ES2351057T3

ES2351057T3 - Anticuerpos contra madcam.

Info

Publication number: ES2351057T3
Application number: ES06795104T
Authority: ES
Inventors: Nicholas Pullen
Original assignee: PFIZER Ltd; Pfizer Ltd Great Britain
Current assignee: PFIZER Ltd; Pfizer Ltd Great Britain
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-07-05
Publication date: 2011-01-31
Anticipated expiration: 2026-07-05
Also published as: DOP2006000162A; CA2614314A1; US20070009536A1; NL1032132A1; PE20070374A1; NL1032132C2; EP1904531A2; TW200740844A; AR054539A1; JP2009500390A; US20090214558A1; EP1904531B1; US20110165167A1; UY29653A1; DE602006017373D1; GT200600297A; US7935794B2; ATE483732T1; WO2007007173A2; WO2007007173A3

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM, o parte de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno: (a) las regiones variables de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº 30, 32 ó 34, sin las secuencias señal; y (b) las regiones variables de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº 26 ó 28, sin las secuencias señal.

Description

La invención se refiere a un anticuerpo humano mejorado específico para la molécula de adhesión celular adresina mucosa (MAdCAM).

La molécula de adhesión celular adresina mucosa (MAdCAM) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de receptores de adhesión celular. Es una de las moléculas de adhesión implicadas en el reclutamiento de linfocitos a los tejidos cuando sea necesario, mediante su interacción con una molécula integrina sobre la superficie de los linfocitos.

Se ha demostrado que los anticuerpos que inhiben la unión de MAdCAM a su compañero de unión integrina, α4β7, por ejemplo anticuerpos anti-MAdCAM (por ejemplo, MECA-367; documento US 5.403.919, documento US 5.538.724) o anticuerpos anti-α4β7 (por ejemplo, Act-1; documento US 6.551.593 o Act-1 humanizado, también llamado MLN02, descrito en el documento WO 01/78779), pueden inhibir la extravasación de leucocitos en intestino inflamado, y por lo tanto pueden ser beneficiosos en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino.

Los anticuerpos anti-MAdCAM tales como MECA-367, sin embargo, no son terapéuticamente útiles en pacientes humanos; MECA-367 se une a MAdCAM de ratón, y no muestra mucha afinidad por la molécula MAdCAM humana. Además, siendo un anticuerpo de rata, conducirá a una respuesta inmune en pacientes humanos y por lo tanto no será adecuado para uso terapéutico. Se han descrito anticuerpos monoclonales de ratón, dirigidos contra MAdCAM humana (documento WO 96/24673), pero estos también tienen probabilidad de ser inmunogénicos en seres humanos. Recientemente, se han desarrollado anticuerpos anti-MAdCAM humana terapéuticamente útiles, completamente humanos, con especificidad y afinidad depuradas por MAdCAM humana y de primate y se han desvelado en el documento WO2005/067620.

Se sabe que incluso anticuerpos completamente humanos aún pueden conducir a una respuesta inmune en algunos pacientes, que probablemente se debe a secuencias en la región variable del anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención son modificaciones de los anticuerpos humanos anti-MAdCAM desvelados en el documento WO2005/067620, que probablemente son incluso menos propensos a cualquier problema de inmunogenicidad en pacientes humanos. Aspectos de la invención

Un aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM, que comprende la región variable de la cadena ligera de 7.16.6_V, 7.16.6_S, o 7.16.6_VS (SEC ID Nº 30, 32, 34).

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente

a MAdCAM, que comprende la región variable de la cadena pesada de 7.16.6_L (SEC ID Nº 28).

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM, que comprende la región variable de la cadena ligera de 7.16.6_V, 7.16.6_S, o 7.16.6_VS (SEC ID Nº 30, 32, 34) y la región variable de la cadena pesada de 7.16.6_L (SEC ID Nº 28).

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM, siendo el anticuerpo un anticuerpo que comprende las regiones variables codificadas por las secuencias de ácido nucleico expuestas en las SEC ID Nº 25 ó 27 y las SEC ID Nº 29, 31, ó 33.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM, siendo el anticuerpo un anticuerpo que comprende las regiones variables de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº 26 ó 28 y las SEC ID Nº 30, 32 ó 34, sin secuencias señal.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo:

una cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº 26 ó 28 y la

secuencia de aminoácidos de cadena ligera de las SEC ID Nº 30, 32 ó 34, sin las

secuencias señal.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal humano de la invención, en el que la lisina C-terminal de cadena pesada está escindida.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal humano de la invención, que es un isotipo IgG2. Un aspecto adicional de la invención es un anticuerpo monoclonal humano de la invención, que es un isotipo IgG4. Un aspecto adicional de la invención es un anticuerpo monoclonal humano de la invención que comprende una cadena ligera κ. Un aspecto adicional de la invención es un anticuerpo monoclonal humano de la invención que comprende una cadena ligera λ. Un aspecto preferido de la invención es un anticuerpo monoclonal humano de la invención que es un isotipo IgG2 con una cadena ligera κ.

En este documento se describe un vector que comprende cualquiera de las secuencias de las regiones variables de las SEC ID Nº 1, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 27, 29, 31, 33, 35, ó 37 o cualquiera de las secuencias que codifican las regiones variables de las SEC ID Nº 2, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 28, 30, 32, 34, 36 ó 38. Un aspecto adicional descrito es una célula huésped que comprende cualquiera de las secuencias de las regiones variables de las SEC ID Nº 1, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 27, 29, 31, 33, 35 ó 37, o cualquiera de las secuencias que codifican las regiones variables de las SEC ID Nº 2, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 28, 30, 32, 34, 36 ó 38. La célula huésped puede ser una bacteria tal como E. coli, una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, una célula vegetal, una célula de insecto, o una célula de mamífero. Más preferiblemente, la célula huésped es una célula de mamífero. Más preferiblemente, la célula huésped es una célula CHO o célula NS0.

Otro aspecto descrito es un procedimiento para producir el anticuerpo de la invención, que comprende cultivar una célula huésped que comprende cualquiera de las secuencias de las regiones variables de las SEC ID Nº 1, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 27, 29, 31, 33, 35 ó 37, o cualquiera de las secuencias que codifican las regiones variables de las SEC ID Nº 2, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 28, 30, 32, 34, 36 ó 38, en condiciones en las que el anticuerpo se expresa, y recuperar el anticuerpo de la célula huésped o su sobrenadante de cultivo.

Otro aspecto descrito es un animal transgénico o una planta transgénica, que comprende cualquiera de las Otro aspecto descrito es un animal transgénico o una planta transgénica, que comprende cualquiera de las secuencias de las regiones variables de las SEC ID Nº 1, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 27, 29, 31, 33, 35 ó 37, o cualquiera de las secuencias que codifican las regiones variables de las SEC ID Nº 2, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 28, 30, 32, 34, 36 ó 38.

Un aspecto de la invención es el uso de los anticuerpos de la invención o una parte de unión a antígeno de los mismos para su uso como medicamento. Otro aspecto de la invención es el uso de los anticuerpos de la invención o una parte de unión a antígeno de los mismos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de afecciones que implican la adhesión mediada por MAdCAM de los leucocitos. Otro aspecto de la invención es el uso de los anticuerpos de la invención o una parte de unión a antígeno de los mismos para el tratamiento de afecciones inflamatorias, tales como, aunque sin limitación, enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino tal como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa; enfermedad de divertículos, gastritis, enfermedad hepática, esclerosis primaria, colangitis esclerosante. Las enfermedades inflamatorias también incluyen, aunque sin limitación, enfermedad abdominal (incluyendo peritonitis, apendicitis, enfermedad del conducto biliar), mielitis transversa aguda, dermatitis alérgica (incluyendo piel alérgica, eccema alérgico, atopia cutánea, eccema atópico, dermatitis atópica, inflamación cutánea, eccema inflamatorio, dermatitis inflamatoria, piel con pulgas, dermatitis miliar, eccema miliar, piel con ácaros del polvo del hogar), espondilitis anquilosante (síndrome de Reiter), asma, inflamación de las vías aéreas, aterosclerosis, arteriosclerosis, atresia biliar, inflamación de vejiga; cáncer de mama, inflamación cardiovascular (incluyendo vasculitis, infartos reumatoides del pliegue ungleal, úlceras en las piernas, polimiositis, inflamación vascular crónica, pericarditis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica), pancreatitis, incluyendo pancreatitis crónica, inflamación perineural, enfermedad celíaca, colitis (incluyendo colitis amébica, colitis infecciosa, colitis bacteriana, colitis de Crohn, colitis isquémica, colitis ulcerosa, proctocolitis idiopática, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis pseudomembranosa), cloroma, trastornos vasculares del colágeno (artritis reumatoide, SLE, esclerosis sistémica progresiva, enfermedad del tejido conectivo mixto, diabetes mellitus), enfermedad de Crohn (enteritis regional, ileítis granulomatosa, ileocolitis, inflamación del sistema digestivo), enfermedad desmielinizante (incluyendo mielitis, esclerosis múltiple, esclerosis diseminada, encefalomielitis diseminada aguda, desmielinización perivenosa, deficiencia de vitamina B12, síndrome de Guillain-Barre, MS asociada a retrovirus), dermatomiositis, diverticulitis, enfisema, diarrea exudativa, fiebre en pacientes inmunocomprometidos, gastritis, hepatitis granulomatosa, inflamación granulomatosa, colecistitis, diabetes mellitas dependiente de insulina, enfermedades inflamatorias hepáticas (fibrosis hepática incluyendo, aunque sin limitación, daño hepático inducido por hepatitis C, enfermedad hepática alcohólica, esteatohepatitis no alcohólica (NASH); cirrosis biliar primaria, hepatitis, colangitis esclerosante), inflamación pulmonar (fibrosis pulmonar idiopática, granuloma eosinofílico del pulmón, histiocitosis X pulmonar, inflamación peribronquiolar, bronquitis aguda), linfogranuloma venéreo, melanoma maligno, enfermedad de la boca/dientes (incluyendo gingivitis, enfermedad periodontal), cánceres metastáticos, mucositis, inflamación del sistema músculo-esquelético (miositis), esteatohepatitis no alcohólica (enfermedad del hígado graso no alcohólico), inflamación ocular y orbital (incluyendo uveítis, neuritis óptica, ulceración reumatoide periférica, inflamación periférica de la córnea), osteoartritis, osteomielitis, inflamación faríngea, poliartritis, proctitis, psoriasis, lesión por radiación, sarcoidosis, neuropatía de células falciformes, tromboflebitis superficial, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tiroiditis, lupus sistémico eritematoso, esprue tropical, enfermedad de injerto contra huésped, lesión aguda por quemadura, síndrome de Behcet, síndrome de Sjögren, trastornos del útero tales como endometriosis, dismenorrea o enfermedad inflamatoria pélvica. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se usan para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, enfermedad de injerto contra huésped, fibrosis hepática, uveítis. Incluso más preferiblemente, los anticuerpos de la invención se usan para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento de tratamiento de una afección mencionada anteriormente, que comprende administrar a un paciente, en necesidad de dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención o una parte de unión a antígeno del mismo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Descripción detallada de la invención

Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada completa de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención puede construirse fusionando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable completo de una cadena pesada o un dominio de unión a antígeno del mismo con un dominio constante de una cadena pesada. Asimismo, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM puede construirse fusionando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena ligera o un dominio de unión a antígeno del mismo con un dominio constante de una cadena ligera. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las regiones VH y VL pueden convertirse en los genes de anticuerpo de longitud completa insertándolas en vectores de expresión que ya codifican las regiones constante de cadena pesada y constante de cadena ligera, respectivamente, de modo que el segmento VH se una de forma funcional al segmento o segmentos de la región constante de cadena pesada (CH) dentro del vector y el segmento VL se una de forma funcional al segmento de la región constante de cadena ligera (CL) dentro del vector. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VH o VL se convierten en genes de anticuerpo de longitud completa uniendo, por ejemplo, ligando, la molécula de ácido nucleico que codifica una cadena VH con una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena CH usando técnicas de biología molecular convencionales. Puede conseguirse lo mismo usando moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes de la región constate de cadena pesada y ligera humanas son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., NIH Publ. Nº 91-3242 (1991). Las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa después pueden expresarse a partir de una célula en la que se han introducido y aislarse el anticuerpo anti-MAdCAM.

Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención o una parte de unión a antígeno del mismo, o la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención o una parte de unión a antígeno del mismo puede prepararse, por ejemplo, sintetizando ácidos nucleicos apropiados usando la información de secuencia proporcionada en este documento, y cortándolos y empalmándolos junto con las regiones constantes deseadas de los genes de inmunoglobulina. Los especialistas en la técnica serán conscientes de los procedimientos apropiados.

Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar de forma recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-MAdCAM, como se describe a continuación. Las moléculas de ácido nucleico también pueden usarse para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpo, como se describe adicionalmente a continuación. Si las moléculas de ácido nucleico se obtienen de un animal no humano, no transgénico, las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para la humanización de anticuerpos, también como se describe a continuación.

La invención proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena pesada o la parte de unión a antígeno de la misma. La invención también proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena ligera o parte de unión a antígeno de la misma. La invención también proporciona vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo, y sondas de los mismos.

Para expresar los anticuerpos, o partes de anticuerpo usados en la invención, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada parciales o de longitud completa, obtenidos como se ha descrito anteriormente, se insertan en vectores de expresión de modo que los genes se unan de forma funcional a secuencias de control de la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus de plantas tales como el virus del mosaico de la coliflor virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YAC, epitomas derivados de EBV, y similares. El gen de anticuerpo se liga en un vector de modo que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector sirvan para su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores diferentes. En una realización preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por procedimientos convencionales (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen de anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no están presentes sitios de restricción).

Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados diseñados de modo que cualquier secuencia VH o VL puede insertarse y expresarse fácilmente, como se ha descrito anteriormente. En dichos vectores, el corte y empalmen habitualmente sucede entre el sitio donante de corte y empalmen en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede la región C humana, y también en las regiones de corte y empalmen que existen dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y terminación de la transcripción suceden en sitios cromosómicos nativos cadena debajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal se una en fase al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula huésped. Los especialistas en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen elevados niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamífero potentes tales como los promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Para una descripción adicional de elementos reguladoras virales, y secuencias de las mismas, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.168.062, 4.510.245, y 4.968.615. Los procedimientos para expresar anticuerpos en plantas, incluyendo una descripción de los promotores y vectores, así como la transformación de plantas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.517.529. Los procedimientos para expresar polipéptidos en células bacterianas o células fúngicas, por ejemplo, células de levadura, también son conocidos en la técnica.

Además de los genes de la cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante usados en la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped dhfr-con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para la selección con G418), y el gen de la glutamato sintetasa.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma y/o la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM, y los vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, pueden usarse para la transformación de una célula huésped de mamífero, vegetal, bacteriana

o de levadura adecuada. La transformación puede ser por cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped. Los procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del (de los) polinucleótido(s) en liposomas, inyección por biolística y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamífero por vectores virales. Los procedimientos para transformar células son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455. Los procedimientos para transformar células vegetales son bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. Los procedimientos para transformar células bacterianas y de levadura son también bien conocidos en la técnica.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC). Éstas incluyen, inter alia, células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0, SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, y otras varias líneas celulares. Las células huésped de mamífero incluyen células humanas, de ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovinas, de caballo y de hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen elevados niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibio, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando se introducen los vectores de expresión recombinante que codifican la cadena pesada o parte de unión a antígeno de la misma, la cadena ligera y/o parte de unión a antígeno de la misma en células huésped de mamífero, los anticuerpo se producen cultivando las células huésped durante un periodo de time suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando procedimientos de purificación de proteínas convencionales. Las células huésped vegetales incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja de agua, maíz, trigo, patata, etc. Las células huésped bacterianas incluyen E. coli y especies Streptomyces. Las células huésped de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.

Además, la expresión de los anticuerpos usados en la invención (u otros restos a partir de la misma) a partir de las líneas celulares de producción puede potenciarse usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintasa (el sistema GS) es un enfoque común para potenciar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se analiza por completo o en parte en conexión con las Patentes europeas Nº 0 216 846, 0 256 055, 0 338 841 y 0 323 997.

Es probable que los anticuerpos expresados por diferentes líneas celulares o en animales transgénicos tengan diferente glucosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en este documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en este documento son parte de la presente invención, independientemente de la glucosilación de los anticuerpos.

Los animales no humanos transgénicos y las plantas transgénicas que comprenden uno

o más moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente pueden usarse para producir anticuerpos usados en la invención. Los anticuerpos pueden producirse en y recuperarse de tejido o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina, de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hámsteres u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, y 5.741.957. Como se ha descrito anteriormente, pueden inmunizarse animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana con MAdCAM o una parte de la misma. Los procedimientos para crear anticuerpos en plantas se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 6.046.037 y 5.959.177.

Los animales transgénicos no humanos y las plantas transgénicas se producen introduciendo una o más moléculas de ácido nucleico usadas en la invención en el animal o planta por técnicas transgénicas convencionales. Véase Hogan, supra. Las células transgénicas usadas para crear el animal transgénicos pueden ser células madre embrionarias, células somáticas u óvulos fertilizados. Los organismos no humanos transgénicos pueden ser heterocigotos quiméricos, no quiméricos, y homocigotos no quiméricos. Véase, por ejemplo, Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson y col., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Los organismos no humanos transgénicos pueden tener una alteración y remplazo dirigidos que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de interés. Los animales o plantas transgénicas pueden comprender y expresar moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera que se combinan para unirse específicamente a MAdCAM, preferiblemente MAdCAM humana. Los animales o plantas transgénicas pueden comprender moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden crearse en cualquier animal transgénico. Los animales no humanos incluyen ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. El animal transgénico no humano expresa dichos polipéptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales.

