ES2353479T3

ES2353479T3 - Moduladores de il-32.

Info

Publication number: ES2353479T3
Application number: ES06766125T
Authority: ES
Inventors: DanielaWeizmann Institute of Science NOVICK; Menachem Rubinstein; Charles A. Dinarello; Soo-Hyun Kim
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; University of Colorado Boulder
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; University of Colorado Boulder
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2006-07-10
Publication date: 2011-03-02
Anticipated expiration: 2026-07-10
Also published as: AU2006267851B2; IL169622A0; WO2007007327A2; DE602006018473D1; AU2006267851A1; CA2614680C; CA2614680A1; IL188629A0; IL188629A; US20080267908A1; US20110044999A1; US9045559B2; EP1913400B1; JP5312025B2; WO2007007327A3; JP2009500639A; EP1913400A2

Abstract

Un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en la unión de IL-32 a la proteinasa 3 (PR-3), que comprende determinar la unión de IL-32 a PR-3 en presencia de un modulador candidato, comparar el nivel de dicha unión con el nivel de unión de IL-32 a PR-3 en ausencia de dicho modulador candidato, y seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar dicha unión, en el que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos para cribar moduladores de interleucina 32 (IL-32), a fragmentos de IL-32 y a su uso. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Interleucina-32 (IL-32) fue identificada inicialmente en 1992 por Dahl y col. como una molécula tipo citocina denominada transcrito 4 de células asesinas naturales (NK4). Debido a su identificación inicial en 10 1992, NK4 no se ha estudiado en extensión y el término NK4 (o NK-4) se asignó también a otras proteínas no relacionadas [Kim, 1989; Smart, 1989; Date, 1997].

Se ha informado del incremento en la expresión génica de NK4 en células mononucleares de la sangre 15 periférica (PBMC) de pacientes que reciben terapia contra el melanoma maligno con elevadas dosis de IL-2, pero no se ha determinado su función [Panelli, 2002].

Kim y col. (2005) han informado recientemente de que la estimulación de células macrófagas Raw 264.7 con NK4 20 recombinante indujo la secreción de grandes cantidades de TNF-α en estas células. Por tanto, se reconoció a NK4 como citocina proinflamatoria y se renombró como IL-32 [Kim, 2005].

El gen que codifica IL-32 reside en el cromosoma 25 humano 16 p13.3. El gen IL-32 contiene ocho exones. Se detectaron cuatro variantes de corte y empalme del ARNm de IL-32 que codificaban las isoformas IL-32α, IL-32β, IL-32δ e IL-32γ en las células asesinas naturales humanas (NK), y se identificó que la isoforma IL-32γ era idéntica al 30 transcrito anteriormente informado como transcrito NK4 [Kim, 2005]. El transcrito IL-32γ, que incluye los exones 3 y 4, codifica una isoforma de proteína que tiene 46 aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal. En el transcrito IL-32δ, el segundo exón está ausente y el 35 inicio de la traducción se produce en un codón ATG presente en el tercer exón. A diferencia de otras variantes, el transcrito IL-32α carece de los exones 7 y 8 y codifica una isoforma de proteína que tiene 57 residuos de aminoácidos desaparecidos en su extremo C-terminal. De 5 entre los cuatro transcritos IL-32, el transcrito IL-32α es el más abundante, por tanto, se caracterizó IL-32α con mayor amplitud. El análisis de la secuencia de aminoácidos de la isoforma IL-32α desveló tres potencialessitios de N-miristoilación y un sitio de N-glicosilación [Kim, 2005]. 10

Se ha informado de que IL-32α y β inducen la secreción de cantidades significativas del factor α de necrosis tumoral (TNF-α) y de la proteína 2 inflamatoria de macrófagos (MIP-2) en una manera dependiente de la dosis a partir de células THP-1 diferenciadas mediante PMA 15 y a partir de células Raw de ratón. Se informó que IL-32-α y β recombinantes (rIL-32-α y β) inducen la producción de IL-8 en células THP-1 monocíticas humanas no diferenciadas. Se encontró que un fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal dirigido contra rIL-32β reduce la 20 actividad biológica de r-IL-32α en hasta un 70 % en una manera dependiente de la dosis. A nivel transcripcional, se detectó el ARNm de IL-32 de 1,2 KB en diversos tejidos, pero fue más prominente en células inmunes que en tejidos no inmunes (Kim, 2005). 25

Células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), que contienen en su mayor parte células T, produjeron y secretaron IL-32 tras estimulación con Con A (que induce principalmente la estimulación de células T). No se detectó la producción o secreción de IL-32 tras la 30 estimulación de PBMC con lipopolisacáridos (que inducen principalmente la estimulación de macrófagos). Estos resultados sugieren que las células T son las productoras principales de IL-32. Sin embargo, se encontró que la estimulación de líneas de células epiteliales con IFN-35 gamma induce la producción de IL-32.

La actividad proinflamatoria de IL-32 parece estar mediada por la degradación de I-κB, que conduce a la activación de NF-κB. Sin embargo, se ha informado también de la activación de la quinasa MAP por IL-32α [Kim, 2005]. 5

La proteinasa 3 (PR-3, conocida también como mieloblastina, PR-3 neutrófilo y autoantígeno de Wegener) es una gránulo serina proteasa producida por los neutrófilos/monocitos y es capaz de procesar múltiples sustratos biológicos [Baggiolini, 1978; Kao, 1988]. PR-3 10 degrada una variedad de proteínas de la matriz extracelular, que incluyen elastina, fibronectina, colágeno de tipo IV, y laminina e inactiva p65 NF-κB [Preston, 2002]. PR-3 escinde muchas prohormonas y citocinas incluyendo el angiotensinógeno, TGF-β1, IL-1β, 15 IL-8 y TNF-α unido a membrana en su forma activa [Ramaha, 2002; Csernok, 1996; Coeshott, 1999; Padrines, 1994; Robache-Gallea, 1995]. De hecho, se encontraron títulos elevados de autoanticuerpos de PR-3 (véase a continuación) que bloqueaban completamente la escisión de TNF-α. 20

PR-3, que aparece en las formas tanto soluble como de membrana celular, es el autoantígeno principal en la granulomatosis de Wegener (GW). La granulomatosis de Wegener es la vasculitis sistémica necrotizante autoinmune más común en adultos y se manifiesta principalmente en el 25 tracto respiratorio y los riñones [Lamprecht, 2004; Frosch, 2004].

Los autoanticuerpos contra PR-3, conocidos como "autoanticuerpos citoplásmicos dirigidos contra neutrófilos" (ANCA) son un factor distintivo en el 30 diagnóstico de GW [van Rossum, 2003; Jennette, 1997]. Se encontró que el fenotipo con elevado PR-3 de membrana (mPR-3) era significativamente mayor en pacientes con vasculitis asociada a ANCA y en pacientes con artritis reumatoide. Por lo tanto, la expresión de PR-3 de membrana 35 es un factor de riesgo de vasculitis y artritis reumatoide [Witko-Sarsat, 1999]. La expresión de PR-3 en las membranas de las células neutrófilas está relacionada con la recaída en la vasculitis asociada a los autoanticuerpos citoplásmicos dirigidos contra neutrófilos (ANCA) PR-3. 5 Los pacientes con vasculitis en vasos pequeños tienen niveles mayores de proteína PR-3 circulante en su plasma [Ohlsson, 2003]. Niveles elevados de expresión de PR-3 en la membrana de los neutrófilos son también un factor de riesgo de GW y se asocian con la recaída de la enfermedad 10 GW (Rarok AA; Stegeman CA, Limburg PC, Kallenberg CG. J Am Soc Nephrol. 2002 Sep; 13(9): 2232-8.

Aparentemente, la patogénesis de GW está inducida por la unión de ANCA al antígeno de PR-3 presente en la superficie de neutrófilos y monocitos. La unión de ANCA a 15 neutrófilos y monocitos produce la activación celular, el estallido respiratorio y la liberación de radicales de oxígeno tóxico y de enzimas proteolíticas. La exposición de PR-3 en la superficie celular y la unión de autoanticuerpos dirigidos contra PR-3 a neutrófilos 20 parecen facilitar la autoinmunización y la amplificación de la inflamación vascular inducida por neutrófilos.

Los perfiles de expresión génica de los neutrófilos y los monocitos maduros periféricos de pacientes que padecen enfermedades ANCA manifestadas en el riñón 25 mostraron niveles elevados de transcritos de un grupo de genes que se expresan normalmente sólo en células precursoras de la médula ósea ("desviación hacia la izquierda"). El transcrito PR-3 está incluido en este grupo de genes aumentados y el incremento de la expresión 30 de PR-3 correlacionado con la actividad de la enfermedad y con la glomerulonefritis [Muller Kobold, 1998; Yang, 2004; Yang, 2002].

Los pacientes con fibrosis quística (FQ) tienen aumentado el ARNm de PR-3 en los monocitos circulantes en 35 el momento de la exacerbación pulmonar [Just, 1999]. La proteína D surfactante (SP-D) es una importante molécula de defensa innata del huésped presente en el pulmón de los pacientes afectados de FQ, que interactúa con los patógenos asociados con FQ [von Bredow, 2003]. SP-D es una 5 proteína diana de PR-3. De esta manera, en los pacientes con FQ, parece estar afectada la defensa del huésped debido a la proteólisis de SP-D por PR-3, incrementándose por tanto la incidencia de la infección del pulmón en estos pacientes. 10

En pacientes con las encías inflamadas, se encontró que PR-3 funcional se expresaba en las células epiteliales orales y se encontró ANCA en el suero del paciente. Dichas células epiteliales que expresan PR-3 funcional parecen participar en los procesos inflamatorios de las encías, 15 que incluyen gingivitis y periodontitis [Uehara, 2004].

Además de actuar sobre la superficie celular y en el espacio extracelular, PR-3 penetra en las células endoteliales, en las que puede imitar a las caspasas, por ejemplo, escindiendo NF-κB e induciendo la activación 20 mantenida de JNK. PR-3 también escinde e inactiva el inhibidor p21Wafl/Cip1/Sdi1 del ciclo celular principal. Se encontraron elevados niveles de PR-3 y del producto de escisión de p21 en tejido humano inflamado tomado de pacientes con enfermedad de Crohn y de colitis ulcerosa 25 [Pendergraft, 2004]

Se requiere la dipeptil peptidasa I (DPPI) para la activación completa de las serina proteasas derivadas de neutrófilos tales como PR-3. No están disponibles ratones con PR-3 inactivado, pero se generaron satisfactoriamente 30 ratones deficientes en DPPI [Adkison, 2002]. Se encontró que los ratones con DPPI inactivada eran resistentes a la inducción de la artritis mediante anticuerpos contra colágeno y no acumularon neutrófilos en sus articulaciones. La resistencia a la inducción de la 35 artritis estaba correlacionada con la inactivación de las serina proteasas derivadas de neutrófilos debido a que los ratones con genes inactivados deficientes en serina proteasas tales como la neutrófilo elastasa (-/-) x catepsina G (-/-) mostraron ser también resistentes a la 5 inducción de la artritis por anticuerpos dirigidos contra colágeno.

