ES2351783T3 - Preparaciones farmacéuticas y procedimientos para la inhibición de tumores. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC Nº: 5.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a preparaciones farmacéuticas (es decir, composición) para usar como agentes supresores de tumores para tumores que resultan de cánceres tales como adenocarcinoma prostático, cáncer de estómago, cáncer de mama, cánceres de endometrio y ovario e hiperplasia prostática benigna (HPB).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La glándula prostática, que se encuentra exclusivamente en mamíferos macho, produce varios componentes del semen y la sangre y varios péptidos reguladores. La glándula prostática comprende células del estroma y epiteliales, consistiendo el último grupo en células secretoras columnares y células no secretoras basa-les. Una proliferación de estas células basales así como de las células del estroma da lugar a la hiperplasia prostática benigna (HPB), que es una enfermedad prostática común. Otra enfermedad prostática común es el adenocarcinoma prostático (CaP), que es el más común de los cánceres prostáticos fisiopatológicos mortales, e implica una transformación maligna de las células epiteliales en la región periférica de la glándula prostática. El adenocarcinoma prostático y la hiperplasia prostática benigna son dos enfermedades prostáticas comunes, que tienen una alta tasa de incidencia en la población humana masculina que envejece. Aproximadamente 1 de cada 4 hombres por encima de 55 años de edad padecen una enfermedad prostática de una u otra forma. El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer más común en hombres mayores, con aproximadamente 96.000 casos diagnosticados y aproximadamente 26.000 muertes registradas anualmente en los Estados Unidos.

Los estudios de diferentes sustancias sintetizadas y secretadas por las próstatas normales, benignas y cancerosas, llevados a cabo con el fin de comprender la patogénesis de las diferentes enfermedades de próstata, ponen de manifiesto que algunas de estas sustancias se pueden usar como marcadores tumorales inmunohistoquímicos en el diagnóstico de la enfermedad prostática. Las 3 proteínas o polipéptidos predominantes secretadas por una glándula prostática normal son: (1) fosfatasa ácida prostática (PAP); (2) antígeno prostático específico (PSA); y (3) proteína secretora prostática de 94 aminoácidos (PSP94), que también se conoce como péptido inhibina prostática (PIP), inhibina del plasma seminal humano (HSPI), o β-microseminoproteína (β-MSP), y que se denomina en lo sucesivo PSP94.

La PSP94 es una proteína rica en cisteína no glicosilada sencilla, y constituye una de las tres proteínas predominantes encontradas en el fluido seminal humano junto con el antígeno prostático específico (PSA) y la fosfatasa ácida prostática (PAP). La PSP94 tiene un peso molecular de 10,7 kiloDaltons (kDa) y la secuencia de aminoácidos completa de esta proteína ya se ha determinado (ID SEC Nº: 1). Se ha clonado y caracterizado el ADNc y el gen para la PSP94 (Ulvsback, y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 164:1310, 1989; Green, y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 167:1184, 1990). Las técnicas inmunoquímicas y de hibridación in situ han mostrado que la PSP94 está localizada predominantemente en las células epiteliales prostáticas. Sin embargo, también está presente en una variedad de otras células epiteliales secretoras (Weiber, y col., Am. J. Pathol., 137:593, 1990). Se ha mostrado que la PSP94 es expresada en la línea celular del adenocarcinoma de próstata, LNCap (Yang, y col., J. Urol., 160:2240, 1998). También se ha observado un efecto inhibidor de la PSP94 exógena en el crecimiento de células tumorales tanto in vivo como in vitro (Garde, y col., Prostate, 22:225, 1993; Lokeshwar, y col., Cancer Res., 53:4855, 1993), que sugiere que la PSP94 podría ser un regulador negativo para el crecimiento del carcinoma de próstata por la interacción con receptores análogos en las células tumorales.

Se ha mostrado que la PSP94 nativa tiene una modalidad terapéutica en el tratamiento del cáncer de próstata refractario a la terapia hormonal (y potencialmente otras indicaciones prostáticas).

Estudios metabólicos e inmunohistoquímicos han mostrado que la próstata es la fuente principal de PSP94. La PSP94 está implicada en el control de la retroalimentación de, y actúa para suprimir la secreción de, la hormona folículo estimulante (FSH) en la circulación, tanto in vitro como in vivo en ratas macho adultas. La PSP94 actúa tanto en la hipófisis como en el sitio de la próstata, puesto que ambos están provistos de sitios receptores para la PSP94. Se ha demostrado que suprime la biosíntesis y la liberación de FSH de la hipófisis de rata así como que posiblemente afecta a la síntesis/secreción de un péptido de tipo FSH por la próstata. Estos descubrimientos sugieren que los efectos de la PSP-94 en el crecimiento tumoral in vivo, se podrían atribuir a la reducción de los niveles de FSH en el suero.

Tanto el PSA como la PAP se han estudiado como marcadores tumorales en la detección de la enfermedad prostática, pero aunque ambos presentan niveles elevados en la próstata con hiperplasia prostática benigna (HPB), ninguno de los marcadores es específico y por lo tanto tienen utilidad limitada.

Recientemente, se ha mostrado que las concentraciones de PSP94 en el suero de pacientes con BPH o CaP son significativamente mayores de lo normal. La concentración en el suero de PSP94 más alta observada en los hombres normales es aproximadamente 40 ng/ml, mientras que en los hombres con BPH o CaP, se han observado concentraciones en el suero de PSP94 en el intervalo de 300-400 ng/ml. Debido a que existe alguna superposición en las concentraciones de PSP94 en sujetos que tienen próstatas normales y pacientes que presentan BPH o CaP, los niveles en el suero de los mismos tiene poco valor.

Una terapia principal en el tratamiento del cáncer de próstata es la supresión de andrógenos. Aunque la mayoría de los pacientes responde inicialmente a este tratamiento, su eficacia disminuye a lo largo del tiempo, posiblemente debido a la presencia de una población heterogénea de células dependientes de andrógenos y células independientes de andrógenos frente al tratamiento de andrógenos, mientras que ninguna célula insensible a andrógenos seguiría proliferando de forma constante.

Otras formas de cáncer que actualmente se cobran un alto coste en la población son el cáncer de mama en mujeres y el cáncer del tracto gastrointestinal. Actualmente, el uso de diferentes fármacos para el cáncer tales como mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5-fluoro-uracilo, metotrexato, adriamicina y daunomicina, forma parte de la terapia para tratar dichos cánceres. Un inconveniente de dicho tratamiento terapéutico es la presencia de efectos secundarios adversos debido a los intervalos de concentración de los fármacos necesarios para el tratamiento eficaz.

Por consiguiente, sería ventajoso encontrar un medio más eficaz para detener el crecimiento de las células y tumores de cáncer de próstata, mama y gastrointestinal, que se puedan usar eficazmente tanto contra células sensibles a andrógenos como insensibles a andrógenos.

En un trabajo previo descrito en la patente de Estados Unidos No. 5.428.011, los autores de la invención proporcionaron preparaciones farmacéuticas (es decir, composiciones) de PSPS94 nativo de plasma seminal humano para inhibir tumores de próstata, gastrointestinal y de mama cancerosos in vitro e in vivo. Las preparaciones farmacéuticas incluían el PSPS94 nativo de plasma seminal humano que se podía administrar en una forma de dosificación, cantidad de dosificación y régimen de dosificación adecuados a un paciente que padecía cáncer de próstata. En otra realización, la preparación farmacéutica incluía una mezcla de PSPS94 de plasma seminal humano y un fármaco anticancerígeno que se podía administrar en una forma de dosificación, cantidad de dosificación y régimen de dosificación adecuados a un paciente que padecía, por ejemplo, cáncer gastrointestinal.

La PSP94 procedente de fluido seminal humano lleva consigo un riesgo significativo de contaminación con agentes infecciosos (p. ej., VIH, hepatitis (a, b o c), y otros virus y/o priones). Incluso con el uso de tratamiento químico severo, no se puede garantizar la erradicación total de dichos agentes. Además, el fluido seminal humano tiene un suministro limitado, haciendo que la producción a granel de la PSP94 sea muy difícil. Por lo tanto, la aceptabilidad de PSP94 de fuente humana o incluso xenógena puede ser muy difícil tanto para las autoridades reguladoras como para el mercado.

Por lo tanto, el uso de tecnología recombinante para producir la PSP94 representaría un avance significativo, ya que la PSP94 recombinante se podría producir tanto libre de patógenos como en un suministro ilimitado. Además, el material sería homogéneo de una fuente de un solo lote, evitando la variación de lotes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En su primer aspecto la presente invención se refiere a un polipéptido como se expone en el ID SEC Nº:

5.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido como se expone en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145) para utilizar en la inhibición del crecimiento de un tumor y más precisamente para utilizar en la inhibición del crecimiento de adenocarcinoma prostático, cáncer de estómago, cáncer de mama, endometrio, ovárico u otros cánceres de secreción epitelial, o la hiperplasia prostática benigna (HPB).

En una realización del segundo aspecto de la presente invención, el polipéptido se puede usar con un fármaco anticancerígeno, tal como, por ejemplo, mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5-fluorouracilo, metotrexato, adriamicina, daunomicina, taxol (es decir, paclitaxel), derivado de taxol (p. ej., docetaxel, taxano), y mezclas de los mismos.

En una realización adicional del segundo aspecto de la presente invención, el polipéptido se puede usar con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización adicional del segundo aspecto de la presente invención, el polipéptido se puede usar con un medio de liberación en el tiempo, tal como, por ejemplo, liposomas y polisacáridos para realizar la dosificación continua de dicho polipéptido o análogo de polipéptido.

En otras realizaciones del segundo aspecto de la presente invención, el polipéptido se puede usar con un fármaco anticancerígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable, con un fármaco anticancerígeno y un medio de liberación en el tiempo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable y un medio de liberación en el tiempo, o con un fármaco anticancerígeno, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un medio de liberación en el tiempo. En el presente documento se describen algunos ejemplos de un fármaco anticancerígeno, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un medio de liberación en el tiempo.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para utilizar en la inhibición de (p. ej., reducir, controlar, atenuar, impedir) el crecimiento de un tumor en un paciente que padece un adenocarcinoma prostático, cáncer de estómago, cáncer de mama, endometrio, ovárico u otros cánceres de secreción epitelial, o la hiperplasia prostática benigna (HPB), que comprende:

a) un polipéptido como se expone en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145), y; b) un fármaco anticancerígeno tal como, por ejemplo, mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5

fluorouracilo, metotrexato, adriamicina, daunomicina, taxol, derivado de taxol y mezclas de los mismos.

En una realización del tercer aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un medio de liberación en el tiempo tal como, por ejemplo, liposomas y polisacáridos para realizar la dosificación continua de la composición.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para usar para inhibir el crecimiento de un tumor en un paciente que padece un adenocarcinoma prostático, cáncer de estómago, cáncer de mama, endometrio, ovárico u otros cánceres de secreción epitelial, o la hiperplasia prostática benigna (HPB), que comprende:

a) un polipéptido como se expone en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145), y; b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización del cuarto aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un medio de liberación en el tiempo tal como, por ejemplo, liposomas y polisacáridos para realizar la dosificación continua de la composición.

En una segunda realización del cuarto aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un fármaco anticancerígeno tal como, por ejemplo, mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5-fluorouracilo, metotrexato, adriamicina, daunomicina, taxol, derivado de taxol y mezclas de los mismos.

En una tercera realización del cuarto aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un medio de liberación en el tiempo y un fármaco anticancerígeno. En el presente documento se describen ejemplos de medios de liberación en el tiempo y fármaco anticancerígeno.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende:

a) un polipéptido como se expone en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145), en una cantidad terapéuticamente eficaz y;

b) un fármaco anticancerígeno tal como, por ejemplo, mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5fluorouracilo, metotrexato, adriamicina, daunomicina, taxol, derivado de taxol y mezclas de los mismos, en una cantidad terapéuticamente eficaz.

En una realización del quinto aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un medio de liberación en el tiempo tal como, por ejemplo, liposomas y polisacáridos para realizar la dosificación continua de la composición.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende:

a) un polipéptido como se expone en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145), en una cantidad terapéuticamente eficaz, y; b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización del sexto aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un medio de liberación en el tiempo tal como, por ejemplo, liposomas y polisacáridos para realizar la dosificación continua de la composición.

En una segunda realización del sexto aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un fármaco anticancerígeno tal como, por ejemplo, mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5-fluorouracilo, metotrexato, adriamicina, daunomicina, taxol, derivado de taxol y mezclas de los mismos.

En una tercera realización del sexto aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede comprender además un medio de liberación en el tiempo y un fármaco anticancerígeno. En el presente documento se describen ejemplos de medios de liberación en el tiempo y fármaco anticancerígeno.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido como se expone en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145), para usar en el tratamiento de pacientes con una enfermedad caracterizada por niveles elevados de FSH.

El polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 5 puede estar presente como una mezcla de polipéptidos, seleccionándose el o los otros polipéptidos del grupo que consiste en rHuPSP94 expuesto en el ID SEC Nº: 2, el decapéptido expuesto en el ID SEC Nº: 3, el polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 4 (polipéptido 7-21), el polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 6 (polipéptido 76-94), un análogo de polipéptido de al menos 5 aminoácidos contiguos del ID SEC Nº: 2, del ID SEC Nº: 3, del ID SEC Nº: 4, del ID SEC Nº: 5, o del ID SEC Nº: 6, un análogo de polipéptido de al menos 2 aminoácidos contiguos del ID SEC Nº: 2, del ID SEC Nº: 3, del ID SEC Nº: 4, del ID SEC Nº: 5, o del ID SEC Nº: 6, un análogo de polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos X1 W Q X2 D X2 C X1 X2 C X2 C X3 X1 X2 expuesto en el ID SEC Nº: 89, en el que X1 es ácido glutámico (Glu), asparagina (Asn) o ácido aspártico (Asp), X2 es treonina (Thr) o serina (Ser), y X3 es tirosina (Tyr) o fenilalanina (Phe), un análogo de polipéptido que comprende el ID SEC Nº: 5 y que tiene una adición de al menos un aminoácido en su extremo amino, en el que dicho análogo de polipéptido que comprende el ID SEC Nº:5 se selecciona del grupo que consta del ID SEC Nº: 59 al ID SEC Nº: 88, un análogo de polipéptido que comprende el ID SEC Nº: 5 y que tiene una adición de al menos un aminoácido en su extremo carboxi, en el que dicho análogo de polipéptido que comprende el ID SEC Nº:5 se selecciona del grupo que consta del ID SEC Nº: 10 al ID SEC Nº: 58, un análogo de polipéptido que comprende de 2 a 50 unidades del ID SEC Nº: 5, un análogo de polipéptido que comprende de 2 a 10 unidades del ID SEC Nº: 5, un análogo de polipéptido que consiste en una secuencia de 2 a 14 unidades de aminoácidos, en la que las unidades de aminoácidos se seleccionan del grupo de unidades de aminoácidos del ID SEC Nº: 5 que consiste en ácido glutámico (Glu), triptófano (Trp), glutamina (Gln), treonina (Thr), ácido aspártico (Asp), asparagina (Asn), cisteína (Cys), o tirosina (Tyr), un análogo de polipéptido que tiene al menos 90% de su secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC Nº: 5, un análogo de polipéptido que tiene al menos 70% de su secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC Nº: 5, y un análogo de polipéptido que tiene al menos 50% de su secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC Nº: 5.