El tratamiento puede implicar la administración de uno o más anticuerpos monoclonales inhibidores anti-MAdCAM de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, solos o con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos inhibidores anti-MAdCAM y las composiciones que los comprenden, pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos diferentes. Dichos agentes adicionales pueden incluirse en la misma composición o administrarse por separado. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes anti-inflamatorios o inmunomoduladores. Estos agentes incluyen, aunque sin limitación, corticosteroides tópicos y orales tales como prednisolona, metilprednisolona, NCX-1015 o budesonida; aminosalicilatos tales como mesalazina, olsalazina, balsalazida o NCX-456; la clase de inmunomoduladores tales como azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10 (Ilodecakina), IL-11 (Oprelvekina), IL-12, antagonistas MIF/CD74, antagonistas CD40, tales como TNX-100/5-D12, antagonistas OX40L, GM-CSF, pimecrolimus o rapamicina; la clase de agentes anti-TNFα tales como infliximab, adalimumab, CDP-870, onercept, etanorcept; la clase de agentes antiinflamatorios, tales como inhibidores de PDE-4 (roflumilast, etc.), inhibidores de TACE (DPC333, RDP-58, etc.) e inhibidores de ICE (VX-740, etc.) así como antagonistas del receptor de IL-2, tales como daclizumab, la clase de antagonistas de moléculas de adhesión selectivas, tales como natalizumab, MLN-02, o alicaforsen, clases de agentes analgésicos tales como, aunque sin limitación, inhibidores de COX-2, tales como rofecoxib, valdecoxib, celecoxib, moduladores del canal sensible a voltaje tipo P/Q (α2δ), tales como gabapentina y pregabalina, antagonistas del receptor de NK-1, moduladores del receptor cannabinoide, y agonistas del receptor opioide delta, así como agentes quimioterapéuticos anti-neoplásicos, anti-tumorales, anti-angiogénicos, o agentes anti-fibróticos incluyendo, aunque sin limitación, inhibidores de

5 proteasa, preferiblemente inhibidores de caspasa, más preferiblemente el inhibidor de caspasa es un compuesto de fórmula I. El compuesto de fórmula I

10

imagen1

Fórmula I en la que A, B, R1 y R2 son como se definen a continuación. En la que

15 A es un aminoácido natural o no natural de Fórmula IIa-i:

imagen2

B es un átomo de hidrógeno, un átomo de deuterio, alquilo, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, 2-benzoxazolilo, 2-oxazolilo sustituido, (CH2)n-cicloalquilo, (CH2)n25 fenilo, (CH2)n-(fenilo sustituido), (CH2)n-(1 ó 2-naftilo), (CH2)n-(1 ó 2-naftilo sustituido), (CH2)n(heteroarilo), (CH2)n-(heteroarilo sustituido), halometilo, CO2R12 , CONR13R14 , CH2ZR15 , CH2OCO(arilo), CH2OCO(heteroarilo), o CH2OPO(R16)R17, donde Z es un átomo de oxígeno o

imagen3

R1 es alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo, fenilalquilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, (1 ó 2 naftil)alquilo, (1 ó 2 naftil)alquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, (heteroaril)alquilo, (heteroaril)alquilo sustituido, R1a(R1b)N, o R1cO; y R2 es hidrógeno, alquilo inferior, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo, fenilalquilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, (1 ó 2 naftil)alquilo, o (1 ó 2 naftil)alquilo sustituido; y en la que:

R1a

y R1b son independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo, fenilalquilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, (1 ó 2 naftil)alquilo, (1 ó 2 naftil)alquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, (heteroaril)alquilo, o (heteroaril)alquilo sustituido, con la condición de que R1a y R1b no pueden ser ambos hidrógeno;

R1c

es alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo, fenilalquilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, (1 ó 2 naftil)alquilo, (1 ó 2 naftil)alquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, (heteroaril)alquilo, o (heteroaril)alquilo sustituido; R3 es alquilo C1-6, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, (CH2)nNH2, (CH2)NHCOR9, (CH2)nN(C=NH)NH2, (CH2)mCO2R2, (CH2)mOR10 , (CH2)mSR11 , (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), (CH2)n(1 ó 2-naftilo) o (CH2)n(heteroarilo), incluyendo el heteroarilo piridilo, tienilo, furilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, pirimidilo, triazinilo, tetrazolilo, e indolilo; R3a es hidrógeno o metilo, o R3 y R3a tomados juntos son -(CH2)d-donde d es un número entero de 2 a 6; R4 es fenilo, fenilo sustituido, (CH2)mfenilo, (CH2)m(fenilo sustituido), cicloalquilo, o cicloalquilo benzocondensado; R5 es hidrógeno, alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), o (CH2)n(1 ó 2-naftilo); R6 es hidrógeno, flúor, oxo, alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo, (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), (CH2)n(1 ó 2-naftilo), OR10 , SR11, o NHCOR9; R7 es hidrógeno, oxo (es decir =O), alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo, (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), o (CH2)n(1 ó 2-naftilo); R8 es alquilo inferior, cicloalquilo, (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), (CH2)n(1 ó 2-naftilo), o COR9; R9 es hidrógeno, alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo, (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), (CH2)n(1 ó 2-naftilo), OR12, o

NR13R14

; R10

es hidrógeno, alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo,

(CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), o (CH2)n(1 ó 2-naftilo); R11

es alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo, (CH2)ncicloalquilo,

(CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), o (CH2)n(1 ó 2-naftilo); R12

es alquilo inferior, cicloalquilo, (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo

sustituido), o (CH2)n(1 ó 2-naftilo); R13

es hidrógeno, alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, (CH2)ncicloalquilo, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), o (CH2)n(1 ó 2naftilo); R14 es hidrógeno o alquilo inferior; o R13 y R14 tomados juntos forman un anillo carbocíclico o heterocíclico de cinco a siete miembros, tal como morfolina, o piperazina N-sustituida;

R15

es fenilo, fenilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, heteroarilo, (CH2)nfenilo,

(CH2)n(fenilo sustituido), (CH2)n(1 ó 2-naftilo), o (CH2)n(heteroarilo); R16

o R17 son independientemente alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido,

naftilo, fenilalquilo, fenilalquilo sustituido, o (cicloalquil)alquilo; R16 R19

y son independientemente hidrógeno, alquilo, fenilo, fenilo sustituido, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido), o R18 y R19 tomados juntos son -(CH=CH)2-; R20 es hidrógeno, alquilo, fenilo, fenilo sustituido, (CH2)nfenilo, (CH2)n(fenilo sustituido); R21, R22 y R23 son independientemente hidrógeno, o alquilo; X es CH2, (CH2)2, (CH2)3, o S; Y1 es Oo NR23; Y2 es CH2, O, o NR23; a es 0 ó 1 y b es 1 ó 2, con la condición de que cuando a es 1 entonces b sea 1; c es 1 ó 2, con la condición de que cuando c es 1 entonces a sea 0 y b sea 1; m es1 ó2; y n es 1, 2, 3ó4;

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Como se usa en este documento, el término "alquilo" significa una cadena de carbono C1 a C10 lineal o ramificada, tal como metilo, etilo, terc-butilo, iso-propilo, n-octilo, y similares. La expresión "alquilo inferior" significa una cadena de carbono C1 a C6 lineal o ramificada, tal como metilo, etilo, iso-propilo, y similares.

Dependiendo de la elección del disolvente y otras condiciones conocidas para los especialistas en la técnica, estos compuestos también pueden adoptar la forma cetal o acetal, y

el uso de estas formas en la combinación de la invención se incluye en la invención.

Estos compuestos pueden prepararse como se describe en el documento WO 00/01666

o en el documento US 6.544.951. Los subgrupos preferidos son aquellos enumerados en el

documento US 6.544.951.

Se prefieren compuestos seleccionados entre:

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-fluoro-4-yodofenil)oxamil)valinil]amino-5-(2',3',5',6'tetrafluorofenoxi)-4-oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-clorofenil)oxamil)valinil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)-4oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-bromofenil)oxamil)valinil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)-4oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-fluorofenil)oxamil)valinil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)-4oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-trifluorometilfenil)oxamil)valinil]amino-5-(2',3',5',6'tetrafluorofenoxi)-4-oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(1-antril)oxamil)valinil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)-4oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-terc-butilfenil)oxamil)alaninil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)4-oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-trifluorometilfenil)oxamil)alaninil]amino-5-(2',3',5',6'tetrafluorofenoxi)-4-oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2,6-difluorofenil)oxamil)alaninil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)4-oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(1-naftil)oxamil)alaninil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)-4oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(4-metoxifenil)oxamil)alaninil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)-4oxopentanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-trifluorometilfenil)oxamil)valinil]amino-4-oxobutanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-terc-butilmetilfenil)oxamil)valinil]amino-4-oxobutanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-bencilfenil)oxamil)valinil]amino-4-oxobutanoico;

ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-fenilfenil)oxamil)valinil]amino-4-oxobutanoico.

Más preferiblemente, el compuesto es ácido (3S)-3-[N-(N'-(2-terc

butilfenil)oxamil)alaninil]amino-5-(2',3',5',6'-tetrafluorofenoxi)-4-oxopentanoico. Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes

antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y potenciadores o retardadores de al absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, tampón acetato con cloruro sódico, dextrosa, glicerol, polietilenglicol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. Son ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables tensioactivos, agentes humectantes o cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian el periodo de validez o la eficacia del anticuerpo.

Las composiciones usadas en esta invención pueden estar en diversas formas, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, torta liofilizada, polvos secos, liposomas y supositorios. La forma aludida depende del modo pretendido de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de seres humanos. El modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular, intradérmico). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular, intradérmica o subcutánea. Si se desea, el anticuerpo puede administrarse usando una bomba, enema, supositorio, o depósito permanente o similar.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de una solución, torta liofilizada, polvo seco, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el anticuerpo anti-MAdCAM en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente estéril del mismo. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. Las características deseadas de una solución pueden mantenerse, por ejemplo, por el uso de tensioactivos y el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión por el uso de tensioactivos, fosfolípidos y polímeros. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales monoestearato, materiales poliméricos, aceites y gelatina.

Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse por una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo preferido de administración es infusión subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa. Como apreciarán los especialistas en la técnica, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados.

En ciertas realizaciones, las composiciones de anticuerpo pueden prepararse con un vehículo que protegerá al anticuerpo contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1978)).

En ciertas realizaciones, puede administrarse por vía oral un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimida en comprimidos, o incorporada directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, a los anticuerpos anti-MAdCAM se les puede incorporar excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención de un modo diferente a administración parenteral, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación.

