ES2351005B1 - Uso de anhidrasa carbónica ii para la elaboración de un medicamento. - Google Patents

Abstract

Uso de anhidrasa carbónica II para la elaboración de un medicamento.#La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, la presente invención se refiere al uso de la anhidrasa carbónica II para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxina, fallo agudo o rechazo al trasplante de un órgano, preferiblemente, el riñón. En una realización preferida, la toxina es cisplatino.

Description

Uso de anhidrasa carbónica II para la elaboración de un medicamento.

La presenteinvención se encuadra dentro del campodela biomedicina. Específicamente,la presenteinvención se refiere al uso de la anhidrasa carbónica II para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño causadopor isquemia, isquemiaseguidade reperfusióno toxina,fallo agudoorechazoal transplantedeun órgano, preferiblemente, el riñón. En una realización preferida, la toxina es cisplatino.

Estado de la técnica anterior

La patología de origen isquémico es la principal causa de muerte en los países desarrollados. En el caso del riñón,elfallorenalagudo(FRA)es una enfermedadque conlleva una mortalidaddemásdel50%, cifraquenoha experimentado cambios significativos en las4últimas décadas. Normalmente los pacientes con síntomas clínicos de fallo renal, son tratados despuésdequeeldañosehaya desarrollado,exceptoenel casode pacientesalosqueseles va practicar un trasplante renal. Puesto que la enfermedad está desarrollada cuando el paciente llega al hospital, se requiere urgentemente disponer de vías de curación mediante la estimulación del proceso regenerativoycurativo en general.

El desarrollode nuevosypotentes fármacosha supuesto unavance importante enel tratamientode enfermedades hasta hace poco tiempo mortales. Sin embargo, algunos de estos tratamientos son causa de una elevada morbilidad por la toxicidadque producen.Laconsecuenciadela toxicidad renalde estosfármacosyde otros agentes tóxicosalosque se puede estar accidentalmente expuesto (sales de metales pesados, hidrocarburos, toxinas vegetales o bacterianas) es asimismo la aparición del FRA.

El cisplatino ha demostrado ser un efectivo agente quimioterapéutico usado en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades neoplásicas. Desafortunadamente, el tratamiento con cisplatino está asociado a una elevada toxicidad lo que obliga a una reducción de la dosis o la interrupción del tratamiento. Uno de los efectos adversos más importantes del cisplatino es la nefrotoxicidad; la insuficiencia renal dosis-dependienteyacumulativa es la principal toxicidad limitante de dosis. Aproximadamente el 25 al 35% de los pacientes desarrollan nefrotoxicidad después de unasola dosisde cisplatino.La toxicidad renalsehacemás prolongadaygravetrasla repeticiónde ciclosdetratamiento, por lo que, es esencial comprobar que la función renal se ha normalizado antes de iniciar un nuevo tratamiento con cisplatino.La nefrotoxicidadpuedeprevenirse manteniendouna hidrataciónadecuadaantes,duranteydespuésde la perfusión intravenosadecisplatino.La diuresis forzada mediante hidratacióno mediante hidrataciónyadministración de un diurético antesydespués del tratamiento con cisplatino reduce el riesgo de nefrotoxicidad. No obstante, puede aparecer nefrotoxicidadincluso empleando estos procedimientos.

Las medidas terapéuticas empleadashasta ahora para la regeneración del riñón dañado han sido: la aplicación de factores de crecimiento (Hirschberget al. KidneyInt. 1999, 55:2423-2432; MilleryPadanilam. Chapter 17: Molecular responses and growthfactors,in:Atlasif diseasesof the kidney, RobertWSchrier,p. 17.1-17.16, Blackwell Science Press, Philadelphia, USA. 1999) o ensayos con células madre (Brodsky et al.AmJPhysiol RenalPhysiol. 2002, 282: F1140-F1149;Kale et al.JClinInvest. 2003, 112:42-49; LinF et al.JAm Soc Nephrol. 2003, 14:1188-1199; Gupta et al. KidneyInt. 2002, 62: 1285-1290; Oliver et al. Clin Invest. 2004, 114: 795-803), pero no se ha conseguido el resultado regenerativo deseado. Existe por tanto la necesidad de disponer de terapias que permitan reducir eldaño renalypotenciarla regeneración.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere al uso de la anhidrasa carbónica II para la elaboración de un medicamento para la prevencióny/oel tratamientodeldaño causadoporisquemia, isquemiaseguidade reperfusióno toxina,falloagudoo rechazo al transplante de un órgano, preferiblemente, el riñón. En una realización preferida, la toxina es cisplatino.

La anhidrasa carbónica es una metaloenzima ampliamente distribuida por todo el organismo (corteza renal, tejidos gliales,ojo, eritrocitos,etc.)que catalizareversiblementela conversióndeanhídrido carbónicoyaguaa ácidocarbónico. Esta enzima presenta cuatroisoformas.De ellas,la anhidrasa carbónicaII (CAII, del inglés carbonic anhidrase II)esla isoenzimamásactivay su secuenciade aminoácidosen humanoseslaSEQIDNO:1(Númerode referencia del Genbank: NP_000058).

En los ejemplos de la presente solicitud de patente se demuestra la capacidad de CAII para inducir la regeneración e inhibir la apoptosis tanto en un modelo experimental in vivo de isquemia-reperfusión renal como en un modelo experimental in vitro de daño inducido por la toxina cisplatino. Estos análisis ponen de manifiesto la utilidad de CAII para prevenir y/o tratar daños en un tejido o un órgano.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de una proteína que comprende la secuencia deaminoácidosSEQIDNO:1,de unavariantedela mismaodeun fragmentodelas anteriores parala elaboración de un medicamento.

Los términos “proteína”, “secuencia de aminoácidos”, “polipéptido” o “péptido”, se usan aquí de manera intercambiable,yse refierenaunaforma poliméricade aminoácidosde cualquierlongitud,quepuedenestar,ono,química

o bioquímicamente modificados.

Enel sentidoutilizadoenesta descripción,el término“variante”serefiereaunaproteína sustancialmentehomologa yfuncionalmente equivalente a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que no alteren sustancialmente su función. El término “variante” incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación o fosforilación.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es sustancialmente homologa a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1cuandosu secuenciade aminoácidos tieneungradode identidad respectoala secuencia de aminoácidos de dicha proteína de, almenos, un 60%, ventajosamente de, al menos un 70%, preferiblemente de, al menos,un80%,más preferiblementede,al menos,un90%,ymás preferiblementedeal menosun95%.

