ES2352561T3 - Dímeros de sgp 130fc mejorados. - Google Patents
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Abstract
Un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R y que comprende dos monómeros, en el cada uno de dichos monómeros comprende (a) una parte extracelular de una molécula de gp130 o (b) una variante o fragmento de dicha parte extracelular capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R, fusionado con un dominio Fc de una proteína IgG1, y en el que al menos el resto aminoacídico Leu235 de la región bisagra del dominio Fc está remplazado por al menos un resto aminoacídico hidrófilo.
Description
La presente invención se refiere a un dímero polipeptídico que comprende dos moléculas de gp130 solubles como se caracteriza en las reivindicaciones. De este modo, se refiere a un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R y que comprende dos monómeros en el que cada uno de dichos monómeros comprende 5 (a) una parte extracelular de una molécula de gp130 o (b) una variante o fragmento de dicha parte extracelular capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R, fusionado con un dominio de Fc de una proteína IgG1 y en el que al menos el resto aminoacídico Leu235 de la región bisagra del dominio Fc está remplazado por al menos un resto aminoacídico hidrófilo. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene dicho dímero y diversos usos médicos. 10
La citocina pleiotrópica interleucina-6 (IL-6) muestra un amplio espectro de funciones biológicas entre las son principalmente notables que la estimulación de linfocitos B y la inducción de síntesis proteica de fase aguda en hígado. IL-6 ejerce su actividad en células diana mediante la unión a un receptor de superficie específico de IL-6 (IL-6R). Este complejo receptor/ligando facilita la homodimerización de gp130, la segunda subunidad del complejo receptor de IL-6. La dimerización de gp130 da como resultado la transducción de una señal de IL-6. Formas solubles del IL-6R (sIL-6R) 15 que se generan por dos mecanismos (corte y empalme alternativo y desprendimiento) también son capaces de desencadenar la dimerización de gp130 y señalizar cuando forman complejo con IL-6.
Puesto que la porción citoplásmica del IL-6R no contribuye a la transducción de señal, la señalización por un homodímero gp130 puede inducirse mediante IL-6 en complejo con IL-6R unido a membrana o soluble. La presencia de sIL-6R, sin embargo, conduce a sensibilización hacia al ligando de las células sensibles a IL-6. Además, las células del 20 hibridoma estrictamente dependiente de IL-6 no proliferan en respuesta a cantidades muy bajas de IL-6 cuando el sIL-6R presente en los medios de cultivo se retira continuamente.
Inicialmente descrito como el transductor de señal de interleucina 6, IL-6, IL-11, factor inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM) y factor neurotrófico ciliar (CNTF). Todas estas citocinas actúan mediante un complejo receptor bi o tripartito en el que la sensibilización se desencadena por homodimerización (para IL-6) o heterodimerización de gp130 25 con LIF-R (para LIF, CT-1, OSM, CLC y CNTF) u OSM-R (para OSM). Estas citocinas pueden mediar de este modo actividades biológicas similares en diversos tejidos.
Mientras que gp130 puede encontrarse en casi todos los tipos celulares, el IL-6R muestra una expresión mucho más restringida. La liberación de sIL-6R por un tipo celular hace a otras células, que sólo expresan gp130, sensibles a IL-6. Este escenario se denomina trans-señalización. De hecho, se han descrito varias actividades celulares que requieren el 30 complejo de sIL-6R e IL-6 y no se ven con IL-6 sola. La proteína gp130 soluble se encuentra en altas concentraciones en plasma humano. Recientemente se ha descrito la citocina de diseño Hyper-LL-6 (H-IL-6), en la que el extremo C terminal de sIL-6R está fusionado covalentemente con el extremo N terminal de IL-6 madura por un enlazador peptídico flexible. Como se ha visto con el complejo de IL-6/sIL-6R, H-IL-6 también actúa en células que sólo expresan gp130. A diferencia de los componentes separados IL-6 y sIL-6R, una concentración de 100 a 1000 veces menor de esta 35 molécula de fusión es suficiente para inducir señales biológicas comparables.
Para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos, puede ser deseable el bloqueo específico de respuestas de IL-6 dependientes de IL-6R soluble. Dichas enfermedades incluyen resorción ósea, hipercalcemia, caquexia, tumores u otros tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de colon, mieloma múltiple, linfoma, leucemia, enfermedad de Hodgkin), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple (EM) o diabetes tipo 1) enfermedades inflamatorias o 40 atópicas (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, asma, psoriasis, sarcoidosis, lupus eritematoso o uveítis), infecciones (por ejemplo, por bacterias, virus, hongos u otros patógenos) así como trastornos endocrinológicos y enfermedades metabólicas o catabólicas (por ejemplo, diabetes tipo 2, obesidad, hiperglucemia o hipercolesterolemia). Se descubrió que, por ejemplo, los dímeros de sgp130 o dímeros de sgp130Fc son útiles para aplicaciones terapéuticas. 45
El problema técnico que subyace la presente invención fue proporcionar dímeros de sgp130Fc mejorados.