Las composiciones de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o parte de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, sexo, y pero del individuo, y la capacidad del anticuerpo o parte de anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan cualquier efecto tóxico o nocivo del anticuerpo o parte de anticuerpo. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctica deseado. Típicamente, como una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una fase anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz puede ser menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente concretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación las formas unitarias de dosificación de la invención están dictaminadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del anticuerpo anti-MAdCAM o parte del mismo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para componer dicho anticuerpo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Un intervalo ejemplar, no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención es de 0,025 a 50 mg/kg, más preferiblemente de 0,1 a 50 mg/kg, más preferiblemente 0,1-25, de 0,1 a 10 o de 0,1 a 3 mg/kg. En algunas realizaciones, una formulación contiene 5 mg/ml de anticuerpo en un tampón de acetato sódico 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM, y 0,2 mg/ml de polisorbato 80. En otras realizaciones, una formulación contiene 10 mg/ml de anticuerpo en 2,73 mg/ml de acetato sódico trihidrato, 45 mg/ml de manitol, 0,02 mg/ml de EDTA disódico dihidrato, 0,2 mg/ml de polisorbato 80, ajustado a pH 5,5 con ácido acético glacial, por ejemplo para uso intravenoso. En otras realizaciones, una formulación contiene 50 mg/ml de anticuerpo, 2,73 mg/ml de acetato sódico trihidrato, 45 mg/ml de manitol, 0,02 mg/ml de EDTA disódico dihidrato, 0,4 mg/ml de polisorbato 80, ajustado a pH 5,5 con ácido acético glacial, por ejemplo, para uso subcutáneo o intradérmico. Debe apreciarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección a aliviar. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse en el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en este documento son solamente ejemplares y no se pretende que limiten el alcance o práctica de la composición reivindicada.

En una realización preferida, el anticuerpo se administra en una formulación en forma de una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5 y que comprende de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo, de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de tampón histidina, de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa, y de aproximadamente 0,01 milimolar a aproximadamente 1,0 milimolar de EDTA disódico dihidrato.

Otro aspecto de la presente invención proporciona kits que comprenden un anticuerpo anti-MAdCAM o parte de anticuerpo de la invención o una composición que comprende dicho anticuerpo. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o composición, agentes de diagnóstico

: o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones para su uso en un procedimiento de diagnóstico o terapéutico. En una realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y un agente de diagnóstico que puede usarse en un procedimiento descrito a continuación. En otra realización preferida, el kit incluye el anticuerpo

: o una composición que lo comprende y uno o más agentes terapéuticos que puede usarse en un método descrito a continuación.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden administrarse a un paciente en necesidad de las mismas mediante terapia génica. La terapia puede ser in vivo o ex vivo. En una realización preferida, se administran a un paciente moléculas de ácido nucleico que codifican tanto la cadena pesada como la cadena ligera. En una realización más preferida, las moléculas de ácido nucleico se administran de tal modo que se integran de forma estable en los cromosomas de células B porque estas células están especializadas para producir anticuerpos. En una realización preferida, se transfectan o infectan ex vivo células B precursoras y se re-transplantan en un paciente que lo necesite. En otra realización, se infectan in vivo células B precursoras u otras células usando un virus recombinante que se sabe que infecta el tipo celular de interés. Los vectores típicos usados para terapia génica incluyen liposomas, plásmidos y vectores virales. Los vectores virales ejemplares son retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados. Después de infección in vivo o ex vivo, pueden controlarse los niveles de expresión de anticuerpo tomando una muestra del paciente tratado y usando cualquier inmunoensayo conocido en la técnica o analizado en este documento.

En una realización preferida, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y expresar la molécula de ácido nucleico. En otra realización, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y expresar la molécula de ácido nucleico. En un procedimiento más preferido, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o la parte de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención y expresar las moléculas de ácido nucleico. El procedimiento de terapia génica también puede comprender la etapa de administrar otro agente anti-inflamatorio o inmunomodulador.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento de diagnosis de una afección en la que el anticuerpo de la invención será útil como medicamento, ensayado si existe unión anormal de un anticuerpo de la invención en el paciente. Esto puede hacerse usando diversas técnicas de formación de imágenes bien conocidas para los especialistas en la técnica, tales como análisis de rayos x, centelleografía gamma, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía de emisión de positrones o tomografía computarizada (CT) y otras.

Puede usarse uno o más anticuerpos inhibidores anti-MAdCAM de la invención como vacuna o como adyuvante para una vacuna, y esto es otro aspecto de la invención. En particular, como MAdCAM se expresa en tejido linfoide, los antígenos de vacuna pueden dirigirse ventajosamente a tejido linfoide conjugando el antígeno con un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención.

Salvo que se defina de otro modo en este documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden habitualmente los especialistas en la técnica. Además, salvo que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán los singulares. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química proteica y de ácidos nucleicos e hibridación descritos en este documento son los bien comprendidos y habitualmente usados en la técnica. Los procedimientos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,

N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se consigue habitualmente en la técnica o como se describe en este documento. Se usan técnicas convencionales para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento de pacientes.

El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos polipeptídicos de una secuencia proteica. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.

La expresión "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de obtención (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no existe en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido que se sintetiza química o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de forma natural estará "aislado" de sus componentes asociados de forma natural. Una proteína también se puede volver sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica.

Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o está "sustancialmente purificado" cuando al menos del 60 al 75% de una muestra presenta una única especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérica o multimérica. Un polipéptido o proteína sustancialmente pura comprenderá típicamente aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% p/p de una muestra proteica, más habitualmente aproximadamente el 95%, y preferiblemente será más del 99% pura. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse por varios medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra proteica, seguida de visualización de una única banda de polipéptido después de la tinción del gel con un tinte bien conocido en la técnica. Para ciertos propósitos, puede proporcionarse mayor resolución usando HPLC u otro medio bien conocido en la técnica para la purificación.

La expresión "fragmento polipeptídico" como se usa en este documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero donde el resto de la secuencia de aminoácidos es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos son de al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente de al menos 50 aminoácidos de longitud, incluso más preferiblemente de al menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud.

La expresión "análogo polipeptídico" como se usa en este documento se refiere a un polipéptido que comprende un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácidos y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a MAdCAM en condiciones de unión adecuadas,

(2) capacidad de inhibir la integrina α4β7 y/o unión de L-selectina a MAdCAM, o (3) capacidad de reducir la expresión de MAdCAM en la superficie celular in vitro o in vivo. Típicamente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución (o inserción o deleción) de aminoácido conservativa con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos típicamente son de al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud o más largos, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud completa.

Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada para una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígeno. La parte carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadena ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras κ y A. Las cadenas pesadas se clasifican como µ, δ, γ, α,o ε,y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase en líneas generales, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forma el sitio de unión del anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas de inmunoglobulina muestran la misma estructura general de regiones flanqueantes relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones flanqueantes para formar un sitio de unión específico de epítopo. De extremo N-terminal a extremo C-terminal, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chotia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987); Chotia y col., Nature, 342:878-883(1989).

El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una parte de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. En algunas realizaciones, un anticuerpo es una parte de unión a antígeno del mismo. Las partes de unión a antígeno pueden producirse por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las partes de unión a antígeno incluyen, inter alia, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, y de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específico al polipéptido. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consta de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consta de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward y col., Nature, 341:544546(1989)) consta de un dominio VH. El término también pretende incluir versiones modificadas del anticuerpo tales como anticuerpos pegilados o anticuerpos conjugados con restos detectables tales como enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina), radioisótopos, biotina, marcadores fluorescentes, y otros.

Como se usa en este documento, un anticuerpo que se menciona como, por ejemplo, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 ó 9.8.2, es un anticuerpo monoclonal que se produce por el hibridoma del mismo nombre. Por ejemplo, el anticuerpo

1.7.2 se produce por el hibridoma 1.7.2. Un anticuerpo que se menciona como 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod es un anticuerpo monoclonal cuya secuencia se ha modificado a partir de su precursor correspondiente por mutagénesis dirigida al sitio.

Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente mediante un enlazador sintético que les permite prepararse en forma de una cadena proteica sencilla (Bird y col., Science, 242:423426 (1988) y Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)). Los diacuerpos son anticuerpos bivalente, biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero usando un enlazado que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo a que los dominios se apareen con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 64446448 (1993) y Poljak, R. J., y col., Structure, 2:1121-1123 (1994)). Puede incorporarse una o más CDR de un anticuerpo de la invención en una molécula de forma covalente o no covalente para crear una inmunoadhesina que se una específicamente a MAdCAM. Una inmunoadhesina puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede unir covalentemente la(s) CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la(s) CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" (diacuerpo) tiene dos sitios de unión diferentes.

Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural, incluyendo otros anticuerpos asociados de forma natural, que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no existe en la naturaleza. Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-MAdCAM que se ha purificado por afinidad usando MAdCAM, un anticuerpo anti-MAdCAM que se ha producido por un hibridoma u otra línea celular in vitro, y un anticuerpo humano anti-MAdCAM obtenido de un animal o planta transgénica.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo humano" significa un anticuerpo en el que las secuencias de región variable y constante son secuencias humanas. El término abarca anticuerpos obtenidos de genes humanos, pero que se han cambiado, por ejemplo, para disminuir la posible inmunogenicidad, aumentar la afinidad, eliminar las cisternas

o sitios de glucosilación que podrían causar plegamiento indeseable, etc. El término abarca dichos anticuerpos producidos de forma recombinante en células no humanas que podrían conferir glucosilación no típica de células humanas. La expresión también abarca anticuerpos que se han creado en un ratón transgénico que comprende alguno o todos los loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado. En algunas

realizaciones, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo que se obtiene de una especie no humana, en la que se han mutado ciertos aminoácidos en los dominios flanqueante y constante de las cadenas pesada y ligera para evitar o anular una respuesta inmune en seres humanos. En algunas realizaciones, puede producirse un anticuerpo humanizado fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. Pueden hallarse ejemplos de cómo preparar anticuerpos humanizados en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado anti-MAdCAM de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de una o más regiones flanqueantes de uno o más anticuerpos humanos anti-MAdCAM de la invención.