El término “identidad”, taly como se utiliza enla presente descripción, hace referenciaala proporciónde aminoácidos idénticos entre dos secuencias de aminoácidos que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entredos secuencias puede ser identificado fácilmenteporunexpertoenla materia,1,por ejemplo, conla ayudade un programa informático apropiado para comparar secuencias.

Laexpresión “funcionalmenteequivalente”,talycomose utilizaenla presentedescripción, significaquela proteína en cuestión mantiene la capacidad de inducir regeneración. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales comolos ensayos descritos enel Ejemplo1que acompañaa esta descripción.

Asimismo,enel sentido utilizadoen estadescripción,el término fragmentose refiereaun péptidoque comprende una porcióndela proteínaque comprendela secuenciade aminoácidosSEQIDNO:1,es decir, una secuenciade aminoácidos contiguos comprendida dentro de dicha SEQ ID NO: 1; o un péptido que comprende una porción de una variantedela proteínaque comprendela secuenciade aminoácidosSEQIDNO:1;siempreycuando dicho fragmento

o péptido sea funcionalmente equivalente.

La proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la variante de la misma o el fragmento de las anteriores pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de un polinucleótido (de aquí en adelante, polinucleótido de la invención) que codifica la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, una variante de la misma o un fragmento de las anteriores para la elaboración de un medicamento.

Los términos “polinucleótido”, “ácido nucleico”y“secuencia de nucleótidos” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN o RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN o DNA).

En una realización preferida de este segundo aspecto, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia de nucleótidosSEQIDNO:2que corresponde ala secuenciade nucleótidosdelgendela proteína CAII humana (Número de referencia del Genbank:NG_007287).

Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso de una construcción génica (de aquí en adelante, construcción génica de la invención) que comprende el polinucleótido de la invención para la elaboración de un medicamento.

La construcción génica de la invención puede comprender el polinucleótido de la invención, operativamente unido a, una secuenciareguladoradelaexpresióndel polinucleótidodelainvención, constituyendode este modoun cassette de expresión.

“Unidos operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” al polinucleótido, estáligadaal mismodetal maneraquese consiguelaexpresióndela secuencia codificadoradel polinucleótido.

“Secuencia de control” se refiere a secuencias de polinucleótidos que afectan la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Dichas secuencias de control incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores, señalesde iniciación, señalesde terminación, intensificadoresosilenciadores.Se pretendequeel término “secuenciasde control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria paralaexpresión,ytambién puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.

En una realización preferidade este segundo aspecto,laconstrucción génicadelainvención comprendeel polinucleótidodelainvención unido operativamentea,al menos, una secuenciade controldela listaque comprende:

a. un promotor que dirija la transcripción de dicho polinucleótido,

b.

una señal de inicio de la transcripción,

c.

una señalde terminacióndela transcripción,

d.

una señal de poliadenilación, o

e.

un activador transcripcional.

Comoseusaaquí,el término“promotor”hace referenciaaunaregióndelDNAsituadaenposición5’conrespecto al puntode iniciodela transcripciónyque resulta necesariaofacilita dicha transcripciónenuna célula animal.Este término incluye,por ejemplo,perosin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicosdetipo celularode tejido o promotores inducibles o reprimibles.

En una realización particular, las secuenciasde controldeexpresión son funcionales en célulasy organismos procariotas, por ejemplo, pero sin limitarse,bacterias; mientras que en otra realización particular, dichas secuencias de controldeexpresión son funcionalesen célulasy organismos eucariotas,por ejemplo, células animales. Preferiblemente, las secuenciasde control son funcionales en célulasde mamífero,ymás preferiblemente, en células humanas.

El polinucleótido de la invención o la construcción génica de la invención pueden ser introducidos al interior de una célula, denominada célula hospedadora, por ejemplo, pero sin limitarse, como ácido nucleico desnudo o mediante un vector.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de un vector (de aquí en adelante, vector de la invención) que comprende el polinucleótido de la invención o la construcción génica de la invención para la elaboración de un medicamento.

Tal como se utiliza en la presente invención el término “vector”, se refiere a un sistema utilizado para introducir un ácido nucleicoexógenoal interiorde una célula procariotao eucariota, permitiendode este modolavehiculización del ácido nucleico al interior de la célula.

Existen numerosos vectores viralesy no virales conocidos enelestadodela técnica.Vectores virales incluyen, pero no están limitados a los siguientes: vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectoreslentivirales, vectoresalfavirales,vectores herpesviralesy vectores derivadosde coronavirus.Vectoresdetipo no viral incluyen, pero no están limitados a los siguientes: gene gun, liposomas, poliaminas, péptidos, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínasysistemasde transferencia génica mediadospor receptor.

En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, el vector es un vector de expresión génica. El términovectorde“expresión”,taly comose utilizaenla presente descripción,se refierea una moléculadeácido nucleicoenlaquesepuedeintegrarotra moléculadeácido nucleico,sinquepierdala capacidadde autorreplicacióny que, además, es adecuado para expresar dicho ácido nucleico integrado en el mismo tras ser introducido en una célula hospedadora. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente.

Un quinto aspectodelainvención se refierea una célulahospedadora(de aquí en adelante, céluladelainvención) que comprendeel polinucleótidodelainvención,la construcción génicadelainvenciónoelvectordelainvención,y que es capaz de expresar la proteína de la invención.

La célula de la invención puede ser procariota o eucariota. Preferiblemente, la célula de la invención es una célula animal, más preferiblemente, una célulade mamíferoyaún más preferiblemente,una célula humana.

El polinucleótidodelainvención,la construcción génicadelainvención,elvectordelainvenciónola céluladela invención pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos enel estadodelatécnica.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construccióngénicadelainvención,elvectordelainvenciónola céluladelainvenciónparala elaboracióndeun medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un daño en un tejido o un órgano.

Una realización más preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,elpolinucleótidodelainvención, la construcción génica de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxina en un tejido o un órgano.

