ES2351153T3 - Uso de bacterias del acido láctico para disminuir el sangrado de las encías y la inflamación oral. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para seleccionar una cepa de bacterias del ácido láctico para la administración externa a un ser humano que comprende seleccionar células de al menos una cepa de lactobacilos del grupo que consiste en Lactobacillus reuteri "Prodentis" (ATCC PTA 5289) y Lactobacillus reuteri FJ3 (ATCC PTA-5290), cepas que tienen propiedades anti- microbianas, anti-inflamatorias y de adhesión a la mucina oral, y que tienen la capacidad de producir vitamina K.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la selección y al uso de cepas de bacterias del ácido láctico antiinflamatorias y contra el sangrado, y a productos que usan tales cepas para el tratamiento y la profilaxis del sangrado de las encías, la gingivitis y la periodontitis provocados por la inflamación oral.

Descripción de la técnica relacionada

Se ha considerado que el sangrado de las encías se debe principalmente a una eliminación inadecuada de la placa de los dientes de la línea de la encía. La placa es un material pegajoso que se desarrolla en las partes expuestas de los dientes, que consta de bacterias, mucosidad y restos de comida. Es una causa muy importante de la caries dental. La placa que no es eliminada se mineraliza en un depósito duro denominado sarro que queda atrapado en la base del diente. La placa y el sarro irritan e inflaman la encía. En última instancia, esto conducirá al aumento del sangrado y a una forma más avanzada de enfermedad de la encía y la mandíbula conocida como periodontitis.

La gingivitis es una de las inflamaciones crónicas más comunes en los seres humanos. La gingivitis, una forma de enfermedad periodontal, es una afección en la que la encía ha perdido su aspecto normal y se ha hinchado, se ha ablandado y ha enrojecido.

Las causas comunes de los problemas dentales y de encías, tales como la gingivitis, también incluyen la periodontitis (forma avanzada de la gingivitis), los anticoagulantes, tales como el cumafeno y la heparina, la abrasión producida por el cepillo de dientes, el uso inadecuado del hilo dental, la infección, que puede estar relacionada con los dientes o con la encía, la deficiencia de vitamina C, la deficiencia de vitamina K, los cambios hormonales producidos durante el embarazo, los irritantes químicos tales como la aspirina, la leucemia, la colocación de nuevas dentaduras que conduce a llagas/irritaciones de la dentadura y la púrpura trombocitopénica idiopática. Generalmente, la enfermedad periodontal se produce cuando la inflamación y la infección destruyen los tejidos que soportan lo dientes, incluyendo la encía, los ligamentos periodontales y los alvéolos dentales (hueso alveolar). Los dientes mal alineados, los bordes rugosos de los empastes, los aparatos bucales mal ajustados o sucios (tales como los aparatos ortodóncicos, las dentaduras, los puentes y las coronas) pueden irritar las encías y aumentar el riesgo de gingivitis. Las medicaciones tales como la fenitoína y las píldoras de control de natalidad, y la ingestión de metales pesados, tales como el plomo y el bismuto, también están asociados a la gingivitis.

La gingivitis y la periodontitis están provocadas por varios mecanismos que incluyen la acumulación de bacterias en el bolsillo dental, iniciando una reacción inflamatoria y los efectos a largo plazo de los depósitos de placa. Si la inflamación y la degradación del colágeno aumentan y llega mucho más abajo en el interior del bolsillo, la gingivitis se convierte en periodontitis. Para el paciente, la consecuencia inmediata de las llagas y del sangrado de las encías es que se dificulta la limpieza dental. En los casos agudos y graves, el paciente puede verse afectado de manera más generalizada y tener fiebre. Además, se ha publicado que los efectos secundarios de la inflamación y del sangrado oral están asociados tanto a la enfermedad cardíaca como al parto prematuro espontáneo. Las complicaciones incluyen la recurrencia de la gingivitis, la periodontitis, la infección y el absceso de la encía o de las mandíbulas y la boca de trinchera.

Como la gingivitis es la primera fase que conduce a la periodontitis, el tratamiento y las medidas preventivas se encuentran entre los desafíos más comunes de los dentistas de hoy. Hoy en día, la primera medida para tratar la gingivitis es mejorar la higiene oral del paciente y, en ocasiones, se usa un tratamiento con clorhexidina o antibióticos.

Si un dentista determina que el paciente tiene alguna pérdida ósea o que las encías se han retirado de los dientes, el tratamiento estándar es una profunda limpieza intensiva, un procedimiento no quirúrgico denominado raspado y alisado radicular (SRP). El raspado raspa la placa y el sarro de arriba a abajo de la línea de la encía. El alisado radicular pule las zonas rugosas de la raíz dental en la que se acumulan gérmenes y ayuda a eliminar las bacterias que pueden contribuir a la enfermedad. Esta superficie alisada y limpia ayuda a permitir que las encías se vuelvan a unir a los dientes.