En otro aspecto, la invención incluye el uso de un "anticuerpo quimérico". En algunas realizaciones, el anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos distintos. En una realización preferida, una o más de las CDR se obtienen de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invención. En una realización más preferida, todas las CDR se obtienen de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invención. En otra realización preferida, se mezclan las CDR de más de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invención y se aparean en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo humano anti-MAdCAM que puede combinarse con la CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo humano anti-MAdCAM, y las CDR de la cadena pesada pueden obtenerse de un tercer anticuerpo anti-MAdCAM. Además, las regiones flanqueantes pueden obtenerse de uno de los mismos anticuerpos anti-MAdCAM, de uno o más anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado.

Un "anticuerpo neutralizante", un "anticuerpo inhibidor" o anticuerpo antagonista es un anticuerpo que inhibe la unión de α4β7 o células que expresan α4β7, o cualquier otro ligando afín o célula que exprese el ligando afín, a MAdCAM en el menos aproximadamente un 20%. En una realización preferida, el anticuerpo reduce o inhibe la unión de la integrina α4β7o células que expresan α4β7 a MAdCAM en el menos un 40%, más preferiblemente en un 60%, incluso más preferiblemente en un 80%, 85%, 90%, 95% o 100%. La reducción de la unión puede medirse por cualquier medio conocido para los especialistas en la técnica, por ejemplo, medida en un ensayo de unión competitiva in vitro. Un ejemplo para medir la reducción en la unión de células que expresan α4β7 a MAdCAM se presenta en el Ejemplo 1.

Los especialistas en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos siguiendo los contenidos de esta memoria descriptiva. Existen extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos cerca de los límites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferiblemente, se usan procedimientos de comparación computarizada para identificar los motivos de secuencia o los dominios de conformación proteica predicha que existen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Los procedimientos para identificar las secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida son conocidos (Bowie y col., Science, 253:164 (1991)).

El término "kdis " se refiere a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

El término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpoantígeno particular. Se dice que un anticuerpo se une a un antígeno cuando la constante de disociación es ≤ 1 µM, preferiblemente ≤ 100 nM y mucho más preferiblemente 5 10 nM.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de una unión específica con una inmunoglobulina o receptor de célula T o de otro modo de interacción con una molécula. Los determinantes epitópicos habitualmente constan de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidrato y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional". En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula de interacción (tal como un anticuerpo) existen de forma lineal a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción existen a través de restos aminoacídicos en la proteína que están separados unos de otros.

Como se usa en este documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology -A Synthesis (2ª Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos α, α-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N-acetillisina, Ofosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares y iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en este documento, la dirección a mano izquierda es la dirección aminoterminal y la dirección a mano derecha es la dirección carboxi-terminal de acuerdo con el uso y

convención normales.

El término "polinucleótido" como se menciona en este documento significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

La expresión "polinucleótido aislado" como se usa en este documento significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en que se encuentra el "polinucleótido aislado" en la naturaleza, (2) está unido de forma funcional a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no existe en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

El término "oligonucleótido" mencionado en este documento incluye nucleótidos de origen natural, y modificados unidos juntos por enlaces oligonucleotídicos de origen natural, y de origen no natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprenden generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y más preferiblemente de 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son habitualmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos con sentido o antisentido.

La expresión "nucleótidos de origen natural" mencionada en este documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" mencionado en este documento incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. La expresión "enlaces oligonucleotídicos" mencionada en este documento incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche y col., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y col., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein y col., Nucl. Acids Res., 16:3209 (1988); Zon y col., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon y col., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pág. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.151.510; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews, 90:543(1990). Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si se desea.

Las secuencias "unidas de forma funcional" incluyen tanto secuencias de control de la expresión que están contiguas con el gen de interés como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés. La expresión "secuencia de control de la expresión" como se usa en este documento se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para realizar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio de la transcripción, de terminación, promotoras y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como secuencias de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencial la eficacia de traducción (es decir, secuencia consenso Kozak); secuencias que potencial la estabilidad de las proteínas; y cuando se desea, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotores, sitios de unión al ribosoma, y secuencias de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. La expresión "secuencia de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañeros de fusión.

El término "vector", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma funcional. Dichos vectores se mencionan en este documento como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, se pretende que la invención incluya dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus deficientes en la replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que sirven para funciones equivalentes.

La expresión "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se usa en este documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichas expresiones no pretenden hacer referencia solamente a la célula objeto particular sino a la descendencia de dicha célula. Como pueden suceder ciertas modificaciones en generaciones consecutivas debido a mutación

: o influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero estar aún incluida dentro del alcance de la expresión "célula huésped" como se usa en este documento.

La expresión "hibrida de forma selectiva" mencionada en este documento significa unir de forma detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención hibridan de forma selectiva con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "alta rigurosidad"

: o "altamente rigurosas" para conseguir condiciones de hibridación selectivas conocidas en la técnica y analizadas en este documento. Un ejemplo de condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" es un procedimiento para incubar un polinucleótido con otro polinucleótido, en el que un polinucleótido puede fijarse en una superficie sólida tal como una membrana, en un tampón de hibridación de 6X SSPE o SSC, formamida al 50%, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42ºC durante 12-16 horas, seguido de lavado dos veces a 55ºC usando un tampón de lavado de 1X SSC, SDS al 0,5%. Véase también Sambrook y col., supra, pág. 9.50-9.55.

La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de las secuencias de nucleótidos se refiere a los restos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para la máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de al menos nueve nucleótidos, habitualmente de al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más habitualmente de al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente de al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente de al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente de al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Hay varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, pueden compararse secuencias polinucleotídicas usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en el Wisconsin Package Versión 10.3, Accelrys, San Diego, CA. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias cuestión y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998). Salvo que se especifique lo contrario, se usan los parámetros por defecto para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de nucleótidos puede determinarse usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de valores) o usando Gap con sus parámetros por defecto proporcionados en el Wisconsin Package Versión 10.3.

Una referencia a una secuencia de nucleótidos abarca su complemento salvo que se indique lo contrario. Por tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria.

En la técnica de biología molecular, los investigadores usan las expresiones "porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de similitud de secuencia" y "porcentaje de homología de secuencia" de forma intercambiable. Es esta memoria descriptiva, estas expresiones tendrán el mismo significado con respecto a secuencias de nucleótidos solamente.

La expresión "similitud sustancial" o "similitud de secuencia sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleótido o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleótido (o su cadena complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 85%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases nucleotídicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se ha analizado anteriormente.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando cargas de hueco por defecto, comparte al menos el 75% o el 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el 90% o el 95% de identidad de secuencia, incluso más preferiblemente al menos el 98% o el 99% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Una "sustitución conservativa de aminoácido" es una en la que un resto aminoacídico está sustituido con otro resto aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácido no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado se similitud puede ajustar a la alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadena laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina, y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina; y 6) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina.

Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidades logarítmicas PAM250 descrita en Gonnet y col., Science, 256: 1443-45 (1992). Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidades logarítmicas PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteína aparea secuencias similares usando mediciones de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo la sustitución conservativa de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, Wisconsin package Versión 10.3. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en Wisconsin package Versión 10,3. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias cuestión y de búsqueda (Pearson (1990); Pearson (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una cantidad grande de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).

La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para la homología generalmente serán de al menos aproximadamente 16 restos aminoacídicos, habitualmente de al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente de al menos aproximadamente 24 restos, típicamente de al menos aproximadamente 28 restos, y preferiblemente de más de aproximadamente 35 restos. Cuando se hace una búsqueda de una base de datos que contiene secuencias de una cantidad grade de diferentes organismos, es preferible comparar secuencias de aminoácidos.

Como se usa en este documento, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una realización, el marcador es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por procedimientos ópticos o colorimétricos). En otra realización, el marcador o indicador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármaco o toxina. Se conocen diversos procedimientos para marcar polipéptidos y glucoproteínas en la técnica y pueden usarse. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, aunque sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99TC, 111In, 125I,131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminaos reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas epitópicas), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tañes como la toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas realizaciones, los marcadores se unen por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir la impedancia estérica potencial.

Los siguientes ejemplos son para propósitos de ilustración solamente y no deben entenderse como limitantes del alcance de la invención de ningún modo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de epítopos inmunogénicos potenciales

Los epítopos de células T CD4+ (auxiliares) son críticos para dirigir las respuestas inmunes dependientes de células T contra antígenos proteicos. Durante el inicio de una respuesta inmune dependiente de células T, las células dendríticas capturan, procesan y presentan el antígeno proteico en forma de péptidos lineales unidos en el surco del MHC de clase II. La unión del receptor de células T al complejo péptido/MHC-II por las células T CD4+ vírgenes puede desencadenar una cascada en la las células T proliferan, se diferencian y proporcionan ayuda produciendo citoquinas co-estimuladoras (por ejemplo, IL-4, IL-6) y por contacto directo célula-célula (por ejemplo, CD40) a células B. La ayuda continuada de células T es necesaria durante la linfopoyesis secundaria de células B en la que las células B reordenan sus cadenas de inmunoglobulina para producir inmunoglobulina de alta afinidad de isotipo cambiado contra el mismo antígeno reconocido por las células T. Es la unión de las inmunoglobulinas producidas por las células B lo que puede neutralizar los efectos de las terapias basadas en proteína. La identificación de epítopos de células T contenidos dentro de anticuerpos terapéuticos es importante para predecir la inmunogenicidad en el hombre. Con su identificación, puede ser deseable diseñar el anclaje MHC-II por mutagénesis dirigida al sitio, generando aductos no inmunogénicos que retienen la actividad terapéutica del precursor.