El término “isquemia” se refiere a una disminución transitoria o permanente del riego sanguíneo en un tejido o un órgano, conla consecuente disminucióndel aportede oxígeno.El conjuntodelos dañosque sufreel tejidooelórgano debido a la isquemia se conoce como “daño causado por isquemia”.

El término “reperfusión” se refiere a la restauración del suministro de sangre a un tejido o un órgano que está isquémico como consecuencia de una disminución del riego normal de sangre. La recuperación del riego sanguíneo restauraelaportedeoxígenoynutrientesaltejido, permitiendola recuperacióndeltejidoodelórgano isquémico.Sin embargo, la reperfusión en sí misma puede lesionar el tejido o el órgano isquémico, ocasionando lo que se conoce como “daño causado por reperfusión”.

La expresión “daño por isquemia-reperfusión” se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano debido a una disminución del riego sanguíneo (isquemia) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).

La expresión “daño causado por toxina” se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano como consecuenciadesuexposiciónaunaomás toxinascomo,porejemplo,perosin limitarse,un antibiótico,un anestésico, un quimioterapéutico, un contraste radiológico, un metal pesado, un fungicida, un pesticida, un solvente orgánico, un veneno animal, un tóxico fúngico o un tóxico de origen endógeno.

El cisplatino (cis-diamino dicloro platino II) ha demostrado ser un efectivo agente quimioterapéutico usado en el tratamientode una ampliavariedadde enfermedades neoplásicas. Desafortunadamente,laexposicióndelos pacientes a cisplatinoestá asociadaa nefrotoxicidad, neurotoxicidad, ototoxicidad, toxicidadgastrointestinal, cardiotoxicidady hepatotoxicidad, entre otros efectos secundarios.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construcción génica de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un daño causado por cisplatino en un tejido o un órgano.

En una realización preferida de la presente invención, el tejido es un epitelio. Un epitelio animal es un tejido formadoporunaovariascapasdecélulasen estrecho contacto,querevistela superficie,cavidadesyconductosdel organismo,la epidermisylacapaexternadelas mucosas,yla porción secretoradelas glándulas.En una realización más preferida, el epitelio se selecciona de la lista que comprende: epitelio renal, epitelio hepático, epitelio pulmonar, epitelio gástrico, epitelio intestinal, epitelio auditivo, epitelio pancreático, epitelio de transición urinario, epitelio uterino o epidermis de la piel. En una realización aún más preferida, el epitelio es el epitelio renal.

En una realización preferida de la presente invención, el órgano se selecciona de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, oído,páncreas,vejiga, úteroo piel.En una realizaciónmás preferida, el órgano es el riñón.

La isquemia renal consiste en una disminución transitoriao permanente del riego sanguíneo, conla consecuente disminución del aporte de oxígeno al riñón, como consecuencia, por ejemplo, pero sin limitarse de una disminución delvolumen sanguíneototal, una redistribucióndela sangreo una obstrucción.La disminucióndelriego sanguíneo puede ser unilateral, cuando afecta únicamente a un riñón, o bilateral, cuando afecta a los dos riñones. El conjunto de los daños que sufre el epitelio renal o el riñón debido a la isquemia se conoce como “daño causado por isquemia renal”.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construcción génica de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamentoparalaprevencióny/oel tratamientodeldaño causadopor isquemiaenel epiteliorenaloenelriñón,es decir, del daño causado por isquemia renal.

Laexpresión “daño por isquemia-reperfusión renal” se refiereal conjuntode losdaños que sufreel riñón debidoa una disminución del riego sanguíneo (isquemia renal) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construcción génica de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño causado por isquemia-reperfusión en el epitelio renal o en el riñón, es decir, del daño causado por isquemia-reperfusión renal.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construcción génica de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño que sufre el epitelio renal o el riñón causado por toxina como, por ejemplo, pero sin limitarse, un antibiótico, un anestésico, un quimioterapéutico, un contraste radiológico, unmetalpesado,un fungicida,un pesticida,unsolventeorgánico,unvenenoanimal,untóxicofúngicoountóxicode origen endógeno.

Uno de los efectos adversos más importantes del tratamiento con el agente quimioterapéutico cisplatino es la nefrotoxicidad. De hecho, la insuficiencia renal dosis-dependientey acumulativa es la principal toxicidad limitante dedosis.Aproximadamenteel25al 35%de los pacientes desarrollan nefrotoxicidad despuésde unasola dosisde cisplatino. Los cambios más comúnmente observados son una caída en la tasa de filtración glomerular reflejada por unaelevaciónenla creatininaséricay una reducciónenelflujorenal plasmáticoefectivo.La toxicidadrenalsehace más prolongadaygrave tras la repetición de ciclos de tratamiento, por lo que, es esencial comprobar que la función renal se ha normalizado antes de iniciar un nuevo tratamiento con cisplatino.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construccióngénicadelainvención,elvectordelainvenciónola céluladelainvenciónparala elaboracióndeun medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño que sufre el epitelio renal o el riñón como consecuencia de su exposición a cisplatino, es decir, del daño renal causado por cisplatino.

La apariciónde nefrotoxicidad causada por cisplatinopuede ser intensificada porel tratamiento concomitante con antihipertensivos que contengan, por ejemplo, pero sin limitarse, furosemida, hidralazina, diazoxido,ypropranolol. La administración concomitante de otros medicamentos como, por ejemplo, pero sin limitarse cefalosporinas, aminoglucósidoso AnfotericinaB o mediosde contraste potencian los efectos nefrotóxicos del cisplatino.La presente invención es, por tanto, útil para la prevención y/o el tratamiento de un daño como consecuencia de la exposición del epitelio renalodel riñóna cisplatino en combinación con otrau otras toxinas, tales como, por ejemplo, perosin limitarnos, las mencionadas anteriormente.

Como consecuencia de los daños causados por isquemia, isquemia-reperfusión o toxina en un órgano puede producirseunfalloagudoorgánico.Los términos“falloagudo”,“falloorgánicoagudo”o “fracasoorgánicoagudo”,se refieren a un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro brusco de la función de un determinado órgano.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construccióngénicadelainvención,elvectordelainvenciónola céluladelainvenciónparala elaboracióndeun medicamento para la prevención y/o el tratamiento de unfallo agudo de un órgano causado por isquemia, isquemiareperfusiónotoxina.En una realización preferidadela presenteinvención,elórganose seleccionadela listaque comprende:riñón,hígado,cerebro,corazón,pulmón,estómago,intestino,páncreas,vejiga,úteroopiel.Enuna realización más preferida, el órgano es el riñón.