En 1998, la FDA aprobó un fármaco relativamente nuevo que se añade al arsenal destinado a combatir la grave enfermedad de las encías denominado Periostat (hiclato de doxiciclina) para su uso en combinación con el SRP. Mientras que el SRP elimina fundamentalmente las bacterias, el Periostat, que se toma oralmente, inhibe la acción de la colagenasa, una enzima que provoca la destrucción de los dientes y de las encías. Se pueden usar tratamientos con antibióticos bien en combinación con la cirugía y otras terapias, o solos, para reducir o eliminar temporalmente las bacterias asociadas con la enfermedad periodontal. Sin embargo, los doctores, los dentistas y los funcionarios de la salud pública están cada vez más concienciados de que el uso excesivo de estos antibióticos puede aumentar el riesgo de la resistencia bacteriana a estos fármacos. Cuando los gérmenes se vuelven resistentes a los antibióticos, los fármacos pierden su capacidad de luchar contra la infección. También hay geles, fibras o escamas de antibiótico que se aplican directamente en el bolsillo infectado. En algunos casos, el dentista prescribirá un enjuague bucal especial contra los gérmenes que contiene clorhexidina para ayudar a controlar la placa y la gingivitis. También se encuentra disponible una pasta de dientes que no requiere receta médica que contiene el triclosán antibacteriano. El ingrediente antibacteriano que se reivindica reduce la placa y la gingivitis resultante, pero sus efectos clínicos son débiles.

Se sabe que hay varias especies bacterianas diferentes (entre otras Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacterioides forsythus, Campylobacter rectus y Selenomonas noxia) implicadas en la patogénesis de las enfermedades periodontales. No se sabe si estas bacterias están provocando las enfermedades o si su presencia tiene lugar como un resultado oportunista del cambio de la composición de las biopelículas lo que, a su vez, hace avanzar a la enfermedad. La progresión de la enfermedad depende de varios cambios en la microflora, en el fluido crevicular gingival y en la interacción con la defensa innata del huésped.

Las enfermedades periodontales están muy extendidas en el mundo industrializado. Muchas personas padecen gingivitis en un grado variable. Habitualmente, se desarrolla durante la pubertad o la edad adulta temprana debido a cambios hormonales, y puede perdurar o recurrir con frecuencia, en función de la salud de los dientes y de las encías. En función de la edad y del género, el 45–70% de los ciudadanos estadounidenses de más de 13 años padecen sangrado de encías. La prevalencia es mayor entre aquéllos con una edad de 13–17 años, y menor a los 35– 44 años, edad a partir de la cual la prevalencia vuelve a aumentar ligeramente. Cuando se convierte en la forma más grave de enfermedad periodontal, la periodontitis (definida como una pérdida de unión que supera los 3 mm) ocurre en el 30–40% de las personas de 30–39 años, y luego aumenta linealmente al aumentar la edad hasta el 85–90% a los 80–90 años. Probablemente, la situación es similar en Europa y en el resto del mundo industrializado. Los datos de Suecia indican que cerca de 3 millones de habitantes tienen problemas de sangrado de las encías.

Normalmente, al dentista se recurre cuando los signos de gingivitis están presentes. Los dentistas examinarán la boca y los dientes, en busca de una encía blanda, hinchada y de color rojo–púrpura. Los depósitos de placa y sarro pueden ser visibles en la base de los dientes. Habitualmente, las encías no duelen o están ligeramente sensibles. Habitualmente, no se hacen más pruebas, aunque se puede hacer una radiografía dental y un sondado dentogingival (medición de la cantidad de hueso) para determinar si se ha desarrollado periodontitis (propagación de la inflamación hasta las estructuras que soportan los dientes). La eliminación de la placa de las encías inflamadas puede ser incómoda. A veces, se usarán medicamentos anti– inflamatorios que no requieren receta médica para paliar las molestias derivadas de una limpieza en profundidad. Las encías sanas tienen un aspecto rosado y firme. Se recomienda el mantenimiento de una estricta higiene oral durante toda la vida del paciente, o la gingivitis volverá a aparecer.

El objetivo del tratamiento de la gingivitis consiste en reducir la inflamación y el sangrado de las encías. El tratamiento normal incluye una limpieza a fondo de los dientes por parte del dentista o el higienista dental. Esto puede implicar el uso de diversos instrumentos o dispositivos para despegar y eliminar los depósitos de los dientes (eliminación del sarro). El dentista o el higienista a menudo realizarán técnicas de cepillado y de uso del hilo dental. Se puede recomendar una limpieza dental por parte de un profesional, además del cepillado y del uso del hilo dental, dos veces al año o con mayor frecuencia en los casos graves. Se pueden recomendar enjuagues bucales antibacterianos u otras ayudas además del cepillado de dientes y el uso del hilo dental frecuente y en profundidad.