De acuerdo con la presente invención, el polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 5, se puede usar en un intervalo de dosificación de aproximadamente 100 nanogramos/kg/día a aproximadamente 4 miligramos/kg/día.

El fármaco anticancerígeno se puede mezclar o no con el polipéptido o se puede dar por separado, por una vía diferente, o incluso con un plan de administración diferente (p. ej., una hora o día diferente).

La administración de la composición se puede realizar por cualquier vía adecuada que incluye la administración por inyección, por vía intramuscular (IM), subcutánea (SC), intradérmica (ID), intravenosa (IV) o intraperitoneal (IP) o administración en las membranas mucosas incluyendo membranas de la cavidad oral y nasal, usando cualquier medio adecuado.

De acuerdo con la presente invención, la composición se puede usar en un procedimiento para tratar el cáncer gastrointestinal.

Se sabe en la materia, que el polipéptido de la presente invención se puede hacer de acuerdo con procedimientos presentes en la materia. El polipéptido de la presente invención se puede preparar, por ejemplo, a partir de extractos de células bacterianas o mediante el uso de técnicas recombinantes. El polipéptido de la presente invención se puede producir, por ejemplo, por transformación (transfección, transducción o infección) de una célula huésped con la secuencia de ADN que codifica el polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145) en un vehículo de expresión adecuado. Los ejemplos de vehículos de expresión adecuados comprenden, por ejemplo, plásmidos, partículas víricas, cromosomas artificiales y fagos. El vehículo de expresión entero o una parte del mismo, se puede integrar en el genoma de la célula huésped. En algunas circunstancias, es conveniente usar un vector de expresión inducible.

Se puede usar cualquiera de una amplia variedad de sistemas de expresión para proporcionar la proteína recombinante. La célula huésped precisa usada no es crítica para la invención. El polipéptido de la presente invención se puede producir en un huésped procariota (p. ej., E. coli o B. subtilis) o en un huésped eucariota (levadura, p. ej., Saccharomyces o Pichia Pastoris; células de mamífero, p. ej., células COS de mono, células 3T3 de ratón (Todaro GJ y Green H., J. Cell Bill. 17: 299-313, 1963), células de ovario de hámster chino (CHO) (Puck TT y col., J. Exp. Med. 108: 945-956, 1958), BHK, células 293 de riñón humano (ATCC: CRL-1573), o células HeLa humanas (ATCC: CCL-2); o células de insecto).

En un sistema de expresión de células de levadura como Pichia Pastoris (P. Pastoris), la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la presente invención se puede clonar en un vector de expresión adecuado tal como el vector pPIC9 (Invitrogen). Tras la introducción de un vector que contiene la secuencia de ADN que codifica todo o parte del polipéptido de la presente invención en las células huésped de P. Pastoris, el suceso de recombinación se puede producir, por ejemplo, en el locus AOX1. Dicho suceso de recombinación puede poner la secuencia de ADN del polipéptido de la presente invención bajo la dependencia del promotor del gen AOX1. La inserción satisfactoria de un gen (secuencia de ADN) que codifica el polipéptido de la presente invención, puede dar como resultado una expresión del polipéptido que es regulada y/o inducida por metanol añadido al medio de crecimiento de la célula huésped (para referencias, veáse Buckholz, R.G. y Gleeson, M.A.G., Biotechnology, 9:1067-1072,1991; Cregg, J.M., y col., Biotechnology, 11:905-910, 1993; Sreekrishna, K., y col., J. Basic Microbiol., 28:265-278, 1988; Wegner, G.H., FEMS Microbiology Reviews, 87:279-284, 1990).

En células huésped de mamífero, se puede usar una serie de sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en el caso en el que se use un adenovirus como un vector de expresión para el polipéptido de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico puede estar ligada a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus (p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita). Este gen quimérico se puede insertar en el genoma de adenovirus, por ejemplo, por recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma vírico (p. ej., región E1 o E3) puede dar como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el polipéptido de la presente invención en huéspedes infectados.

El polipéptido de la presente invención también puede ser producido por células de plantas. Se pueden usar vectores de expresión tales como el virus del mosaico de la coliflor y el virus del mosaico del tabaco y vectores de expresión plasmídicos (p. ej., plásmido Ti) para la expresión del polipéptido en células de plantas. Dichas células están disponibles en una amplia variedad de fuentes (p. ej., la American Type Culture Collection, Rockland, Md.). Los procedimientos de transformación o transfección y la elección del vehículo de expresión deben elegirse, por supuesto, de acuerdo con la célula huésped seleccionada.

En un sistema de expresión de células de insecto tal como el virus de poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), que crece en células de Spodoptera frugiperda, el AcNPV se puede usar como un vector para expresar genes extraños. Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la presente invención se puede clonar en regiones no esenciales del virus (por ejemplo, el gen de la poliedrina) y ponerlo bajo el control de un promotor de AcNPV (p. ej., el promotor de la poliedrina). La inserción satisfactoria de un gen (es decir, secuencia de ADN) que codifica el polipéptido de la presente invención puede dar como resultado la inactivación del gen de la poliedrina y la producción del virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carecen de recubrimiento proteínico codificado por el gen de la poliedrina). Estos virus recombinantes se pueden usar para infectar células de spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado.

Además, una célula huésped se puede elegir por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas, o para modificar o procesar el producto génico de una forma deseada y específica. Dichas modificaciones (p. ej., glicosilación) y procesamientos (p. ej., escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células huésped tienen mecanismos específicos y característicos para el procesamiento y modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Por supuesto, las líneas celulares o sistemas huésped se pueden escoger para asegurar la modificación y procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden usar células huésped eucariotas que tienen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamífero comprenden, por ejemplo, pero sin limitar, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 y 3T3.

Alternativamente, el polipéptido de la presente invención puede ser producido por una línea celular de mamífero transfectada de forma estable. Están disponibles al público una serie de vectores adecuados para la transfección estable de células de mamífero; también están disponibles al público procedimientos para la construcción de dichas líneas celulares.

La integración del plásmido y, por lo tanto, la secuencia de ADN del polipéptido de la presente invención, en el cromosoma de la célula huésped se puede seleccionar incluyendo metotrexato en el medio de cultivo de la célula. Esta selección se puede llevar a cabo en la mayoría de los tipos de células.

También pueden ser necesarias señales de inicio específicas para la traducción eficaz de las secuencias de ADN insertadas en un vehículo de expresión adecuado como se ha descrito antes. Estas señales pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Por ejemplo, en el caso de que el gen o los polipéptidos que codifican el ADNc de la presente invención no pudieran tener su propio codón de inicio y secuencias adyacentes, pueden ser necesarias señales de control de la traducción adicionales. Por ejemplo, pueden ser necesarias señales de control de la traducción exógenas, incluyendo, quizás, el codón de inicio ATG. Se sabe en la técnica que el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de polipéptido para asegurar la traducción adecuada del polipéptido deseado. Las señales de control de la traducción y los codones de inicio exógenos pueden ser de una variedad de orígenes, incluyendo tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción adecuados, terminadores de la transcripción.

Como puede apreciarse, se puede hacer una serie de modificaciones del polipéptido de la presente invención, sin afectar de forma perjudicial a la actividad biológica del polipéptido. El polipéptido de la presente invención comprende, por ejemplo, los polipéptidos que contienen secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o por técnicas de modificación química que son conocidas en la materia. Las modificaciones pueden producirse en cualquier sitio en el polipéptido incluyendo la cadena principal del polipéptido, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremo amino o carboxi. Se apreciará, que puede estar presente el mismo tipo de modificación con el mismo grado o distinto en diferentes sitios del polipéptido. Además, el polipéptido puede contener muchos tipos de modificaciones. El polipéptido puede ser ramificado como resultado de la ubiquitinación, y puede ser cíclico, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser resultado de procesos postraduccionales naturales o pueden hacerse por procedimientos sintéticos. Las modificaciones comprenden, por ejemplo, sin limitación, acetilación, acilación, adición de grupo acetamidometilo (Acm), ADP-ribosilación, amidación, unión covalente a flavina, unión covalente a un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatiidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formulación, gama-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por transferencia de ARN tal como arginilación y ubiquitinación (para referencias, véase “Protein-structure and molecular properties”, 2ª Ed.,

T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New-York, 1993).

DEFINICIONES

Biología molecular general

Salvo que se indique otra cosa, las técnicas de ADN recombinante usadas en la presente invención son procedimientos estándar, conocidos para los expertos en la materia. Se explican ejemplos de dichas técnicas en la bibliografía en fuentes tales como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel y col. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora) y se incorporan en el presente documento por referencia.

“Polinucleótido” se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificados, o ARN o ADN modificados. Los “polinucleótidos” incluyen, sin limitación ADN mono o bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias, o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, “polinucleótido” se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido también incluye ADN y ARN que contienen una o más bases modificadas y ARN y ADN con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones. Las bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases no habituales tales como la inosina. Se ha hecho una variedad de modificaciones en el ADN y ARN; por lo tanto, “polinucleótido” abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de los polinucleótidos encontrados normalmente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. “Polinucleótido” incluye, pero sin limitar, moléculas lineales y cerradas por los extremos. El “polinucleótido” también abarca polinucleótidos relativamente cortos, a menudo denominados oligonucleótidos.

“Polipéptidos” se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados (es decir, isósteros peptídicos). “Polipéptido” se refiere tanto a cadenas cortas, normalmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas denominadas en general proteínas. Como se ha descrito antes, los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes.

Como se usa en el presente documento, la expresión “análogo de polipéptido” se refiere a mutantes, variantes, quimeras, fusiones, deleciones, adiciones y cualquier otro tipo de modificaciones hechas con respecto a un polipéptido dado.

Como se usa en el presente documento, el término secuencia “homóloga” se refiere a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos derivada de la secuencia de ADN o polipéptido de rHuPSP94.

Como se usa en el presente documento, el término secuencia “heteróloga” se refiere a la secuencia de ADN o aminoácidos de un polipéptido heterólogo e incluye una secuencia distinta a la de la PSP94.

Como se usa en el presente documento, el término “tumor” se refiere a tumores sólidos y no sólidos, tumores metastáticos o no metastáticos, tumores de diferente origen tisular incluyendo, pero sin limitar, tumores que se originan en el hígado, pulmón, cerebro, nódulos linfáticos, médula ósea, glándula suprarrenal, mama, colon, páncreas, próstata, estómago, tracto reproductor (cuello de útero, ovario, endometrio, etc.). El término “tumor” como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos cancerosos y precancerosos.

Como se usa en el presente documento, el término “polisacárido” se refiere a una sustancia hecha de dos o más unidades de sacáridos y comprende, por ejemplo, quitosán, pectina, sulfato de condroitina, ciclodextrina, dextranos, goma de guar, inulina, amilosa y goma de algarrobilla.

Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ADN o ARN que se replica de forma autónoma en la que se han insertado fragmentos de ADN o ARN extraños y después se propagan en una célula huésped para la expresión o amplificación de la molécula de ADN o ARN extraña. El término “vector” comprende y no se limita a un plásmido (p. ej., linearizado o no) que se puede usar para transferir secuencias de ADN de un organismo a otro.

Como se usa en el presente documento, la expresión “medio de encapsulación de liberación en el tiempo” se refiere a la liberación controlada o sostenida obtenida cuando una composición farmacéutica se formula, por ejemplo, con polisacáridos, polímeros biocompatibles, otras matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones de bolo, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, liposferas, polvos secos o sistemas de suministro transdérmico. Otras composiciones de liberación controlada de la presente invención incluyen líquidos que, tras la administración a un mamífero, forman un sólido o un gel in situ. Además, el “medio de encapsulación de liberación en el tiempo” o “medio de liberación en el tiempo” comprende una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de poli(ácido láctico) y poli(ácido glicólico), poli(epsilon-caprolactona), poli(ácido hidroxibutírico), poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos, y copolímeros de bloques entrecruzados o anfipáticos de hidrogeles.

Como se usa en el presente documento, la expresión “composición farmacéutica” significa cantidades terapéuticamente eficaces del agente junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” como se usa en el presente documento, se refiere a aquella cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección y régimen de administración dados. Dichas composiciones son formulaciones líquidas o liofilizadas o secadas de otra forma, e incluyen diluyentes de diferentes contenidos de tampón (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a superficies, detergentes (p. ej., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares). Agentes solubilizantes (p. ej., glicerol, polietilenglicerol), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (p. ej., timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias de volumen o modificadores de la tonicidad (p. ej., lactosa, manitol), unión covalente a la proteína de polímeros tales como polietilenglicol, formación de complejos con iones metálicos, o incorporación del material en o sobre preparaciones en partículas de compuestos polímeros tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc., o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo, y tasa de eliminación in vivo. Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen la formulación en depósitos lipofílicos (p. ej., ácidos grasos, ceras, aceites). También se incluyen en la invención las composiciones en partículas recubiertas con polímeros (p. ej., poloxámeros o poloxaminas). Otras realizaciones de las composiciones de la invención incorporan recubrimientos protectores de formas en partículas, inhibidores de proteasa o potenciadores de la permeación para diferentes vías de administración, incluyendo las vías parenteral, pulmonar, nasal y oral. En una realización la composición farmacéutica se administra por vía parenteral, paracanceral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, intracraneal e intratumoral.

Además, como se usa en el presente documento el “vehículo farmacéuticamente aceptable” o “vehículo farmacéutico” se conoce en la materia e incluye, pero sin limitar, tampón de fosfato 0,01-0,1 M y preferiblemente 0,05 M o disolución salina al 0,8%. Además, dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones de alcohol/acuosas, incluyendo disolución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluido y nutrientes, reabastecedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes intercalantes, gases inertes y similares.

Mutantes, variantes y proteínas análogas

Los polipéptidos mutantes tendrán una o más mutaciones, que son deleciones (p. ej., truncados), inserciones (p. ej., adiciones) o sustituciones de restos de aminoácidos. Los mutantes pueden ser naturales (es decir, purificados o aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, llevando a cabo mutagénesis dirigida en el ADN codificante o hechos por otros procedimientos sintéticos tales como síntesis química). Por lo tanto, es evidente que los polipéptidos de la invención pueden ser naturales o recombinantes (es decir, preparados a partir de técnicas de ADN recombinante).

Una proteína al menos 50% idéntica, determinado por procedimientos conocidos para el experto en la materia (por ejemplo, los procedimientos descritos por Smith, T.F. y Waterman M.S. (1981) Ad. Appl. Math., 2:482-489, o Needleman, S.B. y Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol., 48: 443-453), a los polipéptidos de la presente invención, está incluida en la invención, como lo están las proteínas al menos 70% u 80% y más preferiblemente al menos 90% idénticas a la proteína de la presente invención. Esto será en general a lo largo de una región de al menos 5, preferiblemente al menos 20 aminoácidos contiguos.

“Variante” como se usa el término en el presente documento, es un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido de referencia respectivamente, pero retiene las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o pueden no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncados de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute en el presente documento. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. En general, las diferencias están limitadas, de modo que la secuencia del polipéptido de referencia y de la variante son muy similares en general, y en muchas regiones idénticas. Un polipéptido variante y uno de referencia pueden diferir en aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones o cualquier combinación de estos. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede ser o no uno codificado por el código genético. Un polinucleótido o polipéptido variante puede ser uno natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce en la naturaleza. Las variantes no naturales de los polinucleótidos y polipéptidos se pueden hacer por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.