Como consecuenciadeundaño causadopor isquemia, isquemia-reperfusióno toxinaenelriñónpuede producirse un fallo renal agudo (FRA). Los términos “fallo renal agudo”, “fracaso renal agudo” o “insuficiencia renal aguda (IRA)” se refieren a un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro brusco de la función renal que tiene como consecuencia una disminución del filtrado glomerulary una acumulación de productos nitrogenados séricos (como,por ejemplo, ureaocreatinina), pudiendotambiénproducirsealteracionesdelequilibriohidroelectrolíticoydel equilibrio ácido base. El FRA puede clasificarse en tres grandes grupos: FRA funcional, FRA parenquimatoso o FRA obstructivo. En el FRA funcional existe una inadecuada perfusión renal que compromete el filtrado glomerular, pero el parénquima glomerular está íntegro. La insuficiencia renal que se produce durante el FRA funcional es reversible tras restaurar el flujo plasmático, pero si persiste la situación que lo ha desencadenado evolucionará hacia un FRA parenquimatoso. En el FRA parenquimatoso la causa del deterioro de la función renal es un daño en las diferentes estructuras anatómicas renales, que da lugar a diferentes síndromes clínicos: el túbulo (necrosis tubular aguda), el glomérulo (necrosis glomerular),el intersticiotubular (necrosistubular intersticial)olosvasos sanguíneos.EnelFRA obstructivo se produce un aumento de la presión en la vía urinaria, que se transmite retrógradamente, comprometiendo el filtrado glomerular normal, como consecuencia de la obstrucción de alguno de los conductos del riñón.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construccióngénicadelainvención,elvectordelainvenciónola céluladelainvenciónparala elaboracióndeun medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un FRA causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxina.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construccióngénicadelainvención,elvectordelainvenciónola céluladelainvenciónparala elaboracióndeun medicamentoparalaprevencióny/oel tratamientodeunFRAcausado como consecuenciadelaexposicióndelepitelio renal o del riñón a cisplatino.

Una de las situaciones más frecuentes de daño causado por isquemia-reperfusión tiene lugar en el transplante de órganos.De hecho,elfalloorgánicoagudoes unadelas primeras causasporlasquese produceelrechazodeórganos transplantados.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construccióngénicadelainvención,elvectordelainvenciónola céluladelainvenciónparala elaboracióndeun medicamento para la prevención y/o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. En una realización preferidadela presenteinvención„elórganose seleccionadela listaque comprende: riñón,hígado, cerebro, corazón,pulmón, estómago, intestino,oído, páncreas,vejiga, úteroo piel.En una realización máspreferida,elórgano esel riñón.

El FRA asociado al daño causado por isquemia-reperfusión es una de las principales causas por las que se produce el retraso inicial en la función o el rechazo de un riñón transplantado.

Una realización preferida de la presente invención, se refiere al uso de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidosSEQIDNO:1,lavariantedela mismaoel fragmentodelas anteriores,el polinucleótidodelainvención, la construcción génica de la invención, el vector de la invención o la célula de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del rechazo de un riñón transplantado.

Otro aspectodelainvenciónserefiereauna composiciónfarmacéutica(deaquíen adelante, composiciónfarmacéutica de la invención) que comprende la proteína que comprende la SEQ ID NO: 1, una variante de la misma o un fragmentode las anteriores,el polipéptidodelainvención,la construcción génicadelainvenciónola céluladela invención.

Una realización preferida de este aspecto, se refiere al uso de la composiciónfarmacéutica de la invención para la prevención y/o el tratamiento de un daño en un tejido o en un órgano. Una realización más preferida, se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la prevención y/o el tratamiento de un daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxina en un tejido o un órgano. Una realización aún más preferida de este aspecto, se refiere al uso de la composiciónfarmacéutica de la invención para la prevención y/o el tratamiento de un daño causado por cisplatino en un tejido o un órgano. En una realización preferida, el tejido es un epitelio. En una realización más preferida, el epitelio se selecciona de la lista que comprende: epitelio renal, epitelio hepático, epitelio pulmonar, epitelio gástrico, epitelio intestinal, epitelio auditivo, epitelio pancreático, epitelio de transición urinario, epitelio uterino o epidermis de la piel. En una realización aún más preferida, el epitelio es el epitelio renal. En una realización preferida, el órgano se selecciona de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, oído, páncreas, vejiga, útero o piel. En una realización más preferida, el órgano es el riñón.

Una realización preferidade este aspecto, se refiereal usodela composiciónfarmacéuticadelainvención parala prevencióny/oel tratamientodeunfalloagudodeunórgano causadopor isquemia, isquemia-reperfusióno toxina. Preferiblemente, el órgano se selecciona de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, oído, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñón.

Una realización más preferida de este aspecto, se refiere al uso de la composiciónfarmacéutica de la invención para la prevención y/o el tratamiento de FRA causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxina.

Una realización preferidade este aspecto, se refiereal usodela composiciónfarmacéuticadelainvención parala prevención y/o el tratamiento de un FRA causado como consecuencia de la exposición del epitelio renal o del riñón a cisplatino.

Otra realización preferida de este aspecto, se refiere al uso de la composiciónfarmacéutica de la invención para la prevención y/o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. Preferiblemente, el órgano se selecciona de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, oído, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñón.

Una realización más preferida de este aspecto, se refiere al uso de la composiciónfarmacéutica de la invención para la prevención y/o el tratamiento del rechazo de un riñón transplantado.

En una realización preferidade esteaspecto,la composiciónfarmacéuticadelainvención comprende, además, unvehículofarmacéuticamente aceptable.En una realización más preferidade esteaspecto,la composiciónfarmacéutica de la invención comprende además otro principio activo. En una realización más preferida de este aspecto, la composiciónfarmacéutica comprende junto con unvehículofarmacéuticamente aceptable, además, otro principio activo.

Como se emplea aquí, los términos “principio activo”, “sustancia activa”, “sustanciafarmacéuticamente activa”, “ingrediente activo”o “ingredientefarmacéuticamente activo” se refierea cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo del ser humano u otros animales.