Los fragmentos de PR-3 enzimáticamente inactivos generados mediante deleción de la tríada catalítica [Yang, 2001] mantienen todavía algunas actividades biológicas, 10 que incluyen:

: (i) Modulación negativa de la síntesis de ADN en las células progenitoras hematopoyéticas normales, un efecto que se puede invertir por el factor de estimulación de colonias de granulocitos-15 macrófagos (GM-CSF), lo que implica que PR-3 puede funcionar como compensador de los reguladores de la proliferación [Skold, 1999].

: (ii) Inducción de la interleucina-8, a niveles transcripcional y traduccional [Berger, 1996], e 20

: (iii) Inducción de la apoptosis en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) [Yang, 2011].

Según se ha mencionado anteriormente, PR-3 es una serina proteinasa y muchos inhibidores de las serina 25 proteinasas naturales y sintéticas bien caracterizados son capaces de inactivar PR-3, tanto reversible como irreversiblemente. Se informó que algunos inhibidores de las serina proteinasas inhibían específicamente PR-3. Los inhibidores sintéticos 7-amino-4-cloro-3-(2-bromoetoxi) 30 isocumarina y 3,4-dicloroisocumarina (DCI) presentaron valores de kI de 4700 y 2600 M-1·s-1, respectivamente [Kam, 1992]. Suramina, una naftilurea hexasulfonada recientemente usada como fármaco antitumoral, es un potente inhibidor de la neutrófilo elastasa humana, la 35 catepsina G, y PR-3. LA Ki para PR-3 es 5·10-7 M [Cadene, 1997]. Se describió un tipo general de agentes peptidomiméticos basados en una estructura de 1,1-dióxido de 1,2,5-tiadiazolidin-3-ona y se encontró que sus derivados de sulfona eran inhibidores irreversibles, 5 dependientes del tiempo, potentes, y muy eficaces de la leucocito elastasa, la catepsina G, y PR-3 humanas [Groutas, 1997]. Se encontró que dichos compuestos eran útiles como agentes antiinflamatorios (Groutas WC. Patente de los Estados Unidos 5.550.139 27 de Agosto de 1996). 10

Otros inhibidores de la proteinasa consisten en polipéptidos de diversas fuentes. Elafina, un péptido derivado de la piel humana que inhibe la leucocito elastasa humana, mostró ser un potente inhibidor de PR-3, mostrando una CI50 de 9,5 x 10-9 M. Se encontró que la 15 potencia era más de 100 veces mayor en comparación con la antileucoproteasa y eglina C [Wiedow, 1991; Zani, 2004]. MNEI (inhibidor de la monocito/neutrófilo elastasa) es un miembro de la superfamilia de la serpina de 42 kDa, que inhibe eficazmente las proteasas con especificidades de 20 tipo elastasa y quimotripsina. MNEI inhibió rápidamente PR-3 a una velocidad > 107 M-1·s-1 [Cooley, 2001]. Se encontró que una serpina diseñada mediante bioingeniería (LEX032) era un inhibidor dependiente del tiempo de PR-3, formando un complejo enzima-inhibidor muy estable (Ki 12 25 nM) [Groutas, 1997]. De esta manera, muchos inhibidores de la serina proteinasa mostraron inhibir PR-3 específicamente.

El documento WO2005/047478 da a conocer composiciones y procedimientos relacionados con una citocina inducible 30 por IL-18 denominada factor que induce el factor alfa de necrosis tumoral (TAIF) o interleucina-32 (IL-32) y los procedimientos para tratar enfermedades autoinmunes y cáncer, en parte, mediante la regulación de la expresión del factor alfa de necrosis tumoral. 35

El documento US 4.845.242 da a conocer el uso de isocumarinas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Los documentos WO90/15816 y WO91/12009 dan a conocer el uso médico de la suramina en el tratamiento de 5 enfermedades inflamatorias tales como artritis y enfermedades reumatoides, respectivamente.

El documento WO95/18797 da a conocer el uso médico de los derivados de 1,2,5-Tiazolidina-1,1-dióxido como agentes antiinflamatorios. 10

El documento WO02/087511 desvela el uso médico de MNEI para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

McMichael J.W. y col., (Infection and Immunity 73 (2005), pp. 3609-17) tratan sobre el uso médico de Elafina en el tratamiento de la inflamación del pulmón. 15

El documento US 6.342.373 da a conocer el uso médico de Eglina C en el tratamiento de la inflamación pulmonar.

Gu Yuejie y col. (FASEB J. 16 (2002), p. A83 dan a conocer el uso médico de LEX032 en el tratamiento de la lesión por reperfusión tras isquemia transitoria. 20

Teixeira Maurom M. y col. (J. Immunol. 151 (1993), pp. 5525-34) dan a conocer el uso médico de PMSF para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Van der Geld, Y.M. y col. (Clin. Exp. Immunol. 122 (2000), pp. 504-13) dan a conocer el uso médico de 25 fragmentos de PR-3 para el tratamiento de la granulomatosis de Wegener.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 30 32 (IL-32) basado en la unión de IL-32 a PR-3, que comprende determinar la unión de IL-32 a PR-3 en presencia de un modulador candidato, comparando el nivel de dicha unión con el nivel de unión de IL-32 a PR-3 en ausencia de dicho candidato modulador, y seleccionar un modulador 35 capaz de inhibir o potenciar dicha unión, en la que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

En una realización de la invención, dicha unión de 5 IL-32 a PR-3 se midió mediante resonancia de plasmón superficial.

En una realización de la invención, dicho modulador inhibe la unión de IL-32 a PR-3.

En una realización adicional de la invención, el 10 modulador es un inhibidor de la actividad de IL-32, preferiblemente un inhibidor de la actividad inflamatoria de IL-32.

En otra realización de la invención, dicho modulador potencia la unión de IL-32 a PR-3 y potencia la actividad 15 de IL-32.

En otra realización adicional de la invención, el modulador es un fragmento de PR-3, que se une a IL-32, pero que no es capaz de escindirlo.

La presente invención proporciona un procedimiento 20 de cribado de un inhibidor de la actividad de interleucina 32 (IL-32) en la que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF6, y la inducción de IL-8, basado en la actividad proteolítica de PR-3 sobre IL-32, que comprende determinar 25 la proteólisis de IL-32 mediante PR-3 en presencia de un candidato inhibidor y seleccionar un inhibidor capaz de inhibir la aparición de un fragmento de IL-32 generado por la actividad proteolítica de PR-3 o la desaparición de la IL-32 intacta. 30

En una realización de la invención, dicho inhibidor inhibe la actividad inflamatoria de IL-32.

En otra realización de la invención, dicho fragmento de IL-32 es de aproximadamente 16 kDa o aproximadamente 13 kDa. 35

Adicionalmente, la invención proporciona un procedimiento de cribado de un inhibidor de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en el potenciamiento de la secreción de la citocina mediado por IL-32 mediante PR-3 en una célula sensible a IL-32, que comprende poner en 5 contacto IL-32 y PR-3 con una célula sensible a IL-32 en presencia de un inhibidor candidato, determinar la concentración de una citocina en el medio de cultivo de dicha célula, comparar con la concentración de dicha citocina en el medio de cultivo de dicha célula en 10 ausencia de dicho candidato inhibidor, y seleccionar un inhibidor capaz de inhibir dicha secreción de citocina, en el que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, de TNF, y de IL-8, en el que la citocina se selecciona del grupo que consiste en TNF, IL-15 8 y MIP-2.

En otra realización de la invención, la célula sensible a IL-32 es una célula T o una célula macrófaga. 20

En una realización adicional de la invención, la citocina se selecciona del grupo que consiste en TNF, IL-8 y MIP-2.

La presente invención proporciona también un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad 25 de interleucina 32 (IL-32) o de la actividad de uno de sus fragmentos, que comprende estimular una célula sensible a IL-32 con IL-32, o con uno de sus fragmentos en presencia de un modulador candidato, determinar la concentración de una citocina secretada en el medio de cultivo de dicha 30 célula, comparar con la concentración de dicha citocina secretada en el medio de cultivo de dicha célula en ausencia de dicho modulador candidato y seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar la secreción de dicha citocina de dicha célula, en el que el fragmento de 35 IL-32 es el fragmento de aproximadamente 16 kDa generado por la actividad proteolítica de PR-3, o en el que es el grupo que consiste en TNF, IL-8 y MIP-2.

En otra realización de la invención, el fragmento de IL-32 es el fragmento de aproximadamente 13 kDa generado 5 por la actividad proteolítica de PR-3.

En una realización adicional de la invención, la célula sensible a IL-32 es una célula T o una célula macrófaga.

En otra realización adicional de la invención, dicho 10 modulador candidato se selecciona del grupo que consiste en los inhibidores y potenciadores seleccionados mediante los procedimientos de la invención.

En otra realización adicional de la invención, el modulador es un inhibidor de la actividad inflamatoria de 15 IL-32.

La presente divulgación proporciona moduladores de la actividad de IL-32, tales como inhibidores de la actividad inflamatoria de IL-32, seleccionados mediante los procedimientos de cribado según la invención. 20

En un aspecto, la divulgación proporciona un potenciador de la actividad de IL-32, seleccionado mediante los procedimientos de cribado de la invención.

En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de un inhibidor de PR-3 en la fabricación de un medicamento 25 para el tratamiento de una enfermedad que está producida o exacerbada por una regulación positiva de la producción y/o la secreción de IL-32 o de uno de sus fragmentos procedente de células que expresanésta en un mamífero, incluyendo un ser humano. 30

En un aspecto, la enfermedad está producida o exacerbada por la producción y/o secreción de un fragmento de IL-32.

En otro aspecto, el fragmento de IL-32 es de aproximadamente 16 kDa y está generado por la actividad 35 proteolítica de PR-3.

En un aspecto adicional, el fragmento de IL-32 es de aproximadamente 13 kDa y está generado por la actividad proteolítica de PR-3.

En un aspecto más, las células que expresan IL-32 o 5 uno de sus fragmentos son células epiteliales.