Seis mAb completamente humanos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1mod, 6.77.1-mod, 7.16.6 y 9.8.2 (previamente descritos en el documento WO2005/067620; los hibridomas que secretan 7.16.6 y 9.8.2 se depositaron en la European Collection of Cell Cultures (ECACC), H.P.A en CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG el 9 de septiembre de 2003 con los siguientes números de depósito: 7.16.6: Nº de depósito: 03090909;

9.8.2: Nº de depósito: 03090912), se sometieron a una evaluación ex vivo para identificar los epítopos de células T potenciales y determinar su inmunogenicidad. Se sintetizaron péptidos de secuencia solapante (oligómeros de 15 unidades de pureza >90%) que cubren las regiones flanqueante (FR) y determinante de complementariedad (CDR) de los equivalentes de cadena pesada y ligera kappa de 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6 y 9.8.2 usando procedimientos convencionales. Los péptidos se exploraron frente a un panel de 40 donantes humanos en cultivos múltiples de PMSC con las células T CD8+ eliminadas, proporcionando una fuente de células CD4+ y células presentadoras de antígeno a proporciones fisiológicas. Los 40 donantes sanos se seleccionaron para exploración en base al tipificado HLA-DR y representaban >80% de los alelos DR expresados en la población mundial. Los péptidos individuales (1 y 5 µM) se exploraron por seis veces, junto con dos péptidos de control positivo. Las células se trataron con los péptidos durante 7 días, después se midió la proliferación por incorporación de 3Htimidina (0,5 µCi/pocillo; 18 h). La incorporación de radiomarcador se determinó por recuento de centelleo y se expresó como un índice de estimulación (SI) del siguiente modo:

cpm de péptido de ensayo

SI=

cpm de control no tratado

Un epítopo de células T se define como un péptido que da un SI >2 en dos o más

donantes independientes.

Además de la respuesta de proliferación inducida por el péptido, los péptidos se ensayaron en PBMC donantes en un ensayo ELISPOT. Este procedimiento captura las citoquinas liberadas y posibilita la cuantificación de células activadas dentro de la población

5 global. Se seleccionó la liberación de IL-2, la citoquina principal secretada por células T CD4+ activadas, para identificar las células T estimuladas por el epítopo peptídico. Como con el ensayo de proliferación, las muestras donantes se incubaron con el péptido durante 7 días antes de la evaluación. En el análisis se representó cada célula T estimulada como una mancha de liberación de IL-2. Para cada combinación de donante y péptido (1 y 5 µM) se

10 determinó la cantidad de manchas/pocillo y se calculó un índice de estimulación como una proporción: manchas/pocillo de péptido de ensayo

SI=

manchas/pocillo de control no tratado

En general, debe haber buen solapamiento en las respuestas observadas entre los ensayos de proliferación y ELISPOT, aunque diferencias en la cinética y la magnitud de las respuestas entre los dos ensayos puede conducir a alguna ausencia de correlación.

15 La Tabla 1 describe los datos de los ensayos de proliferación de células T y ELISPOT. En base a estos análisis, se identificaron epítopos de células T en la región FR2/CDR2 de la cadena pesada de 6.22.2-mod; CDR2, FR3/CDR3 y CDR3 de la cadena ligera kappa de la cadena ligera de 6.34.2-mod; FR3/CDR3 de la cadena ligera kappa de 6.67.1-mod; CDR3 de la cadena pesada de 6.77.1-mod; CDR2 de la cadena pesada de 7.16.6 y FR3/CDR3 de la

20 cadena ligera kappa de 7.16.6; y FR3/CDR3 de la cadena pesada de 9.8.2. Tabla 1. La inducción de proliferación de células T y la producción de IL-2 en PBMC de 40 voluntarios sanos incubadas con diferentes péptidos obtenidos de los mAb anti-MAdCAM 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod, 7.16.6 y 9.8.2. Se indican las secuencias de cada péptido, los restos que difieren de la secuencia de la línea germinal están en negrita.

25

Tabla 1:

Anticuerpo Cadena Secuencia Proliferación ELISPOT (SI >2) (SI>2)

6.22.2 Pesada SGFTFSSDGMHWVRQ

1 EWVAIIWYDGSNKYY 2 Ligera RASQRIGSSLHWYQQ

1

6.34.2 Pesada AVISNDGNNKYYADS 1 Ligera ISSYLNWFQQKPGKA 1

(continuación)

Anticuerpo Cadena

Secuencia Proliferación ELISPOT

(SI >2) (SI>2)

YLNWFQQKPGKAPKL 1 1

APKLLIYAASGLRRG 3 1

LLIYAASGLKRGVPS 1

SGLKRGVPSRFSGSG 1

QPEDFATYYCHQSYS 1

DFATYYCHQSYSLPF 2

CHQSYSLPFTFGPGT 1 3

SYSLPFTFGPGTKVD 1

6.67.1 Pesada GRIYTSGGTNSNPSL 1 RDRITIIRGLIPSFF 1 ITIIRGLIPSFFDYW 1 LIPSFFDYWGQGTLV 1 Ligera PPKLLIYWASIREYG 1 AEDVAVYFCQQYYSI 1 VAVYFCQQYYSIPPL 3 YFCQQYYSIPPLTFG 1 YSIPPLTFGGGTKVE 1

6.77.1 Pesada AVYYCARDGYSSQWS 1 RDGYSSGWSYYYYYG 1 YSSGWSYYYYYGMDV 3 GWSYYYYYGMDVWGQ 4 Ligera ISCKSSQSLLLSDGK 1 EAEDVGVYSCMQSIQ 1 VYSCMQSIQLMSSFG 1 SIQLMSSFGQGTKLE 1 1

7.16.6 Pesada SVYSGNTNYAQKVQG 2 AVYYCARBGSSSSGD 1 SGDYYYGMDVWGQGT 1 Ligera VEAEDVGIYYCMQNI 1 EDVGIYYCMQNIQLP 4 4 GIYYCMQNIQLPWTF 1 1

(continuación)

Anticuerpo: Cadena Secuencia Proliferación (SI >2) ELISPOT (SI>2)

9.8.2: Pesada VAVIWYDGSNEYYAD 1

IWYDGSNEYYADSVK: 1 1

AEDTAVYYCARGAYH: 1 1

TAVYYCARGAYHFAY: 3

ARGAYHFAYWGQGTL: 1

Ligera: SLQPEDIATYSCQHS 1

PEDIATYSCQHSDNL: 1

IATYSCQHSDNLTFG: 1

YSCQHSDNLTFGQGT: 1

Ejemplo 2: Caracterización de variantes modificadas de 7.16.6 El análisis de proliferación de células T y ELISPOT identificó varios epítopos de células 5 T potenciales en los mAb contra MAdCAM 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod,

7.16.6 y 9.8.2. El epítopo de células T principal en la cadena ligera kappa de 7.16.6 se revirtió a la línea germinal por mutagénesis dirigida al sitio (QuikChange, Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los oligonucleótidos usadas para generar las formas modificadas se indican a continuación: los pares de cebadores 7.16.6_V5 y 7.16.6_V3 10 se usaron para generar el aducto 7.16.6_V (VH=tipo silvestre; VL=190V); 7.16.6_S5 y 7.16.6_S3 se usaron par generar el aducto 7.16.6_S (VH=tipo silvestre; VL=N96S); 7.16.6_VS5 y 7.16.6_VS3 se usaron para generar el aducto 7.16.6_VS (VH=tipo silvestre; VL=190V, N96S). El vector pEE12.1 que contiene el ADNc de cadena pesada de 7.16.6 (descrito en el documento en WO2005/067620) se usó como molde para la PCR QuikChange. En resumen,

15 se ensambló un vector de expresión eucariota funcional que contenía las secuencias de cadena pesada y ligera respectivas del siguiente modo: Los insertos de ADNc de cadena pesada se escindieron del pEE6.1 necesario con NotI/SalI, y los fragmentos purificados se clonaron en sitos idénticos en el vector pEE12.1 correspondiente que contenía las versiones requeridas de las secuencias de cadena ligera kappa.

20 7.16.6_V5 GGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGC 7.16.6_V3 GCATGCAGTAATAAACCCCAACATCCTCAGCC

7.16.6_S5 CTGCATGCAAAGTATACAGCTTCCGTGGAC 7.16.6_S3 GTCCACGGAAGCTGTATACTTTGCATGCAG

25

7.16.6_VS5 GGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAAGTATACAGCTTCCG 7.16.6_VS3 CGGAAGCTGTATACTTTGCATGCAGTAATAAACCCCAACATCC

Se generaron construcciones pEE12.1 que contenía las cadenas ligeras kappa de 7.16.6_V. 7.16.6_S y 7.16.6_VS junto con la cadena pesada de 7.16.6 precursora a partir de los productos de PCR QuikChange y de se verificó su secuencia completamente. Se usó un enfoque de PCR similar para generar la variante 7.16.6_L (VH=V64L, VL=tipo silvestre), usando los siguientes oligonucleótidos y PCR QuikChange: 7.16.6_L5 CTATGCACAGAAGCTTCAGGGCAGAGTCAC 7.16.6_L3 GTGACTCTGCCCTGAAGCTTCTGTGCATAG

Se usaron la cadena ligera kappa precursora y la variante 7.16.6_VS para generar la variante 7.16.6_L y 7.16.6_LVS (VH=V64L; VL=I90V, N96S) como se describe en el documento WO2005/067620. El material recombinante se purificó por cromatografía de afinidad a partir de células FreeStyle HEK293 (Invitrogen) transfectadas de forma transitoria con la construcción apropiada.