La composiciónfarmacéuticadelainvención puede formularse para su administración enunavariedadde formas conocidas enel estadodela técnica.Tales formulaciones pueden administrarsea un animaly,más preferiblemente, a un mamífero, incluyendoa un humano, por unavariedadde vías, incluyendo, pero sin limitarsea parenteral,intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraauricular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular o tópica.

Ladosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva dependede unavariedaddefactores, como, porejemplo,edad,peso,sexootoleranciadel animal.Enel sentido utilizadoenesta descripción,laexpresión “cantidad terapéuticamente efectiva”se refiereala cantidaddelacomposiciónfarmacéuticamente efectivaque produzcaelefecto deseadoy, en general,vendrá determinada entre otrascausas, por las características propiasdedicha composición farmacéuticaydel efecto terapéuticoa conseguir. Los “adyuvantes”o“vehículos”farmacéuticamente aceptablesque pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de la técnica.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Las siguientesfigurasyejemplosse proporcionana modode ilustración,y nose pretendeque sean limitativosdela presente invención.

Descripción de las figuras

Figura 1. Muestra el análisis in vivo del efecto de CAII sobre la regeneración renal. A. Efecto de CAII sobre la expresión del marcadordeproliferacióny regeneraciónPCNA.B. Efectode CAII sobrelaexpresión del marcadorde proliferaciónyregeneración Estatmina. Datos representados comola media+/-SEM; n=5;*p<0,05 vs I/R;+p<0,05 vs I/R+ CAII.

Figura 2. Muestra el análisis in vivo del efecto de CAII sobre la incidencia de apoptosis en el daño renal, evaluada mediante la medida de la actividad de la caspasa 3. Datos representados como la media +/-SEM;p<0,05; n=5; * p<0,05 vs control;+p<0,05 vs I/R.

Figura 3. Muestra el análisis in vivo del efectodeCAIIenlaexpresiónde Eritropoyetina (EPO). Datos representados comola media+/-SEM;p<0,05; n=5;*p<0,05 vs control;+p<0,05 vs I/R.

Figura 4.Muestra el análisis in vitro del efecto de CAII sobre la regeneración renal. A. Efecto de CAII sobre la expresión del marcadorde proliferacióny regeneración PCNA.B. Efectode CAII sobrelaexpresión del marcador de proliferacióny regeneración Ki67. Datos representados como la media +/-SEM;p<0,05; n=5;*p<0,05 vs cis;+ p<0,05 vs cis+ CAII.

Figura5.Muestrael análisis in vitro del efecto de CAII sobre la incidencia de apoptosis en el daño renal, evaluada mediante la medida de la actividad de la caspasa 3. Datos representados como la media +/-SEM;p<0,05; n=5; * p<0,05 vs control;+p<0,05 vs cisplatino.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo1

Análisis in vivo del efecto de CAII sobre la regeneración y daño celular en la lesión renal inducida por isquemiareperfusión

Materiales y métodos empleados

Modelo in vivo de isquemia reperfusión renal

Seutilizaron ratonesdelacepaSwiss,machosdeunpesoaproximadamentede25-30g(CharlesRiver, Francia). Todas las intervenciones se realizaron bajo la supervisión del comité éticodel Instituto de Investigaciones BiomédicasdeBarcelona (CSIC)y siguieron las pautasdela Unión Europea. Las condiciones ambientales se mantuvieron constantes, la temperatura fue de 21-22ºC, la humedad relativa del 70%ylos ciclos alternativosde luz/oscuridad de 12h. Los animales fueron alimentados con una dieta estándarde piensoAO4(Panlab, Barcelona)yaguadela redde Barcelona ad libitum.

Los animales fueron anestesiados con Isoflurane, se colocaron en posición supinay se mantuvo la temperatura corporal entre36y37ºC. Despuésde realizar una laparotomía media para accederal riñón apartando cuidadosamente el paquete intestinal, se indujo la isquemia bilateral mediante el clampaje de ambos pedículos arteriovenosos renales durante 45 minutos con un clamp microvascular no-traumático. Posteriormente se inició el período de reperfusión, con la retirada del clamp y se verificó visualmente con la observación del regreso del flujo sanguíneo al riñón. A continuación se suturóaelanimaly se administró Buprex subcutáneo (4,16 µg/100gde peso).

Animales sujetos a una operación sham fueron utilizados como controles. Durante todo el proceso de operación, los animales fueron bien hidratadosyla temperatura corporal se mantuvo alrededor de 37ºC. Durante el tiempo de reperfusión, los animales se estabularonbajoel controlde unveterinario.Pasadas24hde reperfusión,el animalse sacrificó paralaextraccióndelos riñonesyde sangre.El tejidofueinmediatamente congeladoennieve carbónicay posteriormente almacenado a -80ºC.

Grupos de estudio del modelo in vivo de isquemia y reperfusión renal

I/R.-Animales sometidosa45 minutosde isquemiay24 horasde reperfusión.

I/R+ CAII.-AnimalessometidosaI/RperoconinyeccióndeCAIIdeorigenhumano(Sigma,númerode referencia: C-6165)a una concentraciónde5mg/kgal iniciodela reperfusión, mediante punción directadelavena cava inferior.

CONTROL.-Animales control, no sometidos a isquemia/reperfusión.

CONTROL+CAII. Animales igual a los del grupo control pero con inyección intravenosa de CAII a una concentraciónde5mg/Kg24 horas antesdela recogidade muestras.

I/R+Azt: Animales sometidos a I/R pero con inyección de Azetazolamida (Sigma, número de referencia: A6011) intraperitoneal a una concentración de 30 mg/kg un día antes de someter a los animales al proceso de I/R.

RT-PCR a tiempo real

El RNAde las muestras de riñón fue extraído mediante el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Barcelona). Posteriormentese purificó el RNAtotal de las muestras con el RNeasy mini Kit de Qiagen (Madrid) acorde a las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de RNA fueron calculadas por determinación de absorbancia a 260 nm. La integridad del RNA así obtenido se examinó mediante análisis de las bandasdeRNAribosomal18sy28sdetectadoyanalizadoenel Bioanalyzerdel HospitalClínico Barcelona (Agilent).