En otro aspecto adicional, el inhibidor de PR-3 se selecciona del grupo que consiste en isocumarina, dicloroisocumarina, suramina, naftilurea hexasulfonada, agentes peptidomiméticos basados en una estructura de 1,1-10 dióxido de 1,2,5-tiadiazolidin-3-ona y sus derivados de sulfona, inhibidor de la proteinasa, elafina, antileucoproteasa de eglina C, MNEI (inhibidor de la monocito/neutrófilo elastasa), la serpina LEX032 diseñada mediante bioingeniería, y un anticuerpo neutralizante 15 dirigido contra PR-3.

En otro aspecto, la divulgación enseña el uso de un potenciador o inhibidor de IL-32 cribado según los procedimientos de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que está 20 producida o exacerbada por la producción o secreción no regulada de IL-32 o de uno de sus fragmentos procedente de células que expresan ésta en un mamífero, incluyendo un ser humano.

En un aspecto, la enfermedad está producida o 25 exacerbada por la producción y/o secreción no regulada de un fragmento de IL-32.

En otro aspecto, el fragmento de IL-32 es de aproximadamente 16 kDa y está generado por la actividad proteolítica de PR-3. 30

En un aspecto más adicional, el modulador es un inhibidor seleccionado mediante el procedimiento de 35 cribado de la presente divulgación.

En un aspecto más adicional, la producción o secreción de IL-32 o de uno de sus fragmentos procedente de células que expresan éste, está regulada positivamente.

En un aspecto más adicional, las células que 5 expresan IL-32 o uno de sus fragmentos son células epiteliales.

En un aspecto más adicional, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a 10 un procedimiento para tratar una enfermedad que está producida o exacerbada por la producción y/o secreción regulada positivamente de IL-32 o de uno de sus fragmentos procedente de células que expresan éste en un mamífero, incluyendo un ser humano, lo que comprende administrar a 15 dicho mamífero en necesidad una cantidad efectiva de un inhibidor de PR-3.

En un aspecto, la enfermedad está producida o exacerbada por la producción y/o secreción no regulada de un fragmento de IL-32. 20

En otro aspecto, el fragmento de IL-32 es de aproximadamente 16 kDa y está generado por la actividad proteolítica de PR-3.

En un aspecto más adicional, el fragmento de IL-32 es de aproximadamente 13 kDa y está generado por la 25 actividad proteolítica de PR-3.

En un aspecto más adicional, las células que expresan IL-32 o uno de sus fragmentos son células epiteliales.

En un aspecto más adicional, el inhibidor de PR-3 se 30 selecciona del grupo que consiste en isocumarina, dicloroisocumarina, suramina, naftilurea hexasulfonada, agentes peptidomiméticos basados en una estructura de 1,1-dióxido de 1,2,5-tiadiazolidin-3-ona y sus derivados de sulfona, inhibidor de la proteinasa, elafina, 35 antileucoproteasa de eglina C, MNEI (inhibidor de la monocito/neutrófilo elastasa), la serpina LEX032 diseñada mediante bioingeniería, y un anticuerpo neutralizante dirigido contra PR-3.

En un aspecto más adicional, la divulgación se 5 refiere a un procedimiento para tratar una enfermedad que está producida o exacerbada por la producción y/o secreción no regulada de IL-32 o uno de sus fragmentos procedente de células que expresan éste en un mamífero, incluyendo un ser humano, lo que comprende administrar a 10 dicho mamífero en necesidad una cantidad efectiva de un modulador seleccionado según uno cualquiera de los procedimientos de cribado de la invención.

En un aspecto, la enfermedad está producida o exacerbada por la producción y/o secreción regulada 15 positivamente de un fragmento de IL-32.

En otro aspecto, las células que expresan IL-32 son células epiteliales.

En un aspecto más adicional, el fragmento de IL-32 es de aproximadamente 16 kDa o 13 kDa y está generado por 20 la actividad proteolítica de PR-3.

La invención proporciona también un fragmento de polipéptido de IL-32, obtenido mediante la proteólisis de IL-32 por PR-3, tal como el fragmento de IL-32 que consiste en aproximadamente 16 kDa o en aproximadamente 13 25 kDa o, una muteína, proteína de fusión, derivado funcional, un derivado permutado circularmente, o una de sus fracciones activas, según se define en las reivindicaciones.

Adicionalmente, la invención proporciona una 30 composición farmacéutica que comprende un fragmento de polipéptido de IL-32 obtenido mediante la proteólisis de IL-32 por PR-3, tal como el fragmento de IL-32 que consiste en aproximadamente 16 kDa o el fragmento de IL-32 que consiste en aproximadamente 13 kDa o, una muteína, 35 proteína de fusión, derivado funcional, o una de sus fracciones activas según se define en las reivindicaciones, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También, en una realización, la invención 5 proporciona un fragmento de polipéptido de IL-32 de SEQ ID NO: 1 o, una muteína, proteína de fusión, o una de sus fracciones activas, según se define en las reivindicaciones.

En otra realización, la invención proporciona un 10 fragmento de polipéptido de IL-32 de SEQ ID NO: 2 o, una muteína, proteína de fusión, o una de sus fracciones activas, según se define en las reivindicaciones.

En una realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un 15 fragmento de polipéptido de IL-32 de SEQ ID NO: 1, de SEQ ID NO: 2 o, una muteína, proteína de fusión, o una de sus fracciones activas, según se define en las reivindicaciones, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, para potenciar las respuestas 20 inmunes del hospedador contra agentes patógenos o cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La fig. 1 muestra fracciones de proteínas urinarias eluidas a partir de una columna de cromatografía por afinidad de IL-32 inmovilizada resueltas en SDS-PAGE. Se 25 inmovilizó IL-32 sobre una resina Affigel 15 y se pasaron las proteínas urinarias concentradas a partir de 500 L de orina sobre la resina; se lavó la resina y se eluyeron las proteínas unidas a resina en un tampón a pH 2,2 en fracciones de 1 ml. Se resolvieron alícuotas (60 µl) de 30 diversas fracciones en SDS-PAGE (acrilamida al 12 %; condiciones no reductoras) y se tiñó el gel con plata. El carril 1 es la fracción lavada; los carriles 2-6 son las fracciones de elución 1 a 5, respectivamente, y el carril 7 muestra los marcadores de peso molecular, indicados al 35 lado derecho (en kDa). La flecha en la figura muestra una proteína de unión a IL-32 de 30 ± 2 kDa que se eluyó principalmente en la fracción 3 y se identificó como PR-3.

La fig. 2A-B muestra la cinética de unión de PR-3 urinaria humana a IL-32 humana según se midió mediante 5 resonancia de plasmón superficial. Fig. 2A. Se inmovilizó IL-32 (20 µg/ml) en tampón acetato pH 4,6) en un canal único de un chip BIAcore según las recomendaciones del fabricante (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se llevaron alícuotas de la fracción de elución 3 procedentes 10 de una columna de afinidad de IL-32 hasta una concentración de 10, 20, 30, 40 y 80 nM (curvas de unión desde la parte inferior a la superior, respectivamente) y se analizaron mediante el sistema BIAcore. Los datos de unión proporcionaron una kD de 2,65 x 10-8 M. Fig. 2B. Se 15 llevó a cabo el mismo análisis con PR-3 que se inactivó mediante fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). La kD resultante fue de 7,9 x 10-8 M.

La fig. 3A-B muestra la cinética de unión de PR-3 humana comercialmente disponible a IL-32 humana según se 20 midió mediante resonancia de plasmón superficial. Para los detalles, véase la fig. 2. Los datos de unión proporcionaron una kD de 1,2 x 10-8 M con PR-3 activa, lo que degradó considerablemente la IL-32 inmovilizada (fig. 3A). La kD de la PR-3 comercialmente disponible que se 25 inactivó mediante PMSF (fig. 3B) fue de 3,5 x 10-8 M.

La fig. 4 muestra la cinética de digestión de 125I-IL-32 por la PR-3 urinaria. El carril 1 muestra la 125I-IL-32 no digerida resuelta, el carril 5 muestra los marcadores de peso molecular (en kDa, véase el lado 30 derecho de la fig.) y los carriles 2-4 y 6-7 muestran 125I-IL-32 tras la incubación con PR-3 durante 1, 5, 15, 30 y 60 minutos a 37º C, respectivamente. Tras 1 minuto de incubación con PR-3, la IL-32 de 20 kDa (Carril 1) se escindió en dos productos de escisión de 16 y 13 kDa 35 (Carril 2). Después de 5 min. (Carril 3) desapareció la banda correspondiente a la IL-32 intacta y los productos de escisión permanecieron estables durante al menos 60 min. (carriles 3, 4, 6, y 7). Los fragmentos de 125I-IL-32 resultantes de PM aparentes de 20 kDa, 16 kDa y 13 kDa se 5 indican en el lado izquierdo de la fig.

La fig. 5 muestra la comparación de la escisión de IL-32 mediante la PR-3 urinaria y comercial. Se llevó a cabo el experimento esencialmente según se indica en la fig. 4 (Ejemplo 5) excepto que la incubación de PR-3 e IL-10 32 se limitó hasta 5 minutos y que se usaron tanto la PR-3 urinaria como la comercial. Se incubaron las PR-3 urinaria (Líneas 1-3) o comercial (Líneas 5-7) con 125I-IL-32 durante 0,1 y 5 minutos. Los resultados muestran que la PR-3 comercial fue más eficiente que la PR-3 derivada de 15 orina debido a que la IL-32 de 20 kDa se escindió completamente en sus fragmentos de 16 y 13 kDa después de 1 min (comparar carriles 6 y 2).