Para el tratamiento de la periodontitis, la estrategia principal es similar al tratamiento de la gingivitis; sin embargo, debido a la gravedad de la enfermedad, pueden ser necesarios otros procedimientos. El objetivo del tratamiento consiste en reducir la inflamación, eliminar los bolsillos si están presentes y tratar cualquier causa subyacente. Los irritantes dentales, tales como las superficies rugosas de los aparatos dentales, deberían ser reparados. Es importante limpiarse los dientes en profundidad. Por lo tanto, se recomienda firmemente el raspado. Es necesaria una higiene oral meticulosa realizada en casa tras la limpieza dental por parte de un profesional para limitar una mayor destrucción. El dentista o el higienista a menudo realizarán técnicas de cepillado y de uso del hilo dental. Con la periodontitis, a menudo se recomienda una limpieza dental profesional con mayor frecuencia que las dos veces al año recomendadas habitualmente. Puede ser necesario un tratamiento quirúrgico. Puede ser necesario abrir los bolsillos profundos y limpiarlos. Puede ser necesario sujetar los dientes sueltos. Puede ser necesaria la extracción (retirada) de un diente en el caso de la periodontitis avanzada, de manera que la destrucción no se extienda a los dientes adyacentes.

A pesar del relativo éxito del tratamiento agudo realizado por profesionales, es ampliamente sabido que muchos pacientes diagnosticados y tratados volverán a la siguiente cita en un estado similar o peor. La limpieza dental regular por parte de un profesional es importante para eliminar la placa que se puede desarrollar incluso con un cepillado y un uso del hilo dental meticulosos. Muchos dentistas recomiendan una limpieza dental por parte de un profesional al menos cada 6 meses.

En general, se conoce ampliamente la posibilidad de una actividad antibacteriana eficaz por varios lactobacilos, pero no se ha averiguado mucho acerca de las diferencias entre las cepas de bacterias del ácido láctico en cuanto a su capacidad para reducir la inflamación en el huésped, ni acerca de la posibilidad de seleccionar tales cepas. Sin embargo, ahora esto es posible (W02004031368).

La cavidad oral de los seres humanos y de otros mamíferos contiene especies muy

diferentes de bacterias, que incluyen un número de diferentes especies de bacterias del ácido láctico. Ha habido cierta especulación acerca de la posibilidad de que esas bacterias del ácido láctico tengan un efecto positivo en la inflamación oral y de que sean beneficiosas en términos de la reducción de la gingivitis y del sangrado de las encías. Por ejemplo, Lactobacillus reuteri es un componente muy importante de la población de lactobacilos que habita de manera natural en los seres humanos y los animales. El organismo ha sido estudiado ampliamente como un probiótico durante los últimos diez años, y se ha descubierto que posee una serie de propiedades interesantes. La invención descrita en la presente memoria se diferencia del uso probiótico general de las bacterias del ácido láctico en que las bacterias no necesitan ser digeridas; la presencia de las bacterias del ácido láctico localmente en la bio–película oral cerca de la zona gingival es suficiente para obtener los efectos contra al sangrado de la invención. Para usar las cepas de la invención, basta con que una persona use una goma de mascar o un producto de enjuague bucal que tenga las bacterias del ácido láctico, y escupa el producto transcurrido un tiempo suficiente en este escenario. El efecto frente el sangrado y anti–inflamatorio se puede detectar en unos días.

Las cepas de una amplia variedad de especies de lactobacilos, incluyendo Lactobacillus reuteri, se han usado en formulaciones antimicrobianas. Lactobacillus reuteri es uno de los habitantes naturales del tracto gastrointestinal de los animales, y se encuentra habitualmente en los intestinos y, ocasionalmente, en el canal del parto, la leche materna y la boca de los animales sanos, incluyendo los seres humanos. Se sabe que tiene una actividad antibacteriana. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.º 5.439.678, 5.458.875, 5.534.253, 5.837.238 y

5.849.289. Cuando las células de L. reuteri se desarrollan en condiciones anaeróbicas en presencia de glicerol, producen la sustancia antimicrobiana conocida como reuterín (β–hidroxi– propionaldehído). Se han publicado otras sustancias antimicrobianas además de los tradicionales ácidos orgánicos, tales como la "Reutericiclina" (Höltzel, A. et al. Angewandte Chemie International Edition 39, 2766 – 2768, 2000) y "PCA (ácido piroglutámico)" (Yang, Z. Dissertation, Univ. de Helsinki, marzo de 2000) y "Reutericina 6" (Toba T, et al., Lett Appl Microbiol 13: 281–6). Los lactobacilos, incluyendo L. reuteri, también son ampliamente conocidos por su capacidad para inhibir diversos organismos patógenos a través de la competición local de los nutrientes y de otras interacciones metabólicas.