Los anticuerpos purificados se evaluaron para su actividad en un ensayo de adhesión usando la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc:

Se escindió un fragmento de ADNc EcoRI/BglII que codificaba el dominio tipo inmunoglobulina extracelular maduro de MAdCAM de un clon pINCY Incyte (3279276) y se clonó en sitios EcoRI/BamHI del vector pIG1 (Simmons, D. L. (1993) en Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A, (Oxford Univ. Press, Oxford), pág. 93127) para generar una fusión IgG1 Fc en fase. El inserto resultante se escindió con EcoRI/NotI y se clonó en pCDNA3.1+ (Invitrogen). Se confirmó la secuencia del ADNc de MAdCAM-IgG1 Fc en el vector. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc se muestra a continuación:

imagen1

Subrayado: péptido señal Negrita: dominio extracelular de MAdCAM Se transfectaron células CHO-DHFR con vector pCDNA3.1+ que contenía el ADNc de la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc y se seleccionaron los clones estables que expresaban

la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc en medio de Iscove que contenía 600 µg/ml de G418 y 100 ng/ml de metotrexato. Para la expresión de proteína, se sembró un biorreactor de fibra hueca con células CHO que expresaban de forma estable MAdCAM-IgG1 Fc en medio de Iscove que contenía suero bovino fetal de bajo contenido en IgG (Gibco) al 10%, aminoácidos no esenciales (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), piruvato sódico (Gibco), 100 µg/ml de G418 y 100 ng/ml de metotrexato, y se usó para generar sobrenadante concentrado en el medio. La proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc se purificó del sobrenadante recogido por cromatografía de afinidad. En resumen, se aplicó el sobrenadante a una columna HiTrap de Proteína G Sepharose (5 ml, Pharmacia) (2 ml/min), se lavó con Tris 25 mM pH 8, NaCl 150 mM (5 volúmenes de columna) y se eluyó con glicina 100 mM pH 2,5 (1 ml/min), neutralizando las fracciones inmediatamente a pH 7,5 con Tris 1 M pH 8. Se identificaron las fracciones que contenían la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc por SDS-PAGE, se combinaron juntas y se aplicaron a una columna de Sephacryl S100 (Pharmacia), pre-equilibrada con BisTris 35 mM pH 6,5, NaCl 150 mM. La filtración en gel se realizó a 0,35 ml/min, recogiendo un pico de la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc en aprox. 3 x fracciones de 5 ml. Estas muestras se combinaron y se aplicaron a una columna Resource Q (6 ml, Pharmacia), pre-equilibrada en BisTris 35 mM pH 6,5. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Bis Tris 35 mM pH 6,5, NaCl 150 mM (6 ml/min) y la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc eluyó en una fracción de 4-6 ml con Bis Tris 35 mM pH 6,5, NaCl 400 mM. En esta fase la proteína era un 90% pura y migraba como una única banda a aproximadamente 68 kD por SDS-PAGE. Para su uso como inmunógeno y todos los ensayos posteriores, el material se cambió de tampón en HEPES 25 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaCl 100 mM, glicerol al 50% y se almacenó en forma de alícuotas a -80ºC.

Se adsorbieron 100 µl de una solución a 4,5 µg/ml de la proteína de fusión MAdCAMIgG1 Fc purificada en PBS de Dulbecco a placas de 96 pocillos Black Microfluor "B" con fondo en U (Dynex nº 7805) durante una noche a 4ºC. Las pacas revestidas con MAdCAM después se invirtieron y retiró por transferencia el exceso de líquido, antes de bloquear a 37ºC durante al menos 1 hora en BSA al 10%/PBS. Durante este tiempo, se contaron las células JY cultivadas usando exclusión de azul de tripano (debe ser aproximadamente 8 x 105 células/ml) y 20 x 106 células/placa de ensayo pipeteadas en un tubo de centrífuga de 50 ml. Las células JY se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco), que contenía L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Life Technologies nº 10108-165) y se sembraron a 1-2 x 105/ml cada 2-3 días para evitar que el cultivo se diferenciara. Las células se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 media (Gibco) que contenía L-glutamina 2 mM (Gibco) por centrifugación (240g), resuspendiendo el sedimento celular final a 2 x 106 células/ml en RPMI 1640 para la carga de Calceína AM. Se añadió Calceína AM (Molecular Probes nº C-3099) a las células en forma de una dilución 1:200 en DMSO (concentración final aprox. 5 µM) y las células se protegieron de la luz durante el transcurso de la incubación (37ºC durante 30 min.). Durante esta etapa de incubación de las células, los anticuerpos a ensayar se diluyeron del siguiente modo: para el ensayo de única dosis, los anticuerpos se prepararon hasta 3 µg/ml (1 µg/ml final) en 0,1 mg/ml de BSA (Sigma nº A3059) en PBS; para curvas completas de CI50, los anticuerpos se diluyeron en 0,1 mg/ml de BSA/PBS, siendo 3 µg/ml (1 µg/ml final) la concentración superior, después doblando las diluciones (proporción 1:2) a través de la placa. El pocillo final de la fila se usó para determinar la unión total, de modo que se usó 0,1 mg/ml de BSA en PBS.

Después de bloquearla, los contenidos de la placa se desprendieron golpeando y se añadieron 50 µl de anticuerpos/controles a cada pocillo y la placa se incubó a 37ºC durante 20 min. Durante este tiempo, las células JY cargadas con Calceína se lavaron una vez con medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% y una vez con 1 mg/ml de BSA/PBS por centrifugación, resuspendiendo el sedimento celular final a 1 x 106/ml en 1 mg/ml de BSA/PBS. Se añadieron 100 µl de células a cada pocillo de la placa con fondo en U, se selló la placa, se centrifugó brevemente (1000 rpm durante 2 min.) y después se incubó la placa a 37ºC durante 45 min. Al final de este tiempo, se lavaron las placas con un lavador de placa Skatron y se midió la fluorescencia usando un lector multimarcador Wallac Victo2 1420 (excitación λ 485 nm, emisión λ 535 nm, recuento desde arriba, 8 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 segundos con apertura de emisión normal). Para cada concentración de anticuerpo, se expresión el porcentaje de adhesión como un porcentaje de la respuesta de fluorescencia máxima en ausencia de cualquier anticuerpo menos la fluorescencia asociada con unión no específica. El valor de CI50 se define como la concentración de anticuerpo anti-MAdCAM a la que la respuesta de adhesión disminuye hasta el 50% de la respuesta en ausencia de anticuerpo anti-MAdCAM. Se consideró que los anticuerpos que eran capaces de inhibir la unión de células JY a la proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc con un valor de CI50 <0,1 µg/ml, tenían potente actividad antagonista y progresaron hasta el ensayo de adhesión a MAdCAM-CHO.

Los valores de CI50 se resumen en la Tabla 2 (todos los datos puntuales dados en µg/ml):

Tabla 2. Valores de Kd, ka, y kd para la interacción de MAdCAM con el anticuerpo anti-MAdCAM 7.16.6 y 5 clones derivados del mismo.

Indica que estos valores de disociación están justo por debajo del límite inferior (5 x 10-6 s-1) para BIAcore. Los valores de afinidad (KD) por lo tanto deben citarse de forma más precisa como:

•: <15 pM (=5 x 10-6/3,3 x 105) para 7.16.6 y

•: <27,3 pM (=5 x 10-6/1,83 x 105) para 7.16.6_V

Las constantes de disociación para los otros cuatro anticuerpos están dentro de los límites del instrumento.

Kd (pM): ka (M-1 s -1) kd (s-1) CI50 (ng/ml) s.d. n

7.16.6 7.16.6_S 7.16.6_V 7.16.6_VS 7.16.6_L 7.16.6_LVS: 7,3 23,2 162 90,8 79,5 119 3,3 x 105 1,83 x 105 1,53 x 105 2,40 x 105 1,52 x 105 1,94 x 105 2,42 x 10-6* 4,27 x 10-6* 2,49 x 10-5 2,18 x 10-5 1,21 x 10-5 2,31 x 10-5 24,7 34,2 41,2 58,2 35,6 45,8 7,6 7,4 20,9 51,2 10 16,4 6 5 5 5 5 5

Los resultados muestran que las variantes aún se unen a MAdCAM con elevada afinidad, suficientemente alta para uso terapéutico.

7.16.6. 7.16.6_V, 7.16.6_S, 7.16.6_VS, 7.16.6_L y 7.16.6_LVS también se unían a células CHO que expresaban MAd-CAM, detectado por citometría de flujo.