La fig. 6 muestra que el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), un inhibidor de la serina 20 proteasa, bloquea la actividad enzimática de la PR-3 urinaria y comercial y bloquea la escisión de IL-32. Los carriles 1-4 muestran 125I-IL-32 tras la incubación con la PR-3 urinaria durante 1 y 5 min., tanto no tratada (Carriles 1 y 2) como pretratada con PMSF (Carriles 3 y 25 4). Los carriles 7-10 muestran 125I-IL-32 tras la incubación con la PR-3 comercial durante 1 y 5 min, tanto no tratada (Carriles 9 y 10) como pretratada con PMSF (Carriles 7 y 8). Se indican los marcadores de peso molecular (en kDa; carril 5) en el lado derecho. El carril 30 6 muestra 125I-IL-32 no digerida. La figura muestra la extensión de la escisión de IL-32 por la PR-3 urinaria y comercial después de 1 y 5 min. de incubación (carriles 1 y 5 para la urinaria y 9 y 10 para la comercial) y que PMSF bloqueó completamente la escisión de IL-32 por las 35 PR-3 comercial y urinaria;

La fig. 7 muestra la actividad biológica potenciada de la IL-32 pretratada con PR-3 en células Raw 264.7 de ratón. La línea de células Raw 264.7 macrófagas de ratón se sembró en una placa de 96 pocillos y se incubó con IL-5 32 (20 o 200 ng/ml), IL-32 pretratada con PR-3 (100 ng/ml) durante 5 min. o sólo con PR-3 como control, y se midió MIP-2 secretada al medio de cultivo. Los resultados resumidos en la fig. muestran que IL-32 indujo la secreción de MIP-2 por las células Raw 264.7 y que la 10 preincubación de IL-32 con PR-3 durante 5 minutos antes del tratamiento de las células (que se muestra en las figs. 4-6, que escinde la IL-32 de 20 kDa en los fragmentos de 16 y 13 kDa) potenció la secreción de MIP-2. PR-3 sola no tuvo efecto sobre las células. 15

La fig. 8 muestra la actividad biológica potenciada de la IL-32 pretratada con PR-3 en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Las células PBMC humanas se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron con IL-32 (20 o 200 ng/ml), IL-32 pretratada con 20 PR-3 (100 ng/ml) durante 5 min., o sólo con PR-3 como control. Se midió el contenido de IL-8 en el medio de cultivo celular. Los resultados muestran que IL-32 indujo la secreción de IL-8 en células PBMC humanas y que la incubación de IL-32 durante 5 minutos con PR-3 (muestra 25 que induce la degradación completa de IL-32 en las figs. 4-6) antes del tratamiento celular, potenció la secreción de IL-8. La incubación de las células sólo con PR-3 no induce IL-8 en las células de ratón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 30

La presente invención se refiere a los procedimientos de cribado (o identificación o selección) de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32), basándose en nuestros hallazgos de que PR-3 que se une a IL-32 produce la proteólisis de IL-32 y que los 35 fragmentos proteolíticos generados por la acción de PR-3 tienen actividad potenciada.

Adicionalmente, la presente divulgación se refiere a los moduladores de la actividad de IL-32 identificados mediante dicho procedimiento de cribado y al uso de dichos 5 moduladores en una enfermedad que está producida o exacerbada por la producción y/o secreción no regulada de IL-32 o de uno de sus fragmentos.

La divulgación se refiere también a los inhibidores de la actividad de IL-32 que son fragmentos de PR-3 que se 10 unen a, pero que son incapaces de escindir IL-32.

Las citocinas sirven normalmente para potenciar las defensas. Sin embargo, cuando actúan en exceso, pueden producir gran daño no inferior al que pueden producir los patógenos De hecho, en muchas enfermedades, los efectos no 15 deseados de las citocinas constituyen una causa patogénica principal. La producción y/o secreción regulada positivamente de IL-32 o uno de sus fragmentos puede producir una enfermedad inflamatoria o puede exacerbar una enfermedad inflamatoria. Se desea un inhibidor de la 20 actividad de IL-32 para inhibir las enfermedades inflamatorias producidas o exacerbadas por la producción y/o secreción regulada positivamente de IL-32. La producción y/o secreción regulada negativamente de IL-32 o de uno de sus fragmentos puede afectar las defensas del 25 huésped, incrementando por tanto la incidencia de infecciones y cáncer. Se desea un potenciador de la actividad de IL-32 para inhibir las infecciones y el cáncer producidos o exacerbados por la regulación negativa de la producción y/o secreción de IL-32. La presente 30 invención se basa en nuestros hallazgos de que PR-3 se une a IL-32 con elevada afinidad y degrada IL-32 en los fragmentos de 13 y 16 kDa, que presentan actividad biológica potenciada en comparación con la actividad biológica de la IL-32 intacta. 35

Según se ilustra en la sección de Ejemplos que sigue, hemos establecido que PR-3 juega un papel crucial en la activación de IL-32.

De manera breve, hemos concentrado y cargado proteínas urinarias humanas brutas en una columna 5 constituida por IL-32 humana unida a agarosa. Eluimos las proteínas unidas a la columna disminuyendo el pH de la columna y analizamos las proteínas eluidas mediante SDS-PAGE (acrilamida al 10 %). Se enriqueció específicamente una banda de proteína de 28-32 kDa, identificada 10 adicionalmente como la serina proteasa PR-3 derivada de neutrófilos (según se describe en el Ejemplo 1 a continuación) en una de las fracciones eluidas (fig. 1, fracción de elución 3).

Encontramos que PR-3 se unía a IL-32 con elevada 15 afinidad (Kd de aproximadamente 2,65 x 10-8 M con la PR-3 urinaria y una Kd de aproximadamente 1,20 x 10-8 M con la PR-3 comercial, véase el Ejemplo 2). La afinidad de unión de PR-3 a IL-32 disminuyó muy poco tras la preincubación de PR-3 con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 20 indicando que la unión de IL-32 a PR-3 no es dependiente de la actividad enzimática de la última.

Encontramos que la PR-3 escindió IL-32 (de aproximadamente 20 kDa) en fragmentos de aproximadamente 13 kDa (SEQ ID NO: 1) y 16 kDa (SEQ ID NO: 2). 25

PR-3 escinde IL-32 entre Thr (57) y Val (58): YLET(57)V(58)AAY.

Se supuso que la secuencia de 13 kDa era el fragmento N terminal de IL-32: 30 MCFPKVLSDDMKKLKARMHQAIERFYDKMQNAE SGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLET (SEQ ID NO: 1) y que la secuencia de 16 kDa era el fragmento C terminal: VAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDKSYGAPRGDKEELTPQKCSEPQSSK (SEQ ID NO: 2).

Demostramos que la proteína IL-32 (de aproximadamente 20 kDa) desapareció tras un min de incubación con PR-3 comercial, de manera concomitante con 5 la generación de los fragmentos de 13 kDa (SEQ ID NO: 1) y 16 kDa (SEQ ID NO: 2). El pretratamiento de PR-3 con PMSF bloqueó completamente la escisión de IL-32.

Para nuestra sorpresa, encontramos que los fragmentos proteolíticos de IL-32, de 13 kDa (SEQ ID NO: 10 1) y 16 kDa (SEQ ID NO: 2), tuvieron actividad biológica potenciada en comparación con la proteína IL-32 intacta (según se demuestra en el Ejemplo 8). La escisión de IL-32 y el consiguiente potenciamiento de la actividad biológica se bloquearon mediante la acción de PMSF. 15

Para el objetivo de la presente descripción, la expresión "actividad biológica de IL-32" se refiere, entre otras, a al menos una de las siguientes propiedades biológicas: (i) inducción de MIP-2, (ii) inducción de TNF, e (iii) inducción de IL-8. 20

Por tanto, basándose en nuestros resultados, la modulación de la unión de IL-32 a PR-3 (o la formación del complejo IL-32-PR-3), modulará, concretamente potenciará o inhibirá, la actividad de IL-32. Según se usa en el presente documento, la expresión "inhibición de la 25 actividad de IL-32" significa la capacidad de un inhibidor para inhibir cualquier actividad de IL-32 adicionalmente al bloqueo, por ejemplo, la inhibición parcial, o similar.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de cribado de un modulador de la 30 actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en la unión de IL-32 a PR-3, que comprende determinar la unión de IL-32 a PR-3 en presencia de un modulador candidato, comparar la unión de IL-32 a PR-3 en ausencia de dicho modulador candidato, y seleccionar (o identificar) un modulador 35 capaz de inhibir o potenciar dicha unión en la que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, de TNF, y de IL-8.

En una realización, el modulador candidato es una molécula orgánica que se puede diseñar mediante química 5 combinatoria.

El término "IL-32" según la invención, incluye todas las isoformas de IL-32 tales como IL-32α, IL-32β, IL-32γ e IL-32δ.

La expresión "modulador de la actividad de IL-32" 10 significa un inhibidor o un potenciador de la actividad de IL-32.

Según se usa en el presente documento, la expresión "unión a IL-32" significa la capacidad de PR-3 de unirse a IL-32, por ejemplo, según se evidenció mediante la unión 15 de PR-3 a IL-32, cuando se purifica por afinidad según el Ejemplo 1 o cuando se ensaya en BIAcore según el Ejemplo 3.

Según se ha mencionado, las citocinas sirven normalmente para potenciar las defensas. Sin embargo, 20 cuando actúan en exceso, pueden producir gran daño, no inferior al que pueden producir los patógenos. De hecho, en muchas enfermedades, los efectos no deseados de las citocinas constituyen una causa patogénica principal. Actuando en exceso, IL-32 puede producir una función 25 excesiva de TNF e inflamación. En una realización adicional de la presente invención, el modulador es un inhibidor de la actividad inflamatoria de IL-32.

La deficiencia de IL-32 puede afectar las defensas del huésped, incrementando por tanto la incidencia de 30 infecciones y cáncer. En una realización adicional de la presente invención, el modulador es un potenciador de la actividad de IL-32.

Basándose en nuestros resultados, la inhibición de la proteólisis de IL-32 mediante PR-3 dará como resultado 35 la inhibición de la actividad de IL-32 (Según se ejemplifica a continuación con PMSF).

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de cribado de un inhibidor de la actividad de IL-32 (IL-32), (es decir, la inducción de al menos uno 5 de MIP-2, TNF, e IL-8) basado en la actividad proteolítica de PR-3 en IL-32, que comprende determinar la proteólisis de IL-32 mediante PR-3 en presencia de un inhibidor candidato y seleccionar un inhibidor capaz de inhibir la aparición de un fragmento de IL-32 generado mediante la 10 actividad proteolítica de PR-3 o la desaparición de la IL-32 intacta.

En una realización adicional, se lleva a cabo la determinación de la proteólisis de IL-32 controlando los fragmentos de IL-32 generados mediante PR-3, que tienen 15 pesos moleculares de aproximadamente 16 y 13 kDa y/o controlando la desaparición de la IL-32 intacta de peso molecular de aproximadamente 20 kDa según se ejemplifica en los Ejemplos 5-7.

Basándose en nuestros resultados, la inhibición de 20 PR-3 inhibirá la actividad biológica de IL-32 (según se ejemplifica a continuación con PMSF).

Según otra realización de la presente invención, se pueden emplear fragmentos de PR-3, que se pueden obtener mediante escisión de PR-3 por cualquier procedimiento 25 conocido, que se unen a IL-32, pero que no son capaces de escindirle, para suprimir la función potenciadora de PR-3 sobre la actividad biológica de IL-32 según se manifestó mediante la escisión de IL-32.

Según la divulgación, PR-3 se escindió mediante 30 CNBr, o tripsina, y los fragmentos resultantes de PR-3 se comprobaron para la afinidad por IL-32 mediante BIACORE y se compararon con la afinidad de la PR-3 intacta. A continuación se ensayaron adicionalmente los fragmentos con elevada afinidad para la inhibición de la actividad 35 biológica de IL-32.