Las variantes de secuencia de aminoácidos se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos adecuados en el ADN, o por síntesis in vitro del polipéptido deseado. Dicha variante incluye, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de restos dentro de la secuencia de aminoácidos. Se puede hacer una combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, con la condición de que el producto de proteína final tenga las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales tal como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación, alterando las características de anclaje de la membrana, alterando la situación intracelular por inserción, deleción o afectando de otra forma a la secuencia transmembrana de la proteína nativa, o modificando su susceptibilidad a la escisión proteolítica.

Hay que entender en el presente documento, que si se menciona un “intervalo” o “grupo” de sustancias

(p. ej., aminoácidos), “sustituyentes” o similar, o si se mencionan otros tipos de características particulares (p. ej., temperatura, presión, estructura química, tiempo, etc.), la presente invención se refiere e incorpora explícitamente en el presente documento, todos y cada uno de los miembros específicos y la combinación de subintervalos o subgrupos de los mismos posibles. Por lo tanto, cualquier intervalo o grupo especificado debe entenderse como un modo abreviado para referirse a todos y cada uno de los miembros de un intervalo o grupo individualmente, así como a todos y cada uno de los posibles subintervalos o subgrupos abarcados en la misma; y lo mismo con respecto a los subintervalos o subgrupos del mismo. Así, por ejemplo,

-con respecto a una presión mayor que la atmosférica, debe entenderse que se incorporan específica-mente en el presente documento todos y cada uno de los estados de presión individuales, así como los subintervalos, por encima de la presión atmosférica, tal como por ejemplo, 1,17 kg/cm2 (2 psig), 1,38 kg/cm2 (5 psig), 2,44 kg/cm2 (20 psig), 3,53 kg/cm2 (35,5 psig), de 1,38 a 1,60 kg/cm2 (5 a 8 psig), 1,38 a 3,49 kg/cm2 (5 a 35 psig), de 1,74 a 2,80 kg/cm2 (10 a 25 psig), 2,44 a 3,85 kg/cm2(20 a 40 psig), de 3,49 a 4,55 kg/cm2 (35 a 50 psig), de 1,17 a 8,06 kg/cm2 (2 a 100 psig), etc.;

-con respecto a una temperatura superior a 100ºC, debe entenderse que se incorpora específicamente en el presente documento todos y cada uno de los estados de temperatura individuales, así como los subintervalos, por encima de 100ºC, tales como por ejemplo 101ºC, 105ºC y superior, 110ºC y superior, 115ºC y superior, 110 a 135ºC, 115ºC a 135ºC, 102ºC a 150ºC, hasta 210ºC, etc.;

-con respecto a una temperatura inferior a 100ºC, debe entenderse que se incorpora específicamente en el presente documento todos y cada uno de los estados de temperatura individuales, así como los subintervalos, inferiores a 100ºC, tales como por ejemplo 15ºC y superior, de 15ºC a 40ºC, de 65ºC a 95ºC, 95ºC e inferior, etc.;

-con respecto al tiempo de permanencia o de reacción, un tiempo de 1 minuto o más debe entenderse que se incorpora específicamente en el presente documento todos y cada uno de los tiempos individuales, así como los subintervalos, por encima de 1 minuto, tales como por ejemplo 1 minuto, de 3 a 15 minutos, de 1 minuto a 20 horas, de 1 a 3 horas, 16 horas, de 3 horas a 20 horas etc.;

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que consta de al menos dos aminoácidos contiguos de una secuencia particular, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales, tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 1 y 2, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 2 y 3, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 3 y 4, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 6 y 7, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 9 y 10, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 36 y 37, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 93 y 94, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que consta de al menos 5 aminoácidos contiguos de una secuencia particular, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales, tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 1 a 5, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 2 a 6, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 3 a 7, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 6 a 10, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 9 a 13, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 36 a 40, un análogo de polipéptido que consta de los aminoácidos 90 a 94, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que comprende una secuencia particular y que tiene la adición de al menos un aminoácido en su extremo amino, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales, tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que tiene una adición de un aminoácido en su extremo amino, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 2 aminoácidos en su extremo amino, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 3 aminoácidos en su extremo amino, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 10 aminoácidos en su extremo amino, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 18 aminoácidos en su extremo amino, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 40 aminoácidos en su extremo amino, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 200 aminoácidos en su extremo amino, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que comprende una secuencia particular y que tiene la adición de al menos un aminoácido en su extremo carboxi, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales, tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 1 aminoácido en su extremo carboxi, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 2 aminoácidos en su extremo carboxi, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 5 aminoácidos en su extremo carboxi, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 20 aminoácidos en su extremo carboxi, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 53 aminoácidos en su extremo carboxi, un análogo de polipéptido que tiene una adición de 300 aminoácidos en su extremo carboxi, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que comprende de 2 a 50 unidades de una secuencia particular, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales, tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que comprende 2 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 3 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 6 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 13 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 35 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 50 unidades de esa secuencia particular, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que comprende de 2 a 10 unidades de una secuencia particular, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales, tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que comprende 2 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 3 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 4 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 5 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 6 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 7 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 8 unidades de esa secuencia particular, un análogo de polipéptido que comprende 9 unidades de esa secuencia particular, y un análogo de polipéptido que comprende 10 unidades de esa secuencia particular.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que consiste en una secuencia de 2 a 14 unidades de aminoácidos, en los que las unidades de aminoácidos se seleccionan del grupo de unidades de aminoácidos del ID SEC Nº: 5 que consiste en ácido glutámico (Glu), triptófano (Trp), glutamina (Gln), treonina (Thr), ácido aspártico (Asp), asparagina (Asn), cisteína (Cys) o tirosina (Tyr), debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales, tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido de 2 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son secuencialmente Glu y Trp, un análogo de polipéptido de 2 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son secuencialmente Trp y Glu, un análogo de polipéptido de 3 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son secuencialmente Trp, Glu, Trp, un análogo de polipéptido de 3 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son secuencialmente Trp, Trp, Trp, un análogo de polipéptido de 3 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son secuencialmente Glu, Glu, Trp, un análogo de polipéptido de 3 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Tyr, Asp, Glu, un análogo de polipéptido de 3 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Thr, Asp, Asn, un análogo de polipéptido de 3 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Thr, Thr, Asn, un análogo de polipéptido de 4 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Glu, Gln, Cys, Asn, un análogo de polipéptido de 4 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Gln, Gln Cys, Trp, un análogo de polipéptido de 4 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, Cys, Cys, Cys, Cys, un análogo de polipéptido de 14 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Asn, Asp, Glu, Gln, Trp, Cys, Tyr, Thr, Thr, Asp, Asn, Gln, Thr, Cys, un análogo de polipéptido de 14 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Asp, Asp, Asp, Asp, Trp, Cys, Cys, Trp, Thr, Thr, Thr, Thr, Thr, Cys, un análogo de polipéptido de 14 unidades de aminoácidos en el que los aminoácidos son, independientemente del orden, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, Tyr, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que tiene al menos 90% de su secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos particular, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales (excluyendo 100%), tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que tiene 90% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 91% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 93% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 97% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 99% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que tiene al menos 70% de su secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos particular, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales (excluyendo 100%), tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que tiene 70% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 71% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 73% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 88% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 97% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 99% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, etc.

-con respecto a los polipéptidos, un análogo de polipéptido que tiene al menos 50% de su secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos particular, debe entenderse que incorpora específicamente todas y cada una de las posibilidades individuales (excluyendo 100%), tales como por ejemplo, un análogo de polipéptido que tiene 50% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 51% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 54% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 66% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 70% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 79% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 82% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, un análogo de polipéptido que tiene 99% de su secuencia de aminoácidos idéntica a esa secuencia de aminoácidos particular, etc.

y de forma similar con respecto a otros parámetros tales como presiones bajas, concentraciones, elementos,

etc… Debe entenderse también en el presente documento que “g” es una referencia a la unidad de peso el

gramo; que “C” es una referencia a la unidad de temperatura Celsius; y “kg/cm2” es una referencia a “kilogramos

por centímetro cuadrado”.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

la fig. 1

representa el análisis por espectrometría de masas del polipéptido 7-21 (ID SEQ Nº: 4);

la fig. 2

representa el análisis por espectrometría de masas del polipéptido PCK3145 (ID SEQ Nº: 5);

la fig. 3

representa el análisis por espectrometría de masas del polipéptido 76-94 (ID SEQ Nº: 6);

la fig. 4a

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro del decapéptido del ID SEC Nº: 3 en

células PC-3 después de 9 días de cultivo;

la fig. 4b

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de PSP94 nativa (nPSP94) en células

PC-3 después de 9 días de cultivo;

la fig. 5a

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro del decapéptido del ID SEC Nº: 3 en

células PC-3 después de 21 días de cultivo;

la fig. 5b

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de PSP94 nativa (nPSP94) en células

PC-3 después de 21 días de cultivo;

la fig. 6a

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro del decapéptido del ID SEC Nº: 3 en

células PC-3 después de 10 días de cultivo;

la fig. 6b

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de PSP94 nativa (nPSP94) en células

PC-3 después de 10 días de cultivo;

la fig. 7

representa un gel que muestra la fragmentación del ADN después del tratamiento de células PC-3

con el polipéptido PCK3145 expuesto en el ID SEC Nº: 5;

la fig. 8

es una gráfica que representa los resultados de un ensayo de apoptosis con un kit de ELISA plus

después de tratamiento con el polipéptido de células PC-3 durante 72 horas con diferentes concen

-16

traciones del polipéptido 7-21 (ID SEC Nº: 4), polipéptido PCK3145 (ID SEC Nº: 5), polipéptido 76-94

(ID SEC Nº: 6) o PSP94 nativo (ID SEC Nº: 1);

la fig. 9

es una gráfica que representa el crecimiento de células fibroblastos in vitro cuando se exponen duran

te 72 horas a diferentes concentraciones de PSP94 nativo (nPSP94) (ID SEC Nº: 1) o diferentes con

centraciones de rHuPSP94 (ID SEC Nº: 2) o polipéptido 7-21 (ID SEC Nº: 4), polipéptido PCK3145

(ID SEC Nº: 5), o polipéptido 76-94 (ID SEC Nº: 6);

la fig. 10

es una gráfica que representa el efecto del polipéptido 7-21 (ID SEC Nº: 4), polipéptido PCK3145 (ID

SEC Nº: 5), polipéptido 76-94 (ID SEC Nº: 6), y polipéptido 61-75 en el crecimiento in vitro de células

PC-3 después de 72 horas;

la fig. 11

es una gráfica que representa el efecto del polipéptido 22-36 y polipéptido PCK3145 (ID SEC Nº: 5)

en el crecimiento in vitro de células PC-3 después de 72 horas;

la fig. 12

es una gráfica que representa los resultados del estudio nº MLL-1 en la validación de la eficacia

antitumoral de rHuPSP94 (rPSP94) (ID SEC Nº: 2) contra el tumor Mat LyLu (MLL) implantado en ra

tones sin sistema inmune;

la fig. 13

es una gráfica que representa los resultados del estudio nº MLL-2 en la validación de la eficacia

antitumoral de rHuPSP94 (rPSP94) (ID SEC Nº: 2) contra el tumor Mat LyLu (MLL) implantado en ra

tones sin sistema inmune;

la fig. 14

es una gráfica que representa el volumen del tumor (reducción del crecimiento del tumor) en ratones

sin sistema inmune tratados con rHuPSP94;

la fig. 15

es una gráfica que representa el volumen del tumor (reducción del crecimiento del tumor) en ratones

sin sistema inmune tratados con el decapéptido (ID SEC Nº: 3);

la fig. 16

es una gráfica que representa el volumen del tumor (reducción del crecimiento del tumor) en ratones

tratados con el polipéptido desordenado (PB111);

la fig. 17

es una gráfica que representa el volumen del tumor (reducción del crecimiento del tumor) en ratones

tratados con PSP94 nativa (nPSP99);

la fig. 18

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) en células

PC-3, después de un tratamiento de 72 horas, medido por el ensayo de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)

5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna);

la fig. 19

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de PSP94 nativo (ID SEC Nº: 1) y

PCK3145 (ID SEC Nº: 5) (calidad GMP) en células PC-3, después de 48 horas de tratamiento, medi

do por el ensayo de MTS;

la fig. 20

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) (calidad

GMP) en células PC-3 (ATCC), después de 72 horas de tratamiento, medido por el ensayo de MTS;

la fig. 21

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) (calidad

GMP) en células PC-3 (ATCC), después de 48 ó 72 horas de tratamiento, medido por el ensayo de

MTS;

la fig. 22

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro del decapéptido expuesto en el ID SEC

Nº: 3, polipéptido 7-21 expuesto en el ID SEC Nº: 4, polipéptido PCK3145 expuesto en el ID SEC Nº:

5, o polipéptido 76-94 expuesto en el ID SEC Nº: 6 en células PC-3, medido por el ensayo de absor

ción de [3H]-timidina;

la fig. 23

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro del decapéptido expuesto en el ID SEC

Nº: 3, polipéptido 7-21 expuesto en el ID SEC Nº: 4, polipéptido PCK3145 expuesto en el ID SEC Nº:

5, o polipéptido 76-94 expuesto en el ID SEC Nº: 6 en células PC-3, medido por el ensayo de absor

ción de [3H]-timidina;

la fig. 24

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vitro de la PSP94 nativa (ID SEC Nº: 1) en

células PC-3 después de 72 horas de tratamiento, medido por el ensayo de absorción de [3H]

timidina.

la fig. 25

representa un gel que muestra la fragmentación del ADN después de tratamiento de células PC-3 con

PCK3145 (ID SEC Nº: 5) o doxorrubicina;

la fig. 26

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vivo de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) (0,1

µg/kg/día y 10 µg/kg/día) frente al tumor PC-3 humano xenoinjertado en ratones sin sistema inmune;

la fig. 27

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vivo de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) (de 10

µg/kg/día a 1000 µg/kg/día, administrados por vía intravenosa o intraperitoneal) frente al tumor PC-3

humano xenoinjertado en ratones sin sistema inmune;

la fig. 28

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vivo del polipéptido 7-21 (ID SEC Nº: 4),

PCK3145 (ID SEC Nº: 5) o polipéptido 76-94 (ID SEC Nº: 6), administrado en dosis 1 µg/kg/día o 10

µg/kg/día, en ratas Copenhagen a las que se han implantado tumores Dunning Mat LyLu;

la fig. 29

es una gráfica que representa la actividad inhibidora in vivo de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) o el polipép

tido desordenado administrados en dosis de 10 µg/kg/día o 100 µg/kg/día, en ratas Copenhagen a las

que se han implantado tumores Dunning Mat LyLu;

la fig. 30

es una gráfica que representa el peso del tumor el día 18 después del tratamiento con PCK3145 (ID

SEC Nº: 5) o el polipéptido desordenado (10 µg/kg/día o 100 µg/kg/día), en ratas Copenhagen a las

que se han implantado tumores Dunning Mat LyLu;

la fig. 31

es una gráfica que representa la eficacia del tratamiento de combinación de PCK3145 y taxotere (es

decir, docetaxel) en ratones sin sistema inmune a los que se han implantado células tumorales PC-3,

en el retraso de crecimiento tumoral.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y DE LA DIVULGACION

La rHuPSP94 humana expresada en levaduras no está glicosilada y tiene 10 restos de cisteína. El peso molecular de rHuPSP94 se determinó que era 11,5 kDa, comparado con 10,7 kDa de su homólogo nativo.