La solución de dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Durante los experimentos que condujeron a la presente invención se descubrió que la actividad biológica, capacidad de purificarse y estabilidad de las proteínas de fusión de sgp130Fc dependen significativamente de la composición de aminoácidos de la región bisagra entre la sgp130 y la parte de Fc. Los aminoácidos 234, 235 y 237 50 de la IgG-Fc humana (de acuerdo con la numeración UE) se mutaron para reducir la unión del receptor Fc a este motivo (Duncan y col., Nature (1988), 332: 563-564; Canfield y Morrison, J. Exp. Med. (1991), 173: 1483-1491; Wines y col., J. Immunol. (2000), 164: 5313-5318; Sondermann y col., Nature (2000), 406: 267). Inesperadamente, remplazando Leu235 de la secuencia de tipo silvestre Leu234-Leu235-Gly236-Gly237 con glutamato (Glu, E) o aspartato (Asp, D) y, de este modo, rompiendo el motivo hidrófobo con un aminoácido fuertemente hidrófilo (cargado) la actividad y estabilidad biológicas de 55 las proteínas de fusión sgp130Fc pudo mejorarse. Las mutaciones de las posiciones 234 y 237 aumentan este efecto. El mutante más potente presenta la secuencia Ala234-Glu235-Gly236-Ala237.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Muteínas de la región bisagra de sgp130Fc
La región bisagra inferior de IgG1-Fc humana se modificó por mutagénesis dirigida. La secuencia ideal, como se determinó en los experimentos, es “AEGA” (como se incorpora en el compuesto CR5/18).
Abreviaturas y símbolos: aa, aminoácido o aminoácidos; C, cisteínas que forman los dos puentes disulfuro necesarios 5 para la dimerización de la proteína de fusión de Fc; X, alanina (Ala, A) o fenilalanina (Phe, F); Z, glutamato (Glu, E) o Aspartato (Asp, D).
Figura 2: Curvas de elución de cromatografía de exclusión por tamaño de sgp130Fc de tipo silvestre y CR5/18
CRS/18 muestra una cantidad significativamente reducida de agregados (productos secundarios) en comparación con sgp130Fc de tipo silvestre y, de este modo, un mayor rendimiento de producto no contaminado. 10
Figura 3: Inhibición de la proliferación inducida por IL-6/sIL-6R de células BAF3/gp130 mediante CR5/18 o sgp130Fc de tipo silvestre como se determinó mediante ensayo de MTS de viabilidad celular
CR5/18 es significativamente más activo biológicamente que sgp130Fc de tipo silvestre (wt) en el bloqueo de la proliferación desencadenada por IL-6 100 ng/ml y sIL-6R 50 ng/ml. Esto se refleja por la CI50 de CR5/18 (1), que es aproximadamente la mitad de la CI50 de sgp130Fc (2). Abreviaturas y símbolos: CI50, concentración con eficacia 15 inhibidora del 50%; IL-6, interleucina-6; I/R, IL-6 más sIL-6R; MTS, sustrato que se convierte mediante células metabólicamente activas en un producto de formazán soluble que absorbe a 490 nm; DO, densidad óptica a 490 nm; sIL-6R, receptor de interleucina 6 soluble.
De este modo, la presente invención se refiere a un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R como se caracteriza adicionalmente en las reivindicaciones. 20
El término “soluble” como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de gp130 que carece del dominio intracelular y, preferentemente, del dominio transmembrana.
Los dímeros de la presente invención pueden obtenerse por ingeniería genética usando procedimientos conocidos. Los dominios utilizados pueden consistir en el dominio extracelular completo de gp130 o pueden consistir en mutantes o fragmentos del mismo que mantienen la capacidad de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R. Los 25 fragmentos preferidos son fragmentos que consisten en al menos los dominios extracelulares D1 a D3.
La expresión “fusionado a un dominio Fc de una proteína IgG” significa que, preferentemente, el compañero de fusión del dímero consiste únicamente en el domino Fc de la proteína IgG1. Sin embargo, la parte de Fc puede comprender secuencias de más de un isotipo de IgG y la selección de motivos de secuencia particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la experiencia habitual de la técnica. 30
En una realización preferida del dímero polipeptídico de la presente invención, el resto aminoacídico de la región bisagra Leu234 se remplaza por Phe o Ala.
En una realización más preferida del dímero polipeptídico de la presente invención, los restos aminoacídicos Leu234 y/o Gly237 de la región bisagra se remplazan por el resto aminoacídico Ala.
En una realización aún más preferida del dímero polipeptídico de la presente invención, la región bisagra comprende el 35 motivo de secuencia de aminoácidos Ala234-Glu235--Gly236-Ala237 en lugar de Leu234-Leu235-Gly236 -Gly237.