La invención proporciona un procedimiento para identificar una molécula moduladora, comprendiendo el procedimiento identificar una molécula capaz de potenciar o inhibir la actividad biológica de la IL-32 potenciada 5 mediante PR-3, según se define en las reivindicaciones, en el que la actividad biológica se manifiesta mediante la secreción de una citocina tal como IL-8, TNF y MIP-4 por las células sensibles a IL-32, siendo dicha molécula el modulador. 10

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de cribado de un inhibidor de la actividad de interleucina 32 (IL-32), es decir, la inducción de al menos uno de MIP-2, TNF, e IL-8, basado en el potenciamiento de la secreción de la citocina mediada por 15 IL-32 mediante PR-3 en una célula sensible a IL-32, que comprende poner en contacto IL-32 y PR-3 con una célula sensible a IL-32 en presencia de un inhibidor candidato, determinar la concentración de una citocina en el medio de cultivo de dicha célula, comparar con la concentración de 20 dicha citocina en el medio de cultivo de dicha célula en ausencia de dicho inhibidor candidato, y seleccionar un inhibidor capaz de inhibir dicha secreción de citocina.

La invención proporciona un procedimiento para identificar una molécula moduladora, comprendiendo el 25 procedimiento identificar una molécula capaz de potenciar o inhibir la actividad de IL-32 o una molécula capaz de potenciar o inhibir la actividad o la producción de los fragmentos de 13 kDa (SEQ ID NO: 1) y 16 kDa (SEQ ID NO: 2) de IL-32, siendo dicha molécula el modulador. 30

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32) o una molécula capaz de potenciar o inhibir la actividad o la producción de uno de sus fragmentos, que comprende estimular una célula 35 sensible a IL-32 con un fragmento de IL-32, según se define en las reivindicaciones, en presencia de un modulador candidato, determinar la concentración de una citocina secretada al medio de cultivo de dicha célula, comparar con la concentración de dicha citocina secretada 5 al medio de cultivo de dicha célula en ausencia de dicho modulador candidato y seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar la secreción de dicha citocina a partir de dicha célula.

Según se usa en el presente documento, la expresión 10 "potenciamiento de la secreción de citocina mediada por IL-32 mediante PR-3" significa la capacidad de PR-3 de potenciar la secreción de citocina mediada por IL-32 en una célula sensible a IL-32, por ejemplo, según se evidenció por el potenciamiento de la secreción de IL-8 o 15 MIP-2 estimulado por la IL-32 incubada con PR-3 (según se ejemplifica en el Ejemplo 8).

Se dan a conocer también los moduladores de IL-32 encontrados mediante el procedimiento de la presente invención y su uso en la fabricación de un medicamento 20 para el tratamiento de una enfermedad que está producida o exacerbada por la producción o secreción no regulada de IL-32 o de uno de sus fragmentos procedente de células que lo expresan en un mamífero, incluyendo un ser humano.

En un aspecto adicional, la presente divulgación se 25 refiere al uso de un modulador de PR-3 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, que está producida o exacerbada por la producción y/o secreción no regulada de IL-32 o de uno de sus fragmentos procedente de células que lo expresan en un mamífero, 30 incluyendo un ser humano.

Nuestros resultados muestran que los inhibidores de la presente divulgación, tales como los inhibidores de PR-3, los inhibidores de la unión de PR-3 con IL-32, los inhibidores de la proteólisis de IL-32 mediante PR-3 35 (ejemplificados a continuación con PMSF) y los inhibidores de la actividad biológica de IL-32 identificados mediante los procedimientos de cribado de la presente invención pueden encontrar uso como inhibidores de la actividad de IL-32, por ejemplo, en enfermedades en las que la 5 producción endógena o la administración exógena de IL-32 es la causa de la enfermedad o exacerba la situación del paciente.

En un aspecto, se usó un inhibidor de la actividad de IL-32 identificado mediante el procedimiento de cribado 10 de la presente invención, en una enfermedad, que está producida o exacerbada por la producción y/o secreción aumentada de IL-32 tal como inflamación.

Los términos "inflamación", "enfermedades inflamatorias", "estado inflamatorio" o "proceso 15 inflamatorio" se entienden como estados fisiológicos o patológicos, que están acompañados por una respuesta inflamatoria. Dichos estados incluyen, pero no se limitan a, sepsis, lesión por reperfusión tras isquemia, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, esclerosis 20 múltiple, enfermedad cardiomiopática, colitis, meningitis infecciosa, encefalitis, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, granulomatosis de Wegener, ateroesclerosis, rechazo al trasplante de órgano/tejido (tales como piel, riñón, corazón, pulmón, hígado, médula 25 ósea, córnea, páncreas, intestino delgado), dermatitis, apoplejía, lesión cerebral traumática, psoriasis y lupus.

La presente divulgación proporciona procedimientos para tratar una enfermedad que está producida o exacerbada por la producción y/o secreción no regulada de IL-32, o de 30 uno de sus fragmentos en una célula que lo expresa, tal como las células T y las células endoteliales, en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero en necesidad una cantidad efectiva del inhibidor de PR-3. 35

Los términos "tratamiento" o "tratar" se pretende que incluyan la administración del compuesto de la divulgación a un sujeto para objetivos que pueden incluir la profilaxis, mejora, prevención o cura de la enfermedad producida o exacerbada por la actividad no regulada de IL-5 32. Dicho tratamiento no necesita necesariamente mejorar completamente la respuesta inflamatoria u otras respuestas relacionadas con el trastorno específico. Además, se puede usar dicho tratamiento como un único tratamiento o en conjunción con otros tratamientos tradicionales para 10 reducir los efectos perjudiciales de la enfermedad, trastorno o estado según conocen las personas expertas en la técnica.

Se pueden proporcionar los procedimientos como tratamiento "preventivo" antes de la detección de, por 15 ejemplo, un estado inflamatorio, con el fin de evitar el desarrollo del trastorno en pacientes con un elevado riesgo para el mismo, tales como, por ejemplo, pacientes trasplantados.

El término "cáncer" se refiere a diversos estados 20 asociados a cáncer que incluyen metástasis, crecimiento tumoral, y angiogénesis.

Según la presente divulgación, se proporcionan inhibidores de PR-3 tales como un inhibidor de PR-3 seleccionado de isocumarina, dicloroisocumarina, suramina, 25 naftilurea hexasulfonada, agentes peptidomiméticos basados en una estructura de 1,1-dióxido 1,2,5-tiadiazolidin-3-ona y sus derivados de sulfona, inhibidor de la proteinasa, elafina, antileucoproteasa de eglina C, MNEI (inhibidor de la monocito/neutrófilo elastasa), la serpina LEX032 30 diseñada mediante bioingeniería, y un anticuerpo neutralizante dirigido contra PR-3, como inhibidores de la activación y la liberación de IL-32.

La divulgación incluye también el uso de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra PR-3 así como dirigidos 35 contra sus muteínas, proteínas de fusión, sales, derivados funcionales y fracciones activas. El término "anticuerpo" se entiende que incluye anticuerpos policlonales anticuerpos monoclonales (Mab), anticuerpos quiméricos, anticuerpos dirigidos contra idiotipo (anti-Id) hasta 5 anticuerpos que se pueden marcar en forma soluble o unida, y anticuerpos humanizados así como sus fragmentos proporcionados mediante cualquier técnica conocida, tal como, pero sin limitarse a escisión enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes. 10

Según se ha mencionado, las citocinas sirven normalmente para potenciar las defensas. Aunque si IL-32 actúa en exceso puede producir una función excesiva de TNF, IL-32 o sus fragmentos activos a concentraciones permisivas pueden servir para potenciar las defensas del 15 huésped.

En un aspecto, la invención se refiere a un fragmento de polipéptido de IL-32 de aproximadamente 16 kDa (SEQ ID NO: 2) y a un fragmento de polipéptido de IL-32 de aproximadamente 13 kDa (SEQ ID NO: 1), ambos activos 20 y obtenidos mediante la actividad proteolítica de PR-3.

La invención se refiere también al polipéptido de 16 kDa de IL-32 (SEQ ID NO: 2) o a una muteína, una proteína de fusión o su fracción activa, según se define en las reivindicaciones. 25

La invención se refiere también al polipéptido de 13 kDa de IL-32 (SEQ ID NO:1) o a una muteína, una proteína de fusión o su fracción activa, según se define en las reivindicaciones.

Según se usa en el presente documento, el término 30 "muteínas" se refiere a análogos de una proteína, en los que uno o más residuos de aminoácidos de los componentes de la proteína que se producen naturalmente se sustituyen por diferentes residuos de aminoácidos, o se eliminan, o se añaden uno o más residuos de aminoácidos a la secuencia 35 original de la proteína, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes con respecto a la proteína original. Estas muteínas se preparan mediante técnicas de síntesis conocidas y/o mutagénesis dirigida, o cualquier otra técnica conocida y por tanto adecuada. 5

Las muteínas según la presente invención incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, que hibrida al ADN o al ARN que codifica la proteína, según la presente invención, en condiciones rigurosas. El término "condiciones rigurosas" se refiere a 10 las condiciones de hibridación y posterior lavado, a las que las personas normalmente expertas en la técnica se refieren tradicionalmente como "rigurosas". Véanse Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, más arriba, Interscience, N.Y. §§6.3 y 6.4 (1987, 1992), y 15 Sambrook y col. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Sin limitación, los ejemplos de condiciones 20 rigurosas incluyen condiciones de lavado a 12º-20º C por debajo de la Tm calculada del híbrido en estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y SDS al 0,5 % durante 5 minutos, 2 x SSC y SDS al 0,1 % durante 15 minutos; 0,1 x SSC y SDS al 0,5 % a 37º C durante 30-60 minutos y a continuación, 0,1 x 25 SSC y SDS al 0,5 % a 68º C durante 30-60 minutos. Las personas normalmente expertas en esta técnica comprenderán que las condiciones rigurosas dependen también de la longitud de las secuencias de ADN, las sondas de oligonucleótidos (tales como 10-40 bases) o las sondas de 30 oligonucleótidos mixtas. Si se usan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametil amonio (TMAC) en vez de SSC. Véase Ausubel, más arriba.

Cualquiera de dichas muteínas, según se define en las reivindicaciones, tiene preferiblemente una secuencia 35 de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de los polipéptidos de la invención, tal como tener actividad sustancialmente similar, o incluso mejor, a la de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, una actividad característica de IL-32 es su capacidad para inducir la 5 secreción de TNF en células sensibles. Se describe en la técnica un ensayo tipo ELISA para medir la unión de TNF. Siempre que la muteína tiene una actividad sustancial del polipéptido de la invención, se puede considerar que tiene actividad sustancialmente similar a la del polipéptido de 10 la invención. De esta manera, se puede determinar si cualquier muteína dada tiene al menos sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de la invención por medio de experimentación rutinaria, que comprende someter a dicha muteína, por ejemplo, a ensayos sencillos para 15 determinar si esta induce o no la secreción de una citocina tal como TNF, IL-8 o MIP-2 en células sensibles a IL-32.