Se han llevado a cabo diferentes estudios experimentales con el fin de determinar la eficacia de rHuPSP94 (ID SEC Nº: 2) con respecto a la PSP94 nativa secretada por la próstata enferma, como agente supresor de tumores. También se han llevado a cabo estudios para determinar la eficacia del decapéptido expuesto en el ID SEC Nº: 3, el polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 4 (polipéptido 7-21), el polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 5 (PCK3145), y el polipéptido expuesto en el ID SEC Nº: 6 (polipéptido 76-94), como agentes supresores de tumores. La actividad de supresión de tumor de los polipéptidos se ha seguido por su capacidad para reducir o inhibir el crecimiento del adenocarcinoma prostático tanto in vivo como in vitro. Estos resultados se resumen a continuación.

Se han llevado a cabo estudios usando la línea de adenocarcinoma de próstata humano PC-3, que se puede mantener tanto in vivo como xenoinjerto en ratones sin sistema inmune como in vitro como una línea celular. Además, también se ha usado un tumor de próstata Dunning Mat LyLu de rata, que es un modelo animal preeminente para el estudio del CaP. El tumor Dunning es un tumor trasplantable, poco diferenciado, de creci

miento rápido, que se puede mantener tanto in vivo en la rata Copenhagen como in vitro como una línea celular. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y de ningún modo como limitación.

EJEMPLO 1 PREPARACIÓN de rHuPSP94 (ID SEC Nº: 2) y polipéptidos (ID SEC Nº: 3, ID SEC Nº: 4, ID SEC Nº: 5 y ID SEC Nº: 6)

La HuPSP94 recombinante se clonó y expresó en Pichia pastoris, y después se purificó y se caracterizó como sigue. Materiales

La DEAE-celulosa (DE52) se adquirió en Whatman (Fairfield, New-Jersey). Las membranas de diálisis y el kit de detección de electroquimiluminiscencia (ECL) se adquirieron en Biolynx Canada (Pierce Inc.). Los marcadores de peso molecular de intervalo amplio y las columnas Econo-pack equipadas con adaptadores de flujo se adquirieron en Bio-Rad Labs Ltd (California). El dispositivo Pellicon se adquirió en Millipore (Massachusetts). Tris-HCl se obtuvo de ICN. El MES ((ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico) hidrato) se obtuvo de Sigma. Los conjugados de fosfatasa alcalina de cerdo dirigidos contra IgG conejo se adquirieron en DAKO (Dinamarca). El kit de expresión de Pichia Pastoris versión G era de Invitrogen (Carlsbad, California). El kit de marcaje DIG-High Prime® no radiactivo se adquirió en Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana). Los ensayos de MTS (3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna) se llevaron a cabo usando el kit de ensayo de proliferación no radiactivo acuoso de valoración de células de Promega (Madison, Wisconsin). El lector de placa de microvaloración MRX era de Dynex technologies (Chantillly, Virginia). El anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra PSP94 fue un regalo del difunto Dr. A. Sheth. Todos los cebadores fueron sintetizados por Procyon Biopharma Inc. London, Ontario, Canadá.

Línea celular y cultivo celular

La cepa huésped de P. pastoris GS115 (his4) y todos los productos relacionados con Pichia se obtuvieron de Invitrogen. La línea celular PC-3 (ATCC-nº CRL 1435) se obtuvo de la American Type Cell Culture (ATCC) y se mantuvo en MEM OPTI (medio mínimo esencial) con suero bovino fetal al 10% (FBS). Todos los productos de cultivo celular se obtuvieron de GIBCO BRL.

Clonación

Se usó un vector de clonación TA (pCR TM 2.1) que contenía el ADNc de PSP94 humano que incluía una secuencia líder de 20 aminoácidos descrita previamente (Baijal-Gupta, M., y col., J. Endocrinol., 165:425433, 2000) para amplificar la PSP94 humana sin su secuencia líder usando cebadores adecuados. Los cebado-res para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se diseñaron para contener un sitio de restricción EcoRI en cualquiera de los extremos. El cebador 5’ usado era 5’-GGG AAG AAT TCT CAT GCT ATT TCA TA-3’ (ID SEC Nº: 7) y el cebador 3’, 5’-TGG ATA TCT GCA GAA TTC GGC-3’ (ID SEC Nº: 8). Se ha subrayado el sitio de inicio +1 para PSP94 (en un resto de serina) en el cebador 5’ descrito antes.

La PCR incluía 1 ciclo de 12 minutos a 94ºC, seguido de 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, 1 minuto a 72ºC y una etapa final de 1 ciclo de 10 minutos a 72ºC. La amplificación por PCR del producto se realizó usando el sistema de PCR BM ExpandTM High Fidelity. El producto se llevó a un gel de agarosa al 1,5% y el producto de la PCR adecuado se aisló usando el kit Pharmacia Sehphaglass Kit (Bandprep). La subclonación del inserto PSP94 se realizó en el vector pPIC9 (Invitrogen). La enzima EcoRI se usó para la digestión de restricción tanto del plásmido como de los productos de la PCR (eliminando así la secuencia señal de PSP94) seguido de ligado y transformación usando células DH5α. Los clones aislados se seleccionaron por la resistencia a la ampicilina y los insertos se identificaron mediante mapas de restricción. Las construcciones se secuenciaron (servicio de secuenciación de Robart, Londres, Ontario) para identificar la inserción de PSP94 con una secuencia correcta así como la orientación adecuada y marco de lectura.

Cribado de clones que expresan rHuPSP94

Para la transformación de Pichia pastoris, se usó el procedimiento del esferoplasto de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) usando las cepas de levaduras GS115 y KM71. El plásmido pPIC9 con o sin la inserción de PSP94 se linearizaron usando la enzima de restricción SalI. Las colonias transformadas se cribaron y seleccionaron de acuerdo con su capacidad para producir su propia histidina, y por lo tanto de sobrevivir en medio sin histidina. Todos los transformantes GS115 puntuaron como Mut+, mientras que todas las colonias KM71, que no crecían bien en el cultivo líquido, puntuaron como Huts. Por lo tanto se cribó una serie de clones GS115 para la producción de los niveles más altos de expresión de rHuPSP94.

Se seleccionaron aproximadamente 100 clones y se cultivaron en 2 ml de medio de cultivo hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (DO600) de aproximadamente 6. El ADN total se aisló para el análisis por transferencia en mancha rápido con el fin de detectar las integraciones múltiples por transferencia Southern que corresponderían posiblemente a los clones de expresión alta de rHuPSP94. Se desnaturalizaron 200 µl de cada especie de cultivo y se transfirieron (por duplicado) a una membrana de nailon cargada positivamente, puesta en un aparato de transferencia en mancha. La membrana posteriormente se secó al aire. La membrana se sumergió entre dos láminas de papel 3MM Whatman durante 15 minutos en una disolución que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 50 mM, beta-mercaptoetanol (BME) al 2,5%, pH 9, seguido de una incubación de 24 horas a 37ºC con Zymolyase 100T 1 mg/ml, 5 minutos en NaOH 0,1 N, NaCl 1,5 M, citrato sódico 0,015 M pH 7 y dos incubaciones de 5 minutos en 2x disolución salina-citrato sódico (SSC). Finalmente, la membrana se puso en el horno a 80ºC durante 45 minutos y se expuso a la luz ultravioleta (UV) durante 15 minutos. La sonda de ADNc de PSP94 humana se marcó con el kit de marcaje no radiactivo High Prime DIG® (Boehringer Mannheim) y se usó para la hibridación. La hibridación con la sonda de ADNc marcada con digoxigenina (25 ng/µl) se hizo durante 2 días a 42ºC en tampón de dodecilsulfato sódico (SDS) (SDS al 7% (p/v); formamida al 50% (v/v); 5 X SSC; fosfato sódico 50 mM, pH 7,0; N-lauroil-sarcosina al 0,1%% (p/v)) y se usó reactivo de bloqueo, CSPD® al 2% (p/v) (Boehringer Mannheim) como sustrato quimiluminiscente. Todos los procedimientos de marcaje con digoxigenina (DIG) se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La detección se realizó usando el producto Hyperfilm-ECL (Amersham Life Science Inc. Arlington Hts, Illinois). Se usó el clon con la intensidad de señal más alta para todos los cultivos en matraces agitados.

Optimización de la expresión de la proteína en cultivos en matraces agitados

Se seleccionó un clon que contenía la construcción PSP94 para la expresión alta de la proteína. La colonia se cultivó en 25 ml de medio de crecimiento mínimo basal (BMG) hasta que se obtuvo una DO600 entre 2 y 6. Este clon se amplificó más en matraces Erlenmeyer protegidos en un volumen de 1 litro de medio BMG hasta que se alcanzó una DO600 aproximadamente entre 2,0 y 6,0. El cultivo se centrifugó durante 15 minutos a 2500 x g y se recogió el sedimento. La fase de inducción (es decir, inducción de la expresión de rHuPSP94) se llevó a cabo inoculando el sedimento celular en medio mínimo basal (BMM). El crecimiento se llevó a cabo en matraces protegidos durante 6 días, como recomienda Invitrogen. El volumen de BMM añadido varió de acuerdo con el tamaño del sedimento recogido. Se añadieron 5 mililitros de metanol al 100% por cada litro de cultivo. Esto se realizó cada día, aproximadamente a la misma hora, hasta una concentración final de 0,1% en metanol. Un plásmido sin la inserción de PSP94 servía como un control negativo.

Para determinar el tiempo óptimo para recoger el rHuPSP94 secretado en el medio de cultivo celular, se tomaron partes alícuotas cada 24 horas durante 6 días, empezando el primer día de la inducción. Los niveles de expresión de proteína rHuPSP94 se determinaron midiendo la DO600 y realizando un análisis por SDS al 15%PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) teñido con azul brillante Coomassie o análisis por transferencia Western usando anticuerpo policlonal contra PSP94.

Preparación de la muestra

El líquido sobrenadante del cultivo del clon que presentaba la expresión más alta de rHuPSP94, después de inducción (p. ej., después de 96 horas), se centrifugó a 2500 x g durante 20 minutos. El líquido sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,8 µm y se concentró aproximadamente 10 veces usando una unidad de Pellicon (Millipore). El líquido sobrenadante filtrado se dializó frente a tampón de Tris-HCl 0,05 mM, pH 8,0, usando una membrana con corte de exclusión de peso molecular 3500. Se analizó una parte alícuota del líquido sobrenadante dializado por SDS-PAGE y análisis de transferencia Western y el resto se sometió a posterior purificación.

Condiciones de cultivo para la fermentación

La fermentación se llevó a cabo en el Institute of Biological Sciences, National Research Council (NRC) (Ottawa, Ontario Canadá), siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Por ejemplo, se inició un procedimiento de fermentación inoculando 7,5 litros de medio con 625 ml de un cultivo iniciador. La fase de crecimiento se llevó a cabo durante aproximadamente 2 días en medio BMG hasta que la DO600 alcanzó aproximadamente 0,5. La fase de inducción se inició por la adición de metanol (100%), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). El cultivo se recogió después de 95 horas (es decir, después de inducción con metanol durante 67 horas). El volumen final del cultivo era aproximadamente 13,5 litros.

Preparación de la muestra a partir del cultivo de fermentación

La masa celular grande se separó por centrifugación. El medio exento de células recogido (9 litros) se clarificó después usando una unidad de filtración de 0,2 µm (Pellicon). En los 8,5 litros restantes que contenían la rHuPSP94 secretada se ensayó la expresión de proteína y se almacenaron a -20ºC para el posterior aislamiento y purificación de la proteína.

Cálculo de la proteína

Se obtuvo la cantidad de proteína rHuPSP94 secretada en el líquido sobrenadante de cultivo en matraces agitados y el procedimiento de fermentación, basándose en los cálculos de las intensidades de las bandas de las muestras comparadas con las intensidades de las bandas de una curva patrón obtenida cargando cantidades conocidas de PSP94 liofilizada pura en un análisis por SDS-PAGE. El cálculo inicial para rHuPSP94 para cada etapa de purificación se determinó por la DO a 280 nm. La cuantificación del contenido total de proteína en las etapas finales de la purificación se hizo por el procedimiento de BCA (ácido bicinconínico), usando albúmina de suero bovino (BSA) como patrón.

Liofilización

Las muestras de rHuPSP94 purificada se dializaron frente a agua desionizada usando una membrana con corte de exclusión de peso molecular 3000 y se liofilizaron.

SDS-PAGE

El análisis por SDS-PAGE se realizó usando acrilamida con una concentración final de 15% para la parte separadora del gel y acrilamida con una concentración final de 5% para la parte concentradora del gel. El gel contenía SDS al 0,1% y se realizó en condiciones reductoras. Se usaron marcadores de peso molecular de amplio intervalo para el cálculo del peso molecular de la proteína. Las proteínas se tiñeron con azul brillante Coomassie R-250.

Transferencia Western

Para la inmunotransferencia, se usó la célula de transferencia electroforética Mini Trans-Blot (Bio Rad) con membrana Hi bond-C super (Amersham) y papeles de transferencia de 85 mm. Se cargaron muestras de proteína (0,4 µg) y se separaron por SDS-PAGE como se ha descrito antes. Se transfirieron las proteínas a la membrana durante 2 horas a 4ºC, usando tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3 y metanol al 20%) y una unidad de transferencia fijada a 200 miliamperios (mAmp). Las membranas se bloquearon durante la noche por incubación en leche en polvo no grasa al 2% (p/v) (leche desnatada) disuelta en disolución salina tamponada con tris (TBS: NaCl 500 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) a temperatura ambiente (T.a.). Las membranas se lavaron 3 veces con TBS que contenía Tween-20 al 0,02% (v/v) (este tampón se denomina TTBS). Las membranas posteriormente se incubaron durante 2 horas a T.a. con anticuerpo dirigido contra PSP94 (dilución 1:2000) diluido en TTBS que contenía leche desnatada al 2%. Las membranas se lavaron dos veces con TTBS (5 minutos cada lavado) y se incubaron a T.a. con un anticuerpo secundario (es decir, anticuerpo de cerdo dirigido contra conejo conjugado con HRP) (dilución 1:5000) diluido en TTBS. Las membranas se lavaron dos veces con TTBS al 0,02% (5 minutos cada lavado). Se desarrollaron las transferencias usando el sistema de detección ECL, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando el sustrato SuperSignal, y se expusieron a ECL Hyperfilm de Amersham LS durante 5 a 20 segundos. Se usaron marcadores de peso molecular preteñidos para el cálculo del peso molecular.

Purificación de rHuPSP94 usando cromatografía en columna DE52

Después de separar las células de P. pastoris del cultivo de fermentación, el líquido sobrenadante se concentró aproximadamente 10 veces, se dializó y se sometió a cromatografía de intercambio aniónico. Una columna DE52 que tenía un volumen de lecho de aproximadamente 40 ml (2,5 cm de diámetro interno (di) x 8 cm de altura (h)) se equilibró con Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0 (tampón de equilibrado). La muestra (25 ml) que contenía de 15 a 20 mg de proteína rHuPSP04 se aplicó a la columna DE52 con un caudal de 1 ml/minuto.

