguientes cavidades
(12) y así sucesivamente. Según el número de ramificaciones, el
dispositivo (1) posee los necesarios puertos de entrada o salida de
líquido en la parte superior o inferior de la cavidad (12) primera o
última. En un aspecto preferido de la presente invención, el sistema
de ranuras define un único circuito sin bifurcaciones con dos
orificios, uno para la entrada y otro para la salida, y con una
única ranura (11) para cada abertura que se comunica con la
siguiente abertura de la cavidad (12) adyacente, a no ser que sea la
abertura de las cavidades (12) con los orificios de entrada o salida
de líquido.
El sistema de ranuras se sella mediante dos
tapas (3) y dos juntas (4) ajustadas en las bases del cuerpo (2).
Las tapas (3) y juntas (4) contienen orificios que coinciden con las
aberturas de las cavidades (12) permitiendo encajar los tapones (7,
8) mediante roscado o apriete elástico. En un aspecto preferido de
la presente invención, las tapas (3) se ajustan mediante unos medios
de fijación (6) enroscados en el cuerpo (2), de modo que tapas (3),
juntas (4) y cuerpo (2) poseen tanto orificios pasantes como
roscados, que permiten realizar el apriete sin perturbar el sistema
de canalización. Además los tapones (7 y 8) se ajustan mediante
apriete elástico, empleando unas juntas tóricas (14) insertadas en
unas ranuras practicadas sobre la pared lateral del tapón.
Para alimentar y regular la velocidad del
líquido en el interior del dispositivo (1) se emplea un mecanismo
externo de bombeo (10), o impulsión de líquido. Para ello se conecta
la bomba mediante una tubería o manguera en uno de los puertos de
entrada del líquido al dispositivo (1) mediante unos conectores
roscados (5). Estos conectores roscados (5), tienen forma de espiga
para permitir encajar el extremo del conducto o manguera utilizado.
El mecanismo externo de bombeo (10), suministra líquido desde un
depósito (17) hasta el dispositivo (1) objeto de la presente
invención y desde éste a otro depósito de drenaje (18). El método
descrito permite la introducción de modo controlado de
microorganismos o agentes biocidas.
Se ha realizado una prueba del prototipo
llevándose a cabo un estudio de la actividad in vitro de
daptomicina y vancomicina sobre biocapas de Staphylococcus
epidermidis en catéteres de poliuretano. El objetivo ha sido
evaluar comparativamente la actividad in vitro de daptomicina
y vancomicina frente a biocapas de Staphylococcus epidermis
sobre catéteres de poliuretano, utilizando un modelo estático y un
nuevo modelo dinámico, empleando el dispositivo objeto de la
presente invención:
Material y métodos: Se ha utilizado un sistema
de flujo continuo asociado a una nueva multicámara con flujo laminar
para formar biocapas de S. epidermis ATCC 35984 (slime +)
sobre segmentos de 3 cm de longitud de poliuretano durante 24 horas
a 37ºC (flujo: 40 ml/h). Una vez formada la biocapa (tiempo 0) y
utilizando el mismo sistema dinámico, se ha evaluado la actividad de
daptomicina y vancomicina a concentración de 20 mg/L durante 24 y 48
horas comparadas con un control sin antimicrobiano. Para ello en
cada tiempo (0, 24 y 48 h) se retiraron 3 segmentos de catéteres que
se lavaron y se sometieron a un tratamiento de ultrasonido con
objeto de desprender las bacterias adheridas. El número de bacterias
viables se determinó mediante recuento en agar. En el modelo
estático, biocapas bacterianas de 24 horas formadas en condiciones
estáticas mediante la incubación de segmentos de catéteres en
presencia del microorganismo, se incubaron posteriormente con
diferentes concentraciones de antimicrobiano de 1 x concentración
mínima inhibitoria (CMI) a 40xCMI. La actividad antimicrobiana se
determinó como se describe previamente.