Se han aislado y descrito proteínas de unión a la mucina de L. reuteri. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 6.100.388. Se ha publicado que las cepas de lactobacilos se adhieren a diversas líneas celulares y mucosidad del huésped (Klemm, P. y Schembri, M. A. (2000) “Bacterial adhesins: function and structure”. Int. J. Med. Microbiol. 290, 27–35). Sin embargo, la existencia de importantes diferencias entre una capacidad de las cepas de lactobacilos para adherirse a la mucina oral y a la mucina de otras fuentes no es tan conocida. Algunas cepas se adhieren bien tanto a la mucina oral como a otra mucina, por ejemplo, a la mucina gástrica; otras sólo se adhieren bien a la mucina gástrica y menos a la mucina oral; otras no se adhieren bien a ningún tipo de mucina. Por lo tanto, el uso de mucina oral para encontrar las mejores cepas forma parte del procedimiento de selección de esta invención.

Mientras que se conoce la posibilidad de características antibacterianas, anti– inflamatorias y de unión eficaces por parte de L. reuteri y de otras bacterias del ácido láctico, así como la capacidad de algunas bacterias para segregar vitamina K (menaquinonas), antes no se conocía la existencia de diferencias sustanciales entre las cepas de bacterias del ácido láctico en cuanto a su capacidad para disminuir el sangrado de las encías y reducir la gingivitis, ni que tales cepas se pudieran seleccionar. Actualmente, en general, también se reconoce que la biosíntesis de las menaquinonas aumenta en anaerobiosis (Bentley et. al., Microbiological review Sept. 1982, p.241–280), lo que significa que la capacidad de las cepas seleccionadas para producir vitamina K con el fin de ayudar a disminuir el sangrado aumentará en las zonas más cercanas a la zona gingival, zona en la que más se necesita.

La vitamina K es un grupo de tres sustancias seleccionadas. La K1 (fitonadiona) de origen vegetal, la K2 (menaquinona) de origen bacteriano, la K3 (menadiona), de origen sintético. La vitamina K es necesaria para la coagulación sanguínea normal. Se necesita para la síntesis de la protombina y de otras proteínas (Factores IX, VII y X) implicadas en la coagulación sanguínea.

Se han publicado varios casos de sangrado excesivo en personas que toman antibióticos. (Huilgol VR, et al. Am J Gastroenterol 1997; 92:706–7). Este efecto secundario puede ser el resultado de la reducción de la actividad de la vitamina K y/o la reducción de la producción de vitamina K por parte de bacterias. Un estudio demostró que las personas que habían tomado antibióticos de amplio espectro tenían concentraciones en hígado inferiores de vitamina K2 (menaquinona), aunque los niveles de vitamina K1 (filoquinona) se mantuvieron normales. Varios antibióticos parecen ejercer un potente efecto sobre la actividad de la vitamina K, mientras que otros pueden no tener ningún efecto. Además, la mayoría de las multivitaminas no contienen vitamina K.

Se ha descubierto, de manera imprevista, que las cepas de lactobacilos seleccionadas específicamente según la presente invención por sus propiedades antimicrobianas, antiinflamatorias y de adhesión a la mucina oral (bio–película dental), y su capacidad para producir vitamina K (manaquinonas) son mejores para disminuir el sangrado de las encías y reducir la gingivitis.

Es, por tanto, un objeto de la invención proporcionar mejores cepas de bacterias del ácido láctico que hayan sido seleccionadas por su capacidad para disminuir el sangrado de las encías y reducir la gingivitis en la boca mediante una actividad antimicrobiana, actividad antiinflamatoria, tal como la debida a Porphyromonas gingivalis, por su buena capacidad para adherirse a la mucina oral en combinación con una buena secreción de vitamina K y prevenir, reducir o tratar satisfactoriamente así el sangrado de las encías y la gingivitis. Otro objeto más de la invención consiste en proporcionar productos que contengan dichas cepas para su administración a seres humanos. Tales productos también se podrían usar para disminuir la inflamación y el sangrado de la piel y de otras superficies locales del cuerpo.

También es un objeto de la invención proporcionar mejores cepas de bacterias del ácido láctico que hayan sido seleccionadas por su capacidad para reducir la inflamación oral, tal como la debida a Porphyromonas gingivalis, y también tales cepas que sean buenas productoras de vitamina K para disminuir el sangrado de las encías. Otro objeto más de la invención consiste en proporcionar productos que contengan dichas cepas, incluyendo agentes para el tratamiento o la profilaxis del sangrado de las encías y la gingivitis, para su administración a seres humanos.

Hay otros objetos y ventajas que se aclararán por completo a partir de la siguiente revelación y de las reivindicaciones anexas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención de la presente memoria se refiere al uso de cepas de bacterias del ácido láctico no patógenas, antiinflamatorias y contra el sangrado según lo definido en las reivindicaciones, y a los productos que usan tales cepas para el tratamiento y la profilaxis del sangrado de las encías y la gingivitis causada por la inflamación oral.