Se prefiere particularmente un dímero polipeptídico, en el que la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos Asp221-Lys222-Thr223-His224-Thr225-Cys226-Pro227-Pro228-Cys229-Pro230-Ala231-Pro232-Glu233-Ala234-Glu235-Gly236-Ala237-Pro238-Ser239-Val240.
Las fusiones del domino extracelular gp130 (sgp130), preferentemente en el extremo C terminal, o la variante o 40 fragmento del mismo con la región bisagra de la parte de Fc puede ser directa o puede emplear un dominio enlazador polipeptídico flexible de diversas longitudes y combinaciones de aminoácidos. Estos enlazadores pueden ser completamente artificiales (por ejemplo, que comprendan de 2 a 50 restos aminoacídicos seleccionados independientemente del grupo que consiste en glicina, serina, asparagina, treonina y alanina) o adoptados de proteínas de origen natural. Dichos enlazadores pueden mejorar la flexibilidad y propiedades de enlace del dímero. 45
Adicionalmente, las proteínas de fusión de sgp130Fc de la invención pueden fusionarse adicionalmente a marcadores, tales como poli(His), Myc, Strep, poliarginina, Flag, proteína verde fluorescente (GFP), TAP, glutatión S-transferasa (GST), HA, péptido de unión a calmodulina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP), V5, HSV, S, virus de la estomatitis vesicular (VSV), Proteína C, Luciferasa, Glu-Glu, E, beta-GAL, T7 y otros epítopes para los que están disponibles anticuerpos u otras moléculas de unión para permitir una rápida purificación, detección en transferencia de 50 Western o ELISA, inmunoprecipitación o agotamiento/bloqueo de la actividad en bioensayos.
En una realización adicional preferida del dímero polipeptídico de la presente invención, se insertan uno o más sitios de N-glucosilación entre la molécula de gp130 soluble o variante o fragmento y el dominio Fc. Los motivos de aminoácidos de los sitios de N-glucosilación con la secuencia central Asn-X-Ser o Asn-X-Thr dependen del contexto del motivo en la proteína y pueden predecirse y diseñarse por un experto en la materia, por ejemplo, mediante el uso de software gratuito tal como NetNGlyc (Centro para el Análisis de Secuencias Biológicas, Universidad Técnica de Dinamarca). Un 5 elemento enlazador de N-glucosilación preferido para dímeros de sgp130Fc de la invención es His-Asn-Leu-Ser-Val-Ile.
Otro objeto de la presente invención son formas PEGiladas o modificadas químicamente de otro modo de los dímeros. La PEGilación de las moléculas sgp130 puede llevarse a cabo, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos descritos para IFN-, IFN-, IFN-, IL-15 o IL-2 humanas (Youngster y col., Curr Pharm Des (2002), 8: 2139; Grace y col., J Interferon Cytokine Res (2001), 21: 1103; Pepinsky y col., J Pharmacol Exp Ther (2001), 297:1059; Pettit y col., J 10 Biol Chem (1997), 272: 2312; Goodson y col. Biotechnology NY (1990), 8: 343; Katre; J Immunol (1990), 144:209).
Cualquier tipo de polietileno glicol es adecuado para la presente invención con tal de que el dímero PEG-polipéptido aún sea capaz de bloquear respuestas de IL-6 dependientes de sIL-6R que pueden ensayarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Preferentemente, el polietileno glicol del dímero polipeptídico de la presente invención es PEG 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 15000, 20000 ó 40000 prefiriéndose particularmente PEG 20000 ó 15 40000.
Para formar el dímero, las dos moléculas de gp130 solubles se unen entre sí a través de un enlace covalente simple, un enlazador peptídico flexible o, preferentemente, mediante uno o más puentes disulfuro. Los enlazadores peptídicos pueden ser completamente artificiales (por ejemplo, que comprenden de 2 a 20 restos aminoacídicos seleccionados independientemente del grupo que consiste en glicina, serina, asparagina, treonina y alanina) o adoptados de proteínas 20 de origen natural. La formación de puentes disulfuro puede conseguirse, por ejemplo, por expresión recombinante, en la que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el monómero de sgp130Fc contiene uno o más codones que codifican cisteína, preferentemente en la región bisagra del dominio Fc.
Los dímeros de la presente invención se producen preferentemente de manera recombinante mediante el uso de un polinucleótido que codifica un monómero del dímero y vectores, preferentemente vectores de expresión que contienen 25 dichos polinucleótidos. Para la producción de los dímeros de la invención, los polinucleótidos se obtienen de clones existentes, es decir, preferentemente codifican el polipéptido de origen natural o una parte del mismo (para gp130/IL6ST humano: secuencia de GenBank NM_002184 y clones de apoyo; para la región constante de IgG1/IGHG1: por ejemplo, secuencia de GenBank AK057754). Los polipéptidos codificados por cualquier polinucleótido que hibrida con el complemento del ADN o ARN nativo en condiciones altamente rigurosas o moderadamente rigurosas (para definiciones, 30 véase Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y.) siempre que ese polipéptido mantenga la actividad biológica de la secuencia nativa, también son útiles para producir los dímeros de la presente invención.