Resultados: En el modelo dinámico, la exposición
de la biocapa bacteriana a daptomicina durante 24 y 48 horas indujo
una reducción en el nº de bacterias adheridas al biomaterial de 2 y
4 logaritmos respectivamente, comparadas con un control sin
antimicrobiano (2.28 x 10^{6} y 2.11 x 10^{4} ufc/segmento
respectivamente; control 1.37 x 10^{8} ufc/segmento). Tras 48
horas de exposición a vancomicina, ésta tan solo mostró una
reducción de 1.5 logaritmos en el nº de bacterias adheridas (5.21 x
10^{6} ufc/segmento; control 1.37 x 10^{8} ufc/segmento). En el
modelo estático, daptomicina mostró mayor actividad que en el modelo
dinámico. A 20 mg/L (40 x CMI) la reducción de la viabilidad
bacteriana comparada con el control fue de 5 logaritmos (2.92 x 10
ufc/segmento; control 5.30 x 10^{6} ufc/segmento). A las
concentraciones evaluadas, vancomicina no mostró actividad frente a
la biocapa bacteriana (2.66 x 10^{6} ufc/segmento a 20 mg/L;
control 5.30 x 10^{6} ufc/segmento).
Conclusiones: Utilizando modelos in vitro
dinámico/estático, daptomicina mostró mayor actividad frente a
biocapas de S. epidermis sobre catéteres de poliuretano.
Claims (6)
1. Dispositivo (1) para el estudio dinámico de
biocapas caracterizado porque comprende:
- -
- un cuerpo alargado (2) realizado en material transparente, que dispone de:
- i.
- al menos una cavidad (12) destinadas a alojar las muestra (9) de segmento de catéter,
- ii.
- al menos una ranuras (11) que unen entre sí las cavidades (12) y que están dispuestas dos a dos generando un circuito en forma de serpentín.
- -
- dos tapas (3) ubicadas en cada lateral del cuerpo (2),
- -
- dos juntas (4) ubicadas entre cada tapa (3) y el cuerpo (2) destinadas a evitar fugas,
- -
- medios de fijación (6) encargados de fijar las tapas (3) y las juntas (4) al cuerpo (2),
- -
- dos conectores roscados (5) con forma de espiga para permitir encajar el extremo del conducto utilizado, situados a cada uno en los extremos del cuerpo (2), que permiten la entrada del líquido desde un mecanismo externo de bombeo (10) al dispositivo (1),
- -
- al menos un tapón receptor (7), situado en una de las tapas (3) y encargado de alojar la varilla (13).
- -
- al menos un tapón portador (8) que se aloja en la otra tapa (3) ubicada en el lado opuesto del cuerpo (2) que comprende una varilla (13) portadora de una muestra (9) de segmento de catéter a estudiar.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Dispositivo (1) para el estudio dinámico de
biocapas según reivindicación 1 caracterizado porque el tapón
receptor (7) comprende una junta tórica (14) destinada a evitar
fugas de líquido.
3. Dispositivo (1) para el estudio dinámico de
biocapas según reivindicación 2 caracterizado porque el tapón
receptor (7) adicionalmente comprende un rebaje cónico (15)
destinado a dirigir la punta de la varilla (13) hacia un orificio
(16) donde queda alojada.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método estudio dinámico de biocapas
caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
- -
- se ubica la muestra (9) de segmento de catéter donde crecerá la biocapa en la varilla (13) del tapón portador (8),
- -
- se coloca la muestra de segmento de catéter (9) en la cavidad (12) atravesando el cuerpo (2), las tapas (3) y las juntas (4) dirigiendo la punta de la varilla (13) hacia el tapón receptor (8) ubicado al otro lado del cuerpo (2),
- -
- la punta de la varilla (13) es conducida al orificio (16) del tapón receptor (6) mediante el rebaje cónico (15), la junta tórica (14) sella el conjunto evitando fugas,
- -
- una vez colocada la muestra (9) de segmento de catéter se pone en funcionamiento el mecanismo externo de bombeo (10) que abastece de líquido al dispositivo (1), creando así las condiciones para el cultivo controlado de biocapas sobre la muestra de segmento de catéter (9).
\vskip1.000000\baselineskip
5. Método estudio dinámico de biocapas según
reivindicación 6 caracterizado porque el mecanismo externo de
bombeo (10) regula el flujo de fluido desde un depósito (17) hacia
el dispositivo (1) y desde éste a un depósito de drenaje (18).
6. Método estudio dinámico de biocapas según
reivindicación 6 caracterizado porque el mecanismo externo de
bombeo (10) introduce microorganismos o agentes biocidas en el
fluido que está en contacto con la muestra de segmento de catéter
(9).
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| ES200803508A ES2354781B2 (es) | 2008-12-11 | 2008-12-11 | Dispositivo y método para el estudio dinámico de biocapas sobre catéteres de uso médico. |
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