Laexpresióndelos genes analizadosse midió medianteRT-PCR cuantitativaa tiempo real normalizada conelgen houskeeping gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). LasRT-PCRsa tiempo real se llevarona cabo en un Termociclador Bio-Rad (iCycleriQ Real-Time PCR detection System, Bio-Rad, Barcelona)ylas amplificacionesse hicieron en reacciones de 20 µlconelRT-PCR Kit con SYBR-Green en dos pasos (Bio-Rad) según las instrucciones delfabricante. Los cebadores empleados fueron los siguientes: PCNA: directo, SEQ ID NO: 3; reverso, SEQ ID NO: 4; Estatmina:directo, SEQ ID NO: 5; reverso, SEQ ID NO: 6;GAPDH:directo, SEQ ID NO: 7; reverso, SEQ ID NO:

8.

Actividad de Caspasa 3

La actividad de caspasa-3 fue determinada por medida de proteolisis del sustrato específico (N-acetil-Asp-Glu-ValAsp-7-amino-4-metilcumarina (DEVD-AMC; Biomol, Plymouth Meeting,PA). Las muestras de tejido renal fueron homogenizadasy sonicadas en el tampón de ensayo (50 mM HEPES, 10% sacarosa, 0,1% CHAPS,5mM GSSG,5 mMDTT).Los sobrenadantesdelasmuestrasse incubaronenestetampónalqueseleañadió DEVD-AMCaunaconcentración de 50 µM.El AMC liberado fue cuantificado durante1horaymediaa 37ºCpor fluoroespectrofotometría, usando 380 nmdeexcitaciónymidiendola emisióna 450 nm.

Western blot

Las muestrasdetejidorenalse homogeneizaronentampóndelisis(70mM sucrosa,2mMHepesKOH,220mM Manitol, 0,1 mM EGTA,1mM PMSF, 0,1 mM BSA, antiproteases cocktail (SIGMA),posteriormente se determinó la concentración de proteínas de éstas. Las proteínas se determinaron mediante el método colorimétrico de Bradford con un reactivo comercial de BioRad.

Se dispusieron en cada pocillo del gel de acrilamida al 12% 50 µg de proteína por cada uno de los grupos a analizar.Trasla electroforesis las proteínas fueron transferidas a membranasde nitrocelulosa donde posteriormente fueron bloqueadas con leche desnatadaal5% disueltaen tampón salino (TTBS) conun0,06%de detergenteTween. Las membranas de nitrocelulosa fueron incubadas durante toda la noche a 4ºC con un anticuerpo contra EPO (Santa Cruz antibodies, USA, sc-7956) a dilución 1/1000.

Al día siguiente sesometieronlas membranasa3lavadosde5minutos cada uno con TTBS, para posteriormente incubarlas conun anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa.Tras finalizarel periodode incubación conel segundo anticuerpoy trastreslavadosde cinco minutos con TTBS, se procedióal procesodedetección con ECL.

Análisis estadístico

Losdatosse muestran comomedia+/-el error estándardelamedia(SEM),ylosvaloresdep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisisdevarianza (ANOVA),y en caso de significación se aplicó la t-Student.

Resultados obtenidos

Análisis in vivo del efecto de CAII sobre la regeneración renal

Enla figura1 se muestranlos resultadosdel análisisdelRNA mensajerodelos genesdePCNAy Estatmina, ambos son marcadoresde proliferaciónyregeneración celular.Las muestras fueron tomadasderatones sometidosalos distintos tratamientos aplicados a la parte in vivo del modelo experimental de isquemia-reperfusión (I/R) renal. Como se observa en la figura 1, el proceso de I/R genera una respuesta regenerativa que se determina por un aumento en la expresión tantodePCNAcomode Estatminaenlos gruposdeI/Rcomparadosconel grupo control.Eltratamiento con CAIIprovocaunmarcado aumentoenesta respuestaregenerativa.Ello demuestraelpapel promotordelaregeneración de esta proteína.

La administración de inhibidor de la CAII, la azetazolamida (I/R+AZT), provoca un descenso en los marcadores regenerativos.

Por otra parte la CAII, mostró efecto regenerador únicamente en el tejido dañado, pues su administración a controles (control+ CAII), no provocó inducción de la regeneración.

Análisis in vivo del efecto de CAII sobre la apoptosis en daño renal

Enlafigura2 se representaeldaño celular, determinadoporla incidenciadeapoptosisyevaluadoporlaactividad de la caspasa 3. Podemos observar como la I/R induce un aumento significativo en este parámetro comparado con el grupo control.Esta incidenciade apoptosisseve drásticamente disminuidatrasel tratamientoconCAII(I/R+CAII). La administración de CAII a animales control, muestra que CAII no afecta a la apoptosis presente de manera natural en el tejido sano (grupo control+CAII).

Análisis in vivo del efecto de CAII en la expresión de Eritropoyetina (EPO)

Profundizandoenel mecanismo medianteelcuallaCAIIpodríaejercersufunciónregeneradorayprotectorafrente al daño renal, se estudió, in vivo, la relación de CAIIyEritropoyetina con la hipótesis de una posible inducción de EPO mediada por CAII.

El westernblotparalaEPO(Figura3) confirmóestaposible relacióndadoquese observóun marcado incremento en la cantidad de EPO presente en el grupo I/R cuando añadíamos CAII, así mismo la inhibición de CAII mediante azetazolamida disminuyó la cantidadde EPO presente en el riñón de los ratones sometidos a I/R (I/R+AZT) incluso por debajo de los niveles presentes en el grupo sometido únicamente a I/R.

Ejemplo2

Análisis in vitro del efecto de CAII sobre la regeneración del daño renal inducido por la toxina cisplatino

Materiales y métodos empleados

Cultivo celular de células tubulares renales (modelo de estudio in vitro)

Células epiteliales tubulares proximales de rata (NRK52e) se mantuvieron en botellas de cultivo (75 cm2)con medio de cultivo (DMEM) al que se le añadió17,5 mM de glucosay2,5 mM de glutamina, este medio tambiénfue suplementado con antibióticos (100 unidades/ml de penicilinay100 µg/ml estreptomicina)y con un 10% de suero fetal de ternera (FCS, del inglés fetal calf serum). Las células se incubaron en atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37ºC.

Las células control(control en Fig.4y5) fueron recogidas cuando alcanzaron confluencia sin ningún tratamiento.