Los vectores recombinantes pueden construirse de acuerdo con procedimientos bien conocidos para el experto en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 35 N. Y. Puede utilizarse una diversidad de sistemas de vector de expresión/huésped para contener y expresar secuencias que codifican los dímeros de la presente invención. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, plasmídicos o de cósmidos recombinantes; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión virales (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformados con vectores de 40 expresión virales (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas celulares animales.
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el dímero polipeptídico de la presente invención. Los vectores adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, el vector de expresión pSKK para la expresión en bacterias. 45
En especies de levaduras de tipo silvestre o modificadas (por ejemplo, desarrollados por glucoingenieria), tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe o Pichia pastoris, pueden usarse varios vectores que contienen promotores o sistemas de promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa, PGH, tetraciclina, glucosa, etc; para revisiones, véase Grant y col. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544; Siam y col. (2004) Methods 33: 189-198; Macauley-Patrick y col. (2005) Yeast 22: 249-270, Gellissen y col. (2005) FEMS Yeast Res. 50 5:1079-1096; Wildt y Gerngross (2005) Nat.Rev.Microbiol. 3: 119-128.
En casos en los que se usan sistemas de expresión vegetales del estado de la técnica (para revisión, véase por ejemplo, Stoger y col. (2005) Curr.Opin.Biotechnol.16:167-173; Gomord y col. (2005) Trends Biotechnol. 23: 559-565) la expresión de secuencias que codifican un dímero (o monómeros del mismo) de la presente invención pueden conducirse por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los promotores de 35S y 55 19S de CaMV pueden usarse solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu (1987) EMBO J. 6: 307-311). Como alternativa, pueden usarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi y col. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie y col. (1984) Science 224: 838-843; y Winter y col. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105). Estas construcciones pueden introducirse en células
vegetales mediante transformación de ADN directa o transfección mediada por patógeno. Dichas técnicas se describen en varias revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs y Murry en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, Nueva York, N. Y.; pp. 191-196).
También puede usarse un sistema de insecto para expresar los dímeros (o los monómeros de los mismos) de la presente invención. Por ejemplo, en un sistema tal, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica 5 (AcNPV) como un vector para expresar genes ajenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina y colocarse bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia de ADN que codifica monómeros de sgp130Fc o fragmentos o variantes de los mismos hará al gen de la polihedrina inactivo y producirán virus recombinante sin la cubierta proteica. Los virus recombinantes pueden usarse después para infectar, por ejemplo, células de S. 10 frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que puede expresarse sgp130Fc de la presente invención (Engelhard y col. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224-3227).
En células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados, por ejemplo, en transfección basada en lípidos o transducción viral de las células. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican el polipéptido o los polipéptidos de la presente invención pueden ligarse a un 15 complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que es capaz de expresar los polipéptidos de la presente invención en células huésped infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero. 20
Después de la introducción del vector o vectores recombinantes, las células huésped se cultivan en un medio selectivo, que selecciona con respecto al crecimiento de células que contienen vectores. Puede usarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, M. y col. (1977) Cell 11: 223-32) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, I. y col. (1980) Cell 22: 817-23) que pueden emplearse en células tk.sup. o aprt.sup., 25 respectivamente. Además, puede usarse resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como la base de la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, M. y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-70); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. y col (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14) y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente. Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar 30 indol en lugar de triptófano o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, S. C. y R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51). El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con tales marcadores como antocianinas, beta-glucuronidasa y su sustrato GUS y luciferasa y su sustrato luciferina, usándose ampliamente no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión proteica transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes, C. A. y col. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121-35 131).
La purificación de los polipéptidos recombinantes se lleva a cabo por uno cualquiera de los procedimientos conocidos para este fin, es decir, cualquier procedimiento convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un procedimiento de purificación adicional que puede usarse es la cromatografía por afinidad que usa, por ejemplo, Proteína A, Proteína G o anticuerpos monoclonales, que se unen al polipéptido diana y que se 40 producen e inmovilizan en una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen el polipéptido recombinante se pasan a través de la columna. El polipéptido se unirá a la columna por la interacción específica con la matriz de gel de afinidad mientras que las impurezas la atravesarán. Después de lavar, el polipéptido se eluye del gel mediante un cambio en el pH o la fuerza iónica y después, si se produce como el monómero, se dimeriza y, si se desea, se PEGila. 45
En consecuencia, la presente invención también se refiere a un procedimiento para producir el dímero polipeptídico de la presente invención, que comprende cultivar una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que codifica un monómero de dicho polipéptido y recuperar el monómero o dímero polipeptídico de dicha célula huésped o del cultivo.