Las impurezas se separaron de la columna lavándola con 40 a 50 ml de tampón de equilibrado, y siguiendo la absorbancia a 280 nm. A esta etapa le siguió la adición de 100 a 150 ml de Tris-HCl 0,05 M, pH 6,5 a la columna hasta que el pH de lavado alcanzó aproximadamente 6,5. Después la columna se lavó con 100 a 150 ml de MES-tampón de acetato 0,05 M, pH 6,5, hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó cero. Finalmente se eluyó la rHuPSP04 de la columna con MES-tampón de acetato 0,05 M, pH 5,0. Las fracciones de los picos se caracterizaron por la absorbancia a 280 nm, seguido de análisis por SDS-PAGE y transferencia Western como se ha descrito antes. Las fracciones con valores de absorbancia altos a 280 nm (de 0,5 a 1,8) se mezclaron y dializaron frente a agua o PBS para el almacenamiento a -20ºC y/o liofilización.

Composición de aminoácidos

Se llevó a cabo el análisis de aminoácidos del cultivo en matraces agitados purificado de DE52 y de los cultivos de fermentación. Se usó el sistema de análisis Biosystems Derivatizer-Analyser de Perkin Elmer con la columna Spheri-5 PTC C-18 5µ y detección UV a DO254.

Análisis espectroscópico de masas

Se sintetizaron polipéptidos derivados de PSP94 y se encontró que estaban de acuerdo con las especificaciones requeridas y se analizaron por análisis espectroscópico de masas. Los análisis de espectrometría de masas del polipéptido 7-21 (ID SEC Nº: 4), PCK3145 (ID SEC Nº: 5) y polipéptido 76-94 (ID SEC Nº: 6) están representados en las figuras 1, 2 y 3, respectivamente.

Las muestras de polipéptido se analizaron usando el espectrómetro de masas MALDI-TOF con Voyager-DE PerSeptive Biosystems (Framingham, MA), usando luz de 337 nm de un láser de nitrógeno. Se promediaron aproximadamente 12 a 50 barridos para cada análisis.

Se analizaron las muestras purificadas del cultivo en matraces agitados y del cultivo de fermentación usando el espectrómetro de masas MALDI-TOF con Voyager-DE PerSeptive Biosystems (Framingham, MA), usando luz de 370 nm de un láser de nitrógeno. Se promediaron aproximadamente 50 barridos para cada análisis. También se analizó una muestra de PSP94 nativo en condiciones similares para la comparación.

EJEMPLO 2 EFECTO IN VITRO DE rHuPSP94 EN CÉLULAS PC-3 (ENSAYO DE MTS)

La actividad biológica de rHuPSP94 se determinó por su efecto inhibidor del crecimiento en células de cáncer de próstata humano PC-3. Se siguió la proliferación celular en células PC-3 usando el kit de MTS/PMS (metosulfato de fenazina) (Promega), que mide principalmente la actividad mitocondrial de células vivas. El principio básico de este procedimiento implica el hecho de que las enzimas mitocondriales de las células vivas metabolizan los colorantes MTS/PMS formando un precipitado de color pardo que se puede medir como densidad óptica (DO) por absorción a 490 nm en un espectrofotómetro. Por lo tanto, los valores de DO son proporcionales al número de células vivas. Además, también se realizó el seguimiento de la morfología celular. La morfología celular sería indicativa de su estado de salud. Por ejemplo, las células viables aparecerían adherentes y extendidas, mientras que las células muertas estarían en suspensión en el medio y aparecerían granulares y redondas.

Los resultados del efecto in vitro de rHuPSP94 en las células PC-3 medido por ensayo de MTS se resumen en la siguiente tabla 2. Las células PC-3 (ATCC, Lote AT06) usadas en estos experimentos estaban a un número de pases igual o inferior a 70 (n ≥ 70). Las células se sembraron en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos Costar en medio RPMI complementado que contenía albúmina de suero bovino (BSA) 50 µg/ml y FeSO4 0,1 µM. El péptido se diluyó en el mismo medio. Las células se expusieron continuamente a los polipéptidos de la presente invención durante 72 horas sin cambiar el medio. Se añadieron PSP94 nativo o rNuPSP94 concentrado dos veces, directamente a los pocillos y se diluyeron 1X con el fin de minimizar la manipulación celular y evitar el desprendimiento.

La evaluación del efecto inhibidor del crecimiento de rHuPSP94 en células PC-3 indicaba una reducción sustancial en el número de células (es decir, viabilidad) en el intervalo de 37% a 57% de reducción en concentraciones de 80 a 120 µg/ml de rHuPSP94, respectivamente. Este efecto se observó en 3 de cada 4 experimentos (Tabla 2). Los resultados del ensayo de exclusión con tinta azul de trypan demostraron una viabilidad celular de 62% con 80 µg/ml.

TABLA 2

Experimento nº

Muestra % de Viabilidad (control = 100%) (imagen1 g/ml)

40

60 80 120

1

rHuPSP94 72 78 58 43

2

rHuPSP94 63 63 63 68

3

rHuPSP94 95 85 78 ND

4

rHuPSP94 100 52 62 60

5

rHuPSP94 100 98 90 52

Muestra

% de Viabilidad (control = 100%) (imagen1 g/ml)

5

10 20 40 80

rHuPSP94

98 84 78 70 55

rHuPSP94

92 95 80 71 59

rHuPSP94

89 69 79 68 65

10 EJEMPLO 3 EFECTO IN VITRO DE rHuPSP94 EN CÉLULAS PC-3 (ENSAYO DE ABSORCIÓN DE [3H]-TIMIDINA)

El efecto inhibidor del crecimiento in vitro de rHuPSP94 se evaluó usando el ensayo de absorción de [3H]-timidina. El ensayo de absorción de [3H]-timidina implica la incorporación de [3H]-timidina en el ADN celular 15 de células que proliferan activamente. Mide el índice de proliferación de las células frente al ensayo de MTS, el cual cuantifica el número de células vivas después del tratamiento. Las células se sembraron en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos Costar, en medio RPMI complementado que contenía albúmina de suero bovino (BSA) 50 µg/ml y FeSO4 0,1 µM. Las células PC-3 se expusieron a diferentes concentraciones de rHuPSP94 durante 72 horas y durante las 16 horas finales de incubación las células se pulsaron con [3H]

20 timidina 1 µCi. La radiactividad en cada pocillo de la placa se cuenta mediante un contador beta y se expresa como las cuentas por minuto (cpm) totales. Los resultados del efecto in vitro de rHuPSP94 en células PC-3 usando el ensayo de absorción de [3H]-timidina se resumen en la tabla 3 y se expresan como porcentaje de la radiactividad medida para las células tratadas con respecto a la radiactividad medida para las células no tratadas (para las que el valor de la absorción de [3H]-timidina se estableció como 100%).

25 Los resultados indicaban una reducción de 65% del porcentaje de células que incorporaban [3H]-timidina después de tratamiento con rHuPSP94 con una concentración de 80 µg/ml durante 72 h, comparado con el control no tratado. Los resultados de 65% de reducción de absorción de [3H]-timidina también pueden ser una indicación de una reducción de 65% en la proliferación celular. Se llevó a cabo la comparación entre el ensayo de absorción de [3H]-timidina y el ensayo de MTS, con el

30 fin de evaluar su sensibilidad relativa. Se puso aparte una placa adicional para el ensayo de MTS y se trató en

5

10

15

20

25

30

35

-24

paralelo con el mismo lote de rHuPSP94 que el usado para el ensayo de absorción de [3H]-timidina. Los resultados obtenidos en el ensayo de MTS demostraron una reducción de 35% en la viabilidad celular (65% de las células restantes viables) después de tratamiento con rHuPSP94 con una concentración de 80 µg/ml, indicando que el ensayo de absorción de [3H]-timidina, que era capaz de medir una reducción de 65% en la proliferación celular, puede ser más sensible que el ensayo de MTS.

TABLA 3

Experimento nº

Muestra Absorción de [3H]-timidina (% del control) (imagen1 g/ml)

5

10 20 40 80

1

rHuPSP94 94 101 98 79 35

1

PSP94 nativo 97 98 100 98 77

EJEMPLO 4 EFECTO IN VITRO DEL DECAPEPTIDO Y OTRO POLIPÉPTIDO EN CÉLULAS PC-3

Se ha mostrado en el presente documento que el decapéptido sintético (ID SEC Nº: 3) imita la actividad biológica de la PSP94 nativa (nPSP94) (ID SEC Nº: 1) y por lo tanto se estudió su efecto en las células PC-3 en un ensayo de clonogenicidad (formación de colonias). Las células se sembraron en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos Costar, en medio RPMI complementado que contenía albúmina de suero bovino (BSA) 50 µg/ml y FeSO4 0,1 µM. La clogenicidad se evaluó en las células PC-3 cultivadas en presencia de diferentes concentraciones del decapéptido después de 9 días de cultivo (figura 4a). Se realizó un experimento paralelo con diferentes concentraciones de nPSP94 usando las mismas condiciones experimentales (figura 4b). Se realizaron otros experimentos que evaluaban la clonogenicidad con el decapéptido (figura 5a) o nPSP94 (figura 5b) después de 21 días de cultivo, así como después de 10 días de cultivo (figura 6a: decapéptido y figura 6b: nPSP94).

En relación con las figuras 4 a 6, el decapéptido (ID SEC Nº: 3) tenía una acción inhibidora similar a nPSP94 (ID SEC Nº: 1) en las células PC-3 in vitro estudiadas. Los resultados indicaban una disminución de 40% en el número de colonias para las células incubadas con el decapéptido (ID SEC Nº: 3) con una concentración de 1 µg/ml. Se observó una disminución del número de colonias de hasta 60% para el decapéptido (ID SEC Nº: 3) con una concentración de 10 µg/ml.

EJEMPLO 5 ENSAYO DE FRAGMENTACIÓN DE ADN

El resultado de la apoptosis celular en la fragmentación del ADN se puede evaluar por la presencia de una escalera de ADN visualizada cuando el ADN se desarrolla en un gel de agarosa al 1,2%. El ensayo de la escalera de ADN (ensayo de apoptosis) se realizó después de exponer las PC-3 a diferentes concentraciones de los polipéptidos durante 72 horas. Los polipéptidos que se usaron en este experimento particular eran el polipéptido 7-21 (ID SEC Nº: 4), polipéptido PCK3145 (ID SEC Nº: 5) y polipéptido 76-94 (ID SEC Nº: 6). La visualización del ADN aislado y desarrollado en gel de agarosa al 1,2%, demostraba que todos los polipéptidos ensayados inducían un efecto de escalera de ADN característico de la apoptosis. Este efecto era especialmente evidente después de tratamiento con PCK3145 (ID SEC Nº: 5), el cual se ilustra en la figura 7. La banda 1 del gel ilustrado en la figura 7 representa una digestión de lambda con HindIII estándar. La banda 2 del gel ilustrada en la figura 7 representa el efecto de escala de ADN obtenido para las células tratadas con doxorrubicina. La banda

3 del gel ilustrada en la figura 7 representa el efecto de escalera de ADN obtenido para las células incubadas con 40 µg de nPSP94. La banda 4 del gel ilustrada en la figura 7 representa el efecto de escalera de ADN obtenido para las células incubadas con 20 µg de nPSP94. La banda 5 del gel ilustrada en la figura 7 representa el efecto de escalera de ADN obtenido para las células incubadas con PCK3145 (ID SEC Nº: 5) 22,5 µM. La banda 6 del gel ilustrada en la figura 7 representa el efecto de escalera de ADN obtenido para las células incubadas con PCK3145 (ID SEC Nº: 5) 45 pM.

EJEMPLO 6 ENSAYO DE APOPTOSIS POR ELISA PLUS

Los tres polipéptidos (ID SEC Nº: 4, ID SEC Nº: 5 e ID SEC Nº: 6) y PSP94 nativa usados aquí como control positivo se ensayaron en un ensayo de ELISA plus para medir la muerte celular por apoptosis. En resumen, el ensayo de ELISA plus es un inmunoensayo con enzimas de tipo sándwich que puede medir los mono y oligonucleosomas presentes en la fracción citoplasmática del lisato celular usando dos anticuerpos, uno dirigido contra el ADN y el otro dirigido contra histonas. La muerte celular apoptótica se caracteriza por la activación de endonucleasas endógenas (p. ej., dependientes de calcio y de magnesio), que escinden el ADN bicatenario en la región conectora internucleosómica más accesible, generando mono y oligonucleosomas. El enriquecimiento en mono y oligonucleosomas en el citoplasma de las células apoptóticas se debe al hecho de que la degradación del ADN se produce varias horas antes de la rotura de la membrana plasmática.

Se sembraron 4000 células en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos Costar, en medio RPMI complementado que contenía albúmina de suero bovino (BSA) 50 µg/ml y FeSO4 0,1 µM. Las células PC-3 se trataron con diferentes concentraciones (22,5 µM y 90 µM) de los polipéptidos durante 72 horas. El ensayo de apoptosis se hizo siguiendo las instrucciones del fabricante usando el kit ApopTag (Boeringher Mannheim).

Los resultados presentados en la figura 8, indican un aumento dependiente de la dosis del efecto de muerte celular apoptótica que se observó para todos los polipéptidos usados (ID SEC Nº: 4, ID SEC Nº: 5 y ID SEC Nº: 6). El polipéptido PCK3145 (ID SEC Nº: 5) era más potente que los otros polipéptidos con una concentración 90 µM (figura 8).

EJEMPLO 7 INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR POR POLIPÉPTIDOS PSP94 (Figuras 9 a 11)

La actividad biológica de los polipéptidos expuestos en los ID SEC Nº: 4, ID SEC Nº: 5 e ID SEC Nº: 6, se determinó por su efecto inhibidor del crecimiento en células de cáncer de próstata humana PC-3. También se incluyeron PSP94 nativo, rHuPSP94, polipéptido 22-36 y polipéptido PB111 (polipéptido desordenado), en este experimento como controles. El ensayo de proliferación celular se llevó a cabo en células PC-3 o en fibroblastos normales (usados aquí como control) usando el kit de MTS/PMS (Promega). Se sembraron 4000 (figuras 9 y 10)

o 3000 (figura 11) células en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos Costar, en medio RPMI complementado que contenía albúmina de suero bovino (BSA) 50 µg/ml y FeSO4 0,1 µM. También se realizó el seguimiento de la morfología celular.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 9 a 11. No se observó efecto inhibidor de células después de incubación de los fibroblastos con diferentes concentraciones de polipéptido (de 10 a 90 µM) durante 72 horas (figura 9). Sin embargo, se observó una inhibición significativa del crecimiento para los polipéptidos expuestos en el ID SEC Nº: 4 y el ID SEC Nº: 6 y de forma más importante con el polipéptido PCK3145 (ID SEC Nº: 5) (figura 10). Se realizó otro experimento usando PCK3145 y el polipéptido 22-36 con diferentes concentraciones en células PC-3, cultivadas en medio OPTI-MEM. En las figuras 9 a 11, se evalúa el porcentaje de inhibición del crecimiento dado para células tratadas con respecto a las células de control no

5 tratadas para las cuales se da un valor de 100% de supervivencia celular.