Cualquiera de dichas muteínas tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del 20 polipéptido de la invención, más preferiblemente, al menos un 90 % de identidad u homología con la anterior.

La identidad refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada comparando las secuencias. En 25 general, la identidad se refiere a una correspondencia nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido exacta de las dos secuencias de polinucleótidos o las dos secuencias de polipéptidos, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias que se están comparando. 30

Para las secuencias en las que no existe una correspondencia exacta, se puede determinar un "porcentaje de identidad". En general, las dos secuencias que se van a comparar se alinean para proporcionar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar 35 "huecos" tanto en una como en ambas secuencias, para aumentar el grado de alineamiento. Se puede determinar un porcentaje de identidad sobre la longitud completa de cada una de las secuencias que se están comparando (denominado de esta manera alineamiento global), lo que es 5 particularmente adecuado para las secuencias de longitud igual o muy similar, o sobre longitudes definidas más cortas (denominado de esta manera alineamiento local), que es más adecuado para las secuencias de desigual longitud.

Se conocen bien en la técnica los procedimientos 10 para comparar la identidad y la homología de dos o más secuencias. De esta manera, se pueden usar, por ejemplo, los programas disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package versión 9.1 (Devereux J y col., 1984, Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11; 12(1 Pt 1): 387-95), por 15 ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias de polipéptidos. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (J Theor Biol. 21 de julio de 1981; 91(2): 379-80 20 y J Mol Biol. 25 de marzo de 1981; 147(1): 195-7. 1981) y encuentra la mejor región única de similitud entre dos secuencias. También se conocen en la técnica otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias, por ejemplo, la familia BLAST de 25 programas (Altschul S F y col, 1990 J Mol Biol. 5 de octubre de 1990; 215(3): 403-10, Proc Natl Acad Sci USA. Julio de 1990, 87(14): 5509-13, Altschul S F y col, Nucleic Acids Res. 1 de septiembre de 1997; 25(17): 3389-402, accesible a través de la página de inicio del NCBI en 30
www.ncbi.nlm.nih.gov ) y FASTA (Pearson W R, Methods Enzymol. 1990; 183: 63-98. Pearson J Mol Biol. 13 de febrero de 1998; 276(1): 71-84).

Las muteínas del polipéptido de la invención, que se pueden usar según la presente invención, o, por tanto, el 35 ácido nucleico que las codifica, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de sustitución que una persona normalmente experta en la técnica puede obtener de manera rutinaria, sin experimentación excesiva, basándose en las 5 enseñanzas y directrices presentadas en el presente documento.

Los cambios preferidos para las muteínas según la presente invención son los que se conocen como sustituciones "conservativas". Las sustituciones 10 conservativas de aminoácidos del polipéptido de la invención pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente similares de tal manera que la sustitución entre miembros del grupo preservará la función biológica 15 de la molécula (Grantham Science. 6 de septiembre de 1974; 185(4154): 862-4). Está claro que se pueden realizar también inserciones y deleciones de aminoácidos en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o deleciones implican 20 únicamente unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y preferiblemente, menos de diez, y no eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para la conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por dichas deleciones 25 y/o inserciones están comprendidas dentro del ámbito de la presente invención.

Preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en la Tabla 1. Más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos 30 en la Tabla 2; y lo más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en la Tabla 3.

TABLA 1

Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos 35

Aminoácido: Grupo de sinónimos

Ser: Ser, Thr, Gly, Asn

Arg: Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu: Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro: Gly, Ala, Thr, Pro

Thr: Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala: Gly, Thr, Pro, Ala

Val: Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly: Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile: Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe: Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr: Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys: Ser, Thr, Cys

His: Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln: Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn: Gln, Asp, Ser, Asn

Lys: Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp: Glu, Asn, Asp

Glu: Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met: Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp
Trp

TABLA 2

Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos

Aminoácido: Grupo de sinónimos

Ser
Ser

Arg: His, Lys, Arg

Leu: Leu, Ile, Phe, Met

Pro: Ala, Pro

Thr
Thr

Ala: Pro, Ala

Val: Val, Met, Ile

Gly
Gly

Ile: Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe: Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr: Phe, Tyr

Cys: Cys, Ser

His: His, Gln, Arg

Gln: Glu, Gln, His

Asn: Asp, Asn

Lys: Lys, Arg

Asp: Asp, Asn

Glu: Glu, Gln

Met: Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp
Trp

TABLA 3

Grupos lo más preferidos de aminoácidos sinónimos

Aminoácido: Grupo de sinónimos

Ser
Ser

Arg
Arg

Leu: Leu, Ile, Met

Pro
Pro

Thr
Thr

Ala
Ala

Val
Val

Gly
Gly

Ile: Ile, Met, Leu

Phe
Phe

Tyr
Tyr

Cys: Cys, Ser

His
His

Gln
Gln

Asn
Asn

Lys
Lys

Asp
Asp

Glu
Glu

Met: Met, Ile, Leu

Trp: Met

Los ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que se pueden usar para obtener muteínas del polipéptido de la invención, para uso en la 5 presente invención incluyen cualquier etapa de procedimiento conocida, tales como las presentadas en las patentes de los Estados Unidos 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, de Mark y col; 5.116.943 de Koths y col., 4.965.195 de Namen y col; 4.879.111 de Chong y col; y 10 5.017.691 de Lee y col; y las proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de los Estados Unidos Nº 4.904.584 (Shaw y col.).

Una "fracción activa" según la presente invención es un fragmento de los fragmentos de 13 kDa o 16 kDa. El 15 término fragmento se refiere a cualquier subconjunto de la molécula, esto es, un péptido más corto que retiene la actividad biológica deseada, induciendo, por ejemplo, la secreción de TNF o MIP-2 o IL-8 por las células sensibles a IL-32. Se pueden preparar fácilmente fragmentos eliminando aminoácidos de cualquier extremo del polipéptido de la invención y ensayando el fragmento 5 resultante para sus propiedades biológicas. Se conocen las proteasas para eliminar un aminoácido uno por uno o bien del N-terminal o bien del C-terminal de un polipéptido, y de esta manera, la determinación de los fragmentos que retienen la actividad biológica deseada, implica 10 únicamente la experimentación rutinaria.

Como fracciones activas del polipéptido de la invención, las muteínas y sus proteínas de fusión, la presente invención cubre además cualquier fragmento de la cadena del polipéptido de la molécula de proteína solo o 15 junto con las moléculas o restos asociados unidos a la anterior, por ejemplo, restos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula de proteína o los propios restos de azúcar, siempre que dicha fracción tenga una actividad sustancialmente similar al polipéptido de la invención. 20

En una realización más adicional, la sustancia según la invención comprende una fusión de inmunoglobulina, es decir, las moléculas según la invención se fusionan con toda o con una porción de una inmunoglobulina. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para preparar 25 proteínas de fusión con inmunoglobulina, tales como, por ejemplo, las descritas en el documento WO 01/03737. La persona experta en la técnica comprenderá que la proteína de fusión resultante de la invención retiene la actividad biológica del polipéptido de la invención. La proteína de 30 fusión resultante tiene, idealmente, propiedades mejoradas, tales como un tiempo de residencia alargado en fluidos corporales (vida media), actividad específica aumentada, nivel de expresión aumentado, o purificación facilitada de la proteína de fusión. 35

Preferiblemente, la sustancia según la invención se fusiona con la región constante de una molécula de Ig. Se puede fusionarcon regiones de la cadena pesada, como, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 de la IgG1 humana. Son también adecuadas otras isoformas de las moléculas de Ig 5 para la generación de las proteínas de fusión según la presente invención, tales como las isoformas IgG2 o IgG4, u otros tipos de Ig, del tipo, como por ejemplo, IgM o IgA. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, hetero u homomultiméricas. 10

El término "sales" en el presente documento se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a las sales de adición de ácido de los grupos amino del polipéptido de la invención o sus análogos. Se pueden formar sales de un grupo carboxilo por medios conocidos en la técnica e 15 incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de cinc, y similares, y las sales con bases orgánicas son las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de adición de 20 ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales debe retener la actividad 25 biológica del polipéptido de la invención, tal como la capacidad para inducir TNF, IL-8 o MIP-2 en células sensibles a IL-32.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el fragmento de polipéptido de 30 IL-32 de aproximadamente 16 kDa o de aproximadamente 13 kDa, según se define en las reivindicaciones, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La divulgación proporciona también una composición farmacéutica que comprende el fragmento de polipéptido de 35 IL-32 de aproximadamente 16 kDa o de aproximadamente 13 kDa y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el tratamiento de una enfermedad inducida por un patógeno.

La definición de "farmacéuticamente aceptable" se entiende que abarca cualquier vehículo, que no interfiera 5 con la eficacia de la actividad biológica del principio activo y que no sea tóxica para el huésped al cual se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, se puede formular la(s) proteína(s) activa(s) en forma de dosificación unitaria para la inyección en 10 vehículos tales como solución salina, disolución de dextrosa, albúmina sérica y solución de Ringer.

Se pueden administrar los principios activos de la composición farmacéutica según la invención a un individuo en una variedad de maneras. Las vías de administración 15 incluyen la vía intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, intracraneal, epidural, tópica, e intranasal. Se puede usar cualquier otra vía de administración terapéuticamente 20 eficaz, por ejemplo, la absorción a través de tejidos epiteliales o endoteliales o mediante terapia génica en la que se administra al paciente una molécula de ADN que codifica el agente activo (por ejemplo, mediante un vector), lo que produce que el agente activo se exprese y 25 secrete in vivo. Adicionalmente, se puede administrar la(s) proteína(s) según la invención junto con otros componentes de agentes biológicamente activos tales como tensioactivos, excipientes, vehículos, diluyentes y vehículos farmacéuticamente aceptables. 30

Para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), se puede formular la(s) proteína(s) activa(s) como una disolución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por 35 ejemplo, agua, solución salina, disolución de dextrosa) y aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes y tampones). Se esteriliza la formulación mediante técnicas comúnmente usadas. 5

Se puede mejorar también la biodisponibilidad de la(s) proteína(s) activa(s) según la invención usando procedimientos de conjugación que aumentan la vida media de la molécula en el cuerpo humano, por ejemplo, uniendo la molécula a polietilenglicol, según se describe en la 10 Solicitud de Patente PCT WO 92/13095.