Los dímeros polipeptídicos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o prevención de todas las patologías 50 en las que la actividad del complejo agonista IL-6/slL6R debería inhibirse.
De este modo, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de un dímero polipeptídico de la presente invención, preferentemente combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. “Farmacéuticamente aceptable” significa que abarca cualquier vehículo, que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del principio activo y que no es tóxico para el huésped al que se le administra. 55 Se conocen bien en la técnica ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Dichos vehículos pueden formularse por procedimientos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una dosis eficaz.
Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad del principio activo que es suficiente para influir en el curso y la gravedad de la enfermedad, conduciendo a la reducción o remisión de dicha patología.
Una “dosis eficaz” útil para el tratamiento y/o prevención de estas enfermedades o trastornos puede determinarse usando procedimientos conocidos para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Fingl y col., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman y Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., Nueva York, pp. 1-46 ((1975)). 5
La administración de las composiciones puede lograrse de diferentes maneras, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. El régimen de dosificación se determinará por el médico a cargo del caso y otros factores clínicos. Como se conoce bien en las técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo la talla, área de superficie corporal, edad, sexo del paciente, el compuesto particular a administrar, el momento y vía de administración, el tipo de terapia, la salud general y 10 otros fármacos que se estén administrando simultáneamente.
La presente invención también se refiere al uso de un dímero polipeptídico como se ha definido anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de resorción ósea, hipercalcemia, caquexia, tumores u otros tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de colon, mieloma múltiple, linfoma, leucemia o enfermedad de Hodgkin), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple o diabetes tipo 1) enfermedades 15 inflamatorias o atópicas (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, asma, psoriasis, sarcoidosis, lupus eritematoso o uveítis), infecciones (por ejemplo, por bacterias, virus, hongos u otros patógenos), así como trastornos endocrinológicos y enfermedades metabólicas o catabólicas (por ejemplo, diabetes tipo 2, obesidad, hiperglucemia o hipercolesterolemia).
Los siguientes ejemplos explican la invención en más detalle. 20
Ejemplo 1
Construcción y producción de la muteína CRS/18 de sgp130Fc
(A) Material
Los componentes del sistema de clonación Gateway (Pfx ADN Polimerasa AccuPrime, el vector donante pDONR221, el vector de expresión controlado por promotor de CMV pcDNA-DEST40, recombinasa BP y LR para transferencia del 25 inserto y células de E. coli competentes) se obtuvieron de Invitrogen (Karlsruhe, Alemania). El kit de mutagénesis dirigida QuikChange II se obtuvo de Stratagene (Ámsterdam, Países Bajos). Los cebadores de mutagénesis purificados de PAGE fueron de Microsynth (Balgach, Suiza). Las células CHO-K1 se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania). Los componentes de medio de cultivo se obtuvieron como sigue: medio F12 de Ham, FBS y PBS de IgG baja (PAA Laboratories; Cölbe, Alemania), FBS (Biochrom; Berlín, 30 Alemania), solución de Tripsina/EDTA (Invitrogen) y solución de G418 (Sigma-Aldrich; Taufkirchen, Alemania). El reactivo de transfección Lipofectamine 2000 fue de Invitrogen. Santa Cruz (Heidelberg, Alemania) proporcionó agarosa Protein A/G Plus para inmunoprecipitación. Para inmunoprecipitación y detección primaria en transferencias de Western, se usó un anticuerpo monoclonal anti-IgG humano (Fc) de ratón (CBL102; Chemicon; Hofheim, Alemania). La detección secundaria por transferencia de Western se realizó con un anticuerpo unido a HRP anti-IgG de ratón, sustrato de 35 transferencia de Western ECL-Plus y Hyperfilm ECL (todos de GE Healthcare; Munich, Alemania). Los frascos rotatorios (2,1 l, superficie de 2,5X) se obtuvieron de Greiner Bio-One (Frickenhausen, Alemania). Los filtros de acetato de celulosa (0,45 m) para una unidad de filtro de vacío se obtuvieron de Sartorius (Göttingen, Alemania). Los materiales para cromatografía de afinidad y de exclusión por tamaño (SEC) se obtuvieron todos de GE Healthcare (Munich, Alemania): material MabSelect (código de producto 17-5199-01) en una columna XK16/20, columnas de desalación PD-40 10 y una columna HiLoad 26/60 Superdex de 200 pg para SEC. Las unidades de concentración de membrana Amicon Ultra-15 50 kDa Ultracel-PL se obtuvieron de Millipore (Eschborn, Alemania). La solución de acrilamida-bis preparada (19:1, 30%) para PAGE se obtuvo de Bio-Rad (Munich, Alemania).
