ES2352780B2

ES2352780B2 - Lipopolisacárido de ochrobactrum intermedium contra la sepsis.

Info

Publication number: ES2352780B2
Application number: ES200930265A
Authority: ES
Inventors: Juan Ignacio Ovejero Guisasola; Manuel Fresno Escudero
Original assignee: LABORATORIOS OVEJERO SA; Ovejero S A Lab
Current assignee: ZDROWIE DLA PRZYSZLOSCI SP. Z O.O.
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2011-09-15
Anticipated expiration: 2029-06-04
Also published as: ZA201200021B; CL2011003033A1; WO2010139352A1; CA2763266A1; AU2009347459A1; EA025766B1; BRPI0924393A2; US20120107352A1; EP2437754A1; ES2653202T3; NZ596599A; SG176660A1; MX2011012934A; CU20110223A7; EP2437754B1; JP5730862B2; JP2012528805A; IL216560A0; EA201190309A1; PL2437754T3

Abstract

Lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium contra la sepsis, referido al uso de dicho Lipopolisacárido (LPS) de Ochrobactrum intermedium cepa LMG3306 (IM) en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis, así como adyuvante para vacunas en animales inmunosuprimidos y contra la leishmaniosis.

Description

Lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium contra la sepsis.

La presente invención se refiere al uso de un Lipopolisacárido (LPS) de Ochrobactrum intermedium cepa LMG3306 (IM) en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis, así como adyuvante para vacunas en animales inmunosuprimidos y contra la leishmaniosis.

Estado de la técnica anterior

Aproximadamente, y solo en Estados Unidos, se presentan unos 900.000 casos de sepsis al año, causando unas 210.000 muertes, y con un coste de aproximadamente 17.000 millones de dólares. El choque séptico está considerado como una enfermedad común, con una creciente incidencia y con una mortalidad media del 27-48% de las personas que la padecen.

Los aspectos inflamatorios de la sepsis, después de más de 20 años de estudios clínicos empleando productos antiinflamatorios han mostrado una muy baja eficiencia.

Los mecanismos patológicos que llevan a la sepsis son muy complejos y están muy lejos aún de poder ser bien conocidos. La sepsis implica la respuesta del sistema inflamatorio seguido de una compensación del sistema antiinflamatorio. El balance entre ambas respuestas es vital para la supervivencia del hospedador. Además, el modelo animal de sepsis clínica no se asemeja de manera sencilla la naturaleza compleja de la sepsis en pacientes humanos.

Recientemente, se ha intentado tratar dichos efectos mediante antagonistas de los "toll-like-receptors" (TLR) ya que se cree que la mayoría de las consecuencias que se desencadenan la respuesta fatal a la sepsis son debidas a la circulación de las endotoxinas (LPS) tras el reconocimiento de éstas por los TLR.

Así, el Eritoran, un análogo estructural del Lípido A, (la parte lipídica del Lipopolisacárido) que actúa a nivel del TLR4 como antagonista se encuentra en fase II clínica de estudio, y muestra una reducción de la mortalidad in varios pacientes con sepsis severa. Además, el compuesto TAK-242 que es un inhibidor de la señal producida por el TLR-4, reduce la señal pro inflamatoria (reduciendo los niveles de citoquinas) y como resultado, y en un experimento controlado, redujo la mortalidad en el grupo de pacientes que presentaban un alto nivel de IL-6.

Al día de hoy, hay muchas enfermedades infecciosas para las que no existe vacuna eficaz disponible. En algunas de esas patologías, dicha ausencia es debida a la falta de un adyuvante que induzca una respuesta inmune correcta y apropiada. Para algunas infecciones, sobre todo las debidas a bacterias intracelulares, virus y la mayoría de los protozoos, la respuesta inmune protectora es debida a la inducción adecuada de una respuesta vía linfocitos T colaboradores tipo 1 (Th1), y se caracteriza por la inducción elevada de IFN-gamma.