El tratamiento con cisplatino (Sigma) se realizó disolviendo el fármaco en el mínimo volumen de DMSO (40 µl)y diluyéndoloenPBSa una concentraciónde200 µM.Despuésde6horas,se retirabael medioyse añadía medio nuevo sin fármaco para el grupo CIS (Fig.4y5)y con10 µg/ml de CAII para el grupo CIS+CAII (Fig.4y5). Se recogían las muestras 16 horas después.

En el grupo control+CAII (Fig.4y5)las células eran tratadas con idéntica dosisde CAII durante16 horas hasta su recogida.

RT-PCR a tiempo real

El RNAde las muestras procedentes del cultivo celular, fue extraído mediante el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones delfabricante (Invitrogen, Barcelona). Posteriormente se purificó el RNAtotal de las células con el RNeasyminiKitdeQiagen (Madrid) acordealas instruccionesdelfabricante.Las concentracionesdeRNAfueron calculadas por determinación de absorbancia a 260 nm. La integridad del RNA así obtenido se examinó mediante análisis de las bandas de RNA ribosomal 18sy 28s detectadoy analizado en el Bioanalyzer del Hospital Clínico Barcelona (Agilent).

La expresión de los genes analizados se midió mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real normalizada con GAPDH. LasRT-PCRsa tiempo real se llevarona cabo en unTermociclador Bio-Rad (iCycleriQ Real-TimePCR detection System, Bio-Rad, Barcelona)ylas amplificaciones se hicieron en reacciones de 20 µlcon elRT-PCR Kit con SYBR-Green en dos pasos (Bio-Rad) según las instrucciones delfabricante. Los cebadores fueron los siguientes: Ki-67:directo, SEQ ID NO: 9; reverso, SEQ ID NO: 10; PCNA: directo, SEQ ID NO: 3; reverso, SEQ ID NO: 4; GAPDH:directo, SEQ ID NO: 7; reverso, SEQ ID NO: 8.

Actividad de Caspasa 3

La actividad de caspasa-3 fue determinada por medida de proteolisis del sustrato específico (N-acetil-Asp-Glu-ValAsp-7-amino-4-metilcumarina (DEVD-AMC; Biomol, Plymouth Meeting,PA).Las muestrasde cultivocelular fueron homogeneizadasysonicadas en el tampón de ensayo (50 mM HEPES, 10% sucrose, 0,1% CHAPS,5mM GSSG,5 mM DTT). Los sobrenadantes de la muestra se incubaron en este tampón al que se le añadió DEVD-AMC a una concentración de 50 µM.El AMC liberado fue cuantificado durante1horaymediaa 37ºC por fluoroespectrofotometría, usando 380 nmdeexcitacióny midiendola emisióna 450 nm.

Análisis estadístico

Losdatosse muestran comomedia+/-el error estándardelamedia(SEM),ylosvaloresdep>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaroncon un análisisdevarianza (ANOVA),y en caso de significación se aplicó la t-Student.

Resultados obtenidos

Análisis in vitro del efecto de CAII sobre la regeneración renal

El estudio de regeneración, en este caso en la parte in vitro de nuestro modelo experimental está reflejado en la figura 4. Esta figura muestra, al igual que en el modelo in vivo descrito enelejemplo1, un análisis medianteRT-PCR de genes marcadoresde regeneración, en este caso se seleccionó PCNAyKi 67.

El tratamiento para inducir el daño celular en este caso fue la administración delfármaco cisplatino, un conocido inductor de daño renal. Como se puede observar en la figura 4, la administración de CAII a células dañadas con cisplatino (grupo cis+CAII) aumenta significativamente la regeneración, reflejado como el aumento en la expresión tanto de PCNA como de Ki67.

Análisis in vivo e in vitro del efecto de CAII sobre la apoptosis en daño renal

Enlafigura5 se representaeldaño celular, determinadoporla incidenciadeapoptosisyevaluadoporlaactividad de la caspasa 3. La parte in vitro de este estudio confirma los resultados obtenidos in vivo, pues la administración de CAII a células tratadas con cisplatino, consigue revertir la apoptosis (cisplatino+CAII).

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1.Usode una proteínaque comprendela secuenciade aminoácidosSEQIDNO:1, unavariantedela mismaoun fragmento de las anteriores para la elaboración de un medicamento.
2. 2. Usode un polinucleótidoque codifica parala proteína,lavarianteoel fragmento segúnla reivindicación1para la elaboración de un medicamento.
3. 3.Usodel polinucleótidosegúnlareivindicación2que comprendela secuenciade nucleótidosSEQIDNO:2para la elaboración de un medicamento.
4. 4.Usodeuna construccióngénicaque comprendeel polinucleótidosegún cualquieradelasreivindicaciones2ó3 para la elaboración de un medicamento.

5. 5.

   Usode unvector que comprendeel polinucleótido según cualquierade las reivindicaciones2ó3 ola construcción génica segúnla reivindicación4parala elaboraciónde un medicamento.

6. 6.

   Usode una célula que comprendeel polinucleótido según cualquierade las reivindicaciones2ó3,la construcción génica segúnla reivindicación4oelvector segúnla reivindicación5parala elaboraciónde un medicamento.

7. 7.Usodelaproteína,lavarianteoel fragmentosegúnlareivindicación1,el polinucleótidosegún cualquierade las reivindicaciones2ó3,la construcción génica segúnla reivindicación4,elvector segúnla reivindicación5 ola célula según la reivindicación6para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un daño causado por isquemia,isquemia-reperfusióno toxina en un tejidoo unórgano.

8. 8.

   Uso segúnla reivindicación7dondela toxina es cisplatino.

9. 9.

   Uso según cualquierade las reivindicaciones7 u8dondeel tejido es un epitelio.

10. 10. Uso segúnlareivindicación9dondeel epitelio se seleccionadela lista que comprende: epitelio renal, epitelio hepático, epitelio pulmonar, epitelio gástrico, epitelio intestinal, epitelio auditivo, epitelio pancreático, epitelio de transición urinario, epitelio uterino o epidermis de la piel.
11. 11. Uso según la reivindicación 10 donde el epitelio es el epitelio renal.
12. 12.Usosegún cualquieradelasreivindicaciones7 u8dondeelórganose seleccionadela listaque comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, oído, páncreas, vejiga, útero o piel.
13. 13. Uso según la reivindicación 12 donde el órgano es el riñón.