(B) Construcción de CR5/18
Se optimizaron los codones de un ADNc para sgp130Fc de longitud completa que comprende el domino extracelular 45 completo de gp130 y el IgG1 Fc de tipo silvestre humano (fuentes: para el gp130/IL6ST humano: secuencia de GenBank NM_002184 y clones de apoyo; para la región constante de IgG1/IGHG1 humano: por ejemplo, secuencia de GenBank AK057754) para su expresión en células CHO-K1 y se subclonó en pDONR221 usando cebadores Gateway, Pfx ADN Polimerasa AccuPrime y recombinasa BP en un procedimiento de clonación Gateway convencional. Se verificó completamente la secuencia del inserto subclonado usando cebadores de secuenciación directos y reversos 50 escalonados cada 250-300 pares de bases. En una mutagénesis dirigida con el kit QuikChange II, la región bisagra inferior del IgG1-Fc (aminoácidos 234, 235 y 237 de acuerdo con la numeración UE) se mutó desde la secuencia de tipo silvestre “LLGG” hasta “AEGA”. Los clones mutados se verificaron por secuenciación completa como se ha descrito anteriormente. Posteriormente, el inserto se transfirió al vector de expresión pcDNA-DEST40 mediante recombinación LR Gateway. Como el inserto codifica dos codones de terminación después de la parte de Fc, los marcadores 55 codificados en pcDNA-DEST40 (epítopes V5 y 6xHis) no están presentes en CR5/18. Los clones positivos se identificaron mediante digestión de restricción por AlwNI y la secuencia se verificó de nuevo.
(C) Cultivo y transfección celulares
Las células CHO-K1 se cultivaron en un medio F12 de Ham complementado con FBS al 10% a 37ºC y CO2 5% en una atmósfera saturada de agua. Los cultivos de mantenimiento se separaron cada 3-4 días y se usaron sólo hasta 20 pases. Las células se transfectaron con la construcción de expresión pcDNA-DEST40_CR5/18 usando Lipofectamine 2000 y condiciones convencionales para CHO-K1 proporcionadas por Invitrogen. Para un primer ensayo de expresión 5 transitoria, se transfectaron células CHO-K1 en placas de 6 pocillos y ambos, células y sobrenadantes, se recogieron 24 horas después de la transfección. CR5/18 se inmunoprecipitó de los sobrenadantes usando agarosa Protein A/G Plus y el anticuerpo anti IgG humano (Fc) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se extrajo proteína celular completa y se realizaron transferencias de Western con anticuerpo anti IgG humano (Fc) con los lisados celulares y los inmunoprecipitados como se describe en Waetzig y col., J. Immunol. 168: 5342 (2002). 10
(D) Producción de CR5/18 en células CHO-K1
Después de una expresión transitoria exitosa, las células CHO-K1 se transfirieron y se seleccionaron clones positivos usando 400 g/ml de G418 en placas de 10 cm. Para determinar la calidad y propiedades del producto, se transfirió un conjunto preseleccionado de CHO-K1 policlonales a frascos rotatorios y se cultivó con FBS de IgG bajo. Los sobrenadantes de las células en confluencia se recogieron 2-3 veces por semana, se centrifugaron dos veces a 3.500 x 15 g y 4ºC durante 15 minutos para retirar residuos celulares y se procesaron inmediatamente o se congelaron a -80ºC. Paralelamente, se seleccionaron clones celulares estables del conjunto preseleccionado usando un procedimiento de dilución limitado y se caracterizaron mediante análisis de expresión de transferencia de Western como se ha descrito anteriormente. El clon con la expresión mayor y más estable se transfirió a frascos rotatorios y se usó para producción permanente. 20
(E) Purificación por cromatografía de afinidad y de exclusión por tamaño
Los sobrenadantes que contenían CR5/18 de los cultivos de frascos rotatorios se purificaron a 4ºC usando una bomba peristáltica P-1 y un Sistema Purificador 100 ÄKTA (ambos de GE Healthcare; Munich, Alemania). El protocolo se basó en las recomendaciones del fabricante para la purificación de anticuerpos monoclonales.
Después de la centrifugación, se ajustó el pH del sobrenadante fresco o descongelado (en hielo) a 6,7-7,0. Después de 25 dos ciclos de filtración en vacío (0,45 m) se desgasificó el sobrenadante y, si era necesario, se ajustó el pH de nuevo a un valor de 6,7-7,0. Posteriormente, la columna de cromatografía de afinidad equilibrada con PBS (6-25 ml de MabSelect en una columna XK16/20) se cargó con 2-4 l de sobrenadante a un caudal de 3-10 ml/minuto usando la bomba P-1. Después de lavar con PBS, la columna se transfirió al purificador ÄKTA y se lavó de nuevo con PBS hasta que el A280 se estabilizó después de la retirada cuantitativa de proteína no unida. Para la elución, el sistema ÄKTA se 30 equipó con dos tampones de citrato sódico 50 mM a pH 3,25 y 5,5, respectivamente, que se mezclaron para producir las condiciones de pH deseadas. Se siguió una etapa de lavado a pH 5,1 con elución con pH 3,7. Se recogieron fracciones de 10 ml en tubos de 15 ml que contenían 2 ml de Tris-HCl 1 M (pH 11). Las fracciones máximas se agruparon y se midió y ajustó el pH a 7,5, cuando fue necesario. Se midió la concentración de proteína de conjunto mediante A280 y se concentró cuidadosamente el conjunto a un máximo de 1,5 mg/ml usando unidades de concentración de membrana 35 Amicon Ultra-15 50 kDa Ultracel-PL. Se usaron columnas de desalación PD-10 equilibradas con PBS para remplazar el tampón citrato con PBS, seguido de otra medida de la concentración de proteína a 250 nm.