10 Los valores de Kd de la Tabla 2 se determinaron por BIAcore, esencialmente como se describe en el Ejemplo II en el documento WO 2005/067620, con las siguientes modificaciones: Inyecciones de muestra

Células de flujo usadas: 2 con 1 como referencia, o 4 con 3 como referencia Caudal: 100 µl/min

15 Tiempo de inyección: 2 minutos Espera después de la inyección: 60 minutos (=tiempo de disociación) Ciclos de inyección: triplicado de todas las concentraciones, más seis inyecciones de

blanco con tampón Procedimiento de regeneración 20 Solución/caudal/tiempo de inyección:

Anticuerpo inmovilizado: Solución de regeneración Caudal de regeneración, imagen4 l/min Tiempo de inyección (vol)

7.16.6: Ácido fosfórico 50 mM 50 12 segundos (10 µl)

7.16.6_V: Ácido fosfórico 60 mM 50 54 segundos (45 µl)

(continuación)

7.16.6_VS: Ácido fosfórico 50 mM 50 12 segundos(10 µl)

7.16.6_L: Hidróxido sódico 7,5 mM 50 6 segundos (5 µl)

7.16.6_LVS: Hidróxido sódico 5 mM 50 6 segundos (5 µl)

Tiempo de estabilización después de la regeneración: 5 minutos Ejemplo 3: Tinción inmunohistoquímica de tejidos de mono cynomolgus con variantes de 7.16.6 La inmunohistoquímica se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo III en el documento WO 2005/067620. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 3. Tabla 3: Resumen de tejidos de mono cynomolgus normales con dilución 1/500 de antihMAdCAM (aprox. 0,3 µg/ml), 1 hora de incubación a temperatura ambiente).

Tejido: Intensidad de tinción Clon 7.16.6 Patrón de tinción Intensidad comparativa de diversos clones con el clon 7.16.6

7.16.6_LVS: 7.16.6_L 7.16.6_ 7.16.6_S 7.16.6_VS Control Neg.

Tinción positiva

Íleo/ placa de Peyer (PP): 2-3+ 3+ 2-4+ 4+ HEV (PP). Endotelio vasc. (lámina propia-LP) = > = = = <<<

Ciego: Endotelio vasc. (LP) = = = = = <<<

Bazo: Células que revisten el seno (zona marginal de pulpa blanca) < = = < < <<<

LN mesentérico: HEV = = = = = <<<

(continuación)

7.16.6_L VS: 7.16.6_L 7.16.6_ 7.16.6_ S 7.16.6_ VS Con trol Neg .

Tinción positiva

LN axilar: trazas 1+ Células tipo dendríticas alrededor de los folículos linfoides = = = = = << <

Páncreas: Endotelio vasc. (vénulas de lóbulos exocrinos) = = < = = << <

Tinción negativa

Riñón*: 0 0 0 ------ = = = = = = = = = = = = = = = = = =

Corazón (ventrículo)

Tiroides

• Fuerte tinción en los túbulos, que se puede atribuir a unión no específica del anticuerpo secundario e interpretarse como ruido de fondo.

Ejemplo 4: Caracterización de variantes modificadas de 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 9.8.2 Usando procedimientos similares a los descritos en este documento en el Ejemplo 2 y

5 mencionados en el documento WO2005/067620, se modificaron a la línea germinal algunos de los epítopos de células T potenciales significativos en 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 9.8.2 descritos en la Tabla 1 por sustitución o deleción para generar las variantes de cadena recombinantes purificadas 6.22.2-mod_V (SEC ID Nº 2), 6.34.2_mod_SSQ (SEC ID Nº 8), 6.67.1-mod_Y (SEC ID Nº 14), 6.77.1-mod_DAS (SEC ID Nº 22) y 9.8.2-mod_ΔRGAYH,D

10 (SEC ID Nº 36). Las potencias de CI50 de los siguientes mAb mencionados como 6.22.2-mod_V (SEC ID Nº 2 y 4), 6.34.2_mod_SSQ (SEC ID Nº 6 y 8), 6.67.1-mod_Y (SEC ID Nº 14 y 20), 6.77.1-mod_ΔAS (SEC ID Nº 22 y 24) y 9.8.2-mod_ΔRGAYH,D (SEC ID Nº 36 y 38) en el ensayo de unión a proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc: células JY se representan en la Tabla 4 en comparación con sus mAb equivalentes precursores 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 9.8.2. Todas las variantes modificadas mantenían potencia antagonista similar a sus mAb precursores.

Tabla 4. Comparación de las potencias de CI50 de los mAb 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y

9.8.2 modificados, 6.22.2-mod_V, 6.34.2_mod_SSQ, 6.67.1-mod_Y, 6.77.1-mod_ imagen5 AS y

9.8.2-mod_imagen5 RGAYH,D respectivamente en el ensayo de unión a proteína de fusión MAdCAM-IgG1 Fc: células JY

CI50 (µg/ml): S.D. n CI50 (µg/ml) S.D. n

6.22.2: 0,018 0,0109 4 6.22.2-mod_V 0,076 0,033 7

6.34.2: 0,013 0,0079 4 6.34.2-mod_SSQ 0,086 0,04 11

6.67.1: 0,013 0,0071 4 6.67.1-mod_Y 0,063 0,025 6

6.77.1: 0,022 0,0045 4 6.77.1-mod_ΔAS 0,0485 0,0135 7

9.8.2: 0,02 0,0047 4 9.8.2_ΔRGAYH,D 0,072 0,03 6

10 15: Secuencias: Las secuencias de la secuencia peptídico señal (o las bases que codifican la misma) se indican en minúscula y subrayadas. Las regiones variables están en mayúscula. Las regiones constantes están en mayúscula y subrayadas en las secuencias de proteína. En negrita están los restos modificados a partir de las secuencias descritas originalmente (documento WO2005/067620).

20

25

SEC ID Nº1 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada de 6.22.2-mod_V

imagen6

SEC ID Nº2 Secuencia proteica de cadena pesada predicha de 6.22.2-mod_V

imagen7

SEC ID Nº3 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.22.2-mod

imagen8

SEC ID Nº4 15 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera kappa predicha de 6.22.2-mod

25

30

imagen2

SEC ID Nº5 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada de 6.34.2-mod

imagen6

SEC ID Nº6 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada predicha de 6.34.2-mod

imagen7

SEC ID Nº7 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.34.2-mod_SSQ

imagen8

SEC ID Nº8 15 Secuencia proteica de cadena ligera kappa predicha de 6.34.2-mod_SSQ

imagen2

SEC ID Nº9 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.34.2-mod_QT

imagen7

SEC ID Nº10 Secuencia proteica de cadena ligera kappa predicha de 6.34.2-mod_QT

imagen9

SEC ID Nº11 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.34.2-mod_SSQ,QT

Secuencia proteica de cadena ligera kappa predicha de 6.34.2-mod_SSQ,QT

imagen10

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SEC ID Nº13 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada de 6.67.1-mod

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SEC ID Nº14 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada predicha de 6.67.1-mod

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SEC ID Nº15 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.67.1-mod_Y

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SEC ID Nº16 15 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera kappa predicha de 6.67.1-mod_Y

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SEC ID Nº17 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.67.1-mod_TΔP

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SEC ID Nº18 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera kappa predicha de 6.67.1-mod_TΔP

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SEC ID Nº19 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.67.1-mod_Y,TΔP

SEC ID Nº20 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera kappa predicha de 6.67.1-mod_Y,TΔP

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SEC ID Nº21 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada de 6.77.1-mod_ΔS

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SEC ID Nº22 Secuencia proteica de cadena pesada predicha de 6.77.1-mod_ΔS

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SEC ID Nº23 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 6.77.1-mod

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SEC ID Nº24 15 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera kappa predicha de 6.77.1-mod

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25

30

SEC ID Nº25 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada de 7.16.6

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SEC ID Nº26 Secuencia proteica de cadena pesada predicha de 7.16.6

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SEC ID Nº27 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada de 7.16.6_L

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SEC ID Nº28 Secuencia proteica de cadena pesada predicha de 7.16.6_L

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SEC ID Nº29 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 7.16.6_V

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SEC ID Nº30 15 Secuencia proteica de cadena ligera kappa predicha de 7.16.6_V

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SEC ID Nº31 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 7.16.6_S

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SEC ID Nº32 Secuencia proteica de cadena ligera kappa predicha de 7.16.6_S

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SEC ID Nº33 10 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 7.16.6_VS

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SEC ID Nº34 Secuencia proteica de cadena ligera kappa predicha de 7.16.6_VS

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SEC ID Nº35 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada de 9.8.2_ΔRGAYH,D

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SEC ID Nº36 Secuencia proteica de cadena pesada predicha de 9.8.2_ΔRGAYH,D

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SEC ID Nº37 Secuencia de nucleótidos de cadena ligera kappa de 9.8.2-mod

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SEC ID Nº38 Secuencia proteica de cadena ligera kappa predicha de 9.8.2-mod

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MAdCAM, o parte de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno:

(a)

las regiones variables de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº 30, 32 ó 34, sin las secuencias señal; y

(b)

las regiones variables de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº 26 ó 28, sin las secuencias señal.
2. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo:

(a)

la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de las SEC ID Nº 30, 32 ó 34, sin las secuencias señal y

(b)

una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de las SEC ID Nº 26 ó 28, sin las secuencias señal.
3.

Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la lisina C-terminal de cadena pesada está escindida.
4.

Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso como medicamento.
5.

Un anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
6.

Uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
7.

El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5 o el uso de la reivindicación 6, en el que la enfermedad se selecciona entre enfermedad inflamatoria del intestino, fibrosis hepática, enfermedad de injerto contra huésped, uveítis.
8.

El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5 o el uso de la reivindicación 6, en el que la enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
9.

Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o parte de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

5 10. Un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de las SEC ID Nº30,32 ó34.
11. Un vector que comprende cualquiera de las secuencias que codifican las regiones variables de las SEC ID Nº 30, 32 ó 34.

10
12.

Una célula huésped que expresa el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1.
13.

Un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula

15 huésped de la reivindicación 12 en condiciones en las que se expresa el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo de la célula huésped o sus sobrenadante de cultivo.