Hay otros objetos y características de las invenciones que se aclararán por completo a partir de la siguiente revelación y de las reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 es un gráfico de barras que muestra el efecto de las bacterias del ácido láctico sobre la mejoría observada visualmente en el sangrado de las encías/la gingivitis. L. r. prodentis frente a placebo: p < 0,005; L. r. prodentis frente a L.r.ATCC55730: p < 0,05; L.

r. ATCC55730 frente a placebo: n.s. (Test exacto de Fisher).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA MISMA

La invención de la presente memoria se refiere al uso de cepas de bacterias del ácido láctico no patógenas, anti–inflamatorias y contra el sangrado, y a los productos que usan tales cepas para el tratamiento y la profilaxis del sangrado de las encías y de la gingivitis causados por la inflamación oral.

La presente invención proporciona un producto para disminuir el sangrado de las encías y reducir la gingivitis que utiliza cepas seleccionadas en tales productos, seleccionadas entre Lactobacillus reuteri, tales como L. reuteri “Prodentis” (ATCC PTA–5289) y L. reuteri FJ3 (ATCC PTA–5290). Estas cepas se encuentran disponibles al público en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD), habiendo sido depositadas allí el 29 de julio de 2003, y además L. reuteri (ATCC 55730), que fue depositada el 18 de diciembre de 1995. Los depósitos de Lactobacillus reuteri “Prodentis” (ATCC PTA–5289), L. reuteri FJ3 (ATCC PTA–5290) y L. reuteri (ATCC 55730) cumplen los requisitos del Tratado de Budapest.

En el procedimiento de selección usado en la presente memoria, se examinan los efectos inhibidores de las especies bacterianas (entre otras Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacterioides forsythus, Campylobacter rectus y Selenomonas noxia) implicadas en la patogénesis de las enfermedades periodontales mediante procedimientos microbiológicos tradicionales usando células bacterianas. Las capacidades de adhesión se miden usando pocillos de microvaloración revestidos con mucina oral (ref. Jonsson et al. 2001 FEMS Microbiol. Lett. 204: 19–22).

La selección de bacterias del ácido láctico productoras de vitamina K se realiza mediante procedimientos estándar tales como el análisis CLAR (Ref. Conly JM, Stein K. Am. J Gastroenterol. 1992 Mar; 87(3):311: “Quantitative and qualitative measurements of K vitamins”) de las bacterias de análisis desarrolladas anaeróbicamente en medios MRS o mediante una sonda genética que analiza las bacterias de análisis. Como es sabido por el experto en la técnica, todo crecimiento de las cepas y análisis de la vitamina K se debería hacer bajo luz amarilla, pues la sustancia es sensible a la foto–oxidación.

El producto de la invención puede ser cualquier producto apto para su colocación en la boca como medida preventiva o tratamiento local para el sangrado de las encías y la gingivitis, también productos tales como enjuagues bucales u otros productos sanitarios especificados, goma de mascar, pastillas para chupar y similares.

La concentración de células de lactobacilos seleccionadas necesaria para la eficacia de un producto de la invención depende del tipo de formulación que se vaya a usar (o del tiempo de uso en la boca), pero habitualmente es preferible tener el equivalente a aproximadamente 105– 108 UFC (unidades formadoras de colonias) o más por colocación oral diaria de un producto. Las cantidades de hasta aproximadamente 1010–1011 UFC son posibles y se pueden usar para aumentar la eficacia sin afectar negativamente a las características organolépticas del producto (su sabor o su olor).

Preferiblemente, el producto de la invención no contiene otros componentes antibacterianos, al menos ninguno que inhiba o mate a la(s) cepa(s) bacteriana(s) del ácido láctico seleccionada(s) o interfiera en la actividad anti–inflamatoria o contra el sangrado.

Sin embargo, el producto de la invención puede comprender cualquier otro ingrediente que sea activo contra a la gingivitis y no interfiera con los lactobacilos según la invención. El producto también puede comprender excipientes y aditivos conocidos en la técnica. La expresión “que comprende”, como se usa en la presente memoria, debería entenderse como que incluye, pero no se limita a, los elementos expuestos.

La(s) cepa(s) de bacterias del ácido láctico puede(n) ser un aditivo mezclado en los ingredientes o amasado en el producto o con el que se reviste el producto por medio de procedimientos conocidos en la técnica para la formulación de productos de ese tipo. Cuando se usan células, y si la preparación del producto alimenticio o de otro producto seleccionado de la invención requiere una etapa de calentamiento, la(s) cepa(s) bacteriana(s) del ácido láctico se debería(n) añadir tras el calentamiento. Una vez que las células de bacterias del ácido láctico seleccionadas están en el producto, es preferible no calentar el producto hasta 60–70 grados centígrados o más durante un período más largo de tiempo.

Las características de la presente invención se entenderán más claramente con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar la invención.