EJEMPLO 8 Y 9 EXPERIMENTOS IN VIVO (Figuras 12 y 13)

Los estudios MLL-1 y MLL-2 se llevaron a cabo como sigue: el día 0, se inyectó a ratas macho Copen

10 hagen por vía subcutánea 5 x 105 células Mat LyLu por rata. Estas células se obtuvieron de cultivos de la línea celular Mat LyLu cultivadas en medio RPMI que contenía suero de ternero fetal al 10% (v/v) en fase de crecimiento logarítmica. Las células se recogieron de los matraces de cultivo por tripsinización, se centrifugaron a 1200 rotaciones por minuto (rpm) y se lavaron 3 veces con disolución salina equilibrada de Hanks (HBBS). Después de lavado, las células se contaron y se ajustaron a una concentración de 5 x 106 células/ml en HBSS.

15 Se administró un inóculo de células tumorales de 0,1 ml de volumen que contenía 5 x 105 células, por vía subcutánea en el costado de cada rata. Tres días después de la implantación de las células tumorales (es decir, inoculación), los animales se trataron diariamente con una inyección subcutánea del polipéptido deseado hasta el día

13. Los experimentos ilustrados en la figura 12 muestran la validación de la eficacia antitumoral de 20 rHuPSP94 frente al tumor Mat LyLu (MLL) implantado en ratones sin sistema inmune (Protocolo basado en S. Garde y col.; The Prostate, 22: 225-233, 1993).

Para el estudio MLL-1 (figura 12), los ratones sin sistema inmune con el tumor implantado se separaron

en diferentes grupos, recibiendo cada uno diferentes cantidades de rHuPSP94 o reactivos de control. Los dife

rentes grupos usados en estos experimentos se ilustran a continuación. Cada grupo contenía 8 ratones.

25 Grupo 1: control negativo: PBS por vía subcutánea (s.c.) Grupo 2: control positivo: doxorrubicina 5 mg/kg, un solo bolo por vía intravenosa (i.v.) el día 3 Grupo 3: rHuPSP94 1 µg/kg/día (s.c.) Grupo 4: rHuPSP94 10 µg/kg/día (s.c.)

30 Grupo 5: rHuPSP94 100 µg/kg/día (s.c.)

A continuación se ilustra un esquema de la inoculación; (Implantación de células tumorales (T.C.I.), tratamiento (Tx), medición (M), día (D)).

imagen2

Los experimentos ilustrados en el estudio MLL-2 muestran la validación de la eficacia antitumoral de

rHuPSP94 frente al tumor Mat LyLu (MLL) implantado en ratones con inmunodeficiencia combinada grave

(IDCG) (Protocolo basado en S. Garde y col.; The Prostate, 22: 225-233, 1993).

5

10

15

20

25

30

35

-27

Para el estudio MLL-2 (figura 13), los ratones IDCG con el tumor implantado se separaron en diferentes grupos, recibiendo cada uno diferentes cantidades de rHuPSP94 o reactivos de control. Los diferentes grupos usados en estos experimentos se ilustran a continuación. Cada grupo contenía 8 ratones.

Grupo 1: control negativo: PBS (s.c.) Grupo 2: control positivo: doxorrubicina 5 mg/kg, un solo bolo por vía i.v. el día 3 Grupo 3: rHuPSP94 1 µg/kg/día (s.c.) Grupo 4: rHuPSP94 10 µg/kg/día (s.c.) Grupo 5: rHuPSP94 100 µg/kg/día (s.c.)

A continuación se ilustra un esquema de la inoculación; (Implantación de células tumorales (T.C.I.), tratamiento (Tx), medición (M), día (D)).

imagen2

Los resultados de estos dos estudios indican una diferencia del tamaño y crecimiento del tumor en los ratones sin sistema inmune frente a los ratones con IDCG. Los tumores crecieron más lentamente y eran más pequeños en los ratones con IDCG. Esto puede deberse a algunos factores específicos que controlan el crecimiento tumoral en esta cepa de ratones. Los resultados también muestran una reducción significativa del tumor en ratones a los que se inyectó doxorrubicina (control positivo). Por ejemplo, la reducción del peso del tumor en ratones sin sistema inmune (estudio MLL-1) a los que se inyectó doxorrubicina era 48% (p=0,006) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). La reducción del peso del tumor en ratones IDCG (estudio MLL-2) a los que se inyectó doxorrubicina era 82% (p=0,002) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). Los resultados indican también una reducción del tumor significativa en ratones tratados con rHUPSP94 con una concentración de 1 µg/kg/día. Por ejemplo, la reducción de peso del tumor en ratones sin sistema inmune (estudio MLL-1) tratados con rHUPSP94 con una concentración de 1 µg/kg/día era 26% (p=0,042) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). La reducción de peso del tumor en ratones con IDCG (estudio MLL-2) tratados con rHUPSP94 con una concentración de 1 µg/kg/día era 65% (p=0,010) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante).

EJEMPLO 10 EXPERIMENTO IN VIVO USANDO LA LÍNEA CELULAR PC-3 (Figura 14)

El tumor de próstata humano PC-3 se obtuvo de la ATCC (ATCC 1435). Las células PC-3 se cultivaron en medio RPMI que contenía suero de ternero fetal al 10% (v/v) y se recogieron en la fase logarítmica del crecimiento por tripsinización. Las células se centrifugaron a 1200 rotaciones por minuto (rpm) y se lavaron 3 veces con disolución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Después de lavado, las células se contaron y se ajustaron a una concentración de 1 x 107 células/ml en HBSS. Se administró por vía subcutánea un volumen de 0,1 ml de inóculo de células tumorales que contenía 1 x 106 células en los dos costados opuestos de cada ratón sin sistema inmune (contexto Nu/Nu, BALB/c). El crecimiento tumoral se siguió durante aproximadamente 18 días. Una vez establecido el crecimiento tumoral (el volumen del tumor alcanzó un volumen de 50 mm3) se inició el tratamiento con rHuPSP94 (ID SEC Nº: 2) y se realizó una vez al día durante 14 días por vía subcutánea, basándose en los grupos de tratamiento asignados ilustrados en la tabla 4.

TABLA 4

Grupo de tratamiento

Productos de control y ensayo Nivel de dosis (imagen1 g/kg/día) Concentración de dosis (imagen1 g/mg) Nº de animales

1 Control negativo

PBS 0 0 8

2 Control positivo

Doxorrubicina 5000 2500 8

3

rHuPSP94 1 0,5 8

4

rHuPSP94 10 5 8

5

rHuPSP94 100 50 8

6

rHuPSP94 1000 500 8

Los resultados de este experimento (figura 14) demuestran la reducción del crecimiento tumoral en el 10 grupo de ratones tratados con rHuPSP94 con un nivel de dosificación de 1 µg/kg de peso corporal por día. Esta reducción era similar a la observada para la doxorrubicina (dada con 5 mg/kg/día) que es un agente quimioterapéutico usado como prueba de oro de referencia.

EJEMPLO 11 15 EXPERIMENTO IN VIVO USANDO LA LÍNEA CELULAR PC-3 (Figuras 15-17) El tumor de próstata humano PC-3 (ATCC 1435) obtenido de la ATCC se implantó bilateralmente en ratones sin sistema inmune y se siguió el crecimiento del tumor durante aproximadamente 18 días. Se inyectaron células PC-3 una vez por vía subcutánea en cada costado de los ratones. Una vez establecido el crecimiento del tumor (es decir, el volumen del tumor había alcanzado de 0,25 a 0,50 cm3) se inició el tratamiento con decapép20 tido (ID SEC Nº: 3), PSP94 nativo (ID SEC Nº: 1) y polipéptido mixto PB111 y se realizó una vez al día durante 14 días por vía subcutánea, basándose en los grupos de tratamiento (asignados aleatoriamente) ilustrados en la tabla 5.

Grupo de tratamiento

Productos de control y ensayo Nivel de dosis (imagen1 g/kg/día) Concentración de dosis (imagen1 g/mg) Nº de animales

1 Control negativo

PBS 0 0 4

3

Decapéptido (ID SEC Nº: 3) 1 0,5 4

4

Decapéptido (ID SEC Nº: 3) 10 5

4

5

Decapéptido (ID SEC Nº: 3) 100 50 4

6

Decapéptido (ID SEC Nº: 3) 1000 500 4

7

PSP94 nativa (ID SEC Nº: 1) 1 0,5 4

8

PSP94 nativa (ID SEC Nº: 1) 10 5 4

10

PSP94 nativa (ID SEC Nº: 1) 100 50 4

11

PSP94 nativa (ID SEC Nº: 1) 1000 500 4

12

Polipéptido desordenado (PB111) 1 0,5 4

13

Polipéptido desordenado (PB111) 10 5 4

14

Polipéptido desordenado (PB111) 100 50 4

15

Polipéptido desordenado (PB111) 1000 500 4

La figura 15 representa los resultados obtenidos para los ratones sin sistema inmune con tumor implantado tratados con el decapéptido (ID SEC Nº: 3) comparado con un control no tratado. La figura 16 representa 5 los resultados obtenidos para los ratones sin sistema inmune con tumor implantado tratados con el polipéptido desordenado PB111 comparado con un control no tratado. La figura 17 representa los resultados obtenidos para los ratones sin sistema inmune con tumor implantado tratados con la PSP94 nativa (ID SEC Nº: 1) comparado con un control no tratado. Los resultados de estos experimentos (figuras 15-17) indican una reducción significativa del crecimiento de tumor (p<0,05) en los ratones tratados con el decapéptido (ID SEC Nº: 3) con un nivel de

10 dosificación de 10 µg/kg de peso corporal por día.

EJEMPLO 12 FABRICACIÓN Y PREPARACIÓN DE POLIPÉPTIDOS

Los polipéptidos derivados de la PSP94 incluyendo PCK3145 (ID SEC Nº: 5) se sintetizaron usando el

15 procedimiento de síntesis de polipéptidos en fase sólida con FMOC y BOC (Merrifield, B., Science, 232: 341-347, 1986). Se analizaron los polipéptidos con el fin de determinar su identidad por análisis espectroscópico de masas. Las muestras de polipéptidos se analizaron usando el espectrómetro de masas MALDI-TOF con Voyager-DE PerSeptive Biosystems (Framingham, MA), usando luz de 337 nm de un láser de nitrógeno. Se promediaron aproximadamente 50 barridos para cada análisis. También se analizó una muestra de PSP94 nativa en condicio

20 nes similares para la comparación. Los polipéptidos se pesaron en una microbalanza Mettler AE 163. Las mediciones tenían precisión de 0,1 mg. Los polipéptidos se reconstituyeron en PBS 10 mM pH 7,3 hasta una concentración final de 1 y 5 mg/ml. Los polipéptidos se disolvían relativamente bien y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,2 µm. Se hicieron partes alícuotas de 2 ml/tubo y se almacenaron a -80ºC. El pH de los polipéptidos se midió después de reconstitución para asegurarse de que las posibles dife

25 rencias de pH no serían un factor de variación. Los valores de pH de cada disolución se tomaron a 3 concentraciones: solo, 100 µg/ml y 12,5 µg/ml. El intervalo de pH era aproximadamente de 7,0 a 7,5. Esto no suponía una diferencia significativa en el resultado del ensayo, puesto que las células sobrevivían muy bien en este intervalo de pH. Para cambiar las concentraciones a valores molares, el volumen aproximado de las disoluciones madre

de 1 mg/ml se diluyó en PBS, pH 7,3. Todas las disoluciones madre se hicieron para contener disoluciones de polipéptido 450 µM. Cuando se reconstituyeron disoluciones madre recientes de polipéptido, se hizo directamente hasta concentración de 450 µM en PBS, pH 7,3.

Después del cribado inicial y confirmación de la actividad inhibidora del polipéptido en el crecimiento de las células PC-3, se ensayó un polipéptido fabricado por GMP. Este polipéptido se pesó y se disolvió en PBS y se preparó una disolución madre de 2 mg/ml, se esterilizó por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,2 µm y se almacenó a -80ºC.

EJEMPLO 13 EFECTO DE PCK3145 EN CÉLULAS PC-3 IN VITRO (ENSAYO MTS (Figuras 18-21))

Se evaluó PCK3145, fabricado como se expone en el ejemplo 12, como un producto candidato en la inhibición del crecimiento tumoral.

La actividad biológica de PCK3145 se determinó por su efecto inhibidor del crecimiento en la línea celular de cáncer de próstata humano PC-3 usando el kit de MTS/PMS (Promega). Este ensayo mide la actividad mitocondrial de las células vivas. El principio básico de este procedimiento implica el hecho de que las enzimas mitocondriales de las células vivas metabolizan los colorantes MTS/PMS formando un precipitado de color marrón que se puede medir como una densidad óptica (DO) por absorción a 490 nm en un espectrofotómetro. Por lo tanto, los valores de DO son proporcionales al número de células vivas.

Además, también se hizo una observación visual de las células para comprobar la morfología celular, que también podía ser indicativa del crecimiento de células. Se usaron las siguientes condiciones para el ensayo de MTS: PC-3 (ATCC, lote AT06), número de pases n ≥ 70, línea celular adaptada al crecimiento en OPTI-MEM exento de suero y en RPMI complementado con BSA (50 µg/ml) y sulfato ferroso (0,1 µM), exposición continua hasta 72 horas sin cambiar el medio (es decir, añadiendo PCK3145 en concentración 2X directamente a los pocillos y diluyéndolo 1:2 a 1X para minimizar la manipulación celular y evitar el desprendimiento). Como se indica en la figura 18, PCK3145 se evaluó a las siguientes concentraciones: 12,5, 25, 50, 100, 200, 300 y 400 µg/ml en células PC-3 (ATCC) cultivadas en medio complementado. Los ensayos de MTS se repitieron 5 veces y el efecto inhibidor dependiente de la dosis en el crecimiento de células PC-3 era sistemáticamente reproducible, demostrando una inhibición del crecimiento celular de aproximadamente 40% con la concentración de PCK3145 más alta de 400 µg/ml.

Se repitió el ensayo de MTS con la disponibilidad del polipéptido de calidad GMP (buenas prácticas de laboratorio), para comprobar la reproducibilidad y citotoxicidad frente a células PC-3. En paralelo, también se trataron células PC-3 con PSP94 nativo como un control positivo de referencia y sin tratamiento (control negativo, es decir, cont.). La figura 19 muestra los resultados del ensayo de MTS en el que se sembraron 4000 células y se expusieron a PCK3145 (calidad GMP) durante 48 horas. Se observó un efecto inhibidor del crecimiento de 30% después de tratamiento con PCK3145 con 500 µg/ml. El efecto aumentó a aproximadamente 40% después de 72 horas de exposición (figura 20). En un experimento repetido, una exposición de 48 horas al polipéptido con 500 µg/ml dio como resultado una inhibición del crecimiento de solo 20-22%, sin embargo, este efecto aumentó a 30% después de 72 horas de exposición (figura 21). A pesar de la variabilidad de un ensayo a otro reflejada en el estado del crecimiento de células in vitro, el polipéptido PCK3145 presentaba una inhibición significativa del crecimiento celular.

EJEMPLO 14 EFECTO DE PCK3145 EN CÉLULAS PC-3 IN VITRO, ENSAYO DE ABSORCIÓN DE [3H-]-TIMIDINA (Figuras 22-24)

El ensayo de absorción de [3H]-timidina implica la incorporación de [3H]-timidina en el ADN celular de células que proliferan activamente. El ensayo de absorción de [3H]-timidina mide el índice proliferativo de las células frente al ensayo de MTS, que cuantifica el número de células vivas después del tratamiento. Se evaluaron los efectos antiproliferativos de PCK3145 y otros dos polipéptidos sintéticos derivados de los extremos amino y carboxi de PSP94 (SEC ID Nº: 4 y Nº: 6, respectivamente) así como el decapéptido (SEC ID Nº: 3) que previamente mostraron que imitaban la acción biológica de PSP94, en el ensayo de absorción de [3H]-timidina en células PC-3. Se llevaron a cabo dos experimentos separados con PCK3145 de calidad GMP.