Por el contrario, la respuesta protectiva frente a la mayoría de los helmintos debe ser de tipo 2 (Th2), caracterizada por la producción de IL-4 (Fresno, M., M. Kopf, and L. Rivas. 1997. Cytokines and infectious diseases. Immunol Today 18:56-58).

Existen pocos adyuvantes disponibles para la formulación de vacunas eficaces para humanos, debido a la toxicidad residual de la gran mayoría y a la exacerbada inducción de la respuesta Th1. El dióxido de Aluminio, que realmente no es un adyuvante, es la fórmula ampliamente empleada en la formulación de vacunas para uso humano.

Recientemente, agonistas de los TLR receptores empiezan a ser estudiados como potenciales adyuvantes (Hoffman, Nature Reviews Drug Discovery 4, 879, 2005) (Kwissa; Expert Vaccine Rev., 6, G73, 2007).

Por otro lado, uno de los principales problemas a la hora de formular la vacuna, es que raramente funcionan cuando se emplea en sujetos inmunodeprimidos. Incluso, algunos de los adyuvantes presentan efectos secundarios sobre este tipo de pacientes (Kwissa, et al Expert Vaccine Rev., 6, G73, 2007).

La cepa de Ochrobactrum intermedium LMG 3306 fue descrita por Velasco y col. en International Journal of Systematic Bacteriology, 48 (1998) 759-768.

En la solicitud de patente EP08017486.5 se describe un lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG3306 (IM), así como su actividad como inmunoestimulante, entre las que se puede indicar:

\bullet Induce la producción de IL-12 (interleukina) en macrófagos.

\bullet Los niveles inducidos de TNF (factor de necrosis tumoral) por el LPS de la invención son mucho menores que los que inducen los LPS de enterobacterias clásicas y debido a ello no presenta efectos patológicos.

\bullet Induce la activación de la respuesta linfocitaria T tipo 1 y la producción de gamma interferón (\gamma-IFN).

Explicación de la invención

Ahora, se ha podido demostrar que el lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 (IM) es efectivo en el tratamiento y/o prevención de sepsis, así como adyuvante para vacunas en animales inmunosuprimidos y contra la leishmaniosis.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, ésta se refiere al uso del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 (IM) en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis, así como adyuvante para vacunas en animales inmunosuprimidos y contra la leishmaniasis.

De acuerdo con una realización de la presente invención, ésta proporciona el uso del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 (IM) en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del choque séptico y del choque endotóxico.

Según otra realización de la presente invención, ésta proporciona el uso de lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 (IM) como adyuvante de vacunas para enfermedades infecciosas tanto en humanos como en animales.

De acuerdo con una realización particular de la presente invención, ésta proporciona el uso del IM en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones en animales, incluidos humanos, inmunosuprimidos.

De acuerdo con la presente invención, los usos descritos del lipopolisacárido del Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 son de aplicación tanto en humanos como en animales. Así, la referencia al uso en animales, a lo largo de la presente invención, también incluirá a humanos.

En una realización particular de la presente invención, ésta proporciona el uso del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 (IM) como adyuvante, estimulando la respuesta de la vacunación frente a leishmaniasis, presentando efectos protectivos y curativos en infecciones dérmicas experimentales por leishmaniasis, empleando el modelo experimental en ratón de infección por Leishmania en la planta del pie.

La mayoría de los trabajos relacionados con la prevención del shock endotóxico por bajas dosis subletales de los mismos LPS u otros menos tóxicos han mostrado que se necesita la inoculación previa de los mismos (Hatao, F., et al., The induction of super-resistance using synthetic lipopolysaccharide receptor agonist rescues fatal endotoxemia in rats without excessive immunosuppression. Shock 2005; 23(4):365-70.). Los inventores sorprendentemente han encontrado que el lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 no necesitaba de ese periodo previo de desensibilización y que simplemente la inoculación del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 conjuntamente con LPS protegía del efecto tóxico.