La presente invención se refiere a un procedimiento para potenciar la inmunidad en un paciente que lo necesita, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad infecciosa y cáncer, que comprende la 15 administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho fragmento de IL-32.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es tal que cuando se administra, dicho fragmento de IL-32 da como resultado el potenciamiento de las defensas del huésped. 20 La dosificación administrada, como dosis única o múltiple, a un individuo, puede variar dependiendo de una variedad de factores, que incluyen la vía de administración, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, estado de salud, tamaño), la extensión de 25 los síntomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos de dosificación establecidos están perfectamente comprendidos dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica, así 30 como los procedimientos in vitro e in vivo para determinar la actividad de dichos fragmentos de IL-32.

Aunque esta invención se ha descrito en conexión con sus realizaciones específicas, deberá entenderse que es susceptible de modificaciones adicionales. Se pretende que 35 esta solicitud cubra cualquier variación, uso o adaptación de la siguiente invención, en general, los principios de la invención, que incluyen dichas novedades de la presente divulgación según están comprendidas en la práctica conocida o habitual en la técnica a la que la invención 5 pertenece y según se pueden aplicar a las características esenciales expuestas anteriormente en el presente documento como se indica en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Se describirá ahora la presente invención con más 10 detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y en los dibujos que los acompañan.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. AISLAMIENTO DE UNA PROTEÍNA DE UNIÓN A IL-32 PROCEDENTE DE PROTEÍNAS URINARIAS HUMANAS 15

Se preparó una columna de afinidad de IL-32 recombinante humana (hrIL-32) con el fin de aislar las proteínas de unión a IL-32 a partir de orina humana.

Se acopló una IL-32α recombinante humana (3 mg) producida en E. coli a Affigel-15 (1 ml, BioRad, Richmond 20 CA), según las instrucciones del fabricante y se empaquetó en una columna. Un concentrado 1000 veces de proteínas urinarias brutas humanas (500 ml) se cargó en la columna a un caudal de 0,25 ml/min. Se lavó la columna con 250 ml de una disolución que contenía NaCl 0,5 M, en disolución 25 salina tamponada con fosfato (PBS). Se eluyeron las proteínas unidas a la columna con una disolución que contenía ácido cítrico 25 mM, pH 2,2 y benzamidina (1 mM) y se recogieron fracciones de 1 ml y se neutralizaron inmediatamente con Na2CO3 1 M (0-70 microlitros. Para la 30 elución 3, se usaron 70 microlitros de disolución neutralizante). Se resolvieron alícuotas de las fracciones eluídas procedentes de la columna (y de la fracción de lavado) mediante SDS-PAGE (10 %) en condiciones no reductoras y se visualizaron las bandas de proteínas 35 mediante tinción de plata. Se detectó una amplia banda correspondiente a la proteína específica de unión a IL-32 de 28-32 kDa principalmente en la fracción 3 eluída (la flecha en la fig. 1). No se observó esta banda en la fracción de lavado, que representa las proteínas urinarias 5 brutas.

Los resultados muestran que se obtuvo una fracción de proteínas urinarias enriquecida con una proteína de unión a IL-32 de 28-32 kDa mediante cromatografía de afinidad con una columna de hrIL-32. 10

EJEMPLO 2. IDENTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE UNIÓN A IL-32 COMO PROTEINASA 3.

Se llevó a cabo el siguiente experimento con el fin de identificar la proteína urinaria de unión a IL-32 enriquecida mediante cromatografía de afinidad con la 15 columna de hrIL-32 (Ejemplo 1).

La banda procedente de la SDS-PAGE del Ejemplo 1, correspondiente a 28-32 kDa se escindió a partir del gel y se electroeluyeron las proteínas y se digirieron con tripsina. La digestión tríptica resultante se sometió a 20 cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM). Se determinó inequívocamente la secuencia de tres péptidos trípticos siendo: LFPDFFTR, VALYVDWIR y LVNVVLGAHNVR. El alineamiento de la secuencia de los tres péptidos trípticos y las secuencias de péptidos trípticos 25 en la base de datos de proteínas del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en el National Institute of Health, Bethesda MD, desveló que la proteína de unión a IL-32 aislada mediante cromatografía de afinidad es la Proteinasa-3 humana (PR-3, SwissProt, con Nº de Acceso 30 P24158). Se identificó también una proteína adicional correspondiente a la cadena de inmunoglobulina humana en la misma banda de proteína, pero parece ser un componente no específico.

Se confirmó adicionalmente que esta proteína de 35 unión a IL-32 era PR-3 mediante el análisis de la microsecuencia de la proteína N-terminal. Se escindió la banda de proteína de 28-32 kDa de la SDS-PAGE de la fracción de elución 3 (Ejemplo 1 y fig. 1) a partir del gel, se electroeluyó sobre una membrana de PVDF según las 5 instrucciones del fabricante, y se sometió a la microsecuenciación de la proteína en un equipo Model Applied Biosystems. La secuencia N-terminal resultante de la proteína de 28-32 kDa electroeluída era idéntica a la de la PR-3 comercialmente disponible (Athens Research and 10 Technology), IVGG. Esta secuencia está presente en las posiciones 28-31 de pro-PR-3.

Los resultados muestran que la proteína urinaria de unión a IL-32 de 28-32 kDa, que se aisló mediante purificación por afinidad, es PR-3. 15

EJEMPLO 3. AFINIDAD DE UNIÓN DE PR-3 A IL-32.

Se midió la afinidad de unión de PR-3 (de orina o comercialmente disponible) a IL-32 mediante resonancia de plasmón superficial (BIAcore).

Se inmovilizó IL-32 (20 µg/ml) en tampón acetato pH 20 4,6) en un único canal de un chip BIAcore según las recomendaciones del fabricante (Amersham Pharmacia, Uppsala Suecia). Se llevaron alícuotas de la fracción de elución 3 procedentes de la columna de afinidad de IL-32, que contenía la PR-3 urinaria, hasta una concentración de 25 10, 20, 30, 40 y 80 nM y se analizaron mediante el sistema BIAcore. Los datos de unión proporcionaron una kD de 2,65 x 10-8 M. (fig. 2A). Se llevó a cabo el mismo análisis con PR-3 que se inactivó mediante PMSF (1 mM) (fig. 2B). La kD resultante era de 7,9 x 10-8 M. Se llevó a cabo el mismo 30 análisis con una PR-3 derivada de neutrófilo humano comercialmente disponible (Athens Research and Technology, Athens GA, 0,5 µg en 20 µl de disolución de gelatina) (fig. 3A). La kD resultante era de 1,2 x 10-8 M. Se repitió la unión con PR-3 comercial que se inactivó 35 mediante PSMF (fig. 3B). La kD resultante era de 3,5 x 10-8 M.

El chip no se podía reutilizar indicando que PR-3 está escindiendo IL-32 del chip.

Los resultados obtenidos muestran que la unión de 5 IL-32 a PR-3 no es dependiente de la actividad enzimática de la última, debido a que la PR-3 preincubada con PMSF se une todavía a la IL-32 con elevada afinidad.

EJEMPLO 4. MARCADO RADIOACTIVO DE IL-32

El ejemplo anterior muestra que IL-32 es un sustrato 10 de PR-3. Con el fin de explorar la actividad catalítica de PR-3 sobre la degradación de IL-32, se preparó IL-32 marcada radioactivamente como sigue.

Se yodó IL-32 (15 µg en 60 µl de tampón fosfato pH 7,4) usando la modificación del procedimiento de la 15 Cloramina T. De manera breve, se incubó una mezcla de cloramina T (50 µl, 1 mg/ml en H2O) y [125I]-NaI (10 µl) 1 mCi durante 20 s a 4º C y se añadió a la preparación de IL-32 durante 20 s más a 4º C. Se detuvo la reacción mediante la adición de metabisulfito sódico (50 µl de un 20 stock de 5 mg/ml) y yoduro de potasio (50 µl de un stock de 5 mg/ml). Se separó la IL-32 marcada radioactivamente del yodo libre en una columna Sephadex G25 (Pharmacia), que se equilibró en primer lugar con gelatina al 0,25 % en PBS que contenía azida de sodio al 0,025 % (es decir, 25 disolución de gelatina). Se recogieron seis fracciones de 1 ml usando la disolución de gelatina. Las fracciones 3 y 4 contenían el pico de la 125I-IL-32 marcada (actividad específica ~2 x 105 cpm/ng).

EJEMPLO 5. CINÉTICA DE DEGRADACIÓN DE 125I-IL-32 POR LA PR-30 3 URINARIA

Se llevó a cabo el siguiente experimento con el fin de explorar la cinética de degradación de IL-32 por PR-3.

Se añadió PR-3 urinaria purificada por afinidad (fracción de elución 3 del Ejemplo 1, fig. 1, 50 µl) a 35 125I-IL-32 (250.000 cpm en 10 µl de disolución de gelatina) y se incubó a 37º C durante 0, 1, 5, 15, 30, y 60 min (fig. 4). Se detuvo la degradación mediante la adición de un tampón de muestra de SDS-PAGE y mediante ebullición durante 10 min. Las muestras que contenían 125I-IL-32 y PR-5 3 incubadas a diferentes periodos de tiempo (0-60 min.) se resolvieron en SDS-PAGE al 12 % en condiciones de reducción. Se secó el gel y se autoradiografió. Los resultados resumidos en la fig. 4 muestran la reducción en la banda de 20 kDa que representa la IL-32 intacta (fig. 10 4, carril 1) y el incremento en los niveles de los productos de escisión de 16 y 13 kDa de IL-32 después de 1 minuto de incubación con PR-3 (fig. 4, carril 2). Se encontró que la banda de 20 kDa desapareció completamente y que los niveles de los productos de escisión de 16 y 13 15 kDa de IL-32 aumentaron después de 5 min. de incubación con PR-3 (carril 3) y que los elevados niveles de los fragmentos de 16 y 13 kDa de IL-32 permanecieron estables durante hasta 60 min (fig. 4, carriles 3, 4, 6, y 7).

Encontramos que la incubación de IL-32 con PR-3 20 durante la noche a 4º C dio como resultado una digestión completa y no se observó un producto superior al de un marcador de 10 kDa (el límite del gel) (no se muestran los datos).