Para la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), era recomendable una concentración de proteína máxima de 1,2 mg/ml en PBS. La SEC se realizó con el sistema ÄKTA en una columna HiLoad 26/60 Superdex de 200 pg equilibrada con PBS a un caudal de 0,8 ml/minuto. A diferencia de sgp130Fc de tipo silvestre, CR5/18 eluyó en un pico único 40 después de un pico bajo de agregados de peso molecular mayor (Figura 2). En los primeros ciclos, se obtuvieron muestras de todas las fracciones para análisis por PAGE. Las fracciones picos se agruparon, se midieron sus concentraciones de proteína y se llevaron a 400-500 g/ml en PBS y se congelaron alícuotas de uso único a -80ºC para su almacenamiento a largo plazo. Las fracciones y muestras de conjunto se analizaron mediante PAGE nativo (7,5%) y tinción posterior de plata o Coomassie. 45
Como se muestra en la Figura 2, la cantidad de productos secundarios (agregados) de CR5/18 se reduce significativamente en comparación con el compuesto parental sgp130Fc que se purificó en un experimento paralelo. Además, la elución del producto deseado (dímero CR5/18) es claramente separable de las fracciones de impurezas (agregados), que no es el caso con sgp130Fc de tipo silvestre. De este modo, tanto el rendimiento (debido a una mayor proporción del producto deseado) como la calidad de las preparaciones de CR5/18 son mejores que las de sgp130Fc 50 convencional, lo que conduce a menores costes para la producción industrial. Estos resultados indican una clara mejora de CR5/18 frente a la molécula parental sgp130Fc.
Ejemplo 2
Bioactividad de CR5/18 en un ensayo normalizado de proliferación celular
(A) Material
Se usó la línea celular BAF3/gp130 precursora de linfocitos B transfectada y la citocina de diseño Hyper-IL-6. Los componentes de medio de cultivo se obtuvieron como sigue: DMEM y PBS (PAA Laboratories; Cölbe, Alemania), FBS 5 (Biochrom; Berlín, Alemania) y solución de Tripsina/EDTA (Invitrogen; Karlsruhe, Alemania). La interleucina-6 (IL-6) y el receptor de interleucina-6 (sIL-6R) se obtuvieron de BioSource (Solingen, Alemania) y R&D Systems (Wiesbaden, Alemania), respectivamente. El ensayo de proliferación celular no radiactivo acuoso de titulación celular 96 (MTS) se obtuvo de Promega (Mannheim, Alemania).
(B) Bloqueo de la proliferación de células BAF3/gp130 inducida por IL-6/sIL-6R mediante sgp130Fc o CR5/18 10
Las células BAF3/gp130 dependen de la presencia del complejo IL-6/sIL-6R en el medio de cultivo para su proliferación y viabilidad. Para el mantenimiento, las células BAF3/gp130 se cultivaron a una densidad de menos de 5 x 105 células/ml o en DMEM con FBS al 10% e Hyper-IL-6 10 ng/ml (una citocina de diseño que consiste en IL-6 y sIL-6R unidos covalentemente; Fischer y col. 1997, Nat. Biotechnol. 15: 142-145). La Hyper-IL-6 10 ng/ml podía remplazarse por IL-6 100 ng/ml y sIL-6R 50 ng/ml. Las células se pasaron dos veces por semana. Para los ensayos, las células se 15 lavaron dos veces en medio sin Hyper-IL-6 (o IL-6/sIL-6R) y se sembraron después a 5.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadió CR5/18 o el compuesto parental sgp130Fc a diversas concentraciones que variaban de 20 g/ml a 78 ng/ml (series de dilución 1:4; Figura 3). Posteriormente, las células se incubaron durante 3 días en presencia de IL-6 100 ng/ml y sIL-6R 50 ng/ml. Los controles incluyeron células no estimuladas con y sin la concentración máxima de CR5/18 o sgp130Fc así como células incubadas con los IL-6 y sIL-6R estimulantes solamente (Figura 3). 20
(C) Resultados
La actividad biológica de CR5/18 o sgp130Fc de tipo silvestre en el cultivo celular se midió por la reducción del número de células BAF3/gp130 (según se determinó por conversión de sustrato MTS) después de 3 días. CR5/18 es más activo biológicamente que sgp130Fc de tipo silvestre, alcanzando su CI50 a una concentración de aproximadamente 400 ng/ml mientras que sgp130Fc (CI50 800 ng/ml) aún no muestra un efecto significativo (Figura 3). Esto indica que CR5/18 25 podría usarse a aproximadamente la mitad de concentración terapéutica del compuesto de tipo silvestre.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Conaris research institute AG
<120> Dímeros sgp130Fc mejorados
<130> C1057EP 30
<140> EP06013668
<141> 06-06-2006
<160> 9
<170> Patentln version 3.2 35
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
40
<400> 1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT 45
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<400> 3
<210> 4
<211> 20 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature 15
<222> (221)..(240)
<223> región bisagra de lgG1 de tipo silvestre
<400> 4
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
25
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> aminoácido remplazado
30
<220>
<221> misc_feature
<222> (221)..(240)
<223> esquema de mutación de la región bisagra de lgG1 X es aminoácido remplazado
35
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> PRT..