Asimismo, la mayoría de los datos publicados encuentran una relación entre ambos la supresión de TNF in vitro o en líneas celulares y los efectos desensibilizadores in vivo (ver por ejemplo Lehner, M. D., et al, Lipopolysaccharide and Highly Purified Lipoteichoic Acid Via Different Toll-Like Receptors Independent of Paracrine Mediators. 2.001. J. Immunol. 166: 5161-5167). Sin embargo, los inventores ahora han demostrado que el lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 aunque protege de la acción de LPS in vivo no disminuye la secreción de TNF o IL-12 en líneas macrofágicas ni tampoco en macrófagos peritoneales o en células de bazo. Los resultados preliminares in vivo tampoco parecen indicar que el lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 (IM) sea capaz de reducir drásticamente los niveles de TNF inducidos por LPS aunque lo hace en cierta medida. En cualquier caso no hay una relación directa entre los niveles de TNF y protección. Estos resultados son sorprendentes.

Otras hipótesis atribuyen el efecto desensibilizador a la producción elevada de IL-10 o TGF-\beta (Randow, F. et al., Mechanism of endotoxin desensitization: involvement of interleukin 10 and transforming growth factor beta. J. Exp. Med. 1995. 181, 1887-1892). Sin embargo, no parece ser ese el caso pues IL-10 apenas se induce, in vitro, por el IM, de hecho parece que éste inhibe algo la producción de IL-10 (aunque no es significativo) en macrófagos peritoneales o en células de bazo y los niveles de IL-10 inducidos por LPS apenas se ven aumentados por el IM excepto en células de bazo de ratones C57BL/6.

Otro aspecto muy interesante es la capacidad del IM de modular la respuesta inmune entre patógenos. Así utilizando un sistema de infección por Leishmania major, se ha podido comprobar que el IM potencia la acción inmunogénica de un extracto antigénico de Leishmania carente de ella de modo similar a CpG. CpG es un conocido inmunomodulador que a través de su unión con TLR9 potencia la respuesta Th1 (que son los protectivos frente a patógenos como Leishmania y muchos otros) y que ha sido patentado como inmunomodulador y adyuvante de vacunas. Sin embargo, el IM no altera el perfil in vivo de Th1/Th2 de modo tan exacerbado como lo hace CpG. Ello podría indicar que el IM sería mejor adyuvante que CpG en infecciones donde tanto la respuesta humoral (Th2) como la celular (Th1) tengan un papel importe en protección. Es quizá más importante el haber demostrado que no sólo induce una respuesta protectiva sino que el IM puede inducir protección de modo directo, es decir tiene un efecto terapéutico en la infección por Leishmania.

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A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos.

Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Prevención del efecto tóxico causado por el LPS de E. coli LPS mediante el empleo de IM.

Grupos de 5 ratones fueron tratados con LPS de E. coli (1,75 mg) o IM (lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium LMG3306) 0,6 \mug/Kg (dosis 60) o 3 \mug/Kg (dosis 300) solos o en combinación y evaluada la supervivencia.

Figura 2. Tratamiento del choque endotóxico debido a LPS shock. Grupos de 5 animales fueron tratados con LPS de E. coli (2 mg/animal); 24 horas más tarde fueron inoculados con IM (lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium) 0,6 \mug/Kg (dosis 60) o 3 \mug/Kg (dosis 300), y evaluada su supervivencia.

Figura 3: Prevención de la peritonitis por infección con E. coli. Grupos de 5 animales fueron infectados con E. coli (1E7 unidades formadoras de colonias, CFU); 24 horas más tarde fueron inoculados con IM (lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium) 0,6 \mug/Kg (dosis 60) o 6 \mug/Kg (dosis 600), y evaluada su supervivencia (panel de arriba) y los síntomas clínicos (panel de abajo).