Ejemplo 1. Procedimiento de selección de cepas

La selección de las cepas de bacterias del ácido láctico que se van a usar según esta invención se puede hacer del siguiente modo distribuido en cuatro etapas:

a) Evaluación del efecto inhibidor de Porphyromonas gingivalis por parte de células de cepas de bacterias del ácido láctico

Un ejemplo de una cepa destinada a medir el efecto inhibidor es Porphyromonas gingivalis, la ATCC33277 (disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE.UU.). Se deja crecer el aislado en caldo de tripticasa de soja (Difco, Detroit, EE.UU.) complementado con extracto de levadura al 0,5% (Difco) (TSBY). Se cosechan las células durante la fase de crecimiento exponencial mediante centrifugación a 1.000 xg, se lavan dos veces con PBS y se vuelven a suspender en el mismo tampón. Se someten las suspensiones celulares a un dispositivo ultrasónico de baja intensidad para dispersar los agregados bacterianos.

La cepa de bacterias del ácido láctico del análisis se desarrolla en caldo MRS (Difco) y se cosecha durante la fase de crecimiento exponencial mediante centrifugación a 1.000 xg, se lava dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 6,8) y se vuelve a suspender en el mismo tampón.

Se miden las densidades ópticas de las suspensiones bacterianas en una cubeta de 1,0 ml con un paso de luz de 1 cm, y las suspensiones se ajustan hasta una concentración final de 1,0 x 108 UFC (unidad formadora de colonias)/ml.

El análisis de inhibición se realiza de la siguiente manera: se mezclan la suspensión de P. gingivalis y la suspensión de bacterias del ácido láctico en las proporciones de 100–0; 75–25; 50– 50 y 25–75 en un tubo de centrifugación estéril (volumen total de 100 µl), se añade el caldo BHI, hasta 10 ml, se mezcla mediante movimientos vorticiales durante diez segundos y se incuba durante 90 min a 37°C con una agitación suave. Como control, se mezcla la suspensión de P. gingivalis con un volumen igual de PBS en los tubos control (libres de bacterias del ácido láctico). Tras ello, se lava cada suspensión mediante centrifugación a 1000 xg, se lava dos veces con PBS y se coloca en una placa de agar MS para determinar el contenido de UFC de P. gingivalis. El % de supervivencia de P. gingivalis se obtiene a partir de la siguiente fórmula.

UFC de P. gingivalis incub. con bacterias del ácido

láctico x 100 % de supervivencia de P. gingivalis =

UFC de P. gingivalis incubadas con PBS

El análisis se debería llevar a cabo, como mínimo, con las muestras por triplicado. Todos los datos numéricos obtenidos se deberían analizar estadísticamente.

En este ejemplo, que usa el procedimiento anterior, se seleccionan L. reuteri "Prodentis" (ATCC PTA–5289), L. reuteri FJ3 (ATCC PTA–5290) y L. reuteri (ATCC 55730).

b) Evaluación de las capacidades de adhesión a la mucina oral / biopelícula oral de cepas de bacterias del ácido láctico

Se recogen las cepas de bacterias del ácido láctico que se van a analizar. Se dejan crecer las bacterias a 37°C en caldo MRS (Difco) durante 16 h. Las placas se incuban en tarros anaeróbicos bajo una atmósfera de CO2+N2 (Sistema GasPak, BBL, Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, EE.UU.).

Se recogen mucosidades orales tales como saliva humana, se centrifugan, se filtran en condiciones de esterilidad y se usan para revestir pocillos de microvaloración según lo descrito. Se recogen las mucosidades en 200 ml de solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS) (8,0 g de NaCl; 0,2 g de KCl; 1,44 g de Na2HPO4·2H2O y 0,2 g de KH2PO4 por 1.000

ml de H2Od) y se complementa con Tween 20 al 0,05% (PBST). Primero se centrifuga la suspensión resultante a 11.000 g durante 10 min y luego a 26.000 g durante 15 min para eliminar las células y la materia particulada. Como mucina alternativa, se usa mucina gástrica (Sigma, M1778). La preparación de mucosidad cruda se almacena a 20°C. Se diluye la mucosidad hasta aproximadamente 100 µg/ml en tampón de Na2CO3 50mM, pH 9,7 y se incuba durante una noche en pocillos de microvaloración (Greiner) (150 µl por pocillo) a 4ºC con una rotación lenta. Se bloquean los pocillos con PBS con Tween 20 al 1% durante 1 h, tras lo que se lavan con PBST. Los pocillos revestidos con ASB se usan como controles.

Se dejan crecer las cepas que se van a analizar según lo anterior, se lavan una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,3) complementada con Tween 20 al 0,05% y se diluyen hasta una DO600 de 0,5 en el mismo tampón. Se añaden cien microlitros de suspensión bacteriana a cada pocillo y se incuban durante una noche a 4°C. Se lavan los pocillos 4 veces con PBST y se examina la unión con un microscopio invertido. Se extrae el tampón y, una vez secos los pocillos, se mide la unión en una superficie entera del pocillo con un instrumento Gel Doc 2000 de BioRad (BioRad Laboratories, Herkules, CA, EE.UU.). Todas las medidas se hacen por triplicado.