<213> Homo sapiens
<220> 5
<221> MUTÁGENO
<222> (14)..(15)
<220>
<221> misc_feature 10
<222> (221)..(240)
<223> mutante 1; región bisagra de lgG1
<400> 6
15
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
20
<220>
<221> MUTÁGENO
<222> (14)..(15)
<220> 25
<221> MISC_FEATURE
<222> (221)..(234)
<223> mutante 2; región bisagra de lgG1
<400> 7 30
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens 35
<220>
<221> MUTÁGENO
<222> (14)..(15)
40
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (221)..(240)
<223> mutante 3; región bisagra de lgG1
45
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<220>
<221> MUTÁGENO
<222> (14). . (15)
10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (234) .. (240)
<223> mutante 4; región bisagra de lgG1
15
<400> 9
Claims (17)
- REIVINDICACIONES1.Un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R y que comprende dos monómeros, en el cada uno de dichos monómeros comprende (a) una parte extracelular de una molécula de gp130 o (b) una variante o fragmento de dicha parte extracelular capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R, 5 fusionado con un dominio Fc de una proteína IgG1, y en el que al menos el resto aminoacídico Leu235 de la región bisagra del dominio Fc está remplazado por al menos un resto aminoacídico hidrófilo.
- 2. El dímero polipeptídico de la reivindicación 1, en el que el resto aminoacídico hidrófilo es Glu o Asp.10
- 3. El dímero polipeptídico de la reivindicación 1 ó 2, en el que, además, el resto aminoacídico Leu234 de la región bisagra está remplazado por Phe o Ala.
- 4. El dímero polipeptídico de la reivindicación 3, en el que los restos aminoacídicos Leu234 y/o Gly237 de la región bisagra están remplazados por el resto aminoacídico Ala. 15
- 5. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la región bisagra comprende el motivo de secuencia de aminoácidos Ala234-Glu235-Gly236-Ala237 en lugar de Leu234-Leu235-Gly236-Gly237.
- 6. El dímero polipeptídico de la reivindicación 5, en el que la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos 20 Asp221-Lys222-Thr223-His224-Thr225-Cys226-Pr227-Pro228-Cys229-Pro230-Ala231-Pro232-Glu233-Ala234-Glu235-Gly236-Ala237-Pro238-Ser239-Val240.
- 7. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la molécula de gp130 soluble o variante o fragmento de la misma está fusionada directamente con la región bisagra del dominio Fc de la proteína IgG1 25 o mediante un enlazador polipeptídico flexible.
- 8. El dímero polipeptídico de la reivindicación 7, en el que el enlazador es un enlazador que comprende de 2 a 50 restos aminoacídicos seleccionados independientemente del grupo que consiste en glicina, serina, asparagina, treonina y alanina. 30
- 9. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que uno o más sitios de N-glucosilación están insertados entre la molécula, o variante o fragmento, de gp130 soluble y el dominio Fc.
- 10. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los monómeros están unidos entre 35 sí a través de un enlace covalente simple, un enlazador peptídico flexible o uno o más puentes disulfuro.
- 11. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que al menos un monómero de dicho dímero está PEGilado.40
- 12. Un polinucleótido que codifica un monómero del dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
- 13. Un vector de expresión que contiene un polinucleótido de la reivindicación 12.45
- 14. Una célula huésped que contiene un vector de expresión de la reivindicación 13.
- 15. Un procedimiento para producir el dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 14 y recuperar el monómero o dímero de dicha célula huésped o del cultivo. 50
- 16. Una composición farmacéutica que contiene un dímero polipeptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
- 17. Uso de un dímero polipeptídico como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la 55 preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de resorción ósea, hipercalcemia, caquexia, un tumor u otro tipo de cáncer, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o atópica, una infección, un trastorno endocrinológico o una enfermedad metabólica o catabólica.
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