EJEMPLO 6. CINÉTICA DE ESCISIÓN DE 125I-IL-32 POR LA PR-3 25 URINARIA Y COMERCIAL

Se llevó a cabo el experimento presentado en la fig. 5 esencialmente según se ha descrito en el ejemplo 5, excepto en que se limitó hasta cinco minutos la incubación de IL-32 tanto con la PR-3 urinaria como con la comercial. 30

Se incubaron la PR-3 urinaria o la PR-3 comercial (Athens Research and Technology) con 125I-IL-32 durante 0, 1 y 5 min. Se detuvo la digestión mediante la adición de tampón de muestra de SDS-PAGE y mediante ebullición durante 10 min. Se resolvieron las muestras en SDS-PAGE en 35 condiciones de reducción. Se secó el gel y se autoradiografió. Los resultados resumidos en la Fig. 5 muestran que la PR-3 comercial es más potente que la PR-3 urinaria, conduciendo a la completa desaparición de la banda de 20 kDa de IL-32 en 1 min (comparar el carril 6 5 con el carril 2). Esta diferencia es probablemente debida a una actividad específica diferente de la PR3 urinaria vs. la comercial.

EJEMPLO 7. INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE PR-3 POR EL FLUORURO DE FENILMETILSULFONILO (PMSF) – UN 10 INHIBIDOR GENERAL DE LA SERINA PROTEASA.

Se llevó a cabo el siguiente experimento para probar que la degradación de la siguiente incubación con PR-3 es debida a la actividad proteolítica de PR-3.

Se llevó a cabo el experimento presentado en la fig. 15 6 según se ha descrito en los ejemplo 5 y 6, excepto que se preincubó PR-3 con PMSF (concentración final de 1 mM, 10 min a 37º C) antes de la incubación con 125I-IL-32. PMSF suprimió completamente la capacidad de la PR-3 urinaria y la comercial de procesar IL-32. En contraste con la PR-3 20 activa (carril 1, 2 y 9, 10 para la PR-3 urinaria y comercial, respectivamente), no se observaron productos de escisión con la PR-3 pretratada con PMSF incubada con IL-32 (fig. 6, carriles 3, 4, 7, 8).

EJEMPLO 8. EL EFECTO DE PR-3 EN LA ACTIVIDAD DE IL-32. 25

Los resultados obtenidos en los ejemplos anteriores muestran que PR-3 se une con elevada afinidad a IL-32 y escinde IL-32 en minutos. Se llevaron a cabo los siguientes experimentos para explorar el efecto de PR-3 sobre la actividad biológica de IL-32. 30

La línea celular Raw 264.7 de macrófago de ratón (American Type Culture Collection, ATCC) se mantuvo en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10 %. Se llevaron a cabo los bioensayos en placas de 96 pocillos. De manera breve, se sembraron las células Raw (5 x 105/ml, 0,1 35 ml/por pocillo) y se cultivaron hasta que las células se adhirieron a la placa. Se retiró el medio y a continuación se estimularon las células con medio fresco (sin FCS) que contenía diferente concentración de IL-32 o de IL-32 pretratada con PR-3 durante 5 min a temperatura ambiente 5 en presencia de 5 µg/ml del bloqueante de LPS polimixina B (Bedford Laboratories, Bedford, OH). Se incubaron las placas a 37º C con CO2 al 5 % durante 16-20 h y a continuación se recogieron los sobrenadantes del cultivo para medir la MIP-2 liberada por el cultivo celular. En la 10 fig. 7 se resumen los resultados y muestran que la IL-32 pretratada con PR-3 potencia la producción de MIP-2 en células Raw 264.7 en comparación con la IL-32 no pretratada.

Se mostró un potenciamiento similar de la actividad 15 de IL-32 mediante pretratamiento con PR-3 en un experimento llevado a cabo con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Se prepararon PBMC según se ha descrito anteriormente [Kim, 2005 #36] y se sembraron a una concentración de 5 x 105 células por 20 pocillo en placas de 96 pocillos. El marco experimental de la estimulación con IL-32 e IL-32 pretratada con PR-3 era idéntico al descrito anteriormente para las células Raw de ratón. Tras la estimulación de las células PBMC humanas o bien con IL-32 o bien con IL-32 pretratada con PR-3, se 25 recogieron los sobrenadantes del cultivo para medir la IL-8 humana liberada por las células. En la fig. 8 se resumen los resultados y muestran que la estimulación de IL-32 pretratada con PR-3 potencia la producción de IL-8 en células PBMC humanas en comparación con la IL-32 no 30 pretratada.

EJEMPLO 9. PREPARACIÓN Y ACTIVIDAD DE UN FRAGMENTO DE PR-3

Se redujo PR3 (Sigma) y se alquiló antes de la escisión mediante CNBr. Reducción y alquilación: Se añadió DTT (18 µl, 50 mM) a una muestra de PR3 (90 µg, 1 mg/ml) y 35 se incubó durante 1 hora a 56º C. Se añadió yodoacetamida (60 µl, 100 mM) y se incubó la mezcla durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detuvo la reacción mediante DTT (33,6 µl, 50 mM). Se secó la muestra y se reconstituyó en 70 µl de ácido fórmico. Se añadió 5 Bromuro de Cianógeno sólido (CNBr) durante 48 h a temperatura ambiente y en la oscuridad. Se llevó a cabo la desalación del CNBr con C18 Zip-tip según las instrucciones del fabricante. Se sometió la mezcla de péptidos a espectrometría de masas (Maldi), que mostró la 10 formación de dos péptidos.

Se redujo otra muestra de PR3, se alquiló y se escindió mediante CNBr. Los péptidos resultantes se separaron mediante RP-HPLC (columna de HPLC BIO Wide Pore C8 de Sigma Discovery, tamaño de partícula 5 µm, 5 cm X 4 15 mm). Debido a que la PR-3 madura tiene tres metioninas, se esperaba que se formaran hasta cuatro péptidos mediante la escisión por CNBr: el péptido de 1678 kDa N-terminal, un péptido de 549 kDa y uno de 11712 kDa, y un péptido de 11187 kDa C-terminal. 20

Se determinó la afinidad de cada péptido por IL-32 mediante BIACORE en comparación con la afinidad de la PR-3 intacta enzimáticamente activa por IL-32 y con la afinidad de la PR-3 intacta enzimáticamente no activa por IL-32.

A continuación se ensayaron los péptidos para la 25 inhibición de la actividad biológica de IL-32.

REFERENCIAS

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Claims

25 REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en la unión de IL-32 a la proteinasa 3 (PR-3), que comprende 5

determinar la unión de IL-32 a PR-3 en presencia de un modulador candidato,

comparar el nivel de dicha unión con el nivel de unión de IL-32 a PR-3 en ausencia de dicho modulador candidato, y

seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar 10 dicha unión,

en el que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

15
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha unión de IL-32 a PR-3 se mide mediante resonancia de plasmón superficial.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 y 2, en 20 el que dicho modulador inhibe la unión de IL-32 a PR-3.
4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el modulador es un inhibidor de la actividad de IL-32.

25
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el modulador es un inhibidor de la actividad inflamatoria de IL-32.
6. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en 30 el que dicho modulador potencia la unión de IL-32 a PR-3.
7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el modulador es un potenciador de la actividad de IL-32. 35
8. Un procedimiento de cribado de un inhibidor de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en la actividad proteolítica de la proteinasa 3 (PR-3) sobre IL-32, que comprende 5

determinar la proteólisis de IL-32 por PR-3 en presencia de un inhibidor candidato y

seleccionar un inhibidor capaz de inhibir la aparición de un fragmento de IL-32 generado por la actividad proteolítica de PR-3 o la desaparición de la IL-32 10 intacta, en el que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.
9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el 15 que dicho inhibidor inhibe la actividad inflamatoria de IL-32.
10. El procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho fragmento de IL-32 es de aproximadamente 16 20 kDa.
11. El procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho fragmento de IL-32 es de aproximadamente 13 kDa. 25
12. Un procedimiento de cribado de un inhibidor de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en el potenciamiento de la secreción de citocina mediada por IL-32 por la proteinasa 3 (PR-3) en una célula sensible a IL-30 32, que comprende

poner en contacto IL-32 y PR-3 con una célula sensible a IL-32 en presencia de un inhibidor candidato,

determinar la concentración de una citocina en el medio de cultivo de dicha célula, 35

comparar con la concentración de dicha citocina en el medio de cultivo de dicha célula en ausencia de dicho inhibidor candidato, y

seleccionar un inhibidor capaz de inhibir dicha secreción de citocina, en el que la actividad de IL-32 es al menos 5 una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8 y en el que la citocina se selecciona del grupo que consiste en TNF, IL-8 y MIP-2.
13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el 10 que dicho inhibidor inhibe la actividad inflamatoria de IL-32.
14. El procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, en el que la célula sensible a IL-32 es una célula T o una 15 célula macrófaga.
15. Un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32) o de la actividad de uno de sus fragmentos, que comprende 20

estimular una célula sensible a IL-32 con un fragmento de IL-32 generado por la actividad proteolítica de PR-3 en presencia de un modulador candidato,

determinar la concentración de una citocina secretada al medio de cultivo de dicha célula, 25

comparar con la concentración de dicha citocina secretada al medio de cultivo de dicha célula en ausencia de dicho modulador candidato y

seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar la secreción de dicha citocina a partir de dicha 30 célula,

en el que el fragmento de IL-32 generado por la actividad proteolítica de PR-3 es un fragmento de aproximadamente 16 kDa o de aproximadamente 13 kDa, y

en el que la actividad de IL-32 o del fragmento de 35 IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8 y en el que la citocina se selecciona del grupo que consiste en TNF, IL-8 y MIP-2.

5
16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la célula sensible a IL-32 es una célula T o una célula macrófaga.
17. El procedimiento de cribado según una cualquiera de 10 las reivindicaciones 15 a 16, en el que el modulador es un inhibidor de la actividad inflamatoria de IL-32.
18. Un fragmento de polipéptido de IL-32 obtenido mediante la proteólisis de IL-32 por la proteinasa 3 (PR-15 3).
19. Un fragmento de polipéptido según la reivindicación 18, en el que el fragmento de IL-32 es el fragmento de aproximadamente 16 kDa obtenido mediante la proteólisis de 20 IL-32 por la proteinasa 3 (PR-3) o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO:2 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión o 25

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32,

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8. 30
20. Un fragmento de polipéptido según la reivindicación 18, en el que el fragmento de IL-32 es el fragmento de aproximadamente 13 kDa obtenido mediante la proteólisis de IL-32 por la proteinasa 3 (PR-3) o, 35

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la 5 actividad biológica de IL-32

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

10
21. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento de polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15
22. El fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ ID NO: 1 o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que retiene la actividad biológica de IL-32, 20

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de 25 TNF, y la inducción de IL-8.
23. El fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ ID NO: 2 o

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de 30 identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32 35

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.
24. Una composición farmacéutica que comprende el 5 fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ ID NO: 1 o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que retiene la actividad biológica de IL-32, 10

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32,

y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada 15 de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.
25. Una composición farmacéutica que comprende el fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ 20 ID NO: 2 o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión, o 25

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32,

y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la 30 inducción de IL-8.