Figura 4: Curación de la peritonitis causada por E. coli. Grupos de 5 animales fueron infectados con E. coli (1E8 unidades formadoras de colonias, CFU); 4 horas más tarde fueron inoculados con IM (lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium) 6 \mug/Kg (dosis 600), y evaluada su supervivencia (panel de arriba) y los síntomas clínicos (panel de abajo).

Figura 5: Inmunidad protectiva frente a Leishmaniosis, características generales del esquema inmunológico de la vía de actuación. Como se puede observar en la figura, la interacción de los parásitos con los macrófagos produce una respuesta inmunológica que, si está basada predominantemente por la activación linfocitaria Th1, la respuesta al parásito es eficaz y satisfactoria mientras que si la respuesta vía Th2 es la representativa la infestación va a ser manifiesta.

Figura 6: Protocolo de inmunización para determinar la capacidad adyuvante del IM (lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium LMG 3306) en una vacuna frente a Leishmaniosis. Grupos de 5 ratones son vacunados con el antígeno SLA, solo o junto a CpG o IM a los días 0, 15 y 30.

El día 60, se inocula a cada animal 1.000 promastigotes en cada planta del pie y se evalúa la evolución de la lesión y parámetros inmunológicos.

Figura 7: Evolución de la lesión en los animales vacunados con SLA y SLA-CpG (panel de arriba) o con SLA-IM como adyuvantes. Se cuantifica la inflamación de la almohadilla plantar a lo largo de la infección.

Figura 8: Estado macroscópico de las lesiones en la almohadilla plantar de los animales vacunados con SLA, SLA.-CpG y SLA-IM frente al grupo control (PBS). Se incluyen las fotos de un animal del grupo control, uno del vacunado con SLA, uno con SLA-CpG y los seis vacunados con SLA-IM, transcurridas seis semanas de la infección.

Figura 9: Cuantificación del número de parásitos en el bazo y los nódulos linfoides (DLN) en donde la inmunización con SLA no produce reducción alguna del número de parásitos contados en los órganos comentados con respecto al control mientras que el grupo SLA-CpG reduce en una magnitud aproximada a 2 log dicho recuento y el grupo SLA-IM obtiene resultados similares de reducción.

Figura 10: Gráficas de resultados de la evaluación de la respuesta Th1 (IFN-\gamma) y/o Th2 (IL-4) en las células de los bazos de los animales sacrificados, estando estas células aisladas y estimuladas "in vitro" con SLA.

Figura 11: Evaluación de la respuesta Th1/Th2 en función del análisis de los niveles de Leishmania respecto de los isotipos específicos de anticuerpos IgG2a (Th1) e IgG1 (Th2).

Figura 12: Muestra el protocolo de evaluación del efecto terapéutico de IM en una infección experimental con Leishmania.

Figura 13: (A) Evolución de la lesión en los animales vacunados con IM. Se cuantifica la inflamación de la almohadilla plantar a lo largo de la infección. (B) Estado macroscópico de las lesiones en la almohadilla plantar de los animales vacunados con IM frente al grupo control (PBS). Se incluyen las fotos de un animal del grupo control, uno del vacunado con CpG, y los seis vacunados con SLA-IM, transcurridas seis semanas de la infección.(C) Cuantificación del número de parásitos en el bazo y los nódulos linfoides (DLN) después de siete semanas.

Figura 14: Tabla resumen comparativa entre la muestra de control PBS, CPG e IM respecto de los anticuerpos IgG1 e IgG2a incluyendo la ratio entre ellos.

Figura 15: Esquema del protocolo empleado para analizar el papel como adyuvante del IM en animales inmunosuprimidos. Grupos de 5 animales fueron inmunosuprimidos con Dexametasona y vacunados con SLA, SLA-CpG o SLA-IM. Transcurridas 24 horas, los animales fueron infectados para posteriormente reinfectarlos al día 8. Tras sacrificarlos al día 60, se evalúa la evolución de la lesión y parámetros inmunológicos.