14. 14.

    Uso de la proteína, la variante o el fragmento según la reivindicación 1, el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones2ó3,la construcción génica segúnla reivindicación4,elvector segúnla reivindicación5 ola célula según la reivindicación6para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxina.

15. 15. Uso según la reivindicación 14 donde la toxina es cisplatino.

16. 16.

    Usodelaproteína,lavarianteoel fragmento segúnla reivindicación1,el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones2ó3,la construcción génica segúnla reivindicación4,elvector segúnla reivindicación5 o la célula según la reivindicación6para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamientodel rechazo de un órgano transplantado.

17. 17.

    Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde el órgano se selecciona de la lista que comprende: riñón, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, oído, páncreas, vejiga, útero o piel.

18. 18. Uso según la reivindicación 17 donde el órgano es el riñón.
19. 19. Composiciónfarmacéutica que comprendela proteína,lavarianteoel fragmentodela misma segúnla reivindicación1,el polinucleótidosegún cualquieradelasreivindicaciones2ó3,la construcción génicasegúnlareivindicación4,elvector segúnla reivindicación5ola célula segúnla reivindicación6.
20. 20.Composiciónfarmacéutica segúnla reivindicación19 que además comprende unvehículofarmacéuticamente aceptable.
21. 21. Composiciónfarmacéutica según cualquierade lasreivindicaciones19ó20 que además comprende otro principio activo.

    LISTADE SECUENCIAS

    <110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)

    <120> Uso de anhidrasa carbónica II para la elaboración de un medicamento

    <130> ES1641.478

    <160> 10

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1

    <211> 260

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 1

    ES2351 005A1

    <210> 2

    <211> 24476

    <212> DNA

    <213> Homo sapiens

    <400> 2

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    ES2351 005A1

    <210> 3

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador directo de PCNA

    <400> 3 <210> 4

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador reverso de PCNA

    <400> 4

    <210> 5

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador directo de Estatmina

    <400> 5

    <210> 6

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador reverso de Estatmina

    <400> 6

    <210> 7

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador directo de GAPDH

    <400> 7

    <210> 8

    <211> 24

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador reverso de GAPDH

    <400> 8

    <210> 9

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador directo de Ki-67

    <400> 9

    <210> 10

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> cebador reverso de Ki-67

    <400> 10

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.º solicitud:200930437

    ESPAÑA

    Fecha de presentación de la solicitud: 10.07.2009

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoría

    Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    A A

    LIEN YH, et al. Kidney International.1997. Vol. 52 (61), pp. S-85-S-88. ITO K, et al. Human Cell. 2004, Vol. 17 (1), pp. 17-28. 1-21 1-21

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

    Fecha de realización del informe 30.12.2010

    Examinador M. García Grávalos Página 1/4

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    Nº de solicitud:200930437

    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD C07K14/47 (01.01.2006)

    A61K38/43 (01.01.2006) A61P13/00 (01.01.2006) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

    C07K, A61K, A61P

    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, EBI

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud:200930437

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 30.12.2010

    Declaración

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-21 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-21 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud:200930437

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    LIEN YH, et al. Kidney International.1997. Vol.52 (61):S-85-S-88. 1997

    D02

    ITO K, et al. Human Cell. 2004, Vol. 17 (1):17-28. 2004

22. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La presente invención divulga el uso de una proteína, anhidrasa carbónica II, que comprende la secuencia SEQ ID NO:1; o de un polinucleótido, que comprende la secuencia SEQ ID NO:2, que codifica para dicha proteína, para la elaboración de un medicamento (reivindicaciones 1-3). Así como el uso de una construcción génica, un vector y/o una célula, que comprenden el polinucleótido mencionado (reivindicaciones 4-6). Dicho medicamento tiene aplicación en la prevención y/o tratamiento del daño producido en un tejido u órgano causado por isquemia, isquemia-reperfusión, toxina o rechazo cuando el órgano ha sido trasplantado (reivindicaciones 8-19). Se refiere también a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los elementos antes mencionados, un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otro principio activo (reivindicaciones 2022).

    El documento D01 divulga el posible uso de la terapia génica para el tratamiento de enfermedades que afectan a órganos sólidos como es el riñón, refiriéndose en particular a la terapia génica en la que se utilizan los liposomas como sistema no viral de liberación de genes. También estudia la eficacia de la terapia génica en un modelo animal con deficiencia de anhidrasa carbónica II (ver todo el documento).

    El documento D02, divulga un estudio sobre terapia génica dirigida al riñón. Aunque la liberación de genes en el riñón es difícil debido a las características biológicas de las células renales, este estudio concluye que la transferencia de genes mediada por liposomas es un método efectivo en la terapia génica dirigida al hígado (ver todo el documento).

    1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)

    El objeto técnico de la presente invención es el uso de una proteína, que comprende la secuencia SEQ ID NO:1, o de un polinucleótido que la codifica, que comprende la secuencia SEQ ID NO:2, para la elaboración de un medicamento para prevención y/o tratamiento del daño producido en un tejido u órgano por isquemia, isquemia-reperfusión, toxina o rechazo cuando el órgano ha sido trasplantado. Se refiere también a una composición farmacéutica que puede contiene cualquiera de los elementos antes mencionados.

    1.1. REIVINDICACIONES 1-21

    Se considera D01 como el documento del estado de la técnica más cercano al objeto de la presente invención. Anticipa el uso de terapia génica como modalidad terapéutica para enfermedades renales, utilizando un modelo animal deficiente en anhidrasa carbónica II. El documento D02 anticipa también un estudio de terapia génica dirigida al riñón.

    Aunque la presente solicitud comparte con lo divulgado en D01 y D02 el uso de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades renales. Sin embargo, ninguno de estos documentos, tomados independientemente o en combinación, anticipa el uso de la proteína anhidrasa carbónica II, ni de las secuencias SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, para la elaboración de un medicamento para la regeneración de un tejido dañado por isquemia, isquemia-perfusión o toxina debido a un fallo agudo de un órgano o rechazo de un órgano trasplantado.

    En consecuencia, las reivindicaciones 1-21 cumplen los requisitos de novedad y actividad Inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986).

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/4