Como se muestra en las figuras 22 y 23, el polipéptido PCK3145 presentaba una actividad de inhibición de la proliferación significativa, reflejada en el porcentaje de absorción de [3H]-timidina. En el primer experimento, se observó una reducción de casi 40% en la absorción de [3H]-timidina con una concentración de PCK3145 de 200 µg/ml. En el segundo experimento, aunque se usó una concentración dos veces mayor de PCK3145 (es decir, 400 µg/ml) sólo se observó 25% de inhibición. A pesar de la variación de un ensayo a otro, el grado general de efecto inhibidor de la proliferación frente a células PC-3 era notablemente evidente con el material de calidad GMP. El tratamiento de las células PC-3 con PSP94 nativa como patrón de referencia positivo, presentó una reducción dependiente de la dosis significativa en la proliferación celular, con casi 50% de reducción en la absorción de [3H]-timidina después de 72 horas de exposición (figura 24).

EJEMPLO 15 EFECTO IN VITRO DE PCK3145 EN CÉLULAS PC-3 (APOPTOSIS -Figura 25)

Se evaluó la apoptosis de células PC-3 después de una exposición de 72 horas a PCK3145 con una concentración de 500 µg/ml, en medio complementado, por el ensayo de fragmentación de ADN. Se usó doxorrubicina como control positivo de referencia. Las células no tratadas y las células tratadas con PCK3145 se recogieron y se aisló el ADN, El ADN aislado se desarrolló en un gel de agarosa al 1,2% que contenía bromuro de etidio (EtBr). Como se muestra en la figura 25, el tratamiento de las células PC-3 con el polipéptido PCK3145 dio como resultado la fragmentación del ADN puesta de manifiesto por la formación de la escalera observada para el ADN fragmentado. La banda 1 del gel ilustrado en la figura 25 representa el marcador de ADN (escalera de ADN de 100 pares de bases). La banda 2 del gel ilustrado en la figura 25 representa un control de células PC3 no tratadas. La banda 3 del gel ilustrado en la figura 25 representa el efecto de escalera de ADN observado para las células tratadas con doxorrubicina con una concentración de 2 µg/ml. La banda 4 del gel ilustrado en la figura 25 representa el efecto de escalera de ADN observado para las células tratadas con PCK3145 (ID SEC Nº: 5).

EJEMPLO 16 EXPERIMENTOS IN VIVO USANDO LA LÍNEA CELULAR DE CÁNCER DE PROSTATA HUMANO PC-3 (Figuras 26-27)

Los estudios PC3-6 y PC3-12 (figuras 26-27) son experimentos de grupos consecutivos diseñados para caracterizar la actividad in vivo de PCK3145 en el modelo de xenoinjerto de ratón sin sistema inmune con cáncer

5

10

15

20

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30

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-32

de próstata humano PC-3, y para explorar las relaciones entre dosis, ruta y esquema de administración y los parámetros de eficacia del crecimiento tumoral (volumen).

Las células PC-3 recogidas en fase semilogarítmica se inocularon con 5 x 106 células por ratón por vía subcutánea en la zona trasera de los ratones. Los tumores que crecieron a partir de este inóculo se extirparon aproximadamente el día 32 a 35 postimplante del tumor (p.i.t.) cuando el volumen de tumor alcanzó 200-300 mm 3 (es decir, mm cúbicos). El tejido necrótico se retiró y la masa de tumor viable cortada en trozos pequeños (aproximadamente de 3 mm3) se implantó por vía s.c. en los dos costados opuestos del ratón. El tratamiento con diferentes concentraciones de PCK3145 se inició el día 3 postimplante del tumor (p.i.t.) y se continuó diariamente durante 21 días. Las inyecciones subcutáneas se hicieron bajo los sitios de crecimiento del tumor. Las inyecciones intraperitoneales se realizaron en la región abdominal. Las inyecciones intravenosas se realizaron por la vena lateral de la cola. El experimento se terminó 24 horas después del último tratamiento. Se tomaron medidas del tumor los días 11, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 postimplante del tumor (p.i.t.). Los volúmenes de los tumores se calcularon de acuerdo con la fórmula (axb2 x 0,5), en la que a es la longitud del diámetro largo, y b es la anchura del diámetro corto perpendicular.

El estudio nº: PC3-6 ilustra la eficacia de PCK3145, inyectado por vía subcutánea, en el retraso del crecimiento del tumor en ratones sin sistema inmune, que han recibido implantes PC-3. Los ratones se separaron en diferentes grupos, y cada uno recibía diferentes cantidades de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) o reactivos de control. Los diferentes grupos usados en estos experimentos se ilustran en la siguiente tabla 6. Cada grupo contenía 10 ratones. La doxorrubicina se administró como un solo bolo por inyección intravenosa los días 3 y 11 postimplante del tumor (p.i.t.).

TABLA 6

Grupo de tratamiento

Productos de ensayo y de control Nivel de dosis (imagen1 g/kg/día) Nº de animales Nº de tumores

1 Control negativo

PBS 0 10 20

2 Control positivo

Doxorrubicina 10000 10 20

3

PCK3145 0,1 10 20

4

PCK3145 1 10 20

5

PCK3145 10 10 20

Los resultados de este estudio (figura 26) demostraron un retraso significativo del crecimiento del tumor PC-3 después de tratamiento con PCK3145 con 10 µg/kg/día. Este efecto antitumoral se puso de manifiesto por una disminución estadísticamente significativa del porcentaje de crecimiento del tumor los días 11, 14, 16, 18, 21 y 24 después de implantar el tumor con respecto a los valores p que variaban de p=0,001 a 0,002, en comparación con el grupo de control tratado con PBS (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). Se usó la doxorrubicina, un potente agente quimioterapéutico, como patrón de oro y demostró un efecto terapéutico antitumoral muy significativo. El análisis de varianza ANOVA, ensayo de Dunnett, análisis de datos por ensayo de Kruskal-Wallis y Dunn confirmaron la importancia estadística del efecto antitumoral observado.

El estudio nº PC3-12 ilustra la eficacia de PCK3145 en el retraso del crecimiento de tumor en ratones sin sistema inmune, que han recibido implantes de PC-3. Los ratones se separaron en diferentes grupos, que recibe cada uno diferentes cantidades de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) o reactivos de control. Se inyectó PCK3145 por vía intravenosa o intraperitoneal. Los diferentes grupos usados en estos experimentos se ilustran en la siguiente tabla 7. Cada grupo contenía 9 ratones.

TABLA 7

Grupo de tratamiento

Productos de ensayo y de control Nivel de dosis (imagen1 g/kg/día) Nº de animales Nº de tumores

1 Control negativo

PBS 0 9 18

2

PCK3145 IV 10 9 18

3

PCK3145 IV 100 9 18

4

PCK3145 IV 500 9 18

5

PCK3145 IV 1000 9 18

6

PCK3145 IP 100 9 18

7

PCK3145 IP 1000 9 18

5

Los resultados de este experimento (figura 27) demostraron un retraso significativo del crecimiento del tumor después de tratamiento con PCK3145 con 100 µg/kg/día por vía intravenosa. Este efecto era estadística-mente significativo los días 13, 17 y 20 después de implantar el tumor cuando se comparó por ensayo t de Student (los valores p eran de p=0,005, 0,025 y 0,011, respectivamente para cada dato de tiempo) (valores p medi

10 dos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). No se observó efecto antitumoral significativo después de tratamiento con PCK3145 con los otros niveles de dosificación de 10, 500 y 1000 µg/kg/día inyectados por vía intravenosa. Sin embargo, se observó una tendencia hacia la significancia después de tratamiento con dosis de 500 y 1000 µg/kg/día de PCK3145. El tratamiento de los ratones con PCK3145 con 100 y 1000 µg/kg/día administrado por vía intraperitoneal, mostró una tendencia de retraso del

15 crecimiento del tumor similar con una diferencia estadísticamente menos significativa observada el día 13 p.i.t. (p = 0,056) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante), con la dosis más alta de 1000 µg/kg/día (figura 27).

Durante el transcurso del experimento usando el modelo de xenoinjerto en ratón sin sistema inmune con cáncer de próstata humano PC-3, los resultados obtenidos han sugerido que la inyección subcutánea de 20 PCK3145 en un sitio (es decir, en la nuca) distante del sitio del tumor, puede no ser suficientemente eficaz y es posible que sea improbable el resultado de un efecto antitumoral, al menos en las condiciones experimentales ensayadas (dosis de PCK3145 ensayadas: 10 µg/kg/día y 100 µg/kg/día). El uso de la nuca como un sitio de inyección subcutánea representa un sitio óptimo para la inducción de respuesta inmunitaria más que una vía para la administración de producto terapéutico, y por lo tanto, se espera que la selección de este sitio sea un sitio

25 subóptimo para evaluar la eficacia en el tumor.

EJEMPLO 17 EXPERIMENTOS IN VIVO USANDO LA LÍNEA DE CÁNCER DE PRÓSTATA MAT LYLU DE RATA DUNNING

Se llevó a cabo la evaluación de la eficacia antitumoral de PCK3145 frente al tumor Mat LyLu (MLL)

30 implantado en ratas Copenhagen. (Protocolo basado en S. Garde y col.; The Prostate, 22: 225-233, 1993). Se recogieron células de tumor Mat LyLu en fase semilogarítmica de matraces de cultivo, por tripsinización, se centrifugaron a 1200 rotaciones por minuto (rpm) y se lavaron 3 veces con disolución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Después del lavado, las células se contaron y se ajustaron a una concentración de 5 x 106 células/ml en

5

10

15

20

25

30

-34

HBSS. Se administró un volumen de inóculo de células tumorales de 0,1 ml que contenía 5 x 105 células, por vía subcutánea en el costado de cada rata. El tratamiento empezó el día 3 postimplante de tumor (p.i.t.) por inyección subcutánea local (es decir, en la zona trasera afeitada justo debajo del sitio del implante de tumor) de diferentes concentraciones de PCK3145). Este tratamiento continuó diariamente durante 16 días. Los experimentos se terminaron 24 días después del último tratamiento. Se tomaron medidas de los tumores los días 7, 9, 11, 14, 16 y 18. Los volúmenes de los tumores se calculan de acuerdo con la fórmula (axb2 x 0,5), en la que a es la longitud del diámetro mayor, b es la anchura del diámetro menor perpendicular. El día 19, se extirparon y pesaron los tumores de las ratas individuales.

El estudio Nº: MLL-5 ilustra la eficacia de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) comparado con el polipéptido 7-21 (ID SEC Nº: 4) y el polipéptido 76-94 (ID SEC Nº: 6) en el retraso del crecimiento de tumor en ratas Copenhagen, que han recibido implantes de Mat LyLu. Los ratones se separaron en grupos diferentes, recibiendo cada uno diferentes cantidades de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) o reactivos de control. Se inyectó PCK3145 por vía subcutánea. Los diferentes grupos usados en estos experimentos se ilustran en la siguiente tabla 8. Cada grupo contenía 8 ratones.

TABLA 8

Grupo de tratamiento

Productos de ensayo y de control Nivel de dosis (imagen1 g/kg/día) Nº de animales Nº de tumores

1 Control negativo

PBS 0 8 8

2

Polipéptido 7-21 10 8 8

3

Polipéptido 7-21 1 8 8

4

PCK3145 10 8 8

5

PCK3145 1 8 8

6

Polipéptido 76-94 10 8 8

7

Polipéptido 76-94 1 8 8

Los resultados de este estudio (figura 28) demostraron un efecto antitumoral significativo después de administración de PCK3145 con 10 µg/kg/día. Esto se puso de manifiesto por una reducción significativa del volumen del tumor los días 11 (p=0,006), 13 (p=0,00001), 16 (p=0,002) y 18(p=0,004), después de implantar las células tumorales comparado con el grupo de control tratado con PBS (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). No se observó efecto significativo después de tratamiento con PCK3145 con 1 µg/kg/día. Es interesante destacar que el polipéptido 7-21 extremo amino también demostró un efecto antitumoral comparable, que también se observó en el modelo de xenoinjerto de ratón sin sistema inmune de PC-3, que indicaba la posibilidad de un sitio activo que se solapaba entre las regiones N-terminal y la central de la proteína. Esto se puso de manifiesto por una reducción significativa del volumen del tumor, observada los días 13 (p=0,05), 16 (p=0,00005), y 18 (p=0,01) en ratones tratados con el polipéptido 7-21 (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante).

El estudio nº: MLL-6 ilustra la eficacia de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) en el retraso del crecimiento de tumor en ratas Copenhagen, que han recibido implantes de Mat LyLu. Los ratones se separaron en diferentes grupos, que recibía cada uno diferentes cantidades de PCK3145 (ID SEC Nº: 5) o reactivos de control. PCK3145 se inyectó por vía subcutánea. Los diferentes grupos usados en estos experimentos se ilustran en la siguiente tabla

5

10

15

20

25

30

-35

9. Cada grupo contenía 8 ratones. La doxorrubicina se administró como un solo bolo por inyección intravenosa el día 3 p.i.t.

TABLA 9

Grupo de tratamiento

Productos de ensayo y de control Nivel de dosis (imagen1 g/kg/día) Nº de animales Nº de tumores

1 (Control negativo)

PBS 0 8 8

2

Doxorrubicina 5000 8 8

3

PCK3145 10 8 8

4

PCK3145 100 8 8

5

Polipéptido desordenado 10 8 8

6

Polipéptido desordenado 100 8 8

Los resultados de este estudio (figuras 29 y 30) demostraron un efecto antitumoral significativo dependiente de la dosis después de administración de PCK3145 con 10 y 100 µg/kg/día. Esto se puso de manifiesto por una reducción significativa del volumen del tumor (31% frente al control) después de tratamiento con PCK3145, en especial con 100 µg/kg/día, los días 14, 16 y 18 después de implantar las células tumorales (figura 29). El valor p frente al grupo con tratamiento de control negativo (es decir, el polipéptido desordenado (PB111)) era muy significativo a p=0,0000062 (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). También se observó una extensión moderada del retraso en el crecimiento (significancia estadística marginal a p = 0,03 frente al grupo de control tratado con PBS) después de tratamiento con el polipéptido desordenado con una concentración de 100 µg/kg/día (figura 29) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). El tratamiento con doxorrubicina era muy significativo dando como resultado una reducción de aproximadamente 80% de los volúmenes de los tumores. Este efecto antitumoral de PCK3145 con 100 µg/kg/día también se reprodujo después de analizar los datos de los pesos de los tumores. Como se muestra en la figura 30 (datos de pesos de los tumores) se observó una reducción significativa de los pesos de los tumores (p=0,0003) el día 18 p.i.t. (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). Esto representaba una reducción de 34% de la masa de tumor, una diferencia de 20 gramos entre el grupo de control (56,6 g) y el tratado con PCK3145 con 100 µg/kg/día (37,2 g). Esta diferencia de pesos de los tumores también era estadísticamente significativa cuando se comparó con los pesos de los tumores de las ratas de control tratadas con el polipéptido desordenado administrado con la misma dosis de 100 µg/kg/día (p=0,003) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante). La comparación de los pesos de los tumores tratados con el polipéptido desordenado con los pesos de los tumores de control no tratados con PBS no era estadísticamente significativa (p=0,006) (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante).