Figura 16: Efecto adyuvante del IM tras vacunación con SLA en células de bazo de ratones Las células de bazo fueron cultivadas en presencia o no del antígeno SLA (10 \mug/ml) durante 72 horas y la proliferación analizada por la incorporación de trimidina al DNA en un período de 72 horas. Los resultados mostrados es la media de 2 experimentos por triplicado empleando 6 animales en cada experimento.

Figura 17: Efecto en la producción de IL-4 por las células de bazo de animales vacunados. Las células de bazo fueron aisladas de varios animales y estimuladas SLA (10 \mug/ml) y analizadas por ELISA la secreción de IL-4.

Figura 18: Efecto de la producción de IL-4 e IFN-gamma por las células de bazo de ratones vacunados y tratados con Dexametasona (DEX).

Figura 19. Respuesta celular a SLA en animales vacunados. Respuesta específica frente a IFN-gamma y respuesta frente a SLA 17 días después de la adición "in vitro" de SLA. Se muestra el ratio de secreción IFN-gamma (Th1)/IL-4 (Th2).

Exposición detallada de modos de realización Ejemplo 1 Tratamiento y prevención de endotoxemia

Para la realización de este ensayo, se empleó LPS de E. coli en la raza Balb/c de ratones.

Primero se determinó la dosis de LPS de E. coli que inducía el 100% de mortalidad en un período de 6 días máximo (dosis letal 100).

El LPS de E. coli cepa O111:B4 fue adquirido a la casa comercial SIGMA (St. Louis, MO, USA). En todos los estudios, se empleo tampón fosfato-sal como diluente de los LPS. Para los estudios del cálculo de la dosis letal (o porcentaje de supervivencia) se determinó la dosis apropiada de LPS mediante la gráfica dosis/respuesta incrementando paulatinamente la cantidad de LPS suministrada a ratones hembras de la raza BALB/c por vía intraperitoneal.

Prevención de los efectos letales de la endotoxemia

Ratones hembras de la raza BALB/c, que habían sido inoculadas 24 horas antes del ensayo por vía intraperitoneal con 1,75 mg/por ratón de LPS (E. coli O111:B4), fueron tratadas o no con 2 diferentes dosis del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 (IM) 0,6 \mug/Kg (dosis 60) o 3 \mug/Kg (dosis 300).

Todas las aplicaciones intraperitoneales fueron realizadas a igual volumen final para asegurar igualdad de condiciones.

El IM en las dos concentraciones comentadas previno completamente de la muerte por choque endotóxico debido al LPS de E. coli. Además, los animales tratados con el IM, no mostraron ningún síntoma asociado a choque séptico (Figura 1). La dosis de LPS de E. coli empleada fue mucho más alta que la del IM por lo que es poco probable que este último pueda competir con el LPS de E. coli.

Cura del choque endotóxico letal

El mayor problema actual de la sepsis no es tanto el prevenir dicha patología como curarla una vez el proceso ha comenzado.

Para estudiar esta fase, grupos de 5 ratones fueron inoculados por vía intraperitoneal con 2 mg de LPS de E. coli O111:B4 por animal y transcurridas 24 horas tratados con el IM a dos dosis diferentes 0,6 \mug/Kg (dosis 60) o 3 \mug/Kg (dosis 300) por vía intraperitoneal. El IM tiene un efecto protector frente al efecto letal de la endotoxina.

Así, 72 horas de la administración del placebo al grupo control, todos los animales habían muerto. Sin embargo, el 20% de los animales tratados con cualquiera de las dos dosis del IM sobrevivieron, y en los otros se retrasó su muerte de manera muy notable. Estos datos indican que el lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 es capaz de curar parcialmente a los animales en estado de choquexia (Figura 2).

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Sorprendentemente los animales tratados con IM presentaron niveles de coagulación sanguínea menores que los del grupo Placebo. Este dato es muy importante, ya que problemas de excesiva coagulación están asociados al fenómeno de la sepsis y, de hecho, el único compuesto aprobado recientemente para esta patología presenta un efecto bloqueante de la coagulación.