En el uso del procedimiento anterior en este ejemplo, primero se selecciona L. reuteri "Prodentis" (ATCC PTA–5289), siendo L. reuteri FJ3 (ATCC PTA–5290) y L. reuteri (ATCC 55730) seleccionadas como segundas alternativas.

c) Evaluación de las capacidades anti–inflamatorias de cepas de bacterias del ácido láctico

Se dejan crecer las bacterias del ácido láctico de análisis en los medios de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) y Luria–Bertani (LB) (Difco, Sparks, MD), respectivamente. Se diluyen los cultivos de una noche de las bacterias del ácido láctico hasta una DO600 de 1,0 (lo que representa aproximadamente 109 células/ml) y se diluyen además 1:10 y se dejan crecer durante 4, 8 y 24 horas más. Porphyromonas gingivalis, ATCC33277, se cultiva durante 48 h en caldo Brucella (Difco) complementado con suero bovino fetal al 10% (SBF). Los cultivos se diluyen 1:10 y se dejan crecer durante otras 24 y 48 h. Se recoge el medio acondicionado libre de células bacterianas mediante centrifugación a 8.500 rpm durante 10 min a 4°C. Se separa el medio acondicionado de los sedimentos celulares y luego se filtra a través de una unidad de filtro de poro de 0,22 µm (Millipore, Bedford, Mass. EE.UU.).

Las líneas celulares de monocitos/macrófagos de ratón, RAW 264.7 (ATCC TIB–71) y RAW 264.7 gamma NO(–) (ATCC CRL–2278) se usan como células indicadoras para el estudio de la ruta de la respuesta inflamatoria. Las células RAW 264.7 crecen en medio de Eagle modificado por Dulbecco (tipo natural) o en medio RPMI 1640 (gamma NO–) (Gibco–Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con SBF al 10% y antibiótico al 2% (5.000 unidades/ml de penicilina y 5 mg/ml de estreptomicina, Sigma) en CO2 al 5% a 37°C hasta una confluencia del 80–90%. Se siembran aproximadamente 5 x 104 células en grupos de cultivos de células de 96 pocillos y se permite su adhesión durante 2 h antes de la activación de los lipopolisacáridos (LPS) y la adición del medio acondicionado. Se exponen células RAW 264.7 naïve a LPS purificados de

E. coli de serotipo O127:B8 (Sigma). El medio de activación se forma añadiendo 2 ng de LPS a 20 µl de medio acondicionado por pocillo. Los macrófagos son bien pre–incubados o co– incubados con medio acondicionado de bacterias del ácido láctico libre de células. Se usa mIL– 10 recombinante (R&D Systems, Minneapolis, Min.) como control positivo. Se evalúa la viabilidad de las células mediante exclusión con azul de tripano (Invitrogen). Se mide la presencia de FNT– α en sobrenadante de cultivo celular con un inmunoanálisis enzimático de tipo sándwich, inmunoanálisis de FNT–α de ratón Quantikine M® (R & D Systems). En el uso del procedimiento anterior, se seleccionan L. reuteri "Prodentis" (ATCC PTA–5289) y L. reuteri FJ3 (ATCC PTA– 5290).

d) Evaluación de las capacidades de secreción de vitamina K de cepas de bacterias del ácido láctico

La selección de bacterias del ácido láctico productoras de vitamina K se realiza mediante procedimientos estándar tales como el análisis CLAR (Ref. Conly JM, Stein K. Am. J Gastroenterol. 1992 Mar; 87(3):311: “Quantitative and qualitative measurements of K vitamins”) de las bacterias de análisis desarrolladas anaeróbicamente en medios MRS o mediante una sonda genética que analiza las bacterias de análisis. Como es sabido por el experto en la técnica, todo crecimiento de las cepas y análisis de la vitamina K se debería hacer bajo luz amarilla, pues la sustancia es sensible a la foto–oxidación.

Se seleccionan las cepas de bacterias del ácido láctico que muestran mejores resultados tanto en la inhibición de P. gingivalis usando células de bacterias del ácido láctico, así como mejores resultados en la adhesión a la mucina oral, el efecto anti–inflamatorio y la secreción de vitamina K según los análisis anteriormente.

Ejemplo 2: Fabricación de productos de goma de mascar que contienen la cepa seleccionada

En este ejemplo, se selecciona L. reuteri FJ1 “Prodentis” (ATCC PTA–5289) en base a su buenas características de crecimiento en general y a los resultados favorables en la selección mencionada anteriormente en el Ejemplo 1 para añadir la cepa a una goma de mascar. Se deja crecer la cepa de L. reuteri “Prodentis” y se liofiliza usando procedimientos estándar para el desarrollo de lactobacilos en la industria.