EJEMPLO 18 EFICACIA DEL TRATAMIENTO DE COMBINACIÓN DE PCK3145 Y TAXOTERE

Con el fin de ensayar la eficacia del tratamiento de combinación en el retraso del crecimiento tumoral, se coadministraron PCK3145 y taxotere (es decir, docetaxel) en ratones sin sistema inmune inoculados previamente con células tumorales PC-3. Los ratones se separaron en diferentes grupos que recibían PCK3145 solo o PCK3145 en combinación con taxotere (administrados por vías separadas) o reactivo de control (es decir, PBS). En este experimento, se inició el tratamiento de combinación frente a cargas tumorales relativamente grandes. Los tumores se dejaron crecer más allá del tamaño de 50 a 60 mm3, al cual el tratamiento con PCK3145 normalmente se convertía en ineficaz. PCK3145 se inyectó por vía intravenosa cada dos días durante 28 días

5 empezando el día 1 cuando eran claros tumores subcutáneos de tamaño de 50 a 60 mm3. Se inyectó taxotere por vía intraperitoneal con una concentración subóptima de 2 mg/kg los días 4 y 11 después de ser evidentes los tumores subcutáneos. Los diferentes grupos usados en este experimento se ilustran en la siguiente tabla 10. Cada grupo contenía 10 ratones.

10 TABLA 10

Grupo de tratamiento

Productos de ensayo y de control Nivel de dosis (imagen1 g/kg/día) Nº de animales Nº de tumores

1.Control negativo

PBS 0 11 11

2. Control positivo

Taxotere 2000 11 11

3.

PCK3145 100 11 11

4.

PCK3145 + taxotere 100 + 2000 11 11

Los resultados de este experimento (figura 31) demuestran un retraso significativo del crecimiento del tumor después del tratamiento de combinación de PCK3145 y taxotere. Este efecto es estadísticamente significativo los días 19 y 22 después de inocular la células tumorales cuando se compara por el ensayo t de Student (p=0,02 el día 19 y p=0,047 el día 22), (valores p medidos por ensayo t de Student para datos no emparejados con p<0,05 como límite discriminante) y era notablemente mejor que con taxotere administrado solo con la misma dosis de 2 mg/kg (dosis subóptima).

LISTADO DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: PROCYON BIOPHARMA INC.

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PREPARACIONES FARMACÉUTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA INHIBIR TUMORES

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 92

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A)

DESTINATARIO: BROULLETTE KOSIE

(B)

CALLE: 1100 RENE-LESVEQUE BLVD WEST

(C)

PROV./ESTADO: QUEBEC

(D)

PAÍS: CANADÁ

(E)

CÓDIGO POSTAL/ZIP: H3B 5C9

(v)

FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:

(A)

TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE

(B)

ORDENADOR: PC IBM COMPATIBLE

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: ASCII (TEXT)

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 2.321.256

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-10-2000

(C)

CLASIFICACIÓN: A61K-38/17

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 2.355.334

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-08-2001

(viii) INFORMACIÓN DEL AGENTE DE PATENTE/APODERADO:

(A)

NOMBRE: BROULLETTE KOSIE

(B)

Nº DE REGISTRO: 3939

(C)

Nº DE REFERENCIA/EXPEDIENTE:

(D)

Nº TEL.: (514) 397 8500

(E)

Nº FAX: (514) 397 8515

(2)

INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 94 AMINOÁCIDOS

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

(iii) HIPOTÉTICA:

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO:

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(viii) POSICIÓN EN EL GENOMA

(A)

CROMOSOMA/SEGMENTO:

(B)

POSICIÓN EN EL MAPA:

(C)

UNIDADES:

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE:

(B)

LOCALIZACIÓN:

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN:

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

(x)

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

(A)

AUTORES:

(B)

TÍTULO:

(C)

REVISTA:

(D)

VOLUMEN:

(E)

NÚMERO:

(F)

PÁGINAS:

(G)

FECHA:

(H)

DOCUMENTO Nº:

(I)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

(J)

FECHA DE PUBLICACIÓN:

(K)

RESTOS RELEVANTES EN EL ID SEC Nº:1:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 2:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 102 AMINOÁCIDOS 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDOS

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii)TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 10 AMINOÁCIDOS

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL (ii)TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 AMINOÁCIDOS

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(x)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 AMINOÁCIDOS

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL (ii)TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 AMINOÁCIDOS

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 7: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26

(B)

TIPO: NUCLEÓTIDOS

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

15 (2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21

(B)

TIPO: NUCLEÓTIDOS

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 20 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:

imagen3

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD:

(B)

TIPO: NUCLEÓTIDOS 30 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 35 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 9:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 16

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 10:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 17

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 11:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 18

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 12:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 13:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 20

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(x) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 14:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 15: 25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 30 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 15:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 16:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 22 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 16:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 23

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 17:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 18: 25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 30 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 18:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 25

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 10 vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 19:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 20: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 20:

imagen2

25 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 30 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 21:

imagen2

5 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 10 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 22:

imagen4

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 29

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 20 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 23:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 24:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 24:

imagen2

5 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 25:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 10 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 25:

imagen4

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 26:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 32

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 26:

imagen3

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 27:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 27:

imagen2

5 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 28:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 34

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 10 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 28:

imagen4

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 29:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 35

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 20 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 29:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 30:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 36

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 30:

imagen2

10 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 31:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 37

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 15 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 31:

imagen5

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 32:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 38

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 32:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 33:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 39 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 33:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 34:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 40

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: (vi) FUENTE ORIGINAL: 20 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 34:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 35:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 41

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 35:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 36:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 42

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 15 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 36:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 37: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 43

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 25 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 37: 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 38:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 44 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 38:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 39:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 45

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 39:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 40:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 46

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 40:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 41:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 47

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: (vi) FUENTE ORIGINAL: 15 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 41:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 42:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 48

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 25 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 42: 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 43:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 49 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 43:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 44:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 50

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 44: 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 45:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 51 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 45:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 46:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 52

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 46: 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 47:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 53 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 47:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 48:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 54 15 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 20 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 48: 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 49:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 55

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 5 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 49:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 50:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 56 15 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 20 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 50:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 51:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 57

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 51:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 52:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 58 10 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 15 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 52:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 53:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 59

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 25 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 53:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 54: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 54:

imagen2

15 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 55:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 61

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 20 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 55:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 56:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 62 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 56:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 57:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 63

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 57: 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 58:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 64 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 58:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 59:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 16

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 59:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 60:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 17

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 60:

imagen6

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 61:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 15 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 61:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 62:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 25 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 30 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 62:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 63:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 63:

imagen2

10 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 64:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 15 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 64:

imagen5

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 65:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 22

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 65:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 66:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 66:

imagen6

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 67:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 15 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 67:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 68:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 25 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 30 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 68:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 69:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 26

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 5 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 69:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 70:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 15 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 20 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 70:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 71:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 25 (A) LONGITUD: 28

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 30 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 71:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 72:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 5 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 72:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 73:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 30

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 73:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 74: 25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 30 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 74:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 75: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 32

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 75:

imagen2

15 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 76:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 20 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 76:

imagen3

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 77:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 34

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 77:

imagen7

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 78:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 35

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 10 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 78:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 79:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 36 20 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 25 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 79: 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 80:

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 37

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO 5 (C) TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 80:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 81:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 38 15 (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 20 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 81:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 82:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 25 (A) LONGITUD: 39

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 30 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 82:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 83: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 40

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 83:

imagen2

15 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 84:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 41

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 20 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 84:

imagen3

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 85:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 42

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 85:

imagen2

10 2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 86:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 43

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE CADENA: SENCILLA 15 (D) TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 86:

imagen5

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 87:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 44

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 87:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 88:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 45 5 (C) TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 88:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 89:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 15

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 20 (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

(ix)

CARACTERÍSTICAS: 25 A) NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 4

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es treonina o serina.

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado 30 (B) LOCALIZACIÓN: 6

(D) OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 8

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 9

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es treonina o serina.

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 11

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es treonina o serina.

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 13

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es tirosina o fenilalanina.

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 14

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

(B)

LOCALIZACIÓN: 15

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El resto en esta posición es treonina o serina.

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 89:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 90:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 90:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 91:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 45

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: 10 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 91:

imagen2

2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 92: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

(C)

TIPO DE CADENA: SENCILLA

(D) TOPOLOGÍA: LINEAL 20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 92:

imagen2

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> PROCYON BIOPHARMA INC.

<120> PREPARACIONES FARMACÉUTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA INHIBIR TUMORES

<130> 06508-030-wo-03

<150> 2.321.256

<151> 16-10-2000 5 <150> 2.355.334

<151> 20-08-2001

<160> 92

<210> ID SEC Nº: 1

<211> 94 10 <212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 2

<211> 102

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 3

<211> 10

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 4

<211> 15

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

imagen2

<210> ID SEC Nº: 5 15 <211> 15

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 6

<211> 19

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 7

<211> 26

<212> ADN 5 <213>

imagen2

<210> ID SEC Nº:8

<211> 21 10 <212> ADN

<213>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 9 15 <211> 285

<212> ADN

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 10

<211> 16

<212> PRT

<213>

imagen8

<210> ID SEC Nº: 11

<211> 17

<212> PRT

<213>

30 <400>

<210> ID SEC Nº: 12

<211> 18

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 13

<211> 19

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 14

<211> 20

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 15

<211> 21

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 16

<211> 22

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 17

<211> 23

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 18

<211> 24

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 19

<211> 25

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 20

<211> 26

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 21

<211> 27

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 22

<211> 28

<212> PRT

<213>

<210> ID SEC Nº: 23

<211> 29

<212> PRT

<213>

15 <400>

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen9

imagen2

<210> ID SEC Nº: 24

<211> 30

<212> PRT 20 <213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 25

<211> 31

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 26

<211> 32

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 27

<211> 33

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210>

ID SEC Nº: 28 15 <211> 34

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 29

<211> 35

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 30

<211> 36

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 31

<211> 37

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 32 15 <211> 38

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 33

<211> 39

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 34

<211> 40

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 35 10 <211> 41

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 36

<211> 42

<212> PRT

<213>

imagen10

<210> ID SEC Nº: 37

<211> 43

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 38

<211> 44

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 39

<211> 45

<212> PRT

<213>

imagen11

<210> ID SEC Nº: 40

<211> 46

<212> PRT

<213> 20 <400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 41

<211> 47

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 42

<211> 48

<212> PRT 10 <213>

<400>

imagen2

<210>

ID SEC Nº: 43 15 <211> 49

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 44

<211> 50

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 45

<211> 51

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 46

<211> 52

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 47 15 <211> 53

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 48

<211> 54

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 49

<211> 55

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 50 15 <211> 56

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 51

<211> 57

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 52

<211> 58

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 53 15 <211> 59

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 54

<211> 60

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 55

<211> 61

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 56 15 <211> 62

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 57

<211> 63

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 58

<211> 64

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 59 15 <211> 16

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 60

<211> 17

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 61

<211> 18

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 62

<211> 19

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 63

<211> 20

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 64

<211> 21

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 65

<211> 22

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 66 10 <211> 23

imagen2

imagen2

imagen2

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imagen2

imagen2

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imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 67

<211> 24

<212> PRT

<213>

imagen10

<210> ID SEC Nº: 68

<211> 25

<212> PRT

<213>

25 <400>

<210> ID SEC Nº: 69

<211> 26

<212> PRT

<213>

<210> ID SEC Nº: 70

<211> 27

<212> PRT

<213>

10 <400>

imagen2

imagen12

imagen2

<210> ID SEC Nº: 71

<211> 28

<212> PRT 15 <213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 72

<211> 29

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 73 25 <211> 30

<212> PRT <213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 74

<211> 31

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 75

<211> 32

<212> PRT

<213>

imagen11

<210> ID SEC Nº: 76

<211> 33

<212> PRT

<213> 20 <400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 77

<211> 34

<212> PRT 25 <213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 78

<211> 35

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 79

<211> 36

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210>

ID SEC Nº: 80 15 <211> 37

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 81

<211> 38

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 82

<211> 39

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 83

<211> 40

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 84 15 <211> 41

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 85

<211> 42

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 86

<211> 43

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 87 10 <211> 44

<212> PRT

<213>

<400>

<210> ID SEC Nº: 88

<211> 45

<212> PRT

<213>

<210> ID SEC Nº: 89

<211> 15

<212> PRT

<213>

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 1

<223> El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 4

<223> El resto en esta posición es treonina o serina.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 6

<223> El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 8

<223> El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 9

<223> El resto en esta posición es treonina o serina.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 11

<223> El resto en esta posición es treonina o serina.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 13

<223> El resto en esta posición es tirosina o fenilalanina.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 14

<223> El resto en esta posición es ácido glutámico, asparagina o ácido aspártico.

<220>

<221> Sitio modificado

<222> 15

<223> El resto en esta posición es treonina o serina.

<400>

<210> ID SEC Nº: 90

<211> 30

<212> PRT

<213>

<400>

<210>

ID SEC Nº: 91 10 <211> 45

imagen2

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imagen2

imagen10

imagen2

imagen2

<212> PRT

<213>

<400>

imagen2

<210> ID SEC Nº: 92

<211> 60

<212> PRT

<213>

imagen10

Claims (13)

1.

Un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el ID SEC Nº: 5.

2.

Un polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido se modifica por la adición del grupo acetamidometilo (ACM).

3.

Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, para usar en la inhibición del crecimiento de un tumor.

4.

Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, para usar en la inhibición del crecimiento de adenocarcinoma prostático, cáncer de estómago, cáncer de mama, endometrio, ovárico u otros cánceres de secreción epitelial, o la hiperplasia prostática benigna (HPB).

5.

Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, para usar en combinación con un fármaco anticancerígeno para inhibir el crecimiento de un tumor.

6.

Un polipéptido según la reivindicación 5, en el que dicho fármaco anticancerígeno se selecciona del grupo que consiste en mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5-fluoro-uracilo, metotrexato, adriamicina, daunomicina, taxol, derivado de taxol y mezclas de los mismos.

7.

Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, para usar en el tratamiento de pacientes con una enfermedad caracterizada por niveles elevados de FSH.

8.

Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9.

Una composición farmacéutica según la reivindicación 8, que además comprende un fármaco anticancerígeno.

10.

Una composición farmacéutica según la reivindicación 9, en la que dicho fármaco anticancerígeno se selecciona del grupo que consiste en mitomicina, idarrubicina, cisplatino, 5-fluoro-uracilo, metotrexato, adriamicina, daunomicina, taxol, derivado de taxol y mezclas de los mismos.

11.

Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que además comprende un medio de liberación en el tiempo, seleccionado del grupo que consiste en liposomas y polisacáridos, para realizar la dosificación continua de la composición.

12.

Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para usar en la inhibición del crecimiento tumoral en un paciente que padece adenocarcinoma prostático, cáncer de estómago, cáncer de mama, endometrio, ovárico u otros cánceres de secreción epitelial, o la hiperplasia prostática benigna (HPB).

13.

Una composición farmacéutica según la reivindicación 8, para usar en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por niveles elevados de FSH.