Peritonitis bacteriana

El empleo del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 fue analizado también en otro modelo diferente de sepsis, la peritonitis y posterior sepsis debida a la infección con células de E. coli.

Tratamiento de la peritonitis letal debida a E. coli

Para este estudio, ratones hembras de la raza C57BL/6 fueron infectadas con bien 10^{7} o 10^{8} unidades formadoras de colonias (CFU) de E. coli 026:B6 y transcurridas bien 4 o bien 24 horas de la infección, tratadas con el IM, 0,6 \mug/Kg (dosis 60) o 3 \mug/Kg (dosis 300), o con un placebo por vía intraperitoneal.

Se evaluaron los parámetros de supervivencia así como síntomas patológicos como anorexia, mortalidad, alopecia, choquexia, actividad física, etc.).

A las 20 horas de la infección con 10^{7} CFU E. coli el 20% de los animales estaban ya muertos y el resto mostraban signos patológicos de sepsis, 3 en una escala de 0 a 5.

El tratamiento con IM previene de la muerte de los animales y revierte completamente tanto los síntomas como la propia patología en sí.

Cuando la dosis empleada fue de 10^{8} CFU de E. coli, todos los animales murieron transcurridas 24 horas, por ello, fueron tratados con el IM transcurridas 4 horas de la infección. En ese momento no había muerto ningún animal aunque la valoración de los síntomas era muy alta, 4 (para un total de rango 5). Transcurridas 14 hr de la infección, todos los animales del grupo control habían muerto mientras que el grupo tratado con la dosis 300 de IM (3 \mug/Kg) previno la muerte del 80% de los animales (murió un animal) y mostró un gradual descenso de los severos síntomas clínicos. (Figura 4).

Efecto adyuvante en infección experimental por Leishmania Efecto adyuvante en la infección de la planta del pie murino

Es de sobra conocido que el antígeno soluble de Leishmania (SLA) es un extracto antigénico que no induce efecto protectivo frente a la infección experimental por Leishmania major. Esto es debido a que el SLA es incapaz de activar la respuesta protectiva vía Th1 (Figura 5). Sin embargo, cuando el SLA se combina con el adyuvante denominado CpG (US 7521063) como adyuvante de la vacuna, sí que se produce el estímulo Th1 mediante el reconocimiento por el TLR9 ("Tol Like Receptor") (Heeg, Int. J. Microbiol, 298, 33, 2008), inducir una respuesta protectiva con la inducción y expresión IFN-\gamma (US 6890542).

Así, este modelo es muy útil para analizar el IM y compararlo con el adyuvante bien conocido CpG en el modelo de infección experimental de leishmaniosis.

En la Figura 6 se muestra el diseño de trabajo para esta hipótesis:

Básicamente el antígeno SLA se inocula solo o junto a CpG o IM a los días 0, 15 y 30.

El día 60, se inocula a cada animal 1.000 promastigotes en cada planta del pie y se evalúa la evolución de la lesión y parámetros inmunológicos. La evolución de la patología puede ser analizada microscópicamente y correlaciona con el número de parásitos. Como se muestra en la Figura 7, se muestra que es patente la infección después de la inoculación en el grupo Control. El grupo tratado solo con SLA no evidencia efecto protector al contrario de los grupos SLA+CpG y SLA+IM que si reducen significativamente las lesiones.

Además, los resultados a nivel macroscópicos 6 semanas después de la infección se muestran en la Figura 8 y demuestran que existe una reducción significante de las lesiones en los grupos tratados con SLA-CpG o SLA-IM si se comparan con los animales tratados solamente con SLA.

A las siete semanas post infección, los animales fueron sacrificados y se cuantificaron el número de parásitos en el bazo y los nódulos linfoides (DLN). La inmunización con SLA no produce reducción alguna del número de parásitos contados en los órganos comentados con respecto al control mientras que el grupo SLA-CpG redujo en una magnitud aproximada a 2 log dicho recuento y el grupo SLA-IM obtuvo resultados similares en al menos cuatro de los seis animales (Figura 9).