Se pueden usar las etapas de un ejemplo de un procedimiento de fabricación de goma de mascar que contiene la cepa seleccionada, entendiéndose con ella como los excipientes, las cargas, los aromatizantes, los encapsulantes, los lubricantes, los agentes anti–aglomerantes, los edulcorantes y otros componentes de los productos de goma de mascar conocidos en la técnica, sin afectar a la eficacia del producto:

1.

Fusión: Se funde Softisan 154 (SASOL GMBH, Bad Homburg, Alemania) en un recipiente y se calienta hasta 70ºC para garantizar la completa interrupción de la estructura cristalina. Luego se enfría hasta 52–55ºC (justo por encima de su punto de endurecimiento).

2.

Granulación: Se transfiere polvo liofilizado de Lactobacillus reuteri a un mezclador/granulador de alta cizalladura Diosna o equivalente. Se añade lentamente durante aproximadamente 1 minuto el Softisan 154 fundido al polvo de Lactobacillus reuteri. No es necesario más tiempo de concentración. Durante la adición, se usa una picadora.

3.

Tamizado en húmedo: Inmediatamente después de la granulación, se hacen pasar los gránulos a través de una malla tamizada de 1 mm usando un molinillo Tornado. El granulado tamizado se empaqueta en bolsas de aluminio, fabricadas con papel de aluminio revestido de PVC selladas con un termosellador para formar una bolsa, junto con una bolsa desecante y se almacena refrigerado hasta su mezcla. Se divide el lote granulado para dos lotes de comprimidos.

4.

Mezclado: Se mezclan todos los ingredientes en una mezcladora hasta obtener una mezcla homogénea.

5.

Compresión: Se transfiere la mezcla final a la tolva de una prensa giratoria de comprimidos y se comprimen los comprimidos con un peso total de 765 mg en un compresor Kilian.

6.

Empaquetado en masa: las gomas de mascar se empaquetan en bolsas de aluminio junto con una bolsa secante de tamiz molecular. Se coloca la bolsa de aluminio en un cubo de plástico y se almacena en un sitio frío al menos una semana antes de su empaquetado final.

En la siguiente Tabla 1, se muestran los controles en proceso, como es habitual en la industria.

IPC

Procedimiento de análisis Límite

1

Aspecto visual Claro, solución homogénea

2

Temperatura del termómetro 52–55ºC

3

Análisis de L. reuteri CM003

4

Aspecto visual Color crema con manchas azules, comprimidos convexos lisos por ambos lados

5

Uniformidad de masa Ph. Eur. 765 mg ± 5%

En el ejemplo de la presente memoria, se añade entonces el cultivo de L. reuteri

5 seleccionado como se explica anteriormente a un nivel de 107 UFC/gramo de producto, y la goma de mascar es usada por seres humanos como modo de disminuir el sangrado de las encías y reducir la gingivitis.

Como se expone anteriormente, el producto de la invención puede estar en formas diferentes a la de goma de mascar, por ejemplo, como una pastilla y otras formulaciones, y se

10 usan beneficiosamente procedimientos estándar de preparación del producto subyacente subordinado como se conoce en la técnica para preparar el producto de la invención incluyendo el cultivo de L. reuteri seleccionado.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para seleccionar una cepa de bacterias del ácido láctico para la administración externa a un ser humano que comprende seleccionar células de al menos una cepa de lactobacilos del grupo que consiste en Lactobacillus reuteri “Prodentis” (ATCC PTA 5289) y Lactobacillus reuteri FJ3 (ATCC PTA–5290), cepas que tienen propiedades anti– microbianas, anti–inflamatorias y de adhesión a la mucina oral, y que tienen la capacidad de producir vitamina K.

2. 2.

   Una preparación farmacéutica para su uso en la disminución del sangrado de las encías y en la reducción de la gingivitis en la boca de una persona que comprende células de al menos una cepa de Lactobacillus reuteri seleccionada del grupo que consiste en Lactobacillus reuteri “Prodentis” (ATCC PTA 5289) y Lactobacillus reuteri Fj3 (ATCC PTA–5290), cepas que tienen propiedades anti–microbianas, anti–inflamatorias y de adhesión a la mucina oral, y que tienen la capacidad de producir vitamina K.

3. 3.

   La preparación farmacéutica para su uso según la reivindicación 2, en la que se administran 105–108 unidades formadoras de colonias de la cepa de bacterias del ácido láctico diariamente a la persona.

4. 4.

   La preparación farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2–3, en la que las células se administran oralmente a la persona.

5. 5.

   La preparación farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2–4 que comprende además agentes para el tratamiento o la profilaxis del sangrado de las encías y la gingivitis.

6. 6.

   La preparación farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2–5, en la que el producto está formulado como un producto seleccionado del grupo que consiste en enjuagues bucales, goma de mascar y pastillas para chupar.

7. 7.

   Cepa FJ1 “Prodentis” de Lactobacillus reuteri (ATCC PTA–5289).

8. 8.

   Cepa FJ3 de Lactobacillus reuteri (ATCC PTA–5290).