En resumen, la inmunización con SLA no protege por sí sola de la infección por Leishmania mientras que su combinación con CpG o IM demuestra un efecto protector frente a dicha infección.

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Las células de los bazos de los animales sacrificados fueron aisladas y estimuladas "in vitro" con SLA y evaluada la respuesta Th1 (IFN-\gamma) y/o Th2 (IL-4).

Esta bien descrito que el modelo de infección por Leishmania major en los ratones susceptibles de la línea le Balb/c muestran un el incremento relativo de los niveles de IL-4 frente a los de IFN-\gamma. Aunque la vacunación con SLA no modifica ese patrón, cuando se combina con CpG la respuesta Th1 es mayor (mayor producción IFN-\gamma) y como tal, la proporcionalidad con IL-4 se modifica. Es decir, la proporción IFN-\gamma (respuesta Th1)/IL-4 (respuesta Th2) aumenta significativamente (Figura 10).

Sorprendentemente, aunque el IM ha mostrado un efecto similar protectivo al de CpG, el mecanismo inmunológico de actuación es diferente. La protección no guarda relación con la proporcionalidad del IFN-\gamma (respuesta Th1)/IL-4 (respuesta Th2), ya que ambos parámetros aumentan de igual manera (Figura 10).

Una segunda manera de determinar la respuesta Th1/Th2 e analizando los niveles séricos de los isotipos IgG2a (Th1) e IgG1 (Th2) de los anticuerpos específicos para Leishmania.

Aunque no está claro el mecanismo, los niveles de IgG2a están correlacionados con la protección frente a Leishmania. En los animales no tratados, o tratados solamente con el antígeno SLA, no se detectan niveles séricos de este isotipo (IgG2a). Sin embargo, animales tratados con SLA-CpG o SLA-IM muestran niveles séricos de IgG2a. Así la proporción IgG2a/IgG1 es baja en animales no tratados o tratados solamente con SLA mientras que se eleva significativamente en los tratados con SLA-CpG o SLA-IM (Figura 11).

Efecto terapéutico y protectivo del IM en el modelo murino de la infección de la planta del pie

En la Figura 12 se muestra el protocolo realizado para evaluar el efecto terapéutico del IM en el modelo de infección experimental con Leishmania.

Para ello, el IM se inoculó al mismo tiempo que las Leishmanias y con dos diferentes dosis;

1) Grupo IMF-1, 2 y 3, recibieron una dosis de 0,6 \mug/Kg (18 ng/ratón)

2) Grupo IMF-4, 5 y 6, recibieron una dosis de 1,2 \mug/Kg (36 ng/ratón).

Los resultados muestran que IM es capaz de proteger con una potencia similar a la obtenida cuando se emplea CpG en infecciones por Leishmania major (Figura 13A). Loa animales tratados con IM no mostraron ninguna lesión aparente (Figura 13B). Transcurridas 7 semanas de la infección los animales se sacrificaron y se cuantificó el número de parásitos tanto en bazo como en los nódulos linfoides (LN). Los resultados obtenidos en los grupos CpG e IM fueron similares, con una reducción muy significativa (casi 10.000 veces) en LN e inexistencia de parásitos en bazo (Figura 13C).

Finalmente, y de acuerdo a los resultados previamente obtenidos, el uso de CpG induce un cambio significativo en la proporción de los niveles humorales IgG2a/IgG1. Además, IM no muestra este cambio significativo en la proporción de IgG2a/IgG1 (Figura 14).

Como conclusión, se demostró que el IM posee unas propiedades similares a las publicadas y refrendadas en estos estudios pero difiere de éste en el mecanismo inmunológico de actuación ya que no las proporcionalidad de la respuesta Th1/th2 o de IgG2a/IgG1 son diferentes. En este contexto, el empleo del IM puede ser mejor adyuvante que el CpG ya que activa por igual ambas respuestas y no solo la Th1 como queda demostrado para la CpG.

Efecto adyuvante para vacunación en animales inmunosuprimidos

El uso de IM ha mostrado previamente un gran efecto adyuvante en la vacunación con SLA como antígeno.

Este antígeno, como se ha demostrado es muy pobre inmunológicamente ya que fundamentalmente induce una respuesta Th2 (predominio de anticuerpos IgG1 y producción de IL-4) y no induce respuesta Th1 (caracterizada por los anticuerpos IgG2a y la producción de IFN-gamma) que son los protectivos.

Para analizar el efecto adyuvante en animales inmunosuprimidos, ratones hembras Balb/c fueron tratados con el córtico esteroide Dexametasona (Dex), a razón de 20 \mug intraperitonealmente por animal, y 24 horas más tarde inoculados con SLA sola (10 \mug/animal) o en combinación con IM, 0,6 \mug/Kg (dosis 60) o 3 \mug/Kg (dosis 300), o CpG, Los ratones fueron revacunados una semana más tarde con SLA sola y al día 17 los animales sacrificados y cosechadas células de bazo y evaluados los títulos de anticuerpos frente a SLA.

Como se muestra en la Figura 16, se detectaron anticuerpos específicos frente a SLA en todos los animales vacunados pero no en los controles tratados con Dexametasona. La mayoría de los anticuerpos fueron del isotipo IgG1. Como se descrito previamente, el empleo de CpG incrementó el ratio IgG2a/IgG1 y este ratio fue mejorado por el empleo de IM, o lo que es lo mismo, induciendo un cambio de la reacción inmunológica de Th2 a Th1. Estos datos indican que el IM posee una actividad como adyuvante en animales inmunosuprimidos y más importante, favorece el sostenimiento de la inducción Th1 incluso en animales inmunodeprimidos.

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Además, se obtuvieron células de bazo de diferentes animales y estimuladas in vitro con SLA y se analizó la inducción de IFN-\gamma (citokina de respuesta Th1 necesaria para la inducción de protección frente a Leishmania). Como se muestra en la Figura 17, la adición de SLA induce proliferación celular en animales tratados con Dexametasona. Los animales tratados con Dexametasona y SLA-CpG inducen una repuesta proliferativa mejor. Una vez más, el tratamiento de animales inmunosuprimidos con Dexametasona y SLA-IM además de inducir la mejor proliferación, presenta la característica de ser dosis dependiente.

Además, analizamos la secreción de IFN-\gammay (citokina Th1) e IL-4 (citokina Th2) en los sobrenadantes de las células de bazo después del tratamiento con SLA "in vitro". Como se muestra en la Figura 18, los animales control (Dex), no presentan apenas secreción detectable de IL-4 o IFN-\gamma. Mientras que el grupo vacunado con SLA, muestran una producción clara de IL-4 y muy baja de IFN-\gamma, resultados conforme a los datos obtenidos también en sueros y analizada la proporción de IgG1/IgG2a.

El tratamiento con CpG induce ambas citoquinas (IL-4 e IFN-\gamma) sin alterar el ratio (Figura 19). De manera muy sorprendente el IM incrementa también la producción de ambas citoquinas pero con una mayor proporción de IFN-\gamma frente a IL-4. Este dato fue especialmente evidente en los animales tratados con la dosis mayor testada (3 \mug/Kg, dosis 300), incrementando en 10 veces la proporción IFN-\gamma/IL-4 (Figura 19).

Claims

1. Uso del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del choque séptico.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del choque endotóxico.

4. Uso del lipopolisacárido de Ochrobactrum intermedium cepa LMG 3306 como adyuvante en vacunas para el tratamiento y/o prevención de enfermedades infecciosas.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones en animales inmunosuprimidos.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 4-5, como adyuvante en vacunas contra la leishmaniasis.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación anterior 6, como adyuvante en vacunas contra infecciones dérmicas por leishmaniasis.